UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA "JÚLIO DE MESQUITA FILHO" Faculdade de Ciências Farmacêuticas Campus de Araraquara Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas Variantes genéticas e fatores associados ao risco de hemorragia digestiva alta: um estudo de caso- controle Marcela Forgerini Orientadora: Prof. Dr. Patrícia de Carvalho Mastroianni Coorientadora: Prof. Dr. Maria Teresa Herdeiro Araraquara- SP 2021 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA "JÚLIO DE MESQUITA FILHO" Faculdade de Ciências Farmacêuticas Campus de Araraquara Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas Variantes genéticas e fatores associados ao risco de hemorragia digestiva alta: um estudo de caso- controle Marcela Forgerini (Bolsista FAPESP nº 2018/07501-9) Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas, Área de Pesquisa e Desenvolvimento de Fármacos e Medicamentos, para obtenção do título de Doutor em Ciências Farmacêuticas. Orientadora: Prof. Dr. Patrícia de Carvalho Mastroianni Coorientadora: Prof. Dr. Maria Teresa Herdeiro Araraquara- SP 2021 Forgerini, Marcela. F721v Variantes genéticas e fatores associados ao risco de hemorragia digestiva alta: um estudo de caso-controle / Marcela Forgerini. – Araraquara: [S.n.], 2021. 127 f. : il. Tese (Doutorado) – Universidade Estadual Paulista. “Júlio de Mesquita Filho”. Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas. Área de Pesquisa e Desenvolvimento de Fármacos e Medicamentos. Orientadora: Patrícia de Carvalho Mastroianni. Coorientadora: Maria Teresa Herdeiro. 1. Hemorragia gastrointestinal. 2. Efeitos Colaterais e Reações Adversas Relacionados a Medicamentos. 3. Farmacogenética. 4. Farmacovigilância. 5. Úlcera péptica. I. Mastroianni, Patrícia de Carvalho, orient. II. Herdeiro, Maria Teresa, coorient. III. Título. Diretoria do Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação - Faculdade de Ciências Farmacêuticas UNESP - Campus de Araraquara CAPES: 33004030078P6 Esta ficha não pode ser modificada UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA Câmpus de Araraquara Determinantes genéticos da hemorragia gastrointestinal associada ao uso de ácido acetilsalicílico como agente antiplaquetário: um estudo de caso-controle TÍTULO DA TESE: CERTIFICADO DE APROVAÇÃO AUTORA: MARCELA FORGERINI ORIENTADORA: PATRICIA DE CARVALHO MASTROIANNI COORIENTADORA: MARIA TERESA FERREIRA HERDEIRO Aprovada como parte das exigências para obtenção do Título de Doutora em CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS, área de conhecimento: Sem Área de Conhecimento pela Comissão Examinadora: Profa. Dra. PATRICIA DE CARVALHO MASTROIANNI (Participaçao Virtual) Departamento de Fármacos e Medicamentos / Faculdade de Ciências Farmacêuticas - UNESP - Araraquara Prof. Dr. MARIO HIROYUKI HIRATA (Participaçao Virtual) Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas / Universidade de São Paulo Prof. Dr. CLESLEI FERNANDO ZANELLI (Participaçao Virtual) Departamento de Ciências Biológicas / Faculdade de Ciências Farmacêuticas - UNESP Profa. Dra. FERNANDA RODRIGUES SOARES (Participaçao Virtual) Departamento de Genética / Universidade Federal do Triângulo Mineiro - UFTM Profa. Dra. FABIANA ROSSI VARALLO (Participaçao Virtual) Departamento de Ciências Farmacêuticas / Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto -USP Araraquara, 07 de maio de 2021 Faculdade de Ciências Farmacêuticas - Câmpus de Araraquara - RODOVIA ARARAQUARA - JAÚ, Km 1, 14800903 http://www2.fcfar.unesp.br/#!/pos-graduacao/ciencias-farmaceuticas/CNPJ: 48.031.918/0025-00. DEDICATÓRIA À Deus, por sempre me amparar e por conduzir os meus passos mesmo nos momentos mais difíceis. Aos meus pais, Eduardo e Lucimara, e minha irmã Roberta por todo o apoio e confiança oferecidos ao longo desta jornada. Minha eterna gratidão, pois, sem vocês essa vitória não seria possível. Aos amigos que carrego no meu coração. Agradeço as amigas da minha cidade natal, as da graduação na Universidade Federal de Alfenas (UNIFAL-MG) e as que Universidade Estadual Paulista (UNESP) me proporcionou. Em especial, a República Agridoce e República Santa Dose, por serem abrigo e aconchego nos dias de luta e por vibrarem em todas as minhas vitórias. Não poderia deixar de agradecer a todos que contribuíram para a minha formação, mas em especial as minhas orientadoras da UNIFAL-MG: Professora Dr Sandra Maria Oliveira Moraes Veiga e Dr Luciene Alves Moreira Marques. Gratidão por terem participado ativamente da minha formação profissional e pessoal, e por sempre acreditarem em mim da maneira mais humana possível. E por fim, a todos que de alguma maneira contribuíram para o meu amadurecimento cientifico, pessoal e na condução desse estudo. Deus colocou muitos anjos para me ampararem nessa trajetória e não teria sido possível sem a contribuição de cada um deles. AGRADECIMENTOS À minha orientadora Professora Dr Patrícia de Carvalho Mastroianni por todas as oportunidades, ensinamentos e amadurecimento científico. A nossa trajetória foi marcada por muitas dificuldades e lutas, mas também de muitas vitórias. A minha eterna gratidão por todo o aprendizado e por sempre acreditar em mim. Essa jornada não seria possível sem o seu apoio e confiança. À minha coorientadora Professora Dr Maria Teresa Herdeiro por todas as discussões científicas e ensinamentos. À cada um dos integrantes do grupo de pesquisa Núcleo de Atenção Farmacêutica (NAF), em especial a Geovana Schiavo, que além de orientada, é uma amiga que sempre acreditou em mim e confiou no meu trabalho. Sou muito grata por compartilhar essa jornada de amadurecimento científico com você. À Professora Dr Fabiana Rossi Varallo por todas as discussões científicas, apoio e amizade. Agradeço por todas as oportunidades que tive de trabalhar com você e por você confiar em mim e no meu potencial. Você é uma inspiração de ser humano e profissional. Ao Professor Dr Romeu Magnani por todos os ensinamentos e aulas de estatística, que foram muito desafiadoras devido as restrições impostas pela pandemia COVID-19, mas que se tornaram os momentos mais esperados da minha semana. Minha eterna gratidão por ser esse educador incrível e por ter acreditado no meu potencial. Os seus ensinamentos irão muito além da presente tese e contribuirão para toda a minha jornada acadêmica. À Dr Rosa Camila Lucchetta por todos os aprendizados, oportunidades e por todo o trabalho que construímos juntas. Ao Gustavo Urbano por todos os ensinamentos e por todas as vezes que me ajudou, sendo sempre muito gentil e humano. Ao Professor Dr Tales Rubens de Nadai por ter viabilizado a condução deste estudo. Ao Professor Dr Adolfo Figueiras pelos ensinamentos metodológicos e pela oportunidade de visita técnica à Universidade de Santiago de Compostela. Ao Msc Francisco Barbosa Junior por toda assessoria ao banco de dados do presente estudo, ensinamentos, amizade e pelas longas conversas. A Nayara Telles e Gabriele Castro pelo apoio e pela contribuição na organização do banco de dados. Ao Hospital Estadual de Américo Brasiliense e por toda a equipe de profissionais tão humanos que me acolheram tão bem e alegraram todos os meus dias de recrutamento de pacientes. Ao Centro de Medicina Genômica do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, em especial à Ana Julia Machry por toda a colaboração nas análises genéticas, paciência e ensinamentos. Ao Laboratório de Patologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo e em especial ao Professor Dr Alexandre Fabro Todorovic e Sabrina Setembre Batah pelo acolhimento e colaboração nas análises genéticas. Ao Laboratório de Biologia Molecular e de Microrganismos da UNESP, por terem me recebido tão bem e em especial ao Professor Dr Cleslei Fernando Zanelli, Dr Maria Olivia Masieiro e Professora Dr Tatiana Souza Moreira por todos os ensinamentos. Ao Núcleo de Atendimento à Comunidade da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da UNESP pela colaboração nos exames de sorologia à Helicobacter pylori. Ao Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas da UNESP por ter me proporcionado uma jornada de crescimento e amadurecimento pessoal e científico. Às agências de fomento Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP – processo 2017/24193-3; 2018/07501-9); Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq – processo 401060/2014-4) e a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES – código de financiamento 001) que foram essenciais para realização deste estudo. RESUMO INTRODUÇÃO: A hemorragia digestiva alta secundária à doença péptica complicada (HDA) é uma emergência digestiva associada à alta morbimortalidade e é considerada uma reação adversa a medicamento grave. A presença de variantes genéticas tem sido sugerida como um importante fator de risco para HDA, principalmente em genes envolvidos no metabolismo de medicamentos e em mecanismos fisiológicos de agregação plaquetária e proteção gástrica. OBJETIVO: Investigar a associação de variantes genéticas nos genes PTGS1, NOS3, CYP2C9, VKORC1 e ABCB1 e o risco de HDA. METODOLOGIA: Foi conduzido um estudo caso-controle pareado por gênero e idade (±5 anos) no complexo hospitalar do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. Caso: pacientes com diagnóstico de HDA confirmado mediante endoscopia digestiva alta (EDA) ou intervenção cirúrgica. Controle: pacientes submetidos à cirurgia leve não relacionadas à problemas gastrointestinais. Os dados foram coletados por meio de entrevistas e coleta de sangue (5 mL). Variável dependente: HDA. Variável independente: variante genética. Variáveis de confusão: etnia, escolaridade, índice de massa corpórea, histórico familiar de úlcera, histórico pessoal de doenças gastrointestinais (úlcera, hemorragia, dispepsia), sorologia para Helicobacter pylori, comorbidades, farmacoterapia em uso, hábitos de vida (tabaco, álcool e café) e consistência da entrevista. Foi proposta a análise dos seguintes genes e variantes: PTGS1 (rs1330344, rs3842787, rs10306114, rs5788), NOS3 (rs2070744, rs1799983 e repetição em série de número variável (VNTR) no íntron 4 da eNOS), CYP2C9 (rs1057910 e rs1799853), VKORC1 (rs9923231) e ABCB1 (rs1045642). A genotipagem foi conduzida por meio da reação em cadeia da polimerase em tempo real com o ensaio TaqPath ProAmp (AppliedBiosystems, Foster City, USA) e a determinação da VNTR no íntron 4 da eNOS por meio da reação em cadeia da polimerase e análise de fragmentos (ABI3130, AppliedBiosystems, Foster City, USA). A sorologia por Helicobacter pylori foi determinada por concentração de IgG no plasma dos participantes, por meio da técnica de quimiluminescência. Os dados da entrevista, análise genética e laboratorial foram digitados na plataforma Research Electronic Data Capture. Como controle de qualidade, a frequência genotípica das variantes genéticas foi avaliada por meio do Equilíbrio de Hardy-Weinberg. Análise estatística: modelos de regressão logística não condicional (programa SPSS). RESULTADOS: Foram elegíveis 200 casos e 706 controles, sendo a maioria do gênero masculino [grupo caso: 145 (72,5%) e grupo controle: 512 (72,5%)], autodeclarados brancos [grupo caso: 134 (67,3%) e grupo controle: 516 (73,5%)] e com média de idade de 60,2 (±16,3) e 59,8 (±15,8) anos, respectivamente. A frequência de admissões hospitalares por HDA foi de 7,1% e estima-se que sete a cada cem pacientes submetidos à EDA foram diagnosticados com HDA. Todas as variantes atenderam ao Equilíbrio de Hardy-Weinberg. Foram identificados seis polimorfismos de nucleotídeo único (rs1330344, rs10306114, rs2070744, rs1799983, rs1045642 e rs9923231) e VNTR no íntron 4 da eNOS que podem modificar a magnitude de risco de HDA em usuários de ácido acetilsalicílico. Quando foram considerados os usuários de anti- inflamatório não esteroidal, as onze variantes genéticas avaliadas neste estudo foram associadas ao risco de HDA. Como fatores de risco independentes