Vinícius Pereira Arantes 1 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS CAMPUS DE ARARAQUARA – SÃO PAULO ESTUDO DA ATIVIDADE ANTIMICOBACTERIANA DE EXTRATOS VEGETAIS DO CERRADO BRASILEIRO Vinícius Pereira Arantes Farmacêutico-Bioquímico ARARAQUARA 2005 Vinícius Pereira Arantes 2 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS CAMPUS DE ARARAQUARA – SÃO PAULO ESTUDO DA ATIVIDADE ANTIMICOBACTERIANA DE EXTRATOS VEGETAIS DO CERRADO BRASILEIRO Mestrando: Vinícius Pereira Arantes Orientadora: Prof. Drª Clarice Queico Fujimura Leite ARARAQUARA 2005 Forma apresentada ao programa de pós-graduação em Análises Clínicas da Universidade Estadual Paulista “Julio de Mesquita Filho”- Unesp- Araraquara- São Paulo, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Análises Clínicas. Vinícius Pereira Arantes 3 DEDICO, Ao ser todo poderoso que em algum momento de sua magnitude desejou proporcionar estes momentos de felicidade, amor e ciência a minha pequena sabedoria e ao meu ínfimo conhecimento. DEUS, simplesmente o mentor de tudo que aqui se encontra... Aos meus grandiosos pais Agripino de Oliveira Arantes e Erude Pereira Arantes. Por aceitarem a distância durante estes longos três anos que tenho dedicado à ciência, pesquisa e docência. Além disto, obrigado por concederem através do amor a minha existência. Aos meus queridos avós João Pereira Filho (in memorian) e Clotilde Ferreira da Silva Pereira. Muito obrigado por terem motivado sempre a esta e diversas outras conquistas. Palavras e gestos que a minha memória, tenho certeza guardarão por toda a eternidade, muito obrigado! Minha grande Irmã Ana Célia Arantes dos Santos, ao meu cunhado e amigo José Maria dos Santos e a pequena Maria Fernanda dos Santos, que veio com o intuito de trazer alegria e vida a nossa família. E também a você pequenino João Agripino que hora maravilhosa. Vocês também auxiliaram neste trabalho! A minha namorada Patrícia Dolfini, a Ivone Tomeleri Dolfini e Ricardo Dolfini. Obrigado pela atenção e respeito! Aos professores que auxiliaram durante o início, os primeiros passos, gestos e paciência. A vocês amigos professores é que tenho o prazer de dividir a minha vitória com vocês: Geraldo Emilio Vicentini, Marcelo Antonio Dubuc, Ricardo de Melo Germano, Carlos Augusto Pereira, Paulo Pereira, Mariza Barion Romagnolo, Danil Agar Rocha Rúbio, Fátima Machado, Érica Valentini Pepliascov Pereira, Aldolino Zermiani, Evaldo Bertoldi, Roberto José Linarth (in memorian), Emerson Luis Botelho Lourenço, Irinéia Paulina Baretta, Antonio Marcus Paes, Samira, Marcela, Nelton, Francisco, Elizabethe, Marlene, Marcos, Gislaine, Sandra. Tantos foram aqueles que neste trabalho seria impossível agradecer a todos, a vocês infinitamente obrigado! Aos funcionários da Universidade Paranaense – Unipar. Aos funcionários da Universidade Estadual Paulista “Julio de Mesquita Filho”- Unesp Araraquara- São Paulo. Em especial ao setor de pós-graduação e companheiros do laboratório: Carol Malaspina, Karina, Ivone, Célio e Will. Que a ciência possa gerar cada vez mais dúvidas e incertezas, para que a cada trabalho, tenhamos novas perguntas e que a cada pergunta possamos ter nova resposta. E que assim a ciência possa prosperar entre perguntas e respostas. Muito obrigado!!! Vinícius Pereira Arantes 4 AGRADECIMENTOS A professora Drª Clarice Queico Fujimura Leite. Pessoa incrível que não mediu esforços para auxiliar, ensinar e trabalhar o conhecimento científico, além das inúmeras dúvidas oriundas do trabalho laboratorial. Orientação,conquistas e vitórias é assim que resumo todo o nosso convívio. Muito obrigado! A Drª Daisy Nakamura Sato, incrível pesquisadora que abriu inúmeras portas na vigência de minhas dúvidas sobre microbiologia. A professora Drª Rosemeire Cristina Linhari Rodrigues Pietro, que acolheu as minhas dúvidas e soube ensinar cultivo de células e outras atividades inerentes ao estudo com micobactérias. Ao professor Drº Wagner Villegas, agradeço pela enorme atenção e os extratos gentilmente cedidos e testados neste trabalho. Vinícius Pereira Arantes 5 O Senhor é o meu pastor O Senhor é o meu pastor; nada me faltará. Ele me faz repousar em pastos verdejantes. Leva-me para junto das águas de descanso; refrigera-me a alma. Guia-me pelas veredas da justiça por amor do seu nome. Ainda que eu ande pelo vale da sombra da morte, não temerei mal nenhum, Porque tu estás comigo; o teu bordão e o teu cajado me consolam. Preparas-me uma mesa na presença dos meus adversários, unges-me a cabeça com óleo; O meu cálice transborda. Bondade e misericórdia certamente me seguirão por todos os dias de minha vida; E habitarei na casa do senhor para todo o sempre. Salmo 23 João Pereira Filho (In memorian) “Um dos últimos momentos que oramos juntos celebramos a benção deste salmo, foi possível celebrar a sua força e contemplar o teu semblante. A saudade é grande, gostaria muito que estivesse aqui comemorando comigo todas estas vitórias, que o senhor nunca deixou desfarçar que torcia por mim. Hoje continuo a orar e a pedir que dentre as inúmeras facetas que a vida nos guarda um dia possa novamente contemplar a sua face e dar um abraço forte e dizer quanta falta a sua presença me faz.” Até um dia! De seu neto Vinícius Pereira Arantes Vinícius Pereira Arantes 6 SUMÁRIO Página Lista de Abreviaturas. . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 08 Lista de Tabelas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 Resumo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 Abstract. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 1.0 Introdução. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 1.1 Mycobacterium tuberculosis e outras micobactérias que não tuberculosis (MOTT) de importância médica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 1.2 Quimioterapia da Tuberculose. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 1.3 Pesquisa de novas alternativas terapêuticas para Tuberculose. . . . 24 1.4 Método de Determinação do perfil de sensibilidade utilizando Alamar Blue Assay – MABA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 2.0 Objetivos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 2.1 Objetivos Gerais. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 2.2 Objetivos Específicos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 3.0 Material e Métodos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 3.1 Amostras. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 3.1.1 Extratos Vegetais. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 3.2 Droga de Referência. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 3.3 Cepas do gênero Mycobacterium. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 3.3.1 Cepa padrão de Mycobacterium tuberculosis. . . . . . . . . . . . . . . . 32 3.3.2 Cepa padrão de Mycobacterium avium. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 Vinícius Pereira Arantes 7 3.3.3 Cepa padrão de Mycobacterium fortuitum. . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 4.0 Metodologia. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 4.1 Preparo de suspensões bacilares. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 4.2 Técnica de Microdiluição utilizando Alamar Blue Assay – MABA. . . 33 4.3 Padronização do tempo de leitura para a técnica do MABA. . . . . . . 5.0 Resultados. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 36 6.0 Discussão. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40 7.0 Conclusão. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47 8.0 Referências Bibliográficas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49 9.0 Anexos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67 Vinícius Pereira Arantes 8 LISTA DE ABREVIATURAS AIDS Acquired Immunodeficiency Syndrome ATCC American Type Culture Collection BCG BAAR BACTEC Bacilo Calmette Guérin Bacilo Álcool-ácido Resistente Método Radiométrico para detecção de crescimento bacteriano CIM Concentração Inibitória Mínima ºC Graus Celsius DOTS Directly Observed Treatment Short Course DCM Diclorometano DMSO Dimetilsulfóxido E M B Etambutol ETH Etionamida HIV Human Immunodeficiency virus INH Isoniazida LJ Lowenstein Jensen MAC Complexo Mycobacterium avium MGIT Mycobacterium Growth Indicator Tube mL Mililitro MOTT Micobactérias outras que não Mycobacterium tuberculosis mg Miligrama MABA Microplate Alamar Blue Assay OMS Organização Mundial da Saúde OPAS Organização Panamericana de Saúde Vinícius Pereira Arantes 9 PBS Tampão fosfato (PBS) PCT Programa de Controle da Tuberculose PNCT-MS Plano Nacional de Controle da Tuberculose- Ministério da Saúde PZA Pirazinamida RMP Rifampicina SM Estreptomicina TB Tuberculose TB-MDR Tuberculose “Multi Drug Resistant” µL Microlitro µg Micrograma Vinícius Pereira Arantes 10 ÍNDICE DE TABELAS Apresentação das Tabelas Pág Tabela I Relação dos extratos vegetais, parte do vegetal utilizado, agente extrator e concentração dos extratos utilizados para determinação da atividade antimicobacteriana. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 Tabela II Tabela III Padronização do tempo de leitura da técnica do MABA para as cepas de M.tuberculosis, M.avium, M fortuitum. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Determinação da CIM de extratos vegetais, empregando-se o M. tuberculosis H37Rv ATCC 27294 pela técnica do MABA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 36 Tabela IV Determinação da CIM de extratos vegetais, empregando-se o M. avium ATCC 25291 pela técnica do MABA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 Tabela V Tabela VI Determinação da CIM de extratos vegetais, empregando-se o M. fortuitum ATCC 6841pela técnica do MABA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Determinação da Concentração Mínima Inibitória para as cepas de M. tuberculosis, M.avium e M. fortuitum. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38 39 Vinícius Pereira Arantes 11 RESUMO ARANTES, V.P. Estudo da Atividade Antimicobacteriana de Extratos Vegetais do Cerrado Brasileiro.Araraquara. 2005 (Mestrado em Análises Clínicas) Universidade Estadual “Júlio de Mesquita Filho” – Unesp. A Tuberculose (TB) continua sendo um grave problema de saúde pública, considerada a principal causa de morte em países subdesenvolvidos de grande população e baixo padrão sanitário. Atualmente o aumento do número de casos em paises subdesenvolvidos e desenvolvidos está associado à queda da qualidade de vida, aglomerações, infecções pelo “Human Immunodeficiency Vírus” (HIV) e “Acquired Immunodeficiency Syndrome” (AIDS). Apesar da eficácia dos esquemas terapêuticos utilizados atualmente, nos últimos anos tem-se observado, um aumento na incidência de tuberculose causada pelo M. tuberculosis resistente aos esquemas preconizados para o tratamento da doença, o que reflete falha no emprego dos referidos programas pré- estabelecidos como eficazes. A busca constante por produtos biologicamente ativos e capazes de combater o M. tuberculosis tem promovido a descoberta de novos compostos capazes de eliminar micobactérias, que sejam menos tóxicos, efetivos e que possam ser menos indutores de resistência, podendo associar dose e redução do número de abandono ao tratamento. Este trabalho tem como principal objetivo determinar o efeito antimicobacteriano de extratos vegetais da biota brasileira, frente a cepas padrão de Mycobacterium tuberculosis H37Rv – ATCC 27294, Mycobacterium avium ATCC 25291, Mycobacterium fortuitum ATCC 6841. A metodologia de Microplate Alamar Blue Assay (MABA), foi empregado com o intuito de pesquisar atividade antimicobacteriana, sendo determinado Concentração Mínima Inibitória correspondente a inibir 90% das células viáveis. Os resultados apresentados são promissores, frente à Cepa padrão de M.tuberculosis e M. avium, M.fortuitum destaca-se a grande atividade do extrato de Quassia amara (agente extrator: diclorometano) e Syngonanthus macrolepsis (agente extrator: clorofórmio) com CIM inferior a 200µg/ml para as três espécies testadas. Palavras-chave: Tuberculose, Tratamento, HIV, AIDS. Vinícius Pereira Arantes 12 ABSTRACT ARANTES, V. P. Studying of antimycobactericide activity of vegetal extracts from Brazilian’s “Cerrado”. Araraquara. 