RESSALVA Atendendo solicitação do autor , o texto completo desta dissertação será disponibilizado somente a partir de 12/04/2020. 8 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA ISOLAMENTO, IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR E DETECÇÃO DE GENES DE VIRULÊNCIA DE Yersinia enterocolitica EM AMOSTRAS DE LEITE BOVINO DE TANQUES DE EXPANSÃO DE PROPRIEDADES DO CENTRO- OESTE PAULISTA AMANDA BEZERRA BERTOLINI BOTUCATU- SP 2018 2 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA ISOLAMENTO, IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR E DETECÇÃO DE GENES DE VIRULÊNCIA DE Yersinia enterocolitica EM AMOSTRAS DE LEITE BOVINO DE TANQUES DE EXPANSÃO DE PROPRIEDADES DO CENTRO- OESTE PAULISTA AMANDA BEZERRA BERTOLINI Dissertação apresentada junto ao Programa de Pós- Graduação em Medicina Veterinária FMVZ-UNESP- Botucatu para obtenção do título de Mestre. Orientadora: Profa. Dra. Simone Baldini Lucheis Co-orientadora: Dra. Maria Izabel Merino de Medeiros 3 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. TRATAMENTO DA INFORM. DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CÂMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSANGELA APARECIDA LOBO-CRB 8/7500 Bertolini, Amanda Bezerra. Isolamento, identificação molecular e detecção de genes de virulência de Yersinia enterocolitica em amostras de leite bovino de tanques de expansão de propriedades do centro-oeste paulista / Amanda Bezerra Bertolini. - Botucatu, 2018 Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia Orientador: Simone Baldini Lucheis Coorientador: Maria Izabel Merino de Medeiros Capes: 50505009 1. Análise microbiológica. 2. Diagnóstico molecular. 3. Bovino de leite. 4. Leite - Bacteriologia. 5. Derivados do leite - Microbiologia. 6. Saúde pública. 7. Yersiniose. Palavras-chave: análise microbiológica; diagnóstico molecular; leite bovino; saúde pública; yersiniose. 4 Nome do Autor: Amanda Bezerra Bertolini Título: ISOLAMENTO, IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR E DETECÇÃO DE GENES DE VIRULÊNCIA DE Yersinia enterocolitica EM AMOSTRAS DE LEITE BOVINO DE TANQUES DE EXPANSÃO DE PROPRIEDADES DO CENTRO- OESTE PAULISTA. COMISSÃO EXAMINADORA Profa. Dra.Simone Baldini Lucheis Presidente e Orientadora Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública FMVZ- UNESP- Botucatu Prof. Dr. Hélio Langoni Membro da Banca Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública FMVZ- UNESP- Botucatu Profa. Dra. Vera Lúcia Mores Rall Membro da Banca Departamento de Microbiologia e Imunologia Instituto de Biociências- UNESP- Botucatu Data da defesa: 12 de abril de 2018. 5 Dedico este trabalho à minha família, que sempre esteve ao meu lado em todas as minhas decisões, em especial aos meus pais Aromes e Angeli e meu marido Pedro. 6 AGRADECIMENTOS Agradeço à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo –FAPESP - pelo financiamento do projeto, com o auxílio à pesquisa processo 2016/15908- 6 e com a bolsa de Mestrado, processo 2016/03582-9. Agradeço aos meus pais Angeli e Aromes Bezerra, por absolutamente tudo, pois vocês são meu alicerce, minha vida, minhas inspiração, meu tudo. Agradeço meu Marido Pedro Mady Bertolini, meu maior incentivador, meu companheiro e meu amigo de todas as horas. Agradeço minha sogra Yara Mady Bertolini, que me recebeu tão bem em sua casa durante o tempo que precisei, e sempre se demonstrou preocupada com todas as etapas do meu projeto. Agradeço a minha orientadora Simone Baldini Lucheis, e minha co-orientadora Maria Izabel Merino de Medeiros por terem feito mais que seus papeis, sendo minhas amigas e parceiras nessa jornada. Agradeço aos amigos Marcelo, Lívia, Wesley, Maria Fernanda, Mirian, Fábio, não só pelas ajudas, mas pela amizade e companheirismo, eu tenho muita sorte na vida, pois só encontro amigos incríveis como vocês. Agradeço ao professor e coordenador da pós graduação o Doutor Helio Langoni por ter me recebido de braços abertos na pós graduação, me incentivando e indicando durante o processo seletivo. Agradeço ao professor Márcio Garcia Ribeiro pela disponibilização do curso de microbiologia que foi indispensável para que pudesse realizar as análises microbiológicas. Agradeço ao Fernando José P Listoni, técnico do laboratório de microbiologia da FMVZ, por toda a paciência de me ensinar, sempre com muita dedicação, é incrível ter um profissional como você disponível em uma Universidade. Agradeço a Profa. Juliana Falcão, da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, USP, por ceder gentilmente a amostra de DNA de Yersinia enterocolitica 8081, e por tirar várias dúvidas por e-mail bem no início do meu trabalho. 