para HDA foram identificadas as variáveis: histórico pessoal prévio de úlcera (p-valor: < 0,001); sorologia reagente para Helicobacter pylori (p- valor: 0,029); uso de anticoagulantes (p-valor: < 0,001), ácido acetilsalicílico (p-valor: < 0,001) e anti- inflamatórios não esteroidais (p-valor: < 0,001); consumo > 15 cigarros/dia (p-valor: < 0,001) e consumo de > 30 gramas de álcool/dia (p-valor: < 0,001). CONCLUSÃO: Trata-se de um estudo inédito na população brasileira e que contribui com a análise de três variantes inéditas no escopo da HDA: rs1330344 (PTGS1), rs2070744 (NOS3) e rs1045642 (ABCB1). Os nossos achados evidenciam que a presença das variantes genéticas avaliadas pode modificar a magnitude do risco de HDA em usuários de ácido acetilsalicílico e/ou de anti-inflamatórios não esteroidais, além de outras variáveis de risco independente para HDA. Por fim, os nossos achados sugerem a necessidade de uma terapia individualizada, considerando o monitoramento do uso de medicamentos e identificação de fatores prévios de risco para HDA a fim de promover a segurança do paciente. PALAVRAS-CHAVE: Hemorragia gastrointestinal; Efeitos Colaterais e Reações Adversas Relacionados a Medicamentos; Farmacogenética; Farmacovigilância; Úlcera péptica. ABSTRACT INTRODUCTION: Upper gastrointestinal bleeding secondary to complicated peptic disease (UGIB) is a digestive emergency associated with high morbidity and mortality and is considered a serious adverse drug reaction. The presence of genetic variants has been suggested as an important risk factor for UGIB, mainly in genes involved in drug metabolism and in physiological mechanisms of platelet aggregation and gastric protection. OBJECTIVE: To investigate the association of genetic variants in the PTGS1, NOS3, CYP2C9, VKORC1 and ABCB1 genes and the risk of UGIB. METHODOLOGY: A case-control study paired by sex and age (± 5 years) was conducted in the the hospital complex of Clinical Hospital of the Ribeirão Preto Medical School of the University of São Paulo. Case: patients diagnosed with UGIB confirmed by upper digestive endoscopy (UDE) or surgical intervention. Control: patients undergoing mild surgery not related to gastrointestinal problems. Data were collected through interviews and blood collection (5 mL). Dependent variable: UGIB. Independent variable: genetic variant. Confounding variables: ethnicity, schooling, body mass index, family history of ulcer, personal history of gastrointestinal diseases (ulcer, hemorrhage, dyspepsia), serology for Helicobacter pylori, comorbidities, drug therapy in use, lifestyle (tobacco, alcohol and coffee) and consistency of the interview. The analysis of the following genes and variants were proposed: PTGS1 (rs1330344, rs3842787, rs10306114, rs5788), NOS3 (rs2070744, rs1799983 and variable number tandem repeats (VNTR) in intron 4), CYP2C9 (rs1057910 and rs1799853), VKORC1 (rs9923231). The genotyping were carried out through the real-time polymerase chain reaction with the TaqPath ProAmp assay (AppliedBiosystems, Foster City, USA) and the determination of VNTR in intron 4 of eNOS through polymerase chain reaction and fragment analysis (ABI3130, AppliedBiosystems, Foster City, USA). Helicobacter pylori serology was determined by IgG concentration in the participants' plasma, using the chemiluminescence technique. The interview data, genetic and laboratory analysis were entered into the Research Electronic Data Capture platform. For genotyping control, the genotypic frequency of the genetic variants was assessed using the Hardy- Weinberg Equilibrium. Statistical analysis: unconditional logistic regression models (SPSS program). RESULTS: 200 cases and 706 controls were eligible. Most participants were male [case group: 145 (72.5%) and control group: 512 (72.5%)], self-declared white [case group: 134 (67.3%) and control group: 516 (73.5%)] and with a mean age of 60.2 (± 16.3) and 59.8 (± 15.8) years, respectively. The frequency of hospital admissions for UGIB was 7.1% and it is estimated that seven out of every hundred patients undergoing UDE were diagnosed with UGIB. All the genetic variants attend the Hardy-Weinberg Equilibrium. Six single nucleotide polymorphisms (rs1330344, rs10306114, rs2070744, rs1799983, rs1045642 and rs9923231) and VNTR in intron 4 of eNOS can modify the UGIB risk magnitude in users of low-dose aspirin. When considering users of non-steroidal anti- inflammatory drugs, the eleven genetic variants evaluated in this study were associated with the risk of UGIB. As independent risk factors for UGIB were identified the following variables: previous personal history of ulcer (p-value: <0.001); reagent serology for Helicobacter pylori (p-value: 0.029); use of anticoagulants (p-value: <0.001), low-dose aspirin (p-value: <0.001) and non-steroidal anti- inflammatory drugs (p-value: <0.001); consumption > 15 cigarettes/day (p-value: <0.001) and consumption of > 30 grams of alcohol/day (p-value: <0.001). CONCLUSION: This is an unprecedented study in the Brazilian population and which contributes to the analysis of three new variants within the scope of UGIB: rs1330344 (PTGS1), rs2070744 (NOS3) and rs1045642 (ABCB1). Our findings show that the presence of the evaluated genetic variants can modify the magnitude of the risk of UGIB in low-dose aspirin users and/or non-steroidal anti-inflammatory drugs, in addition to other independent risk variables for UGIB. Finally, our findings suggest the need for individualized therapy, considering the monitoring of drug therapy use and the identification of previous risk factors for UGIB in order to promote patient safety. KEYWORDS: Drug-Related Side Effects and Adverse Reactions; Gastrointestinal Hemorrhage; Peptic ulcer; Pharmacogenetics; Pharmacovigilance. LISTA DE FIGURAS Figura 1. Descrição das atividades conduzidas nas quatro etapas do estudo (clínica, genética, laboratorial e epidemiológica). ............................................................................................................ 39 Figura 2. Plot de discriminação alélica da variante rs1330344 do gene PTGS1. ................................ 48 Figura 3. Análise do produto da reação em cadeia da polimerase de uma amostra em gel de agarose 1,2%. .................................................................................................................................................... 50 Figura 4. Perfil de eletroforese do ladder GeneScan™ 1000ROX ™ (AppliedBiosystems, Foster City, USA). .................................................................................................................................................... 51 Figura 5. Análise de fragmentos no equipamento AB13130, sendo o primeiro gráfico referente ao genótipo selvagem (420 pares de base; b/b; 5 repetições), o segundo ao heterozigoto (393 e 420 pares de bases; a/b) e o homozigoto para o alelo variante (393 pares de bases; a/a; 4 repetições). .............. 53 LISTA DE FLUXOGRAMA Fluxograma 1. Fluxograma de identificação e elegibilidade de casos diagnosticados com hemorragia digestiva alta secundária à doença péptica complicada mediante endoscopia digestiva alta (n= 180) e controles (n=706) recrutados no complexo hospitalar do Hospital das Clínicas de Ribeirão Preto, no período de julho de 2016 a março de 2020. ......................................................................................... 62 LISTA DE QUADROS Quadro 1.Classificação de Forrest considerando o tipo de sangramento, estigmata endoscópica e risco de ressangramento. ............................................................................................................................... 20 Quadro 2. Classificação de Sakita considerando o estágio da úlcera e descrição dos achados endoscópicos. ....................................................................................................................................... 20 Quadro 3. Determinação do fenótipo do gene CYP2C9 considerando a combinação de alelos e o fenótipo predito. ................................................................................................................................... 30 Quadro 4. Variáveis e fontes de dados e mensuração. ........................................................................ 42 Quadro 5. Descrição dos genes e polimorfismos de nucleotídeo único analisados de acordo com o número de identificação (rs), identificação da troca de base nitrogenada do DNA, código do ensaio da AppliedByosistem, fenótipo e genótipo. ............................................................................................... 46 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Preparação da reação em cadeia da polimerase para validação do protocolo de análise da repetição em série de número variável do íntron 4 do gene eNOS. ..................................................... 49 Tabela 2. Descrição do preparo dos mix para reação em cadeia da polimerase e para eletroforese capilar. .................................................................................................................................................. 52 Tabela 3. Descrição das variáveis demográficas e clínicas dos participantes casos (n=200) e controles (n=706) do complexo hospitalar do Hospital das Clínicas de Ribeirão Preto, no período de julho de 2016 a março de 2020. ......................................................................................................................... 62 Tabela 4. Frequência dos sinais e sintomas clínicos dos participantes do grupo caso (n=200) nos 30 dias anteriores a internação, complexo hospitalar do Hospital das Clínicas de Ribeirão Preto, no período de julho de 2016 a março de 2020. ......................................................................................... 64 Tabela 5. Descrição da frequência dos genótipos dos polimorfismos de nucleotídeo único nos genes PTGS1, NOS3, CYP2C9, ABCB1, VKORC1 e repetição em série de número variável (VNTR) do íntron 4 da eNOS e as respectivas análises de Equilíbrio de Hardy–Weinberg entre casos e controles recrutados no complexo hospitalar do Hospital das Clínicas de Ribeirão Preto, no período de julho de 2016 a março de 2020. ......................................................................................................................... 65 Tabela 6. Razão de chances de hemorragia digestiva alta secundária à úlcera péptica complicada após modelo de regressão logística binária multivariado considerando as variantes genéticas estratificadas em homozigoto para o alelo selvagem, heterozigoto e homozigoto para o alelo variante. ................. 67 Tabela 7. Razão de chances de hemorragia digestiva alta secundária à úlcera péptica complicada após modelo de regressão logística binária multivariado considerando as variantes genéticas estratificadas em homozigoto para o alelo selvagem e presença da variação genética agrupando heterozigoto e homozigoto para o alelo variante. ........................................................................................................ 69 Tabela 8. Modelo de regressão logística para avaliar a influência da repetição em série de número variável (VNTR) do íntron 4 da eNOS e o risco de hemorragia digestiva alta secundária à doença péptica complicada. .............................................................................................................................. 71 Tabela 9. Modelo de regressão logística para as variantes genéticas localizadas nos genes PTGS1, NOS3, CYP2C9, ABCB1 e VKORC1 considerando interação multiplicativa com o uso de usuários de ácido acetilsalicílico (AAS) e o risco de hemorragia digestiva alta secundária à doença péptica complicada. .......................................................................................................................................... 