“Desenvolvimento de dispositivos de análise rápida para monitoramento da sarcosina, empregando Polímeros Molecularmente Impressos acoplado na superfície de Pontos Quânticos” RELATÓRIO DE BOLSA DTI-B CNPQ Pesquisadora: Prof.a Dra. Maria del Pilar Taboada Sotomayor Pós-doutoranda: Dra. Bianca Mortari Sede do projeto: Instituto de Química da UNESP de Araraquara Araraquara, janeiro de 2025 Resumo: A sarcosina (SAR) é um aminoácido produzido no corpo humano que, recentemente, foi descoberto que pode atuar como um excelente biomarcador para o câncer de próstata (CaP), pois a sua quantidade se torna maior no sangue e urina quando o paciente tem essa doença. Por causa disso, muitas pesquisas foram feitas para conseguir métodos eficientes de análise quantitativos para a SAR e assim inovando no tratamento do CaP. Nesse trabalho, foi estudada a construção de dispositivos sensores para o monitoramento da sarcosina. Esses dispositivos se baseiam em polímeros molecularmente impressos (MIP), que são microplásticos com cavidades sensíveis e seletivas, fazendo parte da identificação e pré-concentração de diferentes tipos de moléculas. Os MIPs construídos nesse trabalho foram feitos na configuração core@shell junto com os ponto quânticos (QD) que são microcristais semicondutores fluorescentes, formando a combinação QD@MIP. Esse material sintetizado foi caracterizado por microscopia eletrônica de varredura e espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier. Experimentos de fluorescência foram realizados para avaliar o efeito do pH e tempo de interação dos QD@MIPs com a SAR e sua concentração em diferentes matrizes. Sob condições otimizadas, foi obtida uma faixa de concentração linear de 5,0 a 30,0 mmol L-1 e o limite de detecção de 0,78 mmol L-1. A repetibilidade e reprodutibilidade do QD@MIP foram avaliadas em termos do RSD, onde foram obtidos valores de RSD inferiores a 20% em ambos os testes. Estudos de seletividade foram realizados na presença de três aminoácidos interferentes, e os sinais obtidos para estes interferentes confirmaram a excelente seletividade do sensor proposto. Por fim, o QD@MIP construído foi aplicado em quatro tipos de amostras biológicas: urina artificial, soro bovino, células cancerígenas e células saudáveis; todas com os devidos pré-tratamentos utilizando uma concentração fortificada de SAR, onde os valores de recuperação obtidos foram superiores a 80%. Finalmente, ressalta-se o potencial tecnológico deste trabalho, o qual sendo inédito permitirá a formação de recursos humanos de alta qualidade, uma vez que poderá ser explorada várias áreas do conhecimento, desde a síntese de materiais até a avaliação do material e os métodos analíticos em células tumorais. Palavras chaves: sarcosina; sensor óptico; polímero molecularmente impresso; ponto quântico; core@shell. 1. INTRODUÇÃO O câncer de próstata (CaP) é uma doença grave e alarmante, responsável por aproximadamente 10% de todas as mortes por câncer globalmente, classificando-se como o sexto tipo de câncer mais letal de todos. Além disso, essa doença corresponde às principais causas de óbito no geral de homens com idade entre 50 e 80 anos, correspondendo a 29,2% dos tumores incidentes [1]. No Brasil, o câncer de próstata ocupa a segunda posição em incidência entre os homens, ficando atrás apenas do câncer de pele; nos últimos anos, sua ocorrência tem aumentado preocupantemente, passando a ter uma estimativa de novos casos de 65.840 conforme estatística de 2020 do Instituto Nacional do Câncer [2]. Apesar do aumento preocupante dos casos da doença, o câncer de próstata é tratável quando diagnosticado precocemente. No entanto, se diagnosticado tardiamente, o CaP pode evoluir para formas agressivas e letais da doença, tornando- se metastático e resistente aos tratamentos existentes. [3]. Outro problema desse câncer é a sua tendência a não apresentar sintomas significativos, tornando-se uma doença "silenciosa". Isso frequentemente leva a diagnósticos tardios, quando o câncer já se espalhou para várias partes do corpo [4]. Atualmente existem vários tipos de exames para que possa ter um diagnóstico precoce do CaP, sendo o mais popular o exame de toque retal, onde o médico avalia o tamanho, forma e textura da próstata através do toque nas partes posterior e lateral da próstata [5]. Mas também existem exames mais sofisticados, que envolvem detectar níveis de concentração de certas substâncias específicas tanto no sangue quanto na urina, níveis diferentes do normal podem indicar a presença do CaP, assim como outros tipos de doença. Um desses exames bastante conhecido é o que mede a quantidade de uma proteína no sangue chamada de PSA (Antígeno Prostático Específico - Prostate Specific Antigen); essa proteína em níveis elevados pode indicar a presença do CaP, todavia, não é um indicativo com 100% de precisão, pois a alta quantidade de PSA pode tanto indicar a CaP em níveis benignos e menos agressivos quanto outros tipos de condições. Além disso, a quantidade de PSA no sangue naturalmente aumenta com o avanço da idade do paciente [6,7]. Esses fatores levam a resultados de falso-negativo ou falso-positivo, por isso é importante a necessidade de pesquisar e encontrar alternativas de diagnósticos mais precisos. Diante desses desafios, têm sido realizadas novas pesquisas para identificar e desenvolver potenciais biomarcadores que possam auxiliar no diagnóstico do câncer de próstata. Um desses biomarcadores em estudo é a sarcosina (SAR), também conhecida como N-metilglicina (CH3NHCH2COOH). A sarcosina é um aminoácido produzido pelo organismo humano e atua como um produto intermediário na síntese e degradação do aminoácido glicina, estando presente na urina, nos músculos e em outras estruturas do corpo humano [8]. No anos de 2009, a SAR foi destacada como um potencial biomarcador de para o câncer de próstata, permitindo distinguir tumores benignos, localizados ou metastáticos com alta precisão. Esse biomarcador (Figura 1) é produzido pelo organismo humano presente em músculos e outras estruturas, podendo ser detectado não somente no sangue, mas também na urina, permitindo obter um diagnóstico simples e não invasivo [9]. Figura 1 - Fórmula estrutural da sarcosina. A sarcosina está presente em uma variedade de fontes alimentares, como ovos, legumes, nozes, vegetais, peru, presunto e outras carnes; no corpo humano, está presente nos músculos esqueléticos e na próstata [10]. A SAR desempenha um papel essencial na síntese de ácidos nucleicos, contribuindo para a divisão celular e o crescimento do organismo [11]. A produção de sarcosina ocorre nas mitocôndrias por meio de duas vias: a primeira via a partir da dimetilglicina, catalisada pela dimetilglicina-desidrogenase (DMGDH), e a segunda via por meio da metilação da glicina, catalisada pela glicina-N-metiltransferase (GNMT) [12]. No desenvolvimento do câncer de próstata, ocorre uma alteração na metilação do DNA, resultando em uma produção excessiva da enzima GNMT. Isso leva a uma maior conversão de glicina em sarcosina, resultando em níveis elevados de sarcosina na urina e no sangue de pessoas com câncer de próstata [13]. Em pessoas saudáveis, os níveis de sarcosina na urina estão em torno de 6,0 ng mL-1, enquanto em pessoas com câncer de próstata, esses níveis podem chegar a 15 ng mL-1 [14]. Essas características fazem com que a molécula de SAR se torna um importante biomarcador utilizado nas pesquisas do combate ao câncer de próstata. Essas preocupações com a saúde masculina levaram os pesquisadores a estudar várias metodologias para o monitoramento da sarcosina. As técnicas mais comuns utilizadas para determinação de sarcosina são ensaios enzimáticos (colorimétricos ou fluorométricos), cromatografia gasosa (GC), cromatografia líquida (LC), espectrometria de massa (MS), LC/MS, cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa (HPLC/MS). ) ou HPLC/UV, eletroforese