UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE ENGENHARIA CÂMPUS DE ILHA SOLTEIRA CLEVERSON RODRIGUES ATIVIDADES BIOQUÍMICAS DE ISOLADOS AMAZÔNICOS DE TRICHODERMA, AÇÃO ANTAGÔNICA AO FUSARIUM BRASILIENSE E EFEITO BIOESTIMULANTE EM PLANTAS DE SOJA Ilha Solteira 2023 Campus de Ilha Solteira PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA CLEVERSON RODRIGUES ATIVIDADES BIOQUÍMICAS DE ISOLADOS AMAZÔNICOS DE TRICHODERMA, AÇÃO ANTAGÔNICA AO FUSARIUM BRASILIENSE E EFEITO BIOESTIMULANTE EM PLANTAS DE SOJA Tese apresentada à Faculdade de Engenharia de Ilha Solteira – Unesp como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Agronomia. Dr. André Rodrigues dos Reis Orientador Dra. Grace Queiroz David Peres Coorientadora Ilha Solteira 2023 FICHA CATALOGRÁFICA Desenvolvido pelo Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação Rodrigues, Cleverson. R696a Atividades bioquímicas de isolados amazônicos de Trichoderma, ação antagônica ao Fusarium brasiliense e efeito bioestimulante em plantas de soja / Cleverson Rodrigues. -- Ilha Solteira: [s.n.], 2023 142 f. : il. Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista. Faculdade de Engenharia de Ilha Solteira. Área de conhecimento: Sistemas de Produção, 2023 Orientador: André Rodrigues dos Reis Co-orientador: Grace Queiroz David Peres Inclui bibliografia 1. Bioprospecção. 2. Antagonismo. 3. Bioestimulante. 4. Microbioma. 5. Controle biológico. 6. Glycine max. Impacto potencial desta pesquisa A bioprospecção revela muitas potencialidades ainda desconhecidas ou ocultas aos olhos da ciência. A busca por novas ferramentas, que permitam melhorar os sistemas agrícolas e incrementar a oferta de alimentos, são de suma importância. Corroborando aos anseios e acordos de sustentabilidade, firmados entre as nações e pautados pelo Brasil em vários planos nacionais para uma agricultura racional e sustentável. Potential impact of this research Bioprospecting reveals many potentialities that are still unknown or hidden from the eyes of science. The search for new tools to improve agricultural systems and increase food supply is of paramount importance. Corroborating the sustainability aspirations and agreements, signed between nations, and guided by Brazil in several national plans for rational and sustainable agriculture. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA Câmpus de Ilha Solteira CERTIFICADO DE APROVAÇÃO TÍTULO DA TESE: AUTOR: CLEVERSON RODRIGUES ORIENTADOR: ANDRÉ RODRIGUES DOS REIS Aprovado como parte das exigências para obtenção do Título de Doutor em Agronomia, especialidade: Sistemas de Produção pela Comissão Examinadora: Prof. Dr. ANDRÉ RODRIGUES DOS REIS (Participação Virtual) Departamento de Engenharia de Biossistemas / Faculdade de Ciências e Engenharia - UNESP Prof. Dr. SERGIO MIGUEL MAZARO (Participação Virtual) Departamento de Agronomia / Universidade Tecnológica Federal do Paraná - UTFPR Profa. Dra. SOLANGE MARIA BONALDO (Participação Virtual) Instituto de Ciências Agrárias e Ambientais / Universidade Federal de Mato Grosso - UFMT Prof. Dr. FÁBIO FERNANDO DE ARAÚJO (Participação Virtual) Faculdade de Ciências Agrárias / Universidade do Oeste Paulista - UNOESTE Dra. MAYTHSULENE INÁCIO DE SOUSA OLIVEIRA (Participação Virtual) Departamento de Desenvolvimento Tecnológico / Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária - EMBRAPA Arroz e Feijão Ilha Solteira, 28 de agosto de 2023 Faculdade de Engenharia - Câmpus de Ilha Solteira – Av. Brasil Centro, 56, 15385000 www.feis.unesp.br/#!/ppga CNPJ: 48.031.918/0015-20. ATIVIDADES BIOQUÍMICAS DE ISOLADOS AMAZÔNICOS DE TRICHODERMA, AÇÃO ANTAGÔNICA AO FUSARIUM BRASILIENSE E EFEITO BIOESTIMULANTE EM PLANTAS DE SOJA DEDICO Dedico a todos aqueles que vieram antes de mim, juntamente a meus irmãos e meus pais Antônio Rodrigues e Ceverina Rozário. AGRADECIMENTOS Agradeço primeiramente a Deus por todas as bençãos e lições que me possibilitou durante mais essa jornada. Agradeço aos meus familiares, em especial a meus pais Seu Antônio e Dona Ceverina, cujos princípios e educação foram alicerce nesse período remoto do ceio familiar. Aos meus irmãos Cleber, Cléia e Fernando, meus cunhados Marisa e Marcelo, aos meus sobrinhos Caio Vitor, Carlos Eduardo, Camille Vitória e João Lucas, a vocês minha gratidão por todo apoio, que ao longo de uma vida acadêmica se fizeram presentes das mais diversas maneiras. Honro aqui todos os seres de luz que encontrei nesse caminho e os que trouxe comigo em pensamento, com esses compartilhei muitos momentos, experiências, anseios e angústias... muito obrigado meus amigos vocês foram importantes nesse processo. Em especial a minha amiga Nandhara Mendes que muito me auxiliou para a consolidação dessa pesquisa. Minha gratidão ao grupo de estudos em fisiologia agrícola - Gefa, grupo esse diverso, dedicado e comprometido com suas pesquisas e abordagens, na qual pude contar com a colaboração de todos durante as avaliações dos experimentos da segunda fase. Grato a minha coorientadora Grace, que sempre apoiou, encorajou e possibilitou muitas conquistas ao longo desse caminho. Agradeço a meu orientador André Rodrigues dos Reis, pela disposição, coragem, investimento e apoio desde o início do projeto, permitindo integrar os anseios do mundo agro com suas linhas de pesquisa. Agradeço muito a instituição pública que me possibilitou alcançar esta titularidade, por meio de seus servidores, que sempre foram solícitos a me atender tanto no Campus de Ilha Solteira como Tupã. O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) – Código de Financiamento 001. A todos o meu muito obrigado. Epígrafe “Na natureza, tudo está interligado e interdependente. A verdadeira arte da agricultura está em entender essas conexões e trabalhar em harmonia com elas" Ana Primavesi SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO GERAL ........................................................................................... 13 REFERÊNCIAS ........................................................................................................... 15 2 CAPÍTULO 1 - MECANISMOS DE AÇÃO E PAPÉIS FISIOLÓGICOS DE TRICHODERMA NO CONTROLE DE FITOPATÓGENOS E EFEITOS ESTIMULANTES NO CRESCIMENTO E RENDIMENTO DAS CULTURAS 17 2.1 INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 18 2.2 MECANISMOS DE AÇÃO DE BIOCONTROLE - MAB ........................................ 19 2.2.1 Competição .................................................................................................................. 20 2.2.2 Antibiose ..................................................................................................................... 21 2.2.3 Micoparasitismo .......................................................................................................... 22 2.3 COMPOSTOS DO METABOLISMO SECUNDÁRIO ............................................. 23 2.3.1 Compostos orgânicos voláteis - COVs ........................................................................ 29 2.3.2 Produção de enzimas ................................................................................................... 30 2.3.3 Produção de ácidos orgânicos, sideróforos e solubilização de fósforo ....................... 31 2.4 PROMOÇÃO DE CRESCIMENTO E ESTÍMULOS A MECANISMOS DE DEFESA VEGETAL ................................................................................................................... 34 2.5 INCREMENTOS E GANHOS DE PRODUTIVIDADE ........................................... 37 2.6 CONSIDERAÇÕES .................................................................................................... 37 REFERÊNCIAS .......................................................................................................... 38 3 CAPÍTULO 2 - PHOTOGRAPH REGISTRATION OF PETRI DISHES IN HIGH QUALITY AND IMAGE EDITING OF MICROBIOLOGICAL ASSAYS ......... 47 3.1 INTRODUCTION ....................................................................................................... 47 3.2 MATERIAL AND METHODS ................................................................................... 50 3.2.1 Necessaire material ..................................................................................................... 50 3.2.2 Procedures for the confection of the paper tube .......................................................... 50 3.2.3 Procedures for the making of the cellphone framework ............................................. 51 3.2.4 Making of the studio for the photographic registration ............................................... 52 3.2.5 High-Quality Photograph Register – PRHQ Protocol ................................................. 53 3.2.6 Image Editing with Powerpoint tools .......................................................................... 54 3.2 RESULTS AND DISCUSSION .................................................................................. 56 3.3 CONCLUSIONS ......................................................................................................... 