UNIVERSIDADE ETADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS – RIO CLARO unesp PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA MOTRICIDADE EFEITO DO TREINAMENTO FÍSICO PERIODIZADO SOBRE O ACÚMULO DE ATIVIDADE FÍSICA ESPONTÂNEA, VOLUNTÁRIA E A INGESTÃO CALÓRICA EM RATOS WISTAR. OSVALDO TADEU DA SILVA JUNIOR Rio Claro - 2017 Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências do Câmpus de Rio Claro, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Ciências da Motricidade. OSVALDO TADEU DA SILVA JUNIOR EFEITO DO TREINAMENTO FÍSICO PERIODIZADO SOBRE O ACÚMULO DE ATIVIDADE FÍSICA ESPONTÂNEA, VOLUNTÁRIA E A INGESTÃO CALÓRICA EM RATOS WISTAR. Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências do Campus de Rio Claro, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Ciências da Motricidade ORIENTADOR: PROF. DR. JULIO WILSON DOS SANTOS Dezembro – 2017 Silva Junior, Osvaldo Tadeu da Efeito do treinamento físico periodizado sobre o acúmulo de atividade física espontânea, voluntária e a ingestão calórica em ratos Wistar / Osvaldo Tadeu da Silva Junior. - Rio Claro, 2017 95 f. : il., figs., tabs. Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências de Rio Claro Orientador: Julio Wilson dos Santos 1. Medicina esportiva. 2. Atividade física espontânea. 3. Atividade física voluntária. 4. Ingestão calórica. 5. Treinamento periodizado. I. Título. 617.1027 S586e Ficha Catalográfica elaborada pela STATI - Biblioteca da UNESP Campus de Rio Claro/SP - Adriana Ap. Puerta Buzzá / CRB 8/7987 DEDICATÓRIA DEDICATÓRIA Dedico este trabalho a DEUS, esta é minha alegria e uma obrigação que jamais devo esquecer. AGRADECIMENTOS Sem a misericórdia de DEUS nada sou. Ainda que te agradeça todos os dias por tudo que me deste, gostaria de agradecer ao senhor novamente por me capacitar e terminar esta dissertação. Esteve comigo a todo momento ao longo desta jornada, especialmente nos mais difíceis segurando minha mão e me ajudando a lutar. Ao Sr. muito obrigado! Meus pais Osvaldo e Verônica, meus grandes exemplos e incentivadores ao estudo. Obrigado por me proporcionarem estudo e educação, esta conquista é para vocês. Minha irmã, Natália, sua força me ensina. Amo você. Minha família, Simone, Allanis e Nicoly recebam meu agradecimento especial, vocês são meus presentes divinos que tornam os meus dias alegres e especiais. Sem o carinho e compreensão de vocês, não teria conseguido terminar esta jornada. Amo vocês. Meu orientador, Prof. Dr. Julio Wilson dos Santos, minha eterna gratidão. Acreditou em mim quando tudo parecia perdido, me ensinou que um professor tem o poder de mudar a vida das pessoas. Obrigado pelos ensinamentos. Aos professores José Alexandre e Paulo Santiago, vocês me ajudaram demais. Tem minha eterna gratidão. Aos professores Márcio e Rubens, minha admiração pela simplicidade. São surpreendentes no aspecto humano, capaz de fazer a diferença na vida de quem os conhecem. A todos os colegas do FITES pela parceria nos estudos. A CAPES pelo apoio financeiro. Ao UNISALESIANO - Lins pelo apoio durante pesquisa. RESUMO Acredita-se que haja um set point que limita o gasto energético utilizando como estratégia o controle dos níveis de atividade física em nosso organismo visando a manutenção da homeostase energética semelhante a outras variáveis reguladas biologicamente. O presente estudo tem como objetivo investigar se o treinamento periodizado e a dieta hiperlipídica influenciam os níveis de atividade física espontânea e voluntária e a alteração na ingestão alimentar de ratos. Para isso, o estudo foi dividido em duas etapas: na primeira o objetivo foi verificar a acurácia e confiabilidade de um sistema de videogrametria na análise do deslocamento de ratos Wistar, e na segunda etapa, verificar se o aumento da atividade física, por meio do treinamento periodizado, é acompanhado por uma redução compensatória na atividade física e alteração da ingestão alimentar. Foram utilizados Ratos (n=32) da linhagem Wistar (Rattus Norvegicus Albinus Wistar) com idade inicial de 120 dias mantidos em gaiolas coletivas durante 8 semanas, após a separação dos grupos: Grupo controle (GC), Grupo controle com dieta hiperlipídica (GDH), Grupo de treinamento periodizado (TP), e Grupo treinamento periodizado dieta hiperlipídica (TPH), os quais realizaram um protocolo de treinamento periodizado de natação, durante 6 semanas, após 2 semanas de adaptação. O limiar anaeróbio pelo teste de lactato mínimo (Lam) foi realizado para a separação dos animais em grupos homogêneos e para verificação dos efeitos do treinamento. Foram verificados o efeito do treinamento físico periodizado sobre o acúmulo de atividade física espontânea (AFE -deslocamento pela filmagem) e voluntária (AFV - roda de atividades), além da verificação da interferência da dieta hiperlipídica na atividade física espontânea e voluntária, no perfil lipídico (triglicerídeos, HDL), glicemia, comportamento alimentar, medidas e gordura corporal. A análise de variância foi utilizada para verificar as diferenças das variáveis entre os grupos, enquanto que a correlação de Pearson foi utilizada para verificar a associação entre a carga de treinamento com a ingestão alimentar, AFE e AFV, considerando alfa de 5%. Na primeira etapa a acurácia e a confiabilidade do sistema de videogrametria para a análise do deslocamento foi confirmada. Na segunda etapa verificou-se que os valores de glicemia, HDL e TG não apresentaram diferença significativa entre os grupos após 8 semanas de experimento. Os grupos treinados apresentaram maiores valores de Lam em relação ao grupo GC e GDH e não apresentaram ganho excessivo de gordura corporal. Em relação ao consumo alimentar, os grupos alimentados com dieta hiperlipídica apresentaram menor consumo calórico em relação aos grupos alimentados com dieta padrão. O acúmulo de AFV não apresentou diferença entre os grupos, porém a AFE foi maior no grupo controle em relação ao demais. A associação entre a carga de treino total semanal e o consumo alimentar e carga de treino total semanal e AFV foram fracas. Para associação entre a carga de treino total semanal e a AFE, houve forte associação com o grupo TP . O TP e a dieta hiperlipídica levaram a uma redução da AFE, assim como nas semanas onde os treinamentos foram intensos houve um nível de AFE menor. Nosso resultados indicam que existem fatores biológicos responsivos ao treinamento e a dieta hiperlipídica capazes de interferir nos níveis de AFE dos animais. Palavras chave: Atividade física espontânea, Atividade física voluntária, ingestão calórica, treinamento periodizado. ABSTRACT It is believed that there is a set point that limits the energy expenditure using as a strategy the control of the levels of physical activity in our organism aiming the maintenance of the energy homeostasis similar to other variables regulated biologically. The present study aims to investigate whether the periodized training and the hyperlipidic diet influence the levels of spontaneous and voluntary physical activity and the alteration in dietary intake of rats. For this, the study was divided in two phases: in the first the objective was to verify the accuracy and reliability of a videogrammetry system in the analysis of Wistar rats displacement and in the second stage, to verify if the increase of the physical activity through periodized training is accompanied by a compensatory reduction in physical activity and alteration in food intake. Rats (n = 32) Wistar (Rattus Norvegicus Albinus Wistar) with initial age of 120 days were kept in collective cages for 8 weeks, after separation of the groups: Control group (CG), Control group with hyperlipidic diet (GHD), Periodized training group (PT), and Periodic training group hyperlipidic diet (PTH), who performed a periodized swimming training protocol for 6 weeks after 2 weeks of adaptation. The anaerobic threshold by lactate minimum (Lam) test was performed to separate the animals into homogeneous groups and to verify the effects of the training. The effect of the periodic physical training on the accumulation of spontaneous physical activity (SPA - displacement by filming) and voluntary (VPA - activity wheel) was verified, as well as the verification of the interference of the hyperlipidic diet in spontaneous and voluntary physical activity, in the lipid profile (triglycerides, HDL), glycemia, eating behavior, measures and body fat. The analysis of variance was used to verify the differences of the variables between the groups, while the Pearson correlation was used to verify the association between training load and food intake, SPA and VPA, considering alpha of 5%. In the first phase the accuracy and reliability of the videogrammetry system for displacement analysis was confirmed. In the second phase, it was verified that the values of glycemia, HDL and TG did not present significant difference between the groups after 8 weeks of experiment. The trained groups had higher values of Lam in relation to the CG and GHD groups and did not present an excessive gain of body fat. In relation to the food consumption, the groups fed with a hyperlipid diet presented lower caloric intake than the groups fed a standard diet. The VPA accumulation did not present difference between the groups, but the SPA was higher in the control group in relation to the others. The association between total weekly training load and total weekly training and feeding load and VPA were weak. For association between the total weekly training load and the SPA, there was a strong association with the PT group. The PT and the hyperlipid diet led to the reduction of SPA, just as in the weeks where the training was intense there was a lower level of SPA. Our results indicate that there are training-responsive biological factors and the hyperlipidic diet capable of interfering with the SPA levels of the animals. Keywords: Spontaneous physical activity, Voluntary physical activity, caloric intake, periodic training. LISTA DE FIGURAS Figura 1. Padrão de resposta de um sistema homeostático, quando o equilíbrio é alterado. ........................................................................................................ 22 Figura 2. Representação esquemática pelo qual um regulador biológico central para o gasto poderia funcionar. ........................................................................ 24 Figura 3. Desenho experimental dos estudos que compõem a dissertação. ... 35 Figura 1. Ambiente Enriquecido sem os objetos inanimados, com a linha de nylon de 10 m distribuida aleatoriamente ao fundo, marcações das extremidades (ponto de calibração em vermelho) e o bastão com a mini-bolsa marcada com o centro de massa .................................................................... 40 Figura 2. Imagem do percurso de 10 metros a partir das coordenadas X,Y, em 2D, obtida por três avaliadores. Ponto verde = início do rastreamento; Ponto vermelho = final do rastreamento. .................................................................... 41 Figura 3. Imagem do rastro de um rato no ambiente enriquecido durante os 10 minutos de rastreamento. Ponto verde = início do rastreamento; Ponto vermelho = final do rastreamento. .................................................................... 