UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS CAMPUS DE ARARAQUARA ONTOGÊNESE DA SENSIBILIZAÇÃO CRUZADA ENTRE TESTOSTERONA E FEMPROPOREX CLEIDIANE QUITÉRIA DA CONCEIÇÃO ARARAQUARA – SP 2013 CLEIDIANE QUITÉRIA DA CONCEIÇÃO ONTOGÊNESE DA SENSIBILIZAÇÃO CRUZADA ENTRE TESTOSTERONA E FEMPROPOREX Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Curso de Graduação em Farmácia- Bioquímica da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara, da Universidade Estadual Paulista para obtenção do grau de Farmacêutica-Bioquímica. Orientadora: Profª. Drª. Cleópatra da Silva Planeta Co-orientadora: Msc Sheila Antonagi Engi ARARAQUARA 2013 “Há um tempo em que é preciso abandonar as roupas usadas, que já tem a forma do nosso corpo, e esquecer os nossos caminhos, que nos levam sempre aos mesmos lugares. É o tempo da travessia: e, se não ousarmos fazê-la, teremos ficado, para sempre, à margem de nós mesmos.” Fernando Teixeira de Andrade Agradecimentos Gostaria de agradecer, em primeiro lugar, a Deus, ao Mestre Jesus, Nossa Senhora Aparecida e ao meu Espírito de Luz Guardião, que sempre estiveram ao meu lado me guiando e me abençoando durante toda esta trajetória. À minha mãe, Zezé, meu pai, Gersão, e meu irmão, William, por todo carinho, apoio financeiro e emocional durante esses anos de faculdade à distância. Amo vocês! À minha orientadora Cléo, mulher incrível, guerreira, determinada e exemplo de sucesso. Nem mesmo o céu é o limite para ela e para os alunos que possuíram o privilégio de serem por ela orientados! À minha querida co-orientadora Sheila, pela paciência, dedicação, confiança, compreensão, e, acima de tudo, pela amizade. A todos os amigos do laboratório de Neuropsicofarmacologia, que sempre ajudaram a construir um ambiente muito divertido de se trabalhar! Aos professores do departamento, Ricardo, Francisco e Carlos, que sempre estiveram dispostos a ajudar no que fosse necessário. Um agradecimento mais que especial à Elisabete, à Rosana e à Tirene, pois sem o suporte delas todo esse trabalho seria impossível. Finalmente, gostaria de agradecer a todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para este trabalho. SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ....................................................................................... 7 1.1. Femproporex e Estimulantes Anfetamínicos .......................... 7 1.2. Esteroides Androgênicos Anabólicos ..................................... 9 1.3. Dependência ............................................................................... 14 2. JUSTIFICATIVA ..................................................................................... 20 3. OBJETIVOS ........................................................................................... 20 4. MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................... 21 1.4. Parecer ético ............................................................................... 21 1.5. Animais ....................................................................................... 21 1.6. Fármacos .................................................................................... 21 4.4. Avaliação da atividade locomotora ..................................................... 22 5. DELINEAMENTO EXPERIMENTAL ...................................................... 22 5.1 Locomoção induzida pela administração aguda de femproporex em ratos adolescentes e adultos pré-tratados repetidamente com testosterona .......................................................................................... 22 6. ANÁLISE ESTATÍSTICA ....................................................................... 24 7. RESULTADOS ....................................................................................... 24 7.1. Ratos adolescentes .................................................................... 24 7.2. Ratos adultos .............................................................................. 25 8. DISCUSSÃO .......................................................................................... 27 9. CONCLUSÃO ......................................................................................... 31 10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................... 33 11. DADOS FINAIS ..................................................................................... 