capilar e eletroforese capilar com detecção de fluorescência, etc. [15]. Todavia, a maioria desses métodos são custosos e caros, além de consumirem muito tempo de análise; portanto, a identificação simples, rápida, com menor custo da SAR em matrizes biológicas como a urina, ainda é um desafio, exige alta seletividade nos métodos de análise. Assim, o desenvolvimento de novos métodos para a determinação precisa e exata da sarcosina ainda é necessário para avanços no tratamento do câncer de próstata. Os sensores químicos representam métodos sensíveis para detectar substâncias e oferecem portabilidade e baixo custo, além de alta sensibilidade e seletividade. Por essas razões, os sensores se tornam uma alternativa atraente para auxiliar no diagnóstico rápido de diversas condições, incluindo o câncer de próstata. Embora os sensores biológicos sejam amplamente utilizados, o alto custo de anticorpos específicos, a dificuldade no manuseio, variações no tempo de incubação e no processo de lavagem, além da baixa estabilidade, têm motivado pesquisas por alternativas mais simples e econômicas. Uma dessas propostas de materiais são os polímeros molecularmente impressos (MIPs), que são nanomateriais plásticos, rígidos e tridimensionais, onde oferecem diversas vantagens, como seletividade, durabilidade e baixo custo. Eles atuam como uma fase extratora e possuem um reconhecimento altamente seletivo devido à formação de cavidades que são específicas em forma e tamanho para um analito particular, criando sítios de reconhecimento artificialmente. Esses materiais se assemelham a um sistema "antígeno-anticorpo", onde o analito pode ser comparado ao "antígeno" e o MIP funciona como o "anticorpo". Essa analogia é semelhante aos sistemas biológicos encontrados em organismos vivos. Por essa razão, os MIPs são considerados "anticorpos plásticos" ou "polímeros biomiméticos" [16]. Na síntese e polimerização MIPs, uma molécula molde (o analito de interesse) é utilizada para criar uma cavidade específica dentro da matriz polimérica. Durante esse processo, o analito é "impresso" na estrutura do polímero, formando uma cavidade que é complementar em forma e tamanho ao analito. Em seguida, o polímero é lavado para remover o analito e outros reagentes, resultando em uma matriz polimérica contendo uma cavidade seletiva, ou seja, com morfologia e sítios ativos que correspondem ao analito original. Essas cavidades uniformes são capazes de reter e extrair seletivamente o analito de interesse, mesmo em meio a uma amostra complexa, tornando os MIPs valiosos para aplicações analíticas e de detecção [17]. A Figura 2 esquematiza como é feita a síntese do MIP. Figura 2 - Representação esquemática da formação de um MIP por polimerização radicalar. Fonte: Autora do trabalho. Existem também os polímeros não impressos (Non Imprinted Polymers – NIPs), que são sintetizados de maneira semelhante aos MIPs, com a diferença de que não há presença de molécula molde para ser impressa no processo de polimerização, ou seja, esse polímero não possui cavidades definidas. A principal função dos NIPs é para estudos de comparação usando como um material de controle [18]. Os polímeros impressos possuem uma ampla versatilidade, não apenas atuam somente como fase extratora, mas podem se combinar com diferentes materiais para aprimorar e expandir suas aplicações Embora os MIPs tradicionais possam ser sintetizados com facilidade e rapidez, ainda enfrentam alguns desafios como a incompleta remoção do analito, distribuição não uniforme dos sítios ativos, lenta transferência de massa e a morfologia irregular. Portanto, diferentes estratégias de impressão de superfície são estabelecidas para contornar essas desvantagens [19]. Uma das estratégias para usar polímeros MIPs combinados com outros materiais é adotar uma configuração conhecida como "Core@Shell" (Núcleo@Casca). Nesta configuração, o MIP forma a "casca", envolvendo a superfície de outro material que representa o "núcleo" [20]. A composição core@shell tornou-se bastante popular nos últimos anos, oferecendo uma alternativa atraente na identificação e quantificação de moléculas químicas e biológicas. Essa abordagem resulta em um consumo menor de materiais e tempo de detecção reduzido. Além disso, ela melhora e/ou amplia a capacidade de reconhecimento das moléculas-alvo, reduz a adsorção de elementos não desejados e aumenta a taxa de transferência de massa [21]. Os quantum dots (QDs), ou pontos quânticos, são nanocristais semicondutores que, como mencionado anteriormente, podem ser usados como o núcleo principal junto com os MIPs para formar o core@shell (QD@MIP), sendo os materiais escolhidos para este trabalho. Esses materiais têm despertado considerável interesse nas últimas décadas devido às suas propriedades ópticas dependentes do tamanho, alta eficiência de luminescência e fotoestabilidade [22]. Uma das características mais fascinantes dos quantum dots (QDs) é a capacidade de gerar picos de comprimento de onda diferentes com base em seu tamanho e composição. Em outras palavras, os QDs podem emitir cores variadas e brilhantes dependendo de sua forma, tamanho e composição. Partículas de tamanho menor tendem a gerar emissões no espectro violeta, enquanto partículas maiores emitem cores mais próximas do laranja e vermelho [21]. Essa capacidade de ajustar a cor da emissão dos QDs oferece uma flexibilidade significativa para diversas aplicações. Os QDs podem ser sintetizados para emitir em uma ampla gama de cores e com uma alta eficiência luminosa. Isso os torna valiosos em tecnologias de display, iluminação, marcadores biológicos e sensores ópticos, onde cores distintas e brilhantes são necessárias para aplicações específicas. Em termos gerais, o funcionamento básico dos quantum dots (QDs) é muito semelhante ao de um átomo simples. Os QDs absorvem energia externa, o que resulta na excitação de elétrons da banda de valência para a banda de condução, um processo semelhante ao observado em semicondutores. Quando os elétrons excitados retornam para a banda de valência, eles liberam energia na forma de fótons, resultando em fluorescência [23]. Neste trabalho, foram considerados estudos sobre o biomarcador sarcosina (SAR), uma vez que existem poucos trabalhos utilizando polímeros molecularmente impressos para a detecção desse aminoácido e, por conseguinte, para a detecção do câncer de próstata (CaP). Isso evidencia um caráter inédito e um alto potencial de inovação no projeto, especialmente considerando que essa área está ganhando cada vez mais destaque e interesse científico. A construção de um sensor químico baseado em uma sonda óptica QD@MIP (nanocristais semicondutores Quantum Dots revestidos com o Polímero Molecularmente Impresso) foi criada para reconhecimento do aminoácido sarcosina (SAR) que, como foi explicado anteriormente, é um aminoácido de extrema importância para auxiliar no combate ao câncer de próstata. Esse QD@MIP foi submetido a um fluorímetro, para a detecção da fluorescência dos quantum dots ao interagirem com as moléculas alvo, permitindo uma análise qualitativa e quantitativa, além de outros estudos de otimização. 