UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA DEPARTAMENTO DE CLÍNICA VETERINÁRIA ESTUDO DA VARIABILIDADE DA FREQUÊNCIA CARDÍACA EM EQUINOS DURANTE O CASQUEAMENTO COM A UTILIZAÇÃO DE FEROMÔNIO MATERNO EQUINO RENATA ALVES DE PAULA Botucatu-SP 2018 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA DEPARTAMENTO DE CLÍNICA VETERINÁRIA ESTUDO DA VARIABILIDADE DA FREQUÊNCIA CARDÍACA EM EQUINOS DURANTE O CASQUEAMENTO COM A UTILIZAÇÃO DE FEROMÔNIO MATERNO EQUINO RENATA ALVES DE PAULA Dissertação apresentada junto ao Programa de Pós- Graduação em Medicina Veterinária para obtenção do título de Mestre em Medicina Veterinária. Orientador: Prof. Dr. Simone Biagio Chiacchio Botucatu-SP 2018 Nome do Autor: Renata Alves de Paula Título: ESTUDO DA VARIABILIDADE DA FREQUÊNCIA CARDÍACA EM EQUINOS DURANTE O CASQUEAMENTO COM A UTILIZAÇÃO DE FEROMÔNIO MATERNO EQUINO COMISSÃO EXAMINADORA Prof. Ass. Dr. Simone Biagio Chiacchio Presidente e Orientador Departamento de Clínica Veterinária Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia - UNESP – Botucatu,SP Profa. Ass. Dra. Maria Lucia Gomes Lourenço Membro Titular Departamento de Clínica Veterinária Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia - UNESP – Botucatu, SP Profa. Dra. Leticia Peternelli da Silva Membro Titular Departamento de Clínica Veterinária Universidade de Marília – UNIMAR – Marília/SP Data da Defesa: 06 de junho de 2018. Dedicatória: Dedico essa dissertação aos meus pais Rosangela e Renato, que me apoiaram financeiramente e emocionalmente durante todos esses anos de caminhada profissional. Aos meus orientadores por todo o incentivo, compreensão, paciência e oportunidade em realizar este sonho. “Simpatia para ser feliz: 1- Pegue um cavalo; 2- Escove o cavalo; 3- Coloque a sela; 4- Monte no cavalo; 5- Saia para um passeio. ” Agradecimentos Agradeço primeiramente a DEUS, que me deu o dom da vida e a oportunidade de lutar a cada dia para conquistar os objetivos almejados. Sem ele nada seria possível, só tenho motivos para agradecer: “Obrigada DEUS” por estar comigo até mesmo quando eu menos mereci, por conceder inúmeras graças, por me perdoar e principalmente por não desistir de mim”. Agradeço aos meus pais pois sem eles nada seria possível, por todo incentivo emocional e financeiro durante esta caminhada profissional. Ao meu irmão “Guiga” e aos demais familiares por todas as palavras de carinho e que me deram força. Ao meu orientador Simone pela oportunidade em participar deste programa de pós-graduação e realizar um sonho. A minha também orientadora Malu por todo aprendizado, paciência, dedicação e também pelas críticas construtivas as quais fizeram parte do meu desenvolvimento pessoal e profissional e que levarei por toda a vida, muito obrigada por tudo! A minha “uma vez” e “sempre” orientadora Leticia que me ensinou muito desde o meu estágio curricular até o presente momento e é totalmente responsável por esta conquista além de se tornar uma amiga pessoal e parceira que admiro muito e sou eternamente grata. Agradeço imensamente a minha amiga Amanda que me ajudou por todo este período e sempre esteve comigo nos momentos em que mais precisei, “não tenho nem palavras para expressar o quanto sou grata a você”! A minha amiga e companheira de trabalho Marina, que me deu forças para sempre continuar e esteve comigo durante as coletas e durantes os momentos mais difíceis deste trabalho. E também por autorizar seu funcionário e meu amigo Gaúcho a deixar as suas obrigações para me ajudar neste experimento, sou eternamente grata. Agradeço a minha amiga Raissa, que me ajudou no início desta empreitada e mesmo a distância se empenhou para me ajudar na conclusão deste projeto. Ao Raphael, colega que também ajudou nas práticas e foi muito prestativo na escolha do local para realização da pesquisa. Aos proprietários e funcionários do Haras Josilmar, Fazenda Santa Fé e Santanna’s Ranch, que nos cederam o espaço, funcionários e o tempo de realização deste experimento. Sem vocês isso não teria ocorrido. À todos da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia - UNESP, Campus de Botucatu-SP, que diretamente e indiretamente contribuíram para este trabalho. À Pós-graduação em Medicina Veterinária da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia- UNESP, Campus de Botucatu-SP. E finalmente, mas não menos importante a todos os animais que participaram deste trabalho, pois sem vocês ele não existiria. Lista de Tabelas Página Tabela 1. Mean (standard deviation) and p values for HR, RR, and Blood sugar level measurements obtained through clinical examination of equines undergoing hoof trimming with previous treatment with EMP and placebo. 51 Tabela 2. Mean (standard deviation) and p values for Minimum HR, Average HR and Maximum HR obtained through Holter examination of equines undergoing hoof trimming with previous treatment with EMP and placebo. 51 Tabela 3. Heart rate variability indexes (mean ± standard deviation) obtained through Holter examination in the EMP and Placebo groups before (M1), during (M2) and after (M3) hoof trimming. 52 Lista de Quadros Página Quadro 1. Chart 1. Time-domain HRV indexes…………………………. 47 Lista de Figuras Página Figura 1. Órgão vomeronsal de mamíferos.................................... 25 Figura 2. Modelo biológico de resposta animal ao estresse (Fonte: Moberg, 2000) .................................................... 27 Figura 3. Identified syringes (A e B), the product being prepared and application by the examiner in the outer edges of the animal’s nostril……………………………………………… 47 Figura 4. Holter Equipment – Cables, electrodes, SD Card and protective cover…………………………………………….. 48 Figura 5. Position of the electrodes in the animal left (E) and right (D) sides; Holter device attached to the animal’s neck................................................................................. 48 Figura 6. Equipment used in the hoof trimming procedure (pincer, rasp and hoof knife) and trimming being conducted…………………………………………………… 48 Figura 7. Sequence established for the hoof trimming procedure: (1) Right thoracic limb (MTD); (2) Right pelvic limb (MPD); (3) Left thoracic limb (MTE); (4) Left pelvic limb (MPE)………………………………………………………... 49 Figura 8. Overview of the experiment sequence for the study…… 49 Figura 9. Behavior of the HR in Placebo and EMP groups before (M1) and after (M2) the hoof trimming procedure……… 49 Figura 10. Quantification of the behavioral reactions given by the animals in the Placebo group as registered by Observer 1 (Obs1) and Observer 2 (Obs2)………………………….. 50 Figura 11. Quantification of the behavioral reactions given by the animals in the EMP group as registered by Observer 1 (Obs1) and Observer 2 (Obs2)…………………………… 50 LISTA DE ABREVIAÇÕES BEA: Bem-estar animal FME: Feromônio materno equino FC: Frequência Cardíaca HF: High Frequency Hz: Hertz LF: Low Frequency ms: Milissegundos MTD: Membro torácico direito MTE: Membro torácico esquerdo MPD: Membro pélvico direito MPE: Membro pélvico esquerdo mV: Milivolts NN ou RR Médio: Intervalo entre duas ondas R consecutivas, ou NN médio de todo o registro PNN>50: Percentagem de intervalos RR ou NN adjacentes com diferença de duração superior a 50 milissegundos RMSSD: Raiz quadrada da média do quadrado das diferenças entre intervalos RR ou NN normais adjacentes NSA: Nodo Sinoatrial SDANN: Desvio-padrão da média dos intervalos RR ou NN normais a cada cinco minutos SDNN: Desvio-padrão da média de todos os intervalos RR ou NN normais SDNNi: Média dos desvios padrão dos intervalos RR ou NN normais a cada cinco minutos SNA: Sistema Nervoso Autônomo SNC: Sistema Nervoso Central SNP: Sistema Nervoso Parassimpático SNS: Sistema Nervoso Simpático VFC: Variabilidade da Frequência Cardíaca VN: Vomeronasal SUMÁRIO RESUMO ............................................................................................................................. 12 ABSTRACT ......................................................................................................................... 14 CAPÍTULO I REVISÃO DE LITERATURA ............................ 16 1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................ 17 2. REVISÃO DE LITERATURA ........................................................................................... 18 2.1 ETOLOGIA EQUINA .................................................................................................. 18 2.2 FEROMÔNIOS ........................................................................................................... 21 2.3 MECANISMO DE DETECÇÃO DOS FEROMÔNIOS ................................................. 23 2.4 O SISTEMA NERVOSO AUTÔNOMO E A VARIABILIDADE DA FREQUÊNCIA CARDÍACA COMO INDICADOR DE ESTRESSE ............................................................ 26 3. OBJETIVOS GERAIS ...................................................................................................... 31 4. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................................... 31 CAPÍTULO II ARTIGO CIENTÍFICO ....................................... 32 DISCUSSÃO GERAL ...................................................................................................... 54 CONCLUSÃO GERAL ..................................................................................................... 57 NORMAS DA REVISTA ................................................................................................... 58 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................ 59 12 PAULA, R.A. Estudo da variabilidade da frequência cardíaca em equinos durante o casqueamento com a utilização de feromônio materno equino. Botucatu. 2018. 