47 7 1. INTRODUÇÃO 1.1. Femproporex e Estimulantes Anfetamínicos O abuso de substâncias psicoativas é considerado um problema de saúde pública mundial. A United Nations Office on Drugs and Crime (UNODC) relata que em 2011, entre 167 e 315 milhões de pessoas com idade entre 15 e 64 anos (de 3,6% a 6,9% da população mundial) usaram algum tipo de substância ilícita pelo menos uma vez no ano anterior ao levantamento (UNODC, 2013). Os estimulantes do tipo anfetamínicos (ETA) correspondem a um conjunto de moléculas psicoestimulantes, dentre as quais algumas são utilizadas na terapêutica para o tratamento de déficit de atenção, narcolepsia e obesidade (CHASIN e SILVA, 2003). Já como droga de abuso, os ETA estão em segundo lugar no ranking mundial de drogas ilícitas mais utilizadas, com cerca de 33,8 milhões de usuários (UNODC, 2013). No Brasil, a maior parte do consumo ilícito dos ETA está relacionada a estimulantes prescritos que são repassados para outras pessoas. (UNODC, 2013). Um estudo realizado nas 27 capitais brasileiras mostrou que a prevalência de universitários que realizam uso de risco de anfetaminas é de 3,7%, sendo que na faixa etária de 25 a 34 anos a prevalência chega a 5,5%. Já entre os alunos do ensino fundamental e médio de escolas públicas e privadas das 27 capitais brasileiras, 3,7% já fizeram uso de ETA ao menos uma vez na vida. (ANDRADE, DUARTE e OLIVEIRA, 2010). Uma série de inquéritos de consumo de drogas indica que a má prescrição de estimulantes é bastante frequente nas Américas, sobretudo no Brasil, onde o consumo nos anos de 2007 a 2009 mostrou-se bem acima da média global. No 8 período de 2006 a 2009, Bélgica e Brasil foram os dois principais países fabricantes de femproporex, ao redor de 99% da fabricação mundial da substância. Em 2009, o Brasil foi também o principal importador deste anorexígeno. Em 2010 só se fabricou femproporex no Brasil (INCB, 2012). Apesar da Atualização das Diretrizes para o Tratamento Farmacológico do Sobrepeso e da Obesidade (ABESO, 2010) ainda recomendar o uso de medicamentos como o femproporex, a anfepramona e o mazindol para o tratamento da obesidade, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) proibiu, em 2011, o uso de tais substâncias em todo o território brasileiro (BRASIL, 2011). A despeito disso, a venda ilegal desse tipo de medicamento, torna difícil o controle do uso desse e dos outros emagrecedores proscritos (FAGUNDES et al., 2012). Quimicamente, os ETA são derivados das feniletilaminas, que por sua vez são estruturalmente similares à adrenalina. Os fármacos derivados β- feniletilamínicos, como a anfepramona e o femproporex, aumentam a neurotransmissão noradrenérgica e dopaminérgica no sistema nervoso central e periférico. Assim, os efeitos psicoestimulantes dos ETA resultam do aumento extracelular das concentrações de dopamina em regiões límbicas do sistema nervoso central. (KOOB e BLOOM, 1988; KOOB, SANNA e BLOOM, 1998; WISE, 1998). Alguns psicoestimulantes, tais como a cocaína, aumentam a dopamina na fenda sináptica através da inibição de sua recaptação, que é realizada pelo transportador de dopamina da membrana plasmática do terminal pré-sinaptico (HEIKKILA, ORLANSKY e COHEN, 1975; HORN, 1990; AMARA e KUHAR, 1993; GIROS e CARON, 1993). A anfetamina possui ações mais complexas, porém, seu 9 efeito mais significativo é a indução do transporte reverso de dopamina por meio da ligação com as proteínas transportadoras de membrana. (SULZER et al., 1995; JONES et al., 1998). Embora estas monoaminas possam contribuir para as propriedades reforçadoras destas substâncias, o aumento de dopamina na fenda sináptica é o ponto crucial para o desenvolvimento das neuroadaptações responsáveis pelo desenvolvimento da dependência. (HYMAN, 1996) 1.2. Esteroides Androgênicos Anabólicos Os esteroides androgênicos anabólicos (EAAs) são uma família de hormônios que incluem o hormônio natural testosterona, juntamente com outros análogos sintéticos da testosterona (KANAYAMA et al., 2009a). Os EAAs sintéticos foram originalmente desenvolvidos na década de 1930 para tratar o hipogonadismo em homens e outros distúrbios endócrinos (BASARIA e DOBS, 2001; BASARIA, WAHLSTROM e DOBS, 2001; SHAHIDI, 2001). Os EAAs possuem um núcleo básico derivado da estrutura química do colesterol, o que lhes confere natureza lipídica (COERT et al., 1975; HOBBELEN et al., 1975). São hormônios sexuais masculinos e representam uma das classes de hormônios esteroides que são produzidos, principalmente, pelos testículos e, em menores proporções, pelas adrenais. (BIANCO e RABELO, 1999). Na maioria das células-alvo a testosterona atua através de seu metabólito ativo, a diidrotestosterona, produzida pela enzima 5-alfa-redutase. Tanto a testosterona quanto a diidrotestosterona modificam a transcrição de genes através de sua interação com receptores de membrana e intracelulares, e desta forma modulam vários sistemas fisiológicos, incluindo o sistema reprodutor, o sistema 10 nervoso central, a glândula pituitária anterior, o rim, o fígado, os músculos e o coração, entre outros (SHAHIDI, 2001, RANG et al., 2012). Apesar do grande número de moléculas sintetizadas, todos os EAAs apresentam propriedades androgênicas e anabólicas (KANAYAMA, HUDSON e POPE, 2010). Os efeitos androgênicos são responsáveis pelo crescimento do trato reprodutor masculino e desenvolvimento das características sexuais secundárias, enquanto que os efeitos anabólicos estimulam a fixação do nitrogênio e aumentam a síntese proteica (SHAHIDI, 2001). A atividade anabólica da testosterona e de seus derivados é manifestada primariamente em sua ação miotrófica, que resulta em aumento da massa muscular por aumentar a síntese proteica no músculo e por controlar os níveis de gordura corporal (KAM e YARROW, 2005). Os usos não-terapêuticos dos EAAs foram rapidamente disseminados. Nas