42 Figura 4. Imagem do rastro de um rato no ambiente enriquecido durante os 10 minutos de rastreamento. Vermelho = avaliador n°1; Verde = avaliador n°2; e Azul = avaliador n°3. ........................................................................................ 45 Figura 1. Ambiente Enriquecido. A = visualização superior diurna; B = visualização superior noturna. .......................................................................... 54 Figura 2. Tanque de natação com baias individuais. ....................................... 55 Figura 3. Período de adaptação de duas semanas. ........................................ 56 Figura 4. Periodização do treinamento durante o experimento. ...................... 56 Figura 5. Distribuição seminal da carga de treino semanal (CTS) ao longo de 8 semanas de periodização. TP = Treinamento Periodizado, TPDH = Treinamento Periodizado Dieta Hiperlipídica .........................................................................59 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Valores obtidos pelos avaliadores no rastreamento de 10 metros. ................. 44 Tabela 2. Valores obtidos pelos avaliadores durante o rastreamento de 10 minutos do rato. ................................................................................................................................. 44 Tabela 3. Valores obtidos no cálculo de acurácia, precisão e bias do primeiro experimento. .................................................................................................................... 45 Tabela 4. Dados das variáveis para o erro de medição σ 2 confiabilidade do segundo experimento. .................................................................................................................. 455 Tabela 1. Linha temporal dos procedimento experimentais. ........................................... 53 Tabela 2. Periodização utilizada durante o experimento. ................................................ 58 Tabela 3. Composição das dietas. ................................................................................... 62 Tabela 4. Variação massa corporal (Δ MC), índice de Lee, consumo alimentar, glicemia, HDL, TG, gordura epididimal e visceral dos grupos após 8 semanas de experimento. ... 66 Tabela 5. Atividade física voluntária (AFV), atividade física espontânea (AFE) e a capacidade aeróbia (Lam) dos animais durante as 6 semanas de treinamento. ............. 68 Tabela 6. Deslocamento(m) dos animais durante as 8 semanas de experimento. SA: semana de adaptação ao treinamento 1- 2; ST: semana de treinamento 1 - 6................ 70 Tabela 7. Correlação de Pearson (r) entre a carga de treinamento semanal (CTS), consumo alimentar (CA), atividade física voluntária (ATV) e a atividade física espontânea (AFE) dos grupos experimentais ao final do experimento. .............................................. 71 Tabela 8. Correlação de Pearson (r) entre a carga de treinamento semanal (CTS) e atividade física espontânea (AFE) dos grupos submetidos ao treinamento periodizado ao longo das 6 semanas de treinamento. ............................................................................. 71 LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS % MC Percentual de massa corporal 2D Bidimensional 3 Raiz cúbica ΔMC Delta da massa corporal AE Ambiente enriquecido AFE Atividade física espontânea AFV Atividade física voluntária ANOVA Analysis of variance CA Consumo alimentar CNA Comprimento naoanal CTS Carga de treinamento semanal CV Coeficiente de variação GC Grupo controle GDH Grupo dieta hiperlipídica HDL High density lipoproteins Hz Hertz IP Internet protocol IKK Proteina kinase de IKB JNK c-Jun NH2 quinase terminal Kcal Kilocalorias Kg Kilogramas Lam Lactato mínimo LSE Limite de especificação superior LSI Limite de especificação inferior LPL Lipoproteína lipase MP Mega pixel PTP1B Proteína tirosina fosfatase 1B P/T Precisão com tolerância R&R Reprodutividade & Repetitividade SC Soma do consumo alimentar SP Soma do peso SOCS3 Supressores de sinalização de citocinas 3 ST Semana de treinamento TE Tempo total de exercício TG Triacilgliceróis TLR4 Toll like receptor 4 TNFα Fator de necrose tumoral TP Treinamento periodizado TPDP Treinamento periodizado e dieta padrão TPDH Treinamento periodizado e dieta hiperlipídica VLDL Lipoproteína de muita baixa densidade SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 17 2 REVISÃO DA LITERATURA .................................................................................. 21 2.1 Hipótese da “activitystat” ..................................................................................... 21 2.1.1Evidências ......................................................................................................... 25 2.2 Ambiente enriquecido .......................................................................................... 28 2.3 Modelo experimental de treinamento com ratos .................................................. 29 2.4 Atividade física e exercício físico ......................................................................... 31 2.5 Dieta hiperlipídica ................................................................................................ 31 3 JUSTIFICATIVA ..................................................................................................... 33 4 OBJETIVOS ........................................................................................................... 34 4.1 Objetivo geral ...................................................................................................... 34 4.2 Objetivos específicos........................................................................................... 34 5 MATERIAIS E MÉTODOS...................................................................................... 35 6 ESTUDO 1 PRECISÃO E CONFIABILIDADE DE UM SISTEMA DE VIDEOGRAMETRIA NA ANÁLISE DO DESLOCAMENTO DE RATO WISTAR. ..... 36 7 ESTUDO 2 EFEITO DO TREINAMENTO FÍSICO PERIODIZADO SOBRE O ACÚMULO DE ATIVIDADE FÍSICA ESPONTÂNEA, VOLUNTÁRIA E A INGESTÃO CALÓRICA EM RATOS WISTAR. ............................................................................ 52 7.1 Materiais e métodos ............................................................................................ 52 7.1.1 Animais ............................................................................................................. 52 7.1.2 Desenho experimental ...................................................................................... 52 7.1.3 Ambiente enriquecido ....................................................................................... 53 7.1.4 Controle da atividade física voluntária e espontânea ....................................... 54 7.1.5 Protocolo de treinamento periodizado .............................................................. 55 7.1.6 Determinação do limiar anaeróbio .................................................................... 59 7.1.7 Controle antropométrico, das dietas e da ingestão hídrica ............................... 60 7.1.8 Eutanásia ......................................................................................................... 62 7.1.9 Dosagens bioquímicas ..................................................................................... 62 8 ANÁLISE ESTATÍSTICA ........................................................................................ 64 9 RESULTADOS ....................................................................................................... 65 9.1 Massa corporal, Índice de lee, consumo alimentar, glicemia, HDL, TG, gordura epididimal e vísceral. ................................................................................................. 65 9.2 Atividade física voluntária, espontânea e capacidade aeróbia. .......................... 67 10 DISCUSSÃO ........................................................................................................ 74 11 CONCLUSÃO....................................................................................................... 85 REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 86 ANEXOS ................................................................................................................... 94 17 1 INTRODUÇÃO Atividade física regular ao longo da vida tem ocupado um papel de grande relevância na prevenção de doenças crônicas (TRINDADE, 2016). No entanto, informações recentes apontam um declínio nos níveis de atividade física da população e sua relação com os riscos para a saúde por meio de fatores associados ao sobrepeso e a obesidade (SINGH, 2015). A atividade física é definida como qualquer movimento corporal, produzido pelos músculos esqueléticos, que resulta em gasto energético maior do que os níveis de repouso (CASPERSEN et al., 1985) e inclui todas as atividades de lazer, no trabalho ou domésticas (HASKELL, 1994; DUNN,1998). Segundo Garland et al (2011) a atividade física pode ser classificada como atividade física espontânea, que compreende as atividades para a sobrevivência e homeostase, como busca de comida, abrigo e interação social, e a atividade física voluntária, como por exemplo, as atividades recreacionais e o esporte, dentre outras, que variam em duração e intensidade. Garland et al. (2011) apontam similaridade da atividade física espontânea e voluntária entre humanos e animais de laboratório, referindo-se que, tal como nos humanos, no modelo experimental com animais, a locomoção representa a atividade física espontânea, realizada para busca de comida e interação social, enquanto que o exercício físico nas rodas de atividade pode ser considerado uma atividade voluntária na qual é possível medir o exercício voluntário, por meio de um comportamento clássico de automotivação, que pode ser mensurado pelo deslocamento dos animais. Os aspectos físicos e sociais de um ambiente podem influenciar a biologia e, consequentemente, o comportamento de um organismo, provocando alterações na estrutura do cérebro (JOSEPH,1999), concentrações hormonais (HEIDBREDER et al., 2000), peso corporal (BAYNE, 2005) e atividade física (EIKELBOOM; LATTANZIO, 2002). Neste sentido, o ambiente enriquecido é um modelo experimental para estudar o comportamento de animais. O ambiente enriquecido é composto por um espaço maior do que as gaiolas coletivas convencionais, no qual são colocados objetos inanimados, incluindo a roda de atividade, para a estimulação sensorial, cognitiva, motora e social dos animais (SZTAINBERG; CHEN, 2010). 