UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA CAMPUS DE BOTUCATU MAPEAMENTO DE LOCOS DE CARACTERÍSTICAS QUANTITATIVAS ASSOCIADOS A DESEMPENHO E CARCAÇA NOS CROMOSSOMOS 11 E 13 DE Gallus gallus CLARISSA BOSCHIERO Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Zootecnia como parte das exigências para obtenção do título de Mestre. BOTUCATU - SP Fevereiro – 2006 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA CAMPUS DE BOTUCATU MAPEAMENTO DE LOCOS DE CARACTERÍSTICAS QUANTITATIVAS ASSOCIADOS A DESEMPENHO E CARCAÇA NOS CROMOSSOMOS 11 E 13 DE Gallus gallus CLARISSA BOSCHIERO Zootecnista ORIENTADORA: Profa. Dra. ANA SILVIA ALVES MEIRA TAVARES MOURA Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Zootecnia como parte das exigências para obtenção do título de Mestre. BOTUCATU - SP Fevereiro - 2006 “Façamos o homem à nossa imagem e semelhança. Que ele reine sobre os peixes do mar, sobre as aves do céu, sobre os animais domésticos e sobre todos os répteis que se movem sobre a terra, e domine em toda a terra” (Gênesis I, 26). Dedico Para meus pais, Célia e Gilio pela educação, incentivo e amor incondicional. A Deus pela oportunidade de aprendizado. Aos animais que vivem para o progresso da ciência. AGRADECIMENTOS Agradeço especialmente Profa. Dra. Ana Silvia Alves Meira Tavares Moura pela orientação, amizade, ajuda constante e pelo grande aprendizado; Prof. Dr. Luiz Lehmann Coutinho pelo apoio, confiança e por ter aberto as portas do Laboratório de Biotecnologia Animal (Esalq); Pesquisadora Dra. Mônica Corrêa Ledur pelo incentivo, amizade e por fornecer a população experimental. Agradeço às entidades Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia de Botucatu (FMVZ/Unesp) pela oportunidade de realização do mestrado. Esalq e Embrapa Suínos e Aves pelo apoio. Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pela concessão da bolsa de estudo e financiamento do projeto. Agradeço às pessoas que contribuíram diretamente Colegas da equipe “QTL” - Raquel, Marcel e Millor pela amizade, apoio e aprendizado. Todos os colegas do Laboratório de Biotecnologia Animal (Esalq) pela amizade e apoio. Prof. Dr. José Roberto Sartori e Prof. Dr. Henrique Nunes de Oliveira pelas sugestões, e aos demais professores do Programa de Pós Graduação em Zootecnia da FMVZ, Botucatu. Funcionárias da FMVZ - Carmen, Seila e Solange pelo apoio e paciência. Secretária Giovana do Laboratório de Biotecnologia Animal (Esalq) pela atenção e auxílio prestados. Agradeço às pessoas que contribuíram indiretamente Célia, Gilio, Dani, Angel, André e Mônica por todo amor e incentivo. Amigas e amigos que de alguma forma estiveram presentes. Luciano pelo carinho e amor. Em especial, Maria do Carmo pela grande amizade e acolhimento nestes anos. SUMÁRIO Página Lista de Siglas...................................................................................................... ix CAPÍTULO 1........................................................................................................ 10 CONSIDERAÇÕES INICIAIS............................................................................... 10 1 Importância da avicultura e genoma da galinha doméstica (Gallus gallus)... 10 2 Genética molecular x Melhoramento genético animal................................... 12 3 Marcadores moleculares e mapas genéticos................................................. 13 4 Locos de características quantitativas (QTLs)............................................... 17 4.1 Populações e delineamentos experimentais para estudos de mapeamento de QTLs................................................................................. 4.2 Métodos estatísticos para detecção de QTLs........................................ 4.3 Níveis de significância............................................................................ 4.4 Problemas e limitações no mapeamento de QTLs................................ 4.5 Aplicações do mapeamento de QTLs e seleção assistida por marcadores (MAS)....................................................................................... 20 22 22 23 24 5 Trabalhos de mapeamento de QTLs em Gallus gallus.................................. 25 Referências Bibliográficas................................................................................. 27 CAPÍTULO 2........................................................................................................ 39 MAPEAMENTO DE LOCOS DE CARACTERÍSTICAS QUANTITATIVAS ASSOCIADOS A DESEMPENHO E CARCAÇA NOS CROMOSSOMOS 11 E 13 DE Gallus gallus..................................................................................... 40 Resumo ............................................................................................................... Abstract................................................................................................................ 41 42 Introdução............................................................................................................ 43 Material e Métodos............................................................................................... 44 População experimental................................................................................... Colheita dos dados fenotípicos e amostras de sangue..................................... Extração e quantificação de DNA..................................................................... Amplificação dos marcadores microssatélites.................................................. Genotipagem..................................................................................................... Mapas de ligação.............................................................................................. Análise de Mapeamento de QTLs..................................................................... 44 45 46 47 48 48 49 Resultados........................................................................................................... 51 Amplificações por PCR..................................................................................... Seleção dos marcadores informativos e genotipagens..................................... Mapas de ligação.............................................................................................. Análise estatística exploratória e ajuste dos dados fenotípicos........................ Análise de mapeamento de QTLs..................................................................... 51 51 52 52 53 Cromossomo 11........................................................................................... Cromossomo 13........................................................................................... 53 54 Discussão............................................................................................................. 54 Mapas de ligação.............................................................................................. Análise de mapeamento de QTLs..................................................................... Cromossomo 11........................................................................................... Cromossomo 13........................................................................................... 54 56 56 58 Referências Bibliográficas.................................................................................... 61 CAPÍTULO 3........................................................................................................ 80 IMPLICAÇÕES..................................................................................................... 80 Anexos................................................................................................................. 81 LISTA DE SIGLAS AFLP - Amplified fragment length polymorphism – Polimorfismo de comprimento de fragmentos amplificados. BLAD - Bovine leukocyte adhesion deficiency - Deficiência de adesão leucocitária bovina. cM – centiMorgan. DNA - Deoxyribonucleic acid - Ácido desoxirribonucléico. ETL - Economic trait loci - Locos de características econômicas. IGF-2 - Insulin-like growth factor 2 – Fator de crescimento semelhante a insulina tipo 2. KIT - C-kit receptor tyrosine kinase – Receptor C-Kit tirosina quinase. LOD - Likelihood of odds – Chances de probabilidades. MAS - Marker assisted selection - Seleção auxiliada por marcadores. PCR - Polymerase chain reaction - Reação em cadeia da polimerase. PSE - Pale, soft e exsudative – Carne pálida, textura flácida e perde água rapidamente. QTL - Quantitative trait loci – Locos controladores de características quantitativas. RAPD - Random amplified polymorphic DNA - Polimorfismo de DNA amplificado randomicamente. RFLP - Restriction fragment length polymorphism – Polimorfismo no comprimento de fragmentos de restrição. SNPs - Single nucleotide polymorphisms - Polimorfismos de base única. SSR - Simple sequence repeats – Microssatélites. VNTR - Variable number of tandem repeats – Número variável de repetições em tandem. CAPÍTULO 1 CONSIDERAÇÕES INICIAIS 1 Importância da avicultura e genoma da galinha doméstica (Gallus gallus) A galinha (Gallus gallus) é o mais importante animal de produção do mundo com rápido crescimento; produz a principal fonte de proteína animal para a maioria das populações. É muito utilizada como modelo de pesquisa para estudos de comportamento animal, câncer e viroses, pesquisas de regulação gênica e estudos evolutivos (Groenen et al., 2000; McPherson et al., 2002; Jensen, 2005; Wicker et al., 2005). Entre os animais domésticos, a galinha é o animal ideal para a aplicação da tecnologia de mapeamento genético e para análises de locos de características quantitativas (QTL) porque possui um curto intervalo de geração, pode gerar grandes famílias de irmãos completos e possibilita a obtenção de grandes quantidades de DNA das células sanguíneas vermelhas nucleadas. Além disso, o tamanho do genoma da galinha é pequeno comparado aos mamíferos, enquanto que a taxa de recombinação é similar à dos mamíferos (Crooijmans et al., 1996; Groenen et al., 1998; McPherson et al., 2002). No Brasil a avicultura vem se consolidando como uma das atividades mais competitivas e tecnificadas do cenário internacional. O Brasil produziu 8,4 milhões de toneladas de carne de frango em 2004, com crescimento de 13% nos últimos dois anos (Avisite, 2005). A produção de carne de