66p. Dissertação (Mestrado) - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (UNESP). RESUMO A equinocultura encontra-se em constante crescimento e por isso há um maior interesse em estudos científicos que favoreçam a relação homem animal garantindo consequentemente o bem-estar animal. Discussões são cada vez mais frequentes, envolvendo não só as formas de criação como também as práticas as quais são submetidos. A feromonioterapia é uma nova alternativa que vem sendo estudada a fim de tranquilizar e reduzir os problemas relacionados ao medo, ansiedade e fobia e limitando as manifestações do sistema nervoso autônomo e consequentemente o estresse a esses animais. Para tanto, o objetivo deste estudo foi avaliar a variabilidade da frequência cardíaca (VFC) de equinos submetidos ao tratamento com Feromônio Materno Equino (FME) durante o procedimento de casqueamento. Foram avaliados 20 potros, com idade média de vinte e quatro meses, machos e fêmeas sem experiência prévia ao casqueamento que foram divididos em dois grupos (A e B) onde um deles recebeu tratamento com FME e o outro placebo (excipiente sem o princípio ativo), considerado randomizado e duplo-cego. Os parâmetros avaliados foram frequência cardíaca (FC), frequência respiratória (FR), glicemia, VFC e análise de reações comportamentais. O exame clínico foi avaliado em dois momentos sendo: M1 (20 minutos previamente ao casqueamento) e M2 (20 minutos após o casqueamento). Já a VFC, foi avaliada nos momentos pré, trans e pós casqueamento. Os resultados demonstraram que não houve diferenças estatísticas dos parâmetros clínicos avaliados (FC, FR e glicemia) em comparação com os grupos (FME e placebo) em relação aos momentos M1 e M2. A FC mínima, FC média e FC máxima e principalmente os índices da VFC (SDNN, SDANN e SDNNi, RMSSD e PNN50) também não diferiram quando se comparou os grupos nos momentos pré, trans e pós casqueamento. Embora não tenha ocorrido significância, observou-se tendência a 13 diminuição dos parâmetros FC, glicemia e reatividade em um dos grupos, havendo percepção nítida de mudança no comportamento durante o casqueamento sugerindo maior tranquilidade dos equinos durante o procedimento, com a feromonioterapia. Palavras-chave: Bem-estar animal, VFC, Comportamento, Feromonioterapia, Holter 14 PAULA, R.A. Study of the heart rate variability in equines during hoof conformation procedure with the use of maternal equine pheromone. Botucatu. 2018. 66p. Dissertação (Mestrado) - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (UNESP). ABSTRACT The horse breeding is found in constant growth and then there is a greater interest in scientific studies that favor the animal man relationship therefore ensuring animal welfare. Discussions are increasingly frequent, involving not only the forms of creation but also the practices which are submitted. Pheromone therapy is a new alternative that has been studied in order to reassure and reduce the problems related to fear, anxiety and phobia and limiting the manifestations of the autonomic nervous system and consequently the stress to these animals. For this purpose, the aim of this study was to evaluate the heart rate variability (HRV) of horses submitted to treatment with Maternal Equine Pheromone (MEP) during the hoof trimming. We evaluated 20 foals, with an average age of twenty-four months, males and females without prior experience to the hoof trimming that were divided into two groups (A and B) where one received treatment wich MEP and and the other placebo (excipient without the active ingredient), considered randomized and double-blind. The parameters evaluated were heart rate (HR), respiratory rate (FR), blood glucose, HRV and analysis of behavioral reactions. The clinical examination was studied in two moments: M1 (20 minutes before the procedure hoof trimming) and M2 (20 minutes after the procedure hoof trimming). Already the HRV was evaluated in pre, trans and post procedure hoof trimming. The results showed that there was no statistical differences of clinical parameters evaluated (FC, FR and glucose) compared to the groups (MEP and placebo) in relation to the moments M1 and M2. Minimum FC, medium FC and maximum FC and especially the index of VFC (SDNN, SDANN e SDNNi, RMSSD e PNN50) also did not differ when compared the groups in moments pre, during and after procedure hoof trimming. Although there has not been significance there was a tendency to decrease the parameters FC, blood glucose and reactivity in one of the groups, there being clear perception of change in behavior during procedure hoof 15 trimming with pheromone therapy suggesting greater tranquility of equines during the procedure. Keywords: Animal welfare, Behavior, HRF, Pheromone therapy, Holter 16 CAPÍTULO I REVISÃO DE LITERATURA 17 1. INTRODUÇÃO Pesquisas recentes demonstraram que a equinocultura brasileira está em ascensão e que nos últimos 10 anos da atividade ocorreu um aumento de aproximadamente 12% no seu faturamento bruto anual. De acordo com IBGE – Instituto Brasileiro de Geografia Estatística (2016) o Brasil possui uma população de aproximadamente 5 milhões de equinos onde 1,1 milhões são animais destinados a esporte, lazer e criação e o restante 3,9 milhões, realizam atividades de trabalho no campo. A preocupação com o bem-estar animal (BEA) no Brasil vem se destacando cada vez mais, pois vários setores da sociedade têm se organizado no sentido de reivindicar melhorias nas condições das criações de animais. Discussões tem sido realizadas com enfoque nas atividades equestres, o que torna de extrema importância estudos utilizando métodos científicos que comprovem em quais situações os animais sofrem alterações na qualidade de vida e no bem-estar e, consequentemente, determinar métodos que auxiliem positivamente nos sistemas de criação (GONTIJO et al., 2014). Como o homem interviu na biologia e natureza dos equinos alguns procedimentos foram introduzidos no manejo destes animais, como por exemplo o cuidado intensivo no casco. O casqueamento deve ser realizado principalmente nos cavalos estabulados, pois estes necessitam de cuidados diários de manutenção, higiene e equilíbrio. O contorno dos cascos dos membros torácicos deve sempre obedecer a forma arredondada e, dos membros pélvicos ligeiramente ovalados, sempre mantendo a concavidade da sola, barras sólidas, ranilha nitidamente acima do solo quando o membro repousa sobre superfície lisa, também deve-se manter uma inclinação de pinça paralela ao eixo da quartela (SAMPAIO; SILVA, 2013). Estas situações quando inéditas podem se tornar estressantes se realizadas de forma negativa ao animal, pois o mesmo será obrigado a realizar adaptação e alterações fisiológicas para sua sobrevivência (MENGOLI, 2014). Quando realizado de forma traumática pode predispor ao desenvolvimento de comportamentos não desejados, comprometendo assim o BEA, uma vez que, dentre os mamíferos domésticos, o cavalo é significativamente evoluído em termos cognitivos (HELESKI et al., 2002) 18 O estresse pode elevar a frequência cardíaca (FC) em decorrência da ativação do sistema nervoso simpático (SNS) e liberação de catecolaminas (SCHMIDT et al., 2010). A descoberta da relação entre o sistema nervoso autônomo (SNA) possibilitou a elaboração de estudos vinculados ao aumento da atividade simpática e redução da atividade parassimpática sendo a variabilidade da frequência cardíaca (VFC), o marcador mais promissor da atividade do SNA (LOPES et al., 2013). No entanto, a avaliação de uma resposta ao estresse é melhor realizada quando se compara comportamentos e medidas fisiológicas (BROOM, 1991; MASON E MENDL,1993). Substâncias neurolépticas, sedativas e tranquilizantes, podem ser utilizadas a fim de melhorar e facilitar o manejo em algumas práticas, porém, podem causar efeitos colaterais, como por exemplo, alterações hematológicas e bioquímicas que acabam por repercutir na homeostase orgânica (COOPER, 1998; FALEWEE et al., 2006). Uma alternativa promissora para os problemas relacionados ao medo, ansiedade e fobia é a feromonioterapia, comprovada cientificamente com estudos realizados nas espécies canina, felina, suína e leporina (GAULTIER et al., 2005). Em equinos a sua eficácia foi estudada em casos isolados, porém é uma ferramenta que pode otimizar o manejo, bem como facilitar a relação homem-animal promovendo a prática do BEA (FALEWEE et al., 2006; COZZI et al., 2011). Sendo assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar a VFC em potros submetidos ao manejo de casqueamento sob efeito do tratamento com feromônio materno equino (FME), visando-se o emprego do mesmo a fim de propiciar o bem- estar destes animais. 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1 ETOLOGIA EQUINA A etologia é definida como a ciência que estuda o comportamento animal a partir de observação e descrição detalhada, com o principal intuito de entender o funcionamento de mecanismos fisiológicos (BROOM & FRASER 2010). Este estudo pode ser abordado de duas formas: fisiológica e psicológica. A primeira está relacionada a mecanismos do sistema nervoso e sua relação com o comportamento 19 animal e a segunda, aos fatores ambientais e históricos que podem interferir no comportamento animal. Ambas estão intimamente ligadas ao BEA (CINTRA, 2014). Desde a sua domesticação, que ocorreu entre 5.000 e 6.000 anos, os cavalos enfrentaram grandes mudanças realizadas pelo homem, que passou a controlar sua alimentação, habitat e forma de socialização destes animais, artificialmente (CINTRA, 2011). Na natureza, os equinos eram livres e independentes para migrarem juntamente com a sua tropa para diferentes locais (nômades), fugindo de predadores onde o principal objetivo era encontrar um ambiente seguro mesmo que este não tivesse conforto e alimentação suficiente para todos (BIRD, 2004; CINTRA, 2014). Além da busca pela segurança, a socialização era outro fator relevante nestes grupos, que geralmente eram formados por até 20 animais, dentre estes, garanhões, éguas e potros que estabeleciam uma hierarquia e uma interação social intensa (BIRD, 2004). Com a intervenção do homem, os equinos passaram a ser confinados em locais reduzidos com capacidade de locomoção restrita por até 24 horas. Raramente possuem contato com outros animais de mesma espécie tornando improvável a interação social (FUREIX et al. 2009). De acordo com Goodwin (1999), a sobrevivência e o sucesso da reprodução de um animal dependem exclusivamente do seu comportamento e de sua interação com o ambiente. Em relação ao