UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JULIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA CÂMPUS DE BOTUCATU ELUCIDAÇÃO DE ASPECTOS FISIOLÓGICOS E FUNCIONAIS DE PROTEÍNAS ASSOCIADAS AO MERCÚRIO EM PIRARUCU (Arapaima gigas) IZABELA DA CUNHA BATAGLIOLI Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Zootecnia como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Zootecnia. Botucatu – SP Agosto 2019 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JULIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA CÂMPUS DE BOTUCATU ELUCIDAÇÃO DE ASPECTOS FISIOLÓGICOS E FUNCIONAIS DE PROTEÍNAS ASSOCIADAS AO MERCÚRIO EM PIRARUCU (Arapaima gigas) IZABELA DA CUNHA BATAGLIOLI Zootecnista Orientador: Prof. Dr. Pedro de Magalhães Padilha Co-orientador: Dr. José Cavalcante Souza Vieira Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Zootecnia como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Zootecnia. Botucatu – SP Agosto 2019 FICHA CATALOGRÁFICA Permitida a cópia total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte. III Biografia do autor Izabela da Cunha Bataglioli – nasceu na cidade de Amparo/SP, em 3 de dezembro de 1992, filha de Vera Lucia Alves da Cunha. Ingresou no curso de Zootecnia da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – Unesp – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Câmpus de Botucatu, graduando-se em dezembro de 2016. Em abril de 2017 ingressou no Mestrado pelo programa de Pós-Graduação em Zootecnia da Unesp – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – Câmpus de Botucatu, onde foi bolsista FAPESP, na Área de Química e Bioquímica, com foco em metaloproteômica, visando quantificar e caracterizar proteínas associadas ao mercúrio em pirarucu (Arapaima gigas). IV Dedicatória À minha mãe, por todo apoio incondicional durante essa longa caminhada sempre almejando meu crescimento pessoal e profissional, me permitindo assim seguir em frente e alcançar meus objetivos. V Agradecimento Ao Programa de Pós-Graduação em Zootecnia, à Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia e à Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” pela oportunidade de estudar em um programa de excelência, pelo crescimento e conhecimentos adquiridos. Ao meu orientador, Dr. Pedro de Magalhães Padilha, pela oportunidade, confiança e generosidade em compartilhar todo seu conhecimento para que eu concluisse meu trabalho. Ao meu coorientador Dr. José Cavalcante Souza Vieira, por toda dedicação, infinita paciência, por todo ensinamento e suporte desde o primeiro dia, por todas as duvidas tiradas (mais de uma vez!!!), sou muito grata por nossa amizade! À todos os professores que já tive e que contribuíram para que eu chegasse até aqui e aos que me ajudaram nessa jornada, em especial a professora Simone Fernandes, minha primeira incentivadora academica, sempre acreditou em meu potencial e me guiou com sábios conselhos. Aos meus amigos queridos de laboratório, Janaína, Isabela, Grasieli e Mineiro (Wellington), que fizeram com que os dias mais difíceis se tornacem mais toleráveis, pelo carinho, companherismo e alegria de fazer das pequenas coisas cotidianas um motivo para descontrair. A minha querida amiga Mariana, juntas desde o primeiro dia de graduação compartilhando as vitórias e derrotas desde sempre. Muito obrigada pela amizade, certamente levarei para a vida toda! A minha psicóloga Kauana Barreiro, por me auxiliar nos momentos mais confusos, com toda sua paciência e carinho me ajudando sempre a enxergar os fatos com clareza, buscando sempre a melhor alternativa para continuar. Uma pessoa iluminada. Não posso deixar de agradecer ao meu alicerce, Vera (mãe), Daniela (irmã), Janaína (irmã) e Ticiane (cunhada), com todas as dificuldades da vida nunca deixaram de acreditar em mim e me apoiar incondicionalmente, vibrando com minhas realizações como se fossem suas, me levantando e me ensinando a passar pelas dificuldades, a verdade é que vocês sempre foram a luz que iluminou meu caminho. A todos que contribuiram de alguma forma para conclusão desta dissertação. Essa conquista é também de todos vocês, meu muitíssimo obrigada! O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001, e financiado VI pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), Processo FAPESP: Nº 2017/09466-3. VII Elucidação de aspectos fisiológicos e funcionais de proteínas associadas ao mercúrio em pirarucu (Arapaima gigas) RESUMO GERAL Nas últimas décadas estudos científicos tem dado destaque as altas concentrações de mercúrio (Hg) encontradas em solo, sedimentos, peixes e seres humanos na Amazônia. No entanto, encontram-se ainda escassos estudos relacionados aos mecanismos de toxicidade do mercúrio em nível celular na ictiofauna e populações ribeirinhas. Neste sentido, a investigação dos níveis de expressão de proteínas poderá agir como peça chave na elucidação de biomarcadores de exposição ao mercúrio, facilitando o estudo da contaminação no ambiente e seres vivos por este metal tóxico. O mapeamento destas proteínas associadas ao mercúrio poderá indicar previamente possíveis riscos de contaminação do pescado, bem como evitar a exposição humana ao mercúrio. Estudos metaloproteômicos recentes com peixes da região amazônica, desenvolvidos por grupo de pesquisadores da UNESP de Botucatu, permitiram