72 Tabela 10. Modelo de regressão logística para as variantes genéticas localizadas nos genes PTGS1, NOS3, CYP2C9, ABCB1 e VKORC1 considerando interação multiplicativa com o uso de anti- inflamatórios não esteroidais (AINEs) e o risco de hemorragia digestiva alta secundária à doença péptica complicada. .............................................................................................................................. 74 LISTA DE ABREVIATURAS AAS: ácido acetilsalicílico AINEs: anti-inflamatório não esteroidal EDA: endoscopia digestiva alta HDA: hemorragia digestiva alta Heab: Hospital Estadual de Américo Brasiliense HGI: hemorragia gastrointestinal IC: intervalo de confiança OR: odds ratio PCR: Reação em cadeia da polimerase RedCap: Research Electronic Data Capture SNP: Single nucleotide polymorphism VNTR: Variable number tandem repeat SUMÁRIO 1) INTRODUÇÃO ............................................................................................................. 17 2) REVISÃO DE LITERATURA ...................................................................................... 19 2.1) Hemorragia digestiva alta secundária à doença péptica complicada: da etiologia ao diagnóstico................. ...................................................................................................................... 19 2.1.1 Infecção por Helicobacter pylori e o risco de hemorragia digestiva alta secundária à doença péptica complicada ....................................................................................................................... 21 2.1.2 Uso de medicamentos e o risco de hemorragia digestiva alta secundária à doença péptica complicada .................................................................................................................................... 22 2.2) Susceptibilidade genética e o risco de hemorragia digestiva alta secundária à doença péptica complicada ........................................................................................................................... 26 3) OBJETIVOS .................................................................................................................. 36 Objetivo principal ..................................................................................................................... 36 Objetivos específicos ............................................................................................................... 36 Hipóteses do estudo.................................................................................................................. 36 4) METODOLOGIA E CASUÍSTICA .............................................................................. 37 4.1) Estudo 1. Revisão sistemática .................................................................................... 37 4.2) Estudo 2. Estudo observacional do tipo caso-controle ............................................... 37 4.2.1. Aspectos éticos ............................................................................................................ 37 4.2.2. Desenho ....................................................................................................................... 38 4.2.3. Local ........................................................................................................................... 39 4.2.4. Participantes ............................................................................................................... 39 4.2.5. Período e coleta de dados ........................................................................................... 41 4.2.6. Variáveis ..................................................................................................................... 42 4.2.7. Fonte de dados e mensuração ..................................................................................... 42 4.2.8. Análise genética ......................................................................................................... 45 4.2.8.1. Análise de polimorfismo de nucleotídeo único .......................................................... 46 4.2.8.2. Análise da repetição em série de número variável do íntron 4 do gene eNOS .......... 49 4.2.9. Análise laboratorial: solorogia para Helicobacter pylori ........................................... 53 4.2.10. Tabulação de dados .................................................................................................... 54 4.2.11. Viés ............................................................................................................................. 54 4.2.12. Cálculo do tamanho amostral ..................................................................................... 55 4.2.13. Análises estatísticas .................................................................................................... 55 4.2.13.1. Equilíbrio de Hardy-Weinberg ................................................................................... 55 4.2.13.2. Modelo de regressão logística binária ........................................................................ 56 5) RESULTADOS .............................................................................................................. 60 (I) Revisão sistemática das variantes genéticas associadas ao risco de HDA ................. 60 (II) Perfil epidemiológico dos participantes dos grupos caso e controle .......................... 60 (III) Análise genética ......................................................................................................... 65 (IV) Fatores associados a HDA .......................................................................................... 66 6) DISCUSSÃO ................................................................................................................. 76 7) FORTALEZAS E LIMITAÇÕES DO ESTUDO .......................................................... 86 8) CONCLUSÃO ............................................................................................................... 87 9) REFERÊNCIAS ............................................................................................................. 89 10) LISTA DE ANEXOS ................................................................................................... 106 ANEXO 1: Registro da revisão sistemática no International Prospective Register of Systematic Reviews (PROSPERO) (CRD42020167658). ............................................................................... 106 ANEXO 2: Aprovação do projeto pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. .............................. 110 ANEXO 3: Aprovação do projeto pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”. ............................................................................................... 114 ANEXO 4. Termo de consentimento livre e esclarecido para participantes do grupo caso. . 119 ANEXO 5. Termo de consentimento livre e esclarecido para participantes do grupo controle. ......................................................................................................................................122 ANEXO 6. Termo de consentimento para guarda para guarda de material biológico .......... 125 11) LISTA DE APÊNDICE ............................................................................................... 127 APÊNDICE 1: Flowchart do processo de análise e monitoramento das endoscopias digestivas alta dos pacientes admitidos na Unidade de Urgência e Emergência do Hospital das Clínicas de Ribeirão Preto da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. ................................... 127 17 1) INTRODUÇÃO A hemorragia digestiva alta (HDA) é considerada uma emergência médica associada a hospitalizações (LAINE, 2016) e alta morbimortalidade devido à necessidade de intervenções cirúrgicas, readmissões hospitalares e mortalidade intra-hospitalar (QUAN et al., 2014). A HDA possui etiologia varicosa e não varicosa (FEINMAN; HAUT, 2014), sendo a etiologia não varicosa a de maior incidência (LANAS et al., 2018) e com uma taxa de mortalidade que varia de 1.1 a 11% (JAIRATH et al., 2012b) e em até 26% em pacientes hospitalizados (HEARNSHAW et al., 2011). Uma das causas mais frequentes de HDA de etiologia não varicosa é a doença péptica complicada decorrente de úlceras pépticas (duodenais e gástricas) e erosões gastroduodenais (LANAS et al., 2018). A HDA não varicosa também pode ser considerada uma reação adversa a medicamento grave (PIRMOHAMED et al., 2004) e estima-se que sete a cada cem pacientes admitidos e submetidos à endoscopia digestiva alta em um hospital terciário, são diagnosticados com HDA (FORGERINI et al., 2021c). A presença de variantes genéticas tem sido sugerida como importante fator de risco para HDA secundária à doença péptica complicada (FIGUEIRAS et al., 2016; MALLAH et al., 2020) e para a reincidência de sangramento (KIM et al., 2003). Por meio de uma revisão sistemática foram identificadas variantes genéticas relevantes no escopo da HDA (FORGERINI et al., 2021a) e no que concerne o uso de medicamentos, os estudos têm identificado variantes genéticas associadas à HDA em usuários de ácido acetilsalicílico (AAS) (MALLAH et al., 2020; SHIOTANI et al., 2011, 2014; SHIOTANI; FUJITA; NISHIO, 2015) e de anti-inflamatórios não esteroidais (AINEs) (FIGUEIRAS et al., 2016; PILOTTO et al., 2007). No entanto, não é de nosso conhecimento nenhum estudo que tenha avaliado a presença de variantes genéticas envolvidas no risco de HDA secundária à doença péptica complicada na população brasileira (FORGERINI et al., 2021a). Além das variantes genéticas e o uso de medicamentos, comorbidades (CROOKS; WEST; CARD, 2013), infecção por Helicobacter pylori (SOSTRES; LANAS, 2011) e hábitos de vida como consumo de álcool e tabaco (CROOKS; WEST; CARD, 2013) também tem sido sugeridos como importantes fatores de risco, independentes, para HDA secundária à doença péptica complicada. Neste contexto, é proposta a análise de variantes genéticas envolvidas em processos fisiológicos de proteção gástrica e na cascata de agregação plaquetária (variantes nos genes PTGS1 e NOS3) (BRZOZOWSKI et al., 2005; LANAS, 2008), assim como na farmacocinética de medicamentos (variantes nos genes ABCB1 e VKOCR1) (BAHAR et al., 2017; SHIOTANI et al., 2014; ZHOU et al., 2008), e em especial, no metabolismo dos AINEs (variantes no gene CYP2C9) (FIGUEIRAS et al., 2016). 18 Portanto, pretendeu-se investigar a influência de onze variantes genéticas nos genes PTGS1, NOS3, CYP2C9, ABCB1 e VKOCR1 no risco de HDA secundária à doença péptica complicada considerando variáveis de confundimento importantes (e.g., comorbidades, infecção por Helicobacter pylori, farmacoterapia em uso e hábitos de vida), além de estimar a frequência dessas variantes genéticas na população brasileira. 