frango no período de janeiro a novembro de 2005 foi um total de 8.463.080 toneladas de aves produzidas, e a variação percentual sobre o ano anterior foi de 9,05% (União Brasileira de Avicultura, 2006). Em 1975, ano em que foram iniciadas as exportações no Brasil, a avicultura brasileira representava perto de 5% da produção mundial (Embrapa Suínos e Aves, 2005). Passados 30 anos, segundo dados divulgados pelo Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA), o Brasil foi o responsável em 2005 por cerca de 40% da exportação mundial de carne de frango (Avicultura Industrial, 2005). Em 2004 foram exportadas 2,4 milhões de toneladas, tornando o Brasil o maior exportador mundial de carne de frango (Avisite, 2005). Até outubro de 2005, o país exportou 2.325.104 toneladas de carne de frango (Avicultura Industrial, 2005). O USDA estimou um crescimento de 5,8% para as exportações brasileiras no ano de 2005, em relação a 2004 (Tabela 1). Com a demanda crescente por produtos avícolas são necessárias melhorias em todos os aspectos da produção, e cada vez mais, é preciso o desenvolvimento de novas tecnologias para gerar produtos com maior qualidade e menores custos. A evolução e competitividade da indústria avícola brasileira têm impulsionado a constante busca da melhoria do material genético das linhagens (Stringhini et al., 2003). Por isso é importante melhorar a qualidade da carne, diminuir os teores de gordura, aumentar a porcentagem de carnes nobres, não esquecendo da saúde do animal, para terem um desenvolvimento sadio. Características de carcaça e composição corporal são importantes considerações da moderna produção animal (Pomp et al., 2004). O primeiro genoma seqüenciado de um animal doméstico foi o da galinha, concluído em 2004. Foi utilizado o DNA de uma única fêmea ancestral selvagem das galinhas domésticas atuais, a Red Jungle Fowl (Chicken Genome, 2005). O conhecimento da seqüência do genoma é necessário para uma melhor compreensão da estrutura, evolução e arranjo dos genes, assim como a comparação com outros organismos. Como ocorre na maioria das espécies de aves, a galinha possui um genoma relativamente pequeno de 1,1 x 109 pares de bases (pb) de DNA, ou de 39% do tamanho do genoma humano, e estudos prévios sugerem o conteúdo de aproximadamente apenas 15% de DNA repetitivo, onde as seqüências microssatélites são altamente polimórficas. Existe uma baixa quantidade de seqüências repetitivas comparadas aos genomas de mamíferos, o que facilita o seqüenciamento e a procura por genes em galinhas (Fillon, 1998; McPherson et al., 2002; Wicker et al., 2005; Jensen, 2005). O genoma da galinha consiste de 38 pares de autossomos e dois cromossomos sexuais Z e W (Figura 1). A fêmea é o sexo heterogamético (ZW), e o macho é o sexo homogamético (ZZ). Segundo Schmid et al. (2000), o cariótipo da galinha está dividido em oito pares de grandes cromossomos citologicamente distinguíveis (macrocromossomos); 30 pares de pequenos cromossomos (microcromossomos) e os cromossomos sexuais. Além da diferença de extensão, existem outras entre os macrocromossomos e os microcromossomos: (a) maior densidade de genes nos microcromossomos do que nos macrocromossomos; (b) os microcromossomos possuem alto conteúdo de guanina e citosina e baixo conteúdo de adenina e timina; (c) os microcromossomos representam 30% do genoma. Alguns estudos demonstraram que 75% de todos os genes da galinha estão localizados nos microcromossomos, ou seja, eles estão associados à alta atividade genética (Fillon, 1998; Schmid et al., 2000). Fillon (1998) afirma também que existem duas possibilidades que podem explicar a origem dos microcromossomos: estes se fundiram para a formação dos macrocromossomos; ou, houve a fragmentação dos macrocromossomos que resultou nos microcromossomos. Estudos demonstram alto nível de regiões de sintenia entre o genoma de mamíferos e aves, isso faz da galinha um modelo de evolução intermediária e possibilita o aproveitamento da informação adquirida no estudo do genoma humano sobre genes (Fillon, 1998; Groenen et al., 2000; McPherson et al., 2002). 2 Genética molecular x Melhoramento genético animal A partir da década de 70, os cientistas começaram a manipular a molécula de DNA. Desde então, a biologia molecular obteve grandes avanços tecnológicos, que têm culminado em importantes fontes de conhecimentos sobre a localização, função e expressão dos genes em diferentes espécies animais. Uma das grandes mudanças na biologia moderna é a compreensão da base genética da diversidade fenotípica das espécies (Andersson e Georges, 2004). Uma das técnicas mais importantes neste campo é a reação em cadeia da polimerase (PCR – Polimerase Chain Reaction) desenvolvida na década de 80, que permite a amplificação de segmentos específicos do DNA em milhares de cópias em poucas horas. Desta poderosa técnica, outras se derivaram como clonagem, seqüenciamento e análise de polimorfismos de DNA. Outras ferramentas fundamentais que estão sendo muito utilizadas são os marcadores moleculares e os mapas genéticos. A aplicação das técnicas moleculares na análise dos genomas vem apresentando excelentes vantagens biológicas e econômicas para os estudos genéticos das espécies domésticas (Macari et al., 2002). O melhoramento genético tradicional vem proporcionando inúmeros benefícios para a agropecuária, porém existem limitações e desvantagens da seleção pelo fenótipo. A seleção clássica é baseada no fenótipo e algumas vezes este não é fácil de ser identificado precocemente para características ligadas ao sexo (produção de leite e ovos); e pode ser de difícil mensuração para algumas características como: eficiência alimentar, resistência a doenças, qualidade da carne e carcaça. Em muitos casos o fenótipo não é uma indicação precisa do genótipo (Martinez e Machado, 2002). A genética quantitativa, aliada ao uso de técnicas computacionais e estatísticas tem assegurado o ganho genético contínuo em todas as características de produção em aves. Cerca de 80% das melhoras obtidas nas linhagens de corte e postura foram decorrentes do melhoramento genético, acompanhadas de controle ambiental e nutrição adequada. Este melhoramento tem sido realizado sem o conhecimento do número e do efeito dos genes que atuam nas características de interesse (Embrapa Suínos e Aves, 2003). Junto com o sucesso do melhoramento genético na evolução das características de aves de corte e postura, surgiram respostas correlacionadas prejudiciais: aumento de doenças metabólicas, carne de baixa qualidade (PSE), diminuição da fertilidade e resistência à doenças infecciosas em aves de corte, aumento da incidência de osteoporose e problemas na qualidade da casca dos ovos em poedeiras (Ledur et al., 2003). As novas tecnologias do melhoramento genético, surgidas com a genética molecular, não vão substituir os métodos tradicionais, mas sim complementá-los. Estas novas tecnologias têm sido adotadas principalmente para características de baixa herdabilidade, encontradas em um dos sexos e mensuradas apenas após o abate. A combinação de seleção genética tradicional e métodos modernos moleculares são ideais para o melhoramento de galinhas no futuro (Li et al., 2005). 3 Marcadores moleculares e mapas genéticos Marcadores são marcos no genoma que podem representar um gene ou um fragmento de DNA, e podem ser morfológicos ou moleculares. Até meados da década de 60, os marcadores utilizados em estudos de genética e melhoramento eram controlados por genes associados a caracteres morfológicos (marcadores morfológicos), mas estes apresentavam uma série de restrições e desvantagens, como: o número reduzido de marcadores e falta de ligação destes com caracteres de importância econômica. Depois foram desenvolvidos os marcadores moleculares, como isoenzimas ou fragmentos de DNA (Ferreira e Grattapaglia, 1998). Existem vários tipos de marcadores moleculares, tais como: isoenzimas, RFLP (Restriction fragment length polymorphism), VNTR (Variable number of tandem repeats), RAPD (Random amplified polymorphic), AFLP (Amplified fragment length polymorphism), microssatélites e SNPs (Single nucleotide polymorphisms). Os marcadores isoenzimáticos correspondem a genes associados a características importantes, que produzem polimorfismos de proteínas. Os outros tipos de marcadores moleculares são fragmentos de DNA repetidos ou não no genoma. A maioria não apresenta variação associada a fenótipos, porém podem estar associados a determinados fenótipos, por localizarem-se próximos a regiões ou genes responsáveis por determinada característica. Portanto, os marcadores moleculares são pontos de referência nos cromossomos de organismos, correspondendo ou não a regiões expressas. Segundo Griffiths et al. (1998), os genomas apresentam muitos pontos de variação (polimorfismos) no DNA, ou seja, embora todos os membros de uma espécie tenham mais ou menos os mesmos genes, os organismos dentro da espécie diferem nos pontos variantes que contêm. Estes pontos (marcadores) são importantes porque se um animal for heterozigoto para um destes pontos, os dois tipos diferentes de DNA podem ser considerados alelos e podem ser usados no mapeamento como alelos heterozigotos de um efeito conhecido. De fato, os indivíduos em geral contêm grandes números de pontos de DNA heterozigotos, que podem ser usados como locos marcadores de DNA no mapeamento. Walling et al. (1998) afirmam que a utilização de marcadores genéticos é atualmente muito difundida e esta tecnologia é acessível e adaptável a muitas aplicações. Segundo Ferreira e Grattapaglia (1998), as aplicações dos marcadores moleculares são inúmeras, tais como: identificação e discriminação de genótipos, testes de paternidade, estudos de diversidade genética, construção de mapas genéticos e bibliotecas genômicas, mapeamento de QTL, seleção assistida por marcadores (MAS), entre outras. De acordo com Dekkers (2004), durante as décadas passadas avanços na genética molecular trouxeram a identificação de múltiplos genes ou marcadores genéticos associados a genes que afetam características de interesse na produção animal, e isso nos traz a oportunidade de aumentar a resposta de seleção, em particular para características difíceis de serem melhoradas pela seleção convencional. Regitano e Coutinho (2001) afirmam que o uso de marcadores moleculares permite que o potencial genético de um animal seja determinado com maior precisão e antes mesmo da expressão do seu fenótipo. Em outras palavras, talvez seja possível no futuro determinar o genótipo de um embrião, para algumas características, sem que seja necessário avaliar a sua produção ou sua progênie. Alguns exemplos de aplicações de marcadores moleculares na produção animal, que já estão sendo utilizados comercialmente (Regitano e Coutinho, 2001; Ledur et al., 2003; Dekkers, 2004): 1) Receptor da rianodina; IGF-2; receptor do estrogênio e KIT (afeta cor da pelagem) em suínos. 