61 REFERENCES ........................................................................................................... 62 4 CAPÍTULO 3 – TRICHODERMA: AÇÃO ANTAGÔNICA AO FUSARIUM BRASILIENSE, DETERMINAÇÃO DE ATIVIDADES BIOQUÍMICAS E COMPATIBILIDADE A PRODUTOS QUÍMICOS ............................................... 63 4.1 INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 65 4.2 MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................... 66 4.2.1 Isolados biológicos ...................................................................................................... 66 4.2.1.1 Obtenção dos isolados de Trichoderma spp. e F. brasiliense ..................................... 66 4.2.1.2 Identificação molecular dos isolados nativos de Trichoderma spp. ........................... 67 4.2.2 Antagonismo ............................................................................................................... 69 4.2.2.1 Pareamento de colônias .............................................................................................. 69 4.2.2.2 Produção de Compostos orgânicos voláteis (COV’s) ................................................. 71 4.2.3 Atividades bioquímicas ............................................................................................... 72 4.2.3.1 Atividade Quitinolítica ................................................................................................ 72 4.2.3.2 Atividade Celulolítica .................................................................................................. 73 4.2.3.3 Determinação de ácido indol acético (AIA) ................................................................ 73 4.2.3.4 Sideróforos .................................................................................................................. 74 4.2.3.5 Solubilização de P (Fosfatos de cálcio, alumínio e ferro) .......................................... 75 4.2.3.6 Solubilização de K ....................................................................................................... 76 4.2.4 Compatibilidade com fungicidas e herbicida .............................................................. 76 4.2.4.1 Teste de sensibilidade do Trichoderma spp. a fungicidas utilizados no tratamento de sementes (Ts) de soja ................................................................................................... 77 4.2.4.2 Teste de sensibilidade de Trichoderma spp. ao herbicida Glifosato ........................... 78 4.2.5 Registro fotográfico das placas de Petri ...................................................................... 80 4.2.6 Análises estatísticas ..................................................................................................... 80 4.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................. 80 4.3.1 Isolados biológicos ...................................................................................................... 80 4.3.1.1 Identificação molecular dos isolados nativos de Trichoderma spp. ........................... 80 4.3.2 Antagonismo ............................................................................................................... 80 4.3.2.1 Pareamento de colônias .............................................................................................. 80 4.3.3 Compostos Orgânicos Voláteis - COV’s ..................................................................... 83 4.3.4 Atividades bioquímicas ............................................................................................... 86 4.3.4.1 Atividade Quitinolítica e Celulolítica ......................................................................... 86 4.3.4.2 Produção de ácido indol acético (AIA) ....................................................................... 88 4.3.4.3 Sideróforos .................................................................................................................. 89 4.3.4.4 Solubilização de fósforo .............................................................................................. 90 4.3.4.5 Solubilização de potássio ............................................................................................ 93 4.3.5 Compatibilidade com moléculas químicas .................................................................. 94 4.3.5.1 Compatibilidade no Tratamento de sementes - Fungicidas ........................................ 94 4.3.5.2 Compatibilidade com Herbicida – Teste de Tanque .................................................... 96 4.4 CONCLUSÃO ............................................................................................................ 98 REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 99 5 CAPÍTULO 4 - POTENCIAL BIOESTIMULANTE DE TRICHODERMA NO CRESCIMENTO, DESEMPENHO FISIOLÓGICO E PRODUTIVIDADE DA SOJA .......................................................................................................................... 106 5.1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 107 5.2 MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................................... 108 5.2.1 Preparo do solo .......................................................................................................... 108 5.2.2 Preparo do inóculo .................................................................................................... 109 5.2.3 Multiplicação em fermentação sólida (arroz) ............................................................ 109 5.2.3.1 Inoculação de Trichoderma spp. no solo .................................................................. 110 5.2.4 Semeadura da soja ..................................................................................................... 110 5.2.4.1 Aplicação de Trichoderma spp. via foliar ................................................................. 111 5.2.5 Análises agronômicas ................................................................................................ 111 5.2.5.1 Altura parte aérea (cm) ............................................................................................. 111 5.2.5.2 Comprimento raiz (cm) ............................................................................................. 111 5.2.5.3 Massa seca da parte aérea e da raiz (g) ................................................................... 111 5.2.5.4 Número de nódulos e peso dos nódulos (g) ............................................................... 111 5.2.5.5 Número de vagens ..................................................................................................... 112 5.2.5.6 Produtividade por vaso (g) e o peso de 100 grãos (g) .............................................. 112 5.2.6 Análises fisiológicas .................................................................................................. 112 5.2.6.1 Pigmentos fotossintéticos .......................................................................................... 112 5.2.6.2 Malondialdeido (MDA) e Peroxido de hidrogênio (H2O2) ....................................... 112 5.2.6.3 Metabolismo antioxidante ......................................................................................... 112 5.2.6.4 Compostos nitrogenados ........................................................................................... 113 5.2.6.5 Indução de resistência ............................................................................................... 113 5.2.6.6 Proteínas de reserva .................................................................................................. 116 5.2.7 Teste de colonização radicular .................................................................................. 116 5.2.8 Análises estatísticas ................................................................................................... 117 5.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................... 117 5.3.1 Desenvolvimento vegetativo e nodulação ................................................................. 117 5.3.2 Pigmentos fotossintéticos .......................................................................................... 122 5.3.3 MDA e H2O2 e Enzimas antioxidantes ...................................................................... 123 5.3.4 Compostos nitrogenados ........................................................................................... 125 5.3.4.1 Teor de açúcar total em folhas e nódulos .................................................................. 126 5.3.5 Enzimas de indução de resistência e fitoalexina ....................................................... 127 5.3.6 Indicadores de produtividade e qualidade grãos ....................................................... 130 5.3.6.1 Qualidade bioquímica dos grãos produzidos ............................................................ 132 5.3.7 Correlação dos dados ................................................................................................ 