2005 (Master in Clinical Analysis) State University “Julio de Mesquita Filho” – Unesp. Tuberculosis (TB) is still a serious problem of public health, considered the main cause of death in undeveloped Countries of great population and low hygiene standard. In the present moment the increase in the number of cases at undeveloped and developed Countries is associated to the drop of life quality, agglomerations, infections from “Human immunodeficiency Virus” (HIV) and “Acquired immunodeficiency Syndrome” (AIDS). In spite of the present efficiency of the used therapeutics schemes, in the last years has been observed, an increase in the tuberculosis incidence caused by the M. tuberculosis resistant to the recommended schemes of treatment for the disease, which reflects in failures on the use of the referred programs pre- established as effectives. The constant search for products biologically actives and capable of fighting the M. tuberculosis has promoted the discovery of new compounds capable of eliminating mycobacteries, that are less toxic, effectives and that can be less inducer of resistance, letting associate dose and reduction in the number of treatment abandonment. This survey has the main purpose to determine the antimycobactericide effect of vegetal extracts from the Brazilian biota, in front of the strain standard of Mycobacterium tuberculosis H37Rv – ATCC 27294, Mycobacterium avium ATCC 25291, Mycobacterium fortuitum ATCC 6841. The methodology of Microplate Alamar Blue Assay (MABA) was used in the intention to search for antimycobactericide activity, having established a Minimal Inhibitory Concentration correspondent to inhibit 99% of the viable cells. The presented results are promising, in front of the strain standard of M. tuberculosis and M. avium, M. fortuitum stands out the great activity of the Quassia amara extract (extractor agent: dichloromethane) and Syngonanthus macrolepsis (extractor agent: Chloroform) with MIC below 200µg/ml in the three tested species. Key words: Tuberculosis, Treatment, HIV, AIDS. Vinícius Pereira Arantes 13 1.INTRODUÇÃO A tuberculose pulmonar é uma doença infecciosa causada por micobactérias pertencentes ao complexo Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum , Mycobacterium microti e M. canetti) é transmitida de homem a homem por aerossóis produzidos durante a expectoração (AMERICAN THORACIC SOCIETY AND CENTERS FOR DISEASE CONTROL, 1990; ALCAIDE et al.,1997; BLOOM & SMALL,1998; ROXO,1997). As micobactérias pertencem ao gênero Mycobacterium, único representante da família Mycobacteriaceae, apresenta-se na forma de bacilos curvos ou retos, com 0,2 a 0,7 µm de largura por 1,0 a 10,0 µm de comprimento e possui a propriedade de álcool-ácido resistência, devido a grande quantidade de lipídios presentes em sua parede celular. São aeróbios e classificados de acordo com o seu tempo de crescimento, sendo considerados de crescimento rápido quando requerem menos de 7 dias para produzir colônias visíveis, e de crescimento lento, aquelas que requerem mais de 7 dias para produzir colônias visíveis quando inoculadas em meios de cultura sólidos ( KONEMAN et al,2001; AL-HAJJAJ et al.,2001; BARRETO et al.,1994; FREIRE,1989; HART et al.,1996). A tuberculose pulmonar é uma doença que tem a sua magnitude ligada à situação socio-econômica da região ou do país (ROBBINS et al. 1996; HIJJAR et al.,2001; RAVIGLIONE et al., 1997; DANNENBERG, 1993). Atualmente com o advento da AIDS, a coinfecção TB/HIV tem provocado um impacto na epidemiologia da tuberculose em todo o mundo, fato observado em Vinícius Pereira Arantes 14 países desenvolvidos e em desenvolvimento, principalmente nas Américas (GARCIA et al., 1995; MAcKENNA et al., 1998; CANTRELL et al., 2001; SNIDER et al., 1998; BOSHOFF& MIZRAHI, 2000; KUMAR et al., 2001;LIU et al.,1998). A epidemia de AIDS e o controle insuficiente da tuberculose apontam para a necessidade de medidas enérgicas e eficazes de saúde pública. A emergência de focos de tuberculose multirresistente (TBMDR), tanto nos Estados Unidos da América, no início dos anos noventa, quanto atualmente, nos países que compunham a antiga União Soviética, tem mobilizado o mundo para a questão da tuberculose (DALCOMO et al., 1998; COOPER et al.,1993). A Organização Mundial da Saúde (OMS) estima que existam anualmente 1,9 milhões de mortes por tuberculose, 98% delas em países em desenvolvimento e cerca de 350.000 mortes em casos de associação da tuberculose com a AIDS. O número anual de novos casos de tuberculose é estimado em cerca de 8,7 milhões, sendo que 80% estão concentrados em 22 países, dentre eles o Brasil. A TBMDR está presente em 63 países que participaram do inquérito mundial, realizado no período de 1994-1999 (WHO, 2002; FAIRCHILD & OPPENHEIMER,1998). A Organização Mundial da Saúde expressa que no ano de 2020 aproximadamente um bilhão de pessoas em todo o mundo estejam infectadas, 200 milhões adoeçam e 35 milhões morram (WHO,1997). Os casos de tuberculose estimados pela OMS acredita-se que metade sejam notificados, situação que traduz a insuficiência das políticas de saúde e controle. Nos 22 países com maior carga de tuberculose, a estimativa é de 6.910.000 casos. A Índia ocupa o primeiro lugar, com 1.856.000 novos casos anualmente, e o Vinícius Pereira Arantes 15 Brasil atualmente ocupa o 15º lugar com 129.000 casos por ano (HIJJAR et al., 2001), com cerca de 30 milhões de morte por tuberculose (BRASIL. Ministério da Saúde, 1999). A região das Américas alberga 7% do total mundial de casos de tuberculose. No Brasil, estima-se que ocorram cerca de 129.000 casos novos por ano, dos quais apenas 90.000 casos novos são notificados oficialmente. O Estado de São Paulo, responsável pelo maior número absoluto de casos novos com um coeficiente de incidência de 50/100.000 habitantes e cerca de 1.500 óbitos por ano, notificou 20.125 casos novos no ano de 2001. (BRASIL.Ministério da Saúde, 2002). O Brasil é um dos quatro países com maior número absoluto de casos de tuberculose no mundo. O total em 2001, segundo o Sistema Único de Saúde (SUS), é de 103.029 casos. A incidência da doença é de 60,68 /100.000 habitantes (SANT’ANNA, et al., 2002). O percentual de tuberculosos no grupo de 0-14 anos situa-se entre 6% e 7% do total de casos notificados, a baixa taxa de positivos dentre este grupo é explicada pela dificuldade de confirmação baciloscópica nesta idade. A incidência de meningite tuberculosa a forma mais grave desta doença, o grupo de 0-4 anos é o mais atingido, coeficiente de 0,9/100.000 habitantes (BRASIL. Ministério da Saúde, 1993). Entre as capitais brasileiras, as cidades do Rio de Janeiro, Porto Velho, Rio Branco, Recife e São Paulo, apresentam as maiores taxas de mortalidade que variam de 4,6 a 10,2 óbitos por 100.000 habitantes (ZACARIAS et al., 1994). Segundo dados oficiais do Ministério da Saúde, em 1999 foram notificados 91.800 casos novos de tuberculose. É de conhecimento que estes representam 75% a 80% da incidência total, estima-se cerca de 130.000 novos Vinícius Pereira Arantes 16 casos anualmente e deste montante diagnosticado cerca de 75% são curados (DOLIN et al.,1994; ROSEMBERG, 1990). O Centro de Prevenção e Controle de Doenças dos Estados Unidos (CDC) já em 1994 projetou aumentos na incidência global da tuberculose na ordem de 36 e 58% para os anos 2000 e 2005 respectivamente (DOLIN et al., 1994; CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION, 1993). A Organização Mundial da Saúde fez uma estimativa de 30.000.000 de mortes por tuberculose nos próximos dez anos e calcula que pelo menos 8.000.000 de casos novos de tuberculose ocorreram no ano passado (WHO, 1997; RAVIGLIONE et al., 1997). A tuberculose tem aumentado nos últimos 10 anos, associada aos três importantes fatores emergenciais, a pobreza enquadra-se como sendo o primeiro deles, o segundo é considerado a associação entre tuberculose e HIV/AIDS e o terceiro fator o aumento considerável nos casos de resistência a drogas antituberculosas. O HIV é fator de risco para a tuberculose, já que o vírus desencadeia fator de imunodeficiência no paciente infectado, acredita-se existir atualmente cerca de 4,4 milhões de pacientes infectados simultaneamente com HIV e tuberculose no mundo (FIGUEROA & LÓPEZ, 2000). A co-infecção pelo HIV e M. tuberculosis atualmente vem sendo estudada em inúmeros países, onde ocorrem as duas infecções de forma simultânea e que naturalmente representa problemas para aos órgãos de saúde pública (FIUZA & AFIÚNE,1993). Podemos admitir que as chances de um indivíduo HIV positivo em desenvolver a doença em comparação a um indivíduo normal é de Vinícius Pereira Arantes 17 25 vezes maior (BILLO, 1995; CHAISSON & STOKIN, 1989; BENETUCCI et al., 1992). Estima-se que 500.000 pessoas infectadas pelo HIV vivem na América Latina, onde em algumas regiões urbanas segundo Organização Mundial de Saúde (OMS) são considerados locais de emergência mundial contra a tuberculose (LIMA & MADI,1988; LOURES,1995). As cidades do Rio de Janeiro (RJ) e de Rio Grande (RS),pertencem à área regional de alta prevalência para tuberculose. Segundo a OMS a tuberculose e a AIDS juntas constituem, hoje, uma calamidade sem precedentes na história. Em 1999, cerca e 1/3 dos infectados pelo HIV, o eram também pelo bacilo de koch, segundo a atualidade o maior fator de risco para o desenvolvimento da tuberculose em pessoas previamente contaminadas (BOFFO et al. 2004; HIJJAR et al., 2001). 1.1. Mycobacterium tuberculosis e micobactérias outras que não tuberculosis (MOTT) de importância médica. O gênero Mycobacterium é formado por bacilos imóveis, com alta porcentagem de lipídios na parede, que conferem resistência a desinfetantes e antibióticos, bem como, a característica de álcool-ácido-resistência. O gênero Mycobacterium compreende cerca de 100 espécies, 25 identificadas como sendo patogênicas ao homem uma diversidade de espécies, de grande distribuição na natureza. Alem do complexo Mycobacterium tuberculosis (M. microti, M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum) existem espécies saprófitas e outras que atuam como patógenos oportunistas causando enfermidades denominadas de micobacterioses (CORTINAS et al., 2002; POZNIAK et al.,1996; RAYNAUD et al., 1998). Vinícius Pereira Arantes 18 Em 1882, Koch descreveu o agente causal da tuberculose humana (SHEPPARD,2001). Pouco tempo depois, diversos autores comunicaram o isolamento de outras espécies de micobactérias responsáveis por infecções animais. Strauss em 1891 descreveu o agente causal da tuberculose aviária e quatro anos depois Johne descreve o bacilo causador da Enterite Hipertrófica Bovina. Em 1901 Marmoreck diferenciou os agentes responsáveis por causarem a tuberculose humana, bovina e aviária de outras espécies, que denominou de “Micobactérias paratuberculosis”. Logo mais foram isoladas amostras de micobactérias do solo e de amostras humanas, que em determinadas situações são chamadas de oportunistas (MANZANO et al., 1998; SANT´ANNA, 2002; SANT’ANNA, et al., 2002). As espécies de micobactérias outras que não tuberculosis (MOTT) mais isoladas no Brasil são: Complexo M. avium-intracellulare (MAC), M. fortuitum, M. cheloneae, M. kansasii e M. scrofulaceum (LEITE et al., 1995 (a); LEITE & TELAROLLI, 1997; LEITE et al., 1998) causando principalmente