Pedido nacional de Invenção, Modelo de Utilidade, Certificado de Adição de Invenção e entrada na fase nacional do PCT 29409161709989792 21/05/2018 870180042529 17:47 Número do Processo: BR 10 2018 010323 7 Dados do Depositante (71) Depositante 1 de 1 Nome ou Razão Social: UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JULIO DE MESQUITA FILHO Tipo de Pessoa: Pessoa Jurídica CPF/CNPJ: 48031918000124 Nacionalidade: Brasileira Qualificação Jurídica: Instituição de Ensino e Pesquisa Endereço: Rua Quirino de Andrade, 215 Cidade: São Paulo Estado: SP CEP: 01049-010 País: Brasil Telefone: 11 56270217 Fax: 11 56270103 Email: auin@unesp.br Esta solicitação foi enviada pelo sistema Peticionamento Eletrônico em 21/05/2018 às 17:47, Petição 870180042529 Petição 870180042529, de 21/05/2018, pág. 1/32 Dados do Pedido Natureza Patente: 10 - Patente de Invenção (PI) Título da Invenção ou Modelo de Utilidade (54): PROCESSO DE OBTENÇÃO DE MEMBRANAS ESTÁVEIS A PARTIR DA FRAÇÃO INSOLÚVEL DE FRAGMENTOS DE TENDÃO FLEXOR DIGITAL BOVINO Resumo: É descrito um processo de obtenção de membranas estáveis a partir da fração insolúvel de fragmentos de tendão flexor digital bovino tratados em soluções acídicas e com pepsina, incluindo uma sequência de etapas e tempos de tratamento que se diferem daqueles do estado da técnica por não envolver reconstituição de fibras colágenas isoladas, diálise, reticulação ou liofilização das mesmas. 1Figura a publicar: Dados do Procurador Nome ou Razão Social: Sérgio Victor Mastrorocco Procurador: Numero OAB: 296946SP Numero API: 1705 CPF/CNPJ: 02990560823 Endereço: Rua Amaral Gama, 333 - Conjunto 164 - Santana Cidade: São Paulo Estado: SP CEP: 02018-001 Telefone: (11) 2639-7200 Fax: (11) 2973-5032 Email: sergio@mastrorocco.com.br Esta solicitação foi enviada pelo sistema Peticionamento Eletrônico em 21/05/2018 às 17:47, Petição 870180042529 Petição 870180042529, de 21/05/2018, pág. 2/32 Inventor 1 de 3 Nome: MARCELA ALDROVANI RODRIGUES CPF: 30263498875 Nacionalidade: Brasileira Qualificação Física: Biólogo, biomédico e afins Endereço: Rua Matias de Albuquerque, 1001, Jd. Maria Lúcia Cidade: São José do Rio Preto Estado: SP CEP: 15047-103 País: BRASIL Telefone: (11) 562 70217 Fax: (11) 562 70103 Email: auin@unesp.br Inventor 2 de 3 Nome: ALEXANDRE AUGUSTO FRANCHI DE BARROS SOBRINHO CPF: 05903531954 Nacionalidade: Brasileira Qualificação Física: Médico Endereço: Avenida José da Costa, 239, Ap. 62, Aparecida Cidade: Jaboticabal Estado: SP CEP: 14882-005 País: BRASIL Telefone: (11) 562 70217 Fax: (11) 562 70103 Email: auin@unesp.br Inventor 3 de 3 Dados do Inventor (72) Esta solicitação foi enviada pelo sistema Peticionamento Eletrônico em 21/05/2018 às 17:47, Petição 870180042529 Petição 870180042529, de 21/05/2018, pág. 3/32 Nome: JOSÉ LUIZ LAUS CPF: 04185653840 Nacionalidade: Brasileira Qualificação Física: Médico Endereço: Rua Dr. Mario de Assis Moura, 280, Ap. 33, Jardim Nova Aliança Cidade: Ribeirão Preto Estado: SP CEP: 14026-578 País: BRASIL Telefone: (11) 562 70217 Fax: (11) 562 70103 Email: auin@unesp.br NomeTipo Anexo Comprovante de pagamento de GRU 200 FUNDUNESP GRU DEPÓSITO PI 002 - 29409161709989792.pdf Procuração procuracao FUNDUNESP para o INPI.pdf Documento de Cessão 17AUIN014_Termo Cessao Inventores_assinado.pdf DECLARAÇÃO POSITIVA DE ACESSO Cadastro SISGEN Patente (17AUIN014).pdf Relatório Descritivo 17AUIN014 - relatorio.pdf Reivindicação 17AUIN014 - reivindicacoes.pdf Desenho 17AUIN014 - desenhos.pdf Resumo 17AUIN014 - resumo.pdf Documentos anexados Acesso ao Patrimônio Genético Declaração Positiva de Acesso - Declaro que o objeto do presente pedido de patente de invenção foi obtido em decorrência de acesso à amostra de componente do Patrimônio Genético Brasileiro, realizado a partir de 30 de junho de 2000, e que foram cumpridas as determinações da Lei 13.123 de 20 de maio de 2015, informando ainda: Número da Autorização de Acesso: AFA53C0 Data da Autorização de Acesso: 08/05/2018 Origem do material genético e do conhecimento tradicional associado, quando for o caso Bos taurus Esta solicitação foi enviada pelo sistema Peticionamento Eletrônico em 21/05/2018 às 17:47, Petição 870180042529 Petição 870180042529, de 21/05/2018, pág. 4/32 Declaro, sob as penas da lei, que todas as informações acima prestadas são completas e verdadeiras. Declaração de veracidade Esta solicitação foi enviada pelo sistema Peticionamento Eletrônico em 21/05/2018 às 17:47, Petição 870180042529 Petição 870180042529, de 21/05/2018, pág. 5/32 [bb.com.br] - Boleto gerado pelo sistema MPAG. 31/10/2017 10:26:43 INSTRUÇÕES: A data de vencimento não prevalece sobre o prazo legal. O pagamento deve ser efetuado antes do protocolo. Serviço: 200-Pedido nacional de Invenção, Modelo de Utilidade, Certificado de Adição de Invenção e entrada na fase nacional do PCT Clique aqui e pague este boleto através do Auto Atendimento Pessoa Física. Clique aqui e pague este boleto através do Auto Atendimento Pessoa Jurídica. 