19 2) REVISÃO DE LITERATURA 2.1) Hemorragia digestiva alta secundária à doença péptica complicada: da etiologia ao diagnóstico A hemorragia gastrointestinal (HGI) é uma emergência médica e é a causa mais frequente de hospitalizações associadas à morbidades digestivas (GRALNEK; NEEMAN; STRATE, 2017; LAINE, 2016). A HGI é classificada como alta (HDA) e baixa (HDB), a depender da proximidade do sangramento ao ligamento de Treitz (FEINMAN; HAUT, 2014). A HDB tem origem próxima ao ligamento de Treitz e abrange intestino delgado, cólon e reto (FEINMAN; HAUT, 2014). Diverticulite, angiectasias e doenças anorretais como hemorroidas e doenças malignas colorretais são as causas mais frequentes de HDB (HREINSSON et al., 2013; OAKLAND et al., 2018). Já a HDA, possui origem acima do ligamento de Treitz e ocorre nos órgãos esôfago, estomago e duodeno e sua incidência é até cinco vezes maior quando comparada à incidência de HDB (OAKLAND, 2019). A HDA possui etiologia não varicosa e varicosa (FEINMAN; HAUT, 2014). Enquanto a etiologia varicosa é causada por varizes esofágicas ou gástricas que geralmente estão associadas a doenças hepáticas e hipertensão portal (LANAS et al., 2018), a etiologia não varicosa, definida como desfecho deste estudo, é frequentemente causada por doença péptica complicada, que por sua vez está associada à infecção por Helicobacter pylori e ao uso de alguns medicamentos (e.g., AINEs e anticoagulantes orais) (LANAS et al., 2011, 2015). A HDA secundária à doença péptica complicada também pode ser considerada uma reação adversa a medicamento grave (PIRMOHAMED et al., 2004). A fisiopatologia e os mecanismos envolvidos no desenvolvimento da HDA secundária à doença péptica complicada ainda não são bem elucidados. No entanto, sabe-se que a presença de fatores envolvidos na fisiopatologia da HDA está associada a danos a mucosa gástrica, o que acarreta na exposição dos vasos sanguíneos da submucosa gástrica à ação de ácido e pepsina o que irá desencadear erosões, comprometimento da parede do vaso e interferência na coagulação sanguínea (LANAS et al., 2018). Os fatores mais comumente associados ao dano da mucosa gástrica são infecção causada por Helicobacter pylori e uso de medicamentos como AINEs, antiagregantes plaquetários e anticoagulantes (LANAS; CHAN, 2017). Além desses fatores, a influência da presença de variantes genéticas (FORGERINI et al., 2021a), comorbidades não gastrointestinais (CROOKS; WEST; CARD, 2013) e hábitos de vida (e.g., tabagismo e ingestão de álcool) (LANGSTED; NORDESTGAARD, 2019; STRATE et al., 2016) também devem ser considerados. Esses fatores são detalhados mais adiante. 20 Em relação ao diagnóstico de HDA, a endoscopia digestiva alta (EDA) é o padrão ouro para o diagnóstico e também como o método para o tratamento (LANAS et al., 2018). No entanto, todo paciente admitido no serviço de saúde e apresentando um quadro indicativo de HDA deve ser submetido à uma estratificação de risco pré-endoscópica (LANAS et al., 2018). Existem diversos instrumentos para a estratificação de risco, mas o escore de Glasgow-Blatchford apresenta uma boa performance e é utilizado mundialmente, sendo efetivo em predizer necessidade de intervenção, complicações e morte, tanto na pré-admissão do paciente quanto após endoscopia (STANLEY et al., 2017). A EDA será essencial para identificar a causa da HDA e quando realizada dentro de 24 horas após a apresentação dos sintomas, há melhora nos desfechos do paciente (JAIRATH et al., 2012a; SARIN; MONGA; ADAMS, 2009). Portanto, a EDA é recomendada para: a) diagnóstico da causa do sangramento; b) avaliar os estigmas de sangramento recente (e.g. sangramento ativo, vaso sanguíneo visível, presença de coágulos e manchas escuras recobrindo a úlcera); c) estratificar os pacientes de acordo com a classificação de Forrest (FORREST; FINLAYSON; SHEARMAN, 1974); e d) avaliar o nível de cicatrização da úlcera considerando a classificação de Sakita (SAKITA, 1973). A classificação de Forrest permite identificar os pacientes que necessitam de tratamento, assim como estratificar os que possuem riscos de ressangramento e necessidade de intervenção cirúrgica (LAU et al., 1998). O tratamento do paciente por meio de endoscopia é recomendado para os pacientes classificados por Forrest como Ia, Ib e IIa, sendo efetivo em prevenir sangramentos persistentes ou sangramento recorrente (LAINE; MCQUAID, 2009). Já a classificação de Sakita permite avaliar o nível de cicatrização da úlcera. Os quadros 1 e 2 sumarizam como os achados endoscópicos dos pacientes submetidos à EDA são classificados de acordo com Forrest e de Sakita (Quadros 1 e 2). Quadro 1.Classificação de Forrest considerando o tipo de sangramento, estigmata endoscópica e risco de ressangramento. Classificação de Forrest Sangramento Estigmata endoscópica Risco de ressangramento Forrest Ia I – Ativo Em jato Muito alto Forrest Ib Babando Muito alto Forrest IIa II – Recente Coto vascular visível Alto Forrest IIb Coágulo recente Alto Forrest IIc Fundo hematínico Baixo Forrest III III - Sem sangramento Sem sinal de sangramento Muito baixo Fonte: (FORREST; FINLAYSON; SHEARMAN, 1974) Quadro 2. Classificação de Sakita considerando o estágio da úlcera e descrição dos achados endoscópicos. 21 Classificação de Sakita Estágio da úlcera Descrição dos achados A (active) A1 Ativo Lesão com bordas planas e nítidas, fundo com fibrinas, e chances de restos necróticos A2 Ativo Bordas bem definidas, às vezes elevadas, com forma mais nítida, fundo com fibrinas espessa e clara H (healing) H1 Cicatrizando Fibrina mais tênue, discreta convergência de pregas, com hiperemia marginal H2 Cicatrizando Ilhas de tecido de regeneração, com convergência nítida de pregas e intensa hiperemia marginal S (scar) S1 Cicatrizado Formação de cicatriz vermelha com reação inflamatória adjacente residual S2 Cicatrizado Formação de cicatriz branca, com retração adjacente variável Fonte: (SAKITA, 1973) 2.1.1 Infecção por Helicobacter pylori e o risco de hemorragia digestiva alta secundária à doença péptica complicada A Helicobacter pylori é uma bactéria gram-negativa cuja infecção ocorre possivelmente por meio do ciclo oral-oral e fecal-oral (BURKITT et al., 2017) e está associada a diversas doenças gástricas, sendo amplamente estudada no risco de úlcera péptica e câncer gástrico (LEE et al., 2016; WANG et al., 2014). A prevalência global de infecção por Helicobacter pylori é estimada em 50%, sendo mais alta em países em desenvolvimento (BURKITT et al., 2017). No Brasil, por exemplo, a prevalência de infecção por Helicobacter pylori é estimada em cerca de 90% (PELETEIRO et al., 2014) e o nível socioeconômico (EPPLEIN et al., 2011), etnia (EVERHART et al., 2000), presença de sintomas dispépticos (NARAYANAN; REDDY; MARSICANO, 2018) e gênero masculino (OR: 1,16, IC95% 1.11–1.22) (DE MARTEL; PARSONNET, 2006) parecem estar associados a infecção. A infecção por Helicobacter pylori é uma resposta inflamatória mediada por neutrófilos, linfócitos, células plasmáticas e macrófagos na mucosa gástrica, o que acarreta na degeneração e lesão das células epiteliais (NARAYANAN; REDDY; MARSICANO, 2018). A inflamação do revestimento do estômago (gastrite) geralmente é mais grave no antro, com pouca ou nenhuma inflamação no corpo gástrico (NARAYANAN; REDDY; MARSICANO, 2018). No entanto, em alguns indivíduos essa inflamação pode comprometer o corpo gástrico levando à pangastrite, que por sua vez, poderá evoluir para vários graus de atrofia e redução da produção de ácido clorídrico. Estes eventos são reportados como precursores da úlcera péptica e do câncer gástrico (LADEIRA; SALVADORI; RODRIGUES, 22 2003). Também foi reportado um sinergismo importante no dano da mucosa gástrica em usuários de AINEs com infecção por Helicobacter pylori (HUANG; SRIDHAR; HUNT, 2002). O tratamento da Helicobacter pylori consiste na combinação de antimicrobianos e supressores da secreção ácida (BURKITT et al., 2017). Para o tratamento de primeira linha é recomendada a terapia tripla com claritromicina, amoxicilina e omeprazol e o prescritor deve avaliar se o paciente reside em local de resistência antimicrobiana e questionar a respeito do uso prévio de antimicrobianos (CHEY et al., 2018). Nos últimos anos tem sido observada uma queda na frequência de úlcera péptica associada à Helicobacter pylori, o que pode ser justificado pela melhoria nas condições sociais e sanitárias (MCJUNKIN et al., 2011), assim como os avanços no tratamento e erradicação da infecção (GROENEN et al., 2009). No entanto, apesar do tratamento ser efetivo, as falhas terapêuticas tem sido frequentes especialmente devido a presença de cepas de Helicobacter pylori resistentes aos antimicrobianos (BURKITT et al., 2017). Sob outra perspectiva, a adesão ao tratamento para erradicação da infecção (FISCHBACH; EVANS, 2007) e presença de variantes genéticas no gene CYP2C19 que é responsável por metabolizar os inibidores da bomba de prótons também são fatores que poderão influenciar diretamente nas falhas terapêuticas (TANG et al., 2013). 2.1.2 Uso de medicamentos e o risco de hemorragia digestiva alta secundária à doença péptica complicada Ácido acetilsalicílico (AAS) Entre os medicamentos antiagregantes, o AAS é um medicamento de fácil acesso e é frequentemente prescrito na prevenção primária e secundária de eventos cardiovasculares e estima-se que aproximadamente 24,8% da população brasileira o utiliza para prevenção primária e 34,3% para prevenção secundária (VIANNA; GONZÁLEZ; MATIJASEVICH, 2012). No entanto, apesar de guidelines recomendarem o AAS na prevenção de eventos cardiovasculares, esse uso vem sendo associado ao risco de eventos adversos em tratamentos prolongados (LANAS et al., 2015; SHIOTANI; FUJITA; NISHIO, 2015; WANG, 2019) e o real risco/benefício foi questionado (BERGER et al., 2006). A avaliação do benefício do uso do AAS na prevenção primária de eventos cardiovasculares tem sido alvo de inúmeros estudos, especialmente em indivíduos com peso superior a 70 quilos, com diagnóstico de diabetes e idosos (BOWMAN et al., 2018; GAZIANO et al., 2018; MCNEIL et al., 2018; ROTHWELL et al., 2018; SMITH; DEMETRIOU; WEBER, 2019). Uma metanálise que incluiu 117.279 participantes (dez ensaios clínicos) não identificou evidência de benefício do AAS em participantes com peso superior a 70 quilos e reportou que a 23 efetividade do AAS (doses de 75 – 100 mg) diminui conforme o peso do indivíduo aumenta (ROTHWELL et al., 2018). Considerando os indivíduos com diagnóstico de diabetes e idosos que não possuem doenças cardiovasculares, dois ensaios clínicos não identificaram evidência do benefício do AAS nessas populações e reportaram aumento do risco de sangramentos (BOWMAN et al., 2018; MCNEIL et al., 2018). O ensaio ASCEND incluiu 15.000 participantes diabéticos e identificou que apesar dos indivíduos tratados com AAS terem uma menor incidência de eventos cardiovasculares graves (RR: 0,88, CI95%: 0,79 – 0,97), foi observado um aumento do risco de sangramentos (RR: 1,29, CI95%: 1,09 – 1,52) (BOWMAN et al., 2018). O ensaio ASPREE incluiu 17.000 idosos (> 70 anos) e também foi observado aumento no risco de sangramento (HR: 1,38, IC95% 1,18 1,62) e ausência de benefício do AAS na prevenção de eventos cardiovasculares (MCNEIL et al., 2018). Um outro ensaio clínico (ARRIVE) avaliou 12.546 participantes com risco moderado de doença cardiovascular (aterosclerose) e também não identificou melhora em nenhum dos desfechos cardiovasculares avaliados (GAZIANO et al., 2018). Os eventos de sangramento reportados por esses estudos, especialmente risco de HDA, podem ser justificados pelo próprio mecanismo de ação do AAS, o qual irá conferir tanto os seus benefícios quanto os potenciais riscos de segurança (SMITH; DEMETRIOU; WEBER, 2019). Para o efeito farmacológico antiagregante, o AAS inibe irreversivelmente, por meio de acetilação, a atividade da isoenzima COX-1, o que impede a formação de tromboxano A2 durante toda a vida da plaqueta (7 a 10 dias). O tromboxano A2, por sua vez, é um potente vasoconstritor e indutor da ativação e agregação plaquetária e a sua não formação acarretará na redução da agregação, prolongando, assim, o tempo de sangramento e aumentando o risco de sangramento (AWTRY; LOSCALZO, 2000). Também é essencial considerar que existem uma série de fatores que podem influenciar no risco de HDA durante o uso de AAS, como a idade do paciente, gênero, presença de variantes genéticas que de alguma maneira interfiram na farmacocinética e dinâmica do AAS e hábitos de vida (COLLINS et al., 2009; SHIOTANI; FUJITA; NISHIO, 2015; WHITLOCK et al., 2016). Logo, a decisão de iniciar a terapia antiagregante com o AAS, principalmente em indivíduos sem histórico prévio de doença cardiovascular, deve ser avaliada pelo prescritor de uma maneira individualizada, uma vez que há uma alta variabilidade interindividual (WHITLOCK et al., 2016). Sob outra perspectiva, também é crescente o número de estudos avaliando o uso de AAS na prevenção do câncer. No entanto, a maior limitação desses estudos está relacionada ao fato da