doença pulmonar e ganglionar, sendo que estas e outras MOTT são isoladas com maior freqüência em pacientes soropositivos para o vírus da AIDS (BRASIL.Ministério da Saúde, 1994; LEITE et al., 1995 (a); LEITE, et al., 1998; WREN et al., 1998). Nesses pacientes geralmente a doença é disseminada e fatal em curto espaço de tempo (BARBER et al., 1991; FALKINHAM III, 1996; RUNYON,1958). Trabalhos recentes destacam cada vez mais a prevalência de MOTT em pacientes HIV positivos (HIRSCHMAN, 1990; STRATTON, 1992; GIAYETTO & CABRERA, 1994; VON REYN, et al., 1996; FALKINHAM III, 1996; LEITE et al., 1998). LEITE, et al. 1995 (a) destacam o isolamento de M. Vinícius Pereira Arantes 19 avium-intracellulare, M. fortuitum e M. chelonae de pacientes internados no setor de Tisiologia do SESA em Araraquara-SP, sendo que a maior incidência das micobacterioses por MOTT foi encontrada em pacientes soropositivos para o HIV. Além dos pacientes HIV positivos, os imunocompetentes também desenvolvem as micobacterioses e novas espécies como, por exemplo: M. celatum, M.mucogenicum sp. nov. e M.heidelbergense sp. nov. tem sido isoladas de material clínico (HAAS et al., 1993; BUX-GEWEHER et al., 1998; MUÑOZ et al., 1998). Como estas e outras espécies podem ser isoladas de solo, águas e outras fontes naturais (COSTALLAT et al., 1977; LEVY-FREBAULT & DAVID, 1983; GRAHAM-JR et al., 1988; LEITE et al., 1995; HAAS & FATTAL, 1990; SCHULZE-RÖBBECKE et al., 1991; STOSÁREK et al., 1993; FALKINHAM III, 1996; NEUMANN et al., 1997; LEITE, et al., 1998; FALKINHAM III, 1998), deve-se ter cautela ao atribuir a estas espécies a responsabilidade pela etiologia da doença. Já no caso de M. tuberculosis seu isolamento mesmo em cultura mista exclui a possibilidade de outra espécie ser o agente causal da infecção (BRASIL.Ministério da Saúde, 1994; FALKINHAM III, 1996). As infecções causadas pelo complexo M. avium-intracellulare em pacientes imunocompetentes são principalmente pulmonares e disseminadas (HIRSCHMAN, 1990; ELLNER et al., 1991; COOK, 1991; VON REYN et al., 1996; FALKINHAM III, 1996), são descritos casos em grandes centros como Estados Unidos, França, África, Itália, Alemanha, Espanha, Áustria e outros (HORSBURG, et al. 1991; HORSBURG, 1991; NASSOS et al., 1991; GARCIA GARCIA et al., 1995; DABORN et al.,1996) e no Brasil e América Latina (LEITE Vinícius Pereira Arantes 20 et al., 1995; LEITE & TELAROLLI, 1997; GARCIA GARCIA et al., 1995; LEITE et al. 1998). O complexo M. avium-intracellulare pode ser isolado de ambientes naturais, como água, solo com muita matéria orgânica, baixo pH e pouco O2 dissolvido (FALKINHAM III, 1996; FALKINHAM III, 1998). Em laboratório, requer pH em torno de 5 a 5.5 para seu melhor desenvolvimento e também temperaturas no intervalo de 42 a 45ºC (COSTALLAT et al., 1977; GRAHAM-JR et al., 1988; FALKINHAM III, 1996). Existem muitos casos de M. kansasii isolados de amostras clínicas (LEVY-FREBAULT & DAVID, 1983; STRATTON, 1992; LEITE et al., 1995; FALKINHAM III, 1996; ALCAIDE et al., 1997; LEITE et al., 1998) é uma micobactéria de crescimento lento, fotocromogênica, que exige temperaturas em torno de 32ºC a 42ºC, catalase positiva, reduz nitrato a nitrito e hidrolisa o tween 80. As cepas com catalase fortemente positiva são as mais virulentas (FALKINHAM III, 1996). São descritos relatos de isolamento de M. kansasii de fontes de água naturais e tratadas, existe a hipótese de contaminação por aerossol (LEVY-FREBAULT & DAVID, 1983; FALKINHAM III, 1996; FALKINHAM III, 1998). As infecções são geralmente causadas em pacientes com doenças de base de origem pulmonar, câncer ou por alcoolismo (LEVY-FREBAULT & DAVID et al., 1989; FALKINHAM III, 1996; FALKINHAM III, 1998). Segundo FALKINHAM III (1996), M. kansasii pode fazer parte da microbiota normal de plantas e é também encontrado em águas. Possui crescimento lento, pode crescer a 42ºC, não hidroliza Tween 80 e possui muitas características comuns com M. avium, sendo diferenciado através de pigmentação, urease e catalase, Vinícius Pereira Arantes 21 testes positivos para M. kansasii (KENT & KUBICA, 1985; DAVID et al., 1989; BRASIL.Ministério da Saúde, 1994; FALKINHAM III, 1996; GOODFELLOW & MAGEE, 1998; HEIFETS & JENKINS, 1998). Infecções causadas por M. scrofulaceum são historicamente relatadas em linfadenite cervical em crianças, mas existem casos de infecção pulmonar, geralmente associados à doenças de base e predisposição do hospedeiro (bronquite crônica, enfisema, câncer, pneumonia). Tem sido descrito aumento de casos de infecção por esta espécie, associados com o crescente número de casos de AIDS (DELABIE et al., 1991; STRATTON, 1992; FALKINHAM III, 1996; LEITE et al., 1998). As espécies M. fortuitum e M. chelonae segundo GOODFELOW & MAGEE (1998) são consideradas micobactérias de crescimento rápido, patogênicas, podendo causar infecções pulmonares, de pele e tecidos (FALKINHAM III, 1996). Existem muitos casos relatados de M. fortuitum e M. chelonae causando infecções pulmonares, de córnea e outras (LEITE et al., 1995; WALLACE et al. 1991; BARBER et al., 1991; STRATTON, 1992; LEITE et al., 1995; FALKINHAM III, 1996; LEITE et al., 1998). M. fortuitum, cresce a 43ºC, enquanto M. chelonae não cresce a 43ºC (KENT & KUBICA, 1985; DAVID et al., 1989; BRASIL.Ministério da Saúde, 1994; FALKINHAM III, 1996; GOODFELLOW & MAGEE, 1998; HEIFETS & JENKINS, 1998; CONVILLE & WITEBSKY, 1998; MUÑOZ et al., 1998). M. fortuitum, M. chelonae têm sido isolados de muitas fontes naturais, em rios, lagos, mar, solo e também de outras fontes como águas de hospitais, gelo e máquinas de gelo, águas de piscicultura e aquários e de fontes termais (LEITE et al., 1989; FALKINHAM III, 1996; FALKINHAM III, 1998, LEITE et al., 1998). Vinícius Pereira Arantes 22 1.2. QUIMIOTERAPIA DA TUBERCULOSE O esquema terapêutico preconizado pelo Ministério da Saúde (MS) em 1979 é composto por isoniazida, rifampicina e pirazinamida, durante dois meses e isoniazida e rifampicina mantidos por mais quatro meses (Esquema I) (BRASIL. Ministério da Saúde,1999; TELLES et al.,1997;VERONESI & FOCACCIA,1996). O tratamento pode ser dividido em duas fases, a primeira chamada de ataque e a segunda de manutenção sob a finalidade de evitar resistência microbiana e persistência bacilar (BRASIL. Ministério da Saúde, 2002; DINIZ et al. 1995). As drogas têm locais diferentes de ação, a rifampicina (RMP) e isoniazida (INH) são eficazes em população bacilares de crescimento rápido, já em populações bacilares intracelulares o emprego da pirazinamida (PZA) é fundamental (BRASIL.Ministério da Saúde, 2002). No fracasso do esquema I é indicado o esquema de retratamento (Esquema IR) que é composto por Rifampicina (RMP), Isoniazida (INH), Pirazinamida (PZA), Etambutol (EMB), durante dois meses e Rifampicina (RMP), Isoniazida (INH) e Etambutol (EMB) durante quatro meses. Caso os esquemas I e IRI venham a falhar é possível instalar o esquema III, composto por Estreptomicina (SM), Etionamida (ETH), Etambutol (EMB), Pirazinamida (PZA), que compreendem três meses e a segunda fase é composta por Etionamida (ETH) e Etambutol (EMB) durante nove meses (SCHECHTER, 2001). A resistência do M. tuberculosis aos medicamentos utilizados relaciona-se as mutações genéticas das populações bacilares, variando normalmente de acordo com a droga. Quanto mais drogas forem utilizadas de forma inadequada, mais resistência irá aparecer. A multiresistência é estabelecida no Brasil, como a falência dos Vinícius Pereira Arantes 23 esquemas I e III e ou resistência a importantes drogas usuais como RMP, INH, SM, EMB e ou PZA (JARDIM et al.,2001). O aparecimento de inúmeras cepas resistentes de Mycobacterium tuberculosis é alarmante, tendo em vista que poucos fármacos efetivos enquadram o arsenal terapêutico para tuberculose. Em pesquisa realizada no CDC durante o primeiro trimestre de 1991, foram encontrados isolados de Mycobacterium tuberculosis resistentes a, no mínimo, uma droga antituberculosa em 14,9% dos casos; 3,3% dos isolados eram resistentes a isoniazida e rifampicina. Em certas localidades, sobretudo na cidade de Nova York, foram recuperadas cepas resistentes a, no mínimo, uma droga, incluindo resistência emergente as fluoroquinolonas, em 33% dos casos, e a incidência a isoniazida e a rifampicina foi de 19%. A evolução aleatória da resistência das micobactérias às drogas independe da exposição aos agentes antimicrobianos (KONEMAN et al. 2001; KRITSKI et al.,1993; LEITE et al., 1995; OLIVEIRA, 1994; ISEMAN, 1993). Quando da associação tuberculose/Aids, a resistência do bacilo da tuberculose aos diferentes fármacos utilizados, está diretamente relacionada com a influência dirigida pela imunodeficiência gerada pelo HIV. A depleção dos linfócitos T e conseqüentemente de linfócitos T auxiliares CD4+, a inibição de resposta proliferativa e estímulos mitogênicos ou antigênicos desencadeados por proteína transmembrana gp41, diminuição gradual de reação de sensibilidade ao teste tuberculínico, linfócitos TCD4 inferior a 50 mm3 inúmeros fatores que cooperam para o comprometimento da tuberculose (TIERNEY JR et al., 2001). Vinícius Pereira Arantes 24 1.3 PESQUISA DE NOVAS ALTERNATIVAS TERAPÊUTICAS PARA TUBERCULOSE A população mundial utiliza as plantas como medicamentos desde a pré- história. Existem relatos do homem de Neandertal há cerca de 60.000 anos, do emprego de plantas com atividades medicinais para o tratamento de enfermidades humanas. Em meio ao desenvolvimento de cepas resistentes aos quimioterápicos e as infecções causadas por micobactérias não pertencentes ao complexo Mycobacterium tuberculosis, que naturalmente não respondem ao tratamento preconizado para tuberculose pulmonar. (WOLINSKY, 1992; BURMAN, 1997; COHN et al., 1997). Inúmeras plantas foram testadas e detectadas algumas substâncias com atividade contra micobactérias e até outros microrganismos (DI STASI, 1996).Alguns óleos essenciais também foram testados e determinados sua atividade micobactericida.O estudo de plantas com atividade micobactericida é alvo de inúmeros pesquisadores, que além de determinar compostos ativos contra micobactérias patogênicas de crescimento rápido, alegam atualmente de detectar também compostos ativos às espécies de crescimento lento e as MOTT que são causas importantes de infecções em imunodeprimidos (ABBOT & SMITH,1981; BRASIL. Ministério da Saúde ,2002) A toxicidade evidenciada pelos fármacos é alta e inclui, hepatoxicidade, neurotoxicidade, leucopenia, eosinafilia, febre, náuseas, vômitos entre outros. O problema da adesão aos quimioterápicos utilizados no tratamento da tuberculose e das reações colaterais provocadas por eles tem levado os pesquisadores à busca de alternativas terapêuticas para a tuberculose. Nos últimos anos pesquisadores de inúmeras áreas têm dispensado atenção à Vinícius Pereira Arantes 25 pesquisa de princípios ativos em extratos brutos de plantas e suas frações com atividade antibacteriana (GRINBAUM et al.,1995; SALTINI et al.,1993; ZACARIAS et al.,1994). Atualmente, produtos naturais são responsáveis diretamente ou indiretamente por cerca de 40% dos fármacos disponíveis no mercado, sendo 70% antibióticos e antitumorais (CALIXTO& YUNES, 2001). O estudo de plantas pode envolver pesquisas diferentes como comprovação da identidade botânica, determinação de composição química e da ação farmacológica e determinação das estruturas químicas ativas envolvidas. Estudos são condicionados aos requisitos de qualidade e ausência de toxicidade dos princípios ativos vegetais (CECHINEL FILHO & YUNES, 1998). As plantas através de vias metabólicas secundárias produzem compostos como os alcalóides, flavonóides, isoflavonóides, taninos, cumarinas, glicosídeos, terpenos, poliacetilenos e substâncias oleosas, que por