o fracionamento e caracterização de algumas proteínas associadas ao mercúrio com características de biomarcador. No entanto, os aspectos fisiológicos e funcionais dessas proteínas associadas ao mercúrio nos peixes amazônicos e os mecanismos de adaptação apresentados por estes animais frente à exposição ao metal ainda não foram elucidados. Assim, o presente estudo teve por objetivo utilizar uma nova estratégia de preciptação (fracionada) de proteínas para avançar no conhecimento em busca de biomarcadores proteicos/enzimáticos da contaminação de mercúrio em amostras de tecido hepático de pirarucu (Arapaima gigas) coletados em áreas próximas do reservatório da Usina Hidrelétrica de JIRAU - Rio Madeira utilizando-se as seguintes estratégias metaloproteômicas: fracionamento do proteoma das amostras por 2D PAGE (eletroforese bidimensional); mapeamento do mercúrio nos spots proteicos por GFAAS (espectrometria de absorção atômica em forno de grafite); caracterização das proteínas associadas ao mercúrio por ESI- MS-MS (espectrometria de massas) e utilização de procedimentos de bioinformática que poderão contribuir no conhecimento dessas proteínas em níveis fisiológicos e funcionais, bem como suas vias metabólicas. Os resultados obtidos mostram que dos 105 spots proteicos obtidos, 18 apresentaram concentrações de Hg. Nestes 18 spots, foram caracterizadas 10 proteínas que interagiram com mercúrio: Cyb5a protein, Cystathionine beta-synthase a, Fatty acid binding protein 1-A, liver, GTP-binding nuclear protein Ran, Triosephosphate isomerase, 6-pyruvoyl-tetrahydropterin synthase/dimerization cofactor of hepatocyte nuclear factor 1 VIII alpha (TCF1), Novel protein similar to zebrafish hemoglobin alpha-adult 1 (Hbaa1), Hemoglobin subunit alpha, Superoxide dismutase, Perforin 1.8. Todas essas proteínas encontradas apresentam caracteristicas moleculares que favorecem a ligação a metais e podem ser usadas futuramente como biomarcadores de exposição ao mercúrio. Palavras chaves: Mercúrio em peixes amazônicos; Proteômica; Metalômica; Toxicidade; Pescado e Meio Ambiente. IX Elucidation of physiological and functional aspects of mercury-associated metal-binding protein in pirarucu (Arapaima gigas) ABSTRACT Over the recent decades scientific studies have pointed to the high concentrations of mercury found in soil, sediment, fish and humans in the Amazon. However there are still few studies on the mercury toxicity mechanisms at cellular level in ichthyofauna and riverine populations. The investigation of protein expression levels may be a key element in the elucidation of mercury exposure biomarkers in living beings, which would aid the mapping of environmental contamination by this toxic metal. The early screening of these mercury- associated proteins may indicate the risk of fish contamination at a given area and possibly prevent human exposure to mercury. Recent metalloproteomic studies in fish from the Amazon region developed by a group of researchers from Botucatu UNESP have achieved the fractionation and characterization of some mercury-associated proteins with biomarker characteristics. However they have not elucidated the physiological and functional aspects of these mercury-associated proteins and these animals adaptation mechanisms towards this metal exposure. This study aimed to increase the knowledge of possible protein biomarkers of mercury contamination in pirarucu (Arapaima gigas) collected in areas close to JIRAU - Rio Madeira Hydroelectric Power Plant reservoir. Liver tissue samples were analysed using a novel protein precipitation strategy (fractionation) and the following metalloproteomic strategies: 2D PAGE proteome fractionation of samples; mapping of mercury in protein spots by GFAAS (graphite furnace atomic absorption spectrometry); characterization of mercury-associated proteins by ESI-MS-MS (mass spectrometry) and bioinformatics procedures that may contribute to the knowledge of these proteins at physiological and functional levels, as well as their metabolic pathways. The results show that 18 of the 105 protein spots contained Hg (mercury), leading to the characterization of 10 mercury-interacting proteins: Cyb5a protein, Cystathionine beta- synthase A, Fatty acid binding protein 1-A, liver, GTP-binding nuclear protein Ran, Triosephosphate isomerase, 6-pyruvoyl-tetrahydropterin synthase/dimerization cofactor of hepatocyte nuclear factor 1 alpha (TCF1), Novel protein similar to zebrafish hemoglobin alpha-adult 1 (Hbaa1), Hemoglobin subunit alpha, Superoxide dismutase and Perforin 1.8. All X of these proteins have molecular characteristics that favor metal binding and have the potential to be used in the future as mercury exposure biomarkers. Keywords: Mercury in Amazonian fish; Proteomics; Metallomics; Toxicity; Fish and Environment. XI LISTA DE ILUSTRAÇÕES CAPÍTULO I Figura 1: Exemplar de Arapaima gigas (popularmente conhecido como pirarucu) ...... 18 Figura 2: Ciclo do mercúrio em uma bacia hidrográfica ................................................ 20 Figura 3. Níveis de respostas do sistema biológico mediante a exposição a poluentes (xenobióticos). ................................................................................................................ 