2) K-caseína e β-lactoglobulina que afetam a qualidade do leite. 3) BLAD, miostatina e GeneSTAR em bovinos. 4) Gene do pescoço pelado, que confere tolerância ao calor e grupo sanguíneo B que está relacionado à resistência a doenças em aves. Segundo Ferreira e Grattapaglia (1998) uma grande proporção do genoma de organismos eucariotos é composta de seqüências repetidas de DNA. Várias classes destas seqüências têm sido caracterizadas, e diferem no número e composição de nucleotídeos. Exemplo deste tipo de seqüência são os microssatélites. Os marcadores microssatélites, ou SSR (simple sequence repeats) são seqüências curtas de um a seis nucleotídeos repetidos em tandem e são co-dominantes (ambos os alelos de um indivíduo heterozigoto são visualizados). É a classe de marcadores mais freqüente, polimórfica, melhor distribuída ao acaso e fácil de ser detectada por PCR, por isso é a mais utilizada no mapeamento de QTL. Os microssatélites são amplificados por PCR, utilizando-se um par de iniciadores (primers) específicos (de 20 a 30 bases) complementares a seqüências únicas que flanqueiam o microssatélite. Cada segmento amplificado de tamanho diferente representa um alelo diferente do mesmo loco (Ferreira e Grattapaglia, 1998). A visualização dos alelos por PCR é feita por eletroforese em gel de agarose (baixa definição), ou poliacrilamida (alta definição), ou ainda por equipamentos mais sofisticados como seqüenciadores automáticos de DNA. Segundo Primmer et al. (1997), o número de seqüências microssatélites tende a se correlacionar positivamente com o tamanho do genoma. Os mesmos autores afirmam que em galinhas os microssatélites não estão uniformemente distribuídos no genoma e, além disso, encontram-se em baixa densidade nos microcromossomos, o que é um obstáculo para o mapeamento genético. Porém, Smith et al. (2000), discordam destes resultados, pois encontraram mais seqüências microssatélites do que o esperado nos microcromossomos de galinhas. Esta discrepância entre os dois estudos pode ser explicada por um problema na técnica PRINS (Primed in situ) utilizada por Primmer e colaboradores. Uma grande variabilidade no número de repetições da maioria dos locos de microssátelites faz deles úteis no mapeamento genético, testes de paternidade, estimação de variabilidade genética, estudos e genética de populações e mapeamento de QTLs (Crooijmans et al., 1997). A única desvantagem dos microssatélites é o trabalho necessário para o desenvolvimento prévio dos marcadores. Porém, atualmente existe um número suficiente disponível para galinhas. O genoma pode ser considerado em vários níveis, e muitas técnicas têm sido desenvolvidas para o mapeamento de locais específicos. As unidades básicas utilizadas para medir o genoma são pares de bases de DNA (pb), genes, freqüências de recombinação, unidades de mapa genético (cM) e cromossomos (Weller, 2001). Os mapas de ligação ou genéticos constituem um aspecto essencial do estudo genético experimental de qualquer organismo. Há uma forte implicação de que o tamanho de um mapa de ligação seja proporcional ao mapa físico. As distâncias genéticas, de fato, são mais ou menos proporcionais às cromossômicas (Griffiths et al., 1998). O mapa é construído utilizando as informações obtidas na análise de ligação de locos polimórficos e ligação meiótica ao longo do cromossomo (Packer e Paz, 2001). Os mapas de ligação são obtidos a partir de uma análise genética; segundo Griffiths et al. (1998), podemos usar a taxa de recombinação como um indicador quantitativo da distância linear entre dois genes. Quanto maior a distância, maior a probabilidade das cromátides não-irmãs se cruzarem na região entre os genes, e portanto, maior a proporção de recombinantes que seriam produzidos. Determinando a freqüência de recombinantes, obtemos uma medida de distância de mapa entre os genes. A freqüência de recombinação de 0,01 ou 1% é definida como aproximadamente 1 cM (centiMorgan). Segundo Weller (2001), apesar da média de 1 cM ser cerca de um milhão de pares de bases, tem sido mostrado que nos mapas físicos certas regiões possuem uma alta freqüência de recombinação, enquanto outras possuem um baixo nível. Além disso, esta freqüência é afetada por outros fatores, como o sexo dos animais avaliados ou espécie, por isso podemos encontrar divergências de tamanho entre os mapas genéticos e físicos. O desenvolvimento de mapas genéticos é considerado uma das aplicações de maior impacto na tecnologia de marcadores moleculares na análise genética de espécies (Ferreira e Grattapaglia, 1998). Estes mapas são necessários para estudos de mapeamento de QTL. O mapa de ligação, em princípio, pode identificar todas as regiões do cromossomo contendo um QTL ou grupos de QTLs com magnitude de efeito razoável (Packer e Paz, 2001). O primeiro mapa de ligação genético de aves foi publicado por Hutt em 1936, e constituiu também o primeiro mapa de ligação relatado para uma espécie de animal doméstico (Macari et al., 2002). Porém o primeiro mapa genético construído completamente com marcadores de DNA em galinhas foi publicado por Bumstead e Palyga em 1992. Este mapa que utilizou a população referência de Compton consistiu apenas de marcadores RFLP, os quais não eram apropriados para a construção dos mapas genéticos de todo o genoma em grandes populações. Posteriormente, outro mapa foi publicado por Levin e colaboradores em 1994, utilizando a população referência de East Lansing. E em 1998 foi publicado, por Groenen e colaboradores, um mapa genético de galinhas construído com as informações da população referência Wageningen (Groenen et al., 1998). Em 2000 foi publicado um mapa de ligação da galinha denominado de Consensus Linkage Map (Mapa Consenso) por Groenen e colaboradores e foram utilizadas as três populações referência - East Lansing, Wageningen e Compton. De acordo com ele, o genoma da galinha apresenta um total de 1889 locos, sendo que 480 têm sua localização definida nos cromossomos e 235 representam genes identificados ou seqüências que podem ser relacionadas a genes conhecidos, e 801 microssatélites distribuídos em 3800 cM de extensão (Groenen et al., 2000). Este mapa foi atualizado posteriormente por Schmid et al. (2000). Atualmente, existem (jan./2006) 2530 locos no mapa de ligação da galinha, sendo que 765 são genes identificados (ARKdb, 2006). Na Figura 2 podemos verificar os mapas Consenso dos cromossomos 11 e 13 da galinha. Em virtude do extenso polimorfismo dos marcadores microssatélites, os mapas genéticos facilitam a detecção e localização dos locos controladores de características quantitativas. O conhecimento de mapas genômicos de aves constitui o primeiro passo para se fazer uso prático das metodologias com utilização de DNA, permitindo uma série de aplicações (Macari et al., 2002). 4 Locos de características quantitativas (QTLs) Muitas das características de interesse econômico em plantas e animais são de natureza quantitativa, ou seja, os fenótipos observados são distribuídos continuamente e refletem a ação de muitos locos mais o efeito ambiental (De Koning et al., 1998). As características denominadas de quantitativas, complexas, multifatoriais ou poligênicas são o foco de estudos de mapeamento de QTL. Segundo Griffiths et al. (1998), estas se caracterizam por não possuírem segregação de modo simples nos cruzamentos; elas variam mais ou menos continuamente em uma faixa. A continuidade de fenótipo é o resultado de dois fenômenos: (1) cada genótipo não tem uma única expressão fenotípica, mas cobre uma ampla gama fenotípica; (2) muitos locos segregantes podem ter alelos que fazem diferença para o fenótipo que está sendo observado. Além disso, a influência do efeito ambiental. Mackay (2001) afirma que a maioria das características econômicas importantes em animais domésticos é quantitativa e embora sejam influenciadas por muitos genes não são igualmente influenciadas por todos eles, ou seja, alguns genes terão efeitos maiores, e outros efeitos menores. A hipótese de muitos fatores, como é conhecida, explica que um grande número de genes (poligenes) de pequeno efeito está segregando para produzir uma característica quantitativa (Griffiths et al., 1998). Dekkers (2004) afirma que para a finalidade de detecção e aplicação de QTL, as características quantitativas podem ser classificadas em: (1) Características rotineiramente mensuradas; (2) Características difíceis de serem mensuradas (ex. consumo de alimento); (3) Características não mensuráveis (ex. resistência a doenças). Cada uma destas pode ser subdividida em características que são: (4) Mensuradas nos dois sexos; (5) Limitadas ao sexo; (6) Mensuradas tardiamente. A habilidade de detectar QTL depende da disponibilidade dos dados fenotípicos e decresce de 1 até 6, porém para as características difíceis de serem medidas, pode haver maiores ganhos genéticos com a MAS (seleção assistida por marcadores), quando comparadas com as da categoria 1. Segundo Andersson e Georges (2004), o principal desafio das características complexas não é detectar os QTLs, mas descobrir os genes que os explicam. Falconer e Mackay,1996 afirmam que: ”a identificação de genes individuais pode ter inúmeras aplicações úteis: (a) Pode-se aumentar a eficácia da seleção especialmente para características com baixa herdabilidade e que são mensuradas em apenas um dos sexos; (b) A tecnologia dos transgênicos poderá ser aplicada para características quantitativas; (c) Na medicina, a identificação de alelos causando predisposição a doenças multifatoriais comuns, como doenças do coração ou diabetes, poderá ajudar a melhorar os métodos de prevenção; (d) A teoria da genética quantitativa poderá ser mais realista quando o número e as propriedades dos genes forem conhecidos”. São várias as definições para QTL (do inglês - Quantitative trait loci) ou locos de características quantitativas, algumas vezes também são chamados de ETL (locos de características econômicas). Uma região do cromossomo que contém um ou mais genes que influenciam uma característica multifatorial é conhecido como QTL (Andersson e Georges, 2004). Hocking (2005) afirma que a estimativa estatística da melhor localização para um suposto gene é chamada de QTL quando o valor individual para uma característica é regularmente distribuído. Erickson et al. (2004) afirmam que um QTL é uma região cromossômica flanqueada por dois marcadores delimitando sua posição no genoma. A lógica de mapeamento de QTL não é nova e foi utilizada pela primeira vez por Sax em 1923 para mapeamento de QTLs associados com o tamanho de sementes de feijão através da ligação com um loco de pigmento (Mackay, 2001). Avanços na tecnologia de marcadores e, paralelamente, no desenvolvimento de softwares analíticos para análises combinadas de informações fenotípicas e genéticas, resultaram na aplicação da análise de QTL na medicina, agricultura, ecologia e evolução (Erickson et al., 2004). Segundo Slate (2005) nos últimos 15 anos o mapeamento de QTL tem se tornado um método popular para a compreensão da base genética da variação contínua em uma variedade de sistemas. Ikeobi et al. (2004), afirmam que: “a identificação de QTL é o primeiro passo para a caracterização de variações genéticas que ocorrem no nível dos genes e do DNA”. Para o mapeamento genético de qualquer característica simples ou complexa, devem-se seguir três etapas: (1) varrer o genoma todo com uma coleção densa de marcadores genéticos; (2) calcular uma apropriada ligação estatística S(x) para cada posição x ao longo do genoma; (3) identificar as regiões nas quais a ligação estatística S mostra um desvio significativo do que seria esperado caso houvesse segregação independente (Lander e Kruglyak, 1995). Os genes que segregam em um QTL não podem ser individualmente identificados na maioria dos casos. É possível, entretanto, localizar as regiões do genoma nas quais estão os locos relevantes e estimar o quanto da variação total é explicada pela variação do QTL. Esta análise é feita cruzando duas linhagens que diferem na característica quantitativa e também diferem nos alelos de locos conhecidos (marcadores). A geração F1 entre duas linhagens é cruzada entre si para se obter uma geração F2 segregante, ou pode ser retrocruzada com uma das linhagens parentais. Buscam-se regiões cromossômicas comuns a indivíduos aparentados que apresentam desempenho superior para as características de interesse e que, ao mesmo tempo, tendem a diferir entre indivíduos aparentados com desempenho superior e inferior. Se existirem QTLs proximamente ligados a um marcador, então os diferentes genótipos marcadores na geração segregante também levarão os alelos dos QTLs que estavam ligados a eles nas linhagens parentais originais (Griffiths et al., 1998). Segundo Seaton et al. (2002): “o QTL Express (QTL Express, 2005) é a primeira aplicação para mapeamento de QTL em populações exogâmicas com o uso de uma interface na Internet”. São necessários para a análise três arquivos contendo: o mapa de marcadores, fenótipos e genótipo dos marcadores; para realização do mapeamento de um ou de múltiplos QTLs. Para populações derivadas de cruzamentos, o modelo para o mapeamento de QTL pode ser especificado, em termos de efeitos aditivos e de dominância, com a opção de interação entre um QTL e um efeito fixo. Também para populações exogâmicas o modelo de QTL pode incluir efeito gamético (imprinting). Além disso, são realizados testes de permutação, limiar de significância das ligações para todo o genoma, e o procedimento de bootstrap para estimar o intervalo de confiança dos QTLs. 4.1 Populações e delineamentos experimentais para estudos de mapeamento de QTLs Para desenvolver uma população para o mapeamento de QTL, as linhagens parentais devem ter variação tanto no DNA quanto fenotípica. Quanto mais variação, mais fácil será encontrar marcadores informativos (polimórficos), que permitam traçar eventos de recombinação para o mapeamento de QTL (Nones, 2004). Em aves e suínos a maioria dos estudos de mapeamento de QTL tem sido realizada através de cruzamentos de linhagens ou raças genética e fenotipicamente divergentes (De Koning et al., 2003). Esta abordagem foi utilizada para mapear QTLs para uma grande variedade de características em suínos (Knott et al., 1998; De Koning et al., 1999 e 2001), frangos (Van Kaam et al., 1999 a e b; Calborg et al., 2004; Jennen et al, 2005, Ikeobi et al., 2002 e 2004) e codornas (Minvielle et al., 2005). Segundo Ledur e Bertani (2002), são poucas as populações para estudos de QTL em galinhas no mundo. Os cruzamentos mais utilizados são: 1. Entre linhagens de postura e corte (Ledur et al., 2000; Hamoen et al., 2001; Ikeobi et al., 2002; Sewalen et al., 2002; Calborg et al., 2004), 2. Entre linhagens de postura: Buitenhuis et al. (2004), utilizaram duas linhagens com comportamentos divergentes; Siwek et al. (2004), trabalharam com linhagens de respostas imunológicas diferentes, 3. Entre linhagens de corte: Van Kaam et al. (1998), utilizaram uma linhagem paterna selecionada para crescimento e uma linhagem materna selecionada para características reprodutivas; Zhu et al. (2003), trabalharam com linhagens diferentes quanto à resistência a coccidiose e doença de Marek; Jennen et al. (2004), utilizaram uma população derivada da raça White Plymouth Rock, com características divergentes para gordura. A Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (Embrapa) Suínos e Aves em colaboração com a Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” (Esalq) desenvolveram uma população experimental de aves a partir do cruzamento de uma linhagem de corte e uma de postura. Essa população contribui para elucidar diferenças na expressão gênica e nos efeitos de QTLs, bem como possibilita estudos sobre efeito materno, citoplasmático, ligado ao sexo e efeito gamético (gametic imprinting) (Ledur et al., 2000). Nesta população experimental brasileira estão sendo realizados estudos de mapeamento de QTLs. Nos cromossomos 1 a 5 foram mapeados QTLs para as características de: peso vivo, consumo de ração, carcaça e peso de órgãos (Nones et al., 2006; Baron, 2004 e Ruy, 2004). Nos cromossomos 6, 7 e 8 foram mapeados QTLs sugestivos para: características de crescimento, consumo de ração, peso da moela e dos pés (Moura et al., 2006). Grande número de delineamentos experimentais e de metodologias estatísticas tem sido proposto para se detectar QTLs. Todos os delineamentos sugeridos têm vários elementos em comum. Considera-se que um loco de característica quantitativa esteja ligado ao loco de um marcador com a freqüência de recombinação r. Para simplificar, pressupõe-se que apenas dois alelos estão segregando na população para ambos os locos, do marcador M e do QTL Q. Os genótipos dos marcadores podem ser denominados M1M1, M1M2 e M2M2. Os genótipos do QTL podem ser denominados Q1Q1, Q1Q2 e Q2Q2. Desde que M e Q estejam ligados, aquelas progênies que receberem M1 também receberão Q1, enquanto que aquelas que receberem M2, também receberão Q2, exceto pelos indivíduos recombinantes. Dessa forma, o efeito do QTL pode ser detectado pela comparação das médias dos grupos de progênie que receberem alelos marcadores alternativos dos pais heterozigotos (Regitano e Coutinho, 2001). Para a identificação de QTL geralmente são utilizados dados provenientes de cruzamentos entre linhagens ou raças endogâmicas, ou de populações chamadas de segregantes ou exogâmicas, como ocorre na maioria dos animais domésticos. A análise de registros de cruzamentos entre linhagens endogâmicas apresenta algumas vantagens, como o conhecimento dos genótipos dos parentais, da fase de ligação e do número de alelos do suposto QTL (Silva et al., 2005). Segundo Hocking (2005), o delineamento experimental para a identificação de QTL para características de produção é tipicamente uma população F2, do cruzamento de duas linhagens com 250 a 700 aves. 4.2 Métodos estatísticos para detecção de QTLs Para o mapeamento de QTL é necessário um grande número de testes estatísticos e diferentes métodos podem ser utilizados. Lander e Botstein, em 1989, desenvolveram o método por intervalo através da análise de dois marcadores adjacentes na forma de um intervalo. Esta abordagem baseia-se na estimativa de máxima verossimilhança dos parâmetros de freqüência de recombinação, ordem dos marcadores e magnitude do efeito. O teste de hipótese é feito com o método de LOD (likelihood of odds) (Ferreira e Grattapaglia, 1998). Haley e Knott (1992) demonstraram que uma análise de quadrados mínimos pode ser usada no mapeamento de intervalo, pois fornece testes estatísticos e estimativas muito similares às obtidas pelo método de máxima verossimilhança, permitindo a utilização de modelos mais complexos com menor demanda computacional. Segundo Haley et al. (1994), a desvantagem de se utilizar a máxima verossimilhança no mapeamento de intervalos é a sua complexidade computacional, o que dificulta as análises simultâneas de vários QTLs ligados, interações entre QTLs, efeitos de QTLs não ligados e efeitos fixos. Mas isso é discutível, em virtude dos modernos computadores disponíveis para análises. O que dificulta as análises de QTLs para populações exogâmicas é a falta de softwares desenvolvidos; um dos disponíveis é o QTL Express (QTL Express, 2005) o qual utiliza o método da regressão linear. Os modelos de análise mais utilizados para populações exogâmicas são os de meio-irmãos (half-sib) (De Konning et al., 1998 e 2003) ou F2 (line cross) (Alfonso e Haley, 1998). A análise de meio-irmãos não faz suposição de fixação dos alelos do QTL nas linhagens parentais, diferente do modelo de F2, quando os alelos estão supostamente fixados (De Konning et al., 2001). 