vezes, são específicos a determinadas famílias, gêneros ou espécies (CECHINEL FILHO & YUNES, 1998). Várias espécies de plantas têm sido pesquisadas em algumas classes como os terpenóides (CANTRELL et al., 2001) e fisalinas (PIETRO et al., 2000; JANÚARIO et al., 2002) tem sido verificado atividade biológica contra micobactérias. Os estudos evidenciam a importância dos extratos vegetais e seus componentes na síntese de novos produtos farmacêuticos que possam ser eficientes no combate às infecções,atividades bactericida, antifúngica, espasmogênica e antiprotozoário associadas aos triterpenóides (ácido betulínico e lupeol), flavonóides (hiperina), quercetina, sulfonoglicosídeo, esteróides aromáticos, aminoácidos e proantocianinas (CALIXTO et al., 2001). Vinícius Pereira Arantes 26 As plantas e seus produtos já eram utilizados no tratamento das doenças infecciosas há muitos anos atrás. O conhecimento dos efeitos benéficos de certas plantas no tratamento de moléstias faz parte dos acervos populares desde a mais remota Antigüidade (ANDRADE et al.,1994;BRUNETON,1993;BURMAN,1997). Não há dúvidas de que as plantas são excelentes fontes de agentes terapêuticos de todos os tipos. Essas substâncias de origem vegetal são biodegradáveis e renováveis, características de grande interesse na sociedade atual, especialmente quando se pensa não apenas na ocupação sustentável de uma região, mas sim de todo o planeta e, ainda, na conscientização das populações a fim de garantir um ecossistema viável no futuro. Segundo CALIXTO & YUNES (2001) diversas espécies de plantas foram descritas com atividade micobactericida. Sendo que alguns compostos como terpenóides, fisalinas, Glabrol e alguns Compostos fenólicos tem sido descobertos compostos com atividade bactericida, antifúngica, espasmogênica e antiprotozoário associadas aos triterpenóides (ácido betulínico e lupeol), flavonóides (hiperina), quercetina, sulfonoglicosídeo, esteróides aromáticos, aminoácidos e proantocianinas (TUBERCULOSIS DRUG SCREENING PROGRAM, 2001). Os Flavonóides, isoflavonóides, taninos, cumarinas, glicosídeos, terpenos, poliacetilenos e substâncias oleosas, que por vezes, são específicos a determinadas famílias, gêneros ou espécies (CECHINEL FILHO & YUNES, 1998). Outros compostos como os terpenóides (CANTRELL et al., 2001) e fisalinas (PIETRO et al., 2000; JANÚARIO et al., 2002) são responsáveis por atividade biológica contra micobactérias. Vinícius Pereira Arantes 27 1.4. MÉTODO DE DETERMINAÇÃO DO PERFIL DE SENSIBILIDADE UTILIZANDO ALAMAR BLUE ASSAY -MABA Quando se estuda a ação antimicrobiana de substâncias provenientes de plantas, geralmente são testadas várias bactérias Gram positivas e Gram negativas. Porém, raramente as micobactérias são estudadas devido a dificuldade do manuseio, crescimento lento e falta de laboratório adequado para processar este microrganismo que é considerado de nível 3 em relação a periculosidade (BRASIL.Ministério da Saúde, 1994). A descoberta de novas drogas representa um desafio principalmente com relação às substâncias com atividade contra as micobactérias, as quais têm crescimento lento, são patogênicas e sua parede rica em lipídio representa verdadeira proteção contra os agentes agressores. Em relação à polaridade, os extratos vegetais apolares são pouco estudados, pois requerem uso de solventes, e meios de culturas especiais para a concretização do trabalho experimental. No entanto devido à alta porcentagem de lipídios na parede das micobactérias, são os extratos e principio ativo apolar, os mais promissores em relação à atividade antimicobacteriana. A célula micobacteriana se diferencia das demais eubactérias pela constituição de sua parede celular. Esta possui alto conteúdo lipídico (60% do peso seco das células), destacando-se os ácidos micólicos por suas características singulares e importância nos mecanismos de patogenicidade (GANGADHARAM,1998; ABBOT & SMITH,1981; GRANGE, 1998; GOODFELOW & MAGEE, 1998; JAWETZ et al.,2000). Neste estudo é de grande interesse testar extratos vegetais apolares, que podem apresentar Vinícius Pereira Arantes 28 melhor atividade antimicobacteriana, devido a maior facilidade destes compostos ativos em penetrar na parede de micobactérias. A determinação do perfil de sensibilidade de cepas de Mycobacterium frente a compostos quimioterápicos, pode ser realizado por metodologias diferentes. O método das concentrações absolutas que também é referido como a determinação da concentração inibitória mínima, o método da proporção de resistência e, ainda, o método das proporções (KANTOR & LAZLO, 1998). O método das proporções é utilizado no Brasil, incorporando-se as drogas antituberculose utilizadas no esquema terapêutico convencional em meio de Lowenstein-Jensen, no entanto os resultados fornecidos pelo uso desta metodologia oferecem resultados tardiamente, ocorrendo após 28 dias de incubação dos meios de cultura em estufa a 37oC (BRASIL.Ministério da Saúde, 1999). O Alamar Blue (Resazurina) é composto capaz de indicar através óxido- redução à presença de crescimento microbiano. Atualmente muito empregado para determinar perfil de sensibilidade microbiano frente a fármacos sintéticos e naturais, principalmente frente ao gênero Mycobacterium. A utilização do MABA, frente a outras técnicas tem como benefícios à rapidez nos resultados, custo, sensibilidade, possibilidade de testar inúmeros compostos, técnica colorimétrica de fácil manejo, reprodutibilidade, emprego de quantidade reduzida de extratos vegetais comparados a outras técnicas (COLLINS & FRANZBLAU, 1997; FRANZBLAU et al., 1998; JANUÁRIO et al., 2002). A pesquisa da atividade antimicobacteriana de extratos vegetais é realizada preferencialmente pela técnica de microdiluição em placa, empregada Vinícius Pereira Arantes 29 para determinar a CIM do extrato em inibir o bacilo e empregamos o Alamar Blue como revelador da sensibilidade bacteriana as drogas (COLLINS & FRANZBLAU, 1997; FRANZBLAU et al., 1998; BOLLELA et al., 1999), sendo denominada pela técnica do MABA (Microplate Alamar Blue Assay). A técnica do MABA tem sido empregada por diversos autores para determinar atividade antimicobacteriana de princípios ativos naturais (PIETRO et al., 2000; JANUÁRIO et al., 2002) e de novas drogas sintéticas (PÍCON et al.,2002;ANDRADE et al.,1994;BURMAN,1997,CANTRELL et al.,2001;CUNHA et al., 1994;HARDMAN & LIMBIRD,1996; HINOU et al.,1989;JANUÁRIO et al., 2002; KUBO,1993; COWAN,1999). Nesta técnica é determinada a Concentração Mínima Inibitória (CIM), necessária para matar 90% das células bacterianas. Entretanto a técnica do MABA não permite avaliar a atividade antimicobacteriana das drogas sobre as micobactérias internalizadas em macrófago. Vinícius Pereira Arantes 30 2. OBJETIVOS 2.1 OBJETIVOS GERAIS: Avaliar a atividade antibacteriana In vitro de extratos vegetais de plantas do cerrado Brasileiro frente à cepas padrões de Mycobacterium tuberculosis H37Rv – ATCC 27294, Mycobacterium avium ATCC 25291 e Mycobacterium fortuitum ATCC 6841 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS: 2.2.1 – Determinar Concentração Mínima Inibitória de extratos vegetais frente a cepa de M.tuberculosis, M.fortuitum e M.avium. Utilizando a técnica do Microplate Alamar Blue Assay – MABA. 2.2.2 – Comparar os resultados de sensibilidade das espécies de micobactérias obtidos pela metodologia de Alamar Blue (Microplate Alamar Blue Assay) frente aos diferentes extratos utilizados. Vinícius Pereira Arantes 31 3. MATERIAL E METODOS 3.1. AMOSTRAS Os extratos utilizados neste trabalho, integram o Projeto Temático Biota- Fapesp, os mesmos foram confeccionados e gentilmente cedidos pelo Dr. Wagner Villegas, Instituto de Química – Unesp – Araraquara. 3.1.1. EXTRATOS VEGETAIS Tabela I. Relação dos extratos vegetais, parte do vegetal utilizado, agente extrator e concentração dos extratos utilizados para determinação da atividade antimicobacteriana. A metodologia de preparo dos extratos é apresentada no anexo: método 03. Planta Parte do vegetal Agente Extrator Solução Estoque (mg/mL) 1. Ananas ananassoides Folhas DCM 115mg/ml 2. Ananas ananassoides Folhas Metanol 630mg/ml 3. Byrsonima cinera Folhas Metanol 292mg/ml 4. Byrsonima crassa Folhas Clorofórmio 177mg/ml 5. Byrsonima crassa Folhas Etanólico 70% 494mg/ml 6. Byrsonima crassa Aéreas Clorofórmio 228mg/ml 7. Byrsonima fagifolia Folhas Metanol 419mg/ml 8. Cissus suscicaulis Folhas Clorofórmio 159/mg/ml 9.Curatella americana Cascas Clorofórmio 173mg/ml 10.Davilla elliptica Folhas DCM 211mg/ml 11.Eriocaulon ligulatum Escapos Clorofórmio 500mg/ml 12.Leiothrix flavescens Escapos Clorofórmio 206mg/ml 13.Mouriri pusa Folhas DCM 224mg/ml 14.Mouriri pusa Folhas Metanol 729mg/ml 15.Quassia amara Cascas DCM 53mg/ml 16.Solanum cernuum Folhas DCM 225mg/ml 17.Strychnos pseudoquina Folhas Metanol 70% 679mg/ml 18.Strychnos pseudoquina Folhas DCM 183mg/ml 19.Syngonanthus artrothichus Escapos DCM 195mg/ml 20.Syngonanthus bissulcatus Capitulo Etanólico 214mg/ml 21.Syngonanthus macrolepsis Escapos DCM 163mg/ml 22Syngonanthus macrolepsis Escapos Clorofórmio 199mg/ml 23.Syngonanthus xerantemoides Escapos Etanólico 718mg/ml 24.Syngonanthus xerantemoides Capitulos Etanólico 70% 729mg/ml 25.Syngonanthus xerantemoides Capitulos Etanólico 70% 500 mg/ml 26.Turnera ulmifolia Flores Hexano 87mg/ml 27.Turrnera ulmifolia Folhas DCM 260mg/ml Vinícius Pereira Arantes 32 3.2. DROGA DE REFERÊNCIA Foram utilizadas soluções estoque de isoniazida (INH - Sigma) de concentração 10 mg/mL em água destilada. 3.3. CEPAS DO GÊNERO Mycobacterium 3.3.1 Cepa padrão de M. tuberculosis H37Rv ATCC 27294 3.3.2 Cepa padrão de M.avium ATCC 25291 3.3.3 Cepa padrão de M.fortuitum ATCC 6841 As cepas foram então mantidas em meio inclinado de Lowenstein- Jensen até o momento do uso. 4.0 METODOLOGIA 4.1 PREPARO DAS SUSPENSÕES BACILARES Para a realização da técnica do MABA, foram utilizadas culturas de M. tuberculosis, M.avium e M.fortuitum. Cada cepa foi mantida em meio de Lowenstein – Jensen (LJ) até o momento do uso, para obtenção da quantidade ideal de microrganismo. De cada cepa foi retirada uma alçada de bactérias, que corresponde a 5,0mg de peso seco bacteriano e incubado em meio de Middlebrook 7H9 e incubado por 10 dias a 37ºC. Após obtenção de quantidade ideal de microrganismo, as micobactérias foram transferidas para tubos Falcon de 10 ml e centrifugadas a 3.000 Rpm Vinícius Pereira Arantes 33 durante 30 minutos. O sedimento foi então resuspendido e lavado duas vezes com tampão PBS pH 7.0, acrescido de Tween 80 estéril. 