maioria dos dados ser proveniente de estudos que avaliaram a prevenção de doenças cardiovasculares e portanto, não foram delineados com desfecho primário de câncer (SMITH; DEMETRIOU; WEBER, 2019). Essa hipótese somada ao fato do AAS ser um medicamento de fácil acesso, faz com que haja um aumento do uso não racional deste medicamento e consequentemente da incidência de HDA. Ademais, uma revisão sistemática que incluiu 103.787 participantes não identificou redução da 24 incidência de câncer, nem tampouco a mortalidade geral de câncer com o uso de AAS (CHUBAK et al., 2016). Anti-inflamatórios não esteroidais (AINEs) Usuários de AINEs têm até três vezes mais chances de desenvolver lesões na mucosa gástrica (TSUJIMOTO et al., 2018), úlcera péptica (LANAS; CHAN, 2017) e eventos gastrointestinais graves como úlcera perfurada e HDA (LANAS et al., 2015). E, na população brasileira, foi observado um aumento na prevalência de úlcera péptica associada ao consumo de AINEs quando comparada a prevalência associada à infecção por Helicobacter pylori (CARLI et al., 2015). Assim como o AAS, o mecanismo de ação dos AINEs está diretamente associado ao risco de sangramento. De modo geral, a ação dos AINEs envolve a inibição irreversível da COX-1 e COX-2, isoenzimas envolvidas na biossíntese das prostaglandinas, que por sua vez estão fortemente implicadas na inflamação e em processos fisiológicos da gastroproteção e agregação plaquetária (CRYER; FELDMAN, 1998). É importante recordar que a COX-1 é constitutiva e possui funções a nível renal, gástrico e plaquetário importantes, enquanto a COX-2 é induzida e intervém em processos inflamatórios, febris e de dor (LIPPI; DANESE; FAVALORO, 2019). Alguns AINEs são inibidores não específicos de ambas as enzimas, enquanto os chamados "coxibes" irão inibir especificamente a COX-2. É esperado, portanto, um menor risco de sangramento gastrointestinal em usuários de coxibe quando comparado aos usuários de AINEs, uma vez que não há a inibição da COX-1. No entanto, mesmo com a seletividade dos coxibe, o risco de complicações gastrointestinais nos usuários ainda é reportado (BINDU; MAZUMDER; BANDYOPADHYAY, 2020). A nível da mucosa gástrica, os AINEs, assim como o AAS, também diminuem a hidrofobicidade do muco gástrico, fazendo com que o epitélio fique exposto a ação do ácido gástrico e pepsina, levando ao dano da mucosa gástrica (LANAS et al., 2018) e além da seletividade para a COX-2, a dose diária e tempo de uso do AINE também poderá influenciar no risco de HDA (CHATTERJEE et al., 2015). É observado um efeito dose dependente no risco de sangramento gastrointestinal quando se compara usuários de baixas (RR: 2,5, IC95% 2,0 – 3,0) e altas doses de AINEs (RR: 4,5, IC95% 4,0 – 6,1), assim como usuários de AINEs de meia vida curta (RR: 2,4, IC95% 1,9 – 3,1) e longa (RR: 4,5, IC95% 3,3 – 6,2) (GARCÍA RODRÍGUEZ; BARREALES TOLOSA, 2007). Quando o tempo de uso do AINEs é considerado, um maior risco de sangramento gastrointestinal é observado em períodos de uso inferiores à um mês (OR: 8,00, IC95% 6,37 – 10,06) quando comparado à períodos de até três meses (OR: 3,31, IC95% 2,27 – 4,82) ou superiores à três meses de uso (OR: 1,92, IC95% 1,19 – 3,13) (GABRIEL, 1991). Este achado sugere que há uma relação inversa entre o tempo de uso dos AINEs e a ocorrência de sangramento, o que pode ser 25 justificado pela possível adaptação da mucosa gástrica como observado em usuários crônicos de AAS (GRAHAM et al., 1988). O risco de complicações gastrointestinais em usuários de AINEs também aumenta em indivíduos com história prévia de incidentes gastrointestinais (DUBOIS et al., 2004), além de outros fatores como idade superior a 60 anos, uso concomitante de com corticoides e AAS (LANAS et al., 2015). Outro aspecto importante que também pode influenciar no risco de HDA em usuários de AINEs é a presença de variantes genéticas que configuram um metabolismo lento desses medicamentos (FIGUEIRAS et al., 2016; PILOTTO et al., 2007). Primeiramente, o metabolismo da maioria dos AINEs é realizado pelo sistema de enzimas microssomais citocromo P450 (CYP), sendo a CYP2C9 a isoenzima mais importante no processo de metabolismo, seguida de CYP3A4, CYP2C19 e CYP2C8 (WYATT; PETTIT; HARIRFOROOSH, 2012). Notavelmente, as variantes CYP2C9*2 e CYP2C9 *3 podem afetar diretamente a efetividade dos AINEs (WYATT; PETTIT; HARIRFOROOSH, 2012), além de estarem associadas à desfechos negativos de segurança (e.g., HDA) (BLANCO et al., 2008; FIGUEIRAS et al., 2016). A influência dessas variantes no risco de HDA é abordado detalhadamente na próxima seção. Outros medicamentos Os anticoagulantes orais e outros antiagregantes plaquetários também têm sido associados ao risco de HDA (LANAS-GIMENO; LANAS, 2017; PANNACH et al., 2017), principalmente em idosos (ABRAHAM et al., 2015) e em indivíduos em uso concomitante dessas classes e AAS e/ou AINEs (ABRAHAM, 2016). Uma metanálise que incluiu 151.578 participantes identificou que o uso dos anticoagulantes orais de nova geração (e.g., rivaroxaban) foi associado à uma razão de chances de HDA de 1,45 (IC95% 1,07 – 9,07) e esse risco é mais elevado em indivíduos com trombose (OR: 1,59, IC95% 1,03 – 2,44) e síndrome coronariana aguda (OR: 5,21, IC95% 2,58 – 10,53) (HOLSTER et al., 2013). O uso dos anticoagulantes de nova geração parece possuir maior probabilidade de estar associado ao risco de hemorragia digestiva baixa (LANAS-GIMENO; LANAS, 2017) e o uso de anticoagulantes antagonistas de vitamina K e antiagregantes ao risco de HDA (PANNACH et al., 2017). Uma explicação para esse dado seria o fato dos anticoagulantes de nova geração serem dependentes da absorção e excreção mediada pela Pgp e, por consequência, estarem em uma maior concentração no intestino, contrastando com a via de absorção e excreção dos antagonistas de vitamina K e antiagregantes (KIRCHHOF et al., 2016). Outro aspecto que poderia explicar esse risco seria a diferença de meia vida entre essas classes farmacológicas, sendo 9 – 17 horas (anticoagulantes de nova 26 geração) versus uma semana (alguns antagonistas de vitamina K e antiagregantes) (PANNACH et al., 2017). No entanto, em um estudo coorte realizado nos Estados Unidos o risco de HDA foi reportado como similar tanto em usuários dos anticoagulantes de nova geração quanto os de varfarina, um anticoagulante antagonista de vitamina K de estreita faixa terapêutica (ABRAHAM et al., 2015). Nesse contexto, o monitoramento da terapia anticoagulante e antiplaquetária, o emprego de scores preditivos de risco de HDA considerando uma avaliação integral do paciente, assim como discussões rotineiras com o cardiologista e educação ao paciente são essenciais (ABRAHAM et al., 2015). Em relação a outros medicamentos, a influência do uso de antidepressivos e anti-hipertensivos no risco de HDA também tem sido avaliada. No entanto, os dados na literatura são controversos, pois ao passo que alguns estudos identificaram risco de HDA, em outros a associação não foi significativa, tanto em usuários de antidepressivos (CARVAJAL et al., 2011; DE ABAJO et al., 2006) quanto para os de anti-hipertensivos (NAGATA et al., 2015; SUISSA et al., 1998). Na população do presente estudo foi testada a associação do uso de antidepressivos e de anti- hipertensivos e o risco de HDA e o risco foi identificado em usuários antidepressivos concomitante ao uso de AAS e em usuários de anti-hipertensivos das classes dos bloqueadores dos canais de cálcio e bloqueadores alfa e beta adrenérgicos (dados ainda não publicados). 2.2) Susceptibilidade genética e o risco de hemorragia digestiva alta secundária à doença péptica complicada A presença de variantes genéticas pode estar associada ao risco de HDA e estudos têm reportado respostas idiossincráticas ao uso de alguns medicamentos, principalmente AAS na prevenção de doenças cardiovasculares (GROZA et al., 2017; MALLAH et al., 2020; NEGOVAN et al., 2015; WANG, 2019) e AINEs (FIGUEIRAS et al., 2016; PILOTTO et al., 2007). Adiante são abordados os genes selecionados no presente estudo, assim como as variantes genéticas avaliadas. Gene PTGS1 Prostaglandina-endoperóxido sintase 1 (PTGS1) é um gene de aproximadamente 22kb, composto por 11 exons codificadores e localizado no cromossomo 9 (localização 9q32-q33.3) (CHANDRASEKHARAN; SIMMONS, 2004), enquanto a prostaglandina-endoperóxido sintase 2 (PTGS2) é um gene localizado no cromossomo 1. Estes genes são responsáveis pela codificação das ciclooxigenases 1 e 2, respectivamente, também designadas como isoenzimas COX-1 e COX-2. 27 A COX-1 e COX-2 possuem um peso molecular de 71kDa e são estruturalmente semelhantes, compartilhando cerca de 63% da sequência de aminoácidos, assim como regiões funcionais (SIMMONS; BOTTING; HLA, 2004). Essas isoenzimas estão envolvidas em diversos processos fisiológicos e patológicos na agregação plaquetária e trato gastrointestinal (BRZOZOWSKI et al., 2005; PALMA-BARQUEROS et al., 2020). A COX-1 é considerada uma enzima constitutiva expressa na maioria dos tecidos, principalmente no endotélio, plaquetas e monócitos (AGÚNDEZ et al., 2015) e desempenha um papel importante na biologia plaquetária e hemostasia (PALMA-BARQUEROS et al., 2020), enquanto a COX-2 é uma enzima induzida e pró-inflamatória cuja superexpressão está associada ao risco de câncer (VOGEL et al., 2014). A COX-1 media a conversão do ácido araquidônico livre em prostanóides (tromboxano A2, prostaglandina e prostaciclina) que são cruciais em processos fisiológicos como agregação plaquetária, citoproteção gástrica, função renal e reatividade vascular (VANE; BAKHLE; BOTTING, 1998). Ressalta-se que o tromboxano A2 é um agonista da agregação plaquetária e que a prostaglandina está envolvida na manutenção da integridade gástrica (e.g., produção de muco produtor e redução da produção de ácido clorídrico) e do fluxo sanguíneo (BRZOZOWSKI et al., 2005). A relevância clínica da COX-1 e COX-2 está associada principalmente ao uso de medicamentos inibidores dessas enzimas e as reações adversas a medicamento associadas (AGÚNDEZ et al., 2015). A maioria das reações adversas a medicamento observadas durante o uso dos inibidores da COX está relacionada com reações a nível gastrointestinal devido a inibição da COX-1 (RAO; KNAUS, 2008) e apesar do constante desenvolvimento de medicamentos que são inibidores específicos da COX-2, o uso de inibidores não específicos é frequente. Dentre os fatores capazes de modificar a atividade da COX-1, destacam-se as variações genéticas que podem modificar a expressão basal, a estrutura, função ou ainda levar a indução dessa enzima (AGÚNDEZ et al., 2015). Nesse contexto, têm sido descritas variantes genéticas que induzem alterações em sítios de transcrição do gene PTGS1. A presença de variantes genéticas no gene PTGS1 tem sido comum em diferentes populações. No entanto, a presença dessas variantes é de duas a três vezes mais frequente na população europeia e americana miscigenada, respectivamente, quando comparada à população asiática. Ademais, a frequência dessas variantes na população de origem africana é cerca de dez vezes maior do que a identificada na população asiática (AGÚNDEZ et al., 2015). Em 2003 foram identificados pelo menos vinte polimorfismos de nucleotídeo único (single nucleotide polymorphism) no gene PTGS1 (HALUSHKA; WALKER; HALUSHKA, 2003). Dois deles, que se encontram em desequilíbrio de ligação completo em indivíduos saudáveis dos Estados Unidos (rs10306114 e rs3842787), parecem aumentar a sensibilidade ao AAS, uma vez que essas variantes dão lugar à uma COX-1 com menor capacidade de síntese de prostaglandina (HALUSHKA; WALKER; HALUSHKA, 2003). 