00190.00009 02940.916170 09989.792172 2 73580000007000 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JULIO DE MESQUITA FILHO CPF/CNPJ: 48031918000124 RUA QUIRINO DE ANDRADE 215, SAO PAULO -SP CEP:01049010 29409161709989792 29409161709989792 29/11/2017 70,00 INSTITUTO NACIONAL DA PROPRIEDADE INDUST CPF/CNPJ: 42.521.088.0001-37 PRACA MAUA 7 - 14 ANDAR - SALA 1415 , RIO DE JANEIRO - RJ CEP: 20081240 2234-9 / 333028-1 00190.00009 02940.916170 09989.792172 2 73580000007000 INSTITUTO NACIONAL DA PROPRIEDADE INDUST CPF/CNPJ: 42.521.088.0001-37 31/10/2017 29409161709989792 DS N 31/10/2017 29409161709989792 17 R$ A data de vencimento não prevalece sobre o prazo legal. O pagamento deve ser efetuado antes do protocolo. Serviço: 200-Pedido nacional de Invenção, Modelo de Utilidade, Certificado de Adição de Invenção e entrada na fase nacional do PCT UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JULIO DE MESQUITA FILHO CPF/CNPJ: 48031918000124 RUA QUIRINO DE ANDRADE 215, SAO PAULO-SP CEP:01049010 29/11/2017 2234-9 / 333028-1 29409161709989792 70,00 Petição 870180042529, de 21/05/2018, pág. 6/32 FUNDACAO PARA O DESENVOLVIMENTO DA UNESP Agência: 0239 Conta Corrente: 13-002549-6 DETALHE DO COMPROMISSO Convênio: 0033-0239-004900019792 Conta de Débito: 0239-000130027340 Tipo de Pagamento: BLQ Outros Código de Barras: 00190000090294091617009989792172273580000007000 No. compromisso banco: 1026378000300002 No. compromisso cliente: 989792/DS1 1011 Nome/Razão Social do Beneficiário Original: 000009853INPI - INST. NACIONAL Nome/Razão Social do Pagador Efetivo: FUNDACAO PARA O DESENVOLVIMENT CPF/CNPJ do Pagador Efetivo: 57.394.652/0001-75 Valor Nominal: 70,00 Desc./Abat.: 0,00 Juros: 0,00 Data de Vencimento: 27/11/2017 Data de Pagamento: 27/11/2017 Situação: Efetivado No. Lista de Débito: No. Protocolo: PGTFORNB27112017900124684 Autenticação: 11CBC4E6967F0409C92E5D3 Valor a Pagar: 70,00 Central de Atendimento Santander Empresarial 4004-2125 (Regiões Metropolitanas) SAC 0800 762 7777 0800 726 2125 (Demais Localidades) Ouvidoria 0800 726 0322 Internet Banking https://www.santandernetibe.com.br/Paginas/Compromissos/COMP... 1 de 1 28/11/2017 10:53 Petição 870180042529, de 21/05/2018, pág. 7/32 Petição 870180042529, de 21/05/2018, pág. 8/32 Petição 870180042529, de 21/05/2018, pág. 9/32 Comprovante de Cadastro de Acesso Cadastro nº AFA53C0 SISTEMA NACIONAL DE GESTÃO DO PATRIMÔNIO GENÉTICO E DO CONHECIMENTO TRADICIONAL ASSOCIADO CONSELHO DE GESTÃO DO PATRIMÔNIO GENÉTICO A atividade de acesso ao Patrimônio Genético, nos termos abaixo resumida, foi cadastrada no SisGen, em atendimento ao previsto na Lei nº 13.123/2015 e seus regulamentos. Número do cadastro: Usuário: CPF/CNPJ: Objeto do Acesso: AFA53C0 Alexandre Augusto Franchi de Barros Sobrinho 059.035.319-54 Patrimônio Genético Finalidade do Acesso: Desenvolvimento Tecnológico Ministério do Meio Ambiente Bos taurus Espécie Título da Atividade: PROCESSO DE OBTENÇÃO DE MEMBRANAS ESTÁVEIS A PARTIR DA FRAÇÃO INSOLÚVEL DE FRAGMENTOS DE TENDÃO FLEXOR DIGITAL BOVINO Alexandre Augusto Franchi de Barros Sobrinho UNESP Marcela Aldrovani Rodrigues UNESP José Luiz Laus UNESP Equipe Data do Cadastro: 08/05/2018 09:51:25 Situação do Cadastro: Concluído Conselho de Gestão do Patrimônio Genético Situação cadastral conforme consulta ao SisGen em 9:51 de 08/05/2018. Petição 870180042529, de 21/05/2018, pág. 10/32 1/15 PROCESSO DE OBTENÇÃO DE MEMBRANAS ESTÁVEIS A PARTIR DA FRAÇÃO INSOLÚVEL DE FRAGMENTOS DE TENDÃO FLEXOR DIGITAL BOVINO CAMPO DA INVENÇÃO [01] A presente patente de invenção descreve um processo de obtenção de membranas estáveis a partir da fração insolúvel de fragmentos de tendão flexor digital bovino tratados em soluções acídicas e com pepsina, incluindo uma sequência de etapas e tempos de tratamento que se diferem daqueles do estado da técnica por não envolver reconstituição de fibras colágenas isoladas, diálise, reticulação ou liofilização das mesmas. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [02] Colágenos são as proteínas mais abundantes do Reino Animal. Eles estão presentes em todos os vertebrados e também em alguns animais invertebrados como a esponja-do-mar, os corais, as lulas, as medusas e as anêmonas (Gelse, K., Pöschl, E. & Aigner, T. (2003). Collagens–structure, function, and biosynthesis. Advanced Drug Delivery Reviews, 55:1531-1546.; Jankangram, W., Chooluck, S. & Pomthong, B. (2016). Comparison of the properties of collagen extracted from dried jellyfish and dried squid. African Journal of Biotechnology, 15(16): 642-648.). Há, até o momento, 29 tipos de colágenos geneticamente distintos descritos em literatura. Todos eles são formados por cadeias de polipeptídeos (Gelse, K., Pöschl, E. & Aigner, T. (2003). Collagens–structure, function, and biosynthesis. Advanced Drug Delivery Reviews, 55:1531-1546.; Chung, H. J. & Uitto, J. (2010). Type VII Collagen: The Anchoring Fibril Protein at Fault in Dystrophic EpidermolysisBullosa. Dermatologic Clinics, 28(1): 93-105.). Três dos 29 tipos de colágenos são fibrilares, chamados de tipos I, II, Petição 870180042529, de 21/05/2018, pág. 11/32 2/15 III, e podem ser facilmente obtidos dos tecidos conjuntivos, representando importantes matérias prima para as indústrias farmacêutica, de biomateriais e alimentícias. [03] As fibrilas de colágeno são formadas por unidades designadas de tropocolágeno, arranjadas em tripla hélice estabilizada por pontes de hidrogênio, forças de van der Walls, interações hidrofóbicas e ligações eletrostáticas (Junqueira, L.C. & Carneiro, J. (2013). Histologia básica. Rio de Janeiro, Brasil.). Todos os colágenos fibrilares tem uma sequência repetitiva de aminoácidos, nomeada de Gly-X,Y, onde geralmente X é uma prolina e Y é uma hidroxiprolina. [04] O colágeno fibrilar tipo I é o polímero mais abundante em mamíferos (Gelse, K., Pöschl, E. & Aigner, T. (2003). Collagens– structure, function, and biosynthesis. Advanced Drug Delivery Reviews, 55:1531-1546). Ele está presente na pele, nos ossos, na dentina, em tendões, nos vasos sanguíneos e em muitas outras estruturas. Derivados industriais de colágeno tipo I fazem parte do dia-a-dia da população, pois gelatinas alimentares e mesmo alguns tipos de colas não passam de colágeno desnaturado. [05] Algumas propriedades tornam o colágeno tipo I atraente para aplicação industrial e uso humano (Gelse, K., Pöschl, E. & Aigner, T. (2003). Collagens–structure, function, and biosynthesis. Advanced Drug Delivery Reviews, 55:1531-1546; Hashim, P., Mohd Ridzwan, M.S., Bakar, J. & Mat Hashim, D. (2015). Collagen in food and beverage industries. International Food Research Journal, 22(1): 1-8.): [06] A) eles podem ser utilizados isoladamente, ou em combinação com outros polímeros, para confecção de bioprodutos; [07] B) o índice de alergenicidade do colágeno tipo I é baixo (2%) mesmo quando ele é heterólogo; Petição 870180042529, de 21/05/2018, pág. 12/32 3/15 [08] C) colágenos tipo I são biocompatíveis e biodegradáveis (ou reabsorvíveis) [09] D) colágenos tipo I formam fibras que resultam de processos espontâneos de auto-reconhecimento e de auto-associação molecular, os quais são preservados in vitro. [010] E) após extração de um tecido doador e solubilização in vitro, os colágenos tipo I são capazes de se organizarem estruturalmente, adquirindo formas e propriedades muito similares às que possuía in natura; [011] F) colágenos tipo I possuem alta resistência biomecânica à forças tensionais e além disso são viscoelásticos; [012] G) colágenos tipo I podem ser associar com outros elementos, como proteoglicanos, antibióticos, polissacarídeos, polímeros sintéticos, e outros; [013] H) preparações de colágenos tipo I formam matrizes ou membranas que induzem diferenciação e proliferação celular. [014] Relativamente às membranas de colágeno, elas são maleáveis, adaptáveis, de fácil manipulação e estabilização, com vantagens próprias do colágeno, com função hemostática, semipermeáveis e quimiotáxicas. Membranas de colágeno possuem diferentes aplicações odontológicas e clínico-cirúrgicas. Elas podem ser utilizadas em cirurgias corneais de ceratoplastias lamelares; como bandagem para o revestimento e a oclusão de feridas de pele; em cirurgias ortopédicas, como substitutos de periósteos; em implantodontia, para regeneração ósseo-guiada; entre outras. Também possuem aplicações em medicina regenerativa, para promoverem expansão ex vivo e o carreamento de células, originando assim os constructos de bioengenharia. Como outra aplicação