4.2 TÉCNICA DE MICRODILUIÇÃO UTILIZANDO ALAMAR BLUE ASSAY (MABA) COMO REVELADOR (COLLINS & FRANZBLAU, 1998). Para a realização da técnica de microdiluição pela metodologia do MABA, foi utilizada placa estéril de 96 orifícios. Nas colunas de 1e 12 em linhas de A a H foram adicionados 200 µL de água destilada estéril, perfazendo a necessidade de evitar provável evaporação dos compostos a serem testados. Os orifícios presentes nas linhas de A a D da coluna 11 receberam 200 µL de meio Middlebrook 7H9, os orifícios correspondentes de E a H da coluna 11 receberam 100 µL de meio Middlebrook 7H9. Os orifícios correspondentes da linha A de colunas de 2 a 10 receberam 150 µL de meio Middlebrook 7H9 e os de linha B a H referentes a coluna 2 a 10, receberam 100 µL de Middlebrook 7H9. Foram então adicionados os extratos diluídos a serem testados. Todos os extratos foram diluídos para que estivessem na concentração inicial de 16.000 µg/ml. A linha A e B da microplaca e colunas de 2 a 10, procede-se nova diluição e os extratos partem da diluição de 4.000 µg/ml (linha A);4.000 µg/ml(linha B);2.000 µg/ml (linha C);1.000 µg/ml(linha D);500 µg/ml (linha E);250 µg/ml (linha F);125 µg/ml (linha G);62.5 µg/ml (linha H). Os orifícios de coluna 2 a 10 da linha A receberam 50 µL da diluição de 16.000 µg /ml. Os orifícios de linhas B referentes às colunas de 2 a 9 receberam 100 µL de extrato e a coluna 10 a droga padrão (Isoniazida 10mg/ml). Após a Vinícius Pereira Arantes 34 homogeneização da linha B, procede à diluição de linha B a H de colunas de 2 a 10, ao final desprezar volume de 100 µl. Ao final ser adicionado a suspensão bacilar diluída 1:25 referente a escala n.1 de MacFarland realizada após protocolo de obtenção da suspensão bacilar. Os orifícios de colunas de 2 a 10 e linhas de B a H receberam volume de 100 µl de suspensão bacilar, os orifícios das linhas E a H, referentes à coluna 11 receberam 100 µl da suspensão bacilar, com o intuito de ser controle positivo para micobactérias. As placas então foram seladas com filme de polietileno e incubadas em estufa bacteriológica a 37ºC ,no quinto dia de incubação os orifícios A -11 e E – 11, receberam 25 µl de solução reveladora de Alamar Blue na proporção 1:1 e solução de Tween 80 a 10% para a cepa de M. tuberculosis, quarto dia para a cepa de M.avium e três dias para a cepa de M.fortuitum. As placas então foram reincubadas por 24 horas a 37ºC. A presença de cor rósea indica crescimento microbiano e a presença de coloração azul, indica ausência de crescimento microbiano, para as cores intermediárias as placas foram reincubadas por mais 24 horas. Os extratos apresentados neste trabalho foram submetidos frente as três cepas padrão e testados em triplicata. Vinícius Pereira Arantes 35 4.3 PADRONIZAÇÃO DO TEMPO DE LEITURA PARA A TÉCNICA DO MABA Para a realização da técnica do MABA, foi necessário padronizar o tempo de adição da solução reveladora (óxido-redução) solução de Alamar Blue. Em virtude do emprego de cepas diferentes (M. tuberculosis, M. avium e M. fortuitum),tempo de geração diferentes, detivemos a necessidade de implantar tempo de adição específico da solução de Alamar Blue para cada espécie testada. Para determinar a dia ideal de adição da solução de Alamar Blue, realizamos cultura das referidas cepas em placas de 96 Wells, na diluição de 1:25 a partir da escala nº1 de Mac-Farland. A partir de 24 horas de incubação adicionamos 25µL da solução de MABA na coluna A, novamente incubamos e realizamos a leitura após 24 horas.Para os testes negativos adicionamos 25µL de solução de Alamar Blue na coluna B e incubamos por mais 24 horas, sucessivamente até a determinação do ponto de viragem da solução de Alamar Blue para a coloração rosa (Vide anexo:Método 06) Tabela II – Padronização do tempo de leitura da técnica do MABA para as cepas de M.tuberculosis, M.avium e M.fortuitum. Período de Incubação (Tempo em dias) M. tuberculosis M. avium M. frotuitum 1º - - - 2º - - - 3º - - + 4º - + + 5º + + + Vinícius Pereira Arantes 36 A tabela apresenta o tempo de incubação necessário para adição da solução reveladora nas placas. Para o M.tuberculosis foram realizadas no quinto dia de incubação, quarto dia para M.avium e terceiro dia para M. fortuitum. 5. RESULTADOS Os resultados apresentados seguem a faixa de corte preconizada por COLLINS & FRANZBLAU, (1997) como sendo de 200ug/mL. Todos os testes foram realizados em triplicata. Tabela III: Determinação da CIM de extratos vegetais, empregando-se o M. tuberculosis H37Rv ATCC 27294 pela técnica do MABA. Planta Parte do vegetal Agente Extrator CIM (µg/ml) 1. Ananas ananassoides Folhas DCM 2000 2. Ananas ananassoides Folhas Metanol 2000 3. Byrsonima cinera Folhas Metanol 250 4. Byrsonima crassa Folhas Clorofórmio 62,5 5. Byrsonima crassa Folhas Etanólico 70% 2000 6. Byrsonima crassa Aéreas Clorofórmio 250 7. Byrsonima fagifolia Folhas Metanol 500 8. Cissus suscicaulis Folhas Clorofórmio 62,5 9.Curatella americana Cascas Clorofórmio 62,5 10.Davilla elliptica Folhas DCM 2000 11.Eriocaulon ligulatum Escapos Clorofórmio 500 12.Leiothrix flavescens Escapos Clorofórmio 62,5 13.Mouriri pusa Folhas DCM 2000 14.Mouriri pusa Folhas Metanol 2000 15.Quassia amara Cascas DCM 62,5 16.Solanum cernuum Folhas DCM 500 17.Strychnos pseudoquina Folhas Metanol 70% 2000 18.Strychnos pseudoquina Folhas DCM 125 19.Syngonanthus artrothichus Escapos DCM 62,5 20.Syngonanthus bissulcatus Capitulo Etanólico 4000 21.Syngonanthus macrolepsis Escapos DCM 500 22.Syngonanthus macrolepsis Escapos Clorofórmio 62,5 23.Syngonanthus xerantemoides Escapos Etanólico 1000 24.Syngonanthus xerantemoides Capitulos Etanólico 70% 4000 25.Syngonanthus xerantemoides Capitulos Etanólico 70% 4000 26.Turnera ulmifolia Flores Hexano 250 27.Turnera ulmifolia Folhas DCM 500 Os resultados apresentados pelos extratos 04, 08,09,12,15,18,19 e 22 são promissores apresentando valores de CIM inferior a 200ug/ml. Vinícius Pereira Arantes 37 A tabela IV apresenta os Concentração Inibitória Mínima (CIM), de extratos Vegetais, frente a cepa padrão de M. avium. Tabela IV: Determinação da CIM de extratos vegetais, empregando-se o M. avium ATCC 25291 pela técnica do MABA. Planta Parte do vegetal Agente Extrator CIM (µg/ml) 1. Ananas ananassoides Folhas DCM 2000 2. Ananas ananassoides Folhas Metanol 2000 3. Byrsonima cinera Folhas Metanol 500 4. Byrsonima crassa Folhas Clorofórmio 250 5. Byrsonima crassa Folhas Etanólico 70% 2000 6. Byrsonima crassa Aéreas Clorofórmio 500 7. Byrsonima fagifolia Folhas Metanol 1000 8. Cissus suscicaulis Folhas Clorofórmio 250 9.Curatella americana Cascas Clorofórmio 250 10.Davilla elliptica Folhas DCM 125 11.Eriocaulon ligulatum Escapos Clorofórmio 250 12..Leiothrix flavescens Escapos Clorofórmio 500 13.Mouriri pusa Folhas DCM 4000 14.Mouriri pusa Folhas Metanol 4000 15.Quassia amara Cascas DCM 62,5 16.Solanum cernuum Folhas DCM 250 17.Strychnos pseudoquina Folhas Metanol 70% 2000 18.Strychnos pseudoquina Folhas DCM 250 19.Syngonanthus artrothichus Escapos DCM 125 20.Syngonanthus bissulcatus Capitulo Etanólico 4000 21.Syngonanthus macrolepsis Escapos DCM 500 22.Syngonanthus macrolepsis Escapos Clorofórmio 125 23.Syngonanthus xerantemoides Escapos Etanólico 2000 24.Syngonanthus xerantemoides Capitulos Etanólico 70% 4000 25.Syngonanthus xerantemoides Capitulos Etanólico 70% 4000 26.Turnera ulmifolia Flores Hexano 125 27.Turnera ulmifolia Folhas DCM 62,5 Os resultados indicam que os extratos 10,15,19,22,26 e 27, são promissores apresentando atividade antimicobacteriana frente a cepa padrão de M.avium, apresentando valores de CIM inferior a 200ug/ml. Vinícius Pereira Arantes 38 A tabela V apresenta os Concentração Inibitória Mínima (CIM), de extratos vegetais, frente a cepa padrão de M.fortuitum. Tabela V: Determinação da CIM de extratos vegetais, empregando-se o M. fortuitum ATCC 6841pela técnica do MABA. Planta Parte do vegetal Agente Extrator CIM (µg/ml) 1. Ananas ananassoides Folhas DCM 4000 2. Ananas ananassoides Folhas Metanol 4000 3. Byrsonima cinera Folhas Metanol 1000 4. Byrsonima crassa Folhas Clorofórmio 4000 5. Byrsonima crassa Folhas Etanólico 70% 4000 6. Byrsonima crassa Aéreas Clorofórmio 500 7. Byrsonima fagifolia Folhas Metanol 4000 8. Cissus suscicaulis Folhas Clorofórmio 1000 9.Curatella americana Cascas Clorofórmio 4000 10.Davilla elliptica Folhas DCM 125 11.Eriocaulon ligulatum Escapos Clorofórmio 500 12.Leiothrix flavescens Escapos Clorofórmio 1000 13.Mouriri pusa Folhas DCM 4000 14.Mouriri pusa Folhas Metanol 4000 15.Quassia amara Cascas DCM 62,5 16.Solanum cernuum Folhas DCM 500 17.Strychnos pseudoquina Folhas Metanol 70% 4000 18.Strychnos pseudoquina Folhas DCM 500 19.Syngonanthus artrothichus Escapos DCM 500 20.Syngonanthus bissulcatus Capitulo Etanólico 4000 21.Syngonanthus macrolepsis Escapos DCM 1000 22Syngonanthus macrolepsis Escapos Clorofórmio 125 23.Syngonanthus xerantemoides Escapos Etanólico 4000 24.Syngonanthus xerantemoides Capitulos Etanólico 70% 4000 25.Syngonanthus xerantemoides Capitulos Etanólico 70% 4000 26.Turnera ulmifolia Flores Hexano 125 27.Turnera ulmifolia Folhas DCM 125 Os resultados indicam que os extratos 10,15,22,26 e 27, são promissores apresentando atividade antimicobacteriana frente a cepa padrão de M.fortuitum, apresentando valores de CIM inferior a 200ug/ml. Vinícius Pereira Arantes 39 Tabela VI apresenta a determinação da Concentração Mínima Inibitória dos extratos vegetais utilizados frente às cepas de M. tuberculosis , M. avium e M. fortuitum. Tabela VI- Determinação da Concentração Mínima Inibitória para as cepas de M. tuberculosis, M.avium e M. fortuitum Planta CIM (µg/ml) M.tuberculosis CIM (µg/ml) M. avium CIM (µg/ml) M. fortuitum 1. Ananas ananassoides 2000 2000 4000 2. Ananas ananassoides 2000 2000 4000 3. Byrsonima cinera 250 500 1000 4. Byrsonima crassa 62,5 250 4000 5. Byrsonima crassa 2000 2000 4000 6. Byrsonima crassa 250 500 500 7. Byrsonima fagifolia 500 1000 4000 8. Cissus suscicaulis 62,5 250 1000 9.Curatella americana 62,5 250 4000 10.Davilla elliptica 2000 125 125 11.Eriocaulon ligulatum 500 250 500 12.Leiothrix flavescens 62,5 500 1000 13.Mouriri pusa 2000 4000 4000 14.Mouriri pusa 2000 4000 4000 15.Quassia amara 62,5 62,5 62,5 16.Solanum cernuum 500 250 500 17.Strychnos pseudoquina 2000 2000 4000 18.Strychnos pseudoquina 125 250 500 19.Syngonanthus artrothichus 62,5 125 500 20.Syngonanthus bissulcatus 4000 4000 4000 21.Syngonanthus macrolepsis 500 500 1000 22.Syngonanthus macrolepsis 62,5 125 125 23.Syngonanthus xerantemoides 1000 2000 4000 24.Syngonanthus xerantemoides 4000 4000 4000 25.Syngonanthus xerantemoides 4000 4000 4000 26.Turnera ulmifolia 250 125 125 27.Turnera ulmifolia 500 62,5 125 Dentre os extratos que apresentaram atividade antimicobacteriana, devemos destacar os extratos de número 15 e 22 que apresentaram CIM inferior a 200 µg/ml para as três cepas analisadas. Vinícius Pereira Arantes 40 6. DISCUSSÃO Apesar da terapia antituberculosa datar de 50 anos atrás, o M. tuberculosis continua sendo um problema de saúde pública mundial. Acredita-se que 1,7 bilhões de pessoas em todo o mundo foram infectados em 1990 (PARRY & DAVIES,1996; PENNA,1998). A inconsistente eficácia da vacina do Bacillus Calmette Guerin (BCG), o aumento dos casos de AIDS/tuberculose e desencadeamento de cepas resistentes, formam um dos pilares que esclarecem os elevados índices (COOK,1991;PENNA,1998;ABBOT & SMITH,1981). No Brasil foi possível detectar fatores de risco, tais como a redução da eficiência do Programa de Controle da Tuberculose (PCT), o uso incorreto da medicação, abandono ao tratamento, utilização abusiva de álcool e baixo nível de escolaridade (FREEDMAN & CASADEVALL, 1998; NATAL & ELIAS, 2000; MELO et al.,1996; MELO et al.,2000; OMS,1987). O contexto entre sensibilidade e resistência de micobactérias aos diferentes antimicrobianos e a constante evolução da resistência ( SNIDER & CASTRO, 1998) pode-se dizer que os antimicrobianos que dispomos para a terapêutica estão fadados aos dialetos históricos.Provavelmente no futuro encontraremos que medicamentos como INH,RMP e PZA foram úteis ao tratamento da tuberculose e outras micobacterioses, ou ainda que são insuficientes para tratar um paciente com doença similar a Tuberculose ou ainda pelas causas inúmeras de processos infecciosos causados por MOTT (GARCIA, 1986; BARRETO et al.1994;WHO,1996;WAYNE & KUNBICA,1986; RODRIGUES et al.,2003) O conhecimento entre pesquisadores é que se faz necessário a pesquisa de novos medicamentos para o tratamento da Tuberculose e outras doenças Vinícius Pereira Arantes 41 causadas por micobatérias. A pesquisa por substâncias ativas contra micobactérias e por sua vez menos tóxicas, tem motivado e empenhado pesquisadores na busca de soluções para o tratamento da tuberculose que desde a antiguidade vem dizimando populações.Os medicamentos chamados fitoterápicos expressam o estudo por substâncias oriundas de plantas na necessidade da introdução de novos fármacos (ANDRADE et