2. OBJETIVO O objetivo deste trabalho foi na síntese de materiais poliméricos altamente seletivos, baseados na tecnologia de impressão molecular e combinados com semicondutores nanocristalinos quantum dots para a construção do QD@MIP, para depois serem aplicados no desenvolvimento de métodos analíticos rápidos, portáteis, sensíveis e seletivos que permitam o monitoramento e detecção da sarcosina. Esses materiais foram devidamente estudados e otimizados para a posterior aplicação de amostra artificial de urina 3. MATERIAIS E MÉTODOS 3.1. Produtos químicos Durante o período de desenvolvimento desse trabalho, foram utilizados os seguintes reagentes para síntese dos MIPs: Sarcosina (SAR) como analito ou moléculas molde (template), fornecidos pela Sigma-Aldrich®); (3-aminopropil) trietoxisilano (APTES) como monômero funcional, Tetraetil-ortossilicato (TEOS) como agente silanizador e monômero estrutural, também fornecidos pela Sigma-Aldrich®; solução de amônia (NH3) 28-30% como iniciador radicalar fornecida pela Merck Millipore®; toda água utilizada durante os experimentos como solvente e como lavagem foi deionizada, obtida através do sistema Milli-Q Ultra Pure Water System, da marca Millipore®; o metanol foi utilizado como solvente de lavagem, sendo fornecido pela J.T. Baker®, para limpeza e remoção do analito e de outros reagentes remanescentes. Para a síntese do quantum dot, foram utilizados os seguintes reagentes: Telúrio metálico em forma de pó (Te), borohidreto de sódio (NaBH4), cloreto de cádmio (CdCL2), para formar o núcleo de CdTe; ácido 3-mercaptopropiónico (MPA), para formar a camada protetora do núcleo, todos fornecidos pela Sigma-Aldrich®. Para o controle do pH, uma solução de hidróxido de sódio (NaOH) 1,0 M, feita a partir de lentilhas dissolvidas em água e ácido clorídrico (HCl) 37%, ambos fornecidos pela Neon®; álcool Isopropílico para purificação dos quantum dots, fornecido pela J. T. Baker®. Para os estudos de seletividade, utilizaram-se outros três animoácidos: L- cisteína (CIS), L-histidina (HIS), e glicina (GLI), todos fornecidos pela Sigma-Aldrich®. Para a construção da urina sintética usada como amostra real, foram utilizados os seguintes reagentes: cloreto de sódio (NaCl), cloreto de potássio (KCl), cloreto de cálcio (CaCl2), fosfato de potássio monobásico (KH2PO4), cloreto de amônio (NH4Cl) e uréia (CH₄N₂O); onde o KCl foi fornecido pela Neon®, enquanto todos os demais reagentes foram fornecidos pela Synth®. 3.2. Instrumentação Para a obtenção dos espectros de fluorescência, foi utilizado um fluorímetro Lumex® Fluorat-02 Panorama com lâmpada de xenônio e cubeta de vidro de quartzo; o equipamento está acoplado num computador com o software Fluorat-02-Panorama (PanoramaPro) versão 2.3.4. A caracterização morfológica e da superfície dos materiais poliméricos foi realizada utilizando um microscópio eletrônico de varredura de alta resolução com fonte de elétrons por emissão de campo (FEG-SEM) da marca JEOL e modelo 7500F. Para caracterização das composições moleculares dos materiais e reagentes, foram realizadas análises de espectroscopia na região do infravermelho com transformada de Fourier, empregando um espectrofotômetro Vertex 70 da Bruker com detector DLaTGS, na faixa de leitura de 400 a 4000 cm-1. Com relação aos procedimentos de aquecimento e agitação, três agitadores magnéticos diferentes foram usados durante os experimentos: Solad® Modelo SL 55 91/A, Fisatom® Modelo 751 e Kasvi® modelo K45-1810H. Para função apenas de aquecimento, foi utilizada uma manta aquecedora da marca Nova® modelo NI 1013. Para homogeneização das soluções, foram usados um equipamento de ultrassom da Ultronique® modelo Q3.0/25A e/ou um homogeneizador de amostras da marca Norte Científica® modelo NH 2200. O pH foi ajustado com um pHmetro da marca BEL® modelo PHS3BW. Durante o processo de lavagem, a separação dos sólidos do sobrenadante foi realizada utilizado uma centrífuga da marca Kasvi® modelo K14-4000, com velocidade máxima de 4000 rpm. Para a pesagem dos reagentes, foi utilizada uma balança semi-analítica da marca Shimadzu® modelo ATX224. 3.3. Síntese do quantum dot A síntese dos nanocristais quantum dots CdTe encobertos com ácido mercaptopropiônico (MPA) foi realizada e adaptada de acordo com Yang et al. [24]. Um volume de 150 mL de água ultrapura foi adicionado num balão de fundo redondo e deixado borbulhando por 5 minutos, após isso, foram adicionados 216 mg de cloreto de cádmio e 192 μL de MPA, a mistura final apresentou uma aparência esbranquiçada. Nessa mistura, foi adicionada uma solução de hidróxido de sódio 0,1 M até o pH ser ajustado para 9, nota-se que após esse ajuste de pH, a substância deixou de ser branca e tornou-se transparente. O frasco foi submetido a uma manta térmica e mantido na temperatura de 95ºC. Em um erlenmeyer de 25 mL contendo 9,5 mL de água ultrapura, 40 mg de telúrio metálico na forma de pó foi adicionado junto com 30 mg de borohidreto de sódio. A solução foi deixada a 75ºC sob agitação magnética a borbulhamento de gás N2. Após alguns minutos, a solução se tornou uma cor roxa e, imediatamente, foi transferida no frasco contendo a mistura de CdCl2 e MPA, a mistura final exibiu uma coloração alaranjada e foi mantida a 95ºC selada em ambiente anaeróbio por duas horas. O resultado final foi um quantum dot feito de CdTe e encoberto com MPA, que foi lavado com álcool isopropílico numa proporção 1:1 (v:v) e separado por centrifugação, o material lavado foi suspendido em água ultrapura e estocado numa geladeira. Na Figura 3 é mostrada uma fotografia do quantum dot sintetizado, nota- se que ele tem uma coloração alaranjada e brilha em verde quando submetido a uma fonte de luz (UV). Na Figura 4 é mostrada a etapa de criação do CdTe sendo encoberto pelo MPA nota-se que o grupo tiol (-SH) da molécula de MPA se adere na superfície do QD e o grupo carboxila (-COOH) fica na parte exposta, no qual, formará carga na superfície e permitirá a imobilização do polímero impresso [25]. Figura 3 - Fotografia de uma solução contendo quantum dot, ao ser iluminada, o material emite uma cor característica. Fonte: Autora do trabalho. Figura 4 - Esquema ilustrado da síntese do quantum dot CdTe encoberto com MPA. Fonte: Autora do trabalho. 3.4. Síntese do QD@MIP A síntese do sensor QD@MIP foi realizada e adaptada baseando-se também na literatura de Yang et al. [24], com as devidas adaptações. Vale lembrar que foram feitas duas sínteses, uma utilizando o analito de interesse sarcosina (SAR), assim como foi feito o QD@NIP sem a utilização de nenhum analito. Ao término da síntese, os polímeros foram lavados para a remoção da SAR e dos demais reagentes remanescentes, em seguida, foram feitas análises de religação/adsorção do QD@MIP em diferentes condições de concentração, tempo e pH, além da seletividade em relação a outras substâncias. Primeiramente, 0,6 mL da suspensão de QD anteriormente preparada (cerca de 8 mg) foi dispersada num volume de 25 mL de água ultrapura e deixada sob agitação magnética e borbulhamento por 10 minutos. Depois disso foram adicionados o monômero funcional APTES, o monômero estrutural TEOS e o iniciador radicalar amônia na proporção de 1:5:7,5 respectivamente (cerca de 20:100:150 μL); a mistura foi submetida a um ambiente anaeróbio sob agitação e temperatura ambiente por 24 horas. Após esse período, foram adicionadas 6,0 mg de SAR mais 20 μL de APTES, 50 μL de TEOS e 30 μL de amônia na mistura e deixados novamente sob ambiente anaeróbio em temperatura ambiente e agitação magnética por 24 horas. As fórmulas estruturais dos componentes poliméricos são mostradas na Figura 5. Figura 5 - Fórmulas estruturais do TEOS (monômero estrutural) e o APTES (monômero funcional. Fonte: Sigma-Aldrich [26] O QD@MIP e o QD@NIP formados foram lavados utilizando uma mistura de solventes água e metanol 50:50 (v:v) e separados por centrifugação diversas vezes (cerca de 6 ou 7 vezes), sendo que a última lavagem foi 100% metanol. As partículas formadas foram dispersas em 4 mL de água e estocadas numa geladeira. Na figura 6 é mostrado um esquema de modo simples e resumido de como ocorreu a síntese do QD@MIP: o polímero é construindo através dos monômeros funcional e estrutural, encobrindo a superfície do quantum dot, a síntese vai acontecendo e o polímero sendo formado em volta do analito. Após o processo de lavagem e remoção do analito, resulta-se num polímero impresso com cavidades sensíveis e específicas para cada um dos três analitos. Figura 6 - Esquema da síntese completa do QD@MIP: (a) Processo de encobrimento do CdTe pelo MPA; (b) Polimerização do MIP na superfície do QD, formando o QD@MIP; (c) Lavagem para a remoção do analito, obtendo o material com as cavidades seletivas. Fonte: Autora do trabalho. 