18 O enriquecimento ambiental apresenta diferentes consequências biológicas tão significativas, que este conceito tem sido estudado efetivamente em humanos em comparação com os ambientes não enriquecidos (ROSENZWEIG et al., 1969; DIAMOND, 2001; JOSEPH, 1999). De modo contrário, a alocação tradicional de animais em gaiolas individuais ou coletivas de pequena dimensão limitam a movimentação dos animais (VARTY et al., 2000). Atualmente, o Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONCEA) recomenda por meio da Resolução nº32/2016, que os animais sejam alocados em ambiente enriquecido e a disponibilização de espaço mínimo necessário para que o animal possa praticar um repertório comportamental básico para a manutenção de seu bem-estar. O acúmulo de atividade física diária, seja espontânea ou voluntária pode ocasionar melhora no controle da massa corporal (GARLAND et al., 2011; SALGADO et al., 2012), enquanto que a inatividade física (sedentarismo) é um fator de risco a saúde por aumentar a prevalência e incidência de doenças endócrino- metabólicas associadas à obesidade (BOOTH et al., 2015). Interações compensatórias entre a atividade voluntária e espontânea podem ter implicações no dispêndio energético diário. O acúmulo de atividade física diária, seja espontânea ou voluntária pode ocasionar melhora no controle da massa corporal (GARLAND et al., 2011; SALGADO et al., 2012). A roda de corrida é amplamente utilizada em estudos de laboratório para mensurar os níveis de atividade física dos animais. Sua utilização está ligada a estudos de obesidade e equilíbrio energético como uma forma de mimetizar o comportamento humano, observando a tendência de um roedor ser mais ou menos ativo (NOVAK et al., 2012). A videogrametria é o princípio da análise do movimento do corpo humano por meio das imagens consiste na captura de uma sequência de imagens por vídeo, com o auxílio de uma ou mais câmeras, obtendo dados do objeto de interesse através das medidas realizadas nestas imagens (LAGO, 1999). O uso da videogrametria para a análise do deslocamento passou a ser utilizada no modelo experimental com animais (NOLDUS, 2001). Recentemente Tadeu (2017) demonstrou alta confiabilidade do sistema de videogrametria do Dvideo na análise da distância percorrida em estudo de modelo animal. Acredita-se que haja um set point que limita o gasto energético em nosso organismo funcionando como um mecanismo de regulação da homeostase, 19 semelhante a outras variáveis reguladas biologicamente, repleto de sistemas centrais de regulação biológica, denominados "stats" (ROWLAND,1998), sendo proposto que o set point para a manutenção da homeostase energética é denominada de "activitystat", atuando especificamente na regulação da atividade física ou gasto energético. Uma forma de aumentar os níveis de atividade física de forma organizada, é a utilização do treinamento de maneira sistematizada por meio da elaboração da periodização. A periodização é uma forma organizada de treinamento com alternância de cargas, variação da relação volume e intensidade, cujo objetivo é obter o melhor desempenho em determinado momento de um período de treinamento (DOS-SANTOS, 2004). Este modelo de sistematização do treinamento já foi adaptado para o modelo experimental de exercício na natação com ratos (DOS-SANTOS; MELLO, 2011). É possível que este seja um bom modelo para estudar a teoria da activitystat na manutenção da homeostase, uma vez que neste modelo de treinamento os animais são submetidos a treinamentos que variam em alto volume e intensidade. Com isso, a análise da atividade física espontânea e voluntária nos períodos fora de treinamento e a característica da dieta podem ajudar a elucidar se o fenômeno do gasto energético determina o acúmulo diário de atividades como uma estratégia utilizada pelo organismo para manter o “set point”. As informações referentes ao acúmulo de atividade física espontânea e voluntária são importantes para melhor entendimento da teoria da activitystat proposta por Rowland (1998). Além disso, a dieta hiperlipídica vem sendo utilizada de forma empírica para verificar os níveis de atividade na locomoção de ratos frente a situação de grande oferta de energia (WONG et al., 2014). Assim, a compreensão do balanço energético, através da interação entre a dieta e o exercício pode ajudar no entendimento da hipótese da activitystat. Considerando que o treinamento periodizado é uma estratégia para aumentar o gasto calórico e que a atividade física voluntária pode ser mensurada por meio da roda de corrida, a atividade física espontânea possa ser medida por meio do deslocamento dos animais, alocados em um ambiente enriquecido e que o controle da dieta pode ser feito para determinar a ingestão calórica (entrada de energia), a proposta deste estudo é verificar se o fenômeno do aumento do gasto energético, por meio de diferentes intensidades de exercício baseado no limiar 20 aeróbio individual dos animais determina a redução no acúmulo diário de atividade de ratos Wistar como uma estratégia utilizada pelo organismo para manter o set point corroborando ou refutando a teoria da activitystat. 21 2 REVISÃO DA LITERATURA 2.1 Hipótese da “activitystat” Walter Cannon, em 1935 introduziu o termo "homeostase" para descrever a constância do ambiente interno (GOMERSALL, 2013). Um suprimento adequado de energia é vital para a manutenção da função fisiológica, desta forma, acredita-se que exista um centro de controle para manter um estado estável de energia corporal (set point). Este centro de controle seria responsável pelo equilibrio da entrada e saída de energia, afetando o apetite, e causando resposta na regulação da taxa metabólica de repouso, bem como nas despesas em forma de atividade física. A explicação para a ocorrência do set point na manutenção da homeostase energética tem sido proposta por Rowland (1998), denominada de activitystat. Rowland postula que quando a atividade física é aumentada ocorrerá uma alteração na homeostase energética e como resposta uma redução no acúmulo de atividade física diária, a fim de amenizar as alterações na homeostase energética. Esta teoria se baseia em dois mecanismos que são: a ocorrência de um set point da atividade física e do gasto energético que determina um acúmulo diário de atividade e as estratégias utilizadas pelo organismo para manter esse set point, e a ingestão calórica como entrada de energia, para manter o set point. A hipótese da activitystat assume uma base biológica para a regulação da atividade física ou gasto energético. Quando a atividade física é aumentada, ocorre a quebra da homeostase energética além dos limites superiores do "set point da atividade física". Imediatamente estratégias compensatórias são ativadas, dentre elas a redução da atividade física espontânea e voluntária, a fim de restabelecer a homeostase ("set point energético"). Acredita-se que este mecanismo seja controlado pelo sistema nervoso central, sobre grande influência do hipotálamo, para manutenção da homeostase energética, que mantém as condições de ingestão e gasto energético em equilíbrio e evita reduções bruscas na energia corporal. 22 A figura 1, ilustra o sistema homeostático e seu padrão de resposta. O ponto de ajuste ou "set point" é o ponto no qual o sistema flutua. O ponto de ajuste da zona é definida por uma faixa de "tolerância" do sistema representado por uma zona entre valores mínimo e máximo, onde o acionamento do sistema efetor só ocorre fora da faixa de tolerância. Caso os valores excedam a zona de tolerância , o tempo de retorno para o sistema retornar ao set point irá depender do grau de sobrecarga (desvio entre o estado real e o ponto de ajuste). Figura 1 - Padrão de resposta de um sistema homeostático, quando o equilíbrio é alterado. Segundo Rowland (1998), o corpo humano é repleto de autoregulação "stat", com seu limiar "set point", mecanismos de feedback, e seus limites de tolerância. A temperatura corporal, os níveis de osmolaridade e glicose sanguínea, bem como a pressão arterial, não podem ser ajustados sem os seus respectivos centros de controle homeostático. Dentro deste contexto, o set point é definido como uma zona interna representado uma linha de base para a estabilidade do sistema, no sentido de que o ciclo de feedback negativo sempre busque controlar a variável, com base nesta referencia. Frente a um desequilíbrio, inicia-se a restauração para as linhas de base (TORTUGA, 2009). 23 De acordo com Gomersal (2013), um mecanismo homeostático apresenta vários componentes:  Uma variável que está sendo regulada;  Uma zona interna de set point, que representa um valor de referência para o sistema, na direção para o qual o loop de feedback regula a variável controlada;  Um sensor que monitora o estado atual da variável;  Um integrador comparando o valor de referencia e o estado atual da variável;  Um efetor que atua para mudar o valor da variável quando o sensor detecta uma mudança suficientemente diferente do valor de referência do sistema. Um mecanismo homeostático bem conhecido como o de regulação da temperatura corporal, pode ser utilizado como exemplo para ilustrar. No corpo humano o ponto de referência interno está ajustado para aproximadamente 37º C para a regulação da temperatura. Os sensores estão localizados no hipotálamo para detectar mudanças na temperatura corporal e a pele monitora a temperatura externa. O integrador está localizado no centro termoregulador no hipotálamo e o efetor inclui as artérias sanguíneas, glândulas sudoríparas e o músculo esquelético liso, coordenados pelo sistema neural. Este mecanismo trabalha dando resposta ao estímulo recebido reagindo com o aumento ou redução da temperatura corporal (TORTUGA, 2009). Segundo Rowland (1998), existe uma equivalência deste sistema para a activitystat (figura 2), em que o set point representa a linha de base da atividade física ou gasto energético, o sensor talvez esteja posicionado no hipotálamo no sistema nervoso central, onde o sangue seja interpretado, o integrador é o circuito neural, e o efetor utilize o ciclo de feedback hipotalâmico para suprimir a atividade voluntária, por meio do ainda indefinido mecanismo neural ou humoral, com os sistemas endocanabinóide e dopaminérgico sugeridos como possíveis mediadores (GARLAND, 2011; THORBURN, 2000). 24 Figura 2 - Representação esquemática pelo qual um regulador biológico central para o gasto energético poderia funcionar. A hipótese da activitystat supõe que o aumento da atividade física de moderada para vigorosa, é acompanhado por uma redução compensatória na atividade física, e um aumento na inatividade para manter um nível estável de atividade física diária. Isto sugere que existe uma estratégia, em que o gasto de energia é fisiologicamente regulado, e que cada indivíduo tem seu próprio “set-point” para a atividade física (BAGGETT, 2008 apud ROWLAND,1998). De acordo com Garland et al (2011), pesquisas em neurobiologia do controle da atividade física na infância, evidenciam ligações entre a sinalização biológica e o controle do comportamento da atividade física, embora seus mecanismos ainda sejam desconhecidos. Goodman et al. (2011); Baggett (2008) realizaram estudos que refutam a existência da hipótese activitystat. Goodman et al, (2011), não observou evidência na redução do acúmulo de atividade física de crianças observadas em suas atividades do cotidiano, enquanto que Bagget, (2008) encontrou uma baixa correlação entre atividade sedentária e o aumento no índice de massa corporal 25 baseado no acúmulo de atividade física. Porém, sugerem que estudos comparando os efeitos de diferentes intensidades de exercício na atividade física e os níveis de inatividade após o programa de exercícios, possam ajudar a esclarecer esta hipótese. Incorporando controles mais precisos entre gasto energético e a atividade física, é possível ajudar a melhorar o entendimento do papel e contexto do exercício físico no gasto de calorias e a hipótese da activitystat. Gomersall et al. (2013) investigaram os principais estudos relacionados a esta teoria e concluíram que há necessidade de estudos mais controlados, deixando recomendações para futuros desenhos experimentais para as investigações sobre a activitystat como por exemplo: os estímulos dos exercícios devem ser suficientes para acionar o suposto mecanismo compensatório, a determinação do estímulo empregado na intervenção deveria ser bem relatado no protocolo e a utilização de um grupo controle é de extrema importância para melhorar o nível de evidência científica. Desta forma, é possível minimizar os efeitos de interferência nos estudos contribuindo de forma mais cuidadosa para compreensão da hipótese da activitystat, pois as evidencias até o momento são inconclusivas. 