al.,1994; BELICKAS,1994; CUNHA et al.,1994; KUBO,1993; RAMAKERS et al.,1994) Neste estudo, extratos apolares de Byrsonima crassa, Cissus suscicaulis, Curatella americana, Leiothrix flavescens, Quassia amara, Strychnos pseudoquina, Syngonanthus artrothicus, e Syngonanthus macrolepsis apresentaram atividade contra a cepa padrão de M. tuberculosis CIM inferior a 200µg/ml. Para M.avium , valores de CIM inferior a 200µg/mL foram verificados para os extratos apolares de Davilla elliptica, Quassia amara, Syngonanthus artrothichus, Syngonanthus macrolepsis, Turnera ulmifolia. Para M. fortuitum valores de CIM inferior a 200µg/mLforam encontrados apenas nos extratos apolares de Davilla elliptica, Quassia amara, Syngonanthus macrolepsis, e Turnera ulmifolia . Para as mesmas plantas analisadas, utilizando agentes extratores polares (etanólico 70%), foram verificados CIM superiores a 200 µg/m. A elevada concentração de lipídios de alto peso molecular presente na parede de micobactérias provavelmente funcionou como uma barreira para os compostos polares,justificando os valores mais promissores para os extratos apolares (RODRIGUES et al.,2003; TOSSI & ELLNER,1998). Os componentes ativos, extraídos pelos extratores apolares, sendo compostos lipofílicos provavelmente puderam permear mais facilmente a barreira lipídica presente na parede das micobactérias. Vinícius Pereira Arantes 42 Pelos dados da Tabela VI, é verificado que M. tuberculosis apresentou maior sensibilidade aos extratos quando comparado ao M. avium e ao M. fortuitum. Para os extratos de Byrsonima crassa, Curatella americana, Leiothrix flavescens, Strychnos pseudoquina, Syngonanthus artrothichus e Syngonanthus macrolepsis, valores crescentes de CIM foram verificados seqüencialmente para M.tuberculosis, M.avium e M.fortuitum. Este aumento era esperado em virtude da menor rigidez da parede do M.tuberculosis quando comparada à de outras duas espécies ( TOSSI & ELLNER, 1998). O M. fortuitum é caracterizado como sendo o mais resistente e o M. avium como de resistência intermediária (AL-HAJJAJ et al.,2001) A Tabela VI, pode-se verificar também que extratos apolares de Davilla elliptica, Turnera ulmifolia apresentaram atividade contra M.avium e M, fortuitum, não foram efetivos para M. tuberculosis, fato que também poderia ser justificado pela diferença na constituição da parede entre as espécies analisadas.Entretanto devemos salientar que extrato apolares de Quassia amara e Syngonanthus macrolepsis foram ativos numa CIM inferior a 200µg/mL para as três cepas estudadas. Alguns constituintes químicos como os terpenóides, flavonóides, taninos, cumarinas, glicosídeos, terpenos, poliacetilenos, e alcalóides também tem sido estudados quanto a sua atividade antimicrobiana ( CECHINEL FILHO & YUNES,1998; CANTRELL et al.,2001). Os terpenóides são chamados de inseticidas naturais, dentre esta classe integram os limonóides, limoneno e o mirceno, desempenhando um papel de proteção às plantas contra a ação de insetos. Alguns terpenóides já foram testados e apresentaram atividade contra micobactérias (CANTRELL et al., Vinícius Pereira Arantes 43 2001). Os terpenos são formados por unidades básicas de isopentenil- pirofosfato ou isopreno ativo, originando os triterpenos e os sesquiterpenos já citados na literatura como substâncias dotadas de ação bactericida (PIETRO et al.,2000; JANUARIO et al., 2002). Os flavonóides constituem um grande grupo de pigmentos vegetais de ampla distribuição na natureza, detêm presença abundante em plantas, desperta segurança e proteção aos vegetais contra a ação nociva de infecções bacterianas, fúngicas e até mesmo como agente protetor contra a ação dos raios ultravioleta e atração de polinizadores (BRUNETON,1993; PELLETIER,1983). Os taninos são polifenóis, associados na medicina popular para o tratamento de diversas patologias orgânicas tais como, diarréia, feridas, queimaduras, gastrite, úlcera gástrica, hemorragias, problemas renais e sistema urinário e processos inflamatórios (BEARTet al., 1985) As Cumarinas são amplamente distribuídas nos vegetais, mas também podem ser encontradas em fungos e bactérias, estruturalmente são lactonas (EVANS,1996). A atividade farmacológica das cumarinas depende principalmente de seus padrões de substituições. O dicumarol (uma cumarina modificada) na medicina é utilizada como substância de atividade anticoagulante, a escoparona (curamina modificada) apresenta atividade imunossupressora e relaxante vascular e algumas xantonas possuem atividade antimicrobiana) contra o Mycobacterium tuberculosis. Outras substâncias ainda pouco estudadas são citadas em alguns artigos científicos, são os chamados fitóis, um grupo de compostos que pouco interessam ao estudo químico por não apresentarem diretamente importância para a síntese orgânica, mas estão Vinícius Pereira Arantes 44 também presentes em algumas plantas contidas neste trabalho ( HARDMAN & LIMBIRD, 1996; GHOSAL & CHAUDHURI,1975). As plantas do gênero Byrsonima , possuem em sua constituição uma quantidade razoável de compostos derivados de Flavonóides, dentre eles os triterpenos (TEIXEIRA & MACHADO,2000). Estudos realizados anteriormente determinaram a existência de atividade antibacteriana, antifúngica e antiprotozoário. Os gêneros Ananás, Cissus, Eriocaulon, Leiothrix, Mouriri, Quassia, Solanum, Strychnos, Syngonanthus, Turnera. São extratos promissores, e escolhidos neste trabalho por serem citados na literatura com algum emprego na medicina popular para causas infecciosas e o presente tem o intuito de estudar a possível ação antimicobacteriana. A pesquisa de novas drogas está intimamente ligada a métodos analíticos que proporcionem a detecção de compostos ativos contra bactérias. Diferentes técnicas são atualmente utilizadas, dentre elas talvez a mais conhecida é a diluição de extratos em tubos contendo meios sólidos, técnica de reprodutibilidade fácil, porém de determinação tardia onde para conseguirmos realizar a leitura são necessários no mínimo quatro a oito semanas de incubação(BRASIL.Ministério da Saúde,2002). Outro fator negativo é a necessidade de grandes volumes de extrato (que são incorporados no meio sólido). O problema se agrava quando são utilizados meios com ovos como o LJ e o Ogawa, pois os extratos são adicionados antes da fase de coagulação do meio, ocasionando aquecimento dos extratos. Caso haja presença de compostos termolábeis, pode ocorrer alteração da estrutura química com inativação dos princípios ativos (SIDDIQI et al., 1993). Métodos mais novos como o sistema BACTEC e o MGIT são empregado na determinação de Vinícius Pereira Arantes 45 sensibilidade para micobactérias frente a novos compostos, porém as metodologias apresentam elevado custo e necessita de leitores especializados (SIDDIQI et al., 1993). O BACTEC é muito empregado na determinação de sensibilidade para micobactérias frente a novos compostos, porém a metodologia apresenta elevado custo e necessita de leitor semi-automatizado, além de ser método radiométrico envolvendo riscos operacionais. O MGIT também é técnica revolucionária na análise de perfil de sensibilidade, porém apresenta elevado custo e indicador radiométrico, impossibilitando o seu emprego rotineiramente no estudo de compostos novos (SIDDIQI et al., 1993). A metodologia do MABA empregada neste trabalho oferece inúmeras facilidades, frente às outras técnicas tradicionais, por apresentar fácil manejo, reprodutibilidade dos resultados e baixo custo. Sendo uma microtécnica, a quantidade de extrato utilizada no MABA é bem inferior as demais. Outras vantagens que podem ser citadas são : menor tempo de espera, não alterar a constituição dos componentes termolabeis e possibilita avaliar concentrações múltiplas e diversos extratos simultaneamente (FRANZBLAU et al.,1998) A metodologia do MABA, foi empregado neste trabalho para os testes com extratos vegetais utilizando cepa padrão de M. tuberculosis, M. avium M. fortuitum. Para determinar a atividade de substâncias naturais contra o M. tuberculosis já é preconizando a incubação de 05 dias para adição da solução de Alamar Blue (FRANZBLAU et al., 1998). Porém para o emprego das cepas de M.avium e M. fortuitum foi necessário uma padronização em virtude do tempo de geração destes microrganismos, ser diferente comparado ao M.tuberculosis. Assim , foi definido neste trabalho a aplicação do revelador Vinícius Pereira Arantes 46 Alamar Blue após incubação de 04 dias para M. avium e 03 dias para M. fortuitum (Anexo: Método 06). Os estudos mostraram a viabilidade da utilização do MABA mesmo para as micobactérias de crescimento rápido como M.fortuitum , possibilitando estudo de novas drogas para as MOTT, que mesmo pertencendo ao gênero Mycobacterium, apresentam sensibilidade diferenciada em relação ao M.tuberculosis. Ainda citamos sobre a metodologia do MABA a reprodução fácil dos resultados, rapidez, confiabilidade, baixo custo e rentabilidade na comparação e obtenção dos referidos CIM apresentados. A metodologia do MABA foi facilmente empregada e adaptada a este trabalho já que a presença de crescimento de microrganismos e períodos de incubação foi facilitada, propicia emprego de vários extratos, facilitando a comparação entre os diferentes CIM. O emprego de compostos apolares não exclui a atividade de extratos polares. A proposta deste trabalho é analisar se a presença de compostos solúveis e carreados pelos agentes extratores apolares que possam conferir melhor atividade antimicobacteriana. Assim como parte das plantas testadas, flores, folhas, escapos, cascas, capítulos podem apresentar compostos ativos. Porém neste trabalho salientamos que para a espécie M. tuberculosis, só detivemos atividade antimicobacteriana (CIM inferior a 200µg/mL) utilizando agentes extratores apolares. Os agentes extratores polares como etanólico 70% detivemos CIM superiores a 200 µg/mL. Para as cepas de M.avium e M.fortuitum repetimos a boa atuação dos extratos apolares e onde foram empregados agentes extratores de baixa polaridade, perfazendo a justificativa de que compostos lipofílicos possam permear mais facilmente a barreira lipídica presente na parede das micobactérias. Vinícius Pereira Arantes 47 7.0 CONCLUSÃO • A técnica do MABA utilizada neste trabalho, confirma o fácil manuseio da metodologia, sua real reprodutibilidade e a fácil comparação entre os resultados entre as três cepas padrão do gênero Mycobacterium que foram submetidas aos testes. • A técnica de microdiluição é uma técnica que pode ser facilmente empregada para avaliar um grande número de extratos. • Os extratos apolares apresentaram melhor CIM, justificando e comprovando a importância de utilização de agentes extratores apolares, na obtenção de compostos lipofílicos. • A cepa de Mycobacterium tuberculosis apresenta sensibilidade maior a alguns extratos, em relação às cepas de Mycobacterium avium e Mycobacterium fortuitum. • Podemos concluir que a atividade de CIM utilizando a cepa de Mycobacterium tuberculosis,apresentou menores CIM os extratos do gênero: Byrsonima, Cissus, Leiothrix, Quassia, Strychnos, Syngonanthus. E por sua vez os agentes extratores utilizados foram Clorofórmio e Diclorometano. • Os CIMs referentes a cepa de Mycobacterium avium , são atribuídos aos gêneros : Davilla, Quassia, Syngonanthus, Turnera. Os agentes extratores utilizados foram: Diclorometano, Clorofórmio e Hexano. Vinícius Pereira Arantes 48 • Os CIMs referentes a cepa de Mycobacterium fortuitum, são atribuídos aos gêneros: Davilla, Quassia, Syngonanthus, Turnera. E os agentes extratores utilizados são: Diclorometano, Clorofórmio e Hexano. • Neste estudo foi possível comprovar que os extratos polares, não apresentaram efeito antimicobacteriano e conseqüentemente CIM desfavorável e superior a 200µg/ml. Um