4.3 Níveis de significância O nível de significância para declarar a existência de um QTL pode ser expresso na forma de valor de LOD, que indica na escala logarítmica, a razão entre a probabilidade dos dados observados terem surgido assumindo a presença de um QTL, sobre a probabilidade de sua ausência. Um QTL é significativo quando o LOD excede o escore de três, ou seja, indica que esta probabilidade é aproximadamente 1000 vezes maior (Ferreira e Grattapaglia, 1998). Os níveis de significância podem ser analisados de diferentes formas, seguindo outros critérios, como mostram alguns trabalhos, como o publicado por Lander e Kruglyak (1995). O apropriado limiar de significância da ligação deve ser declarado e pode ser calculado em função do tamanho do genoma e do número de cromossomos (Slate, 2005). Hocking (2005) afirma que: “a maioria dos autores utiliza níveis de significância baseados no critério sugerido por Lander e Kruglyak (1995)”. Segundo Lander e Kruglyak (1995), uma ligação sugestiva é a evidência estatística esperada de encontrar um QTL aleatoriamente numa varredura genômica completa. Ligação significativa é a evidência estatística esperada de ocorrer 5% e ligação altamente significativa a evidência estatística esperada de ocorrer 1% na varredura genômica. Os resultados de uma ligação sugestiva devem ser acompanhados de um aviso sobre sua natureza tênue e, devem ser confirmados em outros estudos, nos quais conjuntos de dados antigos e novos são combinados para verificar se uma evidência significativa de ligação pode ser encontrada. 4.4 Problemas e limitações no mapeamento de QTLs Andersson e Georges (2004) afirmam que a identificação de genes e mutações que causam um QTL é problemática por algumas razões. Primeiro é difícil determinar a localização exata de um QTL: estes são freqüentemente mapeados em regiões cromossômicas de 20 cM, que podem conter centenas de genes. Segundo: a maioria dos QTLs possui um efeito fenotípico ameno, portanto as mutações que os causam são difíceis de serem diferenciadas de polimorfismos neutros. A estimativa da localização de um QTL é muito imprecisa para serem feitas inferências se o mesmo QTL está segregando em diferentes populações (Hocking, 2005). Além disso, não apenas falsos QTLs podem ser identificados, mas também reais QTLs podem ser perdidos na varredura do genoma (Slate, 2005). Muitos fatores podem alterar o poder de um experimento de QTL: tipo e número de marcadores, delineamento experimental, número de animais da população. Em experimentos empregando menos de 300 animais haverá dificuldade para estimação dos efeitos do QTL; quanto maior o número de animais, melhor será a detecção de QTL. Alfonso e Haley (1998) afirmam que a fração total da variância fenotípica explicada por um QTL é o mais importante fator influenciando ou não a detecção. Segundo Weller (2001), o principal problema é o tamanho relativamente pequeno das amostras da maioria dos experimentos em mapeamento de QTLs. Na maioria dos casos cujos efeitos do QTL não foram encontrados, o poder foi muito pequeno para encontrar QTL segregando numa magnitude razoável. As limitações em identificar a posição e efeito de um QTL residem em mensurar e genotipar populações de tamanho limitado (Erickson et al., 2004). 4.5 Aplicações do mapeamento de QTLs e seleção assistida por marcadores (MAS) Segundo Dekkers (2004), existem QTLs que já estão sendo utilizados em populações animais comerciais, como exemplos: para características de crescimento e composição de carcaça em suínos (Monsanto, EUA) e gado de corte (Genetic Solutions, Austrália); e para características de composição do leite em gado leiteiro. Segundo Ikeobi et al. (2002), a identificação e uso de QTLs em programas de seleção oferecem o potencial para um rápido ganho genético, particularmente em características difíceis de serem mensuradas. Enquadram-se neste grupo as características reprodutivas, de carcaça, resistência a doenças e longevidade produtiva. Identificar QTLs associados com características de carcaça é interessante porque a maioria destas características não pode ser mensurada em animais vivos, por isso a utilização de QTL irá facilitar a seleção (Van Kaam et al., 1999b). O próximo passo para experimentos de mapeamento de QTL é o mapeamento fino de regiões contendo QTLs de interesse, que requer mapas mais densos (Crooijmans et al., 1997). Depois de obtermos maiores informações sobre os efeitos dos QTLs e suas localizações, é possível a utilização destes dados na seleção assistida por marcadores (MAS – marker assisted selection), juntamente com os métodos tradicionais de seleção. Um fator importante que deve ser considerado é interações entre QTLs. Existem evidências que interações epistáticas entre QTLs são importantes efeitos nas características muiltifatorias (Andersson e Georges, 2004). Essas interações ainda são pouco estudadas; no estudo de Calborg et al. (2004), foi realizado um mapeamento de pares de QTLs que interagem entre si para características de crescimento. No cromossomo 13 houve interações epistáticas significativas com os QTLs encontrados nos cromossomos 1, 2 e 8. Segundo Dekkers (2004), algumas das primeiras aplicações da MAS em animais de produção foi a seleção de aves resistentes a doenças, usando testes de Elisa para detecção do grupo sangüíneo B e a seleção de suínos sem o problema da síndrome do estresse suíno, através da detecção do gene do halotano. Posteriormente, outros testes genéticos foram desenvolvidos para a seleção de animais, como para a exclusão de genes que causam problemas genéticos, ou para adição de alelos que conferem características favoráveis, como o teste do gene receptor do estrogênio, que afeta o tamanho da leitegada em suínos. Os efeitos da MAS são difíceis de serem quantificados, principalmente em condições experimentais, devido às diferenças entre os estudos. O sucesso da aplicação da MAS não é claro e depende da habilidade de integração das informações dos marcadores na seleção com os programas de melhoramento genético (Dekkers, 2004). 5 Trabalhos de mapeamento de QTLs em Gallus gallus Existem diversos trabalhos de mapeamento de QTL em galinhas para características de desempenho e carcaça. Autores mapearam QTLs para características de consumo de alimento, peso corporal, crescimento, rendimento de carcaça, cor da carne, deposição de gordura, comportamento, musculatura, produção e características de ovos (Van Kaam et al., 1998, 1999 a, b; Tatsuda e Fujinaka, 2001; McElroy et al., 2002; Sewalen et al., 2002; Hocking e Burt, 2003; Kerje et al., 2003; Buitenhuis et al., 2003 e 2004; Ikeobi et al., 2002 e 2004; Sasaki et al., 2004). Os principais trabalhos encontrados na literatura cujos autores mapearam QTLs (significativos ou sugestivos) no cromossomo 11 estão enumerados na Tabela 2, e para o cromossomo 13 na Tabela 3. Podemos observar o número de marcadores utilizados para cada cromossomo (quando esta informação estava disponível), número de animais envolvidos no estudo (F2) e a porcentagem da variância fenotípica explicada pelo QTL. Sasaki et al. (2004) buscaram QTLs em uma população oriunda de cruzamentos de aves White Leghorn e Rhode Island Red para características de peso corporal, produção e diversas características de ovos. Foram detectados QTLs significativos nos cromossomos 4, 11, 27 e Z e vários sugestivos. Em outro trabalho, Kerje et al. (2003) mapearam QTLs para características de peso corporal, crescimento em diferentes idades (1-8, 8-46, 46-112 e 112-200 dias) e peso de ovos. Utilizaram 105 microssatélites, com a média de 24,3 cM de distância entre eles. Foram empregados quatro marcadores para o cromossomo 11 e dois para o 13. Encontraram QTLs significativos para os cromossomos 1 a 5, 7, 8, 11, 12, 14, 23, 27 e Z. Jennen et al. (2004) estudaram as características de peso corporal, peso e porcentagem da gordura abdominal em galinhas nas idades de 7, 9 e 10 semanas. Foram mapeados 26 QTLs em diversos cromossomos e três QTLs no cromossomo 13. Sewalen et al. (2002) estabeleceram uma população F2 a partir de cruzamentos entre uma linhagem paterna de corte e uma linhagem de poedeiras. Utilizaram 101 marcadores microssatélites para o mapeamento de QTL associados ao peso corporal as 3, 6 e 9 semanas de idade. Foram identificados QTLs significativos nos cromossomos 1, 2, 4, 7, 8, 13, 27 e Z. Em uma outra população F2, sete QTLs com 5% de significância no cromossomo, foram mapeados no cromossomo 13 para características de crescimento e carcaça. Todos estes QTLs estão localizados a 15 cM (McElroy et al., 2002). No estudo de Ikeobi et al. (2002) foi analisada a maioria dos cromossomos, para a identificação de QTLs associados a peso da gordura abdominal, peso da gordura da pele e distribuição de gordura. Foram mapeados QTLs significativos nos cromossomos: 1, 3, 5, 7, 13, 15 e 28. Utilizando a mesma população, Ikeobi et al. (2004) identificaram 30 QTLs significativos nos cromossomos 1 a 9, 13, 27 e Z para 11 características de carcaça. Em outro trabalho de identificação de QTLs em aves, mas envolvendo o comportamento das mesmas às 5 e 29 semanas de idade, foi encontrado um QTL sugestivo para freqüência de defecação no cromossomo 11 (Buitenhuis et al., 2004). O Capítulo 2, denominado MAPEAMENTO DE LOCOS DE CARACTERÍSTICAS QUANTITATIVAS ASSOCIADOS A DESEMPENHO E CARCAÇA NOS CROMOSSOMOS 11 E 13 DE Gallus gallus, apresenta-se de acordo com as normas para publicação na revista Genetics and Molecular Biology. O objetivo deste trabalho foi identificar locos controladores de características quantitativas (QTLs) nos cromossomos 11 e 13 de galinhas (Gallus gallus) para características de desempenho e carcaça. Referências Bibliográficas ANDERSSON, L.; GEORGES, M. 