23 CAPÍTULO II Figure 1 - Polyacrylamide gel obtained by 2D PAGE from the hepatic tissue pool of Arapaima gigas fish specie. ............................................................................................ 31 Figure 2 - Graphics representing of the functions: Biological Process (A),Celular Components (B) and Molecular Functions (C), generated by Blast2Go software. ........ 36 XII LISTA DE TABELAS CAPÍTULO II Table 1. Concentration of total mercury in the protein pellets of hepatic tissue with molecular mass less than and higher of 90 kDa of Arapaima gigas fish specie and DOLT-4 fish liver protein (Standard certified)……………………………………..….32 Table 2. Mercury concentration in protein spots with molecular mass less than 90 kDa of the hepatic tissue samples of Arapaima gigas fish specie………….…….…………32 Table 3. Results of the characterization of the protein spots by ESI-MS/MS of hepatic tissue samples Arapaima gigas fish specie……………………………………………..33 XIII LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS Hg Mercúrio GFAAS Espectrometria de absorção atômica em forno de grafite ESI-MS-MS Espectrometria de massas 2D-PAGE Eletroforese bidimensional XIV SUMÁRIO CAPÍTULO I Aspectos fisiológicos e funcionais de proteínas associadas ao mercúrio em pirarucu (Arapaima gigas) ............................................................................................................ 15 CONSIDERAÇÕES INICIAIS………………………………………………………...16 1.REVISÃO DE LITERATURA………………………………………………………17 1.1. Espécie estudada .............................................................................................. 17 1.1.1. Arapaima gigas ........................................................................................ 17 1.2. Problemática do Mercúrio ............................................................................... 18 1.3. Mercúrio nos rios amazônicos ......................................................................... 19 1.4. Proteômica e Metalômica ................................................................................ 21 1.5. Metaloproteômica ............................................................................................ 21 1.6. Biomarcadores ................................................................................................. 22 2.OBJETIVO GERAL………..………………………...…………………….……….. 23 REFERÊNCIAS……………...…………………………………..…………………… 24 CAPÍTULO II Physiological and functional aspects of metal-binding protein associated with mercury in theliver tissueofpirarucu (Arapaima gigas) from the Brazilian Amazon ................... 27 ABSTRACT…………………………………………….…………..………………… 28 1.Introduction ................................................................................................................. 29 2. Material and methods ................................................................................................. 30 2.1. Experimental animals, sample collection and processing ................................... 30 2.2. Protein extraction and precipitation ..................................................................... 30 2.3. Two-Dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2D-PAGE) ................... 30 2.4. Determination of total mercury ........................................................................... 30 2.5. Characterization of protein SPOTS by ESI-MS/MS ........................................... 31 3. Results and discussion ................................................................................................ 31 4. Conclusion.................................................................................................................. 37 References…………………………………………………………………………….. 37 CAPÍTULO III IMPLICAÇÕES ............................................................................................................. 40 15 CAPÍTULO I Elucidação de aspectos fisiológicos e funcionais de proteínas associadas ao mercúrio em pirarucu (Arapaima gigas) 16 ELUCIDAÇÃO DE ASPECTOS FISIOLÓGICOS E FUNCIONAIS DE PROTEÍNAS ASSOCIADAS AO MERCÚRIO EM PIRARUCU (Arapaima gigas) CONSIDERAÇÕES INICIAIS Na Amazônia as altas concentrações de mercúrio encontradas em solo, sedimentos, peixes e seres humanos têm sido reportadas em diversos trabalhos nas últimas décadas. No entanto, estudos relacionados à elucidação dos mecanismos de toxicidade do mercúrio na ictiofauna e nas populações ribeirinhas em nível celular, de fundamental importância socioambiental, ainda são poucos. O desenvolvimento de biomarcadores relacionados ao mapeamento e expressões de proteínas associadas ao mercúrio poderá indicar previamente possíveis riscos de contaminação do pescado e da exposição humana. Neste contexto, a metalômica, área científica proposta recentemente, apresenta-se como proposta inédita e inovadora na identificação de biomarcadores de mercúrio associados às proteínas. Estudos metaloproteômicos recentes com peixes da região amazônica, desenvolvidos por grupo de pesquisadores da UNESP de Botucatu, permitiram o fracionamento e caracterização de algumas proteínas associadas ao mercúrio com características de biomarcador. No entanto, os aspectos fisiológicos e funcionais dessas proteínas associadas ao mercúrio nos peixes amazônicos e os mecanismos de adaptação apresentados por estes animais frente à exposição ao metal ainda não foram elucidados. Assim, a proposta de trabalho busca utilizar uma nova estratégia de preciptação (fracionada) de proteínas para avançar no conhecimento em busca de biomarcadores proteicos/enzimáticos da contaminação de mercúrio em amostras de tecido hepático de pirarucu (Arapaima gigas) coletados em áreas próximas do reservatório da Usina Hidrelétrica de JIRAU - Rio Madeira utilizando-se as seguintes estratégias metaloproteômicas: fracionamento do proteoma das amostras por 2D-PAGE; mapeamento do mercúrio nos spots proteicos por GFAAS; caracterização das proteínas associadas ao mercúrio por ESI-MS-MS e utilização de procedimentos de bioinformática que poderão contribuir no conhecimento dessas proteínas em níveis fisiológicos e funcionais. 