28 As variantes rs10306114 e rs1330344 têm sido relacionados com resistência à terapia antiplaquetária (LI et al., 2013; ULEHLOVA et al., 2014) e a rs5788 a diminuição da agregação plaquetária (MAREE et al., 2005). A variabilidade na inibição da COX também é uma explicação plausível para a ocorrência de reações adversas a medicamento (DOÑA et al., 2011; TORRES et al., 2014). Gene NOS3 O óxido nítrico (NO) media inúmeros processos fisiológicos no trato gastrointestinal, incluindo manutenção do tônus muscular e da integridade e modulação do fluxo sanguíneo da mucosa gástrica (LANAS, 2008), além de estimular a secreção de muco e inibir a aderência do leucócito e plaquetas às paredes do endotélio na microcirculação gastrointestinal (PIQUE; WHITTLE; ESPLUGUES, 1989). O NO também tem potencial de inibição da agregação plaquetária ao ponto de desagregar plaquetas previamente agregadas (RADOMSKI; PALMER; MONCADA, 1987), logo, a inibição de sua síntese pode levar ao aumento da agregação. Portanto, no trato digestivo o NO atua na homeostase do trato gastrointestinal e no reparo de possíveis danos; e quando essa homeostase é interrompida, podem ocorrer condições patológicas (LANAS, 2008). O NO é sintetizado a partir da conversão da L-arginina em L-citrulina e NO (VANHOUTTE et al., 2017), conversão a qual é catalisada por meio de uma das três isoformas da oxido nítrico sintase (NOS). A nível gastrointestinal há duas isoformas constitutivas expressas no endotélio vascular e no sistema nervoso entérico do trato gastrointestinal, sendo a NOS endotelial (eNOS) e a neuronal (nNOS). Há também a isoforma induzida da NOS (iNOS) que é expressa em macrófagos e neutrófilos e possui um potente sinal indutor (CHO, 2001). Sabe-se também que as prostaglandinas derivadas tanto do NO quanto da COX compartilham similaridade em várias funções no trato gastrointestinal, pois mediam mecanismos de defesa da mucosa gástrica em um nível de cooperação e a supressão de uma delas pode levar a uma elevação compensatória da outra (WALLACE; MILLER, 2000). Observou-se que a concentração de NO plasmático está associada a variações no gene NOS3. Foi descrita uma repetição em série de número variável caracterizada por 27 pares de base no íntron 4 da isoforma eNOS, também conhecida como 4b/4a VNTR, tendo como alelos mais comuns aqueles com cinco (variante 4b) ou quatro cópias (variante 4a) do fragmento de 27 pares de base (COOKE; DOSHI; BINKLEY, 2007). Essa VNTR regula o gene em um nível pós-transcricional por meio da formação de um pequeno RNA de interferência (sirRNA) (ZHANG et al., 2008). Quantidades maiores de sirRNA foram encontradas em células endoteliais com a variante 4b resultando em uma menor quantidade de RNA mensageiro da NOS3 quando comparado com as células com a variante 4a (ZHANG et al., 2008), o que pode ser justificado pelo fato do sirRNA inibir a expressão gênica (ZHANG et al., 2005). 29 O número dessas repetições está associado à alterações superiores à 25% na concentração basal de NO (WANG et al., 1997) e as implicações clínicas têm sido amplamente estudadas, especialmente no risco de doenças cardiovasculares (OLIVEIRA-PAULA; LACCHINI; TANUS-SANTOS, 2016). Foram identificados apenas dois estudos que avaliaram a repetição em tandem de número variável no íntron 4 da eNOS e o risco de HDA, sendo ambos caso-controle e conduzidos na população espanhola. Serrano et al. (2002) incluíram 188 pacientes com diagnóstico de úlcera péptica (subgrupo de 86 pacientes com HDA) e 120 controles, restringindo a inclusão apenas para participantes caucasianos (SERRANO et al., 2002); enquanto que Piazuello et al. (2008) incluíram 88 pacientes diagnosticados com HDA e 108 controles hospitalares e 158 doadores de sangue, incluindo apenas usuários de AAS (PIAZUELO et al., 2008). Em ambos os estudos os carreadores do alelo “a”, considerado raro, foi associado à uma redução do risco de HDA. Além da repetição em série de número variável 4b/4a no íntron 4 da eNOS, também foram descritas duas variantes funcionais que também podem influenciar na atividade da NOS3 e consequentemente na concentração de NO e agregação plaquetária: rs1799983 e rs2070744 (OLIVEIRA-PAULA; LACCHINI; TANUS-SANTOS, 2016). A variante rs1799983 está localizado no éxon 7 e se caracteriza pela mudança de uma guanina para timina na posição -894, resultando na substituição de uma glutamina por aspartato na posição - 298 (MARSDEN et al., 1993). Essa variante, também conhecida como Glu298Asp, está envolvida na regulação da atividade do gene NOS3. A presença do alelo aspastato resulta em uma redução da ligação da NOS3 à caveolina-1, o que levará a redução da disponibilidade de NOS3 na fração caveolar nas células endoteliais. Tendo uma quantidade reduzida de NOS3 disponível para ativação mediada pelo complexo cálcio-calmodulina, por meio da dissociação da ligação da NOS3 e caveolina-1, haverá uma menor atividade da NOS3 e consequentemente menor produção de NO (JOSHI et al., 2007). A variante rs2070744 está localizado em uma região promotora e é caracterizado pela substituição de uma timina por citosina na posição -786, o que pode afetar a NOS3 em um nível transcricional. A proteína de replicação A1 (RPA1), que atua como um repressor gênico, passará a se ligar com uma maior afinidade nessa região devido a presença da citosina, o que irá resultar em uma redução da atividade transcricional da NOS3 (NAKAYAMA et al., 1999; WANG; DUDLEY; WANG, 2002) e, consequentemente, em uma menor expressão do gene (MIYAMOTO, 2000). Nesse contexto, foi observada uma menor biodisponibilidade de NO em indivíduos carreadores do alelo variante C (presença de citosina) quando comparado ao alelo T (presença de timina) (NAGASSAKI et al., 2006). É de nosso conhecimento apenas um estudo que avaliou o rs1799983 no escopo da HDA secundária à doença péptica complicada (FORGERINI et al., 2021a). Trata-se de um estudo caso- controle espanhol no qual foi identificado risco de HDA em usuários de AAS na presença dos genótipos heterozigoto e homozigoto (GT + TT) (OR: 7.690, CI: 2.4 – 23.7) (MALLAH et al., 2020). A análise do polimorfismo rs2070744 proposta no presente estudo é, portanto, uma análise inédita. 30 Gene CYP2C9 O citocromo P450 (CYP) compreende um grupo de hemoproteínas responsáveis pelo metabolismo de fase I de substratos endógenos e exógenos (RENDIC; CARLO, 1997). A CYP tem sido alvo de inúmeros estudos farmacogenéticos pois é responsável pelo metabolismo de cerca de 60% dos medicamentos (ZHOU et al., 2008) e a presença de variantes genéticas está associada à alterações clinicamente relevantes na depuração, resposta terapêutica ou idiossincrática de medicamentos (HIROTA; EGUCHI; IEIRI, 2013). A subfamília CYP2C, em especial a isoenzima CYP2C9 localizada no cromossomo 10 (q24.2) é responsável pelo metabolismo oxidativo de uma gama de medicamentos, incluindo aqueles com estreita faixa terapêutica, como varfarina (RETTIE et al., 1992) e fenitoína (BAJPAI et al., 1996), além de outros medicamentos amplamente prescritos como losartana, fluoxetina, tamoxifeno e pelo menos 16 AINEs (e.g., diclofenaco, ibuprofeno e meloxicam) (HIROTA; EGUCHI; IEIRI, 2013; RENDIC, 2002). Em 2002 foram identificados 42 alelos da CYP2C9, sendo que o alelo *1 é considerado o selvagem e, dentre os alelos, os mais estudados são os *2 e *3, os quais configuram seis genótipos: *1/*1 (selvagem), *1/*2, *1/*3, *2/*2, *3/*3 e *2/*3 (LEE; GOLDSTEIN; PIEPER, 2002). O alelo variante CYP2C9*2, também conhecido como Arg144Cis, é localizado no éxon 3, e se dá por meio da substituição de uma citosina por timina na posição -430, o que irá acarretar na codificação de uma substituição de arginina por cisteína na posição -144. Já o alelo variante CYP2C9*3, também conhecido como Ile359Leu, é localizado no éxon 7 e ocorre por meio da transversão de uma adenina por citosina na posição -1075, o que irá acarretar na codificação de uma leucina no resíduo do aminoácido -359 (BHASKER et al., 1997). Tem sido reportada uma redução de 20 – 30% da atividade enzimática na presença da variante CYP2C9*2 e uma redução de até 70% na presença da variante CYP2C9*3 (ZHOU et al., 2008). Scott et al. (2007) propuseram a determinação do fenótipo considerando os metabolizadores como extensivos ou normais (extensive metabolizers - EM), intermediários (intermediate metabolizers - IM) e lentos (poor metabolizers - PM) como descrito no quadro 3 (SCOTT et al., 2007). Quadro 3. Determinação do fenótipo do gene CYP2C9 considerando a combinação de alelos e o fenótipo predito. Fenótipo predito Combinação de alelos Combinação de alelos Metabolizador extensivo (EM) EM + EM *1/*1 Metabolizador intermediário (IM) EM + IM *1/*2, *1/*3 Metabolizador lento (PM) IM + IM *2/*2, *3/*3, *2/*3 31 EM: Extensive metabolizers (metabolizadores extensivos ou normais); IM: Intermediate metabolizers (metabolizadores intermediários); PM: Poor metabolizers (metabolizadores lentos). Fonte: Adaptação de (SCOTT et al., 2007). O primeiro estudo a avaliar os genótipos e fenótipos do CYP2C9 na população brasileira foi conduzido por Viana-Jorge et al. (2004), no qual foi realizada a genotipagem de 331 participantes saudáveis (VIANNA-JORGE et al., 2004). As frequências identificadas dos alelos CYP2C9*1, CYP2C9*2 e CYP2C9*3 foram de 84,9%, 8,6% e 6,5%, respectivamente. Ademais, os participantes foram estratificados por meio da auto percepção de cor em branco, preto e pardo e foi observado uma frequência dos genótipos *1/*2 e *1/*3 três vezes menor em participantes pretos quando comparado aos brancos. Um segundo estudo, conduzido pelo mesmo grupo de pesquisa, realizou a genotipagem de 390 participantes em uso de anticoagulantes orais e foi observada uma frequência de 11,8% e 5,4% para CYP2C9*2 e CYP2C9*3 (PERINI et al., 2008). Foi observado que participantes brancos necessitavam de uma dose de varfarina menor em comparação aos pretos, o que pode ser justificado pela maior frequência dos alelos de metabolização lenta nos participantes brancos. Nestes dois estudos foram observadas diferenças nas frequências alélicas a depender da cor do participante, o que pode ser justificado pela alta miscigenação da população brasileira (SUAREZ- KURTZ et al., 2012) e a ancestralidade que irá influenciar diretamente na frequência das variantes genéticas (RAMOS et al., 2014; RODRIGUES-SOARES et al., 2018). Em outro estudo brasileiro, as frequências alélicas do CYP2C9*2 (9,1%) e CYP2C9*3 (4,3%) em usuários de varfarina foram semelhantes às identificadas por Viana-Jorge et al. (VIANNA-JORGE et al., 2004), e a presença dos alelos *2 e *3 também foi associada à necessidade de uma dose reduzida de varfarina (ALMEIDA et al., 2014). No escopo da HDA, o gene CYP2C9 é o mais avaliado e foram identificados seis estudos (sete publicações) na literatura que avaliaram os alelos CYP2C9*2 e CYP2C9*3 (FORGERINI et al., 2021a). Esses estudos foram conduzidos na Espanha (n = 02), Itália (n = 01), Reino Unido (n = 01), China (n = 01) e Turquia (n = 01) e foi identificado risco de HDA em usuários de AINEs e carreadores do alelo CYP2C9*2 (BLANCO et al., 2008; FIGUEIRAS et al., 2016; MARTÍNEZ et al., 2004; PILOTTO et al., 2007) e CYP2C9*3 (FIGUEIRAS et al., 2016). De fato, foi reportado que usuários de AINEs e carreadores dos alelos *2 e *3 possuem um maior risco de desenvolverem sangramentos gastrointestinais e outros eventos adversos a medicamento a nível gastrointestinal (MACÍAS et al., 2020). Apesar do estudo de Ucar et al. ter reportado risco de HDA em usuários de varfarina em carreadores dos alelos CYP2C9*2 e CYP2C9*3, os dados estatísticos não foram reportados (UCAR et al., 2013). Em relação aos aspectos metodológicos, também vale ressaltar que não está claro o processo 32 de recrutamento dos participantes, a identificação e ajuste de variáveis de confusão, assim como a mensuração do uso de varfarina nesse estudo. Portanto, não é de nosso conhecimento nenhum estudo que avaliou o risco de HDA associado a presença das variantes do gene CYP2C9 na população brasileira. Gene VKORC1 O VKORC1 é o principal gene envolvido na farmacodinâmica da varfarina, por ser o alvo molecular de inibição durante a terapia anticoagulante. Este gene codifica a subunidade-1 do complexo