comportamento alimentar, os cavalos possuem um sistema digestório adaptado para receber pequenas quantidades de alimento por longos períodos do dia e da noite e quando no seu ambiente natural, permanecem cerca de 60 a 70% do dia pastejando. Entretanto quando estabulados passam a receber grandes quantidades de alimentos em um tempo reduzido (20% do dia) e, sofrem modificação na qualidade e composição da dieta (BIRD, 2004; CINTRA, 2014). Todas estas modificações despendem de ajustes anormais ou extremos na fisiologia e no comportamento do animal e estas novas adaptações são consideradas como uma situação de estresse que afeta diretamente o BEA (CASEY, 2002; THORNE et al., 2005; VISSER et al., 2008). O termo BEA é interpretado erroneamente quando se admite que o termo em si significa apenas que o animal está sendo bem alimentado, com excesso de cuidados e confinados em baias. A ciência que estuda bem-estar fundamenta-se não apenas na integridade física, mas também na saúde mental dos animais que se 20 correlaciona totalmente ao respeito com a sua natureza (BROOM, 2004). De acordo com Smythe (1990) o cérebro do cavalo foi especialmente adequado para os requisitos de um animal que vive pastando e consequentemente atento a predadores. Nos últimos anos, houve um aumento do número de provas científicas que sustentam a ideia de que a capacidade cognitiva dos animais é muito maior do que se pensava antigamente, e assim comprovou-se que os animais têm sentimentos bons e ruins, e por isso são considerados seres sencientes (DUNCAN E PATHERICK, 1991). A senciência é a capacidade que um ser tem de sentir conscientemente algo, ou seja capaz de vivenciar experiências positivas e negativas. Isso ressalta a importância em atentar-se para os sentimentos de medo, ansiedade, frustração e sofrimento à que esses animais são submetidos (DUNCAN, PATHERICK, 1991; MOLENTO, 2006). Estas sensações nem sempre são facilmente identificadas pois apresentam uma subjetividade na interpretação de suas variáveis (PROCTOR, 2012). Blake (1977) descreveu o cavalo como uma das espécies mais sensíveis para identificar e modular os estímulos do meio ambiente, sendo assim, estes muitas vezes interpretam comandos realizados pelo homem como uma ameaça e mesmo quando habituados podem manifestar uma reação de medo ou comportamento relacionado a luta, fuga ou inerte (MENGOLI, 2014). Devido a característica natural dos cavalos em conviver em grupos hierárquicos, os mesmos podem ser facilmente dominados pelo homem, que deve ater-se a estratégias de trabalho que permitam uma relação forte e positiva entre ambos, principalmente quando se trata de animais jovens que ainda estão em processo de formação (SMYTHIE, 1990; CINTRA, 2014). Kiley-worthington (2011), diz que emoções prazerosas, consideradas positivas e não prazerosas, consideradas negativas são necessárias para o aprendizado do animal. Sendo assim, compreender como os animais interpretam as emoções nas práticas a que são submetidos é fundamental para melhorar o seu bem-estar e a sua qualidade de vida (PROCTOR,2012). Waring (2003), afirma que os cavalos possuem uma memória considerada longa e além disso uma dificuldade em modificar um comportamento aprendido por algo novo. Por isso, é de extrema importância que o primeiro contato de um animal com uma experiência nova seja positivo, pois esta resposta é que irá permanecer 21 quando estiverem diante de uma experiência similar no futuro (CINTRA, 2014; MENGOLI, 2014). 2.2 FEROMÔNIOS Além do estudo do comportamento outras ferramentas vêm sendo avaliadas a fim de auxiliarem a relação homem versus animal como por exemplo o uso do feromônio. Essa substância vem sendo pesquisada a fim de otimizar a prevenção de alterações comportamentais relacionadas ao estresse, ao comportamento em si e ao contato social por modular eventos relacionados a cópula, agressão, ligação de mãe- filho, reconhecimento familiar, apaziguamento e sincronização de estro (BERGER et al., 2013). O termo feromônio, criado por Peter Karlson e Martin Lüscher em 1959, surgiu a partir das palavras gregas pherein (transportar) e hormone (estimular) e foi definido como “substâncias secretadas para fora de um indivíduo e recebidas por um segundo indivíduo da mesma espécie, no qual liberam uma reação específica, por exemplo, um comportamento determinado ou processo de desenvolvimento”. Também são denominados como semioquímicos ou ectormônios (DALACQUA; BARROS, 2006), sendo considerados compostos orgânicos, geralmente voláteis e hidrofóbicos, que podem ser hidrocarbonetos ou incluírem grupos funcionais como álcoois, aldeídos, cetonas (BRENHAS, SILVA, 2008). A comunicação entre os animais pode ocorrer por sinais visuais, sonoros ou químicos que desencadeiam uma ponte de comunicação entre indivíduos. Os feromônios são considerados substâncias de ação interespecíficas quando são acionados em seres da mesma espécie, ou são considerados intraespecíficos quando têm ação na fisiologia ou no comportamento de animais de espécies distintas (VILELA et al., 1987). Ressalta-se a importância entre a distinção dos termos hormônios e feromônios onde diferenciam-se principalmente pelo meio em que são liberados, sendo o primeiro substâncias produzidas internamente, influenciando o metabolismo do animal e o segundo emitido para o meio externo, promovendo uma interação entre indivíduos da mesma espécie (BRENHAS, SILVA, 2008). 22 Os semioquímicos são produzidos em locais diferentes do organismo, de acordo com cada espécie e quando liberados no ambiente são interpretados por indivíduo da mesma espécie como forma de sinalizar aceitação de acasalamento, fortalecimento de laços entre mãe e prole, além de auxiliar na socialização dos animais (VAGLIO, 2009). Nos mamíferos, os estímulos feromonais podem ser derivados da urina, fezes e/ou glândulas cutâneas (ARANDA, 2011). Em humanos são encontrados na pele sendo secretados por glândulas sudoríparas, onde ocorre a síntese, armazenamento e posterior liberação nos queratinócitos sobre forma de metabólitos (COWLEY, 1991; BERLINER, 1991; COHN, 1994). De acordo com Vaglio (2009), no momento do nascimento e durante as primeiras semanas de vida ocorre a produção e liberação do feromônio materno na região para-axilar, que é responsável pelo direcionamento e reconhecimento do mamilo pelo bebê. Em coelhas, imediatamente após o parto, há liberação de um feromônio mamário, 2-metil-but-2-enal (2MB2), para promover a sucção em seus filhotes. Schaal et al., (2003), realizou experimento onde uma vareta de vidro foi embebida em 2MB2 e apresentada a coelhos recém-nascidos que imediatamente demonstraram comportamentos de busca e apreensão (LOGAN, 2015). Em suínos, Wells (2009) relata os benefícios da utilização de feromônios, tais como redução de comportamento agressivo durante reagrupamento de animais usando cheiro de feromônios sexuais e diminuição de brigas e melhor ganho de peso no agrupamento de leitões pós desmame com uso de feromônios maternos. Krebs (2007) verificou que leitões desmamados expostos a aroma de banana e feromônio materno passaram mais tempo em repouso, e, ainda, os tratamentos exerceram um efeito positivo sobre o sistema imune. Por outro lado, não diminuiu a concentração de cortisol, hormônio indicador de estresse (MAIA et al., 2013). Na espécie felina há produção e deposição de feromônios principalmente pelas comissuras labiais, face, coxins plantares e urina no momento em que realizam a marcação territorial pelo movimento facial ou contato do leito ungueal em objetos ou pessoas e marcação urinária (HENZEL, 2014). Em cães, os feromônios sintéticos têm indicação para redução da ansiedade em decorrência da separação do dono, facilitar aprendizado de filhotes, melhorar a 23 socialização, diminuição do medo e excitabilidade. Esta substância mimetiza o feromônio produzido pela cadela lactante (HENZEL, 2014). Outrora, em equinos há produção do feromônio materno equino (FME) que foi isolado da secreção sebácea próximo as glândulas mamárias imediatamente após o parto. O número de estudos relacionados ao seu uso aumentou consideravelmente nos últimos anos. O FME não só envia sinais calmantes, mas também serve como um guia para o recém-nascido encontrar o úbere facilitando assim a sucção e intensificando assim a relação da égua com o potro (COZZI et al., 2011). Os análogos sintéticos de feromônios vem sendo utilizados para reduzir problemas relacionados ao comportamento dos animais, e em situações envolvendo um alto potencial de estresse (COZZI et al., 2012; HENZEL, 2014) onde os animais apresentam ansiedade e fobia (GAULTIER et al., 2005). É considerada uma substância que não interfere na capacidade cognitiva e de memorização e por isso é considerada ideal para atividades que requerem estes fatores (MENDONÇA; MENGOLI, 2014). 2.3 MECANISMO DE DETECÇÃO DOS FEROMÔNIOS Os mamíferos desenvolveram um mecanismo de condução destas moléculas em suspensão até o órgão vomeronasal (OVN). Este mecanismo, denominado como Reflexo de Flehmen é caracterizado como um movimento de elevação e extensão da cabeça, retração do lábio superior e exposição da gengiva sem movimentação da articulação-têmporo-mandibular, o que permite a inalação da substância em questão (CROWELL-DAVIS; HOUPT, 1985). Além do OVN a detecção dos feromônios podem ocorrer através do epitélio olfatório principal (EOP). O epitélio olfatório principal (EOP) juntamente com o bulbo olfatório principal (BOP) e suas projeções constituem o sistema olfatório principal (SOP), que é capaz de perceber uma diversidade de odores, incluindo alguns feromônios. O OVN em conjunto com o bulbo olfatório acessório (BOA) e suas projeções, compõem o sistema olfatório acessório (SOA) (DIAS; SILVA; MATTOS, 2008). 