133 5.4 CONCLUSÕES ......................................................................................................... 134 REFERÊNCIAS ....................................................................................................... 134 6 CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPECTIVAS ................................................ 140 13 1 INTRODUÇÃO GERAL No cenário agrícola atual os bioinsumos surgem como uma resposta inovadora e promissora aos desafios enfrentados pela produção sustentável de alimentos. Esses produtos, derivados de microrganismos benéficos, extratos vegetais ou compostos naturais, representam uma mudança na abordagem do manejo agrícola. Os bioinsumos oferecem uma alternativa aos agroquímicos tradicionais, ao proporcionar ações que vão desde o controle biológico de pragas e doenças até a promoção do crescimento das plantas e o aumento da resistência a estresses ambientais (Souza et al., 2022). O modelo agrícola, pautado em grades áreas de monocultivos e a crescente perda de eficácia dos fungicidas convencionais, contribuem para o aumento no número de doenças em plantas de interesse agrícola. A utilização contínua e intensiva dos mesmos princípios ativos, levou ao desenvolvimento de resistência por parte dos patógenos, reduzindo drasticamente sua capacidade de controlar muitas doenças, impactando diretamente as cadeias produtivas agrícolas (Carmona; Sautua, 2017). Na busca por estratégias para reverter essa problemática, a bioprospecção tem possibilitado a geração de tecnologias promissoras e potenciais para o segmento agrícola, buscando métodos que reduzam a dependência de agroquímicos e minimizem os impactos negativos no ambiente. O Brasil desponta em políticas e metas ambientais, que torna o sistema de produção de alimentos e recursos mais sustentáveis. O Plano Agricultura de Baixa Emissão de Carbono (Plano ABC+), que se concentra na redução das emissões de carbono através de práticas como plantio direto e integração lavoura-pecuária-floresta e o Plano Nacional de Bioinsumos (PNB), que promove a pesquisa e uso de insumos agrícolas de origem biológica, visando reduzir o uso de produtos químicos sintéticos, compartilham o objetivo de tornar a agricultura brasileira mais sustentável, e podem, em certos casos, complementar-se para promover sistemas agrícolas mais amigáveis ao ambiente (MAPA, 2023). Fortalecendo essa necessidade, na última década a indústria passou a investir e oferecer moléculas e tecnologias de natureza biológica, colocando em ascensão o segmento de produtos biológicos. Esses produtos têm demostrado ampla aptidão e abrangência, desde o controle de doenças até a promoção do crescimento e aumento produtivo das plantas; representando uma alternativa promissora aos agroquímicos convencionais (Soares, 2022). 14 Dentre os produtos biológicos, compostos por microrganismos como bactérias e fungos, o gênero Trichoderma têm se destacado devido à sua versatilidade e capacidade de interação com as plantas, tornando-se uma valiosa ferramenta para o manejo de doenças eficaz e sustentável. A incorporação de Trichoderma no manejo agrícola pode resultar em aumentos significativos na produtividade das culturas como soja (Chagas Junior et al., 2021), milho (Steffen et al., 2021), feijão (Peres, 2022), arroz (Eidt et al., 2020), trigo (Oliveira, 2017) e caupi (Santos et al., 2020). Além disso, a capacidade do Trichoderma em melhorar a resistência das plantas a estresses bióticos (causados por patógenos) e abióticos (como seca) amplifica ainda mais seu valor na agricultura. Cepas de Trichoderma possuem a capacidade produzir inúmeros metabólitos secundários (voláteis e não-voláteis), agindo como antibióticos ou enzimas hidrolíticas, capazes de inibir ou destruir propágulos de fungos, bactérias e nematoides fitopatogênicos, são descritos mais de 120 compostos em diferentes estruturas moleculares, tornando uma das fontes de maior diversidade metabólica do Reino Fungi (Harman, 2000; Hermosa et al., 2012, Monte et al., 2019). Atrelado ao seu arsenal metabólico, o Trichoderma também apresenta inúmeras enzimas, como as fosfatases que melhoram a disponibilidade de fósforo para as plantas, e a produção de ácido indolacético (AIA), que estimulam o crescimento das raízes e melhoram a eficiência do sistema radicular, aumentando a capacidade de absorção de água e nutrientes (Sood et al., 2020). O Trichoderma também desencadeia a produção de moléculas que promovem a resistência sistêmica adquirida nas plantas, fortalecendo suas defesas contra patógenos. Essas moléculas ativam caminhos de sinalização que amplificam a resposta imune das plantas, permitindo que elas enfrentem melhor os desafios de infecções fúngicas. Essas comprovações permitem investigar a ação do Trichoderma, principalmente no manejo de doenças radiculares, por meio de mecanismos como competição, antibiose, e micoparasitismo, elevando sua eficiência no controle de diversos patógenos de solo, como a podridão vermelha radicular da soja, causada na américa do sul pelo Fusarium brasiliense. Os danos levam a reduções de produtividade em até 27% e desfolha de acima de 30% em R6 (Farias Neto et al., 2008). Ainda não há produtos registrados ou eficientes para o manejo do F. brasiliense. A soja é uma importante matriz energética para as cadeias produtivas atuais e considerando as projeções de aumento populacional nas próximas décadas é necessário 15 pesquisas que possam melhorar a produção de alimentos, seja integrando essas ferramentas biológicas, reduzindo o uso de moléculas sintéticas ou de origem fóssil não renovável. A presente pesquisa está estruturada em quatro capítulos, nos quais as abordagens culminam em confirmar as seguintes hipóteses: - Os isolados de Trichoderma serão antagônicos ao Fusarium brasiliense, expressando diferentes mecanismos de ação. - Os isolados terão atividades bioquímicas que poderão beneficiar as plantas. - Haverá melhoria no metabolismo fisiológico das plantas - O Trichoderma induzirá a síntese de ureídeos, convertendo-os em aminoácidos e proteínas - A interação tripartite (planta-Trichoderma-Bradyrhizobium) será potencializada. - Os isolados de Trichoderma promoverão o aumento do desenvolvimento das plantas de soja. - O efeito bioestimulante na soja refletirá na produtividade. Nesse contexto, este estudo tem como objetivo avaliar in vitro as atividades bioquímicas produzidas por isolados de Trichoderma, nativos do bioma amazônico e verificar os mecanismos de ação e antagonismo sobre o Fusarium brasiliense, e quando em condições in vivo caracterizar as atividades fisiológicas e os desempenhos fitotécnicos decorridos do efeito bioestimulante em plantas de soja. REFERÊNCIAS CAMPEÃO, P., SANCHES, A. C., MACIEL, W. R. E. Mercado Internacional de Commodities: uma análise da participação do Brasil no mercado mundial de soja entre 2008 e 2019. Desenvolvimento em Questão, Ijuí, v.18, n.51, p.76-92, 2020. CARMONA, M., SAUTUA, F. La problemática de la resistencia de hongos a fungicidas. Causas y efectos en cultivos extensivos. Agronomía & Ambiente, Buenos Aires, v.37, n.1, 2017. CHAGAS JUNIOR, A. F., CHAGAS, L. F. B, MARTINS, A. L. L, COLONIA, B. S. O., OLIVEIRA, R. S. Soybean productivity with Trichoderma asperellum seed treatment in different regions of the Brazilian Cerrado. Brazilian Journal of Agricultural Sciences, Recife, v.16, n.4, p.1-8, 2021. EIDT, R. T., BERNARDO, J. T., BARROS, J. N. G., AGUILERA, J. G., GROHS, M., COSTA, D. F. A. Evaluation of the use of Agrohomeopathy and Trichoderma sp. in the productivity of rice susceptible to blast. Research, Society and Development, Vargem Grande Paulista, v.9, n.9, p.e416997420, 2020. FARIAS NETO, A. L. D., SCHMIDT, M., HARTMAN, G. L., SHUXIAN, L., DIERS, B. W. Inoculation methods under greenhouse conditions for evaluating soybean resistance to sudden death syndrome. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, v.43, p.1475-1482, 2008. 16 HARMAN, G. E. Myths and Dogmas of Biocontrol Changes in Perceptions Derived from Research on Trichoderma harzinum T-22. Plant disease, Geneva, v.84, n.4, p.377-393, 2000. HERMOSA, R., VITERBO, A., CHET, I., MONTE, E. Plant-beneficial effects of Trichoderma and of its genes. Microbiology, Nova Iorque, v.158, n.1, p.17-25, 2012. MINISTÉRIO DA AGRICULTURA, PECUÁRIA E ABASTECIMENTO – MAPA. Programa Nacional de Bioinsumos. Brasília, DF, 2023. Disponível em: https://www.gov.br/agricultura/pt-br/assuntos/inovacao/bioinsumos MONTE, E., BETTIOL, W., HERMOSA, R. Trichoderma e seus mecanismos de ação para o controle de doenças de plantas. In: MEYER, M.C., MAZARO, S.M., SILVA, J.C. (Eds.) Trichoderma: uso na agricultura, Embrapa, Brasília, DF, p.181-199, 2019. OLIVEIRA, J. B. Promoção do crescimento e da produtividade de trigo pelo emprego de cepas comerciais de Trichoderma spp, 2017. Dissertação (Mestrado em Produção Vegetal) Universidade Estadual de Goiás, Ipameri, 2017. PERES, W. M. Uso de Trichoderma atroviride na cultura do feijoeiro. 