epóxido-redutase da vitamina K, um cofator essencial para a γ-carboxilação de proteínas dependentes de vitamina K, incluindo os fatores de coagulação II, VII, IX e X (FLOCKHART et al., 2008). Primeiramente ocorre a conversão da vitamina K-epóxido-redutase, formada durante a carboxilação de várias proteínas, em vitamina K-quinona. Essa conversão irá permitir que o ciclo da vitamina K funcione cataliticamente na geração de resíduos γ -glutamil carboxilase (OMIM 137167), que por sua vez, serão responsáveis pela modificação pós-tradução de resíduos de glutamil em proteínas, incluindo a formação de fatores de coagulação (FLOCKHART et al., 2008). Considerando que os anticoagulantes exercem um efeito antagonista sobre o gene VKORC1 por meio do antagonismo à vitamina K e pela inibição da formação das redutases, especialmente vitamina K-epóxido (OLDENBURG et al., 2007). Logo, se há uma inibição da K-epóxido, haverá uma menor γ-carboxilação de proteínas e consequentemente uma redução da produção de fatores de coagulação dependentes de vitamina K, resultando no aumento do tempo de sangramento e em um INR mais elevado (international normalized ratio) (FLOCKHART et al., 2008). Os fatores pró-coagulantes afetados pela inibição da γ-carboxilação pela varfarina são os fatores II, VII, IX e X e os fatores coagulantes afetados são as proteínas S e C (FLOCKHART et al., 2008). Nesse contexto, a presença de variantes genéticas localizadas no VKORC1 irá afetar diretamente na farmacodinâmica da varfarina e de outros anticoagulantes, podendo resultar tanto na resistência quanto na sensibilidade a esses medicamentos (WADELIUS et al., 2005). Na chamada sensibilidade à varfarina, a dose requerida deste medicamento tende a ser menor e o risco de anticoagulação excessiva tende a ser maior. Uma das variantes mais estudadas no gene VKORC1 ocorre em uma região promotora na posição -1639 (rs9923231, G > A). Os indivíduos carreadores do genótipo GG (selvagem) possuem baixa sensibilidade à varfarina requerendo uma dose aumentada em até 35%; enquanto indivíduos carreadores do genótipo AA (homozigoto) possuem alta sensibilidade à varfarina e requerem uma dose até 32% menor de varfarina (FLOCKHART et al., 2008). Suarez-Kurtz et al. (2010) realizaram a genotipagem desse polimorfismo em 1037 brasileiros saudáveis de quatro regiões geográficas diferentes, estratificados em branco, pardo e preto, de acordo com o auto relato do participante e considerando os marcadores de ancestralidade, e foi observada alta 33 variabilidade interindividual devido a heterogeneidade da população brasileira. A frequência do genótipo AA (homozigoto), alelo que confere sensibilidade à varfarina, variou continuamente conforme aumentou a ancestralidade europeia dos participantes, independentemente da cor auto relatada ou da região geográfica. Logo, foi identificado que participantes de ancestralidade europeia apresentaram uma frequência maior do alelo variante (SUAREZ-KURTZ et al., 2010). Essa variante, em conjunto com outras variantes localizadas no VKORC1 e de metabolização lenta localizadas no CYP2C9 (alelos *2 e *3) tem sido amplamente estudadas na variabilidade da dose de manutenção da varfarina (RODRIGUES‐SOARES; SUAREZ‐KURTZ, 2019; SCOTT et al., 2010), especialmente para a redução de sangramentos graves e para proporcionar uma qualidade de vida melhor ao paciente (PANCHENKO et al., 2020). Essas variantes parecem atuar de maneira independente e aditiva, e a presença de variantes em ambos os genes tem um impacto maior na dose de varfarina, mas não há uma relação sinérgica (MONTES et al., 2008). Praxedes et al. (2020) validaram um algoritmo na população brasileira para predizer o tempo de intervalo terapêutico da varfarina considerando a influência das variantes CYP2C9*2 e CYP2C9*3 e VKORC1, além de outros fatores não genéticos (e.g., gênero, assistência para administração da varfarina e número de medicamentos crônicos em uso), o que permite estratificar os pacientes com risco elevado de sangramento e a qualidade do controle da terapia anticoagulante (PRAXEDES et al., 2020). Portanto, variantes localizadas no VKORC1 têm sido avaliadas no escopo da terapia anticoagulante (AL-MAHAYRI et al., 2019; SOLTANI BANAVANDI; SATARZADEH, 2020) e no contexto da HDA, é de nosso conhecimento apenas dois estudos que avaliaram a influência da variante rs9923231 no risco de hemorragia digestiva (GROZA et al., 2017; MONTES et al., 2008). Montes et al. (2008) avaliaram o risco de hemorragia digestiva em 267 participantes em uso de acenocumarol (89 casos e 178 controles). O risco de hemorragia digestiva só foi identificado nos participantes carreadores do alelo variante da rs9923231 e em uso concomitante com AAS (OR: 8,97; IC: 1,66 – 48,34). No entanto, vale ressaltar o baixo número amostral do grupo de usuários de acenocumarol + AAS (seis casos e dois controles), além dos critérios de inclusão e exclusão não serem claros e a hemorragia digestiva de etiologia baixa ter sido incluída (MONTES et al., 2008). Groza et al. (2017) avaliaram 341 participantes romenos (163 casos e 178 controles), sendo que os pacientes em terapia com antagonistas da vitamina K foram excluídos. Este foi o primeiro estudo a avaliar a influência do polimorfismo rs9923231 no risco HDA secundária a doença péptica complicada; e o risco foi identificado em carreadores do genótipo AA (OR: 1,36, IC: 0,99 – 1,86) e em usuários de AAS e AINEs carreadores do genótipo AA (OR: 7,64; IC: 3,12 – 18,74), sendo “A” o alelo variante. No entanto, não está claro como os autores definiram e mensuração o uso de AAS e AINEs entre os participantes (GROZA et al., 2017). Portanto, considerando o possível risco de HDA identificado por Groza et al. (2017), principalmente em usuários de AAS e AINEs, o presente estudo pretendeu testar a hipótese de que a 34 presença da variante rs9923231 está associada a ocorrência de HDA, independente da terapia anticoagulante. Gene ABCB1 O gene ABCB1, também conhecido como MDR1 (gene humano de resistência a múltiplas drogas), se localiza no cromossomo 7 (q21.1) (CALLEN et al., 1987) e é constituído por uma região promotora e 29 éxons (CHEN et al., 1990). Em 2010, foram reportadas cerca de 50 variantes localizadas neste gene, sendo este, considerado altamente polimórfico (SCHEINER; DAMASCENO; MAIA, 2010). A glicoproteína P (Pgp), uma proteína de membrana integral de 170 k-Da que pertence a superfamília de transportadores (ABCB1 – ATP binding cassete) que atua como uma barreira de proteção e bomba de efluxo para uma grande variabilidade de compostos naturais e xenobióticos lipofílicos (WOODAHL; HO, 2004), e é expressa no gene ABCB1. A Pgp é codificada nas células epiteliais intestinais e é responsável pelo efluxo de vários medicamentos para o intestino e desempenha um papel crítico nos processos de absorção, distribuição, metabolismo e excreção de medicamentos (MEGA et al., 2010). Logo, a presença de variantes localizadas no ABCB1 pode afetar diretamente a farmacocinética e farmacodinâmica de inúmeros substratos da Pgp e, consequentemente, a biodisponibilidade desses substratos (SCHEINER; DAMASCENO; MAIA, 2010). A variante rs1045642, também conhecida como C3435T, é uma das mais frequentemente reportados na literatura. Apesar de ser uma variante considerada “silenciosa”, tem sido associada a alterações no efluxo de medicamentos assim como a baixa expressão da Pgp. Essa variante foi associada à alterações na eficácia e segurança das estatinas (GUAN et al., 2019) e a necessidade de ajustes de doses em tratamento com antidepressivos e antipsicóticos (SAIZ-RODRÍGUEZ et al., 2018), antivirais (COELHO et al., 2013), quimioterápicos (LEPPER et al., 2005) e clopidogrel (MEGA et al., 2010). Mega et al. (2010) identificaram um aumento no efluxo de clopidogrel para o intestino em carreadores da variante rs1045642, o que desencadeou à uma alta reatividade plaquetária e não resposta ao tratamento (MEGA et al., 2010). Também foi observada a necessidade de ajustes para doses menores de varfarina em brasileiros carreadores do alelo variante “T” possivelmente devido a uma alteração da conformação da Pgp, afetando o local de reconhecimento da varfarina e, portanto, levando à diminuição do efluxo desse anticoagulante (TAVARES et al., 2018). Rozhkov, Sychev & Kazakov (2015) apesar de não terem identificado necessidade de alterações nos regimes de dose do acenocumarol, também reportaram risco de sangramento associado a presença do alelo variante “T” (ROZHKOV; SYCHEV; KAZAKOV, 2015). 35 Apesar de não ter sido identificado nenhum estudo que avaliou a influência das variantes no gene ABCB1 no risco de HDA (FORGERINI et al., 2021a), Kugai et al (2013) reportaram que o efluxo do AAS ocorre por meio da Pgp e que a presença de variantes impactará diretamente na permeabilidade desse medicamento nas células epiteliais intestinais, podendo estar relacionado a um alto risco de lesão intestinal induzida (KUGAI et al., 2013). Essa alteração de efluxo está associada ao aumento da biodisponibilidade do AAS e, consequentemente, no aumento da sua absorção (LI et al., 2017). Portanto, não há demonstrações que os alelos no gene ABCB1 estão correlacionados com o risco de HDA, e nesse contexto, foi testada a hipótese de que se a possível alteração da biodisponibilidade do AAS na presença da variante rs1045642 está associada a esse risco. 36 3) OBJETIVOS Objetivo principal Investigar a influência de variantes genéticas localizados nos genes PTGS1 (rs1330344, rs10306114, rs3842787, rs5788), NOS3 (rs2070744, rs1799983, VNTR íntron 4), CYP2C9 (rs1057910 e rs1799853), VKORC1 (rs9923231) e ABCB1 (rs1045642) com o diagnóstico de HDA secundária à doença péptica complicada. Objetivos específicos  Conduzir uma revisão sistemática a fim de identificar as variantes genéticas envolvidas no risco de HDA de etiologia não varicosa;  Estimar a incidência de admissões hospitalares em decorrência de HDA secundária à doença péptica complicada e o perfil epidemiológico desses pacientes;  Avaliar o risco de HDA secundária à doença péptica complicada em usuários de AAS e usuários de AINEs. Hipóteses do estudo H0. A presença das variantes genéticas nos genes PTGS1, NOS3, CYP2C9, ABCB1 e VKOCR1 não está associada ao diagnóstico de HDA secundária à doença péptica complicada independente do uso de medicamentos e em subgrupos de participantes em uso de AAS e AINEs. H1. A presença das variantes genéticas nos genes PTGS1, NOS3, CYP2C9, ABCB1 e VKOCR1 está associada ao diagnóstico de HDA secundária à doença péptica complicada independente do uso de medicamentos e em subgrupos de participantes em uso de AAS e AINEs. 37 4) METODOLOGIA E CASUÍSTICA 4.1) Estudo 1. Revisão sistemática Foi conduzida uma revisão sistemática a fim de identificar as variantes genéticas envolvidas no risco de HDA de etiologia não varicosa por meio de duas questões norteadoras: "Quais são as variantes genéticas associadas ao diagnóstico de HDA de etiologia não varicosa? ” e “Quais são as variantes genéticas e farmacoterapia associada ao diagnóstico de HDA de eiologia não varicosa como uma possível reação adversa a medicamento?” O protocolo metodológico foi delineado e publicado na Journal of Basic and Applied Pharmaceutical Sciences (Qualis B2) (FORGERINI; LUCCHETTA; MASTROIANNI, 2019) (https://rcfba.fcfar.unesp.br/index.php/ojs/article/view/626) e a revisão foi registrada no International Prospective Register of Systematic Reviews (PROSPERO) (CRD42020167658) (ANEXO 1). As buscas foram conduzidas por meio de estratégia pré-definida nas bases de dados PubMed, Scopus e Cochrane Central, considerando o seguinte acrônimo PECOS: Participants: estudos que incluíram participantes com HDA, independentemente dos critérios diagnósticos, gênero, idade ou etnia. Estudos que incluíram explicitamente participantes com HDA de etiologia varicosa serão excluídos; Exposure: estudos que avaliaram variantes genéticas associadas ao diagnóstico de HDA; Comparator: sem restrições; Outcome: HDA de etiologia não varicosa; Study design: estudos observacionais do tipo caso-caso, caso-controle e coorte. A análise de qualidade metodológica dos estudos foi conduzida utilizando o instrumento padronizado Joanna Briggs Institute for case-control studies. A elegibilidade (etapas de triagem e leitura na íntegra) e extração de dados foram conduzidas de maneira independente por dois pesquisadores, assim como a análise de qualidade dos estudos incluídos. 