importante, membranas de colágeno podem ser utilizadas Petição 870180042529, de 21/05/2018, pág. 13/32 4/15 como dispositivos de liberação lenta de fármacos. [015] Diferentes estruturas ricas em tecidos conjuntivos podem ser utilizadas como tecidos doadores (ou de extração) de colágeno para confecção de membranas ou de outros bioprodutos. As mais empregadas são a pele/derme, os ossos e os tendões de animais de produção, notadamente de porcos, de búfalos e de bovídeos e, mais recentemente, colágenos da derme e das nadadeiras de peixes também estão sendo utilizados pelas indústrias. [016] Quanto aos tendões bovinos, são estruturas complexas e representam uma das mais importantes fontes de colágeno fibrilar tipo I para as indústrias. No entanto, o tendão flexor digital bovino, subproduto da produção animal, quando exposto a protocolos convencionais para extração de colágenos, oferece pouca quantidade de material solúvel e alta quantidade de matéria insolúvel. O material insolúvel é designado de “fração colagênica ácido-insolúvel”, e muitas vezes é descartado ou então submetido a protocolos custosos de dissolução, que podem envolver tratamentos especiais, fervura do tendão e liofilização. Ainda, a solubilidade dos colágenos dos tendões depende da idade do animal e do tipo de criação, fatores que influenciam o estado de agregação e o número de ligações cruzadas das fibras colágenas. [017] A literatura técnica descreve diversos métodos para solubilização parcial ou total de tendões, visando a obtenção de colágenos tipo I para emprego na confecção de membranas ou de matrizes, cujas aplicações clínico-cirúrgicas são múltiplas. Em comum, muitos dos protocolos para solubilização de tendões envolvem tratamentos com soluções acídicas e com enzimas, métodos em “salting-out” e procedimentos em diálise, os quais originam géis compostos por colágenos denominados de Petição 870180042529, de 21/05/2018, pág. 14/32 5/15 “solúveis”. [018] O documento US1551163 descreve um método que inclui ciclos repetitivos de solubilização do tecido doador de colágeno em solução aquosa de ácido acético 0.5 M contendo pepsina, seguidos por precipitação com NaCl, até chegar ao produto final. [019] O documento EP0284789 descreve soluções aquosas de ácido acético, livres de pepsina, e com concentrações variando de 0,1 M até 5 M. [020] O documento PI9404595 descreve um processo para a preparação de colágeno com auxílio de solvente orgânico em meio ácido. [021] O documento PI9405043 descreve um processo de extração de colágeno de tecidos animais com auxílio de solvente orgânico em meio alcalino. [022] O documento PI9701570 descreve um preparado de fibras reconstituídas de colágeno, com grau elevado de auto-agregação, cristalinas e com arranjo helicoidal símile ao natural, para múltiplos fins e para formar com hidroxiapatita óssea um complexo para implantes ósseos. [023] O documento PCT/BR2010/000221 descreve um processo de fabricação de membrana colagênica biocompatível para aplicação médico-odontológica e produto obtido. [024] O documento US5028695 descreve um processo de fabricação de membranas de colágeno usadas para hemostasia, curativo de feridas e para implante. [025] O documento US4655980 descreve um processo de obtenção de membranas de colágeno para uso médico. [026] O documento US5837278 descreve uma membrana de colágeno Petição 870180042529, de 21/05/2018, pág. 15/32 6/15 reabsorvível para uso na regeneração de tecidos. [027] O documento US20030115677 descreve um método de fabricação de uma membrana de colágeno de pele porcina. [028] O documento US3131130 descreve um método de produção de colágeno solúvel. [029] O documento US3178301 descreve colágeno solubilizado e reconstituído de meio ácido. [030] A literatura patentária, independente de variações não críticas nas concentrações dos componentes usados para extração de colágeno, obtém colágeno solúvel. Todavia, nem todo colágeno exposto à extração acídica sofre solubilização. A solubilização depende das interações intermoleculares e do quantitativo de ligações cruzadas entre fibras colágenas, os quais diferem entre os tecidos conjuntivos. [031] No entanto, o estado da técnica não descreve nem sugere um processo de obtenção de membranas estáveis utilizando a fração insolúvel de fragmentos de tendão flexor digital bovino, incluindo uma sequência de etapas e tempos de tratamento que se diferem daqueles do estado da técnica por não envolver reconstituição de fibras colágenas isoladas, diálise, reticulação ou liofilização