2.1.1 Evidências Segundo Rowland (2017), uma grande quantidade de dados observados em diferentes estudos fundamenta a evidência de uma função biológica para o controle involuntário do gasto de energia através da atividade física diária. Umas das mais fortes evidências de um comando central para o controle da atividade física diária, se respalda nas observações de que o gasto de energia sob forma de atividade motora declina, quando é ajustado pelo tamanho do corpo ao logo da vida. (BIJEN, 1998; TELAME; YANG, 2000; TURIN, 2005). De acordo com Malina (2008), um condensado de estudos transversais investigou entre as idades de 2 e 18 anos o declínio de atividades em garotos, apontando um declínio de aproximadamente 35%. Além disso, a redução nos níveis de atividade física com a idade, se correlacionam com o declínio da taxa metabólica basal e a ingestão diária de calorias, ambas variáveis reguladas pela atividade da regulação biológica. Tal cenário ocorre no esforço de estabilizar o balanço energético 26 e garantir o funcionamento de outras variáveis visando a sobrevivência do indivíduo. (ROWLAND, 2017) Pesquisas realizadas anteriormente por meio do método de água duplamente marcada e medidas da taxa metabólica basal entre a idade de 1 e 17 anos, mostraram uma redução de 38% no gênero masculino e 25% no feminino. Estudos longitudinais confirmam, que a taxa de declínio do gasto energético através da atividade física, ocorre na fase da infância. Embora inúmeros fatores possam contribuir, existe uma forte relação entre a demanda energética da massa corporal em crescimento e o declínio no gasto energético em forma de atividade física sugerindo uma estratégia de economia de energia (ROWLAND, 2017). Ainda segundo Rowland (2017), quando olhamos para o cenário na fase da vida adulta, a situação é muito semelhante. Vários estudos longitudinais que analisaram os níveis de atividade física abrangendo desde a infância até a idade adulta verificaram declínio dentro deste período. Pesquisas utilizando questionários para quantificar o tempo de atividade física na escola, trabalho e lazer apontaram na faixa etária entre 13 e 27 anos uma redução de 42% para homens e de 17% para mulheres, entre 9 e 27 anos redução de 57% para homens e de 28% para mulheres, acima de 75 anos, a queda foi de 7% para homens e 9% para mulheres. Ideias para a quantificação de atividade física em humanos têm sido na maioria das vezes amparadas em pesquisas com modelos animais. Apesar disso, extrapolar os achados dos roedores com segurança aos seres humanos pode não ser ilimitada, um exemplo é o comportamento da atividade motora em roedores, onde as fêmeas apresentam maior locomoção em ralação aos machos, enquanto o inverso é observado em humanos. (ROWLAND, 2017) Uma outra linha que contribui para compreensão dos hábitos da atividade física e seu declínio ao longo da vida, está focada na identificação de agentes neuroquímicos e sua via de sinalização em animais e humanos. Estes dados corroboram de forma clara a existência de um mecanismo de controle biológico. O mecanismo neural dependente de dopamina tem sido apontado como um agente químico que altera a atividade motora regular. Bronikowisk et al (2004), encontraram uma diferença superior de 20% de receptores de dopamina D2 e D4, durante um experimento de seleção de ratos com altos níveis de atividade nas rodas em relação ao grupo controle. Em outro estudo, altos níveis de atividade de 27 dopamina foram relatados nas regiões nigrostriatal e mesolimbica no cérebro de ratos que apresentavam altos níveis de atividade em rodas (FINK; REIS, 1981). Estudo de eletroestimulação, na substância negra e ventral tegmental em cérebro de ratos, mostram um aumento na atividade espontânea dos animais. Por outro lado, administração de bloqueadores de dopamina seja de forma sistêmica ou direta no núcleo accumbes, tem sido descrita como redutor dos níveis de atividade espontânea em ratos (ROWLAND, 2017). Já em estudos com humanos, Knab e Lightfoot (2010) concluíram em um estudo de revisão, que está claro que o sistema dopaminérgico afeta a motivação para a quantidade de atividade física voluntária em humanos. Outro agente neuroquímico investigado é a orexina ou hipocretina. Trata-se de peptídeo sintetizado na região do hipotálamo lateral atuando diretamente no cérebro. Pesquisas realizadas por Teske et al. (2008) mostram um aumento da atividade espontânea em ratos quando recebem uma injeção de orexina diretamente na região do cérebro, e que por outro lado ocorre uma drástica redução na atividade física espontânea dos animais na ausência de orexina. As observações concluem que a orexina atua na substância negra e nos ventres paraventriculares do cérebro, estimulando a secreção de dopamina atuando no desfecho final do estímulo para a promoção da atividade física motora. A grelina, peptídio sintetizado no estômago tem sido relatado como modulador da atividade física, em algumas situações reduzindo ou aumentando este comportamento após sua administração. (ROWLAND, 2017) Pesquisas focadas no papel do óxido nítrico também apontam este agente neuroquímico com forte poder de modulação no comportamento motor. Acredita-se que ele atue por influência do sistema de atividade neuronal dopaminérgico na substância negra do cérebro. Em sua obra, Rowland (2017) cita outros agentes farmacológicos e químicos, cuja atuação se relaciona com os quadros de comportamento hiperativo ou hipoativo quando se trata de atividade física espontânea em animais e humanos. Vários distúrbios na função cerebral, seja por indução utilizando experimentos ou de ocorrência natural, têm demonstrado afetar os níveis de gasto calórico por meio da atividade física espontânea. Geralmente alterações nos níveis de atividade física são observadas após lesões, tumores e distúrbios de regulação da atividade motora no cérebro tais como: anorexia nervosa (KRON, 1978), 28 transtorno de déficit de atenção e hiperatividade (HASTINGS; BARKLEY, 1978), acromegalia (DANTAS et al., 2013) e síndrome das pernas inquietas (DAUVILLIERS; WINKELMANN, 2013). Outras pesquisas investigam a natureza do "brincar", e buscam explicações em mecanismos de regulação neuroquímicos para entender porque este comportamento diminui ao longo da vida tanto em humanos quanto em animais. Panksepp (1984) verificou que após a administração de morfina o comportamento de brincar dos animais aumenta, mas quando bloqueadores de opiáceos como naloxana são administrados, este comportamento muda reduzindo drasticamente. Desta forma, todas as evidências apresentadas anteriormente oferecem um forte argumento para a existência de um centro de controle biológico para a atividade física em humanos e animais. A ideia da necessidade de um centro de controle involuntário biológico para a regulação da atividade física se fundamenta em uma base evolutiva, devido à necessidade de manutenção do balanço energético corporal (ROWLAND, 2017). 2.2 Ambiente enriquecido O ambiente enriquecido (AE) é classicamente definido como uma combinação de um complexo inanimado e estimulação social, tipicamente composto por um grupo de animais e objetos inanimados (roda de corrida, túnel, pontes, bolas), que facilitam estimulação sensorial, cognitiva, motora e social padronizando a condição de habitação em um laboratório (SZTAINBERG; CHEN, 2010). Este modelo de laboratório animal tem sido concebido para a padronização de manutenção dos animais em bom estado de saúde, facilitando o controle de alimentação, temperatura ambiental, higiene, aumentando a possibilidade de explorar seus comportamentos contribuindo para o avanço da ciência (OLSSON; DAHLBORN, 2002). Segundo estudos conduzidos por Vieira et al. (2015), a manutenção de ratos idosos no ambiente enriquecido, é capaz de proporcionar aumento significativo na massa encefálica, auxiliar no controle dos níveis de glicose, triglicerídeos e na massa corporal, quando comparados com animais mantidos em gaiolas convencionais. 29 Em estudos recentes, o ambiente enriquecido tem sido utilizado como estratégia de neuroproteção em modelos animais durante os diferentes períodos do desenvolvimento do sistema nervoso, impactando de forma positiva na progressão da doença de Parkinson (JUGLING et al., 2017), além de atuar na estimulação da neurogênese em regiões específicas do cérebro, resultando na melhora da memória e aprendizagem (MELANI et al., 2017). O nível de atividade física proporcionados pelo ambiente enriquecido é capaz de aumentar de forma significativa a capacidade aeróbia de ratos em comparação aos animais que são mantidos em gaiolas convencionais verificados pela determinação da máxima fase estável de lactato (JORDÃO et al., 2015). Kobilo et al. (2011) demonstram em seu estudo, que além dos benefícios proporcionados pelo enriquecimento ambiental, a atividade física é um fator de grande relevância capaz de ocasionar neurogênese em ratos. Assim a manutenção de animais em ambiente enriquecido é capaz de promover aumento no acumulo de atividade física, possibilitando explorar seus comportamentos (XIE et al., 2013). 2.3 Modelo experimental de treinamento com ratos O exercício de natação com ratos é um modelo experimental amplamente utilizado para avaliar efeitos do treinamento seja em condições fisiológicas ou patológicas tais como obesidade (SILVIA et al., 2014), diabetes (GHIASI et al., 2015); metabolismo dos lipídeos (STOTZER et al., 2015) e metabolismo da glicose (MOLENA-FERNANDES et al., 2015). O método de natação apresenta alguns benefícios, como não necessidade de seleção de animais, já que todos possuem habilidade inata de nadar, e seu baixo custo do equipamento. As desvantagens nesse método, como o controle da temperatura, a dificuldade na determinação da intensidade, o estresse promovido pelo contato com água, são alguns dos fatores relevantes a se considerar durante um experimento com a natação (GOBATTO et al., 2001). Diferentes protocolos de treinamento estudados em humanos tem sido reproduzido em ratos como por exemplo exercício intermitente e contínuo (LIU et al., 2015). 