2022. Tese (Doutorado em Agronomia). Faculdade de Engenharia de Ilha Solteira – UNESP, Ilha Solteira, 2022. SANTOS, G. R., REIS, H. B., ROTILI, E. A., MOURÃO, D. D. S. C., FARIAS, D. I. O. A., PEREIRA, T. A., JUNIOR, A. F. C. Inoculation of Rhizobium associated with Trichoderma asperellum on the development and yield of cowpea. Brazilian Journal of Agricultural Sciences, Recife, v.15, n.2, p.1-8, 2020. SOARES, C. O. O próximo salto da agricultura. AgroANALYSIS, São Paulo, v.42, n.4, p.21- 22, 2022. SOOD, M., KAPOOR, D., KUMAR, V., SHETEIWY, M.S., RAMAKRISHNAN, M., LANDI, M., ARANITI, F., SHARMA, A. Trichoderma: The “secrets” of a multitalented biocontrol agent. Plants, Basileia, v.9, n.6, p.762, 2020. SOUZA, F. P., CASTILHO, T. P., MACEDO, L. O. Um marco institucional para os bioinsumos na agricultura brasileira baseado na economia ecológica. Sustainability in Debate, Brasília, DF, v.13, n.1, p.266-285, 2022. STEFFEN, G. P. K, TOMAZZI, D. J., STEFFEN, R. B., GABE, N. L., SILVA, R. F., MORTARI, J. L. M., MALDANER, J. Incremento da produtividade de milho pela inoculação de Trichoderma harzianum. Brazilian Journal of Development, Curitiba, v.7, n.1, p.4455- 4468, 2021. 17 2 CAPÍTULO 1 - MECANISMOS DE AÇÃO E PAPÉIS FISIOLÓGICOS DE TRICHODERMA NO CONTROLE DE FITOPATÓGENOS E EFEITOS ESTIMULANTES NO CRESCIMENTO E RENDIMENTO DAS CULTURAS RESUMO É necessário aumentar a produção de alimentos para atender o aumento da população mundial. A aplicação de fungicidas é um dos principais gastos na produção de alimentos. São necessárias alternativas de controle que visem reduzir a agressividade dos patógenos e melhorar o desempenho do vegetal de forma eficiente com redução dos danos ao meio ambiente. Agentes de biocontrole como os fungos antagonistas do gênero Trichoderma desencadeiam inúmeras reações fisiológicas, bem como indução de resistência e promoção de crescimento do vegetal, garantindo assim a produtividade das culturas. O Trichoderma tem a capacidade de produção de metabólitos antifúngicos, enzimas hidrolíticas da parede celular como proteases e glucanases. Além disso, o Trichoderma é capaz de realizar a disponibilização de fósforo (fosfatases ou ácidos orgânicos), absorção e disponibilização de ferro (sideróforos), ou ainda promover crescimento através de ação indireta. A aplicação do Trichoderma na agricultura tem promovido o crescimento de plantas pela produção de fitohormônios e indois relacionados ao ácido indolacétil, ácido salicílico, ácido jasmônico, etileno e indução do sistema de defesa da planta pelo aumento da atividade da quitinase e peroxidase, cuja resposta imune é dependente da cepa, concentração, duração da interação e do estado de desenvolvimento e órgão da planta. Essa revisão de literatura compila e sumariza os principais mecanismos de ação de Trichoderma atrelados ao biocontrole e seus efeitos fisiológicos como estimulantes do crescimento e rendimento produtivo das culturas agrícolas. Palavras-chave: controle biológico; antagonismo; bioestimulantes. ABSTRACT It is necessary to increase food production to meet the increase in world population. The application of fungicides is one of the main expenses in food production. Control alternatives are needed that aim to reduce the aggressiveness of pathogens and improve plant performance efficiently with reduced damage to the environment. Biocontrol agents such as antagonistic fungi of the genus Trichoderma trigger numerous physiological reactions, in addition to inducing resistance and promoting plant growth, thus ensuring crop productivity. Trichoderma has the ability to produce antifungal metabolites, cell wall hydrolytic enzymes such as proteases 18 and glucanases. Furthermore, Trichoderma is capable of making phosphorus available (phosphatases or organic), absorbing and making iron available (siderophores), or even promoting growth by indirect action. The application of Trichoderma in agriculture has promoted plant growth through the production of phytohormones and indoles related to indoleacetic acid, salicylic acid, jasmonic acid, ethylene and the induction of the plant's defense system by increasing the activity of chitinase and peroxidase, whose immune system response depends on the strain, concentration, duration of interaction, developmental state and organ of the plant. This literature review compiles and summarizes the main switches of action of Trichoderma and linked to biocontrol its physiological effects as growth stimulants and productive yield of agricultural crops. Keywords: biological control; antagonism; biostimulants. 2.1 INTRODUÇÃO Os modelos agrícolas de produção limitam-se a inúmeros fatores, sejam eles: as adversidades ambientais ou causas bióticas. De modo que novas ferramentas, como uso de produtos biológicos, ganham espaço e otimizam os moldes agrícolas dos cenários atuais, visando suprir as demandas de alimentos e reduzir os efeitos negativos consolidados, como a resistência de muitas pragas às moléculas químicas. As práticas de manejo cultural das áreas de produção e o uso de mecanismos biológicos de controle surgem como novas estratégias para uma agricultura sustentável. Guzman-Guzman et al. (2023) apontam em suas compilações inúmeras vantagens e estratégias atribuídas ao controle biológico por meio do gênero fúngico Trichoderma. Vários são os benefícios apontados por Woo et al. (2023) em sua revisão, voltada à multifuncionalidade deste gênero para as áreas agrícolas, inclusive demonstrando o quão expressivo é este seguimento na formulação de produtos, principalmente em países líderes na produção de matrizes energéticas (ex.: soja, milho) como o Brasil, que se destaca no cenário global por suas legislações e número de registros de produtos à base de Trichoderma. As espécies de Trichoderma são de vida livre, antagonistas a vários fitopatógenos, bem distribuídos e altamente interativos na raiz e solo, bem como no interior de plantas. São consideradas saprófitas e de grande interesse científico, por serem utilizadas como agentes de controle biológico e produtores de enzimas para uso industrial (Tyśkiewicz et al., 2022). 19 Entre alguns mecanismos antagonistas, destaca-se a competição por nutrientes, produção de metabólitos antifúngicos, enzimas hidrolíticas da parede celular, quitinases, proteases e glucanases, além do micoparasitismo, liberação de hormônios e biossolubilização de elementos nutricionais como fósforo e potássio na zona rizosférica (Manzar et al., 2022). Os estudos descrevem que o gênero Trichoderma atua sinérgica ao vegetal e promove uma série de reações que atuam na germinação de sementes, nos processos bioquímicos durante o crescimento das plantas, elicitação as defesas das plantas diante a presença de patógenos, além de mitigar estresses abióticos como seca, veranicos ou salinidade. Monte et al. (2019), acrescentam que como resultado dessa interação, surgem distintos sistemas de regulação gênica que podem estimular o crescimento da planta, adaptando-se às condições sub-ótimas de cultivo ou defendendo-se por meio de mecanismos de resistência sistêmica, isso culmina em benefícios fisiológicos e possivelmente ganhos em rendimento e produtividade Essa revisão traz um panorama dos efeitos dessa interação, seus mecanismos de ação e principais metabólitos envolvidos no decorrer do biocontrole, bem como estes estão atreladas ao aumento de produtividade das culturas. 2.2 MECANISMOS DE AÇÃO DE BIOCONTROLE - MAB Diferentes mecanismos são desencadeados durante o antagonismo, ou seja, as relações entre os agentes de biocontrole e os organismos alvos. No caso do Trichoderma há uma grande produção de metabólitos oriundos de elevado número de genes, que garantem amplo oportunismo ambiental. É o gênero fúngico que possui maior capacidade de codificar enzimas hidrolíticas, como proteases, quitinases e glucanases graças a presença de chaperonas e transportadores ABC. Considerando a fisiologia do organismo fúngico, estes se nutrem absorvendo os nutrientes por meio de suas hifas, para tanto necessitam liberar enzimas extracelulares capazes de degradar a parede celular e hidrolisar as moléculas de alto peso molecular tornando-as compostos nutricionais menores e assimiláveis (Monte et al., 2019). O sucesso do biocontrole pelo Trichoderma está associado a uma série de fatores, como a elevada capacidade reprodutiva, alta eficiência no aproveitamento de nutrientes e crescimento em condições adversas, modificador da zona rizosférica, forte agressividade contra fungos fitopatogênicos e promotor de crescimento e indutor de defesa vegetal (Benítez et al., 2004). Essas respostas diretas (micoparasitismo) ou indiretas (competição e antibiose) causadas pela presença do Trichoderma, caracterizam os principais mecanismos de ação de 20 biocontrole (MAB), de modo que podem ocorrer simultaneamente em maior ou menor intensidade, por meio da liberação de inúmeros metabólitos (voláteis ou não) que exercem diversas atividades bioquímicas como: enzimas hidrolíticas, hormônios indutores de auxinas, liberação de ácidos orgânicos solubilizadores, elicitação de fitoalexinas, aumento da sinalização de flavonoides e outros compostos que incrementam o microbioma radicular e