3.5. Estudos de caracterização 3.5.1. Microscopia Eletrônica de Varredura A Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) é uma técnica de microscopia na qual um feixe de elétrons focalizado é direcionado para a superfície da amostra. Esse feixe de elétrons interage com a matéria da amostra, gerando diferentes tipos de sinais que fornecem informações detalhadas sobre a morfologia e composição química do material. O microscópio eletrônico contém uma fonte que gera o feixe de elétrons que, durante o ensaio, é continuamente disparado na superfície da amostra, realizando uma varredura minuciosa. As interações entre os elétrons do feixe e os átomos da amostra resultam na emissão de elétrons secundários, retroespalhados, ou outros tipos de sinais, dependendo da técnica específica utilizada. Esses sinais são capturados por detectores presentes no equipamento, sendo analisados e interpretados para produzir imagens de alta resolução da superfície da amostra. 3.6. Estudos de otimização 3.6.1. Protocolo de medidas O protocolo de medida adotado para o sensor QD@MIP projetado foi o seguinte: Primeiramente foi preparada uma solução estoque de 30 mmol L-1 da sarcosina em água. A partir desta solução estoque foram preparadas seis soluções de 3,0 mL com concentrações de 5, 10, 15, 20, 25 e 30 mmol L-1; cada solução foi colocada em um pequeno frasco de plástico com tampa para permitir homogeneização. Em seguida, foi adicionada uma quantidade de aproximadamente 100 μg de QD@MIP na solução líquida contendo a SAR para fins de interação; a mistura foi então colocada em um homogeneizador para obter tempo de interação e pH otimizados. Após a interação da SAR com o QD@MIP (ou QD@NIP), a solução foi vertida em uma cubeta e colocada no fluorímetro. A ideia principal nesse trabalho é que a sarcosina, ao interagir com as cavidades do QD@MIP, afete a fluorescência que foi gerada através no quantum dot no núcleo. O equipamento excita o QD fazendo-o gerar fluorescência, que por sua vez seria detectada e medida pelo mesmo, mas com a presença da sarcosina, o valor dessa fluorescência detectada no fluorímetro acaba sendo diferente, sendo uma alteração diferente para cada concentração específica, como é mostrado na Figura 7, essas características permitem realizar analises quantitativas do material QD@MIP. Figura 7 – O QD@MIP tem sua fluorescência específica quando excitado, mas seu valor se altera na presença do analito sarcosina. Fonte: Autora do trabalho. No caso dos testes realizados nesse trabalho, o incremento da concentração da sarcosina promove uma diminuição do sinal nessa região de comprimento de onda, em outras palavras, a fluorescência é inversamente proporcional à concentração da SAR. Para a construção das curvas de calibração, foi importante incluir a medida da fluorescência do branco nos espectros, pois utilizou-se uma variação (Δ) da intensidade da fluorescência que consiste na diferença entre a intensidade do QD@MIP no branco e a intensidade do QD@MIP com analito, nesse caso, a curva e a linearidade apresentaram um comportamento crescente. O princípio de funcionamento do quantum dot (QD) como sensor químico baseia-se nas suas propriedades fluorescentes e na sensibilidade da sua luminescência ao estado de superfície das nanopartículas. A detecção ocorre devido à interação (química ou física) com o analito, que pode resultar no aumento da fotoluminescência (enhancement) ou na sua extinção (quenching). A maioria dos sistemas de detecção que utilizam quantum dots não se baseia diretamente na interação com a superfície do QD, mas sim no fluxo de energia entre o QD como doador de energia e as moléculas do analito como receptor. Esse fenômeno é conhecido como Transferência de Energia de Ressonância Förster (Förster resonance energy transfer - FRET). O FRET é uma transferência de energia não radiativa que ocorre entre o doador fluorescente (quantum dot) e o receptor de energia menor (analito) por meio de interações dipolo-dipolo. Em outras palavras, quando o brilho fluorescente do doador (QD) diminui enquanto o brilho do receptor (analito) aumenta, isso indica que o fenômeno de FRET está ocorrendo [27,28]. 3.6.2. Otimização para o tempo de interação e pH da solução Na etapa de otimização dos QD@MIPs, foram avaliados os efeitos de dois parâmetros diferentes, com a finalidade de encontrar as melhores condições analíticas para aplicar a religação dos QD@MIPs com a sarcosina: tempo de interação e pH da solução. Para verificar qual é a influência do tempo de interação entre o analito e o QD@MIP, foram realizados experimentos entre 30 e 180 minutos de interação. Utilizou-se um frasco de plástico com 3 mL e concentração de 20 mmol L-1 , nos diferentes tempos: 30, 60, 90, 120, 150 e 180 minutos. Com a metodologia previamente explicada, os frascos foram selados submetidos ao homogeneizador e as medidas no fluorímetro foram feitas em triplicada. Estudos de religação foram feitos em soluções com diferentes valores de pH: 3, 5, 7, 9 e 11; O pH das soluções foi controlado usando soluções de 0,1 mol L-1 de HCl e 0,1 mol L-1 de NaOH. As medidas foram feitas utilizando a concentração de 20 mmol L-1 explicada no protocolo de medidas descrito anteriormente. 3.7. Perfil de resposta do sensor em diferentes concentrações de sarcosina Ao otimizar cada um dos dois parâmetros corretamente, foi obtida uma curva analítica da variação da intensidade da fluorescência em função da concentração em 605 nm, com a finalidade de avaliar o perfil de resposta do sensor e estimar o limite de detecção e quantificação. Foram aplicadas 6 soluções de 3,0 mL de sarcosina com as concentrações de 5, 10, 15, 20, 25 e 30 mmol L-1 , usando água como solvente e as medições foram realizadas seguindo o protocolo previamente explicado. 3.8. Avaliação da seletividade do QD@MIP Tendo sido o QD@MIP otimizado em relação à construção e análise, a seguinte etapa de estudo foi a análise da seletividade do sensor proposto. Para realizar esses estudos, foram selecionadas três outras substâncias: L-cisteína (CIS), L-histidina (HIS), e glicina (GLI), cujas fórmulas estruturais são apresentadas na Figura 8. Todas essas três substâncias, assim como a sarcosina, são aminoácidos com estruturas muito semelhantes, inclusive a glicina é um precursor na síntese da sarcosina no corpo humano, por isso elas foram escolhidas nos testes de seletividade. Para cada um desses aminoácidos, foram preparadas soluções com o mesmo protocolo descrito anteriormente, sendo as mesmas concentrações e água como solvente para os analitos e os interferentes: 5, 15 e 30 mmol L-1, dissolvidos em 3,0 mL de água e aproximadamente 100 μg de polímero; todos com os devidos parâmetros otimizados. Figura 8 - Fórmulas estruturais a sarcosina e dos aminoácidos empregados como interferentes. Fonte: Sigma-Aldrich [26]. 3.9. Aplicação do QD@MIP em amostra de urina artificial Após a realização de todos os experimentos de otimização, caracterização e seletividade, a eficiência do QD@MIP foi estudada utilizando uma amostra de urina sintética produzida dentro do laboratório. A amostra foi construída baseada em Wong et al. [29] misturando os seguintes reagentes em um balão de 100,0 mL de água: 49,0 mmol L-1 de NaCl; 20,0 mmol L-1 de KCl; 10,0 mmol L-1 de CaCl2; 15,0 mmol L-1 de KH2PO4; 18,0 mmol L-1 de NH4Cl; e 18,0 mmol L-1 de ureia. Após a adição dessas soluções, o balão foi preenchido com água ultrapura. Após a formação da amostra de urina artificial, ela foi pré-tratada e dividida em três partes: uma amostra diluída em 10 vezes (10x), uma amostra diluída em 50 vezes (50x) e uma não diluída, totalizando em 3 amostras diferentes para serem analisadas. 