17 1. REVISÃO DE LITERATURA 1.1. Espécie estudada Os critérios de escolha da espécie, pirarucu (Arapaima gigas) para este estudo, levaram em consideração seu nivél trófico e sua importância para o estudo metaloproteômico com mercúrio, por ser uma espécie muito consumida pela população ribeirinha e bastante comercializada nos grandes centros comerciais do Brasil (MURRIETA, 2001). 1.1.1. Arapaima gigas O Arapaima gigas, popularmente conhecido como pirarucu ou arapaima (Figura 1), pertence a família Arapaimidae da ordem Osteoglossiformes (REIS, 2003). São animais piscívoros, ou seja, alimentam-se de outros peixes (SÁNCHES, 1969), podendo atingir até 3 metros de comprimento com aproximadamente 200kg, sendo considerado a maior espécie de peixe de escama do mundo em comprimento (ARANTES et al., 2010; NELSON, 2006). Seu nome tem origem tupi (pira=peixe e urucu=vermelho) e é atribuído devido sua intensa coloração em algumas partes do corpo, que variam sua intensidade de acordo com o sexo e período reprodutivo (VENTURIERI; BERNARDINO, 1999). O pirarucu é um peixe de água doce que habita as regiões tropicais da América do Sul, podendo ser encontrados no Peru, Bolívia, Guiana e Brasil (bacias hidrográficas do rio Amazonas e Tocantins-Araguaia) (SANTOS; FERREIRA; ZUANON, 2006). Vivem em várzeas, áreas que sofrem constante influência dos ciclos hidrológicos regionais (GOULDING; BARTHEM; FERREIRA, 2003) e possuem estratégias para se adaptarem a essas variações do nível d’água (JUNK, 1997). O animal em sua fase adulta consegue retirar oxigênio do ar atmosférico através de uma bexiga natatória muito vascularizada. A cada 20 a 30 minutos, o animal sobe à superficie para respirar. Mesmo sendo um animal que precisa buscar oxigênio fora d’água para manter sua respiração, o pirarucu não consegue viver por muito tempo fora do rio, a não ser que sejam constantemente irrigado com água (BARD; IMBIRIBA, 1986; CASTELLO, 2004). Da mesma forma, quando malhado na rede de pesca, se seu resgate for demorado, o animal não resiste a falta de oxigênio e morre. O pirarucu é uma espécie de peixe muito apreciada e com grande aceitação de mercado regional e nacional. É explorado na Amazônia desde o século XVIII, tendo sido na região uma das espécies mais comercializadas durante a segunda metade do século XIX. A partir da década de 1970 estudos citam a espécie como importante nos desembarques pesqueiros e 18 comercialização em mercados dos principais centros urbanos da Amazônia brasileira. Alguns destes estudos avaliaram os tamanhos dos pirarucus, com base em informações indiretas como por exemplo: dados de desembarque e comercialização, medidas de línguas e mantas, e indicaram que a espécie encontrou-se sobrexplorada em diversas partes da bacia amazônica. Uma das formas em se tentar conter a exploração descontrolada do pirarucu foi por meio da implementação de medidas restritivas adotadas pelo Instituto Brasileiro de Recursos Naturais Renováveis (IBAMA), estipulando tamanhos mínimos de captura, período de defeso reprodutivo, além de permitir as capturas apenas em áreas provenientes de manejo ou produzidas em cativeiro. No entanto, mesmo havendo medidas de proteção, a pesca do pirarucu está colocando em risco a sobrevivência da espécie, pois é praticada de forma predatória. A intensidade da pesca, determinada pelo alto valor comercial, tem estimulado a captura de exemplares jovens que ainda não atingiram a maturidade sexual, prejudicando assim os estoques naturais (GOULDING, 1980; SANTOS; SANTOS, 2005). Figura 1: Exemplar de Arapaima gigas (popularmente conhecido como pirarucu) Fonte: http://seafoodbrasil.com.br/especie/pirarucu-arapaima-gigas/ 1.2. Problemática do Mercúrio O rio Madeira é o principal afluente do rio Amazonas, banhando os estados de Rondônia e Amazonas, sendo rico em sedimentos e matéria dissolvida, com altas cargas de sólidos em suspensão (SIOLI, 1968; VAUCHEL et al., 2017). A instalação do complexo Hidrelétrico de Jirau (HE JIRAU), na região de Porto Velho-RO, poderá modificar a dinâmica do mercúrio nesse ambiente (BASTOS; LACERDA, 2004; BASTOS et al., 2006), por meio de processos de remobilização de espécies mercurais que até o momento apresentavam-se indisponíveis, podendo modificar sua forma química, sendo disponibilizados para a biota aquática (BASTOS; ALMEIDA; ZARA; ROCHA; SANTOS, 2009; PFEIFFER et al., 1993), e os 19 processos de metilação, com transformação da forma inorgânica para forma orgânica, o metilmercúrio (MeHg), poderiam ser favorecidos. Entre as décadas de 80 e 90 , toda a região amazônica passou por intensa corrida do ouro, causando preocupação com a contaminação de mercúrio na água e solo (OLAF, 1998; PFEIFFER; LACERDA, 1988), concomitante à esse problema, alguns estudos tem observado que altas concentrações de mercúrio são encontradas em latossolos de florestas, de origem natural e não antropogênica (ROULET; LUCOTTE, 1995), e que a disponibilização desse elemento para o corpo d'água estaria relacionado principalmente com processos de erosão do solo, decorrentes do desmatamento e práticas agrícolas, responsáveis pela perturbação do ciclo natural do mercúrio (ROULET et al., 1999). 