24 O OVN, é uma estrutura tubular de extremidade cega bilateral dividida pelo septo nasal, geralmente localizada diretamente acima da cavidade oral (CO), na base da cavidade nasal (CN). Seu lúmen é revestido por neurônios receptores, geralmente preenchidos por fluido oriundo das glândulas vomeronasais, as quais apresentam ductos secretórios localizadas nas paredes dorsais e ventrais do lúmen vomeronasal. Lateralmente ao lúmen, são visualizados vasos e seios sanguíneos inervados por fibras do sistema nervoso autônomo. Na sua superfície convexa encontra-se uma fileira de células ciliadas não sensoriais (DIAS; SILVA; MATTOS, 2008). O tamanho do referido órgão e seu desenvolvimento variam de acordo com a espécie animal (SCHNEIDER et al., 2008). Em roedores situa-se dentro da CN, em gatos dentro do canal nasopalatino, o qual conecta as CN e CO e em bovinos abre- se diretamente na CO (DUKES, 2006). Nos equinos não existe comunicação entre as CN e CO. Os ductos incisivos são fechados em cada lado da CO e continuam caudalmente com um canal em fundo cego, dando origem ao VN (PAGEAT, GAULTIER, 2003; BERGER et al., 2012). Em cetáceos, alguns morcegos e alguns primatas o VN está ausente. Em alguns humanos adultos podem existir cavidades vomeronasais portanto, sem tecido neural (IBARRA-SORIA; LEVITIN; LOGAN, 2014). No entanto, estudos sugerem que a espécie ainda pode perceber certos feromônios, por exemplo, em mulheres que vivem próximas pode ocorrer uma sincronização de ciclos menstruais (BERGER et al., 2013). Os efeitos fisiológicos e hormonais da estimulação feromonal ocorrem através de projeções dos neurônios para o BOA. O BOA envia axônios para o núcleo medial da amígdala (MeA), núcleo posterior cortical da amígdala (PCoA), núcleo próprio do trato olfatório acessório e para o núcleo próprio da estria terminal (BNST – bed nucleus of the stria terminalis). O núcleo MeA possui projeções para o BNST e para a área pré-optica medial (APOM), bem como para o hipotálamo ventromedial (VMH). Já o PCoA tem projeções para o núcleo periventricular anteroventral (AVPV), VMH e projeções indiretas para a APOM, estando assim relacionadas com a modulação e comportamentos sociais e reprodutivos (DIAS; SILVA; MATTOS, 2008). Existem convergências entre as projeções do SOA e o SOP isso significa que tanto o BOP quanto o BOA se projetam para vias consideradas apenas do SOP (núcleo lateral do trato olfatório, amígdala cortical anterior) ou apenas do SOA 25 (amigdala anterior ventral, núcleo próprio do trato olfatório acessório e núcleo anteroventral medial da amígdala)(DIAS; SILVA; MATTOS2, 2008). Na figura 1, pode-se observar a posição e conexões do OVN em um roedor (hamster) para ilustrar a organização geral em mamíferos. O diagrama mostra o OVN localizado dentro de uma protuberância longitudinal ao lado esquerdo do septo nasal. Os neurônios sensitivos vomeronasais compõem um grupo sensorial de células (fornecem o sentido do olfato) revestindo uma cavidade longa (lúmen) dentro da cápsula óssea fina que envolve o órgão. O ducto estreito, que se abre para o assoalho da cavidade nasal logo abaixo da narina, é o único acesso para os semioquímicos. Os neurônios sensoriais vomeronasais de mamíferos detectam substâncias químicas específicas, algumas das quais podem atuar como sinais de comunicação de outros indivíduos da mesma espécie e desencadear a geração de impulsos elétricos que transportam as informações para o cérebro (DIAS; SILVA; MATTOS2, 2008). Figura 1. OVN de mamíferos (Fonte: http://www.justpetcats.com/cat-behavior/the- flehmen-response-in-cats/) O hipotálamo é uma das mais importantes regiões do cérebro, reconhecidamente envolvida no processamento de feromônios e também no controle de funções hormonais e endócrinas (BEHR, 2009), possui conexão com muitas partes do SNC, incluindo o hipocampo, o núcleo amilóide, e os lobos frontais do córtex. A percepção dos odores atua não só nas fases do processo reprodutivo, como também 26 no reconhecimento do parceiro no comportamento sexual e durante a realização de comportamentos maternos envolvendo mãe-filhote (DIAS; SILVA; MATTOS, 2008). 2.4 O SISTEMA NERVOSO AUTÔNOMO E A VARIABILIDADE DA FREQUÊNCIA CARDÍACA COMO INDICADOR DE ESTRESSE O sistema nervoso pode ser dividido em duas partes: o sistema nervoso central (SNC), que inclui encéfalo e medula espinhal, e o sistema nervoso periférico (SNP), que consiste em nervos cranianos e nervos espinhais que se conectam com estruturas somáticas. Além disto, distingue-se o sistema nervoso autônomo (SNA), que coordena a atividade das estruturas viscerais (músculo liso, músculo cardíaco e glândulas). O SNA tem elementos no SNC (tronco encefálico) e no SNP (medula espinhal), e ambos possuem componentes sensitivos e motores (FRADSON; WILKE; FAILS, 2005). Apresenta duas divisões clássicas, simpática e parassimpática. A divisão simpática do SNA prepara o organismo para enfrentar o estresse produzido por uma combinação de alterações fisiológicas frequentemente denominada resposta de luta ou fuga. A divisão parassimpática do SNA é em muitos casos antagônica a divisão simpática e é responsável em promover digestão e armazenamento de glicogênio, proporcionando ao organismo um estado de repouso (FRANDSON, WILKE, FAILS 2003). A resposta biológica à um estímulo estressor é dividida em três estágios: reconhecimento do agente estressor, defesa biológica contra o agente estressor e consequências da resposta ao estresse (Figura 2). 27 FIGURA 2: Modelo biológico de resposta animal ao estresse (Fonte: Moberg, 2000). Inicialmente o animal tenta evitar o estímulo estressor mantendo-se no mesmo local. Posteriormente, há ação do mecanismo de luta ou fuga, que ativa o sistema cardiovascular, gastrointestinal, glândulas exócrinas e medula adrenal (MOBERG, 2000). A síndrome de luta ou fuga é caracterizada pela ativação do SNS que estimula a medula adrenal ocasionando um aumento na secreção das catecolaminas (adrenalina e noradrenalina), e, consequentemente aumento na FC, circulação sanguínea em músculos esqueléticos, diminuindo, desta forma, as reservas de glicogênio para aumentar a energia disponível. As catecolaminas são secretadas rapidamente em momentos críticos, proporcionando ao organismo a possibilidade de reação muito rápida (MOBERG, 2000). A frequência cardíaca responde dinamicamente a alterações fisiológicas mediada pelo SNA através de impulsos nervosos eferentes vagais e simpáticos, (CRUZ-ALEIXO, 2017) de forma intrínseca e extrínseca. A modulação intrínseca decorre dos disparos rítmicos determinados pelo nodo SA que, posteriormente, percorrem todo o tecido cardíaco, e a regulação extrínseca pela inervação autonômica simpática e parassimpática (JENSEN-URSTAD et al., 1997). Alterações na atividade cardíaca podem ser fortemente influenciadas pelo comportamento, portanto esta observação torna-se difícil de ser realizada devido aos padrões comportamentais entre espécies não serem padronizados, tornando a análise subjetiva. Um outro fato a se considerar é que, as alterações da atividade cardíaca 28 podem ocorrer antes de qualquer alteração de comportamento ou até mesmo depois. Por exemplo, algumas aves desenvolvem taquicardia antes de realizar um voo (BORELL et al., 2007). A influência do SNA sobre o coração ocorre por quimiorreceptores, barorreceptores, receptores atriais e ventriculares, sistema respiratório, sistema vasomotor, sistema renina-angiotensina-aldosterona e, entre outros, sistema termorregulador. O controle autonômico cardíaco está intimamente ligado à FC, a qual sofre flutuações fisiológicas batimento a batimento. Esse mecanismo de controle ocorre através de vias aferentes medulares e vagais, onde a informação que atinge o SNC é modulada e retorna ao coração pelas fibras eferentes vagais rápidas e eferentes simpáticas lentas. Como a dissipação da noradrenalina, liberada nas terminações simpáticas, é mais lenta que a da acetilcolina nas terminações vagais, essa diferença na velocidade de transmissão nas vias colinérgicas e adrenérgicas resultarão em desigualdades na frequência de modulação desses dois sistemas no nodo SA (ZHOU et al., 2015). Por ser considerada um grande indicador para verificar a atividade do SNA, a VFC vem sendo correlacionada com a resposta comportamental em animais frente a agentes estressores, condições patológicas, práticas de manejo, regimes de treinamento bem como o comportamento e temperamento em várias espécies de animais de fazenda e de companhia. Tornou-se uma ferramenta de estudo de grande importância na última década e fez com que vários grupos de estudo em cardiologia, se unissem para identificar e compreender através de pesquisas, a capacidade da mesma em avaliar estresse e BEA (BORELL et al., 2007). Estudos demonstraram a utilidade da análise da VFC no domínio do tempo como um indicador da atividade simpática durante um período de tensões físicas e psicológicas (KUWAHARA et al., 2004; BORELL, 2007). Indivíduo com baixo tônus vagal apresenta-se mais vulnerável ao estresse. Uma alta atividade vagal tem sido associada à regulação autonômica eficiente, o que permite um organismo aumentar sua sensibilidade em respostas aos desafios ambientais e fisiológicos (BORELL, 2007). A VFC descreve as oscilações dos intervalos entre os batimentos cardíacos consecutivos (intervalos RR). Como ferramenta de pesquisa, a avaliação da VFC tem permitido o melhor entendimento da participação do SNA em diferentes situações 29 fisiológicas, patológicas e terapêuticas (CRUZ-ALEIXO, 2017). Estudos têm demonstrado que a diminuição da VFC está relacionada com um maior índice de morbidade e mortalidade cardiovascular em humanos (ABREU, 2012; LOTUFO et al., 2012). A ativação do SNS resulta em maior cronotropismo, inotropismo e dromotropismo cardíaco, além de redistribuir a circulação sanguínea e ativar sistemas como o renina-angiotensina-aldosterona, preparando o organismo para situações de estresse (NETO, 2011). Em contrapartida, a ativação parassimpática modula, de maneira inversa, essas variáveis, constituindo, desta forma, o balanço autonômico cardíaco. A variação dos intervalos de despolarização cardíaca, provida pela influência autonômica, pode ser detectada ao eletrocardiograma pelas diferentes distâncias entre as ondas R normais (intervalos RR ou NN) (PASCON, 2009; SCHWAB et al., 2004). A VFC é o método que quantifica essas variações, permitindo a observação das flutuações no ciclo cardíaco que ocorrem durante curtos períodos de tempo ou, em períodos longos