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Tabela 1 – Estimativa das exportações de carne de frango de 2002 a 2005 EExxppoorrttaaççõõeess ddee CCaarrnnee ddee FFrraannggoo [[eemm 11..000000 ttoonneellaaddaass ((**))]] País 2002 2003 (1)2004 (2)2005 Brasil 1.577 1.916 2.451 2.595 Estados Unidos 2.180 2.232 2.163 2.279 União Européia 877 760 824 830 Tailândia 465 528 215 270 China 438 388 241 250 Argentina 23 39 75 90 Canadá 84 76 70 75 Emirados Árabes 37 40 40 42 Arábia Saudita 20 25 25 25 Austrália 15 15 16 15 Outros Países 31 27 21 26 Total Mundial 5.751 6.051 6.148 6.507 Notas: (1) Dados Preliminares (2) Previsão (*) Carne in natura com osso Fonte: USDA (Avicultura Industrial, 2005). T ab el a 2 – Q T Ls s ig ni fic at iv os ( 1 e 5% ) e su ge st iv os m ap ea do s e de sc rit os n a lit er at ur a pa ra o c ro m os so m o 11 d e G al lu s ga llu s, nú m er o de a ve s es tu da da s, n úm er o de m ar ca do re s e po rc en ta ge m d a va riâ nc ia fe no típ ic a CC aa rr aa cc tt ee rr íí ss tt ii cc aa NN oo aa vv ee ss FF 22 NN ú m er o dd ee MM aa rr cc aa dd oo rr ee ss11 MM aa rr cc aa dd oo rr ee ss ff ll aa nn qq uu ee aa dd oo rr ee ss RR 22 (( %% )) AA uu tt oo rr ee ss F re qü ên ci a de d ef ec aç ão à s 5 se m an as d e id ad e+ 63 0 - LE I0 14 3 – A D L0 12 3 4, 3 B ui te nh ui s et a l., 2 00 4 P es o da g or du ra a bd om in al à s 7 se m an as + 45 6 8 A D L0 28 7 – A D L0 12 0 - Je nn en e t a l., 2 00 4 Lu m in os id ad e en co nt ra da n a ca sc a de o vo s+ 26 5 2 - 10 ,0 S as ak i e t a l., 2 00 4 T eo r de v er m el ho e nc on tr ad o na c as ca d e ov os * 26 5 2 - 19 ,0 S as ak i e t a l., 2 00 4 T eo r de a m ar el o en co nt ra do n a ca sc a de o vo s+ 26 5 2 - 13 ,0 S as ak i e t a l., 2 00 4 C re sc im en to d os 8 a os 4 6 di as ** 85 1 4 A D L0 21 0- A D L0 30 8 2, 5 K er je e t a l., 2 00 3 P es o co rp or al a os 4 6 di as ** 85 1 4 A D L0 30 8 – M C 1R 2, 8 K er je e t a l., 2 00 3 ** S ig ni fic at iv o a 1% n o ge no m a; * S ig ni fic at iv o a 5% n o ge no m a; + Li ga çã o su ge st iv a. 1 M ar ca do re s m ic ro ss at él ite s ut ili za do s pa ra o c ro m os so m o 11 . R 22 P or ce nt ag em d e va riâ nc ia fe no típ ic a. T ab el a 3 – Q T Ls s ig ni fic at iv os ( 1 e 5% ) e su ge st iv os m ap ea do s e de sc rit os n a lit er at ur a pa ra o c ro m os so m o 13 d e G al lu s ga llu s, n úm er o de a ve s es tu da da s, n úm er o de m ar ca do re s e po rc en ta ge m d a va riâ nc ia fe no típ ic a CC aa rr aa cc tt ee rr íí ss tt ii cc aa NN oo aa vv ee ss FF 22 NN úú mm ee rr oo dd ee mm aa rr cc aa dd oo rr ee ss11 MM aa rr cc aa dd oo rr ee ss ff ll aa nn qq uu ee aa dd oo rr ee ss RR 22 (( %% )) AA uu tt oo rr ee ss P es o às 3 s em an as ** 46 6 3 A D L0 14 7- A D L0 22 5 4, 3 S ew al em e t a l., 2 00 2 P es o as 6 s em an as ** 46 6 3 A D L0 14 7- A D L0 22 5 4, 4 S ew al em e t a l., 2 00 2 P es o às 9 s em an as * 46 6 3 A D L0 14 7- A D L0 22 5 3, 6 S ew al em e t a l., 2 00 2 P es o da m et ad e da c ar ca ça fr on ta l* 20 1 - - - M cE lro y et a l., 2 00 2 P es o an te s do tr an sp or te * 20 1 - - - M cE lro y et a l., 2 00 2 P es o ap ós tr an sp or te * 20 1 - - - M cE lro y et a l., 2 00 2 P es o da c ar ca ça s em m iú do s* 20 1 - - - M cE lro y et a l., 2 00 2 E sc or e de c on fo rm aç ão * 20 1 - - - M cE lro y et a l., 2 00 2 P es o de fi lé * 20 1 - - - M cE lro y et a l., 2 00 2 P es o de c ar ne b ra nc a* 20 1 - - - M cE lro y et a l., 2 00 2 P es o da g or du ra d e pe le * 44 2 3 A D L0 14 7- A D L0 22 5 3, 6 Ik eo bi e t a l., 2 00 2 G or du ra d a pe le + 44 2 3 A D L0 14 7- A D L0 22 5 - Ik eo bi e t a l., 2 00 2 P es o da g or du ra a bd om in al + 44 2 3 A D L0 14 7- A D L0 22 5 - Ik eo bi e t a l., 2 00 2 M us cu la tu ra c ox a e so br ec ox a (c ov . o ss o da p er na )* * 44 2 3 A D L0 14 7- A D L0 22 5 5, 1 Ik eo bi e t a l., 2 00 4 S ob re co xa + 44 2 3 A D L0 14 7- A D L0 22 5 - Ik eo bi e t a l., 2 00 4 ** S ig ni fic at iv o a 1% n o ge no m a; * S ig ni fic at iv o a 5% n o ge no m a; + Li ga çã o su ge st iv a. 1 N úm er o de m ar ca do re s m ic ro ss at él ite s ut ili za do s pa ra o c ro m os so m o 13 . R 2 P or ce nt ag em d e va riâ nc ia fe no típ ic a. T ab el a 3 – Q T Ls s ig ni fic at iv os ( 1 e 5% ) e su ge st iv os m ap ea do s e de sc rit os n a lit er at ur a pa ra o c ro m os so m o 13 d e G al lu s ga llu s, nú m er o de a ve s es tu da da s, n úm er o de m ar ca do re s e po rc en ta ge m d a va riâ nc ia fe no típ ic a CC aa rr aa cc tt ee rr íí ss tt ii cc aa NN oo aa vv ee ss FF 22 NN úú mm ee rr oo dd ee mm aa rr cc aa dd oo rr ee ss11 MM aa rr cc aa dd oo rr ee ss ff ll aa nn qq uu ee aa dd oo rr ee ss RR 22 (( %% )) AA uu tt oo rr ee ss M us cu la tu ra c ox a e so br ec ox a ( co v. c ar ca ça )* 44 2 3 A D L0 14 7- A D L0 22 5 4, 1 Ik eo bi e t a l., 2 00 4 M us cu la tu ra c ox a (c ov . c ar ca ça )* * 44 2 3 A D L0 14 7- A D L0 22 5 5, 0 Ik eo bi e t a l., 2 00 4 C ox a* * 44 2 3 A D L0 14 7- A D L0 22 5 4, 6 Ik eo bi e t a l., 2 00 4 M us cu la tu ra c ox a (c ov . s ob re co xa )+ 44 2 3 A D L0 14 7- A D L0 22 5 - Ik eo bi e t a l., 2 00 4 M us cu la tu ra d o pe ito ( co v. m us cu la tu ra co xa e s ob re co xa )* * 44 2 3 A D L0 14 7- A D L0 22 5 5, 1 Ik eo bi e t a l., 2 00 4 M us cu la tu ra d o pe ito ( co v. c ar ca ça )+ 44 2 3 A D L0 14 7- A D L0 22 5 - Ik eo bi e t a l., 2 00 4 P es o de g or du ra a bd om in al à s 7 se m an as + 45 6 9 M C W 01 04 - M C W 03 22 - Je nn en e t a l., 2 00 4 P es o co rp or al à s 7 se m an as + 45 6 9 M C W 03 22 -M C W 01 10 - Je nn en e t a l., 2 00 4 P es o co rp or al à s 10 s em an as * 45 6 9 M C W 03 22 -M C W 01 10 26 ,6 Je nn en e t a l., 2 00 4 ** S ig ni fic at iv o a 1% n o ge no m a; * S ig ni fic at iv o a 5% n o ge no m a; + L ig aç ão s ug es tiv a. 1 N úm er o de m ar ca do re s m ic ro ss at él ite s ut ili za do s pa ra o c ro m os so m o 13 . R 2 P or ce nt ag em d e va riâ nc ia fe no típ ic a. Figura 1 – Representação esquemática do cariótipo de Gallus gallus (os cromossomos e grupos de ligações em preto são os que possuem seqüências disponíveis) (NCBI Map Viewer, 2005) Figura 2 – Mapas Consenso dos cromossomos 11 e 13 de Gallus gallus (ARKdb, 2006) Mapeamento de locos de características quantitativas associados a desempenho e carcaça nos cromossomos 11 e 13 de Gallus gallus Clarissa BoschieroI; Luiz L. CoutinhoII; Mônica C. LedurIII; Ana Silvia A.M.T. Moura I IFaculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Departamento de Produção e Exploração Animal, Unesp, Botucatu, SP, Brasil. IIEscola Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz", Departamento de Zootecnia, Laboratório de Biotecnologia Animal, Piracicaba, SP, Brasil. IIIEmpresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária, Centro Nacional de Pesquisas de Suínos e Aves, Concórdia, SC, Brasil. Palavras-chave: QTL, Gallus gallus, Mapeamento Genético, Marcadores Microssatélites. Correspondência para Ana Silvia A.M.T. Moura Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Departamento de Produção e Exploração Animal, Distr. Rubião Jr, s/n , Botucatu, Brasil E-mail: anamoura@fca.unesp.br Mapeamento de locos de características quantitativas associados a desempenho e carcaça nos cromossomos 11 e 13 de Gallus gallus Resumo O objetivo deste trabalho foi identificar locos controladores de características quantitativas (QTLs) nos cromossomos 11 e 13 de galinhas (Gallus gallus) para características de desempenho e carcaça. A partir do cruzamento entre uma linhagem de corte e uma de postura, foi gerada a população experimental F2 na Embrapa Suínos e Aves. Foram avaliadas as seguintes informações fenotípicas: peso ao nascer, peso aos 35, 41 e 42 dias, ganho de peso, consumo de ração, eficiência e conversão alimentar dos 35 aos 41 dias e valores de hematócrito. As carcaças foram evisceradas e avaliados: o comprimento do intestino, peso dos pulmões, do fígado, do coração e da moela. Foram obtidos após quatro horas de resfriamento: peso da carcaça, gordura abdominal, peso de partes: peito, coxas, dorso, asas, cabeça e pés. Quatro e cinco marcadores microssatélites dos cromossomos 11 e 13, respectivamente, foram genotipados num total aproximado de 330 animais F2 em quatro famílias de irmãos-completos. Os mapas de ligação para ambos os cromossomos foram construídos e a análise de mapeamento de QTLs baseada no modelo genético de F2 foi realizada. No cromossomo 11 foram mapeados dois QTLs sugestivos: para peso de pés e de moela, ambos posicionados no intervalo entre ADL0123 e ADL0210. No cromossomo 13 foi mapeado um QTL sugestivo para peso de coração posicionado no intervalo entre MCW0110 e MCW0104. Mapping quantitative trait loci for performance and carcass traits on chromosomes 11 and 13 of Gallus gallus Abstract The objective of this study was to identify quantitative trait loci (QTLs) for performance and carcass traits in chicken (Gallus gallus) chromosomes 11 and 13. From the crossbreeding of a broiler and a layer line, an F2 experimental population was generated at the Embrapa Suínos e Aves. The following phenotypic data were recorded: body weights at birth, 35, 41 and 42 d; weight gain, feed consumption and feed conversion from 35 to 41 d; weights of carcass, carcass parts, organs and abdominal fat, hematocrit and length of intestine. Four and five microsatellite markers from chromosomes 11 and 13, respectively, were genotyped in approximately 330 F2 chickens from four full-sib families. The linkage maps for both chromosomes were constructed and the QTL mapping analyses were carried out based on an F2 genetic model. Two suggestive QTLs were mapped to chromosome 11: for feet and gizzard weights, both located in the interval between ADL0123 and ADL0210. On chromosome 13 one suggestive QTL for heart weight was detected in the interval between MCW0110 and MCW0104. Introdução A galinha (Gallus gallus) é o mais importante animal de produção do mundo, além disso, é muito utilizado como modelo de pesquisa para doenças humanas e estudos de comportamento animal. O total da população mundial de galinhas é cerca de 30 bilhões (Jensen, 2005). A avicultura é uma atividade de grande importância socioeconômica em todos continentes. No Brasil, esta atividade vem se consolidando como uma das mais competitivas e tecnificadas do cenário internacional. Em 2004 o Brasil passou a ser o maior exportador mundial de frangos (União Brasileira de Avicultura, 2005). O desenvolvimento desta atividade foi possível devido a melhorias nas instalações, nutrição, manejo, sanidade e, principalmente devido aos progressos obtidos pelo melhoramento genético (Ledur et al., 2003). Características economicamente importantes para animais de produção, como: peso vivo, produção e qualidade de carne, resistência a doenças, gordura, entre outras, são reflexos do conteúdo genético (genótipo), mais as influências ambientais, resultando no fenótipo. Um ambiente próximo do ideal deve ser proporcionado para que eles possam apresentar ótimo desenvolvimento em curto período de tempo. Pelos métodos tradicionais de melhoramento a seleção é baseada no fenótipo, que nem sempre é um reflexo do genótipo. O desenvolvimento da biologia molecular propiciou a utilização de novas ferramentas para uma melhor compreensão da variação genética das espécies. Através das técnicas moleculares está sendo possível descobrir mecanismos de