das mesmas. SUMÁRIO [032] O processo de obtenção de membranas estáveis a partir da fração insolúvel de fragmentos de tendão flexor digital bovino não envolve etapas complexas e de tecnologia sofisticada e apresenta baixo custo. [033] O processo de obtenção de membranas estáveis a partir da fração insolúvel de fragmentos de tendão flexor digital bovino provê um produto final (membrana) que apresenta resiliência, resistência biomecânica e biocompatibilidade. Petição 870180042529, de 21/05/2018, pág. 16/32 7/15 [034] O processo de obtenção de membranas estáveis a partir da fração insolúvel de fragmentos de tendão flexor digital bovino provê uma membrana com fibras colágenas supra-organizadas e com elevada cristalinidade (ordem molecular). [035] O processo de obtenção de membranas estáveis a partir da fração insolúvel de fragmentos de tendão flexor digital bovino provê membranas de colágeno para aplicações odontológicas e clínico- cirúrgicas; emprego como biomaterial destinado à bioengenharia tecidual; utilização como dispositivo para liberação lenta de fármacos. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [036] A figura 1 apresenta os gráficos com valores médios de ganho de peso (± desvios padrão) das membranas objeto da presente invenção. No gráfico A, é avaliado o intumescimento após imersão em PBS por 24 horas e no gráfico B o intumescimento após imersão em ácido acético 3%. [037] A figura 2 apresenta a micrografia de uma membrana avaliada in totum sob microscopia de luz polarizada. [038] A figura 3 apresenta os gráficos de linha representando mudanças temporais nos valores médios de refração (± desvios padrão), em dioptrias, das córneas utilizadas nos testes, evidenciando no gráfico A as córneas no grupo que não recebeu membrana (grupo SM) e no gráfico B as córneas no grupo que recebeu membrana (grupo CM). [039] A figura 4 apresenta os gráficos de linha representando mudanças temporais nos valores médios de astigmatismo (± desvios padrão), em dioptrias, das córneas utilizadas nos testes, evidenciando no gráfico A as córneas no grupo que não recebeu membrana (grupo SM) e no gráfico B as córneas no grupo que recebeu membrana (grupo Petição 870180042529, de 21/05/2018, pág. 17/32 8/15 CM). DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [040] O processo de obtenção de membranas estáveis a partir da fração insolúvel de fragmentos de tendão flexor digital bovino, objeto da presente patente de invenção, compreende uma primeira etapa de preparo dos tendões bovinos, incluindo a lavagem e o corte transversal em fragmentos de aproximadamente 5 cm x 5 cm, sendo as extremidades dos tendões desprezadas, pois se tratam de regiões que se inserem em extremidades ósseas e musculares e que, portanto, contêm considerável teor de moléculas não colagênicas. [041] Em uma segunda etapa, os fragmentos de tendões são imersos em hipoclorito de sódio 1%, por cerca de 1 hora, sob refrigeração em torno de 9oC. [042] Em seguida, em cada fragmento de tendão são feitas secções longitudinais profundas respeitando a direção dos crimps dos feixes colágenos que compõem a estrutura. [043] Os fragmentos de tendão são imersos em hidróxido de sódio 4M, em torno de 24 horas, sob refrigeração de 9oC, sendo lavados em água destilada gelada. [044] Em seguida, cada fragmento de tendão é imerso em uma solução aquosa de cloreto de cálcio 2 M, por cerca de 12 horas, sendo posteriormente imersos em água destilada gelada (3 imersões em águas destiladas diferentes, de 20 minutos cada). [045] Após lavagem em água, cada fragmento de tendão é imerso em solução aquosa de ácido clorídrico 1 M, sendo mantido por 24 horas, em temperatura ambiente de 25oC. Na sequência, cada fragmento é imerso em solução aquosa de ácido acético 0,5 M contendo 1% de pepsina, onde permanece por sete dias, em temperatura ambiente de Petição 870180042529, de 21/05/2018, pág. 18/32 9/15 25oC e, findo este período, acrescido à solução acídica cerca de 250 mL de solução de NaCl 10% (w/vol). [046] Esta solução é mantida em repouso por 20 dias à temperatura ambiente de 18oC, apresentando os fragmentos insolúveis de colágeno de tendão uma aparência esbranquiçada e maleável, com aspecto similar a um algodão umedecido. [047] Este material é peneirado em filtro de malha (0,59 mm), sendo os fragmentos insolúveis retidos submetidos à lavagem com solução salina 0,9% gelada (2 lavagens de 30 minutos) e colocados sob placas de vidro estéreis. Nesta etapa, devido à maleabilidade do material, o “cerne