últimas décadas, o uso ilícito dos EAAs tem ocorrido predominante em indivíduos de ambos os sexos, que administram tais substâncias para melhorar o desempenho atlético ou a imagem corporal (KOCHAKIAN e YESALIS, 2000; TRENTON e CURRIER, 2005; LLEWELLYN, 2007; KANAYAMA, HUDSON e POPE, 2008). Dessa maneira, há relatos de homens adultos que autoadministram EAAs em concentrações de 10 a 100 vezes maiores que as recomendadas para uso terapêutico (WU, 1997; DALY et al., 2001; PERRY et al., 2003; MATSUMOTO e BREMNER, 2004; TRENTON e CURRIER, 2005; LLEWELLYN, 2007; KANAYAMA, HUDSON e POPE, 2008). Ao longo dos últimos 30 anos, o uso ilícito de esteroides androgênicos se tornou um problema generalizado nos Estados Unidos e em vários países do mundo, incluindo o Brasil (BUCKLEY et al., 1988; YESALIS et al., 1993; 11 NILSSON, 1995; MELIA, PIPE e GREENBERG, 1996; HANDELSMAN e GUPTA, 1997; GALDURÓZ et al., 2005A; O'MALLEY et al., 2006; PALLESEN et al., 2006; RACHOŃ, POKRYWKA e SUCHECKA-RACHOŃ, 2006; MCCABE et al., 2007; WANJEK et al., 2007). A maioria dos usuários é composta por homens jovens (BAHRKE et al., 2000; YESALIS e BAHRKE, 2000). Em estudos com adolescentes e universitários dos Estados Unidos, a prevalência de uso de EAAs oscilou entre 1% e 11,1% (CASTILLO e COMSTOCK, 2007), mas é geralmente mais elevada entre os envolvidos em esportes de potência ou levantamento de peso - variando de 20% a mais de 50% nesses indivíduos (BEEL, MAYCOCK e MCLEAN, 1998; KANAYAMA et al., 2009a). Outro trabalho feito entre universitários de várias faculdades americanas mostrou que o uso de tabaco, maconha, cocaína, anfetaminas, sedativos, alucinógenos, opiáceos, inalantes e drogas sintéticas é maior entre os usuários de EAAs (MEILMAN et al., 1995). No Brasil, não se tem estimativa desse uso ilícito, mas sabe-se que o consumidor preferencial está entre 18 e 34 anos de idade e, em geral, é do sexo masculino (IRIART e ANDRADE, 2002; SILVA, 2002; SANTOS, 2006). No comércio brasileiro, os principais medicamentos à base dessas drogas utilizados com fins ilícitos são a testosterona nas formas de isocaproato de testosterona e ciprionato de testosterona, e a nandrolona nas formas de decanoato de nandrolona e fempropionato de nandrolona (IRIART e ANDRADE, 2002; SILVA, 2002; SANTOS, 2006). Apesar da crescente utilização abusiva com sérias consequências, ainda são poucos os estudos epidemiológicos que comprovem a incidência e prevalência do uso de EAAs no Brasil (IRIART e ANDRADE, 2002). 12 Estudos demonstram que os EAAs estão associados a diversos efeitos neuropsiquiátricos (UZYCH, 1992; KANAYAMA, POPE, et al., 2003; KANAYAMA, HUDSON e POPE, 2008). Estudos mais recentes demonstram que os EAAs podem causar síndrome de dependência e abstinência com vários aspectos comuns a outras substâncias psicoativas, tais como a cocaína e a anfetamina. (KANAYAMA et al., 2010; POPE et al., 2010). Relatos individuais de dependência aos EAAs começaram a aparecer no final da década de 1980, onde foram descritos casos de indivíduos que realizavam uso crônico e abusivo dessas substâncias, a despeito de seus efeitos adversos (TENNANT, BLACK e VOY, 1988; BROWER, BLOW, BERESFORD, et al., 1989; BROWER, BLOW, ELIOPULOS, et al., 1989; BROWER et al., 1990). A literatura mostra que os EAAs possuem semelhanças e diferenças em relação às drogas de abuso clássicas, tais como a cocaína e a anfetamina. Assim, como semelhanças, podemos citar a presença de síndrome de abstinência com a descontinuidade do uso, o reforço positivo em modelos animais de autoadministração, o uso continuado apesar dos efeitos adversos, padrões de comportamento desajustados e abuso concomitante com outras substâncias. (DURANT et al., 1993; MIDDLEMAN et al., 1995; KANAYAMA, COHANE et al., 2003; KANAYAMA, POPE et al., 2003; O'MALLEY et al., 2006; KANAYAMA, HUDSON e POPE, 2008; KANAYAMA et al., 2009b) Quanto às diferenças em relação às drogas de abuso clássicas, alguns mecanismos foram propostos para tentar explicar a dependência aos EAAs. Uma das hipóteses propostas é que a dependência aos EAA está relacionada aos seus efeitos genômicos ao ligarem-se ao receptor androgênico de membrana e/ou intracelular. Dessa maneira, atuariam como fatores de transcrição que aumentam 13 a produção de RNA mensageiro, que por sua vez codifica uma variedade de proteínas estruturais e enzimáticas (LI e AL-AZZAWI, 2009). Essas proteínas possuem ações anabólicas (construção muscular) e androgênicas (masculinização). Uma vez que o uso é iniciado, alguns usuários com distúrbios patológicos em relação à aparência física, como, por exemplo, a vigorexia, podem continuar a usar os EAAs em doses crescentes e por períodos longos, contribuindo assim para a dependência (CAMARGO et al., 2008; KANAYAMA et al., 2010; KANAYAMA, HUDSON e POPE, 2010). Outro mecanismo conhecido é de que os efeitos androgênicos dos EAAs podem causar, a longo prazo, a supressão do eixo hipotalâmico-pituitário-gonadal, o que pode resultar em hipogonadismo, que persiste por longos períodos mesmo após a retirada da droga. O hipogonadismo, combinado a outros fatores neuroendócrinos, pode