expressão gênica, localização de genes ou regiões cromossômicas responsáveis por características importantes; para que seja realizada uma seleção mais precoce e precisa, fundamentada no genótipo do animal. Essas novas tecnologias devem ser complementares às técnicas tradicionais de melhoramento genético, e os resultados poderão não ser de aplicação imediata, sendo ainda necessários mais estudos para sua validação. Os mapas genéticos que recentemente foram publicados para galinhas (Groenen et al., 2000; Schmid et al. 2000), e os marcadores microssatélites são importantes ferramentas que facilitam a detecção e localização de locos controladores de características quantitativas (QTL). A disponibilidade de um mapa genético da galinha, rico em informações sobre marcadores, permite a análise sistemática da natureza da variação genética de características economicamente importantes (Ledur e Bertani, 2002). Uma das maiores metas da pesquisa genômica de aves tem sido o mapeamento de QTLs. A detecção destes locos pode ser feita através da varredura de todo o genoma com a utilização de marcadores anônimos, ou através do estudo de polimorfismos de genes candidatos. A aceleração do melhoramento genético e as melhorias das práticas de nutrição, manejo e sanidade resultaram no aumento das taxas de crescimento do frango de corte moderno, e também no aumento dos problemas de mortalidade causados por distúrbios metabólicos, como a síndrome da morte súbita, discondroplasia tibial e síndrome ascítica (Berchieri Júnior e Macari, 2000). Por este motivo, é fundamental uma melhor compreensão das características do coração, pulmão, pernas e pés de aves, e os genes ou regiões (QTL) que as controlam para o melhoramento genético mais eficiente dos frangos. A Embrapa Suínos e Aves (Concórdia, SC) em colaboração com a Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” (Esalq/Piracicaba, SP), iniciou em 1999 o Projeto Brasileiro de Genômica de Aves, cujo objetivo inicial foi o mapeamento de QTL para características de importância econômica. Foi desenvolvida uma população experimental para estes estudos através do cruzamento de uma linhagem de corte e uma de postura. Várias outras instituições estão colaborando com este projeto: Embrapa Soja, Embrapa Gado de Leite, Embrapa Pecuária Sul, Agroceres, Instituto Roslin, UEL, Universidade de Wageningen, US Poultry Genome Project e recentemente a Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ/Botucatu, SP). Nesta população experimental brasileira estão sendo realizados estudos de mapeamento de QTLs. Foram mapeados QTLs nos cromossomos 1 a 5, para as características de: peso vivo, consumo de ração, carcaça e peso de órgãos (Nones et al., 2006; Baron, 2004 e Ruy, 2004). Nos cromossomos 6, 7 e 8 foram mapeados QTLs sugestivos (Moura et al., 2006). Este estudo tem o objetivo de identificar locos controladores de características quantitativas (QTL) para desempenho e carcaça nos cromossomos 11 e 13 de Gallus gallus. Material e Métodos População experimental Foi utilizada uma população experimental desenvolvida pela Embrapa Suínos e Aves, obtida a partir do cruzamento de machos de uma linhagem de corte (designada TT) e fêmeas de uma linhagem de postura (CC). A linhagem TT é uma linha macho, cujo objetivo de seleção é melhorar o peso corporal, conversão alimentar, consumo de ração, rendimento de carcaça e partes, viabilidade, fertilidade e eclodibilidade; e reduzir a gordura abdominal e doenças metabólicas (Figueiredo et al., 2003a). A linhagem CC foi originada da raça White Leghorn, para melhorar a produção de ovos, peso e qualidade do ovo, conversão alimentar, viabilidade, maturidade sexual, fertilidade, eclodibilidade e redução do peso corporal (Figueiredo et al., 2003b). Estas linhagens possuem características divergentes, ou seja, quando é realizado um cruzamento entre estas linhagens, obtemos uma população ideal para estudos de mapeamento de QTLs. Sete machos e sete fêmeas de cada linhagem foram utilizados nos cruzamentos. As aves foram mantidas em gaiolas individuais, com controle de pedigree, e os ovos foram identificados para possibilitar o anelamento ao nascer dos pintos da primeira geração (F1). Esta geração foi formada de sete famílias TC (cruzamento de machos de corte e fêmeas de postura) utilizada neste projeto. Para a formação da segunda geração (F2) foram selecionados um macho e três fêmeas ao acaso, de cada família F1. Cada macho fertilizou três fêmeas, através de inseminação artificial, evitando-se acasalamentos próximos. A geração F2 TC totalizou 2063 aves (cerca de 100 irmãos completos F2, por fêmea), produzidos em 17 incubações, com intervalos de 15 dias durante quase oito meses. Podemos verificar a estrutura populacional das famílias TC na Tabela 4. Essa população foi anelada com controle de pedigree individual, e avaliada para várias características de desempenho e carcaça. As aves foram criadas como frangos de corte recebendo ração à base de milho e farelo de soja, formulada para atender às necessidades nutricionais em cada fase, e água à vontade. As aves foram mantidas em boxes coletivos até os 35 dias de idade, quando foram realizados a pesagem e alojamento em gaiolas individuais para teste de conversão alimentar dos 35 aos 41 dias. Colheita dos dados fenotípicos e amostras de sangue As características de desempenho medidas foram: peso ao nascer (PN), peso aos 35 dias (P35), 41 dias (P41) e 42 dias (P42) de idade. O P42 foi mensurado após seis horas de jejum e transporte para o abate. Foram avaliados também: ganho de peso do nascimento aos 35, 41 e 42 dias e dos 35 aos 41 dias; consumo de ração, conversão alimentar e eficiência alimentar dos 35 aos 41 dias de idade e valores de hematócrito (porcentagem de glóbulos vermelhos no volume sangüíneo total). As carcaças foram evisceradas e medidas: comprimento do intestino (delgado e grosso), peso dos pulmões, do fígado, do coração e da moela. As seguintes características de carcaça foram obtidas após quatro horas de resfriamento: peso da carcaça (peso da carcaça sem vísceras, pés e cabeça), gordura abdominal e peso de partes: peito (com osso e pele), coxas (peso das coxas e sobrecoxas), dorso (peso da carcaça sem peito, asas e coxas), asas, cabeça e pés. Foram utilizadas as características: porcentagem de peito (peso do peito / P42), porcentagem de carcaça (peso da carcaça / P42) e porcentagem de gordura na carcaça (peso da gordura abdominal / P42). Todos os dados fenotípicos estão armazenados em um banco de dados do Setor de Melhoramento de Aves da Embrapa Suínos e Aves. Amostras de sangue foram colhidas em tubos contendo EDTA 10% e armazenadas em freezer a -80o C. Foram colhidos dos animais da geração parental 5 mL de sangue da veia braquial divididos em três colheitas durante três semanas (aproximadamente 1,6 mL/semana). Dos animais F1 e F2 o sangue foi colhido no abate após as aves serem decapitadas. O término dos abates ocorreu em agosto de 2000 e a organização e separação de alíquotas do sangue foram feitas até março de 2001. Parte das alíquotas foi levada para a Esalq, e o restante foi mantido como um banco de sangue na Embrapa para futuras pesquisas. Extração e quantificação de DNA No Laboratório de Biotecnologia Animal (Esalq) foram realizadas as extrações de DNA de diversas amostras do sangue das aves para os projetos de mapeamento de QTL. Os eritrócitos de aves são nucleados, sendo assim, maior quantidade de DNA é obtida na extração a partir de sangue, quando comparada a mamíferos. Dos animais F2, não foi necessário extrair DNA, uma vez que para outros projetos (cromossomos 1 a 5), foram extraídas quantidades suficientes de DNA. Um total de 16 animais parentais e F1 tiveram seus DNAs extraídos. Primeiramente foi utilizado o protocolo de extração com o detergente de guanidina (DNAzol ®1) (Anexo I). Mas, para algumas amostras, foi necessário utilizar o 1 Invitrogen Life Techonologies. protocolo com Proteinase K (Anexo II), já que delas resultou quantidade insuficiente de DNA quando realizada a extração com o detergente de guanidina. O DNA foi quantificado no espectrofotômetro (HITACHI, modelo U-20000). Depois da quantificação, foi feito o cálculo de diluição para que todas ficassem com a mesma concentração padronizada de 20 ng de DNA/µl. Amplificação dos marcadores microssatélites O Laboratório dispunha de alguns pares de primers doados pela Michigan State University através do projeto “Chicken Genome Project”. Alguns destes foram inicialmente testados, mas posteriormente outros foram adquiridos. Para o cromossomo 11 foram selecionados inicialmente: LEI0143, ADL0123, ADL0210 e MCW0230. Para o cromossomo 13 foram inicialmente testados seis marcadores: ADL0147, LEI0251, MCW0213, MCW0244, MCW0322 e MCW0104 (Tabela 5). Para as amplificações dos marcadores microssatélites foram utilizadas reações de PCR contendo 20 ng/µl de DNA genômico, as quais tiveram volume final de 25 µl e incluíram solução tampão, MgCl2 (cloreto de magnésio), dNTPs, iniciadores (primers) direto e reverso e 0,5 U da enzima Taq DNA polimerase (Anexo III). Primeiramente, foi feito um gradiente de temperatura para cada marcador microssatélite: depois de verificada a temperatura de anelamento recomendada deste marcador2 foi escolhida uma variação de seis graus a mais e seis a menos. O programa utilizado no termociclador está no Anexo IV. Depois da reação de PCR, as amostras foram aplicadas em gel de agarose a 2%, acompanhadas do marcador de peso molecular φX174 RF DNA/ Hae III na primeira canaleta para visualização do tamanho aproximado dos fragmentos. Nem sempre a temperatura de anelamento indicada2 foi a ideal, pois houve muita variação. Além da temperatura, também foi verificada a concentração de cloreto de magnésio. No caso da existência de muitas bandas inespecíficas, primeiro foi alterada a temperatura e depois a concentração do cloreto de magnésio. 