ou miolo” do fragmento insolúvel é denteado, com a utilização de uma tesoura, de forma a desfazer uma espécie de “nó” central que amarra os feixes de colágeno. Em seguida, os feixes de colágeno são manualmente puxados e distendidos como um leque aberto, adquirindo aspectos de membranas finas e semitransparentes. [048] Para armazenamento, as membranas são estendidas manualmente em uma base estéril, sendo em seguida congelada. [049] Para esterilização, a base de suporte das membranas pode ser submetida à radioesterização. [050] Foram conduzidos ensaios físico-químicos por meio dos testes de intumescimento e de porosidade, avaliações à microscopia de luz polarizada e por microscopia eletrônica de varredura e estudo clínico de viabilidade e de biocompatibilidade, que visaram caracterizar as membranas confeccionadas com colágeno tipo I extraído de tendão flexor digital bovino. [051] Teste de intumescimento [052] O teste de intumescimento visa a avaliar as características hidrofílicas das membranas e sua capacidade de absorção de fluídos. Petição 870180042529, de 21/05/2018, pág. 19/32 10/15 Fragmentos de membranas foram pesados e, individualmente, imersos em tampão fosfato salino (PBS), pH 7,4, ou em ácido acético 3% (Synth, São Paulo, Brasil). Todas as amostras foram incubadas em temperatura ambiente controlada (8°C), sendo retiradas para pesagem após 1h, 2h, 3h, 4h, 6h, 8h, 10h, 12h e 24h de imersão. Em cada momento, elas foram pesadas três vezes para eliminação de erros sistemáticos. Diferenças com P < 0,05 foram consideradas significativas. [053] Conforme apresentado na figura 1A, as membranas imersas em PBS ganharam peso nas primeiras 4 horas. Transcorridas 6 horas de imersão em PBS, as membranas perderam peso (P < 0,01 vs. peso basal, teste de Tukey). A perda de peso não foi contínua, havendo estabilização da absorção de fluídos após 8 horas de imersão (P > 0,05 vs. 6 horas de imersão, ANOVA para medidas repetidas). [054] Membranas imersas em ácido acético 3% apresentaram, em 24 horas, uma tendência ao ganho de peso. Todavia, a análise estatística revelou que o ganho de peso não foi significativo (P = 0,148 vs. basal, ANOVA para medidas repetidas), conforme apresentado na figura 1B. [055] Estudo de porosidade [056] A presença de porosidades nas membranas foi avaliada pelo método de deslocamento dos líquidos. Inicialmente, um volume fixo de etanol PA (Synth) foi calculado com base no peso seco de dez fragmentos do biomaterial. Ato contínuo, os fragmentos foram imersos em etanol por 48 horas e, então, pesados. A porosidade foi calculada com a fórmula: (V2-V1-V3) / (V2-V3) x 100; onde V1 é o peso inicial da amostra, V2 é o peso resultante da soma do álcool com a amostra submersa e V3 é o volume do etanol após remoção da amostra. [057] O valor médio da porosidade estimada pelo método do Petição 870180042529, de 21/05/2018, pág. 20/32 11/15 deslocamento de líquidos foi de 58,64 ± 16,18. [058] Estudo por microscopia de luz polarizada [059] Fibras colágenas das membranas foram estudadas por microscopia de luz polarizada quanto aos parâmetros de ordem molecular do colágeno. Para tal, as membranas foram distendidas sobre uma lâmina para histologia e avaliadas in totum, empregando-se microscópio Olympus BX-53P, munido com objetivas de 20x e de 40x, filtro monocromador passa banda em 546 nm e lâmpada de halogênio com iluminação de Köhler. Com vídeo-câmera, as imagens de microscopia foram transmitidas para um computador, onde foram digitalizadas e processadas. [060] As membranas construídas com colágeno tipo I extraído de tendão de boi apresentaram propriedades birrefringentes oriundas de ordem molecular, mostrando que o processo de extração e de confecção do produto final não ensejaram desnaturação da molécula de colágeno, que preservou suas propriedades líquido-cristalinas, conforme apresentado na figura 2. [061] Microscopia eletrônica de varredura [062] Após a fixação em glutaraldeído 3%, amostras foram tratadas com tetróxido de ósmio e desidratadas em soluções crescentes de etanol. Em seguida, foram secadas em câmara de dióxido de carbono (37°C e sob pressão de 1500 PSI), metalizadas em ouro e montadas com fita adesiva. As avaliações foram realizadas com acelerações de 15 a 20 Kv, em aumentos de 750 e 5000x. As imagens foram impressas em papel térmico e "escaneadas" em vídeo impressora. [063] A microscopia eletrônica de varredura revelou que as membranas eram formadas de fibras colágenas espessas com arranjo grosseiro no plano