7 Agradeço a FIOCRUZ por cederem gentilmente as cepas referência de Yersinia do grupo sorológico 1B, 2, 3, 4 e 5 (Referência FIOCRUZ Clist: 3438, 3439, 3440, 3442 e 3443), procedentes da coleção de culturas do Departamento de Bacteriologia do IOC/FIOCRUZ (Rio de Janeiro, RJ). 8 LISTA DE QUADRO QUADRO 1. Identificação das amostras de leite positivas à Yersinia enterocolitica e submetidas ao sequenciamento, com os resultados disponíveis na base de dados do GenBankTM.........................................................................................................44 9 LISTA DE FIGURAS FIGURA 1: Localização dos municípios onde ocorreram as coletas e o número respectivo de amostras de leite dos tanques de expansão analisados de cada município. Botucatu, SP, 2018. ........................................................................ 31 FIGURA 2: Esquema de todo procedimento de coleta de amostras e análises microbiológicas: coleta do leite do tanque, pré enriquecimento em água peptonada a 4°C por 30 dias, seguido de enriquecimento em caldo PSTA a 28°C por 48 horas, emplacamento em três diferentes meios de cultura e testes bioquímicos para as colônias suspeitas. Botucatu, SP, 2018. ......................... 33 FIGURA 3: (A) Todas as amostras foram semeadas em água peptonada e (B) permaneceram em geladeira (com termômetro) por 30 dias a 4°C. Botucatu, SP, 2018. ................................................................................................................ 34 FIGURA 4: Decorridos os 30 dias de pré enriquecimento, (A) 1 mL do material enriquecido foi inoculado em 100mL do Caldo PSTA; (B) e, em seguida, levado para a estufa a 28°C por 48 horas. Botucatu, SP, 2018. ................................. 35 FIGURA 5: Cepas puras de Yersinia enterocolitica nos meios de ágar Hektoen (A), Yersinia ágar (B) e Agar Mac Conkey (C) Botucatu, SP, 2018. ......................................................................................................................... 36 FIGURA 6: Realização das provas bioquímicas em EPM, MILI e Citrato. Em seguida, as mesmas foram incubadas em estufa a 28ºC para a identificação Botucatu, SP, 2018. .................................................................. 37 FIGURA 7:As colônias suspeitas foram semeadas em painel de identificação de enterobactérias API 20E (BioMerieux®). Botucatu, SP, 2018. ........................ 38 FIGURA 8: Gel de agarose a 2% apresentando seis amostras de leite bovino dentre 102 dos tanques de expansão amplificaram para Yersinia enterocolitica (linhas 2 a 7), Ladder de 100pb (linha 1), controle positivo (linha 8) e controle negativo (linha 9). Botucatu, SP, 2018. ............................................................ 43 FIGURA 9: Teste de competitividade realizado em ágar Yersinia. (A)Yersinia enterocolitica pura; (B) Isolamento a partir do leite cru contaminado na escala 5 de McFarland, com crescimento exuberante de bactéria mucóide e não característica;(C) cultivo em escala 1 de MacFarland, apresentando crescimento abundante de bactéria mucóide Botucatu, SP, 2018. ......................................................................................... 47 FIGURA 10: (A) Suíno em trabalho de parto ao lado do tanque de expansão; (B) Leitão bebendo restos de leite da saída do tanque de expansão no momento da coleta de leite. Botucatu, SP, 2018. ................................................................. 50 10 LISTA DE ABREVIAÇÕES ail- Adhesion invasion locus Células M- Microfold cells Inv- Invasion PCR- Reação em Cadeia da Polimerase PSTA- Caldo peptona sacarose tris azida de sódio ampicilina pYV- Plasmid for Yersinia virulence VirF- Virulence regulon transcriptional activator Y. enterocolitica- Yersinia enterocolitica YadA- Yersinia adhesin A Yops- Yersinia outer membrane proteins Yst-Yersinia stable toxin YstB- Yersinia stable toxin B 11 SUMÁRIO RESUMO .......................................................................................................... 