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO Os resultados apresentados a seguir se dividem em quatro etapas. A primeira mostra os estudos de caracterização da composição molecular utilizando Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR) e o da morfologia do QD@MIP e QD@NIP usando Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV). A segunda mostrará os estudos de otimização das condições de análise do sensor em relação à religação dele com a sarcosina, para o qual foram avaliados os parâmetros de tempo de interação (incubação) e pH da solução da análise. A terceira etapa mostra os parâmetros de resposta do QD@MIP, tais como a faixa de trabalho e outras figuras de mérito, assim como também sua seletividade, repetibilidade e reprodutibilidade, sob as condições otimizadas. Finalmente, a quarta e última etapa mostrará a aplicação do QD@MIP em amostra biológica de urina artificial. 4.1. Caracterização morfológica dos materiais 4.1.1. Infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) A espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) tem a finalidade de caracterizar as estruturas e composição dos materiais, como as dos polímeros impressos, dos quantum dos, dos analitos e dos reagentes empregados na síntese. Essa análise foi realizada com o propósito de detectar a presença de grupos funcionais presentes nos polímeros e no quantum dot. Na Figura 9 é mostrado o gráfico do espectro de IR para o polímero impresso QD@MIP, o polímero não-impresso QD@NIP e o monômero estrutural TEOS. Observando-se o gráfico e identificando as bandas em destaque: As bandas localizadas em 1040 cm-1 presentes nos três materiais correspondem aos modos de alongamento do grupo siloxano (-Si-O-Si-), de acordo com dados coletados na literatura [30]. Esse grupo está presente na molécula de TEOS, como foi mostrado anteriormente na Figura 5, vale lembrar também que o monômero estrutural é o componente principal da estrutura molecular dos polímeros impressos MIP e NIP, o que justifica a similaridade das bandas mostrado no gráfico. 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 20 40 60 80 100 T ra n s m it â n c ia / % Número de onda / cm -1 MIP NIP TEOS 2976 cm -1  C-H 1390 cm -1 C-H 1040 cm -1  Si-O-Si 960-783 cm -1  C-H Figura 9 -Espectros do IR para o polímero impresso QD@MIP da sarcosina, do polímero não impresso QD@NIP e também do TEOS. Fonte: Autora do trabalho. Observando-se os espectros da figura acima, notou que tanto os dois polímeros MIP e NIP possuem, nos seus espectros, a banda destacada em 1040 cm-1, uma vez que todos foram sintetizados utilizando a mesma metodologia, diferenciando-se apenas da presença ou não da molécula molde. Portanto, tanto o QD@MIP quanto o QD@NIP e o monômero TEOS são compostos feitos com a mesma estrutura molecular. Analisando ainda as bandas do espectro do TEOS, a banda no 2976 cm-1 corresponde ao estiramento C-H dos grupos éster, enquanto a banda em 1390 cm-1 são as deformações assimétricas do C-H; as bandas em 930 e 783 cm-1 também são associadas as ligações C-H da molécula de TEOS. Todas essas bandas relacionadas a ligação C-H possuem intensidade bastante menores ou quase nulas nos espectros dos polímeros, o motivo disso é porque, durante o processo de polimerização, os grupos C-H do TEOS foram removidos, restando apenas os grupos siloxano em destaque [31]. Para uma compreensão melhor do processo de síntese do quantum dot sem estar encoberto pelo MIP/NIP, um espectro de FTIR do quantum dot puro e o reagente MPA foi construído com a finalidade de comparar ambos os espectros e comprovar que houve o processo de encobrimento, pois o quantum dot CdTe é coberto pelo MPA. A Figura 10 mostra o FTIR do MPA puro e do quantum dot CdTe revestido com esse MPA suas bandas foram estudadas conforme relatos da literatura [32]. 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 20 40 60 80 100 1400-1250 cm -1 CH 2 1700 cm -1  COO - 3300-2500 cm -1  S-H 1554 cm -1  COO - T ra n s m it â n c ia / % Número de onda / cm -1 QD MPA Figura 10 - Espectro do IR do CdTe e do MPA, junto com sua estrutura. Fonte: Autora do trabalho. Para o reagente MPA no espectro: existe uma banda longa em 1700 cm-1, esta banda corresponde à agitação COO- do ácido carboxílico; a banda grande em 3300- 2500 cm-1 corresponde ao grupo de agitação S-H e as bandas em 1400 e 1250 cm-1 são para os grupos CH2. Para o quantum dot CdTe: o 1554 cm-1 corresponde ao COO- formado quando o MPA reveste o nanocristal, onde o grupo tiol do MPA interage com o cristal CdTe e o grupo COO-, no lado oposto da molécula, torna-se a nova superfície revestida com CdTe. 4.1.2. Microscopia eletrônica de varredura (MEV) Para observar a estrutura de formação e uniformidade dos polímeros, foram registradas imagens visando microscopia eletrônica de varredura por emissão de campo. A análise foi feita com o polímero impresso QD@MIP e com o QD@NIP, portanto, foram obtidas 2 imagens que são observadas na Figura 11. Figura 11 - Imagem da microscopia eletrônica de varredura do polímeros impresso QD@MIP e do não impresso QD@NIP. Fonte: Autora do trabalho. É observado na imagem que o QD@MIP apresentou vários aglomerados de partículas com uma distribuição homogênea e uma rugosidade maior, enquanto pro QD@NIP foi mais irregular. Este resultado é esperado uma vez que os polímeros impressos possuem cavidades formadas a partir da molécula molde, enquanto os polímeros não impressos não possuem a molécula molde, portanto, sua morfologia é totalmente irregular. Utilizando as informações coletadas no equipamento e mostradas na imagem, foi realizada uma medição do tamanho médio das partículas do polímeros impressos QD@MIP, seu diâmetro médio foi de 2-10 µm. Não foi possível calcular esse tamanho médio do diâmetro das partículas do QD@NIP, pois apresentou-se formar totalmente irregulares, como foi mencionado anteriormente. 4.2. Estudos de otimização 4.2.1. Otimização do tempo de interação entre o analito e o QD@MIP Para verificar qual é a influência do tempo de interação entre a sarcosina e o QD@MIP, foram realizados experimentos com os seguintes tempos de incubação: 30, 60, 90, 120, 150 e 180 minutos. Foram obtidos os espectros da fluorescência em função do comprimento de onda dos dois polímeros, utilizando uma concentração de 20 mmol L-1 da SAR num volume de 3,0 mL de água e 100 μg de polímero. Vale lembrar que esse valor diminui conforme adiciona-se quantidade de analito devido ao efeito de preenchimento das cavidades no MIP. Os resultados são mostrados nas figuras a seguir. 580 590 600 610 620 0 5 10 15 20 25 In te n s id a d e d a f lu o re s c ê n c ia Tempo / min 30 60 90 120 150 180 MIP 580 590 600 610 620 630 0 5 10 15 20 25 NIP In te n s id a d e d a f lu o re s c ê n c ia Tempo / min 30 60 90 120 150 180 Figura 12 - Espectros de fluorescência para diferentes tempos da sarcosina dissolvida em água e interagindo o QD@MIP e QD@NIP, para monitoramento. As análises foram realizadas em 3,0 mL de solução contendo 20 mmol L-1 do aminoácido e 100 μg do polímero. Fonte: Autora do trabalho. 