espacial. Petição 870180042529, de 21/05/2018, pág. 21/32 12/15 [064] Estudo clínico de viabilidade e biocompatibilidade [065] Foram avaliados os efeitos clínicos da implantação intra-estromal das membranas confeccionadas com colágeno tipo I extraído de tendão flexor digital bovino. [066] Os testes foram realizados atendendo as normas da Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) e autorização da Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA – proc. Nº 6.330/16, da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias (FCAV) da Universidade Estadual Paulista (UNESP), Campus de Jaboticabal). [067] Foram utilizados 36 coelhos (Oryctolagus cuniculus) da raça Nova Zelândia Branco, adultos, machos ou fêmeas, com peso médio de 3 kg. Os animais foram mantidos individualmente, em ambiente ventilado, em gaiolas apropriadas, limpas e higienizadas, com dieta à base de ração comercial e de água potável à vontade. Os animais foram avaliados à semiotécnica oftálmica balizada no teste lacrimal de Schirmer, na biomicroscopia com luz em fenda, na tonometria de aplanação, na oftalmoscopia binocular indireta e na prova do tingimento pela fluoresceína. Apenas os livres de alterações oculares e em aparente higidez sistêmica foram utilizados, fazendo uso apenas dos olhos direitos. [068] Os coelhos foram distribuídos em dois grupos, que foram anestesiados e submetidos à procedimento cirúrgico para confecção de um “bolso” no estroma corneal anterior, onde foi implantada uma membrana confeccionada com colágeno tipo I extraído de tendão flexor digital bovino (grupo CM, experimental) ou não foi implantada a membrana (grupo SM, controle negativo). [069] A anestesia foi induzida e mantida pela associação de xilazina (5mg/kg) e cetamina (20mg/kg). Os animais foram preparados para Petição 870180042529, de 21/05/2018, pág. 22/32 13/15 procedimento asséptico, em decúbito lateral esquerdo, a cabeça estabilizada sobre um vacuum pillow, e a região periorbital tricotomizada. Realizou-se a antissepsia empregando-se solução aquosa de iodopovidona 10% nas pálpebras, diluída na proporção 1:1, vol/vol. Empregou-se, em complementação à anestesia geral, colírio de tetracaína contendo 0,1% de fenilefrina (Alcon, São Paulo, Brasil). Realizou-se a antissepsia da córnea e da conjuntiva com solução de iodopovidona 10%, na diluição 1:50, vol/vol, em solução salina. Após isolamento do campo operatório, foi realizada uma blefarostase mecânica (Blefarostato de Barraquer, Steel inox, São Paulo, Brasil). Um “bolso” foi confeccionado no estroma, na região central da córnea (eixo visual). A incisão foi feita com bisturi calibrado de 300 um (profundidade do bolso) (Razor, Osaka, Japão), em olhos centralizados com anel de Fine-Thornton (Duckworth&Kent, Baldock, Inglaterra). Um bisturi angulado de 15 graus (Alcon) e um dissector de Martinez (Steel inox) foram utilizados para estender o plano de dissecção dentro do estroma corneal. Todos os procedimentos foram realizados pelo mesmo cirurgião. [070] Membranas foram implantadas no leito estromal do grupo CM. O “bolso” corneal não foi suturado após o procedimento. Todos os olhos foram protegidos com lente de contato corneoescleral Purevision 2 (Bausch & Lomb, Nova Iorque, EUA), com diâmetro de 14 mm. As lentes foram removidas no pós-operatório do dia 3. [071] Os animais receberam cloridrato de tramadol na dose de 4 mg/kg, pela via subcutânea, em intervalos regulares de 8 h, por cinco dias. Ademais, colírios a base de neomicina, polimixina B e dexametasona (Maxitrol®, Alcon) foram utilizados a cada 8 horas, até o momento da eutanásia. Petição 870180042529, de 21/05/2018, pág. 23/32 14/15 [072] Os animais foram avaliados com lâmpada em fenda e eventuais irregularidades na superfície ocular foram registradas. Realizou-se, também, avaliações clínicas (a cada 3 dias). As manifestações clínicas (blefarospasmo, hiperemia conjuntival, edema, secreção ocular e neovascularização) foram avaliadas (ausente ou presente) e classificadas em discreta, moderada e intensa. Sob contenção física delicada, a região central da córnea dos coelhos foi avaliada empregando-se Auto refrator Potec PRK-7000 (Daejeon, Coréia do Sul), calibrado em modo automático com auxílio de olho teste (dispositivo que acompanha o equipamento). Consideraram-se, para cada olho, em cada avaliação, a média calculada de cinco medidas consecutivas. A emetropia foi definida como sendo o erro refrativo entre -0,5 e +0,5 dioptrias (D). Diferenças com P < 0,05 foram consideradas