30 Em modelos experimentais de treinamento físico com ratos é comum utilizar o treinamento contínuo na natação. Um protocolo muito utilizado no treinamento de natação com ratos, como no estudo de Santos; Mello (2010) foram realizadas com sessões de 1h/dia, frequência de 5 dias/semana, sobrecarga de 5% da massa corporal, durante um período 8 semanas. Por outro lado, um protocolo de natação intervalado tem sido utilizado com duração total de 50 minutos por sessão, caracterizado por breves períodos de alta intensidade por 60 segundos, seguido por um período de descanso de 120 segundos em uma plataforma submersa (OLIVEIRA et al., 2013). Recentemente o exercício de natação periodizado tem sido proposto em ratos (DOS-SANTOS; MELLO 2010). Este particularmente reproduz o modelo de periodização usado em treinamentos de alta performance com a sobrecarga (volume/intensidade/recuperação) bem controlados (DOS-SANTOS; MELLO, 2010). O treinamento periodizado é um modelo de treinamento organizado por meio da alternância de estímulos leves, moderados e intensos, divididos em período básico (treinamento de maior volume), específico (treinamento de maior intensidade) e o polimento (fase final onde se busca o pico da performance aeróbia, através da redução do volume e manutenção da intensidade). Com este modelo de treinamento periodizado, esperamos obter mais informações sobre a teoria da activitystat ao invés de adotar um modelo linear com uma intensidade fixa por todo o período de treinamento. Obviamente a estrutura e ativação muscular, biomecânica e atividade metabólica são diferentes entre humanos e ratos, porém, o treinamento apresenta similaridade de resposta entre as espécies. Independente do modelo de treinamento empregado, a avaliação física dos animais é de grande relevância, pois assim é possível verificar as alterações aeróbias provocadas pelo protocolo de treinamento empregado. A máxima fase estável foi estabelecida para natação com ratos e o teste de lactato mínimo para determinação do limiar anaeróbio com humanos (TEGTBUR, 1993) foi adaptado para o modelo de natação com ratos (VOLTARELLI, 2002; GOMES et al., 2007). 31 2.4 Atividade física e exercício físico Recentemente o foco das pesquisas tem se concentrado em compreender os fatores que motivam o indivíduo a se exercitar regularmente e a influência diária no gasto energético, como uma estratégia de prevenção a saúde (PEDERSEN; SALTIN, 2015). A atividade física é definida como qualquer movimento corporal, produzido pelos músculos esqueléticos, que resulta em gasto energético maior do que os níveis de repouso (CASPERSEN et al., 1985) e inclui todas as atividades de lazer, no trabalho ou domésticas (HASKELL, 1994; DUNN,1998). Segundo Garland et al. (2011) a atividade física pode ser classificada como atividade física espontânea, que compreende as atividades para a sobrevivência e homeostase, como busca de comida, abrigo e interação social, e a atividade física voluntária, como por exemplo, as atividades recreacionais e o esporte, dentre outras, que variam em duração e intensidade. A locomoção é de fundamental importância para a manutenção da vida diária da maioria dos mamíferos. Garland et al. (2011) apontam a similaridade da atividade física espontânea e voluntária entre humanos e animais de laboratório, ressaltando que, tal como nos humanos, no modelo experimental com animais, a locomoção representa a atividade física espontânea, realizada para busca de comida e interação social, enquanto que o exercício físico nas rodas de atividade, pode ser considerado uma atividade voluntária, na qual é possível medir o exercício voluntário, por meio de um comportamento clássico de automotivação, que pode ser mensurado pelo deslocamento dos animais. 2.5 Dieta hiperlipídica Existe uma crença comum que o exercício (método de indução ao déficit energético) cause uma compensação no consumo de energia em resposta ao gasto produzido pelo exercício. No entanto, evidências sugerem que a intervenção em gasto de energia, muitas vezes, não é compensada por alterações no consumo de energia, pelo menos a curto prazo (KING et al., 1997). 32 O fluxo de energia no organismo é influenciado, basicamente, pela entrada de energia e o gasto energético. Porém, existe uma complexa relação entre diversos fatores intrínsecos e extrínsecos que vão resultar no balanço energético do organismo. Desta forma, fatores genéticos, fisiológicos, psicológicos (intrínsecas) e ambientais (extrínsecos) podem definir o balanço energético que é fundamental para a manutenção da homeostase celular (BLAIR; HAND; HILL, 2015). A qualidade da dieta em modelo experimental com ratos tem sido utilizada para verificar seus efeitos sobre os níveis de atividade física. Em roedores, a mudança no total dos níveis de macronutrientes e sua ingestão calórica podem alterar a atividade espontânea dos animais (WONG et al., 2014). Assim, examinar a relação entre exercício e ingestão calórica, e as estratégias a fim de amenizar as alterações na homeostase energética, podem ajudar a compreender melhor a hipótese da activtystat. 33 3 JUSTIFICATIVA Gomersall et al. (2013) realizaram uma metanálise, cujo objetivo foi investigar os principais estudos relacionados a activitstat e concluíram que há necessidade de estudos mais controlados, pois as evidencias até o momento são inconclusivas. Desta forma, esta hipótese ainda necessita de estudos para fortalecer sua comprovação. Garland et al. (2011) apontam que há evidências de que o exercício físico voluntário e atividade física espontânea estão sob controle biológico em humanos e roedores. Porém, não há na literatura estudos que comprovem a ocorrência do fenômeno da alteração na homeostase energética, e sua resposta sobre o acúmulo de atividade física diária (voluntária e espontânea), além de mudança na dieta, utilizadas como estratégia, a fim de amenizar as alterações na homeostase energética restabelecendo o set point para atividade física (activitystat) em modelo animal com situação bem controlada. Fica evidente a necessidade de estudos com o ambiente controlado e estímulo adequado para a investigação da veracidade das estratégias utilizadas para restabelecer o set point para atividade física. Presume-se que a evidência para controladores genéticos de atividade locomotora em animais é transferível para humanos, uma vez que evidências sugerem que roedores e humanos compartilham cerca de 75% de seus genomas (LIGHTFOOT, 2011). Rowland (2008) escreveu sobre a hipótese da existência de um centro de controle involuntário biológico para a regulação da atividade física. Ele se fundamenta em uma base evolutiva, devido à necessidade de manutenção do balanço energético corporal intitulado activitystat. Segundo o autor, sob demanda de altos níveis de gasto de energia, um centro de comando biológico situado no hipotálamo é ativado para tentar restabelecer o equilíbrio energético do corpo através da redução dos níveis de atividade física (estratégia de reduzir a saída de energia) e aumento da fome (estratégia de entrada de energia). Com base na literatura apresentada, nasce a pergunta central: o treinamento físico periodizado é capaz de influenciar o acúmulo de atividade física espontânea, voluntária e a ingestão calórica em ratos Wistar. 34 4 OBJETIVOS 4.1 Objetivo geral A teoria da activitystat sugere que quando ocorrem alterações do gasto de energia, com atividade física, o organismo procura restabelecer a homeostase energética, compensando o gasto energético com redução da atividade física, espontânea e voluntária no período em que não se pratica exercício físico, assim como a alteração da ingestão de calorias por meio da dieta consumida. O treinamento periodizado é um modelo de treinamento organizado por meio da alternância de estímulos leves, moderados e intensos, dividido em período básico (treinamento de maior volume), específico (treinamento de maior intensidade) e o polimento (fase final onde se busca o pico da performance aeróbia, através da redução do volume e manutenção da intensidade). Com este modelo de treinamento periodizado, esperamos obter mais informações sobre a teoria da activitystat ao invés de adotar um modelo linear com uma intensidade fixa por todo o período de treinamento. Deste modo, o objetivo geral deste estudo é: - Verificar se a teoria da activitystat ocorre na pratica com o treinamento físico periodizado combinado com dieta hiperlipídica, por meio da atividade física espontânea e voluntária e alteração na ingestão alimentar de ratos. 4.2 Objetivos específicos - Verificar a acurácia e confiabilidade de um sistema de videogrametria na análise do deslocamento de ratos Wistar, rastreados em ambiente enriquecido; - Verificar o efeito do treinamento físico periodizado sobre o acúmulo de atividade física espontânea (deslocamento pela filmagem) e voluntária (roda de atividades) em ratos Wistar. - Verificar se a dieta hiperlipídica interfere na atividade física espontânea e voluntária, no perfil lipídico (triglicerídeos, HDL), glicemia, comportamento alimentar e composição corporal de ratos submetidos ao treinamento periodizado. 35 5 MÉTODOS Para responder aos nossos objetivos, optamos por utilizar o modelo escandinavo na dissertação, o qual preconiza a divisão em seções no formato de estudos ou artigos científicos para responder aos objetivos específicos da dissertação. Assim a dissertação está composta de dois estudos (Figura 3). Cada estudo apresenta um objetivo conforme apresentado na seção anterior. O primeiro objetivo (1° Estudo) foi verificar a acurácia e confiabilidade de um sistema de videogrametria na análise do deslocamento de ratos Wistar, e posteriormente utilizar a videogrametria, para verificar o efeito do treinamento físico periodizado sobre o acúmulo de atividade física espontânea dos animais (2 estudo). Figura 3 - Desenho experimental dos estudos que compõem a dissertação. 