beneficiam todo o desenvolvimento da planta. Esses mecanismos foram esquematizados e representados na figura 1. Figura 1 - Principais mecanismos de ação de biocontrole desencadeados pela presença de Trichoderma na zona da rizosfera Fonte: Elaboração do próprio autor 2.2.1 Competição A competição é um importante mecanismo quando se trata da eficiência no controle biológico, visto que a partir deste, o antagonista, pode reduzir a oferta de recursos, como nutrientes, oxigênio, luz, espaço físico, entre outros requerimentos que garantiriam a permanência de organismos como os fitopatógenos que ali habitam, conforme evidenciam os vários trabalhos, cuja supressão de inúmeros patógenos é devido à presença do Trichoderma (Mahmood et al., 2018; Al-Ani, 2019) A competição por nutrientes, mesmo sendo indireta, proporciona ao Trichoderma ser um agente de controle formidável, possibilitando-o a colonização de diferentes substratos em diversas regiões, expressando assim um amplo oportunismo ambiental, fato que o permite agilidade no antagonismo, principalmente na rizosfera, zona de intensa atividade microbiana e extravasamento de secreções vegetativas que permitem tamanha riqueza, mantendo-o ativo e Indirect Metabolites Volatile Organic Compounds (VOC’s) Non-volatile Organic Compounds Hydrolytic enzymes, hormones, phytoalexins, flavonoids and others Mycoparasitism Competition AntibiosisIndirect Direct BMA Pathogen Trichoderma with without Resistance induction Growth promotion 3 0 c m Glycine max (L.) 21 colonizando os mais diferentes nichos, além de desencadear inúmeras reações, como a produção de ácidos orgânicos, enzimas e compostos que liberam o fósforo ou quelam elementos como ferro (Infante et al., 2009; Prajapati et al., 2020) O Trichoderma exibe uma elevada capacidade de mobilizar e absorver nutrientes do solo em comparação com outros microrganismos rizosféricos; logo a disponibilidade limitada e a competição por nutrientes levam ao manejo natural de fungos fitopatogênicos (Sood et al., 2020). Ressalta-se ainda que durante as interações de fungos a competição por macro e micronutrientes como nitrogênio, carbono e ferro desempenham papel fundamental, oferecendo grandes vantagens aos sistemas de biocontrole. Em testes in vitro esse mecanismo se torna um importante critério para seleção de cepas, visto que indicam as potencialidades competitivas que poderiam ocorrer frente a um patógeno (Figura 2). Figura 2 - a) Capacidade competitiva de miceliação em meio de cultura para seleção de Trichoderma spp. (T1, T2, T3, T4, T5 e T6) após 72 horas de incubação. b) Rastreamento da competição in vitro entre Trichoderma sp. e Corynespora cassiicola acima de 120h, observando que o antagonista limita totalmente a área disponível, permitindo melhor aproveitamento dos recursos disponíveis do meio de cultura Fonte: Elaboração do próprio autor 2.2.2 Antibiose Esse conceito está relacionado a interação entre os organismos de uma população, que são capazes de secretar metabólitos, a fim de inibir ou impedir o desenvolvimento de indivíduos de uma outra espécie. Cepas de Trichoderma possuem a capacidade produzir inúmeros T1 T2 T3 T4 T5 T6 0 24 48 72 96 120h 72h a) a) 22 metabólitos secundários voláteis e não-voláteis, como antibióticos e enzimas hidrolíticas, capazes de inibir ou destruir propágulos de fungos, bactérias e nematoides fitopatogênicos; além de apresentar ampla variedade e aplicação potencial, pois são vários compostos distribuídos em mais de 120 estruturas moleculares, tornando-se uma das fontes de maior diversidade metabólica do Reino Fungi (Harman, 2000; Hermosa et al., 2012, Monte et al., 2019) A antibiose desempenha importante papel no controle biológico de doenças radiculares. A combinação de antibióticos e enzimas hidrolíticas resultam em um nível mais alto de antagonismo do que qualquer um dos mecanismos isoladamente. Quando em campo seus efeitos nem sempre são distintos aos do micoparasitismo (Lobo Junior et al., 2019), e quando em laboratório os testes in vitro revelam a potencialidades antibiótica de muitos isolados de Trichoderma com elevada eficiência antagônica, conforme evidenciado na figura 3. Figura 3 - Observação dos diferentes níveis de antibiose promovidos em resposta ao pareamento antagonista de Trichoderma sp. e três isolados de Fusarium spp. O halo entre as duas colônias revela a liberação de compostos metabólicos que impedem o avanço e o desenvolvimento da colônia do fitopatógeno Fonte: Elaboração do próprio autor 2.2.3 Micoparasitismo Vários isolados do gênero Trichoderma possuem o micoparasitismo como principal mecanismo de ação durante o biocontrole. O ataque direto de um fungo a outro é um processo complexo que envolve uma série de eventos, incluindo reconhecimento, avanço, penetração e consequentemente a morte do hospedeiro (Benítez et al., 2004). Antibiosis levels Isolated 01 Isolated 02 Isolated 03 84 hour 23 O Trichoderma apresenta esse potencial de biocontrole direto por detectar outros fungos e crescer em direção a eles, graças a receptores e vias de sinalização intracelular para detecção e interação de sinais liberados pelo fitopatógeno. Esse direcionamento induzido ocorre antes do contato físico direto, devido a ação de um conjunto de genes presentes em receptores da superfície celular das hifas do Trichoderma (Druzhinina et al., 2018, 2011) Os genes reconhecem oligocitosacarídeos e oligopeptídeos do fungo-presa, liberando enzimas que degradam a parede celular desencadeando (Seidl et al., 2009) O micoparasitismo decorrente da ação deste gênero, possibilita inúmeras cepas com amplo potencial de aplicação nas áreas de produção. Para tanto, testes in vitro permitem elucidar o comportamento destes isolados frente aos principais fitopatógenos de difícil controle das áreas agrícolas (Figura 4). Conforme Contreras-Cornejo et al. (2020), o micoparasitismo é um processo complexo, na qual o Trichoderma spp. é capaz de promover inúmeras reações para coordenar a expressão gênica e produção de metabólitos secundários eficazes contra sua presa. Figura 4 - a) Bioensaios in vitro mostrando o mecanismo de ação do micoparasitismo de Trichoderma spp. no fungo fitopatogênico Rhizoctonia solani. b) Imagens de microscopia eletrônica de varredura revelam contato físico direto, promovendo o enrolamento das hifas de Trichoderma spp. (em verde – edição em Photoshop) sobre o patógeno R. solani (cinza) Fonte: Elaboração do próprio autor 2.3 COMPOSTOS DO METABOLISMO SECUNDÁRIO Estudos sobre os mecanismos de ação do Trichoderma spp. adotando técnicas de biologia molecular evidenciam que além da competição, micoparasitismo e antibiose, há uma importante ação de metabólitos secundários produzidos pelo fungo, agindo como promotor de a) b) 24 crescimento de plantas e como indutor de resistência a patógenos (Harman et al., 2004; Hermosa et al., 2012). Esses metabólitos secundários são compostos químicos de baixa massa molecular e muito diversificados e estão envolvidos em vias de sinalização, desenvolvimento e interação com outros organismos. No entanto, não exercem um papel fundamental no crescimento e desenvolvimento do Trichoderma, esses metabólitos são importantes na colonização de hábitats, oferecendo vantagem ecológica na conquista do ambiente (Ramada et al., 2022) e garantam que suas aplicações reduzam as perdas das safras (Figura 5). Figura 5 - Representação da interação de Trichoderma com fitopatógenos e comportamento da direção de resposta na liberação de compostos metabólitos (← →). a) Encontro da hifa de Trichoderma (verde) com o fitopatógeno (bege); b) liberação de metabólitos produzidos por Trichoderma (►); c) resposta do fitopatógeno (●) devido à ação do Trichoderma; d) contrarresposta de Trichoderma com a secreção de diferentes enzimas hidrolíticas (⁌ + ▬) Fonte: Adaptado de Ramada et al. (2022). A grande diversidade de organismos-alvo parasitados pelo Trichoderma é o que possibilita a ampla variedade de metabólitos secundários. Em geral, esses metabólitos são ácidos orgânicos, cetonas, ésteres, éteres, hidrocarbonetos, peptídeos, pironas, policetídeos, enxofre e compostos contendo nitrogênio. Esses compostos podem exibir uma infinidade de funções biológicas e atuar como protagonistas em diversas interações entre organismos, seja a b c d 25 entre: fungo – fungos; fungo – planta, ou na rizosfera entre fungo – microbiota local como bactérias e nematoides (Mukherjee et al., 2012). Vinale e Sivasithamparam (2020), afirmam que muitos genes fúngicos envolvidos na biossíntese de metabólitos secundários não são transcritos sob condições in vitro, mas podem ser ativadas quando há presença de comunidades microbianas complexas, principalmente na zona rizosférica, conforme descrito por Al-Ani (2019) e esquematizado na figura 6. Figura 6 - Efeitos gerados pelos metabólitos secundários produzidos por Trichoderma spp. aos diferentes grupos biológicos presentes na rizosfera vegetal Fonte: Elaboração do próprio autor A produção de metabólitos secundários de origem fúngica compreendem vias bioquímicas incomuns que levam a diferentes