inferindo sobre a modulação autonômica cardíaca (ROQUE, 2009). A avaliação da VFC é, portanto, um instrumento não invasivo e útil para análise da função autonômica (DOXEY, BOSWOOD, 2004). Embora existam vários métodos para determinação dos índices de VFC, utiliza- se principalmente a VFC no domínio do tempo, que se baseia em cálculos estatísticos, ou domínio da frequência, no qual as frequências cardíacas são transformadas em potência (PASCON, 2009). O método linear no domínio de tempo, expressa resultados em unidade de tempo (milissegundos), medindo-se cada intervalo RR normal durante um determinado intervalo de tempo, logo depois utiliza-se métodos estatísticos ou geométricos (média, desvio padrão e índices derivados histograma ou do mapa coordenadas cartesianas dos intervalos RR), calculando-se os índices tradutores de flutuações na duração dos ciclos cardíacos (CALVERT, 1998; CRUZ-ALEIXO, 2017). Os índices estatísticos, no domínio do tempo, obtidos pela determinação de intervalos RR correspondentes em qualquer ponto no tempo, são: (AUBERT, 2003). a) SDNN - Desvio padrão de todos os intervalos RR normais gravados em um intervalo de tempo, expresso em ms; 30 b) SDANN - Representa o desvio padrão das médias dos intervalos RR normais, a cada 5 minutos, em um intervalo de tempo, expresso em ms; c) SDNNi - É a média do desvio padrão dos intervalos RR normais a cada 5 minutos, expresso em ms; d) rMSSD - É a raiz quadrada da média do quadrado das diferenças entre intervalos RR normais adjacentes, em um intervalo de tempo, expresso em ms; e) pNN50 - Representa a porcentagem dos intervalos RR adjacentes com diferença de duração maior que 50ms. Os índices SDNN, SDANN e SDNNi são obtidos a partir de registros de longa duração e representam as atividades simpática e parassimpática, porém não permitem distinguir quando as alterações da VFC são devidas ao aumento do tônus simpático ou à diminuição do tônus vagal (NOVAIS et al., 2004). Já os índices rMSSD e pNN50 representam a atividade parassimpática (PUMPRLA, 2002; AUBERT, 2003; BITTENCOURT et al 2005; RIBEIRO, 2005), pois são encontrados a partir da análise de intervalos RR adjacentes (CRUZ-ALEIXO, 2017). O método no domínio da frequência consiste em um método espectral que decompõe um tacograma (gráfico de intervalo RR X batimentos cardíacos) nas várias frequências espectrais pré-estabelecidas com seus respectivos pesos de contribuição para o sinal, gerando, desta forma, um gráfico de densidade de potência espectral em função da frequência. Este gráfico possui os componentes espectrais de muito baixa frequência (very low frequency - VLF), baixa frequência (low frequency - LF) e alta frequência (high frequency - HF) (SELIG, 2011; SOWMYA et al., 2014). Em equinos adultos, de acordo com Von Borell et al. (2007), altas frequências são definidas entre 0,13-0,26 Hz (corresponde a uma taxa respiratória de 8 a 16 mpm), enquanto que nos neonatos são entre 0,25-0,33 Hz (correspondente a uma taxa respiratória entre 15 e 20 mpm). Os componentes RMSSD e HF estão bem estabelecidos como sendo a expressão da modulação vagal cardíaca (atividade parassimpática). Por sua vez, componente LF tem sua interpretação controversa, sendo que alguns autores postulam que o componente representa a atividade vagal parassimpática e a função barorreflexa; outros suportam que o LF é a representação da atividade simpática, parassimpática e função barorreflexa e, há também aqueles que afirmam refletir a 31 atividade simpática e parassimpática, com maior atuação da simpática (MONTEZE, 2014; RASSI, 2010). A teoria do Caos descreve elementos manifestando comportamentos que são extremamente sensíveis às condições iniciais, dificilmente se repetem, mas apesar de tudo são determinísticos (GODOY, 2005). As teorias dos sistemas não-lineares têm sido progressivamente aplicadas para interpretar, explicar e prever o comportamento dos fenômenos biológicos. Esses parâmetros têm se mostrado bons preditores de morbi-mortalidade no âmbito clínico, apesar da necessidade de aprofundamento científico, com amostras expressivas e acompanhamento prolongado. Tais estudos poderão ser úteis na investigação e no tratamento de cardiopatias (GODOY, 2005). 3. OBJETIVOS GERAIS Avaliar os efeitos do FME em equinos jovens submetidos ao procedimento de casqueamento, a fins de verificar se houve ou não influência do FME no comportamento dos animais, empregando para tanto a análise de VFC pelo método de Holter. 4. OBJETIVOS ESPECÍFICOS Determinar se o uso do FME favoreceu a relação homem versus animal e consequentemente o bem-estar animal. Identificar entre dois grupos (tratamento cego) qual recebeu o FME e o placebo por meio de avaliação de parâmetros clínicos, laboratoriais e comportamentais. 32 CAPÍTULO II ARTIGO CIENTÍFICO 33 Trabalho a ser enviado para a revista Journal of Veterinary Behavior. Normas disponíveis 1 no site: https://www.journalvetbehavior.com/content/authorinfo 2 3 Study on the effects of the equine maternal pheromone on the clinical and 4 ethological parameters of equines undergoing hoof trimming 5 6 Renata Alves de Paula1, Amanda Sarita Cruz Aleixo2, Letícia Peternelli da Silva3, Marina 7 Cecília Grandi4, Miriam Harumi Tsunemi5, Maria Lucia Gomes Lourenço6, Simone Biagio 8 Chiacchio7 9 10 1School of Veterinary Medicine and Animal Science, Department of Animal Health, UNESP, Botucatu, São Paulo, 11 Brazil; email: *Corresponding author: medvetrenata@hotmail.com 12 2School of Veterinary Medicine and Animal Science, Department of Animal Health, UNESP, Botucatu, São Paulo, 13 Brazil; email: amanda.cruz21@hotmail.com 14 3School of Veterinary Medicine and Animal Science, Department of Animal Health, UNIMAR, Marília, São Paulo, 15 Brazil; email: leticia_pet@hotmail.com 16 4Diplomate in Veterinary Medicine, Lençóis Paulista, São Paulo, Brazil; email: grandi_vet@yahoo.com.br 17 5Institute of Biosciences, UNESP, Botucatu, São Paulo, Brazil; *Corresponding author: mtsunemi@ibb.unesp.br 18 6School of Veterinary Medicine and Animal Science, Department of Veterinary Clinics, UNESP, Botucatu, São 19 Paulo, Brazil; *Corresponding author: mege@fmvz.unesp.br 20 7School of Veterinary Medicine and Animal Science, Department of Animal Health, UNESP, Botucatu, São Paulo, 21 Brazil; email: chiacchios@fmvz.unesp.br 22 23 Abstract 24 Pheromone therapy is a promising alternative therapy to improve the human-animal 25 relationship and reduce behavioral reactions to stressful stimuli. This study aims at 26 evaluating the use of the equine maternal pheromone (EMP) in animals undergoing 27 hoof trimming and verify a possible influence of the pheromone over the autonomous 28 nervous system. For this purpose, 20 foals (14 females and 6 males) with an average 29 age of 24 months were divided into two experimental groups (A and B), one group 30 receiving treatment with EMP and the other receiving placebo (excipient without the 31 active ingredient). The parameters analyzed were heart rate (HR), respiratory rate 32 (RR), blood sugar levels, heart rate variability (HRV) and behavioral reactions. The 33 https://www.journalvetbehavior.com/content/authorinfo mailto:medvetrenata@hotmail.com mailto:amanda.cruz21@hotmail.com mailto:grandi_vet@yahoo.com.br mailto:mtsunemi@ibb.unesp.br mailto:chiacchios@fmvz.unesp.br 34 results revealed no statistically significant differences in the clinical parameters (HR, 34 RR, and blood sugar levels)) when comparing the EMP and placebo groups. The HRV 35 indexes (Minimum HR, Average HR, Maximum HR, NN, SDNN, RMSSD, and PNN50) 36 also did not present statistically significant differences when comparing the groups 37 before, during and after trimming. Despite the absence of statistical significance, we 38 observed a strong tendency towards lower HR, blood sugar levels and reactivity in the 39 group treated with EMP, in addition to an evident behavioral change during trimming, 40 making the animals calmer and the procedure more comfortable. 41 42 Keywords: animal well-being, HRV, behavior, pheromone therapy, hoof trimming 43 44 Introduction 45 46 The interest with animal well-being has been on the rise both in Brazil and around the 47 world as several sectors of society have become more organized to demand better 48 conditions in animal husbandry (Gontijo et al., 2014). 49 50 These conversations have been, in part, focused on equestrian activities, which adds 51 value to studies using a scientific approach to determine in which situations animal 52 quality of life and well-being may improve and, therefore, determine new methods that 53 may have a positive impact in the animal husbandry systems (Gontijo et al., 2014). 54 55 Since the time humanity has first interfered in the biology and nature of equines, some 56 methods have been introduced to the handling of these animals, including intensive 57 care with the hoof. Hoof trimming is a procedure that should be conducted chiefly in 58 horses held in stable, which require daily care to maintain hygiene and balance 59 (Sampaio; Silva, 2013). 60 61 Equines show varying temperaments, which are defined as the animal’s response to 62 human handling, usually associated with fear and sometimes leading to behavioral and 63 physiological changes. New situations, intense stimuli and sudden actions may cause 64 fear in the animal. These behavioral responses or changes range from low reactivity 65 and meekness to fear, escape attempts or aggression (Calviello, 2013). When these 66 35 situations become traumatic and stressful, the well-being of the animal has apparently 67 been compromised (Heleski et al., 2002). 68 69 Stress may lead to increases in heart rate (HR) due to the activation of the Sympathetic 70 Nervous System (SNS) and the release of catecholamines. The discovery of the 71 relationship with the autonomic nervous system (ANS) led to studies regarding the 72 increase in sympathetic activity and the resulting decreases in parasympathetic 73 activity, with heart rate variability (HRV) representing the most promising marker for 74 ANS activity. However, the evaluation of responses to stress is better conducted by 75 comparing behaviors and physiological measurements (Cruz-Aleixo, 2017). 