levar a síndrome de abstinência, que pode ser mediada por uma série de sistemas neurotransmissores (KASHKIN e KLEBER, 1989; HOCHBERG, PACAK e CHROUSOS, 2003; WOOD, 2008). A fim de minimizar tais efeitos adversos, o usuário crônico de EAA pode retomar o uso dessas substâncias após sua retirada, embora isso ainda seja pouco documentado (KANAYAMA et al., 2009a; SCALLY e TAN, 2009; TAN E SCALLY, 2009). Finalmente, os EAAs podem também ter efeitos diretos no sistema de recompensa (FRYE, 2007). Estudos em animais sugerem que esse mecanismo é biologicamente similar aos mecanismos de dependência de drogas clássicas, embora isso ocorra de forma mais lenta e gradual (WOOD, 2008). Durante os últimos anos, ocorreu um aumento relevante do interesse na compreensão da relação entre o uso de EAAs e outras substâncias psicoativas. 14 Alguns estudos relataram que o uso de EAAs está positivamente associado à utilização de tabaco, álcool e drogas ilícitas (DURANT et al., 1993; DURANT, ESCOBEDO e HEATH, 1995; KINDLUNDH et al., 1999). Também como resultado da preocupação com a imagem corporal, os usuários de EAAs abusam de uma série de substâncias adicionais para ganhar massa muscular, perder gordura, ou modificar a aparência do corpo, o que inclui o uso de estimulantes e anorexígenos, tais como anfetamínicos, efedrina e pseudoefedrina. (KANAYAMA, HUDSON e POPE, 2008). 1.3. Dependência Atualmente, a dependência a substâncias psicoativas é caracterizada como um fenômeno comportamental complexo com causas e consequências decorrentes de vários fatores que incluem desde mecanismos moleculares até aspectos sociais. A décima edição da classificação internacional de doenças (ICD10) define síndrome de dependência como um conjunto de fenômenos fisiológicos, comportamentais e cognitivos no qual o uso de uma substância adquire prioridade na vida do indivíduo. Além disso, define–se como característica central da dependência o desejo forte e/ou irresistível de consumir a substância psicoativa (WHO, 2011). Nos primeiros estudos sistemáticos com o objetivo de compreender a farmacodependência, predominaram as investigações das consequências aversivas decorrentes da interrupção do uso das drogas, quadro denominado de síndrome de abstinência (SHARPE, WEINHOLD e JAFFE, 1989). A síndrome de abstinência é um conjunto de sinais e sintomas, geralmente opostos aos efeitos 15 agudos das drogas, que promovem desconforto intenso ao indivíduo. Assim, foi proposto que esses indivíduos manteriam o uso da droga para evitar o desconforto da retirada. Dessa forma, a substância atuaria como um reforçador negativo (DACKIS e O'BRIEN, 2001). Porém, a teoria do reforço negativo apresenta algumas limitações: o tratamento da síndrome de abstinência é pouco eficaz para tratar dependência; muitos fármacos utilizados na terapêutica (antidepressivos e antipsicóticos, por exemplo) produzem síndrome de abstinência, porém não induzem o uso compulsivo. Além disso, o início do uso das drogas de abuso acontece na ausência de síndrome de abstinência (WISE e BOZARTH, 1987; SHARPE, WEINHOLD e JAFFE, 1989; DACKIS e O'BRIEN, 2001). Outro ponto importante é o fato de que todas as substâncias psicoativas que induzem dependência são reforçadores positivos e promovem sensibilização comportamental (WISE e BOZARTH, 1987; ROBINSON e BERRIDGE, 1993; WISE, 1998). Wise e Bozarth (1987) sugerem que o efeito reforçador positivo das drogas é decorrente da ativação de um substrato neurobiológico comum - o sistema dopaminérgico mesocorticolímbico. Os principais componentes do circuito do reforço são a área tegmental ventral (VTA) e suas projeções para regiões do sistema límbico ( WISE e BOZARTH, 1987; KOOB e LE MOAL, 2001). Os estados afetivos de prazer proporcionados pelas substâncias psicoativas podem explicar a experimentação e o uso ocasional. Entretanto, não explicam a principal característica que define a farmacodependência, ou seja, a perda do controle do uso da droga e seu uso a despeito das consequências adversas (DACKIS e O'BRIEN, 2001; WHO, 2004). 16 Robinson e Berridge (1993) propuseram que o uso compulsivo das substâncias psicoativas de abuso resultaria de processos neuroadaptativos no sistema mesocorticolímbico promovidos pelo uso repetido das mesmas. Essas alterações expressam-se como tolerância ou sensibilização comportamental (ROBINSON e BERRIDGE, 1993). A tolerância resulta de adaptações de vias neurais que medeiam efeitos específicos da droga e dão origem à síndrome de abstinência na sua retirada. (DACKIS e O'BRIEN, 2001). Entretanto, a tolerância e a síndrome de abstinência são específicas para cada classe de droga e, como relatado acima, elas não subsidiam as características que definem a dependência, ou seja, a perda do controle e o uso compulsivo. Segundo a teoria da sensibilização, ao invés de mediar apenas a sensação subjetiva de prazer, o sistema dopaminérgico mesolímbico regularia o impulso motivacional e a atenção a estímulos salientes. Dessa maneira, com o uso repetido, a droga e os estímulos associados a ela tornam-se progressivamente mais atrativos desenvolvendo dessa forma um