significativas. [073] Nenhum olho operado, nos grupos CM ou SM, desenvolveu blefarospasmo, irregularidades na superfície corneal ou neovascularização. No terceiro dia de pós-operatório, todos os coelhos apresentaram hiperemia conjuntival, 66,6% apresentaram secreção e 11,1% tiveram edema corneal. No sexto dia de pós-operatório, 38,8% dos animais do grupo I apresentavam hiperemia, 11,1% apresentaram secreção e 11,1% tiveram edema. A partir do nono dia de pós- operatório, as manifestações clínicas arrefeceram e não mais foram observadas. [074] Os procedimentos cirúrgicos realizados na córnea dos animais do grupo SM não alteraram a refração (P = 0,479, ANOVA para medidas repetidas). Em contraste, os coelhos do grupo CM apresentaram mudanças significativas em refração do terceiro até o vigésimo dias de pós-operatório (P < 0,01 vs. basal, teste post hoc de Tukey). Petição 870180042529, de 21/05/2018, pág. 24/32 15/15 [075] Relativamente à curvatura, todas as córneas apresentaram astigmatismo. Os procedimentos executados nas córneas do grupo SM não ensejaram alterações nos valores de astigmatismo (P = 0,105). Em contraste, a implantação de membranas nas córneas do grupo CM suscitou aumento importante do astigmatismo, com redução significativa dos valores médios encontrados, em dioptrias (P < 0,01), conforme apresentado na figura 4. Petição 870180042529, de 21/05/2018, pág. 25/32 1/2 REIVIDICAÇÕES: 1. PROCESSO DE OBTENÇÃO DE MEMBRANAS ESTÁVEIS A PARTIR DA FRAÇÃO INSOLÚVEL DE FRAGMENTOS DE TENDÃO FLEXOR DIGITAL BOVINO caracterizado por compreender as etapas: a) lavagem e corte transversal dos tendões bovinos em fragmentos de aproximadamente 5 cm x 5 cm; b) imersão dos fragmentos de tendões bovinos em hipoclorito de sódio 1%, por cerca de 1 hora, sob refrigeração em torno de 9oC; c) secção longitudinal nos fragmentos de tendões bovinos, respeitando a direção dos crimps dos feixes colágenos; d) imersão dos fragmentos de tendão bovino em hidróxido de sódio 4M, em torno de 24 horas, sob refrigeração de 9oC; e) lavagem dos fragmentos de tendão bovino em água destilada gelada; f) imersão dos fragmentos de tendão bovino em solução aquosa de cloreto de cálcio 2 M, por cerca de 12 horas; g) imersão dos fragmentos de tendão bovino em água destilada gelada; h) imersão dos fragmentos de tendão bovino em solução aquosa de ácido clorídrico 1 M, sendo mantido por 24 horas, em temperatura ambiente de 25oC; i) imersão dos fragmentos de tendão bovino em solução aquosa de ácido acético 0,5 M contendo 1% de pepsina, por sete dias, em temperatura ambiente de 25oC e, findo este período, acrescido à solução acídica cerca de 250 mL de solução de NaCl 10% (w/vol), sendo mantido em repouso por 20 dias à Petição 870180042529, de 21/05/2018, pág. 26/32 2/2 temperatura ambiente de 18oC; j) separação dos fragmentos insolúveis em peneira e lavagem com solução salina 0,9% gelada; k) posicionamento dos fragmentos de tendão bovino sob placas de vidro estéreis e endentação do miolo do fragmento insolúvel para liberação dos feixes de colágeno que são puxados e distendidos. l) estender as membranas em uma base estéril; m) congelamento das membranas. 2. PROCESSO DE OBTENÇÃO DE MEMBRANAS ESTÁVEIS A PARTIR DA FRAÇÃO INSOLÚVEL DE FRAGMENTOS DE TENDÃO FLEXOR DIGITAL BOVINO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato base de suporte das membranas ser submetida à radioesterização. Petição 870180042529, de 21/05/2018, pág. 27/32 1/4 FIGURA 1 Petição 870180042529, de 21/05/2018, pág. 28/32 2/4 FIGURA 2 Petição 870180042529, de 21/05/2018, pág. 29/32 3/4 FIGURA 3 Petição 870180042529, de 21/05/2018, pág. 30/32 4/4 FIGURA 4 Petição 870180042529, de 21/05/2018, pág. 31/32 1/1 RESUMO PROCESSO DE OBTENÇÃO DE MEMBRANAS ESTÁVEIS A PARTIR DA FRAÇÃO INSOLÚVEL DE FRAGMENTOS DE TENDÃO FLEXOR DIGITAL BOVINO É descrito um processo de obtenção de membranas estáveis a partir da fração insolúvel de fragmentos de tendão flexor digital bovino tratados em soluções acídicas e com pepsina, incluindo uma sequência de etapas e tempos de tratamento que se diferem daqueles do estado da técnica por não envolver reconstituição de fibras colágenas isoladas, diálise, reticulação ou liofilização das mesmas. Petição 870180042529, de 21/05/2018, pág. 32/32 Peticionamento Eletrônico Formulário Comprovante de pagamento de GRU 200 Procuração Documento de Cessão DECLARAÇÃO POSITIVA DE ACESSO Relatório Descritivo Reivindicação Desenho Resumo 2018-05-21T17:47:51-0300 Brasil Documento Assinado - INPI