4.2) Estudo 2. Estudo observacional do tipo caso-controle 4.2.1. Aspectos éticos O projeto foi aprovado pelos Comitês de Ética em Pesquisa do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (CAAE 38 53753115.4.0000.5440; protocolo nº 1.536.886) – ANEXO 2 – e da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (CAAE 53753115.4.3001.5426; protocolo nº 1.657.615) – ANEXO 3. O estudo também foi registrado no Registro Brasileiro de Ensaios Clínicos (REBEC – número de registro: RBR-3hstqm; https://ensaiosclinicos.gov.br/rg/RBR-3hstqm). 4.2.2. Desenho Foi conduzido um estudo do tipo caso-controle, pareado por gênero, idade (±5 anos) e data de recrutamento (3 meses), tendo como desfecho de interesse a HDA secundária à doença péptica complicada. Considerando a HDA como uma possível reação adversa a medicamento é um evento de baixa incidência e que se objetivou conhecer os fatores de risco associados, esse é o desenho de estudo mais adequado (YANG et al., 2010). O reporte deste estudo é baseado no Strengthening the Reporting of Observational Studies in Epidemiology (STROBE) (VON ELM et al., 2008). Partindo dos princípios básicos de um estudo caso-controle, os casos e controles foram selecionados de uma mesma população, sendo os casos aqueles participantes com o desfecho (HDA secundária à doença péptica complicada) e os controles aqueles participantes sem o desfecho. A seleção dos participantes foi realizada independente de outras possíveis variáveis de confusão (e.g., uso de medicamentos, infecção por Helicobacter pylori, hábitos de vida) (SETIA, 2016). É relevante comentar que a seleção dos participantes independente do uso de medicamentos permite avaliar diretamente a influência das variantes genéticas no risco de HDA (ESTANY-GESTAL et al., 2011) e quando o recrutamento é limitado apenas para indivíduos em uso de medicamentos, a seleção dos participantes do grupo controle é ainda mais complexa, pois os participantes de ambos os grupos devem compartilhar o mesmo uso (ESTANY-GESTAL et al., 2011) Etapas do estudo caso-controle O estudo foi conduzido em quatro etapas: clínica, análises genéticas e laboratorial e epidemiológica. Na etapa clínica foram identificados os pacientes com diagnóstico de HDA secundária de doença péptica complicada e recrutados os participantes para os grupos caso e controle por meio de entrevistas e coleta de sangue total. Na etapa de análise genética o DNA genômico foi obtido por meio do sangue total coletado dos participantes para posterior análise das variantes genéticas propostas, e na laboratorial o plasma dos participantes foi utilizado para análise de anticorpos IgG para infecção por Helicobacter pylori. Na etapa epidemiológica, todos os dados obtidos por meio das entrevistas com os participantes caso e controle, assim como os resultados das análises genéticas e laboratorial, foram digitados e conferidos na base de dados Research Electronic Data Capture (RedCap). Posteriormente, os dados 39 foram extraídos e tabulados para as análises estatísticas a fim de avaliar quais eram as variáveis envolvidas no risco do diagnóstico de HDA, considerando, portanto, as variáveis clínicas, genéticas, laboratorial e epidemiológica (Figura 1). Todas as quatro etapas são descritas detalhadamente adiante. - Monitoramento diário dos laudos endoscópicos - Identificação de pacientes elegíveis para o grupo caso - Entrevista de pacientes para os grupos caso e controle - Genotipagem das variantes genéticas - Determinação de anticorpos IgG para Helicobacter pylori - Digitação e conferência dos dados na base de dados RedCap - Tabulação de dados - Análise estatística considerando dados clínicos, genéticos, laboratoriais e epidemiológicos Figura 1. Descrição das atividades conduzidas nas quatro etapas do estudo (clínica, genética, laboratorial e epidemiológica). 4.2.3. Local O estudo foi conduzido no complexo hospitalar Hospital das Clínicas de Ribeirão Preto (HC- RP) da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo que compreende quatro hospitais: o Hospital das Clínicas de Ribeirão Preto, hospital de nível terciário com mais de 700 leitos; a Unidade de Emergência de Ribeirão Preto, hospital de urgência com 300 leitos; o Hospital Estadual de Ribeirão Preto, hospital de nível secundário com 60 leitos; e Hospital Estadual de Américo Brasiliense (Heab), hospital de 110 leitos de nível secundário. Esse conjunto hospitalar atende a população da região sanitária do noroeste paulista (Departamentos Regionais de Saúde - DRS-III e DRS-XIII), abrangendo 49 munícipios e cerca de 2.461.143 habitantes – DRS-III: 24 municípios e 989.971 habitantes e DRS-XIII: 25 municípios e 1.471.172 habitantes. 4.2.4. Participantes Critérios de elegibilidade Todos os participantes dos grupos caso e controle foram recrutados no complexo hospitalar HC- RP, considerando o importante princípio de um estudo caso-controle de que todos participantes do Clínica Epidemiológica Genética Laboratorial 40 grupo controle devem ser comparáveis e devem ser recrutados de uma mesma “base de estudo” que os participantes caso (SETIA, 2016; WACHOLDER et al., 1992). Grupo caso Para a identificação dos pacientes com o desfecho de interesse (HDA secundária a doença péptica complicada), foi realizado o rastreio e monitoramento diário dos laudos das endoscopias digestivas altas (EDA) realizadas no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (HC-FMRP-USP). O rastreio foi conduzido por meio da avaliação dos laudos das EDA e em duplicata com o médico Gustavo Urbano (G.U), membro do corpo clínico do HC-RP e da equipe do projeto. Definiu-se que como achados endoscópicos de interesse úlcera gástrica ou duodenal; erosões, lesões agudas da mucosa gástrica ou duodenal; e gastrite ou duodenite erosiva (com ou sem sangramento ativo ou recente) e durante o processo de rastreio, as histórias clínicas de potenciais casos foram discutidas para avaliar se o paciente se enquadrava nos critérios de inclusão. Todas as EDA rastreadas foram tabuladas com os dados de registro hospitalar do paciente, nome, idade, achados endoscópicos e quando aplicável as justificativas de exclusões primárias, secundárias ou perdas. Após identificar um paciente que atendesse aos critérios do grupo caso, o paciente foi convidado para participar da entrevista e a partir do aceite, para cada caso coletado foram coletados participantes controle, pareados por gênero, idade (±5 anos) e tempo de admissão hospitalar (período máximo de até três meses posteriores a data da EDA do participante caso). Foram considerados casos todos os pacientes maiores de 18 anos que apresentaram doença péptica complicada, caracterizada por hemorragia digestiva alta (HDA) ou úlceras perfuradas, e que atendam aos seguintes critérios: (i) admissão nos hospitais de estudo com queixa de HDA, caracterizada pela presença de hematêmese, vômitos escuros ou em borra de café, melena e/ou hematoquezia e tenham sido submetidos a endoscopia digestiva alta (EDA); (ii) pacientes que não apresentavam sintomas de HDA, mas que tenham sido submetidos à EDA por motivos diversos e durante a mesma observam-se sinais de sangramento recente (sangramento ativo, coágulo aderido, vaso visível); (iii) pacientes que foram admitidos com sintomas de abdome agudo perfurativo, confirmado por exames de imagem (raio-X ou tomografia computadorizada) e que tenham sido submetidos a procedimento cirúrgico, no qual confirmou-se tratar de perfuração de úlcera péptica (gástrica ou duodenal). Como critérios de exclusão primária para os casos: (i) pacientes que foram admitidos nos hospitais de estudo com queixa de HDA por outros diagnósticos endoscópicos, como varizes esofágicas, neoplasia gástrica, e síndrome de Mallory-Weiss; (ii) pacientes com HDA intra-hospitalar e (iii) admissão não associada à HDA. 41 Como critérios de exclusão secundária, incluem-se: (i) casos cuja endoscopia não tenha sido realizada até 48 horas após o ingresso no hospital, ou, no caso de pacientes ambulatoriais, aqueles cuja endoscopia tenha sido marcada há mais que 7 dias; (ii) pacientes que não foram entrevistados até 15 dias após o ingresso no hospital; (iii) pacientes em estado grave e (iv) óbito. O fluxograma de rastreio e monitoramento das EDA é descrito no APÊNDICE A. Grupo controle Os participantes do grupo controle foram recrutados da unidade pré-operatória, entre pacientes que foram submetidos às cirurgias leves e programadas de processo clínico, como cirurgias plásticas; de facectomias, correção de hérnias inguinais/umbilicais, adenomas da próstata, entre outros. Critérios de exclusão primária para casos e controles Menores de 18 anos; histórico de neoplasia e coagulopatias; pacientes HIV positivos; narcóticos; portadores de sonda nasogástrica ou percutânea; pacientes que foram ao hospital por qualquer motivo 15 dias antes da admissão atual (casos) ou da entrevista (controles); e não residentes na região por pelo menos três meses foram excluídos. 4.2.5. Período e coleta de dados O recrutamento dos participantes do grupo caso e controle foram conduzidos por quatro pesquisadores (M.F, P.C.M, T.R.N, G.U) após treinamento prévio e mediante Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (ANEXOS 4 e 5). A coleta de dados teve início em julho de 2016 e finalizou em março de 2020. A coleta de dados foi conduzida por meio de entrevistas com os pacientes e/ou familiares, com duração aproximada de 40 minutos/entrevista, mediante um questionário previamente validado (FIGUEIRAS et al., 2016) e traduzido e adaptado para ser aplicado no Brasil. O questionário está disponível na íntegra no depositório público OSF (FORGERINI et al., 2021b). Os dados obtidos durante a entrevista foram confirmados em fontes secundárias, como prontuário médico eletrônico do HC-RP (ATHOS) que possui a anamnese da equipe multiprofissional detalhada desde a inserção do paciente no serviço de saúde, além de prescrições médicas e exames laboratoriais. As entrevistas foram avaliadas pelos entrevistadores mediante uma escala de 0 a 10, considerando a consistência das informações recordadas. Foi considerada baixa consistência da entrevista notas inferiores a seis pontos, valor de referência adotado seguindo o estudo de Figueiras et al (FIGUEIRAS et al., 2016). Coleta de amostra biológica 42 Após a entrevista feita a coleta de cerca de 5,0 mL de sangue total dos participantes dos grupos caso e controle para posterior análise das variantes genéticas propostas e pesquisa de anticorpos para infecção por Helicobacter pylori. 4.2.6. Variáveis Dependente: diagnóstico de hemorragia digestiva alta secundária a doença péptica complicada mediante endoscopia digestiva alta ou intervenção cirúrgica; Independentes: presença das variantes genéticas nos genes PTGS1, CYP2C9, NOS3, VKORC1 e/ou ABCB1, etnia, escolaridade, índice de massa corpórea, histórico familiar de úlcera, histórico pessoal de doenças gastrointestinais (úlcera, hemorragia, dispepsia), comorbidades, sorologia Helicobacter pylori, farmacoterapia em uso (AAS, AINEs, inibidores da bomba de prótons, antagonistas dos receptores de H2, anticoagulantes e antidepressivos), hábitos de vida (tabagismo, consumo de álcool e café) e consistência da entrevista. 4.2.7. Fonte de dados e mensuração As variáveis e as respectivas fontes de dados e mensuração são descritas detalhadamente no Quadro 4. Quadro 4. Variáveis e fontes de dados e mensuração. Variável (classificação) Fonte mensuração Fonte de dados