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 0 2 4 6 8 10 12 14 16  I n te n s id a d e d a f lu o re s c ê n c ia Tempo / min MIP NIP Figura 13 - Respostas de fluorescência obtidas para QD@MIP e QD@NIP em relação ao tempo de incubação com a sarcosina. As medições foram feitas em triplicata e correspondem ao valor médio dos experimentos. Fonte: Autora do trabalho. Foi observado que que o valor de fluorescência máxima do QD@MIP foi de 605 nm, portanto, o valor da intensidade da fluorescência foi coletado nesse comprimento de onda. Observou-se também que nos gráficos da Figura 12, o QD@MIP apresentou valores de variação de fluorescência maiores do que os QD@NIPs, o que é o comportamento esperado desses materiais, uma vez que os polímeros impressos conseguem reter mais analito na sua superfície graças as cavidades seletivas e sensíveis. Na Figura 13, foram construídas curvas que mostram a variação da intensidade da fluorescência em função do tempo de interação em minutos, essa variação foi obtida com a diferença da fluorescência entre o branco e a concentração de 20 mmol L-1. As medidas foram todas feitas em triplicada (n = 3). Analisando os resultados mostrados nas figuras, foi possível observar que a interação entre sarcosina e QD@MIP foi aumentando conforme foi aumentando o tempo de incubação, onde o tempo de 120 minutos (2 horas) foi onde essa interação foi máxima e também foi onde ocorreu a saturação do polímero, ou seja, a partir desse ponto não ocorreu nenhum aumento significativo da variação da fluorescência. Além disso, observou-se que a variação foi maior com o QD@MIP em relação ao QD@NIP, devido as suas cavidades sensíveis e seletivas. Portanto, a conclusão final nos estudos do tempo de interação mostrou que 120 minutos é o tempo ideal para que haja a total saturação do analito sarcosina com o seu respectivo QD@MIP. 4.2.2. Avaliação do pH de medida da solução O efeito do pH da solução foi avaliado com a finalidade de estudar o comportamento dos polímeros com o aminoácido dependendo da acidez/basicidade. Tendo preparado as soluções com os valores de pHs pré-estabelecidos e realizadas as medidas de fluorescência, foram obtidos os espectros da fluorescência em função do comprimento de onda para MIP e NIP, utilizando as mesmas quantidades descritas anteriormente no teste com o tempo de retenção. Os resultados obtidos são mostrados nas figuras a seguir. 580 590 600 610 620 630 0 5 10 15 20 25 In te n s id a d e d a f lu o re s c ê n c ia Comprimento de onda / nm pH 3 pH 5 pH 7 pH 9 pH 11 MIP 580 590 600 610 620 630 0 5 10 15 20 25 NIP In te n s id a d e d a f lu o re s c ê n c ia Comprimento de onda / nm pH 3 pH 5 pH 7 pH 9 pH 11 Figura 14 - Espectros de fluorescência para diferentes valores de pH da sarcosina dissolvida em água e interagindo seu QD@MIP e também o QD@NIP. As análises foram realizadas em 3,0 mL de solução contendo 20 mmol L-1 do aminoácido e 100 μg do polímero. Fonte: Autora do trabalho. 2 4 6 8 10 12 0 2 4 6 8 10  I n te n s id a d e d a f lu o re s c ê n c ia pH MIP NIP Figura 15 - Respostas de fluorescência obtidas para QD@MIP e QD@NIP em relação ao valor do pH da solução. As medições foram feitas em triplicata e correspondem ao valor médio dos experimentos em triplicata. Fonte: Autora do trabalho. Na Figura 14, é mostrado o gráfico do espectro da intensidade da fluorescência em função do comprimento de onda, onde o valor máximo foi coletado em 605 nm. Após isso foi construída duas curvas em um gráfico que mostra a variação da intensidade da fluorescência em função do valor do pH, essa variação foi obtida com a diferença da fluorescência entre o branco e a concentração de 20 mmol L-1. As medidas foram todas feitas em triplicada (n = 3). Os resultados mostrados nas figuras das respostas da variação da fluorescência com a mudança do pH indicaram que o melhor pH da solução para se realizar as medidas foi o pH neutro (próximo de 7) onde a variação da fluorescência foi maior assim como a adsorção do analito sarcosina, além de também ser maior para o QD@MIP em relação ao QD@NIP. Portanto, estudos da acidez/basicidade da solução mostraram um pH neutro é o mais indicado para as análises de adsorção. 4.2.3. Perfil de resposta do QD@MIP em diferentes concentrações de sarcosina Os testes de otimização dos parâmetros de tempo de retenção e pH foram devidamente medidos e calculados nas duas sessões anteriores. De acordo com os resultados encontrados, concluiu-se que um tempo de incubação de 120 minutos e um pH 7 são as condições adequadas para realizar as medidas de fluorescência dos QD@MIP e QD@NIP. Com essas configurações estabelecidas, foram construídas as curvas analíticas em diferentes concentrações conhecidas de sarcosina, com a finalidade de encontrar a regressão linear, equação da reta e os limites de detecção e quantificação. A Figura 16 mostra os gráficos dos espectros da intensidade da fluorescência em função do comprimento de onda para os dois polímeros impresso e não impresso. 580 590 600 610 620 0 5 10 15 20 25 MIP MIP In te n s id a d e d a f lu o re s c ê n c ia Comprimento de onda / nm 5 mmol L -1 10 mmol L -1 15 mmol L -1 20 mmol L -1 25 mmol L -1 30 mmol L -1 580 590 600 610 620 0 5 10 15 20 25 NIP In te n s id a d e d a f lu o re s c ê n c ia Comprimento de onda / nm 5 mmol L -1 10 mmol L -1 15 mmol L -1 20 mmol L -1 25 mmol L -1 30 mmol L -1 Figura 16 - Espectro da fluorescência na região do UV-Vis obtido na aplicação de diferentes concentrações de sarcosina dissolvida em água com as condições previamente otimizadas. Fonte: Autora do trabalho. Baseado na análise dos espectros de fluorescência na figura anterior para o QD@MIP e o QD@NIP, foi observado que o polímero impresso QD@MIP apresentou uma boa variação da fluorescência e adsorveu mais analito do que o QD@NIP, o que é um resultado esperado e positivo, uma vez que eles possuem as cavidades impressas sensíveis ao analito estudado. O decréscimo dos picos com o aumento da concentração confirma a propriedades quenching da sarcosina, um valor fixo da fluorescência foi coletado baseando na fluorescência máxima dos polímeros, que foi de 505 nm. Com esses valores coletados, foram construídas curvas analíticas da variação da fluorescência em função da concentração para o QD@MIPs e o NIP, mostrados na Figura 17. Os resultados a seguir mostram sua curva analítica junto com o coeficiente angular, suas equações da reta e os limites de detecção e quantificação. 5 10 15 20 25 30 0 3 6 9 12 15 R 2 = 0,999  I n te n s id a d e d a f lu o re s c ê n c ia Concentração / mmol L -1 MIP 5 10 15 20 25 30 0 3 6 9 12 15 R 2 = 0,999 NIP  I n te n s id a d e d a f lu o re s c ê n c ia Concentração / mmol L -1 Figura 17 - Curvas analíticas da variação da intensidade da fluorescência em função da concentração de sarcosina (de 5 a 30 mmol L-1) para os polímeros MIP e NIP. Fonte: Autora do Trabalho. A curva analítica do QD@MIP apresentou uma boa linearidade entre 5 e 30 mmol L-1, com um coeficiente de correlação (R) de 0,999, enquanto o coeficiente do QD@NIP também foi de 0,999 na mesma faixa de concentração. Utilizando o software OriginLab® 9.0, foi possível obter as equações das curvas analíticas: 𝑦𝑀𝐼𝑃 = 1,79(±0,088) + 0,374(±0,005)𝑥𝑀𝐼𝑃 𝑦𝑁𝐼𝑃 = −0,294(±0,095) + 0,272(±0,003)𝑥𝑁𝐼𝑃 Onde y corresponde à variação da fluorescência medida e x corresponde à concentração da sarcosina em mmol L-1. Com as equações da regressão linear obtidas, foi possível encontrar os coeficientes angulares e lineares para ambos os polímeros e, também com o valor da sensibilidade (s) foi possível calcular os limites de detecção e quantificação dos polímeros. O limite de detecção é calculado através da razão entre o desvio padrão da média do coeficiente linear de três retas (n = 3) e a média dos coeficientes angulares multiplicado por 3,3; enquanto o limite de quantificação é calculado usando a mesma razão mencionada anteriormente, mas multiplicada por 10. Todos esses valores são mostrados na Tabela 1. Tabela 1 - Dados dos parâmetros obtidos nas curvas analíticas dos polímeros MIP e NIP. Parâmetros QD@MIP QD@NIP Faixa de resposta (mmol L-1) 5 - 30 5 - 30 Coeficiente angular (sensibilidade) 0,374 0,272 Coeficiente Linear 1,79 - 0,294 Limite de Detecção (mmol L-1) 0,78 1,15 Limite de Quantificação (mmol L-1) 2,35 3,49 Fonte: Autora do trabalho. Ao comparar as duas curvas, ficou evidente que o QD@MIP adsorveu muito mais o analito do que o QD@NIP, comprovando a capacidade seletiva e alta sensibilidade do polímero impresso, isso pode ser observado pelo aumento maior da diferença de fluorescência aumentou conforme foi aumentando a concentração da sarcosina. Os dados obtidos na Tabela 1 evidenciam claramente, pois a sensibilidade do MIP foi maior do que a do NIP, e seus limites de detecção e quantificação foram menores, o que são resultados esperados e promissores. 