1.3. Mercúrio nos rios amazônicos Podemos encontrar no ambiente o mercúrio em sua forma inorgânica (metáliaca) e na forma orgânica (metilmercúrio e dimetilmercúrio), sendo esta última muito mais tóxica aos organismos aquáticos por sua facilidade de absorção, elevada taxa de captação e baixa taxa de eliminação pelo organismo (BIDONE et al., 1997; PFEIFFER et al., 1993). Concentrações mais altas de mercúrio são frequentemente encontradas nas espécies que compõem o topo da cadeia alimentar. Os fatores que podem influenciar as variações dos níveis de concentração de mercúrio são: idade do peixe, taxa de crescimento individual, extensão da cadeia alimentar e fase de desenvolvimento do peixe, já que os hábitos alimentares podem variar de acordo com crescimento do mesmo (AULA; BRAUNSCHWEILER; MALIN, 1995; BARBOSA et al., 1995). A medida que aumenta o nível trófico, além de aumentar o acúmulo de mercúrio no indivíduo, a taxa de conversão em metilmercúrio também aumenta. Quanto ao acúmulo desse metal em peixes com maior longevidade pode se relacionar ao fato do mercúrio apresentar baixa taxa de eliminação pelo organismo, ou seja, quanto mais velho o organismo, maior o acumulo em seu sistema (DOLBEC et al., 2001; WASSERMAN; HACON; WASSERMAN, 2001). Com mais de 1300 espécies descritas, a Amazônia possui a ictiofauna mais rica do mundo; porém, a avaliação dessa diversidade de peixes ainda é de dificil mensuração, pois os estudos existentes encontram-se dispersos nos institutos de pesquisa (CÁUPER, 2006). Com tamanha riqueza pesqueira, pode se imaginar que o pescado é a principal fonte de proteína animal da população ribeirinha da Amazônia e quando contaminados com mercúrio, podem 20 apresentar riscos a saúde humana (BIDONE et al., 1997; PFEIFFER et al., 1993). Na corrente sanguínea esse metal fixa-se às proteínas e aos glóbulos vermelhos, tendo acesso a vários sistemas do organismo (SHENKER; GUO; SHAPIRO, 2000), podendo causar alterações na mitocôndria, indução de apoptose em céculas T (GUO et al., 1998), mutações em nível cromossômico e gênico podendo dar origem à cânceres e doenças hereditárias (QUEIROZ et al., 1999), além de transpor a barreira placentária, causando grandes danos à saúde do feto, inclusive ao sistema nervoso (SHENKER; GUO; SHAPIRO, 2000). Ao entrar nos ecossistemas aquáticos, o mercúrio de origem natural e/ou de origem antropogênica, participam de ciclos biogeoquímicos mediados por microorganismos, transformando-se quimicamente em mercúrio iônico ou mercúrio orgânico que pode ser bioacumulado e biomagnificado na cadeia trófica (Figura 2). Portanto, peixes predadores que estão no topo da cadeia trófica, ao acumularem altos níveis de mercúrio, tornam-se transportadores dessas espécies mercurais para seus consumidores como répteis, aves e seres humanos (LEBEL et al., 1998). Figura 2: Ciclo do mercúrio em uma bacia hidrográfica. As emissões de mercúrio podem ser transportadas por longas distâncias, principalmente em sua forma inorgânica gasosa [Hg (0)], 21 o elemento [Hg (II)] oxidado na atmosfera pode ser depositado por precipitação e pelo contato superficial (deposição seca). Bactérias anaeróbicas podem converter uma pequena porção do Hg (II) em metilmercúrio (MeHg), sendo então bioacumulado na cadeia alimentar aquática. Várias reações bióticas e abióticas interconvertem as diferentes formas de mercúrio (Hg), afetando a absorção, a deposição e a evasão de volta à atmosfera (ENGSTROM, 2007). 1.4. Proteômica e Metalômica A proteômica tem por objetivo analisar as proteínas sintetizadas nas células, tecidos e fluídos biológicos, bem como sua identificação e quantificação. Atua também na identificação da alteração de expressão dessas proteínas, na caracterização de modificações pós- traducionais, identificação de proteínas com interação mútua (interação proteína-proteína), entre outras diversas aplicações (BERANOVA-GIORGIANNI, 2003; VISPO, 2004). As pesquisas proteômicas tiveram início em meados dos anos 90, devido ao desenvolvimento simultâneo de três áreas: eletroforese bidimensional (2D-PAGE); espectrometria de massas para a análise de proteínas separadas por 2D-PAGE com alta sensibilidade e especificidade; e pesquisa em alta-escala do genoma, que gerou um grande número de sequências peptídicas que foram catalogadas em vários bancos de dados, tornando necessária a utilização de programas cada vez mais avançados de bioinformática para suas análises. A utilização dessas técnicas para obtenção de perfis de expressão de proteínas são ferramentas-chave para o estudo proteômico (MANSO et al., 2005). Dentro da proteômica temos a metalômica, vertente que busca informações sobre as interações e conexões funcionais entre os genes, metabólitos, proteínas e outras biomoléculas do organismo com espécies metálicas (GÓMEZ-ARIZA et al., 2004; MOUNICOU et al., 2009; SZPUNAR, 2005). Esta área de pesquisa busca esclarecer o papel biológico dos íons metálicos que ligam-se as biomoléculas e sua função no organismo, podendo ser utilizada como ferramenta valiosa no estudo de toxicologia ambiental, envolvendo metais tóxicos tais como o mercúrio (MOUNICOU; SZPUNAR; LOBINSKI, 2009). 