13 ABSTRACT ....................................................................................................... 14 2. REVISÃO DA LITERATURA ................................................................... 18 2.1 Características gerais de Yersinia spp. ....................................................... 18 2.2 Yersinia enterocolitica: taxonomia e propriedades gerais ........................... 19 2.3 Y. enterocolitica: epidemiologia ................................................................... 19 2.4 Fatores de virulência e patogenia ............................................................... 21 2.5 A doença em humanos ............................................................................... 24 2.6 Importância no leite ..................................................................................... 25 2.7 Métodos de isolamento e identificação de Yersinia enterocolitica .............. 26 2.8 Sensibilidade antimicrobiana e tratamento ................................................. 28 3. Objetivos ................................................................................................. 29 4. MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................ 30 4.1 Número de amostras e propriedades rurais visitadas para coleta das amostras de leite do tanque .............................................................................. 30 4.2 Aquisição de cepas referência de Yersinia ................................................. 32 4.3 Análises microbiológicas ............................................................................ 32 4.3.1 Pré-enriquecimento das amostras ........................................................... 33 4.3.2 Inoculação em Caldo PSTA ..................................................................... 34 4.3.3 Inoculação em meios de cultura ............................................................... 35 4.3.4 Controle de efetividade da metodologia e teste de competitividade ........ 36 4.3.5 Provas bioquímicas .................................................................................. 37 4.4 Reação em Cadeia da Polimerase convencional. ....................................... 38 4.4.1. Extração do DNA .................................................................................... 39 4.4.2 Identificação para Yersinia spp. ............................................................... 39 4.4.3 Identificação de Yersinia enterocolitica .................................................... 40 4.4.4 Pesquisa da presença de genes de virulência de Yersinia enterocolitica patogênica: inv, ail , YadA, virF, ystA e ystB. ................................................... 40 4.4.5 Sequenciamento ...................................................................................... 41 12 5 RESULTADOS ........................................................................................ 42 5.1 Análises microbiológicas e características fenotípicas das colônias ........... 42 5.2 Análises moleculares .................................................................................. 42 6. DISCUSSÃO ................................................................................................. 46 7. CONCLUSÕES ....................................................................................... 53 8. REFERÊNCIAS ....................................................................................... 54 9. TRABALHO CIENTÍFICO ........................................................................ 61 Anexo 1 – Atestado do Comitê de ética ............................................................ 74 Anexo 2 Eletroferogramas obtidos pelo sequenciamento genético Sanger. ..... 