desejo obsessivo (‘fissura’) pela droga que é capaz de controlar o comportamento. O desenvolvimento do desejo obsessivo pela droga resulta da sensibilização de vias dopaminérgicas mesolímbicas envolvidas com o incentivo motivacional e recompensa (ROBINSON e BERRIDGE, 1993). Devido à dificuldade metodológica e aspectos éticos a maioria dos estudos sobre os aspectos comportamentais e neuroadaptativos relacionados à dependência advêm de observações em modelos animais. Em modelos animais a sensibilização comportamental caracteriza-se pelo aumento gradual e progressivo 17 da atividade locomotora após a administração repetida da substância psicoativa de abuso (ROBINSON e BECKER, 1986). O aumento da atividade locomotora observado na sensibilização comportamental decorre de adaptações neuroquímicas e moleculares do sistema dopaminérgico mesolímbico homólogas àquelas responsáveis pela transição do uso controlado para o uso compulsivo das substâncias psicoativas (COVINGTON e MICZEK, 2001; NESTLER, 2001; ROBINSON e BERRIDGE, 2001). A sensibilização comportamental foi descrita para a cocaína, anfetamina, etanol, morfina, nicotina, delta-9-THC e heroína (ROBINSON e BECKER, 1986; KALIVAS e DUFFY, 1987; MISERENDINO e NESTLER, 1995; CADONI, SOLINAS e DI CHIARA, 2000; MARIN e PLANETA, 2004; CRUZ, DELUCIA e PLANETA, 2005; LENOIR et al., 2007). Muitos fatores podem aumentar a vulnerabilidade do desenvolvimento da dependência aos psicoestimulantes, como por exemplo, o estágio de desenvolvimento. Ontogênese (também chamada ontogenia ou morfogênese) é o estudo da origem e do desenvolvimento de um organismo a partir do óvulo fecundado até chegar à forma madura. Em determinado período de tempo, pode cobrir o estudo da vida de um organismo (WAKE, 1978). Pesquisas recentes têm enfatizado que há um risco maior de desenvolvimento de dependência associado ao período de adolescência (ANTHONY e PETRONIS, 1995; BRESLAU e PETERSON, 1996). Uma das justificativas é que a adolescência é um período ontogênico único, que apresenta processos contínuos de plasticidade neural, que ocorrem por meio de processos 18 anatômicos, neuroquímicos e fisiológicos (TEICHER, ANDERSEN e GLOD, 1997). No entanto, muito pouco é conhecido a respeito dos efeitos e consequências que a exposição a agentes psicoativos podem ter durante esse estágio de desenvolvimento (LAVIOLA et al., 1999; SPEAR, 2000). Além disso, foi demonstrado que o uso prévio ou concomitante de outras substâncias pode aumentar a vulnerabilidade ao abuso e dependência de drogas (AKIMOTO et al., 1990; CUNNINGHAM e KELLEY, 1992; DAFNY e YANG, 2006). Estudos indicam que o pré-tratamento de ratos com cocaína resulta em sensibilização cruzada à anfetamina, provocando aumento na locomoção e efeitos reforçadores na autoadministração (PIERCE e KALIVAS, 1995; BONATE, SWANN e SILVERMAN, 1996; PIERCE e KALIVAS, 1997A; B; LIU, MORGAN e ROBERTS, 2007) Da mesma maneira, Yang et al (2003) observaram que ratos Sprague-Dawley adolescentes e adultos pré-tratados cronicamente com metilfenidato, um psicoestimulante usado no tratamento do déficit de atenção, apresentaram sensibilização cruzada à anfetamina (YANG, SWANN e DAFNY, 2003). Em camundongos fêmeas, o pré-tratamento com anfetamina ou cafeína resultou em sensibilização cruzada à nicotina (CELIK, UZBAY e KARAKAS, 2006). Estudos pré-clínicos demonstram a interação entre psicoestimulantes e testosterona. Por exemplo, Minerly et al. (2010) mostraram que ratos adolescentes (dia pós-natal 30) que receberam uma injeção de testosterona (5 ou 10 mg/kg) e após 45 minutos receberam injeção aguda de cocaína (20 mg/kg) apresentaram aumento na resposta locomotora induzida pela cocaína quando comparados aos animais que não foram pré-tratados com este hormônio (MINERLY et al., 2010). Em outro trabalho, realizaram-se dois experimentos com ratos machos Long- 19 Evans com 90 dias de idade, para investigar os efeitos dos EAAs nos circuitos de recompensa do sistema nervoso central, utilizando eletrodos implantados na lateral do hipotálamo desses animais. No primeiro, observou-se que o tratamento repetido por duas semanas com metandrostenolona (1mg/kg, subcutânea) não resultou em mudanças significativas nas taxas de recompensa cerebral durante a autoestimulação. No segundo experimento, o tratamento repetido por 15 dias com um coquetel de EAA contendo sais de testosterona (2 mg/kg), nandrolona (2 mg/kg) e boldenona (1 mg/kg) tampouco alterou a taxa de recompensa cerebral, mas produziu uma pequena, porém significativa mudança no número de pressionamentos da barra. Além do tratamento com o coquetel de EAA, nesse segundo experimento, os ratos receberam uma injeção de anfetamina antes e depois do tratamento de 15 dias com o coquetel de EAA. O número de respostas nos animais que receberam o pré-tratamento com o coquetel foi significativamente maior. Embora pareça não alterar as propriedades de recompensa durante a estimulação cerebral com eletrodos, os EAAs podem influenciar a sensibilidade dos sistemas de recompensa cerebral, tornando-os mais suscetíveis à ação da anfetamina (CLARK, LINDENFELD e GIBBONS, 