1.5. Metaloproteômica As metaloproteínas são proteínas cuja função é modulada por um metal. A presença do metal é essencial para que ela desempenhe atividade catalítica, participe de reações redox em oxidoredutases, podendo também estabilizar estruturas terciárias ou quaternárias, etc. A determinação da função de metaloproteínas e características de seu sítio de ligação, podem ser 22 elucidadas por análise conjunta de sua sequência por técnicas de bioinformática e a identificação de seu metal intrínseco (GÓMEZ-ARIZA et al., 2004; MOUNICOU; SZPUNAR; LOBINSKI, 2009; SHI; CHANCE, 2011; SZPUNAR, 2005). As metaloproteínas fazem parte de um grupo onde existe a necessidade de um íon metálico incorporado as proteínas por meio de ligações específicas para exercerem suas funções biológicas. Se caracterizam pela alta afinidade da interação metal-proteína. Elas são diferentes das proteínas ligadas a metais, que fazem parte de um grupo onde as proteínas incorporam íons metálicos por meio de ligações não-específicas, se caracterizando pela fácil quebra dessa ligação devido a baixa afinidade de interação metal-proteína. No grupo que constituem uma fraca ligação proteína-metal, podemos encontrar os íons monovalentes como o potássio e o sódio, de moderada intensidade temos o cálcio e o magnésio, já dentre os metais que apresentam forte ligação encontramos com maior frequência os de transição como o cobalto, manganês, zinco, ferro, cobre e molibidênio, que estão ligados à maioria das metaloproteínas devido às suas propriedades como densidade, forças eletrostáticas, raio atômico pequeno e interação via eletromagnética (FÁBIO ARLINDO SILVA, 2009). 1.6. Biomarcadores Biomarcadores são parâmetros mensurados em fluidos corporais, células ou tecidos que indicam modificações bioquímicas ou celulares que prejudicam a homeostase de um organismo, como a presença de substâncias tóxicas ou de condições patológicas (GOLDSTEIN et al., 1987). No contexto de organismos aquáticos, a definição foi modificada por Adams (ADAMS, 1990), incluindo as respostas desses organismos, populações ou comunidades às mudanças no ambiente. As respostas dos organismos foram classificadas em três grupos de biomarcadores: exposição, efeito e susceptibilidade. Com a crescente identificação de novos biomarcadores, se tornou aparente que alguns biomarcadores podem pertencer a mais de um desses grupos. Numa perspectiva mais recente relacionada aos biomarcadores, um efeito resultante da exposição a agentes de estresse pode ser definido como um evento não-patogênico adaptativo ou como um evento funcional alterado mais sério, o que depende da toxicocinética e mecanismo de ação desses agentes. Assim, os biomarcadores de exposição e de efeito podem muitas vezes ser combinados em uma única classificação, com ocorrência de susceptibilidade em qualquer estágio (DECAPRIO, 1997). Normalmente, a ocorrência das perturbações manifesta-se inicialmente nos níveis mais baixos da organização biológica, antes de surgirem nos níveis mais altos (populações, 23 comunidades ou ecossistemas). A avaliação de efeitos adversos ou de estresse sinalizados por biomarcadores permite a observação dos mesmos ainda na fase inicial da perturbação (ADAMS, 1990). Nessa fase inicial, o estresse causa ativação do sistemas de defesa celular, como um modo de adaptação do organismo ao contaminante após a exposição. No entanto, caso a resposta de defesa seja falha, podem ser desencadeados danos em níveis mais altos (histológico ou tecidual). Quando a falha nesses processos ocorre em períodos críticos do desenvolvimento do organismo, podem ser afetadas sua reprodução ou mesmo sua sobrevivência, acarretando em mudanças populacionais e, possivelmente, nos níveis de comunidade da organização biológica (SCHLENK, 1999). Desse modo, o reconhecimento de biomarcadores em níveis hierárquicos mais baixos permite a identificação precoce do efeito, antes que seja propagado aos níveis mais altos (Figura 3) (BAYNE et al., 1985). Sinais imediatos (busca por biomarcadores) Molecular Subcelular (organela) Celular Tecido Sistêmico (órgão) Organismo População Comunidade EcossistemaEfeitos tardios Exposição ao Poluente Figura 3. Níveis de respostas do sistema biológico mediante a exposição a poluentes (xenobióticos). Adaptado de Bayne et al., 1985. 