75 13 BERTOLINI, A.B. Isolamento, identificação molecular e detecção de genes de virulência de Yersinia enterocolitica em amostras de leite bovino de tanques de expansão de propriedades do Centro-Oeste paulista. Botucatu, 2018. p.80. Defesa de Dissertação (Mestrado) - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista. RESUMO O leite e seus derivados são bons meios para o desenvolvimento de micro- organismos patogênicos e deteriorantes, exigindo cuidados rigorosos com a ordenha, processamento e armazenamento. Entre os vários grupos de bactérias que podem ser desenvolvidas em leite refrigerado cru, Yersinia enterocolitica, um enteropatógeno invasivo para humanos, é uma delas. Esta bactéria pode causar a uma série de sintomas clínicos intestinais e extraintestinais, variando de gastroenterite leve a linfadenite mesentérica, semelhante a apendicite. Para avaliar a prevalência de Yersinia enterocolitica patogênica no leite cru de tanques de expansão localizados no estado de São Paulo, foram avaliadas 102 amostras de leite bovino, pelas análises microbiológicas, seguido de provas bioquímicas; a Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) e sequenciamento genético. Não houve o isolamento de Yersinia enterocolitica pelas provas microbiológicas. A análise de PCR revelou seis (6) amostras positivas para Yersinia enterocolitica (5,9%), confirmadas por sequenciamento genético. Somente o gene inv, foi detectado, presente em cepas virulentas e avirulentas. Portanto, ainda que o patógeno estudado não represente um risco potencial nas amostras de leite analisadas neste estudo, foram observados diversos fatores de risco nas fazendas visitadas e uma grande contaminação da microbiota presente no leite, podendo-se afirmar que a qualidade do leite cru em tanques de expansão das fazendas avaliadas é de risco para a saúde pública. Palavras-chave: análise microbiológica, diagnóstico molecular, leite bovino, saúde pública, yersiniose. 14 BERTOLINI, A.B. Isolation, molecular identification and detection of the virulence genes of Yersinia enterocolitica in bovine milk samples from dairy farms´s bulk tanks in the Central-West region of the State of São Paulo. Botucatu, 2018. p.80. Defesa de dissertação (Mestrado)- Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista. ABSTRACT Milk and its byproducts are good means for the development of pathogenic and deteriorating microorganisms, demanding rigorous care with milking, processing and storage. Among the various groups of bacteria that can be grown in raw refrigerated milk, Yersinia enterocolitica, an invasive enteropathogen for humans, is one of them. This bacterium can cause a number of intestinal and extraintestinal clinical symptoms, ranging from mild gastroenteritis to mesenteric lymphadenitis, similar to appendicitis. To evaluate the prevalence of pathogenic Yersinia enterocolitica in raw milk from bulk tanks milk located in the state of São Paulo, 102 bovine milk samples were evaluated by microbiological analysis, followed by biochemical tests; the Polymerase Chain Reaction (PCR) and genetic sequencing. There was no isolation of Yersinia enterocolitica by microbiological tests. PCR analysis revealed six (6) positive samples for Yersinia enterocolitica (5.9%), confirmed by genetic sequencing and later, identification of virulence genes by PCR. Only the inv gene, present in virulent and avirulent strains, was found. Therefore, although the pathogen studied does not present a potential risk in the milk samples analyzed in this study, several risk factors were observed in the farms visited and a great contamination of the microbiota present in the milk, and it can be stated that the quality of raw milk in tanks of the farms evaluated is a risk to public health. Keywords: microbiological analysis, molecular diagnosis, bovine milk, public health, yersiniosis. 53 7. CONCLUSÕES - A elevada contaminação microbiana nas amostras de leite cru avaliadas dificultou o isolamento de Yersinia enterocolitica com o uso das técnicas microbiológicas recomendadas; - A Reação em Cadeia da Polimerase convencional (cPCR) utilizada no presente estudo permitiu a identificação de Yersinia enterocolitica a partir de leite de tanques de expansão com alta carga microbiana, indicando que nesta situação, esta é a melhor metodologia. - Verificou-se apenas o gene inv nas amostras de Yersinia enterocolitica identificadas à prova de cPCR, não sendo possível afirmar que tais cepas eram patogênicas. 54 8. REFERÊNCIAS AHOMAA, M. F.; KORJEALA, H. Low ocurrence os pathogenic Yersinia enterocolitica in clinical, food, and environmental samples: a methodological problem. Clin. Microbiol. Rev., v. 16, n. 2, p. 220-229, 2003. ARCURI, F. E.; SILVA, P. D. L.; BRITO, M. P. V. P.; BRITO, J. R. F.; LARGE, C. C.; MAGALHÃES, M. M. A. 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