compostos naturais obtidos de alguns precursores do metabolismo primário (aminoácidos, acetil-CoA e mevalonato) (Zeilinger et al., 2016) ou produtos de complexos enzimáticos chamados de sintetases não ribossomais, conhecidos como peptaibols (Mukherjee et al., 2012). São descritas mais de 500 estruturas diferentes produzidas por Trichoderma, onde são exemplos de grupos de metabólitos secundários compostos como: esteroides, gliotoxinas, • reduces spore germination and mycelial growth. • affect the production of enzymes and secondary metabolites. • competing for nutrients with other microorganisms • lower the level of virulence • cause cytotoxicity by producing toxins. • affects egg productivity and hatching. • cause juvenile motility. • affect the production of intercellular and extracellular enzymes and metabolites. • cause hunger by chelating useful nutrients. • prevent binary fission. • cause cell wall degradation and cytotoxicity by producing toxins. • affect the production of intercellular and extracellular enzymes and metabolites. • reduces the level of virulence by suppressing toxin synthesis. • cause cytotoxicity by producing phytotoxins. • cause deficiency of essential micronutrients. • cause vascular wilting, leaf rust. • cause leaf, stem and root rot. • affect seed emergence. • cause cytotoxicity by producing mycotoxins. • affect the mechanisms of metabolism. • inactivate virus particles. • decrease the level of virulence. Effects of secondary metabolites on rhizospheric biological groups 26 gliovirinas, pironas, quinonas, terpenóides e peptídeos antibióticos (peptaibols) (Patil et al., 2016). Destaca-se entre estes, compostos como: peptaibóis, sesquiterpenos, policetídeos, alquilpironas, esteróides, isonitrilas e dicetopiperazinas, que são metabólitos de propriedades antibióticas frequentemente associadas à atividade de biocontrole. As classes e os diferentes metabolitos secundários produzidos pelo Trichoderma, foram sumarizados por Khan et al., (2020), atualizados e representados na Tabela 1. Tabela 1 - Principais classes e respectivos metabólitos secundários produzidos pelo gênero Trichoderma spp. com ação sobre fungos fitopatogênicos Class Secondary metabolite Species Trichoderma promoter Activity Target organism Reference E p ip o ly th io d io x o p ip er az in es /D ik et o p ip er az in es Gliotoxin T. lignorum, T. viride, T. hamatum antimicrobial Aspergillus fumigatus, Rhizoctonia bataticola, Macrophomina phaseolina, Pythium deharyanum, Pythium aphanidermatum, Sclerotium rolfsii, Rhizoctonia solani Botrytis cinerea Scharf et al. (2016); Mukherjee et al. (2012); Zaid et al. (2022) Gliovirin T. virens, T.longibrachiatum antimicrobial Rhizoctonia solani, Pythium ultimum Sclerotium rolfsii Vargas et al. (2014); Pachauri et al. (2023) B u te n o li d es Butenolide T. harzianum; antifungal Gaeumannomyces graminis var. tritici; Pythium ultimum Rhizoctonia solani Botrytis cinerea Scharf et al. (2016) Harzianolide T. harzianum; antifungal Gaeumannomyces graminis var. tritici; Pythium ultimum Rhizoctonia solani Botrytis cinerea Vinale et al. (2006); Andrade et al. (1992) 5-hydroxyvertinolide T. longibrachiatum antifungal Mycena citricolor Vinale et al. (2009) P y ri d o n es Harzianopyridone T. harzianum antifungal Pythium ultimum, Gaeumannomyces graminis var. tritici;, Rhizoctonia solani, Botrytis cinerea; Phytophthora cinnamomi, Vinale et al. (2006); Ahluwalia et al. (2015) 27 Leptosphaeria maculans Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum, Sclerotium rolfsii P ep ta ib o ls Alamethicin F30 T. viride, T.koningi, T. brevicompactum T. arundinaceum, T. turrialbense, T. protrudens and Hypocrea rodmanii. anticancer antimicrobials inductor resistance Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum, Verticillium dahliae, Botrytis cinerea Viterbo et al. (2007); Leitgeb et al. (2007); Degenkolb et al. (2008) Trichoconins VI, VII and VIII T. pseudokoningii anticancer antimicrobials inductor resistance Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum, Phytophthora parasitica, Verticillium dahliae Xiao-Yan et al., (2006); Shi et al., (2012) Tricorzianin A1 and B1 T. harzianum anticancer antimicrobials inductor resistance Clavibacter spp Schirmbock, et al. (1994) Peptaivirins A and B T. harzianum antimicrobial and antiviral tobacco mosaic virus Yun et al. (2000) P y ro n s 6-pentyl-2-pyranone (6- PP) T. viride T. koningii T. harzianum T.longibrachiatum T. atroviride Antifungal, plant growth promoter Phytophtora sp. Fusarium oxysporum Rhizoctonia solani Botrytis cinerea Fusarium sp. Candida albicans, Penicillium spp., Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus Armillaria mellea Mutawila et al. (2016); Shi et al. (2012); Tarus et al. (2003); Vinale et al. (2008) Viridepironone T. viride antifungal Sclerotium rolfsii Evidente et al. (2003) A za p h il o n es T22 azafilone, harzifilone and fleefilone T. harzianum antifungal Pythium ultimum, Gaeumannomyces graminis var. tritici Rhizoctonia solani Botrytis cinerea, Phytophthora cinnamomi, Leptosphaeria maculans Huang et al. (2020); Vinale et al. (2009, 2006) K o n in g in in s Koninginin A, Koninginin B, Koninginin C, Koninginin D, Koninginin E, Koninginin G T. koningii T. aureoviride T. harzianum antifungal Gaeumannomycesgra minis var. tritic Fusarium oxysporum, Bipolaris sorokiniana, Phytophthora cinnamomi, Phytophthora middletonii Fusarium solani, Liu; Wang (2001); Mori et al. (2002); Chen et al. (2015) S te ro id s Stigmasterol T. harzianum T. koningii antifungal Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii, Macrophomina phaseolina, Fusarium oxysporum Ahluwalia et al. (2015) Ergosterol and 3,5,9-trihydroxyergosta- 7,22-dien-6-one Trichoderma sp. antifungal Pyricularia. oryzae, Candida albicans, Aspergillus niger, Alternaria alternata Xuan et al. (2014) 28 an th ra q u in o n es 1,8-dihydroxy-3- methylanthraquinone 1-hydroxy-3- methylanthraquinone 6-methyl-1,3,8- trihydroxyanthraquinone T. harzianum Antifungal, resistance induction Gaeumannomycesgra minis var. tritici Phytium ultimum Rhizoctonia solani, Sclerotium. rolfsii, Macrophomina phaseolina, Fusarium oxysporum Liu et al. (2001); Vinale et al. (2006); Ahluwalia et al. (2015) L ac to n es Cremenolide lactone T. cremeum growth promoting, antifungal Rhizoctonia solani, Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum Vinale et al.(2012) Lactone and Aspinolide C T. arundinaceum antibiotic to induce plant resistance Botrytis cinerea Fusarium sporotrichioides. Malmierca et al.(2014). Cerinolactone T. cerinum antibiotic Rosellinia necatrix Vinale et al.(2012) T ri ch o th ec en es Trichodermin T.brevicompactum T. harzianum Antifungal and protein synthesis inhibitor Rhizoctonia solani, Botrytis cinerea, Colletotrichum gloeosporioides Colletotrichum lindemuthianum Cochliobolus miyabeanus, Fusarium oxysporum, Thanatephorus cucumeris, Degenkolb et al. (2008); Shi et al. (2009) O th er - a n ti fu n g al c o m p o u n d s b el o n g in g t o d if fe re n t ch em ic al cl as se s is o la te d f ro m T ri ch o d er m a s p p . Harziandione diterpene T. harzianum T. viride antifungal Sclerotium rolfsii Mannina et al. (1997) 10,11- dihydrocyclonerotriol; Catenioblin C and Sohirnone T.longibrachiatum antifungal Candida albicans Pyricularia oryzae Xuan et al. (2014) Harzianic acid T. harzianum antimicrobial and plant growth promotion Pythium irregulare Sclerotinea sclerotiorum Rhizoctonia solani Lee et al. (2009) Tricodermester A T. atroviride antifungal Pseudopestalotiopsis theae Tang et al. (2020) Fonte: Adaptado de Khan et al., (2020) Como uma parcela representativa desse contexto, Zhang et al. (2021) descreveram em sua publicação, cerca de 203 metabólitos secundários produzidos por diferentes espécies de Trichoderma, especialmente o T. harzianum, de acordo com os manuscritos de diversos autores, há várias bioatividades atribuídas aos metabolitos, conforme representação da figura 7. 29 Figura 7 - Porcentagem representativa das principais atividades promovidas pelos metabólitos secundários de Trichoderma spp Fonte: Adaptado de Zhang et al. (2021). Os metabólitos secundários de Trichoderma são descritos na literatura como padrões moleculares associados a microrganismos (MAMPs), esses são responsáveis pela ativação de uma série de sinalizações químicas que resultam na: indução de resistência a doenças, na ativação de hormônios vegetais para controlar o ataque de patógenos e estresse ambiental, além de serem precursores da sinalização para promoção de crescimento do vegetal (Hermosa et al., 2012; Vinale; Sivasithamparam, 2020). 