2. OBJETIVO GERAL Fracionar e analisar o proteoma do tecido hepático da espécie de peixe amazônico Arapaima gigas (pirarucu) para identificar metal binding protein de mercúrio e elucidar os seus aspectos fisiológicos e funcionais por meio de análises de bioinformática utilizando o software Blast2Go. O artigo foi publicado no periódico da Chemosphere 24 REFERÊNCIAS ADAMS, S. M. Status and use of bioindicators for evaluating effects of chronic stress on fish. American Fisheries Society Symposium, v. 8, p. 1–8, 1990. ARANTES, C. C.; CASTELLO, L.; STEWART, D. J.; CETRA, M.; QUEIROZ, H. L. Population density, growth and reproduction of arapaima in an Amazonian river‐floodplain. Ecology of Freshwater Fish, v. 19, n. 3, p. 455–465, 2010. AULA, I.; BRAUNSCHWEILER, H.; MALIN, I. The watershed flux of mercury examined with indicators in the Tucurui reservoir in Pará, Brazil. Science of the Total Environment, v. 175, p. 97–107, 1995. BAYNE, B. L.; BROWN, D. A.; BURNS, K.; DIXON, D. R.; IVANOVICI, A.; LIVINGSTONE, D. R. D.; LOWE, M.; MOORE, M. N.; STEBBING, A. R. D.; WIDDOWS, J. The Effects of Stress and Pollution on Marine Animals. Praeger Special Studies/Praeger Scientific. The Quarterly Review of Biology, v. 61, p. 136– 137, 1985. BARBOSA, A. C.; BOISCHIO, A. A.; EAST, G. A.; FERRARI, I.; GONÇALVES, A.; SILVA, P. R. M.; CRUZ, T. M. E. Mercury contamination in the Brazilian Amazon. Environmental and occupational aspects. Water, Air and Soil Pollution, v. 80, n. 1– 4, p. 109–121, 1995. BARD, J.; IMBIRIBA, E. P. Piscicultura do pirarucu, Arapaima gigas. Belém, EMBRAPA–CPATU, Circular Técnica, 52, p 17, 1986. BASTOS, W. R.; ALMEIDA, R.; ZARA, L. F.; ROCHA, J. C.; SANTOS, A. Programa de Monitoramento Hidrobiogeoquímico do AHE JIRAU – Bacia do Rio Madeira. Tractebel Energia, 2009. BASTOS, W. R.; LACERDA, L. D. A contaminação por Mercúrio na bacia do Rio Madeira: Uma breve revisão. Geochimica Brasiliensis, v. 18, p. 99–114, 2004. BASTOS, W. R.; Gomes, J, P, O.; Oliveira, R. C.; Almeida, R.; Elisabete, L, N.; Bernardi, J, V, E.; Lacerda, L, D.; Silveira, E, G.; Pfeiffer, W, C. Mercury in the environment and riverside population in the Madeira River Basin, Amazon, Brazil. Science of the Total Environment, v. 368, n. 1, p. 344–351, 2006. BERANOVA-GIORGIANNI, S. Proteome analysis by two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry: Strengths and limitations. Trends in Analytical Chemistry, v. 22, n. 5, p. 10–15, 2003. BIDONE, E. D.; CASTILHOS, Z. C.; SANTOS, T, J, S.; SOUZA, T, M, C.; LACERDA, L. D. Fish contamination and human exposure to mercury in Tartarugalzinho River, Amapá state, Northern Amazon, Brazil. A screening approach. Water, Air, and Soil Pollution, v. 97, n. 1–2, p. 9–15, 1997. CASTELLO, L. A Method to Count Pirarucu Arapaima gigas : Fishers, Assessment, and Management . North American Journal of Fisheries Management, v. 24, n. 2, p. 379–389, 2004. CÁUPER G. C. B. Ictiofauna In: Biodiversidade Amazônica – Flora Amazônica – Volume II. Centro Cultural dos Povos da Amazônia, 2006. DECAPRIO, A. P. Biomarkers: Coming of Age for Environmental Health and Risk Assessment. Environmental Science & Technology, v. 31, n. 7, p. 1837–1848, 1997. DOLBEC, J.; MERGLER, D.; LARRIBE, F.; ROULET, M.; LEBEL, J.; LUCOTTE M. Sequential analysis of hair mercury levels in relation to fish diet of an Amazonian population, Brazil. Science of the Total Environment, v. 271, n. 1–3, p. 87–97, 2001. ENGSTROM, D. R. Fish respond when the mercury rises. Proceedings of the National Academy of Sciences, v. 104, n. 42, p. 16394–16395, 2007. 25 SILVA, F. A. Selênio em tilápia do nilo utilizando eletroforese em gel e espectrometria atômica. 2009. Tese (Doutorado em Zootecnia) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Botucatu. REIS, R. E.; KULLANDER, S. O.; FERRARIS JR, C. J. (eds.). Check list of freshwater fishes of South and Central America. EDIPUCRS, Porto Alegre, p. 742, 2003. GOLDSTEIN, B.; GIBSON, J.; HENDERSON, R.; HOBBIE, J.; LANDRIGAN, P.; MATTISON, D.; PERERA, F.; PFITZER, E.; SILBERGELD, E.; WOGAN, G. Biological markers in environmental health research. By the Committee on Biological Markers of the National Research Council. Environmental health perspectives, v. 74, p. 3-9, 1987. doi:10.1289/ehp.74-1474499 GÓMEZ-ARIZA, J. L.; GARCÍA-BARRERA, T.; LORENZO, F.; BERNAL, V.; VILLEGAS, M. J.; OLIVEIRA, V. Use of mass spectrometry techniques for the characterization of metal bound to proteins (metallomics) in biological systems. Analytica Chimica Acta, v. 524, n. 1–2, p. 15–22, 2004. GOULDING, M.; BARTHEM, R.; FERREIRA, E. The Smithsonian atlas of the Amazon. Smithsonia Books, Washington and London, p. 253, 2003. GOULDING, M. The fishes and the forest: explorations in amazonian natural history. Berkeley, Los Angeles, University of California Press, p. 280, 1980. GUO, T. L.; MILLER, M. A.; SHAPIRO, I. M.; SHENKERA, B. J. Mercuric chloride induces apoptosis in human T lymphocytes: Evidence of mitochondrial dysfunction. Toxicology and Applied Pharmacology, v. 153, n. 2, p. 250–257, 1998. JUNK, W. J. General aspects of floodplain ecology with special reference to Amazonian floodplains. In: JUNK, W. J (ed.). The Central Amazon Floodplain: Ecology of a pulsing system, v. 126, p. 525, 1997. LEBEL, J.; MERGLER, D.; BRANCHES, F.; LUCOTTE, M.; AMORIM, M.; LARRIBE, F.; DOLBEC, J. Neurotoxic effects of low-level methylmercury contamination in the Amazonian basin. Environmental Research, v. 79, n. 1, p. 20–32, 1998. MALM, O. Gold mining as a source of mercury exposure in the Brazilian Amazon. Environmental Research, v. 77, p. 73–78, 1998. MANSO, M. A.; LÉONIL, J.; JAN, G.; GAGNAIRE, V. Application of proteomics to the characterisation of milk and dairy products. International Dairy Journal, v. 15, n. 6– 9, p. 845–855, 2005. MOUNICOU, S.; SZPUNAR, J.; LOBINSKI, R. Metallomics: The concept and methodology. Chemical Society Reviews, v. 38, n. 4, p. 1119–1138, 2009. MURRIETA, R. S. S. A MÍSTICA DO PIRARUCU : PESCA , ETHOS E PAISAGEM EM COMUNIDADES RURAIS DO BAIXO AMAZONAS. Horizontes Antropológicos, v. 7, n. 16, p. 113–130, 2001. http://dx.doi.org/10.1590/S0104-71832001000200006 NELSON, J. S. Fishes of the world. 