exemplo é que em todas os extratos de Syngonanthus macrolepsis, obtido com agente extrator etanólico não apresentou efeito de CIM inferior a 200µg/ml, porém com a utilização de clorofórmio como agente extrator foi apresentado CIM , inferior a 200µg/ml. Comprovando a necessidade do estudo de extratos apolares. Vinícius Pereira Arantes 49 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS: ABBOT,M.R.; SMITH,D.D. Mycobacterial infections in immunocompromised patients. Med. J. Aust., V.1 , p. 351- 353, 1981. ALCAIDE, F.; RICHTER, I.; BERNASCONI, C.; SPRINGER, B.; HAGENAU, C.; SCHULZE-RÖBBECKE, R.; TORTOLI, E.; MARTÍN, R.; BÖTTGER, E. C. and TELENTI, A. Heterogeneity and clonality among isolates of Mycobacterium kansasii: Implications for epidemiological and pathogenicity studies. Journal of Clinical Microbiology. V. 35, nº 8, august, p. 1959-1964,1997. AL-HAJJAJ, M.S.; AL-KASSIMI, F.A. AL- MOBEIREEK, A.F.ALZEER, A.H. Progressive rise of Mycobacterium tuberculosis resistance and streptomycin in Riyadh, Saudi Arabia. Respirology, V.6, n.4, p.317-322, Dec. 2001. AMERICAN THORACIC SOCIETY AND CENTERS FOR DISEASE CONTROL. Diagnostic standards and classification of tuberculosis. Am. Rev. Resp. Dis. , New York, v. 142, n. 3, p. 725-35, 1990. ANDRADE,F.J.L.;MELO DINIZ,M.F.F.;OLIVEIRA,R.A.G. Plantas que atuam no trato respiratório. In: Simpósio de Plantas Medicinais do Brasil,13 Fortaleza, Ceará. Anais.1994 BARBER, T. W.; CRAVEN, D. E. and McCABE, W. Bacteremia due to Mycobacterium tuberculosis in patients with human immunodeficiency virus infection. A report of 9 cases and a review of the literature. Medicine, vol. 69, nº 6, 375-383.1991 BARRETO, A.M.W.; CAMPOS,C.E.D.; MARTINS,F.M.Manual de bacteriologia da tuberculose:Centro de referência Prof. Hélio Fraga.2ed. Rio de Janeiro: Guanabara, 115p 1994. Vinícius Pereira Arantes 50 BEART,J.E.;LILLEY,T.H.;HASLAM,E. Plant polyphenols –secondary metabolism and chemical defence: some observations. Phytochemistry, V.24,p-33-38, 1985. BÉLICkAS,T.A saúde que vem das plantas.Jornal da Unesp, n. 89 , p 6 – 7, 1994 BENETUCCI, J. A.; BOUZA, J. .; COMPAGNUCCI, M. A.; CORTI, M.; ORTEGA, G.; BAJA, C. D.; LONARDO, M. D.; MONTANDER, L. J. G. and ASTARLOA, L. La tuberculosis como infección oportunista en el SIDA. Infectologia y Microbiologia Clinica, vol. 4, nº 3, 61-66.1992 BILLO, N.E. Programa de controle da tuberculose nos tempos da infecção pelo HIV. In: Seminário interprogramas HIV/ tuberculose. Brasília, 1994.Anais. Fortaleza, p.25-29,1995. BLOOM, B. R. and SMALL, P. M. The envolving relation between humans and Mycobacterium tuberculosis. The New England Journal of medicine,vol. 338, nº 10, march, p. 677-678.1998. BOFFO, M.M.S.;MATTOS,I.G.;RIBEIRO,M.O.;NETO,I.C.O. Tuberculose associada à AIDS:características demográficas, clínicas e laboratoriais de pacientes atendidos em um serviço de referência do sul do Brasil.J. Bras. Pneumol. V.30(2), p. 141-146, 2004. BOLLELA,V.R.;SATO,D.N.;FONSECA,B.A.L. Problemas na padronização da reação em cadeia da polimerase para diagnóstico da tuberculose pulmonar.Rev. Saúde Pública.V.33(3), p-281-286,1999. BOSHOFF, H.I.M.; MIZRAHI,V. Expression of Mycobacterium smegmatis Pyrazinamidase in Mycobacterium tuberculosis Confers Hypersensitivity to Pyrazinamide and Related Amides.J. of Bacteriology. V.182 (19) , p.5479- 5485, 2000. Vinícius Pereira Arantes 51 BRASIL.Ministério da Saúde.Fundação Nacional de Saúde. Reunião de avaliação operacional e epidemiológica do programa Nacional de Controle da Tuberculose na década de 80. Bol. Pneum.Sanit. Número especial, Brasília,1993. BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Assistência à saúde. Divisão Nacional de Doenças Sexualmente Transmissíveis-SIDA/AIDS. Co-infecção TB/HIV/AIDS.Brasília, 1994. BRASIL. Ministério da Saúde. Fundação Nacional de Saúde. Plano Nacional de Controle da tuberculose.Brasília, DF, p.1-15,1999. BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Políticas de Saúde. Departamento de Atenção Básica. Manual técnico para o controle da tuberculose. Brasília, 2002, 64 p. (Cadernos de Atenção Básica no 6. série A. Normas e Manuais Técnicos, n. 148). BRUNETON,J. Pharmacognosie. Phytochimie. Plantes Medicinales. 2ed. Paris: Tec & Doc, 1993 BURMAN, W.J. The value of in vitro drug activity and pharmacokinetics in predicting the effectiveness of antimycobacterial therapy: a critical review. Am. J. Med. Sci., Philadelphia, v. 313, n. 6. p. 355-63, 1997. BUX-GEWEHER, I; HAGEN, H. P.; RÜSCH-GERDES, S. and FEURLE, G. E. Fatal pulmonary infection with Mycobacterium celatum in na apparently immunocompetent patient. Journal of Clinical Microbiology,vol. 36, nº 2, feb., p. 587-588.1998 CALIXTO,J.B.;YUNES,R.A. Plantas Medicinais sob a ótica da moderna química medicinal.Editora Argos, Chapecó, 2001 CANTRELL, C. L.; FRANZBLAU, S. G.; FISCHER, N. H. Antimycobacterial plant terpenoids. Planta Med., v. 67, p. 1-10, 2001. Vinícius Pereira Arantes 52 CECHINEL FILHO,V.; YUNES,R.A. Estratégias para a obtenção de compostos farmacologicamente ativos a partir de plantas medicinais. Conceitos sobre modificação estrutural para otimização da atividade. Quim. Nova, v.21, n.1, p- 99 –105, 1998 CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION. Estimates of future global tuberculosis morbity and mortality. MMWR Morb. Mortal. Wkly Rep., Atlanta, v. 42, n. 49, p. 961-4, 1993. CHAISSON,R.E.;STOKIN,G. Tuberculosis and human immunodeficiency virus. J. Infect. Dis. V.159, p. 96-100, 1989. COHN, D.L.; BUSTREO, F.; RAVIGLIONE, M.C. Drug-Resistant tuberculosis: review of de worldwide situation and the WHO/ IUATLD Global Surveillance Project. Clin. Infect. Dis., Chicago, v. 24, p. S121-30, 1997, Supplement 1. COLLINS, L. A.; FRANZBLAU, S. G. Microplate Alamar Blue Assay versus BACTEC 460 System for high-throughput screening of compounds against Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium. Antimicrob. Agents Chemother , v. 41, n. 5, p. 1004-1009, 1997. CONVILLE, P. S. and WITEBSKY, F. G. Variables affecting results of sodium chloride tolerance test for identification of rapidly growing mycobacteria. Journal of Clinical Microbiology,vol. 36, nº 6, june, p. 1555-1559,1998 COOK, G. C. Immunosuppression and Mycobacterium sp infection. Quaterly Journal of medicine, New Series,february, 78, nº 286, p. 97-99.1991 COOPER, A.M.; DALTON, D., STEWART A.; GRIFFIN, J. ; RUSSEL, D.; ORME, I. Disseminated tuberculosis in interferon-gamma gene-disrupted mice. J. Exp. Med., p. 2243-2247, 1993. Vinícius Pereira Arantes 53 COWAN, M. M. Plant products as antimicrobial agents. Clin. Microbiol. Rev., v. 12, n. 4, p. 564-582, 1999. CORTINAS, M.N.; FERNANDEZ, M.; VALETA. M.I.; URIARTE, M.R.;MOGDASY,M.C.Caracterización genotipica de 80 cepas Del género Mycobacterium en Uruguay.Rev Med Uruguay.;V18, p.230-238,2002. COSTALLAT, L. F.; DE CASTRO, A. F. P.; RODRIGUES, A. C. and RORIGUES, F. M. Examination of soils in the Campinas rural area for microorganisms of the Mycobacterium avium-intracellulare-scrofulaceum complex. Australian Veterinary Journal,vol. 53, july, 349-350.1977. CUNHA,G.M.A.; VIANA.G.S.B.; RAO,V.S.N.; MAFEZOLI,J.; OLIVEIRA,M.C.F.; LIMA,M.A.S.; SILVEIRA,E.R. Atividade antimcrobiana de oleos essenciais de espécies de Cróton e Psidium. In: Simpósio de Plantas Medicinais do Brasil,13, Fortaleza, Ceará, Anais.1994 DABORN, C. J.; GRANGE, J. M. and KAZWALA, R. R. The bovine tuberculosis cycle-an African perspective. Journal of Applied Bacteriology Symposium Supplement,81, 27S-32S.1996. DALCOMO M.P.; FORTES A , MOTTA R.M.; BARRETO, A M.W. GERHARDT, F.G. Retrospective analysiss of multidrug resistant tuberculosis (MDRTB) cases treatment. Am.J. Respir. Crit. Care med, v.157 n.3,1998. DANNENBERG, A.M. Immunopathogenesis of pulmonary tuberculosis. Hosp. Pract.,v.28, p. 33-40, 1993. DAVID, H.; LEVY-FREBAULT, V. and THOREL, M. F. Méthodes de laboratoire pour mycobactériologie clinique. Institut Pasteur, Paris. 85p. 1989 Vinícius Pereira Arantes 54 DELABIE, J.; WOLF-PEETERS, C.; BOBBAERS, H. BILBE, ,G. and DESMET, V. J. Immunophenotypic analysis of histiocytes involved in AIDS-associated Mycobacterium scrofulaceum infection: Similarities with lepromatous lepra. Clinical Exp. Immunology,85: 214-218.1991. DINIZ, L.S.; GERHARDT,G.; MIRANDA,J.A.; MANCEAU,J.N.Efetividade do tratamento da tuberculose em oito municípios de capitais brasileiras.Bol. Pneum. Sanit. V.3, p. 8-18, 1995 DI STASI,L.C.Plantas medicinais:arte e ciência. Um guia de estudo interdisciplinar. Editora Unesp, São Paulo, 1996. DOLIN, P.J.; RAVIGLIONE, M.C.; KOCHI,A. Global tuberculosis incidence and mortality during 1990-2000. Bull World Health Organization, Genebra, v. 72, n. 2, p. 213-20, 1994. ELLNER, J. J.; GOLDBERGER, M. J. and PARENTI, D. M. Mycobacterium avium infection and AIDS: A therapeutic dilemma in rapid evolution. The Journal of Infectious Diseases,163: 1326-1335.1991 EVANS,W.C. Trease and Evan’s Pharmacognosy.London: WB Saunders, 14 ed. 1996. FAIRCHILD, A. L. and OPPENHEIMER, G. M. Public health nihilism vs pragmatism: History, politics and the control of tuberculosis. American Journal of Public Health,vol. 88, nº 7, 1105-1117.1998 FALKINHAM III, J. O. Epidemiology of infection by nontuberculous mycobacteria. Clinical Microbiology Reviews,vol. 9, nº 2, april, 177- 215.1996. FALKINHAM III, J. O. Transmission of mycobacteria. In GANGADHARAM, P. R. J. and JENKINS, P. A. Mycobacteria vol. I Basic aspects.178-209, 400pp.1998. Vinícius Pereira Arantes 55 FIGUEROA, M.L.; LOPEZ,V.C.S. Descripción de la resistência adquirida Del Mycobacterium tuberculosis a los antibióticos contra la tuberculosis en Bogotá entre octubre de 1996 y diciembre de 2000. Calle, V.13, p.32-69, 2000 FIUZA DE MELLO, F.A.; AFIÚNE,J.B.Transmissão e imunopatogenia da tuberculose. J. Pneumol., Porto Alegre, v.19. n.1, p. 19-24, 1993 FRANZBLAU, S. G.; WITZIG, R. S.; McLAUGHLIN, J. C.; TORRES, P.; FUENTES, P.; COOK, M. B.; MADICO, G.; HERNANDEZ, A.; DEGNAN, M. T.; QUENZER, V. K.; FEERGUSON, R. M.; SHEEN, P.; GILMAN, R. H. Rapid, low- technologiy MIC determination with clinical Mycobacterium tuberculosis isolates by using the Microplate Alamar Blue Assay. J. Clin. Microbiol., V. 32, n. 2, p. 362-366, 1998. FREEDMAN, A.G.; CASADEVALL, A. Serum Therapy for Tuberculosis Revisited: Reappraisal of the Role of Antibody-Mediated Immunity against Mycobacterium tuberculosis. Clin. Microbiol. Reviews.V.11,n.3,p.514-532, 1998. FREIRE, D. N. Tuberculose In AMATO NETO, V. ; BALDY , J. L. S. Doenças Transmissíveis, 3a ed., rev. e ampl., São Paulo, SARVIER,p. 845-868.; 929pp.1989 GANGADHARAM, P.R.J. Resistance in Tubercle bacilli. In: GANGADHARAM, P.R.J.; JENKINS, P.A. Mycobacteria. I. Basic aspects. New York: Chapman & Hall, V.1, p.72, 1998. GARCIA,J.T. Manual da Sociedade Européia de Micobacteriologistas. Micobacteriologia Clínica e de Saúde Pública. Lisboa: Instituto Nacional de Saúde “Dr. Ricardo Jorge”, 98p 1986 Vinícius Pereira Arantes 56 GARCIA GARCIA, M. L.; GÓMEZ, J. L. V.; SANCHO, M. C. G.; ÁLVAREZ, R. A. S.; ZACARÍAS, F. and AMOR, J. S. Epidemiology of AIDS and tuberculosis. Bulletin of PAHO, 29(1), p. 37-57.1995. GHOSAL,S.;CHAUDHURI,R.K. Chemical constituents of Gentianaceae. Antitubercular activity of xanthonas of Canscora decussata Schuit. J. Pharm. Sci. V.64, p-888-889, 1975. GIAYETTO, V. O. and CABRERA, L. Isolation of Mycobacterium flavescens from na AIDS patient. Infectologia Y Microbiologia Clinica,vol. 6, nº 4, p. 130.1994 GOODFELLOW, M.; MAGEE, J.G. Taxonomy of mycobacteria. In: GANGADHARAM, P.R.J.; JENKINS, P.A. Mycobacteria I. Basic aspects. New York: Champman & Hall, p.1-71.1998 GRAHAM-JR, L.; WARREN, N. G.; TSANG, A. G. and DALTON, H. P. Mycobacterium avium Complex pseudobacteriuria from a Hospital water supply. Journal of Clinical Microbiology,vol. 26, nº 5, may, p. 1034- 1036.1988 GRANGE, J. M. Pathogenesis of mycobacterial disease. In GANGADHARAM, P. R. J. and JENKINS, P. A. Mycobacteria vol. I Basic aspects.145-175, 400pp.1998. GRINBAUM,R.S.; DAHER,M.; MEDEIROS,E.AS.; MENDONÇA,J.S.; BEU.M.F.; KUSANO,E.; TELLES,M.AS.; EUKI,S.Y.M. Infecção casuada por Mycobacterium tuberculosis com resistência primária a múltiplas drogas:relato de um caso em pacientes com AIDS. Ver. Ass. Med. Brasil., V. 41, p- 255 – 256, 1995 HARDMAN,J.G.;LIMBIRD,L.E. Gooldman e Gilman’s: The pharmacological basis of therapeutics. New York: Mac Graw-Hill, 9 ed, 1996 Vinícius Pereira Arantes 57 HART, C.A.; BEECHING, N.J.; DUERDEN, B.I. Tuberculosis into the next century. J. Med. Microbiol. V.44 p.1-34, 1996. HASS, W. H.; BUTLER, W. R.; WOODLEY, C. L. and CRAEFORD, J. T. Mixed –Linker Polymerase Chain Reaction: anew Method for rapid fingerprinting of isolates of the Mycobacterium tuberculosis Complex. Journal of Clinical Microbiology,vol. 31, nº 5, may, p. 1293-1298.1993. HAAS, H. and FATTAL, B. Distribution of mycobacteria in different types of water in Israel. Water res.,vol. 24, nº 10, p. 1233-1235.1990. HEIFETS, L. B. and JENKINS, P. A. Speciation of mycobacteria in clinical laboratories. In GANGADHARAM, P. R. J. and JENKINS, P. A. Mycobacteria vol. I Basic aspects. 