2 Obtida nos catálogos do marcador ou em ARKdb, 2005. Genotipagem As quatro famílias de irmãos completos TC (F2) com o maior número de marcadores informativos na genotipagem seletiva dos cromossomos 1 a 5 (Baron et al. 2003; Nones et al. 2003 e Ruy et al. 2003) foram selecionadas para a genotipagem neste estudo. A genotipagem foi desenvolvida em duas etapas. Inicialmente foram genotipados 8 animais parentais (TT e CC) e oito da geração F1 para cada marcador. Depois de verificado se os marcadores eram informativos ou não, foi feita uma segunda genotipagem, com de cerca de 90 animais da geração F2 de cada uma destas mesmas quatro famílias. Um genotipador MegaBACE3 foi utilizado na análise dos fragmentos e identificação dos alelos. Apesar da amplificação de cada marcador ter sido individual, as genotipagens foram feitas a partir da mistura do produto amplificado de três a quatro marcadores, de acordo com o tamanho e a fluorescência do primer, juntamente com o padrão interno (ET-ROX 400)3. O programa para representação gráfica dos picos de fluorescência e determinação do tamanho dos fragmentos foi o Genetic Profiler3. Todos os picos e tamanhos foram conferidos manualmente. Mapas de ligação Os mapas de ligação dos cromossomos 11 e 13 foram construídos pelo método da máxima verossimilhança com o auxílio do programa CRIMAP (Green et al., 1990), que utiliza a função de Kosambi para transformar a fração de recombinação em distância de mapa em cM. Para isto, as informações de parentesco e genótipo dos marcadores foram digitadas em arquivo de editor de texto. Os seguintes procedimentos do programa foram empregados: a) twopoint, o qual estima as frações de recombinação entre os marcadores, dois a dois; b) build, que constrói o mapa de ligação, iniciando com os dois marcadores mais informativos e inserindo os demais nas suas respectivas posições; c) flips, que confere o valor de LOD, alterando a posição de pares de marcadores enquanto os outros permanecem fixos, e 3 GE Healthcare. gera valores de verossimilhança correspondentes; d) chrompic, que mostra a fase de ligação dos marcadores alinhados no cromossomo para cada indivíduo. Esta última opção permitiu identificar os indivíduos com duplas e triplas recombinações, os quais tiveram seus dados genotípicos conferidos, evidenciando possíveis erros. O programa utiliza como default o LOD três, que implica que a hipótese dos marcadores estarem ligados é 1000 vezes mais provável que a de não estarem. Após a obtenção dos mapas, eles foram desenhados com o auxílio do programa Mapchart (Voorrips, 2002), para uma melhor visualização dos marcadores e suas respectivas distâncias. Análise de Mapeamento de QTLs O método de mapeamento de QTL por intervalos, proposto por Haley et al. (1994), que emprega regressão linear e estimação de quadrados-mínimos, foi implementado utilizando-se o programa QTL Express (Seaton et al., 2002, QTL Express, 2005). Uma das opções do programa é o delineamento genético F2, desenvolvido para pedigree de três gerações e análise de QTL a partir do cruzamento de linhagens não- endogâmicas. Três arquivos de dados foram necessários para possibilitar a análise: um de genótipos dos marcadores, outro do mapa de ligação e o terceiro de fenótipos. Os dados fenotípicos foram previamente submetidos a uma análise estatística exploratória. O modelo incluiu os efeitos fixos de incubação, sexo, mãe, interações e as covariáveis (PN, P35 e P42). A covariável PN para as características: P35, P41, P42, ganho de peso do nascimento aos 35, 41 e 42 dias. A covariável P35 dias para as características: ganho de peso, conversão alimentar, consumo de ração e eficiência alimentar, todas dos 35 aos 41 dias. A covariável P42 dias para as características restantes (carcaça, partes, órgãos e valores de hematócrito). Para as características: peso ao nascer, porcentagens de gordura, peito e carcaça não foram empregadas covariáveis. Em seguida, todas as características foram pré-ajustadas para o efeito de incubação. Ajustes para os efeitos das interações duplas entre incubação, sexo e mãe foram efetuados somente quando significativos. Os resíduos desta análise foram empregados na análise de mapeamento de QTL. Os efeitos de sexo e mãe e covariável, quando significativos, foram incluídos posteriormente, no modelo de análise de mapeamento de QTL para cada característica. Na primeira etapa da análise de QTL, a probabilidade de um indivíduo F2 possuir cada um dos possíveis genótipos do QTL foi calculada condicionalmente a cada cM, na dependência do genótipo dos marcadores. A seguir, um modelo linear para os efeitos aditivos e de dominância de um QTL numa dada posição foi ajustado por quadrados- mínimos, para cada característica. O efeito aditivo é definido como sendo metade da diferença do valor fenotípico entre os indivíduos F2 homozigotos para os alelos originários da linhagem TT e CC, enquanto o efeito de dominância corresponde à diferença entre o valor fenotípico dos heterozigotos e a média dos dois homozigotos (De Koning et al., 1999). Segundo Haley et al. (1994) o coeficiente aditivo de um QTL para um indivíduo é a diferença entre a probabilidade condicional de dois QTLs homozigotos, e o coeficiente de dominância é igual a probabilidade condicional do indivíduo possuir um QTL heterozigoto. O modelo genético F2 (line cross) pressupõe que o QTL tenha alelos alternativos fixos nas linhagens fundadoras de corte e de postura, apesar delas poderem compartilhar alelos dos marcadores. Caso o teste estatístico F na análise inicial excedesse o valor limiar (threshold), as interações do QTL com os efeitos fixos de sexo e família foram testadas. Os níveis de significância cromossômico (5%) e genômico foram empregados, controlando-se, no último caso, a taxa de Erro Tipo I (falso positivo), pois para detectar QTLs um grande número de testes é necessário. Como estes testes não são independentes, obtêm-se um nível de significância que pode gerar falsos QTLs. Para reduzir este problema o nível de significância no cromossomo foi calculado para obter o nível de significância genômico desejado, proporcional à contribuição do cromossomo para o comprimento total do genoma autossômico, como sugerido por De Koning et al. (1999) e Tuiskula-Haavisto et al. (2002). Esta probabilidade foi calculada pela seguinte equação seguindo a correção de Bonferroni: ( ) r cromossomogenômico PP /1 )( )1(1 −−= Onde r é a contribuição de um cromossomo, obtida dividindo-se o comprimento do cromossomo (ou segmento) estudado pelo comprimento do genoma autossômico. A partir de 10.000 permutações realizadas na análise de QTL, foram obtidos empiricamente, segundo Churchill e Doerge (1994), os valores de F que correspondiam aos níveis de significância sugestivos e 5% de detectar QTL em algum lugar em todo o genoma, para cada característica. Resultados Amplificações por PCR No cromossomo 11, os quatro marcadores microssatélites testados produziram boa amplificação, mas foram necessários ajustes na temperatura de anelamento e na concentração de cloreto de magnésio. No cromossomo 13, dos marcadores testados inicialmente (ADL0147, LEI0251, MCW0213, MCW0244, MCW0322 e MCW0104) apenas três amplificaram – ADL0147, LEI0251 e MCW0104. Os iniciadores que não produziram produto de PCR foram descartados. Além disso, foram adquiridos os marcadores: MCW0110 e MCW0213, para uma melhor cobertura no mapa. Para os iniciadores que amplificaram também foram realizados testes de gradiente de temperatura, e quando apresentaram bandas inespecíficas na visualização do gel de agarose, foram feitos ajustes nas concentrações de cloreto de magnésio. Para o marcador MCW0104 foram realizados vários testes para se chegar à condição ideal. Outros tiveram sua concentração inicial de cloreto de magnésio alterada, como exemplo os marcadores LEI0143 e o MCW0230; já para os marcadores do cromossomo 13, a concentração de cloreto de magnésio não precisou ser alterada. A temperatura de anelamento para os marcadores variou de 55 a 68o C. Na Tabela 6 estão as condições de otimização de PCR para os marcadores dos cromossomos 11 e 13. Exemplos de géis de agarose mostrando os resultados das amplificações de alguns marcadores estão no Anexo V. Seleção dos marcadores informativos e genotipagens Neste estudo foram genotipadas quatro famílias de irmãos-completos, uma vez que nos outros trabalhos realizados com esta mesma população experimental (com os cromossomos 1 a 5), elas se mostraram sempre informativas para os marcadores analisados. As genotipagens foram feitas em duas etapas. Na primeira etapa, os animais parentais e F1 foram genotipados com os marcadores otimizados dos cromossomos 11 e 13. Foram genotipados 16 animais para cada marcador, ou seja, os parentais TT e CC e os indivíduos da geração F1. Na Tabela 7 encontramos o resultado das genotipagens dos animais das gerações parental e F1 para todos marcadores. Os noves marcadores foram pelo menos parcialmente informativos nas quatro famílias, por isso foi realizada a segunda etapa da genotipagem de cerca de 90 animais F2 de cada família para todos os marcadores. No Anexo VI podemos verificar as genotipagens de animais parentais com o marcador LEI0143 (cromossomo 11) e, de um casal F1 para o LEI0251. Todos os genótipos foram conferidos e incluídos numa planilha única para cada cromossomo para construção do mapa de ligação. Os genótipos que geraram dúvidas foram corrigidos. Após a conferência e correção dos genótipos foi construído o mapa de ligação para cada cromossomo. Mapas de ligação Os mapas de ligação dos cromossomos 11 e 13 foram construídos com o auxílio do programa Crimap (Green et al., 1990). As representações gráficas (Figuras 3 e 4) foram obtidas com o software MapChart – versão 2,1 (Voorrips, 2002). As Figuras 3 e 4 mostram os mapas designados como Embrapa (obtidos neste estudo), e à direita o mapa Consenso para fins de comparação. As médias das distâncias entre os marcadores dos mapas Embrapa foram de 35,17 cM no cromossomo 11, e de 14,25 cM no cromossomo 13. Os números de meioses informativas totais, e de fase conhecida para cada marcador estão na Tabela 8. O mapa do cromossomo 11 foi semelhante ao mapa Consenso, a ordem dos quatro marcadores foi a mesma, e a extensão do mapa obtido neste trabalho foi de 105,5 cM. A extensão do mapa de ligação do cromossomo 13 foi de 57 cM, mas com a ressalva de que é parcial, pois inicia-se a 22 cM do mapa Consenso e contém cinco marcadores, enquanto que o Consenso, onze. A ordem dos marcadores foi a mesma do mapa Consenso, com a exceção de dois marcadores: ADL0147 e MCW0213, que tiveram sua posição invertida quando comparada ao mapa Consenso. Análise estatística exploratória e ajuste dos dados fenotípicos As estatísticas descritivas das 28 características de desempenho e carcaça avaliadas nas quatro famílias