4.2.4. Estudos da capacidade de repetibilidade do QD@MIP A repetibilidade representa a concordância entre os resultados de medidas feitas sucessivamente de um mesmo método. Essas medidas são realizadas sob as mesmas condições de procedimento, mesmo analista e equipamento/instrumento, utilizando os mesmos parâmetros como temperatura, pH, tempo, concentração, entre outros. Todas as medidas e repetições são feitas em um curto intervalo de tempo [33]. No fluorímetro, foram feitas 10 medidas consecutivas para cada concentração nos QD@MIP e QD@NIP, sob as mesmas condições utilizadas para encontrar a curva analítica. Tendo obtido esses valores, foram calculadas as médias das concentrações, junto com o Desvio Padrão e o Desvio Padrão Relativo (RSD), cujo cálculo é mostrado na equação abaixo: 𝑅𝑆𝐷 = 𝑠 �̅� 100 Onde “s” é o Desvio Padrão e “�̅�” é a média dos valores, o valor do RSD é dado em porcentagem. Os resultados calculados a seguir são mostrados nas tabelas e curvas analíticas obtidos. Tabela 2 - Valores calculados da média das fluorescências, desvio padrão e desvio padrão relativo para n = 10. Concentração (mmol L-1) Δ Fluorescência Média Desvio Padrão RSD (%) MIP 5,0 2,59 0,449 17,34 10,0 4,52 0,482 10,65 15,0 6,29 0,592 9,42 20,0 8,76 0,380 4,34 25,0 10,76 0,228 2,12 30,0 12,82 0,375 2,93 NIP 5,0 0,85 0,513 60,40 10,0 2,42 0,427 17,63 15,0 3,32 0,353 10,61 20,0 4,24 0,538 12,71 25,0 5,22 0,512 9,81 30,0 6,65 0,253 3,80 Fonte: Autora do trabalho. Com as médias das fluorescências obtidas, foi possível construir o gráfico da curva da fluorescência em função da concentração, mostrado na Figura 18. 5 10 15 20 25 30 0 3 6 9 12 15 R 2 = 0,999  I n te n s id a d e d a F lu o re s c ê n c ia Concentração / mmol L -1 MIP 5 10 15 20 25 30 0 3 6 9 12 15  I n te n s id a d e d a F lu o re s c ê n c ia Concentração / mmol L -1 R 2 = 0,993 NIP Figura 18 - Resultados obtidos para a análise da repetibilidade do QD@MIP e NIP com medidas feitas em 10 vezes (n = 10). Fonte: Autora do trabalho. 𝑦𝑀𝐼𝑃 = 0,426(±0,133) + 0,413(±0,006)𝑥𝑀𝐼𝑃 𝑦𝑁𝐼𝑃 = −0,032(±0,191) + 0,221(±0,008)𝑥𝑁𝐼𝑃 Os resultados mostrados acima evidenciam que o QD@MIP da sarcosina apresentou um desvio padrão relativo abaixo de 20%, o que é um resultado relativamente positivo, sendo ainda mais eficiente do que o QD@NIP. 4.2.5. Estudos da capacidade de reprodutibilidade do QD@MIP A reprodutibilidade é o grau de concordância entre os resultados das medições de uma única amostra sob condições variadas como equipamento, material, local, analista, etc. [33]. Nesse experimento, a reprodutibilidade foi aplicada utilizando três QD@MIPs e QD@NIPs diferentes, nas mesmas amostras sob as mesmas condições realizadas nos experimentos anteriores. A tabela apresentada a seguir mostra os resultados obtidos junto com as médias e os desvios calculados. Em seguida, são apresentados os gráficos da média das fluorescências dos polímeros em função da concentração. Tabela 3 - Valores calculados da média das fluorescências, desvio padrão e desvio padrão relativo para n = 3 (Pol. = polímero). Δ Fluorescência Concentração (mmol L-1) Pol. 1 Pol. 2 Pol. 3 Média Desvio Padrão RSD MIP 5,0 3,69 3,43 3,39 3,50 0,163 4,67 10,0 5,50 5,40 5,13 5,34 0,190 3,56 15,0 7,19 7,31 6,97 7,16 0,170 2,38 20,0 8,94 9,03 9,07 9,01 0,067 0,75 25,0 11,65 11,20 10,76 11,20 0,443 3,95 30,0 13,15 12,42 12,43 12,66 0,422 3,33 NIP 5,0 1,10 1,28 1,01 1,13 0,138 12,20 10,0 2,36 2,39 2,51 2,42 0,081 3,33 15,0 3,29 3,30 3,55 3,38 0,146 4,31 20,0 5,07 5,40 4,89 5,12 0,262 5,11 25,0 6,69 6,64 6,67 6,67 0,026 0,39 30,0 7,88 7,83 7,10 7,60 0,434 5,71 Fonte: Autora do trabalho. Com as médias das fluorescências obtidas, foi possível construir o gráfico da curva da fluorescência em função da concentração, mostrado na Figura 19. 5 10 15 20 25 30 0 3 6 9 12 15  I n te n s id a d e d a f lu o re s c ê n c ia Concentração / mmol L -1 MIP R 2 = 0,999 5 10 15 20 25 30 0 3 6 9 12 15 R 2 = 0,996  I n te n s id a d e d a f lu o re s c ê n c ia Concentração / mmol L -1 NIP Figura 19 - Resultados obtidos para a análise da reprodutibilidade do QD@MIP e NIP com medidas feitas com média de 3 polímeros (n = 3). Fonte: Autora do trabalho. As equações das curvas analíticas obtidas e ajustadas respectivamente com valores de coeficientes de linearidade (R) de 0,999 e 0,996, são descritas a seguir: 𝑦𝑀𝐼𝑃 = 1,65(±0,072) + 0,369(±0,004)𝑥𝑀𝐼𝑃 𝑦𝑁𝐼𝑃 = −0,437(±0,177) + 0,284(±0,008)𝑥𝑁𝐼𝑃 Os resultados mostrados acima evidenciam que os três QD@MIP sintetizados da sarcosina apresentaram um desvio padrão relativo abaixo de 5%, o que é um resultado positivo e promissor com uma ótima reprodutibilidade, sendo ainda mais eficiente do que os três QD@NIPs. 4.2.6. Avaliação da seletividade Para examinar o efetivo desenvolvimento das cavidades seletivas do QD@MIP impresso e consequentemente garantir as seletividades dos sensor proposto, as capacidades de medição foram avaliadas na presença de outras moléculas com estruturas análogas à sarcosina. Outras três substâncias químicas foram empregadas nesta análise: L-Cisteína (CIS), L-Histidina (HIS) e glicina (GLI); essas substâncias foram escolhidas por também serem aminoácidos. Os resultados obtidos são mostrados a seguir: 5 10 15 20 25 30 0 3 6 9 12 15  I n te n s id a d e d a f lu o re s c ê n c ia Concentração / mmol L -1 SAR CIS HIS GLI Figura 20 - Curvas da variação da fluorescência em função da concentração (5, 15 e 30 mmol L-1 em triplicata) da sarcosina e interferentes para o sensor QD@MIP. Fonte: Autora do trabalho. SAR CIS HIS GLI 0 3 6 9 12 15  I n te n s id a d e d a f lu o re s c ê n c ia Substância MIP NIP Figura 21 - Análise comparativa baseado na aplicação do QD@MIP e QD@NIP para a determinação da sarcosina e interferentes, na concentração de 30 mmol L-1 em triplicata. Fonte: Autora do trabalho. Ao observar e analisar os dois gráficos mostrados acima, os resultados obtidos na análise de seletividade foram positivos e satisfatórios para o QD@MIP, uma vez que a utilização do sensor proposto levou a um maior reconhecimento da sarcosina na presença de outros possíveis interferentes. Quanto ao reconhecimento dos interferentes, obviamente notou-se que o QD@NIP apresentou uma resposta semelhante em comparação ao QD@MIP. Ambos os sensores QD@MIP e QD@NIP exibiram um bom grau de seletividade em relação ao seu analito alvo, o que foi muito superior ao reconhecimento de quaisquer interferentes. Para avaliar a seletividade do sensor em termos numéricos foram calculados o fator de impressão molecular (α) e o fator de seletividade (β) usando as duas equações abaixo, conforme relatado na literatura para sensores químicos à base de polímeros molecularmente impressos [34]. 𝛼 = ∆𝐹𝑙𝑢𝑜𝑟𝑒𝑠𝑐ê𝑛𝑐𝑖𝑎 (𝑀𝐼𝑃) ∆𝐹𝑙𝑢𝑜𝑟𝑒𝑠𝑐ê𝑛𝑐𝑖𝑎 (𝑁𝐼𝑃) 𝛽 = 𝛼 (𝐴𝑛𝑎𝑙𝑖𝑡𝑜) 𝛼 (𝐼𝑛𝑡𝑒𝑟𝑓𝑒𝑟𝑒𝑛𝑡𝑒) Os valores obtidos para os parâmetros de impressão molecular e seletividade são apresentados na Tabela 4. Tabela 4 - Valores obtidos dos parâmetros de seletividade baseado na aplicação do QD@MIP da sarcosina comparando com QD@NIP na presença de diferentes substâncias interferentes. Substância Variação da fluorescência Parâmetros da seletividade QD@MIP QD@NIP α (MIP,NIP) β (analito, interferente) SAR 13,1 (±0,63) 7,88 (±0,10) 1,67 - CIS 4,18 (±0,84) 2,42 (±0,26) 1,73 0,97 HIS 4,88 (±0,69) 5,37 (±0,49) 0,91 1,84 GLI 6,37 (±0,30) 3,40 (±0,65) 1,87 0,89 Fonte: Autora do trabalho. O fator de impressão molecular é dado pela razão entre o valor absoluto da variação da fluorescência do QD@MIP e o valor do QD@NIP. Isso significa que, quanto maior for o valor desse fator, maior será a diferença de fluorescência entre o polímero impresso e o não impresso [35]. Um valor alto e maior que 1, como foi mostrado nas tabelas anteriores, significa que o QD@MIP adsorveu mais analito em relação ao QD@NIP, na Tabela 4 mostrou que esse valor foi alto para a sarcosina, um resultado esperado e satisfatório. No caso das substâncias interferentes, foi possível observar que também houve uma resposta maior ou igual no QD@MIP, sendo que o fator de impressão molecular teve um valor relativamente maior do que 1, com exceção da L-Histidina onde o fator foi menor que 1. Mesmo com esses resultados calculados na tabela, nos gráficos mostram que a variação da fluorescência do QD@MIP foi ainda maior para a sarcosina em relação aos demais aminoácidos, comprovando a seletividade do material. 