308-350, 400p.1998. HIJJAR, A. M.; PROCOPIO, M.J.; OLIVEIRA, R.; TEIXEIRA, G.M. A tuberculose no Brasil e no Mundo. Bol. Pneumologia Sanitária., V.9, n.1, p.10, jul/dez 2001. HINOU,J.B.;HARVALA,C.E.;HINOU,E.B. Antimicrobial activity screening of 32 commos constituents of essential oils. Die Pharmazie, v.44, p. 302-303, 1989. HIRSCHMAN, S. Z. Mycobacterial infection in the AIDS era: Implications for infection control and employee health. The Mount Sinai Journal of Medicine, vol. 54, nº 4, september, 207-208.1990 HORSBURGH, C. R. Mycobacterium avium Complex infection in the acquired immunodeficiency syndrome. The New England Journal of Medicine,may, 9, p. 1332-1338,1991. Vinícius Pereira Arantes 58 HORSBURGH, C. R.; HAVLIK, J. A.; ELLIS, D. E.; KENNEDY, E.; FANN, S. A.;DUBOIS, R. E. and THONPSON, S. E. Survival of patients with acquired immune deficiency syndrome and disseminated Mycobacterium avium Complex infection with and without antimycobacterial chemotherapy. Am. Rev. Respir. Dis., 144: 557-559,1991 ISEMAN,M.D. Treatment of multidrug resistant tuberculosis.N. Engl. J. Med. V.329, p. 784-791, 1993 JANUÁRIO, A. H.; FILHO, E. R.; PIETRO, R. C. L. R.; KASHIMA, S.; SATO, D. N.; FRANÇA, S. C. Antimycobacterial physalins from Physalis angulata L. Phytother. Res., v. 16, n. 5, p. 445-448, 2002. JARDIM,P.C.R.;ZAMARIOLI,L.A.;COELHO,A.G.V.FIGUEIREDO,T.R.ROZMAN, M.A.Resistência do Mycobacterium tuberculosis às drogas no município de São Vicente.Rev.Inst.Adolfo Lutz. V.60,n.2,p.119-123,2001 JAWETZ, E.; MELNICK, J. L.; ADELBERG, E. A.; BROOCKS, G. F.; BUTEL, J. S. & ORNSTON, L. N. Microbiologia Médica, 21 ed., Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, p.223-229, 2000. KANTOR, I. M.; LAZLO, A. Tuberculosis laboratory procedures for developing countries. In: GANGADHARAM, P. R. & JENKINS, P. A. Mycobacteria. I Basic aspects. New York: Chapman & Hall,. p. 351-390. 1998. KENT, P. T. and KUBICA, G. P. Public health mycobacteriology a guide for the level III laboratory, Centers for Diseases Control, Atlanta,207pp,1985 KONEMAN, E.W.; ALLEN, S.D.; JANDA,W.M.; SCHRECKENBERGER, P.C.; WINN,W.C. Diagnóstico laboratorial de Microbiologia: texto e Atlas colorido. 5.ed. São Paulo: Editora Medsi, p. 941 –947, 2001. Vinícius Pereira Arantes 59 KRITSKI,AL.; DALCOMO,M.P.; BRAVO DE SOUZA,R.; HOLLANDA,T.; GONTIJO FILHO,P.P.;FIUZA DE MELO,F.A.Tuberculose entre profissionais de saúde. Risco ocupacional. J. Pneumol.,V.19,p 113- 121,1993 KUBO,I. Screening methods for antimicrobial agents from plants. S.n.t.,18p 1993. KUMAR, R.A.; PAUL,K.L.; INDULAKSHMI,R.; MANJU,Y.K.; KUMAR,K.V.; AYYAPPAN,P.; JOSHI,M.; MUNDAYOOR,S. Analysis of drug susceptibility in Mycobacterium tuberculosis isolated from Triruvananthapuram using Alamar Blue Assay.C.Science. V.80(1),p.70-72,2001. LEITE, C. Q. F.; BARRETO, A. M. W. and LEITE, S. R. A. Thin-layer chromatography of mycobactins and mycolic acids for the identification of clinical mycobacteria. Revista Microbiologia, São Paulo,26(3):192-199.1995 LEITE, C. Q. F.; TELAROLLI JR.,R.Aspectos epidemiológicos e clínicos da tuberculose.Rev.Ciênc. Farm.São Paulo, v.18, n.1,p.17-28,1997 LEITE, C. Q. F.; SOUZA, C. W. O. and LEITE, S. R. A. Identification of mycobacteria by thin layer chromatographic analysis of mycolic acids and conventional biochemical method: Four years of experience. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, nov./dec.vol. 93(6):801-805.1998 LEVY-FREBAULT, V. and DAVID, H. L. Mycobacterium kansasii: Contaminat du réseau d'eau potable d'un hôpital. Ver. Epidém. Et Santé Publ,31, 11- 20.1983 LIMA, R. J. ;MADI , K. Tuberculose na infância. Cultura médica. 2 ed. Rio de Janeiro, p17-26, 1988. Vinícius Pereira Arantes 60 LIU, Z. SHILKRET, K. L.; TRANOTTI, J.; FREUND, C. G. and FINELLI, L. Distinct trends in tuberculosis morbidity among foreign-born and US-born persons in New Jersey, 1986 through 1995. American Journal of Public Health,vol. 88, nº 7, july, p. 1064-1067.1998 LOURES, L.A.M. Epidemiologia da interação HIV/TB.In: Seminário Interprogramas HIV/Tuberculose. Brasília, 1994. Anais. Fortaleza, p. 39- 50,1995. MAcKENNA, M. T.; McCRAY, E.; JONES, J. L.; ONORATO, I. M. and CASTRO, K. G. The fall after the rise: Tuberculosis in the United States, 1991 trough 1994. American Journal of Public Health,vol. 88, nº 7, 1059- 1063.1998. MANZANO.J.R.; MANTEROLA.J.M.; AUSINA.V.; SAURET,J. Nomenclatura y clasificación de las micobacterias. Arch Bronconeumol.V34, p.154-157, 1998. MELO, F.A.F.; AFIUNE,J.B.;RIBEIRO,L.H.G.; CASTELO,A. A resistência primária do Mycobacterium tuberculosis num serviço ambulatorial de referência em São Paulo: evolução por três décadas e comparação com outros estudos nacionais. J. Pneumol. São Paulo, V. 1 p.3-7,1996 MELO, F.A.F; DE FELICE, E.A.A; SPADA, D.T.A.; AFIUNE, J.B.; CASTELO,A. Resistência primária do Mycobacterium tuberculosis em uma referência na cidade de São Paulo. Evolução por quatro décadas.J. Pneumol. São Paulo, V.26 (3), 2000. Vinícius Pereira Arantes 61 MUÑOZ, M.; RAYNAUD, C.; LANÉELLE, M. A.; JULIÁN, E.; MARÍN, L. M. L.; SILVE, G.; AUSINA, V. DAFFÉ, M. and LUQUIN, M. Seroreactive species- specific lipooligosaccharides of Mycobacterium mucogenicum sp. nov. (formerly Mycobacterium chelonae-like organisms): Identification and chemical characterization. Microbiology, 144: 137-148.1998 NATAL, S.;ELIAS,M.V. Projeto de Análise de Informação para Tuberculose. Bol. Pneumol. Sanit. V.8,n.1,p.15-22,2000 NASSOS, P. S.; YAKJO, D. M.; SANDERS, C. A. and HADLEY, W. K. Respiratory specimens from AIDS and non-AIDS patients in a San Francisco Hospital. Am. Rev. Respir. Dis.,143:66-68.1991 NEUMANN, M; SCHULZE-RÖBBECKE, R.; HAGENAU, C. and BEHRINGER, K. Comparison of methods for isolation of mycobacteria from water. Applied and Environmental Microbiology,vol. 63, nº 2, feb., p. 547-552.1997 OLIVEIRA, C.C.; SIQUIERA,J.M.; SOUZA,K.C.B.; RESENDE,U.M. Avaliação da atividade antibacteriana de extratos de plantas do cerrado. In: SIMPÓSIO DE PLANTAS MEDICINAIS DO BRASIL,13, Fortaleza, Ceará. Anais,1994. OMS. Organización Panamericana de Salud. Manual de los metodos y procedimientos para los programas integrados de tuberculosis. Washington. OPS Pub Cientif. n.489, 1987 PARRY, C. and DAVIES P. D. O. The ressurgence of tuberculosis. Journal of Applied Bacteriology Symposium Supplement,81, 23S-26S,1996 PELLETIER,S.W. The Nature and definition of an alkaloid. In: PELLETIER,S.W.. Alkaloids. Chemical and biological perspectives. New York: John Wiley. p- 131, 1983 PENNA,M.L.F.Tuberculose e AIDS.Net, abr. 1998. Disponível em:. Acesso em 16.02.2003 Vinícius Pereira Arantes 62 PICON,P.D.; GIUSTINA,M.L.D.; RIZZON,C.F.C.; BASSANESI,S.L.; ZANARDO,A.P.; MICHALCZUK,M.T.; RICARDI,L.R.Resultado do tratamento com estreptomicina, isoniazida e etambutol (esquema SHM).J. Pneumol.V.28 (4), p-187-192,2002. PIETRO, R. C. L. R.; KASHIMA, S.; SATO, D. N.; JANUÁRIO, A. H.; FRANÇA, S. C. In vitro antimycobacterial activities of Physalis angulata L. Phytomedicine, v. 7, n. 4, p. 335-338, 2000. POZNIAK, A. L.; UTTLEY, A. H. C. and KENT, R. J. Mycobacterium avium Complex in AIDS: Who, when, where, why and how? Journal of Applied Bacteriology Symposium Supplement,81, 40S-46S.1996 RAMAKERS,G.;NEUMANN,G.;MOREIRA LIMA,H.J. Estudo das plantas utilizadas como medicinais no estado do Ceará. In: Simpósio de Plantas Medicinais do Brasil, 13, Fortaleza, Ceará. Anais. 1994 RAYNAUD, C.; ETIENNE, G.; PEYRON, P. LANÉELLE, M. A. and DAFFÉ, M. Extracellular enzyme activies potentially involved in the pathogenicity of Mycobacterium tuberculosis. Microbiology, 144: 577-587.1998 RAVIGLIONE, M.C; DYE, C.; SCHMIDT, S.; KOCHI, A. WHO Global surveillance and monitoring project. Assessment of worldwide tuberculosis control. Lancet, London, v. 350, n. 9078, p. 624-9, 1997. ROBBINS,S.L.;COTRAN,R.S.;KUMAR,V. Patologia estrutural e functional.Guanabara Koogan. 5ed. Rio de Janeiro, p.286-288,1996. RODRIGUES, M.A.V.; ANDRÉ,M.C.D.P.B.; ALVES,S.L.; SOUZA,M.P.M.; KIPNIS,A.; SERAFINI,A.B. Identificação e teste de susceptibilidade a drogas de cepas de Mycobacterium tuberculosis isoladas de pacientes provenientes de hospital público de referência, Goiânia/GO. Rev Bras.Anal.Clinicas.V. 35(2), p.59-62,2003. Vinícius Pereira Arantes 63 ROSEMBERG,J. Tuberculose. In: Tarantino, A.B. Doenças Pulmonares. Guanabara Koogan. 3ed. Rio de Janeiro, 1990. ROXO, E. M. bovis como causa de zoonose. Revista Ciência Farmacêutica, São Paulo, 18(1): 101-108,1998. RUNYON, E.H. Mycobacteria encountered in clinical laboratories. Lepr. Briefs, V.9, p 21-23, 1958 SALTINI,C.; AMICOSANTE,M.; GIRARDI,E.; ANTONUCCI,G.; HIPÓLITO,G.; AMEGLIO,F.; MONNO,L.; CONGEDO,P.; ANGARANO,G.; BABUDIERI,S.; GUARALDI,G.; VISCO,G.; PICCOLELLA,E.; PAONE,G.; PALLOTTA,G.; BISETTI,A. Early abnormalities of the antibody response against Mycobacterium tuberculosis in Human Immunodeficiency Virus Infection. J. Infect. Dis., V.168, p 1409-1414, 1993 SANT’ANNA, C.C. Tuberculose na infância e na adolescência. São Paulo: Editora Atheneu, p. 1-15.2002 SANT’ANNA, C.C.; MOURGUES, L.V.; FERRERO,F.;BALANZAT, A M. Diagnóstico e terapêutica da tuberculose infantil- uma visão atualizada de um antigo problema.Jornal de Pediatria. V.78 n.2 p.205,2002 SCHECHTER, M.; MARANGONI, D.V. Doenças Infecciosas: conduta diagnóstica e terapêutica. Guanabara Koogan. 2ed. Rio de Janeiro, p301- 315,2001. SCHULZE-RÖBBECKE, R.; WEBER, A. and FISCHEDER, R. Comparison of decontamination methods of the isolation of mycobacteria from drinking water samples. Journal of Clinical Methods,vol. 14, p. 177-183.1991 SHEPPARD, D. S. A literatura médica brasileira sobre a peste branca: 1870- 1940.História, Ciência e Saúde – Manguinhos. V.3 n.1,p1-10 mar/jun 2001. Vinícius Pereira Arantes 64 SIDDIQI, S. H.; HEIFETS, L. B.; CYNAMON, M. H.; HOOPER, N. M.; LAZLO, A.; LIBONATI, J. P.; LINDHOLM-LEVY, P. J.; PEARSON, N. Rapid broth macrodilution method for determination of MICs for Mycobacterium avium isolates. J. Clin. Microbiol., v. 31, n. 9, p. 2332-2338, 1993. SNIDER, D. E. and CASTRO, K. G. The global threat of drug-resistant tuberculosis. The New England Journal of Medicine, vol. 338, nº 23, june, 1689-1690,1998. STOSÁREK, M.; KUBIN, M. and JARESOVÁ, M. Water-borne household infections due to Mycobacterium xenopi. Central European Journal of Public Health,vol. 1, nº 2, p. 72-80. 1993 STRATTON, C. W. Mycobacterial infections other than tuberculosis in the AIDS