1996). A despeito da importância do uso combinado de EAAs e ETAs, há poucos trabalhos que descrevem o efeito da administração crônica de testosterona sobre as respostas comportamentais aos ETAs em ratos adultos e adolescentes. Desta forma, uma questão que deve ser analisada é se o uso crônico de testosterona poderia promover sensibilização cruzada com derivados anfetamínicos em modelos animais de adolescência , tornando os animais mais susceptíveis ao desenvolvimento da dependência a esse tipo de psicoestimulante. De fato, 20 resultados anteriores do nosso laboratório demonstram que o pré-tratamento de animais adultos (DPN 60) e adolescentes (DPN 28) com testosterona (10 mg/kg) aumenta o efeito estimulante da cocaína (10 mg/kg) sobre a atividade locomotora, além de causar sensibilização cruzada em ratos adolescentes, sugerindo que possa haver sensibilização relacionada também com outras drogas estimulantes (ENGI, 2012) 2. JUSTIFICATIVA O abuso de drogas tem alcançado grandes proporções nos últimos anos, e atualmente é considerado um problema de saúde pública mundial. O uso de estimulantes anfetamínicos e dos EAAs tem aumentado no Brasil, sendo comum observar entre adultos e adolescentes o uso concomitante dessas substâncias. Estudos com modelos animais de autoadministração já demonstraram o efeito reforçador positivo dos EAAs com outras drogas de abuso. Sendo assim, é importante avaliar se o uso prévio crônico de testosterona e derivados anfetamínicos, tal como o femproporex, poderia promover sensibilização comportamental a esse ETA em animais adultos e adolescentes. 3. OBJETIVOS Investigar a sensibilização cruzada entre exposição repetida à testosterona e exposição aguda ao estimulante anfetamínico femproporex, em ratos adolescentes e adultos. 21 4. MATERIAIS E MÉTODOS 4.1. Parecer ético O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Ética para Uso de Animais da Faculdade de Ciências Farmacêuticas – UNESP (CEUA-15/2010) e os experimentos foram conduzidos seguindo os princípios do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal – (COBEA). 4.2. Animais Foram utilizados ratos Wistar machos adolescentes (DPN 28), provenientes do Biotério Central da Universidade Estadual Paulista – UNESP de Botucatu. Os animais foram transferidos para o biotério do laboratório de Farmacologia do Departamento de Princípios Ativos Naturais e Toxicologia do Campus de Araraquara - UNESP sete dias antes do início dos experimentos e foram mantidos em condições controladas de temperatura (23  2°C) e luz (ciclo 12/12 horas, luzes apagadas às 19 h), com livre acesso a alimento e água. Em ratos, a adolescência é definida como o período ao redor da maturação sexual, ocorrendo aproximadamente entre os dias pós-natal (DPN) 28 e 42 (SPEAR e BRAKE, 1983). 4.3. Fármacos - Testosterona (Pharma Nostra ®) dissolvida em óleo de amêndoas. - Femproporex (Merck®), dissolvida em solução salina 0,9%. 22 4.4. Avaliação da atividade locomotora Foi utilizada a caixa de medida automática da atividade locomotora (Opto – Varimex, Columbus Instruments),, com medidas de 45,1 x 8 x 44,1 cm (largura x altura x comprimento). Esta caixa possui 10 emissores de luz infravermelha, distantes 2,5 cm entre si e a 3,0 cm do piso da caixa. Cada unidade de locomoção corresponde à interrupção de um feixe de luz (Figura 1). Figura 1 – Caixa de registro automático da atividade locomotora. 5. DELINEAMENTO EXPERIMENTAL 5.1. Locomoção induzida pela administração aguda de femproporex em ratos adolescentes e adultos pré-tratados repetidamente com testosterona Os ratos foram divididos em quatro grupos:  Veículo – Salina (VEIC-SAL): pré-tratamento com óleo de amêndoas (0,1 mL/kg); tratamento com salina 0,9% (0,1 mL/kg); n= 8 23  Veículo – Femproporex (VEIC-FEM): pré-tratamento com óleo de amêndoas (0,1 mL/kg); tratamento com femproporex (3 mg/kg); n= 10  Testosterona – Salina (TEST-SAL): pré-tratamento com testosterona (10 mg/kg); tratamento com salina 0,9% (0,1 mL/kg); n=10  Testosterona – Femproporex (TEST-FEM): pré-tratamento com testosterona (10 mg/kg); tratamento com femproporex (3 mg/kg). n= 9 Cada grupo foi submetido à administração repetida de uma injeção diária de testosterona (10 mg/kg; s.c.) ou veículo (óleo de amêndoas, s.c.) durante 10 dias consecutivos. No 13º dia, os animais adolescentes (DPN 41) foram inicialmente colocados por 20 minutos na caixa de atividade locomotora para habituação. Em seguida, receberam uma injeção de femproporex (3 mg/kg, i.p.) ou solução salina (0,9 %), e sua atividade locomotora foi avaliada na caixa de medida automática durante 40 minutos, sendo que as unidades de locomoção foram verificadas e anotadas a cada 5 minutos. Decorridos 30 dias da última administração de testosterona, os mesmos ratos, já adultos (DPN 68), receberam novamente o tratamento repetido com testosterona ou veículo nas doses anteriormente descritas. No 13º dia (DPN 81) foram novamente submetidos a uma injeção de femproporex ou salina nas mesmas doses anteriores, e tiveram sua atividade locomotora mais uma vez avaliada, como descrito acima. 