2.3.1 Compostos orgânicos voláteis - COVs Os metabólitos secundários podem ser categorizados em três grupos, sendo: os peptaibols; os compostos solúveis em água e os antibióticos voláteis (Ghisalberti; Sivasithamparam, 1991). Os antibióticos voláteis são altamente eficientes nas ações de biocontrole. Sabe-se que cepas fúngicas de Trichoderma são grandes produtoras de metabólitos ou compostos orgânicos voláteis (COVs) com atividades antibióticas, com papel significativo na comunicação entre as espécies interativas na rizosfera, sendo esse o start que desencadeará os demais mecanismos de ação (MAB – direto), como o micoparasitismo (Guo et al., 2019; Zeilinger; Omann, 2007). A zona rizosférica possibilita grande atividade metabólica e de elevada biodiversidade incluindo a presença de fitopatógenos de difícil controle convencional (Penuelas et al., 2014). No entanto, devido à sua volatilidade e difusividade através dos espaços porosos, os COVs têm 0 5 10 15 20 25 30 Antimicrobial activity Anticancer activity Antimicroalgal activity No activity Untested Other bioactivities Herbicidal activity Enzyme inibitory activity Nematicidal activity % representative 30 propriedades biofísicas ideais para funcionar como moléculas de sinalização acima e abaixo do solo (Schulz-Bohm et al., 2017). O Trichoderma se destaca na eficácia fisiológica dessas pequenas moléculas de fase gasosa e seu potencial para exploração em biotecnologias, há cerca de 480 COVs diferentes oriundos do Trichoderma, que compreendem: hidrocarbonetos simples, heterociclos, compostos contendo enxofre, piranos simples, derivados de benzeno, compostos hidroxilados ou amino, aldeídos, cetonas, álcoois, fenóis, tioálcoois, tioésteres e seus derivados, esses compostos dependem de espécies/cepas, composição do substrato e ambiente de cultivo (Crutcher et al., 2013; Siddiquee, 2014; Contreras-Cornejo et al., 2014; Li et al., 2018). 2.3.2 Produção de enzimas O gênero Trichoderma possui o maior número de enzimas hidrolíticas encontradas no Reino Fungi, enzimas como quitinases, glucanases e proteases são importantes compostos nos processos de biocontrole. Além de possibilitar o crescimento e reparação celular quando em condições desfavoráveis (Manzar et al., 2022; Monte et al., 2019; Geraldine et al., 2013). Cada enzima hidrolítica possui um série de componentes enzimáticos que exibem diferentes funções durante as interações biológicas decorrentes dos mecanismos de ação de biocontrole, em especial no micoparasitismo cujas ações são diretas (Kredics et al., 2005). Durante o contato entre Trichoderma e o fitopatógeno enzimas hidrolíticas (quitinases e glucanases) juntamente com metabólitos secundários (COVs e sintetases de peptídeo não ribossomal) são expressos, induzindo a morte do patógeno (Masi et al., 2018; Sood et al., 2020). Vários componentes enzimáticos liberados por cepas de Trichoderma foram sumarizados por Sood et al. (2020), na qual apontam as principais enzimas: Hidrolíticas (β- glucosidases, endo-β-1,4-glucanases, exo-β-1,4-glucanases, cellulolytic enzymes, xylanase, chitinase, endochitinases, exochitinases); Proteases (exopeptidases, endopeptidases, lipase, glucose oxidase, antioxidant enzymes – POD, SOD, CAT); Biosintéticas e sinalizadoras (glucan and chitin synthases, MAP-quinase, ETR1 and CTR1, chalcona sintase, lipoxygenase, phenylalanine ammonia lyase, ACC synthase ACC oxidase, δ-cadinene synthase), caracterizando-as suas funções durante contato direto. 31 2.3.3 Produção de ácidos orgânicos, sideróforos e solubilização de fósforo Em solos neutros a alcalinos os metabólitos secundários na forma de ácidos orgânicos como o glucônico, cítrico e fumárico secretados por cepas de Trichoderma tem papel especial na absorção de nutrientes (Vinale et al., 2012). Estes ácidos orgânicos ácidos orgânicos que promovem alteração no pH na região rizosférica, potencializando a solubilização de fosfatos mediante processos de acidificação (Li et al., 2015), redox, quelação e hidrólises, facilitando a absorção pelas plantas de elementos pouco disponíveis como é o caso de micronutrientes e cátions como manganês, magnésio e ferro. O ferro é um nutriente essencial devido à sua função metabólica nas plantas. Suas propriedades redox permitem que ele exista em dois estados de oxidação, ferroso (Fe2+) e férrico (Fe3+) para a doação e aceitação de elétrons, respectivamente. Embora o elemento ferro seja abundante na terra, sua biodisponibilidade é baixa principalmente porque o ferro férrico reage com o oxigênio formando hidróxidos férricos (Anke et al., 1991). Alguns microrganismos, incluindo cepas de Trichoderma e bactérias do gênero Pseudomonas reagem a condições limitantes de ferro liberando moléculas quelantes de Fe3+. Estas substâncias são denominadas de sideróforos (do grego sideros=ferro, foros = transportador), cada microrganismo pode produzir um ou mais tipos desta substância (Neilands, 1995). Em geral são de baixo peso molecular que possuem alta afinidade pelo Fe3+, formando compostos mais estáveis ou que se dissociem com maior facilidade, e também são usados como transportadores de ferro para o interior das células (Hider; Kong, 2010). Em filtrados de cultura de Trichoderma spp. sob condições de deficiência de ferro, Anke e colaboradores (1991), verificaram a presença de diferentes sideróforos: coprógeno, coprógeno B, fusarinina C (fusígeno) e ferricrocina. Mesmo espécies patogênicas como Fusarium, Aspergillus e Ustilago, desenvolveram capacidade de produzir substâncias quelantes devido a necessidade do ferro para seu desenvolvimento. O ferro é um fator de crescimento para fungos. Esporos de Fusarium spp. só germinam na presença de ferro. Desta forma, quando o Trichoderma sequestra o ferro no entorno das raízes, ele impede a germinação destes esporos de Fusarium que é um importante patógeno radicular para muitas espécies vegetais. Além disso, pelo contato íntimo com as raízes, estes elementos assimilados pelas hifas de Trichoderma são transferidas para as raízes vegetais, seja por trocas de contato ou quando estas hifas se degradam e então seus nutrientes podem ser absorvidos pela raiz (Tyskiewicz et al., 2022; Li et al., 2015; Mukherjee et al., 2012). 32 Renshaw et al. (2002) abordam diversas pesquisas com sideróforos fúngicos, elencando suas estruturas, funções e aplicações, a partir daí, esquematizou-se o mecanismo de transporte dos sideróforos produzidos pelo Trichoderma spp. (Figura 8). Figura 8 - Esquema do mecanismo de transporte de ferro pelos sideróforos através da membrana de Trichoderma spp. O Fe3+ + complexo sideróforo atravessa a membrana e, no citoplasma, sofre redução a Fe2+ e o sideróforo retorna ao meio extracelular, onde pode se ligar novamente ao Fe3+ Fonte: Elaboração do próprio autor Os íons ferro servem como cofator para várias classes de enzimas e desempenham um papel fundamental como nutriente para o crescimento e desenvolvimento das plantas. O ferro ocorre principalmente como Fe3+ nas condições de pH neutro e na presença de oxigênio (Sood et al., 2020). O Trichoderma pode realizar a acidificação do solo da área rizosférica e por si só este efeito pode tornar elementos como o fósforo mais disponíveis, pela alteração de pH. O fósforo é um macronutriente importante para as culturas agrícolas, atua como fator limitante ao crescimento vegetal por fornecer energia necessária para os processos metabólicos. No entanto aproximadamente 80% do fosfato inorgânico solúvel aplicado se torna indisponível, pois é 33 rapidamente imobilizado na forma de fosfato insolúvel, pois fixam a minerais de argila, ao cálcio ou óxidos de ferro e alumínio (Behera et al., 2014). A baixa eficiência na absorção do fósforo inorgânico é um dos desafios no cenário da pesquisa agrícola atual. Muitos microrganismos presentes na rizosfera são capazes de atuar solubilizando o fosfato inorgânico (Ribas et al., 2016). Trichoderma spp. apresentam potencial de solubilização de fosfato aumentando a eficiência na absorção deste nutriente. O uso de cepas capazes de realizar fosfatase e quelar ferro, leva a diminuição das doses de aplicação de fertilizantes fosfatados reduzindo consideravelmente os custos de produção, assim como ocorreu com a adubação nitrogenada e a fixação biológica de nitrogênio. Estudos demonstram que estes fungos podem realizar fosfatase alcalina e ou fosfatase ácida, sendo a última mais frequente (Bononi et al., 2020; Li et al., 2015). Em screening in vitro esse potencial indicativo de solubilidade pode ser expresso pela reação promovida em meio de cultura específico, como o meio NBRIP (Figura 9). Figura 9 – Crescimento de Trichoderma sp. em meio NBRIP sólido com adição de corante azul de bromotimol (a), em que a presença de halo translucido (após 96h) e o aspecto granular indicam solubilização de fosfato; ou corante púrpura de bromocresol (b), cuja mudança na coloração do meio de cultura (púrpura para amarelo) indica a liberação de ácidos orgânicos capazes de solubilizar o fósforo Fonte: Elaboração do próprio autor a) b) 34 2.4 PROMOÇÃO DE CRESCIMENTO E ESTÍMULOS A MECANISMOS DE DEFESA VEGETAL Ressalta-se que dentro deste gênero fúngico existe muita diversidade, pode-se ter cepas capazes de realizar a disponibilização de fósforo em quantidades significativas, ou na absorção e disponibilização de ferro, produção ou transporte de hormônios como auxina, ou ainda promover crescimento através de ação indireta (Ribas et al., 2016). O Trichoderma é encontrado em associação com as plantas de forma endofítica e ou