4.2.7. Aplicação do QD@MIP em amostras de urina sintética A fim de verificar a interação entre o QD@MIP e seu analito sarcosina frente a amostras reais, foram realizados experimentos em amostras de urina sintética produzida no laboratório com o método explicado na sessão 3.9, com todos os parâmetros devidamente otimizados e tendo os materiais caracterizados. A urina foi separada em três partes: uma concentrada e sem nenhuma diluição, uma diluída em 10 vezes e a terceira diluída em 50 vezes. Todas as amostras foram fortificadas com 3 concentrações pré-estabelecidas de sarcosina: 5, 15 e 30 mmol L-1 com 100 µg de polímero e em 3,0 mL de água. Com os parâmetros anteriormente otimizados, as amostras foram aplicadas com 120 minutos de tempo de interação e pH próximo de 7. Os resultados das fluorescências obtidos foram mostrados na Tabela 5. Tabela 5 - Resultados obtidos das medidas da fluorescência baseada na aplicação da sarcosina em três amostras de urina artificial com diluições diferentes. Medidas feitas em triplicata. Concentração (mmol L-1) Variação da fluorescência Concentrado 10x 50x MIP NIP MIP NIP MIP NIP 5,0 3,02 0,73 3,51 0,77 3,37 0,88 15,0 6,20 2,07 7,06 2,86 6,57 2,41 30,0 11,0 3,98 11,6 6,67 12,7 5,49 Fonte: Autora do trabalho. Para avaliar o desempenho do QD@MIP nas amostras reais, foi calculado a Porcentagem de Recuperação, que é a medida percentual da interação entre analito e polímero impresso que é recuperada após se misturarem na matriz de uma amostra real. A equação da Porcentagem de Recuperação é dada pela razão entre a variação da fluorescência nas amostras reais e a variação da fluorescência na curva analítica. 𝑃𝑜𝑟𝑐𝑒𝑛𝑡𝑎𝑔𝑒𝑚 𝑑𝑒 𝑅𝑒𝑐𝑢𝑝𝑒𝑟𝑎çã𝑜 = 𝛥𝐹𝑙𝑢𝑜𝐴𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 𝛥𝐹𝑙𝑢𝑜𝐶𝑢𝑟𝑣𝑎 𝐴𝑛𝑎𝑙í𝑡𝑖𝑐𝑎 𝑥100% Se a recuperação for menor do que 100%, significa que a capacidade de interação entre analito e QD@MIP foi menor dentro da amostra. A Tabela 6 a seguir, mostra os resultados dos valores da Porcentagem de Recuperação encontrados para a sarcosina na amostra de urina artificial. Tabela 2 - Resultados obtidos das porcentagens de recuperação na aplicação da sarcosina em três amostras de urina artificial. Concentração (mmol L-1) Recuperação (%) Concentrado 10x 50x MIP NIP MIP NIP MIP NIP 5,0 81,88 66,26 95,06 70,16 91,49 79,77 15,0 86,19 62,96 98,15 86,88 91,37 73,42 30,0 83,32 50,46 88,39 84,72 96,35 69,66 Fonte: Autora do trabalho. Analisando os valores das porcentagens calculados nas tabelas anteriores, observou-se que todos resultados foram satisfatórios para o polímero impresso com todas as amostras, onde a maioria das porcentagens de recuperação foram acima de 90%, com uns poucos casos que foi acima de 80%; no caso, sendo a amostra não diluída que é mais complexa devido à alta quantidade de sais e ureia presentes. Adicionalmente, pôde se observar que o QD@NIP apresentou porcentagens de recuperação menores que os de QD@MIP, isso porque ele não apresenta interações específicas e cavidades seletivas, próprio de sua natureza não seletiva, como foi explicado anteriormente. Os resultados finais mostraram uma boa seletividade do QD@MIP da sarcosina proposto, nos quais mostraram uma grande capacidade de adsorção para o aminoácido; sendo claramente atribuídos a alta seletividade e sensibilidade do polímero impresso. A aplicação do sensor proposto baseado em MIP seletivo mostra a viabilidade do método desenvolvido para aplicação em amostras de interesse populacional. 5. CONCLUSÕES Com a realização desse trabalho, foi possível desenvolver um sensor óptico QD@MIP através da imobilização covalente de polímeros molecularmente impressos polimerizados na superfície de semicondutores nanocristalinos quantum dots. Sendo construído um sensor óptico para o aminoácido sarcosina, obtendo-se resultados satisfatórios. Os quais foram validados em relação a um QD@NIP e em relação a outras substâncias. Nos estudos de caracterização morfológica dos materiais poliméricos, a Microscopia Eletrônica de Varredura permitiu verificar a morfologia dos polímeros QD@MIP e QD@NIP, mostrando a homogeneidade e robustez dos polímeros impressos com suas cavidades seletivas, assim como foi possível medir os seus diâmetros. Na caracterização do QD@MIP por FTIR, as bandas observadas comprovaram a presença do polímero na superfície do quantum dot, assim como a presença do MPA em sua superfície antes da polimerização Ao analisar a capacidade de religação do QD@MIP com seu analito, o polímero impresso apresentou uma grande eficiência na determinação da sarcosina, uma vez que o MIP mostrou uma boa religação graças às cavidades seletivas frente as demais substâncias interferentes, sendo mais eficiente em pH neutro e com cerca de 2 horas de retenção. O sensor foi otimizado e os limites de detecção e quantificação do QD@MIP foram de 0,78 mmol L-1 e 2,35 mmol L-1 respectivamente; enquanto para o QD@NIP foi 1,15 mmol L-1 e 3,49 mmol L-1 respectivamente. Nos estudos de repetibilidade e reprodutibilidade, todos os resultados para o QD@MIP apresentaram um RSD abaixo de 20%. Nos estudos da seletividade dos sensores propostos, foi possível calcular os parâmetros α e β, obtendo-se valores que demonstraram que o QD@MIP construído foi altamente seletivos para seu analito em relação aos demais interferentes. Por fim, ao aplicar os QD@MIPs em amostras urina sintética com várias diluições diferentes, os resultados mostraram-se com uma boa porcentagem de recuperação, mesmo sob efeito da matriz da amostra, indicando a funcionalidade dos materiais, precisando apenas de um pré-tratamento simples e rápido das amostras. 6. Agradecimentos A autora gostaria de expressar sua gratidão pela assistência prestada pelas seguintes agências brasileiras de financiamento à pesquisa em apoio a este estudo: CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico) e Universidade Estadual Paulista (UNESP); Instituto de Química – Araraquara – SP. Também gostaria de agradecer as duas professoras Drª Marie del Pilar Taboada Sotomayor pela orientação durante a pesquisa e a Drª Rosa Amalia Fireman Dutra pela disponibilidade da bolsa de estudos 7. Plano de atividades futuras Para os planos futuros após essa relatório, pretende-se dar continuidade as atividades que não pode serem concluídas no período do projeto. Além disso, também se pretende melhorar os resultados que já foram obtidos, com a intenção de aumentar a diferença de afinidade entre QD@MIP e QD@NIP, assim como reduzir tanto a faixa de resposta quanto os limites de detecção e quantificação. Também está programado os testes em amostras reais de soro e sangue sintéticos, além de testes com um novo dispositivo chamado de Fluxo Lateral para renovar a aprimorar a detecção e identificação de sarcosina. Além dos testes que serão melhorados junto com novos testes realizados, também será feita a submissão de artigos científicos para revistas de alto fator de impacto, assim como a participação de eventos científicos e a redação do relatório de atividades. 8. REFERÊNCIAS 1- BAADE, P. D.; YOULDEN, D. R.; KRNJACKI, L. J. International epidemiology of prostate cancer: Geographical distribution and secular trends. Molecular Nutrition & Food Research, v. 53, n. 2, p. 171–184, fev. 2009. 2- Câncer de próstata. Disponível em: . Acesso em: 15 abr. 2024. 3- WANG, X. et al. Detection of prostate specific antigen in whole blood by microfluidic chip integrated with dielectrophoretic separation and electrochemical sensing. 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