76 77 Neuroleptic, sedative and tranquilizing substances are often administered to equines 78 to facilitate certain types of handling, but they often lead to collateral effects such as 79 hematological and biochemical alterations which compromise homeostasis. For this 80 reason, some studies have been conducted regarding the use of pheromone therapy 81 to calm the animals and reduce fear and anxiety without causing any adverse effects 82 (Falewee et al., 2006). 83 84 Studies have already proved the effectiveness of pheromones in several animal 85 species, including canines, felines, swines and leporids (Heleski Et Al., 2002; Gaultier 86 et al., 2005; Dalacqua; Barros, 2006; Pageat, 2008; Maia et al., 2013; Ibarra-Soria; 87 Logan, 2014; Stowers; Kuo, 2015; Jouhanneau; Schaal; Coureaud, 2016). Their 88 effectiveness in equines have been studied in isolated cases, but it represents a 89 promising tool to optimize handling, facilitate the relationship between human and 90 animal and promote animal well-being (Heleski et al., 2002; Falewee et al., 2006; Cozzi 91 et al., 2011). 92 93 Therefore, this study aims at determining if the use of EMP had a positive impact on 94 the human-animal relationship and animal well-being, as well as identifying which 95 experimental group received the treatment with EMP through the evaluation of clinical, 96 laboratory and behavioral parameters. 97 98 99 36 Materials and Methods 100 101 Experiment location 102 The study was conducted at two stud farms in the midwestern region of the state of 103 São Paulo, Brazil. The first, identified as Fazenda Santa Fé, is located in the city of 104 Areiópolis, SP – Brazil (latitude 22º40'05" S & longitude 48º39'54" W), and the second, 105 identified as Haras Josilmar, is located in the city of Bauru, SP – Brazil (latitude 106 22°18′55″ S & longitude 49°3′41″ W). The study was approved by the Ethics 107 Commission for Animal Experimentation (CEUA, Comissão de Ética no Uso de 108 Animais) at the School of Veterinary Medicine and Animal Sciences (FMVZ – UNESP, 109 Botucatu, Brazil) under protocol no. n°0214/2016 after written consent by the animal 110 owners. 111 112 Animals 113 The study included 20 Mangalarga Paulista horses, 14 females and 6 males, with an 114 average age of 24 months. The inclusion criteria for the study were animals that were 115 healthy upon a physical examination, no history of infectious or contagious diseases 116 in the previous 30 days, regular vaccination and deworming, age between 12 and 28 117 months, uninitiated taming process and no previous hoof trimming. 118 119 All animals came from similar husbandry systems: free-roaming in Tifton fields with 120 water and mineral salts ad libitum. For this study, the foals were gathered in a handling 121 corral, subdued and led to a horse stock for the procedures to begin. 122 123 Synthetic Pheromone 124 The manufacturer provided the product in syringes identified as A or B on the outside 125 Figure 3). One group contained a synthetic equivalent of the equine maternal 126 pheromone (EMP 1%) and an excipient (Glycerol, Methyl Hexadecanoate, 2-Tert-127 Butyl-Cresol 99%), while the other contained only the excipient (Glycerol, Methyl 128 Hexadecanoate, 2-Tert-Butyl-Cresol 99%) without the active ingredient, which is 129 considered a placebo. The researchers did not know which syringe contained what 130 until the end of the experiment. 131 37 The carton contained 2.5 ml of a gel, which was distributed over the examiner’s index 132 finger and the applied over the outer edge of the animal’s nostril, one unit for each 133 nostril. The examiners used gloves for each application, discarding them afterward as 134 per the manufacturer’s instructions (Figure 3). 135 136 Clinical parameters 137 The study assessed the heart rate (HR) and respiratory rate (RR) of the animals 138 through a conventional clinical examination with the aid of a stethoscope. Values 139 between 32 and 44 beats per minute for the HR and between 8 and 15 movements 140 per minute for the RR were considered normal (Cunningham, 1999). Blood sugar 141 levels were determined with the aid of a portable device (Accu-Chek® Performa – 142 Marca Roche), using specific bands, after collection through jugular venipuncture with 143 5 mL syringes and 30x10 needles. Values were considered normal between 75 and 144 115 mg/dL (Kaneko, 2008). These parameters were evaluated at two moments: M1 – 145 20 minutes before the application of the EMP; and M2 – after the trimming procedure. 146 147 Heart Rate Variability (Holter) 148 The electrocardiographic recording happened after the application of a Holter device 149 (Cardio Light, Cardios, ANVISA, São Paulo, Brazil) (Figure 4). The area was epilated 150 and cleaned with 70% alcohol before the electrodes were secured with the aid of glue 151 (Super Bonder®- Loctite). 152 The positive electrodes (red and black) were positioned on the animal’s left side, with 153 the red electrode placed at the withers and the black electrode in the ventral region of 154 the thorax, in the fifth intercostal space behind the olecranon. The negative electrode 155 (white) and the ground electrode (green) were positioned in the middle third of the 156 seventh intercostal space on the right thorax, with the green electrode positioned 157 slightly closer than the white electrode (Figure 5). 158 159 The recorder was then secured at the animal’s neck with an elastic band to protect the 160 equipment (Figure 5). The data collected was stored in an electromagnetic card (SD 161 card) (Figure 4). 162 163 38 The time-domain HRV indexes are shown in Chart 1 and were analyzed in all animals 164 through computer-based decoding of the Holter electrocardiographic monitoring 165 employing the software CardionetClient® at three distinct moments: before, during and 166 after the hoof trimming procedure. 167 168 Experimental design 169 After the clinical examination and blood sugar level test, the Holter device was placed 170 on the animal and the electrocardiographic recording initiated. After recording for 20 171 minutes, the product was administered. The first animal, selected at random by the 172 handler, was given the contents of syringe A (Group A) and the second animal was 173 given the contents of syringe B (Group B) and so on until all animals received the 174 product. All applications were conducted by the same person. 175 A 20-minute wait period was observed after application (as per the product’s minimum 176 action time), during which the animals were not in contact with humans or other 177 animals. 178 179 Hoof Trimming 180 A preventive hoof trimming procedure was then conducted on the animals employing 181 a hoof cleaner, a hoof knife, a rasp and a pincer (Figure 6). The procedure consisted 182 in cleaning the hoof with the cleaner, removing all dirt. The hoof knife was then used 183 to carefully remove excess material from the sole, the central groove of the frog and 184 the white line. The hoof wall was then trimmed with the pincer and leveled with the sole 185 with a rasp. The procedure was finalized by rounding the hoof. 186 187 The procedure was conducted by the same person and followed the same limb order 188 in all animals: right thoracic limb (RTL), right pelvic limb (RPL), left thoracic limb (LTL) 189 and left pelvic limb (LPL) (Figure 7). After concluding the procedure, the clinical 190 examination and the blood sugar level test were repeated. After another 20-minute 191 wait period, the cardiac monitoring device was removed, with a total recording time of 192 approximately 20 minutes per animal. 193 194 195 196 39 Behavioral parameters 197 The trimming procedures were recorded with a digital camera (iPhone 7 – Full HD 198 1080p –Apple) and two observers identified and recorded the behavioral reactions of 199 each animal, in particular: walking backwards, running away, walking sideways, hitting, 200 kicking, stepping, dropping their weight over the limb, putting the tail between the legs 201 and prancing. 202 The entire sequence of the experiment is represented in Figure 8. 203 Statistical analysis 204 Variable distribution was evaluated through Kolmogorov-Smirnov’s normality tests. 205 Comparisons between the groups employed the t-test for independent samples. The 206 significance level adopted for the study was 0.05. 207 208 Results 209 210 The study was conducted as a blind trial and the treatment received by each animal 211 was revealed upon the end of the experiment: animals in Group A received the placebo 212 and animals in Group B received treatment with EMP. 213 To measure the effects of the EMP and the placebo, twenty animals were evaluated 214 regarding their physiological parameters (HR, RR, Blood sugar levels and HRV) and 215 their behavior. However, there was a problem with the HRV data recording of four 216 animals, which were excluded from the study. 217 218 Clinical examination 219 The data obtained through conventional clinical examinations did not reveal any 220 statistically significant difference within the EMP and Placebo groups for the HR, RR 221 and Blood Sugar Level parameters when comparing moments M1 and M2, as 222 described in Table 1. 223 224 Heart Rate Variability 225 In the Holter examination, the Minimum HR in the placebo group (45.00 ± 10.28), 226 Minimum HR in the EMP group (41.20 ± 7.89), Average HR in the placebo group (63.60 227 ± 25.16), Average HR in the EMP group (64.80 ± 22.89), Maximum HR in the placebo 228 group (112.40 ± 31.44) and Maximum HR in the EMP group (122.30 ± 47.60) also did 229 40 not present statistically significant differences (p>0.05) between the three analyzed 230 moments (before, during and after hoof trimming) (Table 2). 231 232 Likewise, the remaining HRV indexes (NN, SDNN, RMSSD and PNN50) also did not 233 present statistically significant differences for each group between the three analyzed 234 moments: before (M1), during (M2) and after (M3) hoof trimming. This data are shown 235 in Table 3. 