colonizando a rizosfera. São atraídos para esta região pelos exsudatos secretados pelas raízes. Nestes exsudatos encontram-se substâncias como o L-triptofano que são usados em seu metabolismo e são precursores outros compostos como o ácido indolacético (AIA), que promovem o aumento no número de raízes, tolerância à seca (Bailey et al., 2006). Além de promover a germinação e o vigor das sementes, aumento da biomassa e do comprimento de parte aérea, melhoram a absorção de nutrientes de forma geral, portanto, considerado um fungo capaz de promover crescimento vegetal e gerar efeitos benéficos significativos para as plantas (Harman et al., 2004; Sood et al., 2020). O potencial de produção de AIA por diferentes isolados de Trichoderma spp. podem ser expressos em testes laboratoriais, através de meio específicos, para multiplicação do microrganismo, a exemplo do meio BD+Triptofano (Figura 10) Figura 10 - Triagem de AIA orgânico produzido por diferentes isolados de Trichoderma spp. sob crescimento orbital em meio BD+Trip, e posterior avaliação em espectrofotometria 72h após a inoculação. Cores mais intensas demonstram maior concentração de AIA na amostra Fonte: Elaboração do próprio autor - +[ ] AIA 35 Trabalhos evidenciam que algumas espécies de Trichoderma tem promovido o crescimento das plantas pela produção de fitohormônios e indois relacionados ao ácido indolacétil, ácido salicílico, ácido jasmônico, etileno e a indução do sistema de defesa da planta pelo aumento da atividade da quitinase e peroxidase, cuja resposta imune é dependente da cepa, concentração, duração da interação e do estado de desenvolvimento e órgão da planta (Segarra et al., 2007; Meyer et al., 2019) Foram caracterizados vários elicitores do sistema de defesa de plantas na presença do Trichoderma, bem como proteínas com atividade enzimática, oligossacarídeos e compostos de baixo peso molecular, além da melhoria do dano oxidativo quando induzido pelo estresse. Essa resposta é o análogo mais próximo da resistência induzida descrita pela ação de rizobactérias (Contreras-Cornejo et al., 2009; Hermosa et al., 2012; Salas-Marina et al., 2011; Shoresh et al., 2010). As interações entre os metabólitos secundários com as plantas são permeadas de inúmeras sinalizações, que possibilitam a indução de resistência do vegetal, sendo essas: resistência sistêmica induzida e resistência sistêmica adquirida (Bisen et al., 2016). De acordo com Fiorini et al. (2016), quando o Trichoderma interage com as raízes das plantas, provoca alterações profundas e substanciais a nível bioquímico que, dependendo do tipo de metabólito regulado na planta, afetam a fisiologia, defesa e as respostas ao estresse. O efeito benéfico do Trichoderma nas plantas pode ser explicado pela capacidade do fungo em modular a arquitetura radicular e/ou pela produção de compostos que aumentam a disponibilidade de nutrientes, como sideróforos e ácidos orgânicos (López-Bucio et al., 2015). Há mudanças consideráveis no conteúdo de fitohormônios em tecidos vegetais após inoculação Trichoderma spp., demonstrando que os fitohormônios produzidos por fungos desempenham papéis importantes nas interações patogênicas fungo-planta (Contreras-Cornejo et al., 2020). Guzmán-Guzmán et al. (2019) relatam que o Trichoderma produz auxinas e um precursor ácido abscísico, além de produzir citocininas e etileno que juntos, contribuem para uma infinidade de maneiras, pelas quais esse fungo interage com seu hospedeiro gerando inúmeros benefícios. Os autores demonstram o impacto da presença de Trichoderma na rizosfera de plantas, enfatizando a colonização da raiz, levando ao aumento no crescimento da planta, proteção contra fitopatógenos por micoparasitismo e preparação contra estressores bióticos e abióticos 36 por meio da participação de metabólitos secundários, efetores e modulação do equilíbrio hormonal (Figura 11). Figura 11 – O Trichoderma spp. interage com a planta, colonizando suas raízes e ocorre uma alteração no equilíbrio hormonal da planta, mediada por hormônios derivados de Trichoderma sp., melhorando a saúde e o vigor da planta Fonte: Adaptado de Guzmán -Guzmán et al., 2019. Plant hormonal balance Defense • SA • JA/Et • ABA • Cks Growth and development • Auxins • Cks • GAs • ABA • Et Nutrient uptake Benefits plant hormonal balance, nitrient uptake, growth ande defense Phytohormones Hormones from Trichoderma Nutrients ↓ Detriments from pathogens ↑ Benefits from Trichoderma Trichoderma hormones • Auxins • ABA • Cks • GAs • Et Redution growth, development and nutriente uptake Phytopathogen Mycoparasitism Trichoderma v x 37 2.5 INCREMENTOS E GANHOS DE PRODUTIVIDADE Compreendendo todo o arsenal metabólico e capacidade adaptativa às condições adversas que o Trichoderma possui, o reflexo direto dos papéis fisiológicos e bioquímicos desencadeados no controle biológico de fitopatógenos, bem como efeitos bioestimulantes para as culturas, culminam em incrementos e ganhos de produtividade, conforme evidenciado por diversos autores, que tiveram rendimentos satisfatórios ao fazer o uso de Trichoderma spp. em seus sistemas de produção. A elevação do rendimento das culturas, permite otimizar e melhor aproveitar as áreas de produção, atrelado a isso, o uso de bioinsumos com Trichoderma spp. possibilitam o aumento da diversidade biológica nos solos, tornando-os supressivos e mais sustentáveis. Demonstrando a versatilidade e aplicabilidade desse microrganismo, há um compilado dos incrementos produtivos mais expressivos obtidos para as principais fontes energéticas base da nutrição humana e pecuária (Figura 12). Figura 12 - Infográfico do aumento médio da produtividade (Kg ha-1) das principais commodities e matrizes energéticas produzidas com a aplicação de Trichoderma spp. (T) comparado ao controle (C) sem a aplicação Fonte: Elaboração do próprio autor 2.6 CONSIDERAÇÕES O uso de microrganismos benéficos na lavoura é o elo entre ganhos de produtividade e uso racional de agroquímicos, tornando-se uma ferramenta muito promissora dentro dos sistemas agrícolas de produção, junto a outras estratégias potencializando ainda mais seus efeitos. Soybean (kg ha-1) C = 2113 T = 2612 Increase (%) 23.6 Chagas Junior et al., 2021 Bean (kg ha-1) C = 1610 T = 2311 Increase (%) 43.4 Peres, 2022 Cowpea (kg ha-1) C = 1073 T = 2875 Increase (%) 167.9 Santos et al., 2020 Corn (kg ha-1) C = 13800 T = 16232 Increase (%) 17.6 Steffen et al., 2021 Wheat (kg ha-1) C = 732 T = 2751 Increase (%) 275.8 Oliveira, 2017 Rice (kg ha-1) C = 8424 T = 9710 Increase (%) 15.2 Eidt et al., 2020 38 A exemplo de nações líderes na produção agrícola e rica na diversidade biológica existentes em toda sua extensão territorial, o Brasil sem dúvidas tem muito a oferecer e contribuir com esse segmento. Desta forma, o investimento em pesquisas, em bioprospecção de cepas de microrganismos multi-eficientes como o Trichoderma, seja em controle biológico, na disponibilização de nutrientes, promoção de crescimento ou indução de resistência são primordiais para o fortalecimento de uma agricultura contemporânea, pautada nos objetivos do desenvolvimento sustentável instituídos pela ONU. Possibilitando a redução no uso de insumos ou moléculas nocivas ao ambiente e a todos que dele dependem. Agradecimentos O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) – Código de Financiamento 001. REFERÊNCIAS AHLUWALIA, V., KUMAR, J., RANA, V. S., SATI, O. P., WALIA, S. Comparative evaluation of two Trichoderma harzianum strains for major secondary metabolite production and antifungal activity. Journal of Natural Products, Londres v.29, n.2, p.914–920, 2015. AL-ANI, L. K. T. 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In microbiological research, several pieces of evidence can be indicated with parameters that are deeply related to culture media; pH and color variation, halo formation, overlay of structures, culture shape, among others. The employment of technical photographs as a strategy of the experimental observation and reliable representation is indispensable. The protocol presented here suggests the production of photographic support in microbiological assays in Petri dishes taken by smartphone to obtain high-quality images, besides showing tools to edit images using PowerPoint. The support is composed of a paper tube with a transparent border, whose reduced light penetration avoiding light refection over the Petri dishes or the culture media. The edition consists of photograph variation, and in clipping and pasting on uniform backgrounds to provide further detailing. The protocol allowed a standardized photograph collection in high quality, which is ideal for a comparative portrait of microbiological behaviors. The image editing enabled a framework and greater visibility of physical and biological structures in the exhibition of photographs inside the manuscript, such as the removal of noises, background alterations, deformities, or irregularities. This protocol is an intelligent and cheap tool to help researcher on the knowledge-obtaining process, and it is applied to diff