36 6 ESTUDO 1. PRECISÃO E CONFIABILIDADE DE UM SISTEMA DE VIDEOGRAMETRIA NA ANÁLISE DO DESLOCAMENTO DE RATO WISTAR. Este manuscrito foi publicado no periódico científico MOTRIZ - JOURNAL OF PHYSICAL EDUCATION (Anexo A). RESUMO O comportamento de animais de laboratório tem sido estudado através da medida do deslocamento em estudos com objetivos diferentes, tais como, verificar os efeitos de fármacos, nutrientes, estímulos ambientais e o exercício físico. Embora métodos diferentes já tenham sido utilizados, a videogrametria de rastreamento manual do deslocamento para a análise em 2D ainda não foi verificada em estudos com animais. O objetivo deste estudo foi verificar a acurácia e a confiabilidade na determinação do deslocamento de ratos Wistar por meio de um software de videogrametria. Para isso, oito ratos Wistar foram alocados em ambiente enriquecido, sendo selecionado um animal para avaliação. A acurácia, avaliada comparando-se a distância conhecida e a distância rastreada foi determinada por 3 avaliadores diferentes, duas vezes consecutivas, através da filmagem de um percurso de 10 metros no ambiente enriquecido e posterior análise do deslocamento do ponto médio marcado em um aparato. Para calcular a confiabilidade (precisão do sistema de medição) e a reprodutibilidade (precisão dos avaliadores) para obtenção da razão de precisão para a tolerância (P/T), os animais foram filmados por 10 minutos em um ambiente enriquecido e analisada a distância do deslocamento do animal por três diferentes avaliadores, três vezes consecutivas. O software Dvideo foi utilizado para a análise do deslocamento, no modo de rastreamento manual. Os resultados obtidos no trajeto de 10 metros da distância conhecida, demonstraram acurácia de 0,10 m, precisão de 0,05 m e bias de 0,07 m. No teste de confiabilidade foi observada P/T = 0,1 metro, entre os três diferentes avaliadores, o que demonstra uma capacidade adequada de medição. O modo de rastreamento manual de videogrametria do Dvideo apresentou elevada confiabilidade e pode ser empregado para a análise do deslocamento em estudos com o modelo experimental com ratos. Palavras-chave: atividade física, deslocamento, videogrametria, análise 2D. 37 INTRODUÇÃO O comportamento de animais de laboratório tem sido estudado através do deslocamento em modelos experimentais com diferentes objetivos. Métodos diferentes têm sido empregados para a análise da distância percorrida, tais como monitor de atividade ultrasônica (AKAKA; HOUCK, 1980), dispositivo eletrônico (TARPY; MURCEK, 1984), cálculo da posição do centro de gravidade no piso (GAPENNE et al., 1990), e detecção por infra-vermelho (CLARKE, 1992). No entanto, estes métodos têm como limitação a impossibilidade de analisar o comportamento dos animais em grupo, ou interagindo entre si. Eles podem rastrear apenas um animal por vez. Além disso, esses métodos requerem um fundo simples (em termos de seus valores de escala de cinza) e podem lidar apenas com uma gama limitada de configurações experimentais (NOLDUS et al., 2001), tornando difícil o rastreamento no escuro. Por outro lado, a análise por videogrametria no modo de rastreamento manual permite a gravação de vários animais em uma gaiola ou ambiente enriquecido para analisar o comportamento dos animais em um grupo através da análise individual dos animais e permite o rastreamento durante o ciclo escuro. Inicialmente, empregada para analisar o movimento de humanos (BARROS, 1999), o uso da videogrametria para a análise do deslocamento passou a ser utilizada no modelo experimental com animais (NOLDUS, 2001). Embora, em estudos com humanos, a aceleração, a velocidade a análise de ângulos dos segmentos corporais sejam parâmetros importantes para algumas áreas do conhecimento, em experimentos com animais o deslocamento por si é um parâmetro importante para o estudo do comportamento. Classificada como atividade física espontânea, o comportamento locomotor é um elemento chave na vida diária dos animais, requerida para a sobrevivência e homeostase (GARLAND et al., 2011). O desenvolvimento de métodos de análise por videogrametria evoluiu e nas últimas décadas a análise do deslocamento foi utilizada em estudos com diferentes objetivos, para entender o efeito de psicoestimulantes (MARIN et al., 2011), ambientes diferentes (XIE et al., 2013), restrição alimentar (LEIGHTON et al., 2014), diferentes condições de habitação (AUGUSIAK; BRINK, 2015) e drogas (SMETHELLS et al., 2016). 38 Embora a videogrametria automatizada seja um método efetivo para a análise do deslocamento, esta evolução tecnológica necessita de equipamentos com custo elevado. Por outro lado, o modo semi-automático de análise do deslocamento dos animais também é uma boa opção, pois utiliza o mesmo método (videogrametria), mas com investimento muito inferior ao método automático. O método semi- automático tem sido em utilizado estudos que necessitam de alta precisão, tais como cinemática angular de movimentos (BARBIERI et al., 2010) e medidas de distância e velocidade no esporte (BUENO, 2014; PEREIRA, 2016). Deste modo, é possível empregar o modo semi-automático de videogrametria em estudos com animais, uma vez que este método de análise de vídeo permite rastrear animais por várias horas e analisar o deslocamento dos mesmos. O software Dvideow (BARROS, 1999, 2007) tem sido utilizado como uma ferramenta em estudos para a análise de movimento (BARBIERI et al., 2010;BUENO, 2014; PEREIRA, 2016) apresentando várias possibilidades de aplicações, para a análise em três dimensões (3D), com uso de, pelo menos, duas câmeras. No modelo experimental com ratos, a análise do deslocamento pode ser feita em duas dimensões (2D), apenas com uma câmera, uma vez que é possível posicionar apenas uma câmera acima da gaiola ou ambiente no qual os animais são alocados e obter imagens para análise do deslocamento dos animais. No entanto, a acurácia e a confiabilidade do método semi-automático de análise de vídeo, utilizando a videogrametria para a análise em 2D do deslocamento ainda não foram verificadas em estudos com animais. O termo acurácia é muito utilizado para indicar a qualidade de uma grandeza observada ou um parâmetro estimado, definida como o grau de proximidade de uma estimativa com seu parâmetro, valor verdadeiro (MIKHAIL; ACKERMAN, 1976). Segundo Montgomery (2004), é possível planejar estudos da capacidade de um sistema de medição para investigar dois componentes de erro de mensuração, através dos parâmetros confiabilidade e reprodutibilidade (R&R). Dessa forma, R&R é uma ferramenta utilizada para a análise da variabilidade associada à contribuição da instrumentação, das condições ambientais e dos avaliadores em determinado processo de medição.A nosso conhecimento, nenhum dos sistemas de análise de deslocamento utilizados no modelo experimental com ratos apresentou uma medida de precisão e confiabilidade. 39 A confiabilidade dos resultados de uma medição está diretamente associada ao conhecimento e ao controle de características do sistema de medição. Desta forma, verificar a acurácia e a confiabilidade da videogrametria para a medida do deslocamento no modelo experimental com animais é preeminente. A proposta deste estudo foi verificar a acurácia e a confiabilidade da determinação da distância percorrida de ratos Wistar com o uso do rastreamento no modo manual. Materiais e métodos Animais Ratos Wistar (Rattus Norvegicus Albinus Wistar), com idade de 120 dias oriundos do Biotério Central da Universidade Estadual Paulista (UNESP) campus Botucatu foram utilizados no presente estudo. Os animais foram alocados em gaiola (ambiente enriquecido) medindo 1,28 mx 58 cm x 45 cm (8 animais/ambiente) no Biotério do Centro Universitário Unisalesiano Campus Lins. O ambiente enriquecido é composto por um grupo de animais e objetos inanimados (roda de corrida, túnel, pontes, bolas e outros) que facilitam a estimulação sensorial, cognitiva, motora e social dos animais (SZTAINBERG; CHEN, 2010). A temperatura (25 ± 1°C) e a luminosidade (ciclo claro/escuro 12/12 h) do biotério foram controladas e os animais tiveram livre acesso à água e alimento.Os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com os termos do Conselho Nacional de Controle e Experimentação Animal (CONSEA) e aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais- CEUA - UNISALESIANO (Protocolo n° 09/2015, em 27/08/2015). Aquisição das imagens para calcular a acurácia Uma Câmera IP Infra 1.3 MP 30M (1280x720) foi fixada na parte central superior do ambiente enriquecido a 1 metro acima da gaiola, por meio de um suporte de meta fixado no teto. A gravação foi gerenciada pelo Software de captura (Citrox), ajustada a uma frequência de aquisição de 60 Hz (resolução da imagem de 720x480). A determinação da acurácia foi feita no mesmo espaço do ambiente enriquecido, no entanto, sem os objetos inanimados. Uma linha de nylon contínua de 40 10 m foi distribuída aleatoriamente no fundo do ambiente. Uma aparato contendo um bastão de madeira com uma mini-bolsa de tecido (4x6 cm) em sua extremidade, marcada com um ponto vermelho de 0.5 cm de raio, como referência ao centro de massa, foi usado para a filmagem de um avaliador ao percorrer o trajeto de 10 m (Figura 1). Figura 1 - Ambiente enriquecido sem os objetos inanimados, com a linha de nylon de 10 m distribuída aleatoriamente ao fundo, marcações das extremidades (pontos de calibração em vermelho) e o bastão com a mini-bolsa marcada com o centro de massa. Após a aquisição do vídeo da rota de 10 metros e processo de calibração que tomou como referência os quatro pontos marcados nos cantos da caixa do ambiente enriquecido, cujas distâncias reais foram previamente medidas, o eixo "X" representou o comprimento do ambiente enriquecido, e o eixo "Y" representou sua largura. Em seguida, três avaliadores realizaram duas medidas de cada deslocamento total pelo ponto médio, usando o modo de rastreamento manual do software Dvideo. Posteriormente, foi criado um arquivo com as coordenadas de tela dos pares ordenados (X, Y) em 2D, do movimento da haste em torno das marcas no fundo do ambiente e, a partir desta informação, o deslocamento do ponto médio foi calculado para obtenção da distância total (m) (Figura 2), em uma rotina específica desenvolvida no software Matlab® 2014a (Match Works Inc, Massachusetts, Estados Unidos). 41 Figura 2 - Imagem do percurso de 10 m a partir das coordenadas X,Y, em 2D, obtida por um dos três avaliadores. Ponto verde = início do rastreamento; ponto vermelho = final do rastreamento. Teste de Acurácia O percurso total percorrido pelo bastão foi rastreado, e verificou-se a acurácia (equação 1), o bias (erro sistemático - equação 2) e a precisão (equação 3) das medidas a partir do cálculo da distância experimental obtida, através das fórmulas apresentadas abaixo: (1) a 2 = b 2 +p 2 (2)    i n =i mμ N =b  1 1 (3)  ² 1 1 1 1        n =i mm N =p onde: a = acurácia; b = bias; p = precisão; µ = valor real; m i = (i = 1, ..., N) = valor observado da medida obtido experimentalmente; =m valor médio das N medidas; N = número de repetições do experimento. 