236 237 Behavioral reactions 238 According to the analyses conducted by the observers, there were noticeably more 239 behavioral reactions in the placebo group, indicating higher reactivity in this group 240 during trimming. However, the statistical analysis did not reveal any statistically 241 significant differences, as was the case in the other results described so far, which may 242 be explained by the number of samples included in the study. 243 244 Discussion 245 246 In this study, the HR of the foals in both the EMP and Placebo groups started above 247 the reference values described for the species in the clinical examination conducted at 248 rest, before handling to secure the Holter device and before the trimming procedure. 249 This indicates that the animals were already in an alert state, which may be explained 250 by the fact that they had been restrained. An animal may undergo physiological 251 changes when feeling insecure in a particular situation, which highlights the importance 252 of studying parameters such as HR, which is an expression of emotional activation 253 (Visser et al., 2002). 254 255 Despite not being a statistically significant difference, the HR in the EMP group was 256 higher at M1 (64.80 ± 14.34) and then decreased at M2 (55.60 ± 14.78), a difference 257 of -9.20 beats per minute. Some studies report that differences exceeding 6 beats per 258 minute from the measurement taken at rest may indicate stress (Craig; Nunan, 1998). 259 This indicates that the EMP can aid the physiological adaptation process to which the 260 animals were submitted. On the other hand, the placebo group behaved in the opposite 261 way. Increases in the HR are the result of reduced vagal activity and increased 262 41 sympathetic activity or, in some cases, a combination of concomitant changes in both 263 branches of the ANS (Borell et al., 2007). 264 265 When comparing the blood sugar levels of each group between moments M1 and M2, 266 the differences observed were not statistically significant. As was the case with the HR, 267 the EMC presented higher values before the trimming procedure than afterward, with 268 a difference of -7.90 mg/dL (Table 1). In the placebo group, the blood sugar levels 269 remained similar at M1 and M2. 270 271 The levels of sugar in the blood in stress situations are related to an increase in the 272 levels of cortisol because when there is a stress stimulus, the hypothalamus 273 synthesizes the corticotropin-releasing hormone (CRH), which induces the hypophysis 274 into producing the adrenocorticotropic hormone (ACTH). The ATCH, in turn, runs 275 through the bloodstream to the adrenal glands, stimulating the synthesis of cortisol, 276 which is known as the “stress hormone.” At the same time, the SNS is activated, 277 leading to the release of catecholamines (noradrenaline and adrenaline), leading to an 278 increase in glycogenolysis (Mendes; Nascimento, 2009). 279 280 The analysis of the indexes obtained through the Holter examination revealed the 281 minimum, average and maximum HR was high in both groups, but it is known that, in 282 some cases, the HR may rise quickly to over 100 bpm, especially in cases involving 283 sudden fear, excitation or before physical exercise (Clayton, 1991; Evans, 1994). 284 285 The remaining indexes reflect the variability in the cardiac activity and are influenced 286 by sympathetic and parasympathetic activity (Borrell et al., 2007). The index SDNN is 287 obtained from long recordings and represents both sympathetic and parasympathetic 288 activity, but it does not allow the distinction of whether the HRV changes are caused 289 by increases in the sympathetic tonus or reductions in the vagal tonus. On the other 290 hand, the indexes RMSSD and pNN50 represent parasympathetic activity given that 291 they are calculated from the analysis of adjacent RR intervals (Vanderlei et al., 2009). 292 High heart rate variability is a sign of good adaptation, characterizing a healthy 293 individual with efficient autonomic mechanisms, while low variability often is an 294 indicator of abnormal and insufficient ANS adaptation, implying the presence of some 295 42 physiological ‘malfunction’ in the individual (Abreu, 2012). A problem in the data 296 recording of four animals during the procedure compromised the statistical analysis 297 since the number of samples analyzed in this study may have been a relevant factor. 298 Therefore, the evaluation of a response to stress should be conducted associating 299 physiological and behavioral measurements (Broom, 1991; Mason e Mendle,1993). 300 301 Although the statistical analysis also did not reveal significant differences regarding 302 behavior, the observers who analyzed the videos reported much more reactivity in 303 animals from the placebo group. Also, both groups had fleeing as the most common 304 reaction in this situation, as shown in Figure 10 and 11. 305 306 During the hoof trimming procedure, we noticed that two animals in the EMP group 307 that had a history of high reactivity before humans, with exaggerated reactions 308 (kicking) when feeling threatened, were handled without any problems during the 309 experiment. 310 311 Equines have a considerably high learning ability, and this has a substantial impact in 312 the initial stages of handling and training. The more conditioned the animal is to a 313 particular situation; the easier handling will be if the first instance was free of fear. 314 However, positive reinforcement facilitates understanding, leading to positive 315 behaviors and reactions during the subsequent handling (Mengoli et al., 2014). In this 316 study, the animals were young and untamed, with most accepting handling only with a 317 halter. Considering that most animals had never undergone hoof trimming and, 318 therefore, did not go through the learning procedure, the expected result was a high 319 reactivity level in all animals since the procedure would be interpreted as a threat, 320 especially during restraint. 321 322 Another study regarding equines submitted to a fear-inducing situation under the 323 effects of the EMP employed a heart rate sensor (Polar® Horse Trainer Advanced TM). 324 The results were similar to the ones observed in this study regarding the HRV as it also 325 did not find any statistically significant differences with the use of the EMP. The authors 326 also reported a loss of HR data due to a recording error, which compromised the 327 analysis. However, according to the authors, the average and maximum HR were lower 328 43 during the study in the group treated with EMP. Also, they have reported success in 329 the analyses related to performance and behavior, proving that the EMP was useable 330 for specific tasks that induce fear and anxiety. 331 332 Conclusion 333 These results suggest that pheromone therapy could be an efficient alternative to be 334 employed in situations with high-stress potential for equines. The use of EMP produced 335 favorable results in the handling for a hoof trimming procedure, in particular reducing 336 the number of behavioral reactions and improving the human-animal relationship 337 during the procedures. Also, it was possible to detect through the experimental findings 338 that the syringes containing EMP were those identified with a letter B, a result that was 339 later confirmed by the manufacturer. 340 341 Acknowledgments 342 To IRSEA - Research Institute in Semiochemistry and Applied Ethology, for allowing 343 the study and proving products used in the experiment. 344 345 To the owners of Haras Josilmar and Fazenda Santa Fé, who granted us their facilities 346 and employees to help with the experiment. 347 348 Conflict of Interest Statement 349 The authors declare they have no conflicting interests. 350 351 Authorship 352 The concept for the article was conceived by Renata Alves de Paula. The experiment 353 was designed and conducted by all the authors. The data was analyzed by Miriam 354 Harumi Tsunemi. The article was written by all authors. 355 356 357 358 359 360 361 44 References 362 363 ABREU, L.C. 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Time-domain HRV indexes 445 Index Unit Definition NN Ms Mean of all RR intervals SDNN Ms Standard deviation of all RR intervals SDNNi Ms Mean of the standard deviations of RR intervals calculated over 5-second segments SDANN Ms Standard deviation of the average RR intervals calculated over 5- second segments RMSSD Ms Square root of the mean of the squares of the successive differences between adjacent RR intervals pNN50 % Proportion of successive differences between RR intervals that differ by more than 50 ms 446 447 Figure 3. Identified syringes (A e B), the product being prepared and application by 448 the examiner in the outer edges of the animal’s nostril. 449 450 48 451 Figure 4. Holter Equipment – Cables, electrodes, SD Card and protective cover. 452 453 454 Figure 5. Position of the electrodes in the animal left (E) and right (D) sides; Holter 455 device attached to the animal’s neck. 456 457 458 Figure 6. Equipment used in the hoof trimming procedure (pincer, rasp and hoof 459 knife) and trimming being conducted. 460 49 461 Figure 7. Sequence established for the hoof trimming procedure: (1) Right thoracic 462 limb (MTD); (2) Right pelvic limb (MPD); (3) Left thoracic limb (MTE); (4) Left pelvic 463 limb (MPE). 464 465 466 Figure 8. Overview of the experiment sequence for the study. 467 468 469 Figure 9. Behavior of the HR in Placebo and EMP groups before (M1) and after (M2) 470 the hoof trimming procedure. 471 472 50,00 52,00 54,00 56,00 58,00 60,00 62,00 64,00 66,00 M1 M2 Heart Rate PLACEBO EMP 50 473 Figure 10. Quantification of the behavioral reactions given by the animals in the 474 Placebo group as registered by Observer 1 (Obs1) and Observer 2 (Obs2). 475 476 477 Figure 11. Quantification of the behavioral reactions given by the animals in the EMP 478 group as registered by Observer 1 (Obs1) and Observer 2 (Obs2). 