4th Edition, John Wiley & Sons, Hoboken, v. 15, p. 601, 2006 PFEIFFER, W. C.; . LACERDA, L. D.; SALOMONS, W.; MALM,O. Environmental fate of mercury from gold mining in the Brazilian Amazon. Environmental Reviews, v. 1, n. 1, p. 26–37, 1993. https://doi.org/10.1139/a93-004 PFEIFFER, W. C.; LACERDA, L. D. Mercury inputs into the Amazon Region, Brazil. Environmental Technology Letters, v. 9, p. 325–330, 1988. QUEIROZ, M. L.; BINCOLETTO, C.; QUADROS, M. R.; CAPITANI, E. M. Presence of micronuclei in lymphocytes of mercury exposed workers. Immunopharmacology and Immunotoxicology, v. 21, n. 1, p. 141–150, 1999. ROULET, M.; LUCOTTE, M.; FARELLA, N.; SERIQUE, G.; COELHO, H.; PASSOS, C. J. S.; SILVA, E. J.; ANDRADE, P. S.; MERGLER, D.; GUIMARÃES, J. R. D.; AMORIM, M. Effects of recent human colonization on the presence of mercury in 26 Amazonian ecosystems. Water, Air, and Soil Pollution, v. 112, n. 3–4, p. 297–313, 1999. ROULET, M.; LUCOTTE, M. Geochemistry of mercury in pristine and flooded ferralitic soils of a tropical rain forest in French Guiana, South America. Water, Air, & Soil Pollution, v. 80, n. 1–4, p. 1079–1088, 1995. SÁNCHES, J. “El paiche” aspectos de sucesso e aproveitamento natural. Revista de Caza y Pesca (Lima, Peru), v. 10, p. 17–61, 1969. SANTOS, G. M.; FERREIRA, E. J. G.; ZUANON, J. A. S. Peixes comerciais de Manaus. Manaus: IBAMA/AM, ProVárzea, p. 144, 2006. SANTOS, G. M.; SANTOS, A. C. M. Sustentabilidade da pesca na Amazônia. Estudos Avançados, v. 19, n. 54, p. 165–182, 2005. SCHLENK, D. Necessity of Defining Biomarkers for Use in Ecological Risk Assessments. Marine Pollution Bulletin, v. 39, n. 1–12, p. 48–53, 1999. SHENKER, B. J.; GUO, T. L.; SHAPIRO, I. M. Mercury-induced apoptosis in human lymphoid cells: Evidence that the apoptotic pathway is mercurial species dependent. Environmental Research, v. 84, n. 2, p. 89–99, 2000. SHI, W.; CHANCE, M. R. Metalloproteomics: forward and reverse approaches in metalloprotein structural and functional characterization. Current Opinion in Chemical Biology, v. 15, n. 1, p. 144–148, 2011. SIOLI, H. Hydrochemistry and Geology in the Brazilian Amazon Region. Amazoniana, v. 3, p. 267–277, 1968. SZPUNAR, J. Advances in analytical methodology for bioinorganic speciation analysis: metallomics, metalloproteomics and heteroatom-tagged proteomics and metabolomics. Analyst, v. 130, n. 4, p. 442–465, 2005. VAUCHEL, P.; SANTINI, W.; GUYOT, J.L.; MOQUET, J. S.; MARTINEZ, J. M.; ESPINOZA, J. C.; BABY, P.; FUERTES, O.; NORIEGA, L. N.; PUITA, O.; SONDAG, F.; FRAIZY, P.; ARMIJOS, E.; COCHONNEAU, G.; TIMOUK, F.; OLIVEIRA, E.; FILIZOLA, N.; MOLINA, J.; RONCHAIL, J. A reassessment of the suspended sediment load in the Madeira River basin from the Andes of Peru and Bolivia to the Amazon River in Brazil, based on 10 years of data from the HYBAM monitoring programme. Journal of Hydrology, v. 553, p. 35–48, 2017. VENTURIERI, R.; BERNARDINO, G. Pirarucu, espécie ameaçada pode ser salva através do cultivo. Revista Panorama da Aqüicultura, v. 9, n. 53, p. 13–21, 1999. VISPO, N. S. Proteómica. In: Combinatoria Molecular. Cuba: Elfos Scientiae, p. 367-404, 2004. WASSERMAN, J. C.; HACON, S.; WASSERMAN, M. A. O Ciclo do mercúrio no Ambiente Amazônico. Rio de Janeiro: Revista Mundo e Vida, v. 2, p. 46–53, 2001. 27 CAPÍTULO II Physiological and functional aspects of metal-binding protein associated with mercury in theliver tissue of pirarucu (Arapaima gigas) from the Brazilian Amazon Este capítulo foi escrito de acordo com as normas do periódico Chemosphere no qual foi publicado. 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 CAPÍTULO III 40 IMPLICAÇÕES A metaloproteômica se apresenta como uma importante ferramenta de pesquisa em busca de biomarcadores moleculares de exposição ao mercúrio em peixes, sinalizando proteínas que interagem com este metal. A técnica utilizada de separação eletroforética bidimensional (2D-PAGE), se mostrou eficiente na busca por possíveis biomarcadores de exposição ao mercúrio, a padronização do protocolo se fez necessária devido a estrátegia de precipitação utilizada (fracionada) não ter sido desenvolvida até então para a espécie estudada (Arapaima gigas). O presente estudo trás contrubuições para a área, no entanto, apesar dos avanços que foram obtidos por meio deste trabalho, ainda será necessário mais estudos com as proteínas identificadas, caracterizar sua ligação ao mercúrio e entender o que esse fato pode causar nos organismos a curto e longo prazo, bem como estudar outras espécies de peixes expostos ao mercúrio para comparar os efeitos desse metal em diferentes organismos que tenham dietas variadas (onívoros, detritívoros e carnívoros). Estudos futuros que confrontem os resultados obtidos em diferentes espécies de peixes expostos ao mercúrio, serão de suma importância, bem como novos experimentos que possam ser realizados estudando mais a fundo as proteínas identificadas encontradas nesse trabalho que apresentaram associações entre concentração de mercúrio e proteínas, podendo ajudar na consolidação das mesmas como biomarcadores de exposição a este metal.