24 6. ANÁLISE ESTATÍSTICA Os dados comportamentais foram analisados por ANOVA bifatoral, considerando-se os fatores pré-tratamento (veículo x testosterona) e tratamento (salina X femproporex). Nos casos em que ANOVA mostrou diferenças significativas (p < 0,05) os resultados foram analisados pelo teste post-hoc Newman-Keuls. 7. RESULTADOS 7.1. Ratos adolescentes Os resultados da atividade locomotora induzida por femproporex (3 mg/kg) em ratos adolescentes (DPN 41) pré-tratados durante 10 dias com veículo (óleo de amêndoas) ou testosterona (10 mg/kg) estão apresentados na Figura 2. ANOVA revelou diferenças significativas na atividade locomotora considerando o fator pré-tratamento [F(3,33)= 17,76; p< 0,05] e fator tratamento [F(3,33)= 278,18; p<0,05]. Foi observada também interação significativa entre os dois fatores [F(3,33)= 8,73; p<0,05]. O teste de Newman-Keuls revelou que o tratamento com femproporex aumentou a atividade locomotora em ambos os grupos veículo e testosterona, revelando o efeito estimulante dessa substância. Newman-Keuls revelou também que a atividade locomotora induzida pelo femproporex no grupo tratado com testosterona e femproporex foi maior que o tratado com veículo e femproporex, revelando a sensibilização cruzada entre testosterona e femproporex. 25 Figura 2. Atividade locomotora de ratos adolescentes (DPN 41) após injeção intraperitoneal de femproporex (3 mg/kg, i.p.) ou salina (0,1 mL/kg) 3 dias após o término do tratamento repetido com testosterona (10 mg/kg, s.c.) ou veículo (óleo de amêndoas, 0,1mL/kg) durante 10 dias. Os dados representam a média ± EPM de 8 -10 animais por grupo. *p<0,05: comparados aos respectivos controles. #p<0,05: comparado ao grupo TEST-SAL +p<0,05: comparado ao grupo VEIC-FEM. 7.2. Ratos adultos Os resultados da atividade locomotora induzida por femproporex (3 mg/kg) em ratos adultos (DPN 81) pré-tratados durante 10 dias com veículo (óleo de amêndoas) ou testosterona (10 mg/kg) estão apresentados na Figura 3. ANOVA não demonstrou diferenças significativas na atividade locomotora considerando o fator pré-tratamento [F(3,33)= 2,75; p> 0,05]. Contudo, ANOVA revelou diferenças significativas para o fator tratamento [F(3,33)= 42,37; p<0,05]. Nenhuma interação foi observada entre os fatores pré-tratamento e tratamento [F(3,33)=1,95; p>0,05]. VEICULO TESTOSTERONA 0 1000 2000 3000 SALINA FEMPROPOREX * U N ID A D E S L O C O M O Ç Ã O * # + 26 A comparação múltipla das médias por Newman-Keuls, considerando o fator tratamento, mostrou que a injeção aguda de femproporex (3mg/kg) aumentou a atividade locomotora independentemente do pré-tratamento com testosterona. Figura 3. Atividade locomotora de ratos adultos (DPN 81) após injeção intraperitoneal de femproporex (3 mg/kg, i.p.) ou salina (0,1 mL/kg) 3 dias após o término do tratamento repetido com testosterona (10 mg/kg, s.c.) ou veículo (óleo de amêndoas, 0,1mL/kg) durante 10 dias. Os dados representam a média ± EPM de 8-10 animais por grupo.*p<0,05: comparados aos respectivos controles. VEICULO TESTOSTERONA 0 1000 2000 3000 4000 SALINA FEMPROPOREX U N ID A D E S L O C O M O Ç Ã O * * 27 8. DISCUSSÃO Nos últimos anos, tem havido um aumento do uso concomitante de ETAs e EAAs no Brasil e no mundo, tanto entre adultos quanto entre adolescentes (CHASIN e SILVA, 2003; GALDURÓZ et al., 2005b; KANAYAMA, HUDSON e POPE, 2010) É sabido que o desenvolvimento da dependência à anfetamina está relacionado com sua atuação no sistema dopaminérgico (WISE, R. A. e BOZARTH, M. A., 1987; CAMÍ e FARRÉ, 2003). O femproporex, assim como a anfetamina, atua nas mesmas vias dopaminérgicas. (PLANETA, ALCANTARA e DELUCIA, 2002). Semelhantemente, vários autores descrevem a possível participação dos EAAs na modulação da transmissão dopaminérgica. (POWER et al., 1991; LE GREVÈS et al., 1997; JOHANSSON et al., 2000; KINDLUNDH et al., 2001; KANAYAMA et al., 2009a). Modelos animais de autoadministração já demonstraram o efeito reforçador positivo dos EAAs. (WOOD, 2004). Baseado nos relatos da literatura, em nosso trabalho, investigamos o possível desenvolvimento de sensibilização comportamental cruzada entre testosterona e femproporex, em ratos adolescentes e adultos. Nossos resultados demonstram que a administração repetida de testosterona (10 mg/kg) resultou em sensibilização cruzada ao femproporex (3 mg/kg) em ratos adolescentes (DPN 41), mas não em ratos adultos (DPN 71). O fenômeno da sensibilização comportamental é uma característica comum para todas as substancias psicoativas de abuso, e está relacionada ao desenvolvimento da dependência, principalmente aos psicoestimulantes. (ROBINSON e BERRIDGE, 28 1993; 2001; HYMAN, MALENKA e NESTLER, 2006; ROBINSON e BERRIDGE, 2008) O pré-tratamento com uma determinada substância pode aumentar a resposta comportamental à administração subsequente da mesma substância, caracterizando assim a sensibilização comportamental. Tal fenômeno já foi descrito para a cocaína, anfetamina, etanol, morfina, nicotina, ∆-9-THC e heroína (ROBINSON e BECKER, 1986; KALIVAS e DUFFY, 1987; MISERENDINO e NESTLER, 1995; CADONI et al., 2001; MARIN e PLANETA, 2004; CRUZ, DELUCIA e PLANETA, 2005; LENOIR et al., 2007). Dessa forma, foi sugerido que todas as substancias psicoativas que induzem dependência atuam como reforçadores positivos e promovem sensibilização comportamental (WISE, R. A. e BOZARTH, M. A., 1987; ROBINSON e BERRIDGE, 2008) A sensibilização cruzada indica que a exposição a uma substância psicoativa pode aumentar a vulnerabilidade ao abuso de outra substância, (ITZHAK e MARTIN, 1999), e já foi demonstrada entre nicotina e cocaína (COLLINS e IZENWASSER, 2004) entre anfetamina e nicotina (SANTOS et al., 2009) e entre testosterona e cocaína.