479 480 51 Table 1. Mean (standard deviation) and p values for HR, RR, and Blood sugar level 481 measurements obtained through clinical examination of equines undergoing hoof 482 trimming with previous treatment with EMP and placebo. 483 Variable Placebo EMP P Value HR M1 56.40 (12.99) 64.80 (14.34) 0.187 HR M2 57.60 (16.78) 55.60 (14.78) 0.781 HR_dif_M2-1 1.20 -9.20 0.211 RR M1 31.20 (11.12) 31.60 (9.13) 0.931 RR M2 34.00 (7.36) 36.40 (14.87) 0.655 RR_dif_M2-1 2.80 4.80 0.777 Blood Sugar M1 99.60 (14.65) 102.90 (14.93) 0.624 Blood Sugar M2 99.70 (15.17) 95.00 (11.04) 0.438 Blood Sugar _dif_M2-1 0.10 -7.90 0.255 HR: heart rate; RR: respiratory rate. Comparisons between the groups through the t-test for 484 independent samples. 485 486 487 Table 2. Mean (standard deviation) and p values for Minimum HR, Average HR and 488 Maximum HR obtained through Holter examination of equines undergoing hoof 489 trimming with previous treatment with EMP and placebo. 490 Variable Placebo EMP P Value Min HR 45.00 (10.28) 41.20 (7.89) 0.366 Avg HR 63.60 (25.16) 64.80 (22.89) 0.912 Max HR 112.40 (31.44) 122.30 (47.60) 0.590 Min HR: minimum heart rate; Avg HR: average heart rate; Max HR: maximum heart rate. Comparisons between 491 the groups through the t-test for independent samples. 492 493 494 495 496 497 498 499 500 501 52 Table 3. Heart rate variability indexes (mean ± standard deviation) obtained through 502 Holter examination in the EMP and Placebo groups before (M1), during (M2) and after 503 (M3) hoof trimming. 504 Parameter EMP Group Placebo P Value NN (ms)_M1 752.26±192.50 740.89±262.67 0.921 NN (ms)_M2 859.03±290.11 721.75±196.08 0.277 NN (ms)_M3 731.12± 240.47 751.73± 427.94 0.918 SDNN (ms)_M1 207.32±110.76) 184.82±63.68 0.623 SDNN (ms)_M2 247.97±142.43 229.98±123.86 0.786 SDNN (ms)_M3 155.81±122.59 177.47±107.52 0.731 RMSSD (ms)_M1 260.90±210.56 171.15±129.27 0.322 RMSSD (ms)_M2 204.66±148.19 237.15±229.24 0.730 RMSSD (ms)_M3 237.13±243.03 158.32±151.32 0.449 PNN50_M1 56.67±32.42 44.04±25.66 0.347 PNN50_M2 50.08±21.33 42.82±29.19 0.533 PNN50_M3 49.63±36.76 39.87±32.08 0.535 NN: Interval between two consecutive R waves, or mean NN for all the recording; SDNN: standard deviation of all 505 normal RR intervals in the examination; rMSSD: Square root of the mean of the squares of the successive 506 differences between adjacent normal RR intervals in the entire examination; pNN50: proportion of differences 507 exceeding 50 ms between adjacent normal RR intervals in a 24-hour examination. Statistical analysis: Comparisons 508 between the groups through the t-test for independent samples. 509 510 511 512 513 514 515 516 517 518 519 520 53 CAPÍTULO III 54 DISCUSSÃO GERAL Embora não tenhamos encontrado diferenças significativas, os parâmetros avaliados tiveram uma tendência a serem diferentes no grupo tratado com FME e também foram detectadas durante a realização prática mudanças no comportamento dos animas deste grupo. A FC dos equinos dos grupos FME e placebo iniciou-se com valores acima dos limites de referência descritos para a espécie no exame clínico realizado em repouso, antes da manipulação para colocar o gravador de Holter e realizar o casqueamento, indicando assim que estes já se encontravam em estado de alerta, justificado pelo simples fato de terem sido contidos. Quando os animais estão inseguros em determinada situação, estes podem sofrer modificações fisiológicas destacando-se assim a importância de estudar este parâmetro. A FC é uma expressão da ativação emocional (VISSER et al., 2002). Apesar de não ter sido significativo, a FC (obtida ao exame clínico) apresentou- se mais elevada no momento M1 (64,80 ± 14,34) demonstrando posteriormente uma diminuição no M2 (55,60 ± 14,78), com uma diferença de -9,20 batimentos por minuto. Há relatos de que além de seis bpm acima da frequência de repouso pode-se caracterizar algum tipo de estresse (CRAIG; NUNAN, 1998). Isso indica que o FME foi capaz de auxiliar o processo de adaptação fisiológica ao qual os animais foram submetidos. Já o grupo placebo se comportou de maneira inversa. Um aumento na FC resulta de atividade vagal reduzida e aumento na atividade simpática ou, em algumas vezes, de uma combinação de mudanças na atividade dos dois ramos do SNA concomitantemente (VON BORELL et al., 2007). Quando se comparou a glicemia do grupo placebo e do grupo FME nos momentos M1 e M2 as diferenças estatísticas não foram significativas, apesar de que assim como na FC o grupo FME apresentou no pré-casqueamento valores mais altos do que o pós-casqueamento, ou seja, uma diferença de -7,90 mg/dL (Tabela 1). No grupo placebo, o M1 e o M2 mantiveram-se semelhantes. 55 A glicemia no estresse correlaciona-se ao aumento do cortisol devido ao fato de que quando ocorre um estímulo estressor o hipotálamo sintetiza o hormônio liberador de corticotrofina (CRH), que induz a glândula hipófise a produzir o hormônio adrenocorticotrópico (ACTH), o qual se desloca através da corrente sanguínea até as glândulas adrenais e estimulam a síntese do cortisol, conhecido como hormônio do estresse. Simultaneamente ocorre ativação do SNS, levando à liberação de catecolaminas (noradrenalina e adrenalina) e consequentemente elevação da glicogenólise (MENDES; NASCIMENTO, 2009). Os índices obtidos através do Holter, demonstraram que a FC mínima, média e máxima apresentaram-se elevadas em ambos os grupos, porém em alguns casos, a FC pode aumentar rapidamente para mais de 100bpm, principalmente em casos envolvendo medo repentino, excitação ou pré-exercício (CLAYTON, 1991; EVANS, 1994). Os demais índices refletem a variabilidade na atividade cardíaca, e são influenciados pela atividade simpática e parassimpática (VON BORELL et al., 2007). Os índices SDNN é obtido a partir de registros de longa duração e representa a atividades simpática e parassimpática, porém não permite distinguir quando as alterações da VFC são devidas ao aumento do tônus simpático ou à remoção do tônus vagal. Já os índices RMSSD e pNN50 representam a atividade parassimpática, pois são encontrados a partir da análise de intervalos RR adjacentes (Vanderlei et al., 2009). Uma alta variabilidade na FC é indício de boa adaptação, caracterizando um indivíduo saudável, com mecanismos autonômicos eficientes, enquanto que baixa variabilidade é frequentemente um indicador de adaptação anormal e insuficiente do SNA, implicando a presença de mau funcionamento fisiológico no indivíduo (ABREU, 2012). Devido a falha na gravação dos dados de quatro animais durante o procedimento a análise estatística acabou sendo prejudicada já que o número de amostras interpretadas para este exame também pode ter sido um fator relevante. Portanto a avaliação de uma resposta ao estresse é melhor realizada quando se associa as medidas fisiológicas e comportamento (BROOM, 1991; MASON E MENDLE,1993). 56 Os observadores que analisaram os vídeos demonstraram que houve um número muito maior de reatividade nos animais do grupo placebo. Além disso, pode- se notar que ambos os grupos apresentaram como principal reação diante desta situação o comportamento de fuga assim como pode ser observado nas figuras 10 e 11. Na prática de casqueamento, observou-se que dois animais do grupo FME, que apresentavam histórico de alta reatividade diante de pessoas, manifestando reações comportamentais exacerbadas (coices) ao sentirem-se amedrontados, foram manuseados tranquilamente durante o experimento. O equino possui uma habilidade consideradamente alta para aprendizagem e isso influência fortemente os primeiros manejos ou treinamentos. Ou seja, quanto mais condicionado o animal estiver para tal situação, mas fácil será a manipulação, desde que este primeiro ato não tenha lhe gerado medo, pois em situações futuras semelhantes, podem suscitar respostas negativas. No entanto, a aprendizagem de forma positiva, facilita o entendimento gerando comportamentos e reações positivas durante os próximos manejos (MENGOLI et al., 2014). Em nosso estudo, os animais utilizados eram jovens e sem doma, sendo que a maioria aceitava somente o cabresto. Levando-se em consideração o fato de que os animais nunca tinham sido submetidos ao casqueamento e, portanto, não passaram pelo processo de aprendizagem a tendência é de que, o nível de reatividade fosse elevado em todos os animais, pois o procedimento seria interpretado como uma ameaça, principalmente no momento da contenção do animal. Em estudo envolvendo equinos submetidos a uma situação indutora de medo sob efeito do FME utilizou-se o frequencímetro (Polar® Horse Trainer Advanced TM). Os resultados foram semelhantes ao nosso estudo no que diz respeito a VFC, pois também não foram encontradas diferenças estatísticas durante a utilização do FME. Os autores também relataram a perda de dados da FC devido à falha na gravação, conforme observado no presente estudo, prejudicando, por conseguinte, a análise. Entretanto, segundo os autores, a FC média e a FC máxima se mantiveram mais baixas durante o estudo no grupo tratado com FME. Além disso, obtiveram sucesso nas análises relacionadas ao desempenho e comportamento, comprovando que o FME se mostrou viável para ser utilizado em tarefas específicas que provocam medo e ansiedade. 57 CONCLUSÃO GERAL  O FME demonstrou ser uma ferramenta útil para melhorar a relação homem e animal auxiliando positivamente no manejo de casqueamento em equinos sem experiência prévia e altamente reativos;  Apesar da estatística não ser significativa para os parâmetros avaliados, pode- se perceber na experimentação prática alterações marcantes no comportamento, tornando possível identificar qual dos dois grupos recebeu o tratamento com FME;  A falha na gravação de alguns exames do Holter e o número de animais envolvidos foram fatores relevantes na pesquisa;  Estudos devem continuar com intuito de favorecer a utilização do FME em outras atividades envolvendo equinos. 58 NORMAS DA REVISTA Journal of Veterinary Behavior Disponível em: https://www.journalvetbehavior.com/content/authorinfo https://www.journalvetbehavior.com/content/authorinfo 59 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ABREU, L.C. 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