42 Cálculo do Deslocamento A filmagem do ambiente enriquecido, contendo oito animais, foi utilizada para a análise do deslocamento. No entanto, apenas o deslocamento de um animal foi utilizado na análise. Um vídeo com duração de 10 min foi gravado para determinação da distância percorrida daquele animal no ambiente enriquecido. A análise foi feita por três avaliadores diferentes que realizaram duas medições cada um do mesmo vídeo. Os mesmos procedimentos da reconstrução em 2D e os cálculos das coordenadas “X” e “Y” foram realizadas conforme descritos anteriormente, no teste de acurácia. Tal como no teste de acurácia, um ponto de referência na cor vermelha, foi marcado próximo ao centro de massa do animal, para padronizar o rastreamento. O resultado do deslocamento do animal rastreado por um dos avaliadores está apresentado na figura 3. Figura 3. Imagem do rastro de um rato no ambiente enriquecido durante os 10 minutos de rastreamento. Ponto verde = início do rastreamento; Ponto vermelho = final do rastreamento. Confiabilidade e Reprodutibilidade A confiabilidade e a reprodutibilidade por videogrametria no modo de rastreamento manual do Dvideo foram calculadas como proposto pelo método (R & R) (MONTGOMERY, 2004). Assim, a reprodutibilidade refere-se à variabilidade das médias das medidas obtidas por diferentes avaliadores (em diferentes períodos de tempo, ambientes diferentes ou sob diferentes condições) ao realizar repetidas 43 vezes com o mesmo instrumento de medição. A partir do R & R é possível obter os componentes do desvio padrão do erro de medição (σ _ meter) e calcular a relação de precisão com tolerância (P / T), onde um sistema de medição requer medir com precisão o suficiente para interpretar a medida correta entre os avaliadores. Os valores de P / T iguais ou inferiores a 0,1m indicam a capacidade adequada da medida. Os dados de rastreamento foram obtidos a partir do deslocamento do rato para determinar os seguintes parâmetros: σ 2 erro de medição = σ 2 medidor (equação 3) = σ 2 repetitividade (equação 1) + σ 2 reprodutibilidade (equação 2) e razão 6σ medidor (faixa de tolerância total da precisão - equação 4) como segue: ilidadereprodutibσ+daderepetitiviσ=medidorσ=oerromediçãσ 2222 (1) 3 1 =R ( )1 32 R+R+R 2d R =idadeσrepetitiv (2)      32máx x,x,xmáx=x 1      32mín x,x,xmín=x 1 MÍNMÁX x XX=R  2d R =bilidadeσreproduti x (3) 2σ=medidorσ 2 repetitividade + σ̂ 2 reprodutibilidade (4) LIELSE σmedidor = T P  6 onde: =R Média das três amplitudes médias dos avaliadores, 1R = Amplitude média das medidas 1 e 2 do avaliador n°1; 2R = Amplitude média das medidas 1 e 2 do avaliador n°2; 3R = Amplitude média das medidas 1 e 2 do avaliador n°3; d 2 = Fator para amostra de tamanho 2 (1,693), 1x = Média do valor médio das medidas do avaliador n°1, 2x = Média do valor médio das medidas do avaliador n°2, 3x = Média do valor médio das medidas do avaliador n°3, x R = Amplitude para amostra de tamanho 3, P = precisão, T = tolerância, LSE = Limite de especificação superior 44 (média mais o desvio padrão), LIE = Limite de especificação inferior (média menos desvio padrão). RESULTADOS Os resultados das medições realizadas durante o modo de rastreamento manual por três avaliadores apresentaram valores aceitáveis, na comparação entre distância conhecida e distância traçada (Tabela 1). Tabela 1 - Valores obtidos pelos avaliadores no rastreamento de 10 metros. Avaliador Medidas (m) Media Desvio padrão 1° 2° 1 9,77 9,77 9,77 0,005 2 9,67 9,60 9,64 0,053 3 9,81 9,82 9,81 0,007 Os resultados individuais, bem como o desvio padrão e média para as medidas obtidas pelos avaliadores durante os 10 minutos do deslocamento do rato, são mostrados na Tabela 2. De acordo com os resultados observados, a diferença entre os valores máximo e mínimo entre os avaliadores é muito pequeno, resultando no coeficiente de variação (CV = 0,06). Tabela 2 - Valores obtidos pelos avaliadores durante o rastreamento de 10 minutos do rato. Avaliador Medidas (m) Media Desvio padrão 1° 2° 3° 1 13,42 13,42 13,24 13,36 0,10 2 13,45 13,27 13,38 13,37 0,08 3 13,42 13,24 13,34 13,33 0,08 A distância total percorrida, que é a soma dos três diferentes resultados de rastreamento de animais de 10 minutos realizados pelos diferentes avaliadores encontrados foi de 40,08 metros para o avaliador n °1, 40,10 metros (valor máximo) 45 avaliador n °2 e 40,01 metros (valor mínimo ) para o avaliador n °3. A maior diferença encontrada no valor da distância percorrida entre os avaliadores foi de 0,10 metros (0,27%). A figura 4 mostra o resultado do rastreamento do animal pelos três diferentes avaliadores durante a primeira tentativa. Figura 4 - Imagem do rastro de um rato no ambiente enriquecido durante os 10 minutos de rastreamento. Vermelho = avaliador n°1; Verde = avaliador n°2; e Azul = avaliador n°3. A Tabela 3 apresenta os valores das variáveis de erro no teste de precisão, em que foi calculado o rastreamento de uma distância conhecida de 10 metros feita na parte inferior da caixa do ambiente enriquecido. A Tabela 4 apresenta os valores de erro obtidos no teste de confiabilidade através de R & R de um rato no ambiente enriquecido durante os 10 minutos de rastreamento. A relação P / T permaneceu dentro do limite de tolerância (10%). Tabela 3 - Valores obtidos no cálculo de acurácia, precisão e bias do primeiro experimento. TESTE Acurácia (m) Precisão (m) Bias (m) 10 metros 0,10 0,05 0,07 Tabela 4 - Dados das variáveis para o erro de medição σ 2 confiabilidade do segundo experimento. TESTE idadeσrepetitiv bilidadeσreproduti medidorσ 2 Relação P/T R&R 0,08 0,05 0,09 0,1 46 DISCUSSÃO As metodologias baseadas em videogrametria permitem investigar e compreender melhor vários fenômenos em animais de laboratório relacionados ao deslocamento, tais como: o efeito de drogas psicoestimulantes na locomoção (MARIN et al., 2011), quantificar a influência do meio ambiente nos níveis de atividade física, melhorar os protocolos de estudo em animais (XIE et al, 2013) e estudar Informação de memória e orientação espacial (GAPENNE et al., 1990). O presente estudo foi projetado para investigar a precisão e a confiabilidade da medida do deslocamento de ratos Wistar por videogramas usando o modo de rastreamento manual do Dvideo. A interface Dvideo permite obter as coordenadas da tela de um determinado objeto através de um operador, apontando a tela do computador para o objeto cuja coordenada você deseja obter, com a ajuda do mouse. É uma opção usada onde não é possível realizar a medição automaticamente. As conclusões deste estudo, precisão de 1% (0,10 m) e confiabilidade através dos cálculos de R & R (P / T = 0,10 m) demonstraram que o modo de rastreamento manual da videogravação Dvideo 2D é um bom método para análise do deslocamento de ratos Wistar . A precisão 0,10 m, precisão (0,05 m) e Bias (0,07 m) corroboram com estudos prévios (BARROS, 2007; BUENO, 2014), em que através da videogrametria foi verificada a confiabilidade do software Dvideo na determinação do deslocamento em jogadores de futebol e análise de movimentos humanos, respectivamente, demonstrando a sua flexibilidade de aplicação. Embora as situações de análise dos estudos acima sejam diferentes, o deslocamento no campo de futebol, o movimento dos segmentos do corpo humano e, no presente estudo, com deslocamento de ratos, em todas as situações, o uso do software Dvideo apresentou precisão. Especificamente, nos estudos sobre análise de deslocamento no modelo experimental com ratos, a nosso conhecimento, nenhum estudo apresentou a precisão e confiabilidade da medida em seus diferentes métodos, como um monitor de atividade ultra-sônica (AKAKA; HOUCK, 1980), dispositivo eletrônico (TARPY; MURCEK, 1984), cálculo da posição do centro de gravidade no chão (GAPENNE et al., 1990) e detecção infravermelha (CLARK et al., 1992). Portanto, a comparação de 47 nossos resultados com os resultados de outros estudos com animais é limitada. Este é o primeiro estudo que apresenta a precisão da análise de deslocamento no modelo experimental com ratos, demonstrando a confiabilidade do sistema Dvideo, através do modo de rastreamento manual, para uso em estudos com deslocamento no modelo experimental com ratos. A análise por videogrametria permite o armazenamento de informações e analisa o comportamento de vários ratos alocados no mesmo ambiente, o que não é possível fazer com os métodos aplicados em estudos anteriores, como monitor de atividade ultra-sônica (AKAKA; HOUCK, 1980), dispositivo eletrônico (TARPY; MURCEK, 1984), cálculo da posição do centro de gravidade no chão (GAPENNE et al., 1990) e detecção infravermelha (CLARK et al., 1992). Nos estudos citados acima, o rato é avaliado isoladamente, sem interação com outros animais. O sistema de videogrametria permite a análise de deslocamento considerando a interação do animal com outros animais e o meio ambiente, que podem ser manipulados pelo pesquisador. Dentro da análise de videogramas, o método automático tem sido utilizado em estudos sobre o comportamento no ciclo luz / escuridão (VERWEY et al., 2013; ASLANI et al., 2014), distância e velocidade (XIE et al., 2013; SMETHELLS et al., 2016). Por outro lado, a nosso conhecimento, a videogrametria com modo de rastreamento manual ainda não havia sido testada em experimentos com animais. No presente estudo, o modo de rastreamento manual apresentou confiabilidade e precisão. Além disso, o sistema analisado no presente estudo é uma opção de baixo custo em comparação com o método automático, que tem um alto valor comercial, enquanto o software Dvideo foi desenvolvido para fins de pesquisa e disponibilizado gratuitamente. A confiabilidade do modo de rastreamento manual de videogrametria verificada através do estudo dos parâmetros R & R (MONTGOMERY, 2004) demonstrou ser útil para avaliar a ferramenta utilizada no experimento, uma vez que sua configuração foi de 0,1 m, o que indica uma capacidade de medição adequada. O índice R & R é utilizado para verificar a adequação do sistema de medição, determinado por 6 σmeter do intervalo de tolerância total ou precisão na relação de tolerância (P / T). Uma vez que a relação P / T é influenciada pela confiabilidade (precisão básica associada à própria ferramenta de medição) e reprodutibilidade (variabilidade devido ao fato de que o sistema de medição a ser utilizado por diferentes avaliadores), o resultado encontrado para a reprodutibilidade 48 (0,05m) em relação à confiabilidade (0,08m) deixa claro que o uso de videogramas usando o Dvideo entre diferentes avaliadores tem boa confiabilidade. A metodologia de videogrametria do modo de rastreamento manual, empregada neste estudo para ratos, além de apresentar baixo custo, precisão e confiabilidade verificadas, pode ser útil para pesquisa em diferentes modelos experimentais com ratos e outras espécies, como a análise do comportamento social dos ratos Wistar mantidos em ambiente enriquecido, análises em situações isoladas, como labirintos ou qualquer outra condição em que seja possível realizar a aquisição da imagem com vista superior. Finalmente, é importante notar que o presente estudo não encerra esse tópico. O estudo apresenta a limitação de avaliar apenas uma espécie animal, ratos Wistar, em um ambiente enriquecido. Assim, embora a precisão e a confiabilidade do sistema Dvideo tenham sido confirmadas, estudos adicionais devem ser realizados, com animais de outra espécie, como ratos, principalmente por causa da diferença de tamanho corporal e da velocidade de deslocamento entre estas duas espécies animais, e a analise em outro ambiente. 49 CONCLUSÃO A alta confiabilidade do sistema testado no presente estudo demonstra que o modo de rastreamento manual de videogrametria do Dvideo pode ser útil para a análise da distância percorrida em modelos experimentais que estudam os efeitos de diferentes variáveis no comportamento animal, tais como interação social, drogas, alimentos, dieta, atividade física e exercício entre outras. 50 REFERÊNCIAS AKAKA, W.H; HOUCK, B.A. The use of an ultrasonic monitor for recording locomotor activity. Behavior Research Methods & Instrumentation, v.12, n.5, p. 514-516, 1980. ASLANI, S.; HARB, M.R.; COSTA, P.S.; ALMEIDA, O.F.; SOUSA, N.; PALHA, J.A. 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O experimento seguiu as recomendações das Resoluções Brasileiras de Bioética de Experimentos com Animais (lei federal nº 11.794, de 08 de outubro de 2008, Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONCEA). O Estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Unisalesiano - Lins, (Protocolo n° 09/2015, em 27/08/2015) (Anexo B) . 