(ENGI, 2012). De acordo com a teoria de sensibilização do incentivo, esses resultados sugerem que a exposição prévia a uma substância pode aumentar a vulnerabilidade à dependência de outra. Avaliando a hipótese de que a sensibilização está relacionada à dependência, podemos sugerir que, em ratos adolescentes, a exposição repetida à testosterona aumenta a vulnerabilidade aos efeitos de estimulantes do tipo anfetamínico, tais como o femproporex. A sensibilização cruzada entre testosterona e femproporex observada no presente estudo, sugere que esse EAA 29 pode induzir neuroplasticidades nos circuitos neurais relacionados à ativação psicomotora induzida pelo femproporex. Assim, o uso de testosterona poderia influenciar a vulnerabilidade ao abuso e dependência de derivados anfetamínicos A sensibilização comportamental reflete neuroadaptações no sistema dopaminérgico mesocorticolímbico, que estão envolvidas no desenvolvimento da dependência às substancias psicoativas. (WISE e BOZARTH, 1987; NESTLER, 2001). Os principais componentes desse sistema são a área tegmental ventral e suas projeções para o sistema límbico, que inclui o núcleo accumbens, amígdala e córtex pré-frontal (WISE, ROY A. e BOZARTH, MICHAEL A., 1987; KOOB e LE MOAL, 2001). A administração repetida de drogas de abuso, especialmente psicoestimulantes, causam alterações moleculares similares nesse sistema de recompensa. De acordo com a literatura recente, os EAA podem causar síndrome da dependência e esta divide muitas características com a dependência de outras substâncias psicoativas, como a cocaína e a anfetamina (KANAYAMA et al., 2009b). Por exemplo, os esteroides atuam como reforçadores positivos em modelos animais de autoadministração, e também podem produzir síndrome de abstinência característica (KANAYAMA, HUDSON e POPE, 2009). Neuroadaptações no sistema dopaminérgico foram observadas após administrações de testosterona. Nesse sentido, BIRGNER et al. (2008) demonstraram que a administração de nandrolona (3 ou 15 mg/kg) durante 14 dias, em ratos adultos causou aumento do RNAm do receptor dopaminérgico do subtipo D4 no núcleo acúmbens, diminuição do RNAm do subreceptor tipo D1 no hipocampo e aumento do RNAm do receptor D1 na amígdala, evidenciando 30 neuroplasticidades nos sistemas relacionados ao desenvolvimento e manutenção da dependência. Além disso, outros autores demonstraram que a testosterona parece ter uma ação no sistema opioidérgico. Dessa maneira, Johansson et al , (1997) demonstraram que ratos que receberam nandrolona (5 ou 15 mg/kg) por 14 dias apresentaram aumento de β-endorfina na VTA. Em um estudo posterior semelhante, Johansson et al. (2000) demonstraram aumento de dinorfina e encefalina no hipocampo e estriado, relatando um ‘desbalanço’ desses dois peptídeos opióides nessas regiões. Dessa maneira, os efeitos da administração repetida de testosterona na atividade locomotora induzida pelo femproporex em ratos adolescentes poderiam estar relacionados com neuroplasticidades nos sistemas dopaminérgicos e com participação de outros sistemas, tal como o sistema opioidérgico. Para tanto, novos estudos são necessários para confirmar tal suposição. A administração repetida de testosterona causou sensibilização comportamental ao femproporex em ratos adolescentes. Dessa maneira, nossos resultados sugerem que a administração repetida de EAAs poderia aumentar a vulnerabilidade ao desenvolvimento da dependência aos ETAs. Contudo, novos estudos em modelos animais são necessários para confirmar o mecanismo molecular da interação entre EAAs e ETAs no desenvolvimento da dependência aos esteroides e aos derivados anfetamínicos. 31 9. CONCLUSÃO Nossos resultados demonstram que o tratamento repetido por 10 dias com testosterona (10 mg/kg) causou sensibilização cruzada induzida pelo femproporex (3 mg/kg) em ratos adolescentes, mas esse mesmo fenômeno não foi observado em ratos adultos. Esses resultados sugerem uma provável interação entre essas duas substancias no SNC, em regiões relacionadas ao desenvolvimento da dependência. 32 33 10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ABESO. Atualização das Diretrizes para o Tratamento Farmacológico da Obesidade e do Sobrepeso. p. 4-18, 2010. AIZENSTEIN, M. L.; SEGAL, D. S.; KUCZENSKI, R. Repeated amphetamine and fencamfamine: sensitization and reciprocal cross-sensitization. Neuropsychopharmacology, v. 3, n. 4, p. 283-90, 1990. AKIMOTO, K, HAMAMURA, T. ;KAZAHAYA, Y.; AKIYAMA, K.; OTSUKI, S.. 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