7.1.2 Desenho experimental Todos os animais foram mantidos em ambiente enriquecido durante todo o experimento, sendo consideradas como variáveis independentes o treinamento físico e a dieta hiperlipídica. Os animais foram avaliados através do teste de limiar anaeróbio pelo lactato mínimo (Lam) para natação com ratos (ARAÚJO et al., 2007) para verificação da evolução da aptidão física dos animais. Além disso, o Lam também serviu como parâmetro para distribuição dos quatro grupos experimentais, para que os mesmos apresentassem aptidão aeróbia similar e fossem compostos por animais com diferentes níveis de aptidão aeróbia: Grupo controle (GC), n=8: dieta balanceada padrão e sem treinamento físico. Grupo de treinamento periodizado (TPDP), n=8: dieta balanceada padrão submetidos ao treinamento periodizado de natação. 53 Grupo controle com dieta hiperlipídica (GDH), n=8: dieta hiperlipídica e sem treinamento físico. Grupo treinamento periodizado dieta hiperlipídica (TPDH), n=8: dieta hiperlipídica submetidos ao treinamento periodizado de natação. Inicialmente, o teste de Lam foi realizado após duas semanas de adaptação ao meio líquido, para evitar o efeito do estresse durante o teste. A adaptação consistiu de 1 sessão/dia de 20 minutos em água a 31 ± °C, com profundidade de 25 cm. Posteriormente ao teste de Lam, os animais foram divididos em quatro grupos de acordo com mesmo nível de aptidão aeróbia verificado pelo teste de ANOVA para garantir a homogeneidade, e alocados no ambiente enriquecido. Na semana seguinte os grupos de treinamento iniciaram o período de adaptação ao treinamento, com aumento progressivo da sobrecarga durante duas semanas. O protocolo de treinamento foi composto de seis semanas de treinamento, acompanhado dos procedimentos do experimento (Tabela 1). A intensidade do treinamento foi estipulada com base no Lam individual dos animais e ajustada semanalmente em 5% do Lam, durante todo o experimento (NICHOLAS et al., 2009). Tabela 1 - Linha temporal dos procedimento experimentais. SEMANAS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Adaptação ao meio líquido para teste de Lam - Pré TD TD Teste de Lam TD GC GT Adaptação ao treinamento GT GT Período de treinamento GT GT GT GT GT GT Adaptação ao teste Lam Pós GC Sacrifício TD TD = Todos os grupos, GC = Grupo Controle, GT = Grupo Treinamento, Lam = Lactato Mínimo. 7.1.3 Ambiente enriquecido O ambiente enriquecido (AE) é um ambiente onde são inseridos objetos para estimular os diversos repertórios dos animais. As características do ambiente enriquecido que foi utilizado no presente estudo são: dimensões de 1,30 m x 80 cm x 60 cm, composto por objetos inanimados, brinquedos coloridos, roda de atividade, 54 vasilhas para alocação de alimento e água (Figura 3). Todos os brinquedos foram trocados semanalmente com o intuito de manter a intensidade dos estímulos para o enriquecimento ambiental. Figura 1 - Ambiente Enriquecido. A = visualização superior diurna; B = visualização superior noturna. 7.1.4 Controle da atividade física voluntária (AFV) e espontânea (AFE) A atividade física espontânea foi mensurada pela análise do deslocamento dos animais (TADEU et al., 2017) por meio de filmagem realizada pela câmera e Software de gestão CITROX, e, posteriormente rastreado e os resultados reconstruídos em 2D utilizando o software Dvideow (Digital Video for Biomechanics for Windows 32 bits) (BARROS et al., 1999). Após esta etapa, as informações foram 55 calculadas em uma rotina desenvolvida no software Matlab® 2014a (Match Works Inc, Massachussets, Estados Unidos), para obtenção dos dados de deslocamento dos animais, expressos em metros. A filmagem foi realizada durante 8 semanas logo após a divisão dos grupos, no período escuro, onde ocorre maior atividade dos animais, das 20h00 às 21h00 (XIE et al., 2013). A atividade voluntária foi mensurada por meio de uma roda de atividade inserida no ambiente enriquecido. Esta roda tem 20 cm de diâmetro, 10 cm de largura fixada em uma base com um pilar de metal onde está acoplado um ciclocomputador digital modelo Assize AS-100 para o controle do número das voltas para o cálculo semanal da distância total acumulada. 7.1.5 Protocolo de treinamento periodizado As sessões de natação foram realizadas em um tanque de vidro medindo 2,00m x 1,00m x 1,00m contendo água a 40 cm de profundidade (Figura 2), com baias individuais de tal forma que os animais não pudessem interferir na atividade de natação do outro, com temperatura da água mantida em 31  1º C. O treinamento de natação periodizado teve duração de 6 semanas entre 8:00 e 10:00 h da manhã, prescrito com base na aptidão aeróbia de forma individual determinada pelo teste de Lam. Figura 2 - Tanque de natação com baias individuais. 56 Após a semana de adaptação ao meio líquido para o teste de Lam, os animais do grupo treinamento periodizado (TP) e treinamento periodizado dieta hiperlipídica (TPDH) passaram por um período de adaptação, antes de iniciarem o protocolo de treinamento periodizado, de seis semanas. A adaptação ao treinamento foi feita com aumento gradativo da sobrecarga, até realizarem 50min de exercício com 5% mc, adaptado de Dos-Santos e Mello (2010). Na primeira semana os animais realizaram o exercício sem sobrecarga com aumento progressivo do volume (tempo), com 10min no primeiro dia, 20, 30, 40 e 50min nos dias seguintes. Na segunda semana o volume permaneceu constante (50min/sessão, 5dias/semana) e ocorreu uma adaptação à sobrecarga de 5% da mc, iniciando com 10 minutos de exercício com sobrecarga no primeiro dia, 20 min no segundo dia, 30 min no terceiro dia, 40 min no quarto dia e 50 min no quinto dia (Figura 3). Tempo (Min) 50 40 30 20 10 Dias S T Q Q S S T Q Q S Legenda Recuperação sem exercício Tempo de exercício realizado sem carga Tempo de exercício com sobrecarga de 5 % 1° Semana Adaptação Volume Adaptação Intensidade 2° Semana Figura 3 - Período de adaptação de duas semanas. Após a adaptação ao treinamento, os animais foram submetidos ao protocolo de treinamento periodizado em períodos: básico, específico e polimento (Figura 4), com alternância de carga (volume e intensidade), das sessões de treinamento, conforme proposto Dos-Santos e Mello (2010), similar ao treinamento de alto desempenho em humanos. Figura 4 - Estrutura da periodização do treinamento durante o experimento. 57 Os estímulos durante as sessões de treinamento de natação para os grupos TP e TPDH, foram aplicados em níveis de intensidade aeróbia e anaeróbia. O treinamento aeróbio foi dividido em três diferentes níveis: A-1 (50% abaixo do limiar anaeróbio), A-2 Contínuo (valor do limiar anaeróbio), A-2 Intervalado com pausa passiva (20% acima do valor de Limiar) e A-3 Intervalado com pausa passiva ( 50% acima do valor do limiar). Para o treinamento anaeróbio a divisão dos níveis foi a seguinte: AN-1 (70% acima limiar) e AN-2 (100% acima do limiar). O período preparatório básico de duas semanas foi composto de estímulos combinados entre A-1, A-2 Contínuo, A-2 Intervalado com pausa passiva, A-3 Intervalado com pausa passiva e AN-2, com duração total de 398 minutos e predominância de volume. O período específico foi composto de estímulos combinados entre A-2 Contínuo, A-2 Intervalado pausa passiva, A-3 Intervalado pausa passiva, e AN-1 e AN-2, com duração total de 482,5 minutos com aumento de volume e intensidade. Após estas duas fases, teve início o período de polimento, caracterizado pela redução de volume e intensidade em relação às fases anteriores com duração de 123 minutos (Tabela 2). Para o planejamento de quantificação da carga total de treinamento semanal (CTS), o cálculo foi realizado através da multiplicação do tempo de execução do exercício de natação (minutos) pela intensidade (percentual da massa corporal, % mc), considerando a soma de todos os estímulos de todas as sessões de treinamento realizados pelos respectivos grupos, sem levar em consideração os intervalos de recuperação. Assim, a carga de trabalho foi calculada da seguinte forma: W = TE x % mc (UT) Onde: W = sobrecarga de trabalho de cada sessão de treinamento, expressas em unidades arbitrárias de treinamento (UT), TE = tempo total de exercícios, desconsiderando os intervalos de recuperação, % mc = percentual de massa corporal utilizada como sobrecarga com base no limiar anaeróbio do animal, durante o exercício. 58 Tabela 2 - Periodização utilizada durante o experimento. Período Dias semana Treino Principal Treino Complementar Total IT RepxTempxRec Sobrecarga (% Limiar) IT Tempo (minutos) Sobrecarga (% Limiar) Tempo (minutos) B Á S IC O Segunda A - 1 1 x 20 x (-) 50%↓ A -1 0 50%↓ 20 Terça A - 2 1 x 30 x (-) Limiar A -1 20 50%↓ 50 Quarta A - 3 6 x 4.0 x 1.5 60%↑ A -1 15 50%↓ 31 Quinta A - 1 1 x 50 x (-) 50%↓ A -1 0 50%↓ 50 Sexta A -2 4 x 6.0 x 0.5 20%↑ A -1 20 50%↓ 44 Sáb/Dom - Ausente Segunda A -2 1 x 35 x (-) Limiar A -1 15 50%↓ 50 Terça A -3 6 x 4.0 x 1.5 60%↑ A -1 25 50%↓ 41 Quarta AN - 2 6 x 0.5 x 3.0 100%↑ A -1 30 50%↓ 33 Quinta A -3 6 x 2.5 x 1.0 60%↑ A -1 30 50%↓ 45 Sexta A - 2 6 x 6.0 x 0.5 20%↑ A -1 10 50%↓ 34 E S P E C ÍF IC O Sáb/Dom - Ausente Segunda AN - 1 4 x 5.0 x 1.5 70%↑ A -1 20 50%↓ 40 Terça A - 2 5 x 6.0 x 0.5 Limiar A -1 20 50%↓ 50 Quarta A - 3 5 x 2.5 x 1.0 60%↑ A -1 25 50%↓ 37,5 Quinta AN - 2 6 x 0.5 x 3.0 100%↑ A -1 30 50%↓ 33 Sexta A - 2 5 x 6.0 x 0.5 Limiar A -1 20 50%↓ 50 Sáb/Dom - Ausente Segunda A - 2 3 x 6.0 x 0.5 Limiar A -1 15 50%↓ 33 Terça AN - 1 4 x 1.5 x 0.5 70%↑ A -1 15 50%↓ 21 Quarta A - 3 4 x 2.5 x 1.5 60%↓ A -1 15 50%↓ 25 Quinta AN - 2 4 x 0.5 x 3.0 100%↑ A -1 20 50%↓ 22 Sexta A - 2 4 x 5.0 x 0.5 Limiar A -1 15 50%↓ 35 Sáb/Dom - Ausente Segunda A - 2 3 x 6.0 x 0.5 Limiar A -1 15 50%↓ 33 Terça AN -1 4 x 1.5 x 5.0 70%↑ A -1 15 50%↓ 21 Quarta A - 3 4 x 2.5 x 1.5 60%↓ A -1 15 50%↓ 25 Quinta AN - 2 4 x 0.5 x 3.0 100%↑ A -1 20 50%↓ 22 Sexta A - 2 4 x 5.0 x 0.5 Limiar A -1 15 50%↓ 35 P O L IM E N T O Sáb/Dom - Ausente Segunda AN -2 3 x 0.5 x 3.0 100%↑ A -1 10 SS 11,5 Terça A -3 3 x 2.5 x 1.5 60%↓ A -1 10 SS 17,5 Quarta A -2 4 x 6.0 x 0.5 20%↑ A -1 20 SS 44 Quinta - Teste Lam Sexta A - 2 1 x 40 x (-) Limiar A -1 10 50%↓ 50 IT = Intensidade do treinamento, Rep = repetição, Temp = tempo, Rec = recuperação passiva, ↓ (abaixo) e ↑ (acima), SS = sem sobrecarga adicional. 59 A figura 5 ilustra como foi distribuída a carga de treino ao longo da periodização de 6 semanas de treinamento. Figura 5 - Distribuição da carga de treino semanal (CTS) ao longo de 6 semanas de periodização com os períodos Básico, Específico e Polimento. TP = Treinamento Periodizado, TPDH = Treinamento Periodizado Dieta Hiperlipídica. 7.1.6 Determinação do limiar anaeróbio Para a determinação do limiar anaeróbio foi utilizado o teste de Lam proposto para natação com ratos (ARAÚJO et al., 2007). O teste consiste, inicialmente, na indução da hiperlactacidemia com uma carga de 13% da massa corporal (mc), através do exercício de natação através de 2 séries de 30 segundos seguido de 30 segundos de recuperação, e depois retornando a água até sua exaustão (considerada como 10 segundos submerso na água). Após o período de exercício para indução da acidose, o animal passa por um período de recuperação de sete minutos e no oitavo minuto de recuperação é iniciado o teste incremental. O teste incremental tem início com carga inicial de 4,0 % mc (considerada abaixo o limiar anaeróbio) e aumento de carga de 0,5% mc a cada estágio, até a exaust