UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “Júlio de Mesquita Filho” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU Triagem de alterações genéticas em indivíduos com diagnóstico clínico de síndrome de Williams-Beuren e com exame da FISH (-). Letícia Cassimiro Batista Botucatu-SP 2024 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “Júlio de Mesquita Filho” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU Triagem de alterações genéticas em indivíduos com diagnóstico clínico de síndrome de Williams-Beuren e com exame da FISH (-). Letícia Cassimiro Batista Orientador: Prof. Dr. Danilo Moretti Ferreira. Co-orientadora: Dra. Deise Helena de Souza Botucatu-SP 2024 Tese apresentada ao Instituto de Biociências, Câmpus de Botucatu, UNESP, para obtenção do título de Doutor no Programa de Pós- Graduação em Ciências Biológicas (Genética) genética. DEDICATÓRIA Dedico esse trabalho aos meus pais Ademir e Dulce, in memoriam, por me permitirem sonhar e acreditar em mim mesmo quando eu mesma não acreditava. Vocês são meus maiores exemplos de vida, amor, trabalho e dedicação. Eu amo muito vocês! AGRADECIMENTO À Deus, por conceder-me paz e sabedoria para conduzir este trabalho; Aos pacientes e seus familiares, por aceitarem participar deste estudo. Sem vocês este projeto não seria realizado; Ao Prof. Dr. Danilo Moretti-Ferreira, meu orientador. Muito obrigada pelo carinho, paciência, orientações, conselhos, suporte e confiança durantes toda essa trajetória. A Dr. Deise Helena de Souza pela amizade, carinho, conselhos, apoio e ensinamentos que foram importantíssimos para a realização deste projeto; À Dra. Sarah H. Elsea agradeço por me receber em seu laboratório e por tudo que me ensinou, também agradeço o carinho e atenção que foram de grande suporte durante minha estadia em Houston. À Rosana Bicudo pela disponibilidade, ensinamento e carinho no laboratório. Aos membros do Laboratório da Dra. Sarah H. Elsea por me receberem bem e toda ajuda no período que passei lá. À ABSW e demais centro de genéticas, e seus professores, funcionários e colaboradores, por tornar este trabalho possível; Aos meus amigos e familiares pelo amor, pela amizade, compreensão, incentivo e pela ajuda nos momentos em que mais precisei. Ao Murilo, meu namorado, por estar do meu lado desde o princípio, por me ajudar e apoiar nas decisões mais difíceis, você estava lá quando me senti mais perdida; Aos familiares ausentes, que em todos os momentos estiveram presentes em meu coração; A todos que me ajudaram neste trabalho; A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) por todo o financiamento para a realização do presente trabalho. Muito obrigada!! RESUMO A síndrome Williams-Beuren (SWB) é causada por uma microdeleção, na região 7q11.23. As deleções típicas podem ser de 1,5Mb e 1,8Mb. O fenótipo da SWB caracterizado com face típica, perfil cognitivo específico e alterações cardíacas. Devido a esse fenótipo conhecido, sistemas de pontuação foram desenvolvidos baseados nas características clínicas e assim auxiliar no diagnóstico clínico indicando quando se fazer o diagnóstico laboratorial. Esse diagnóstico pode ser realizado por diferentes técnicas, como a hibridização in situ por fluorescência (FISH), a amplificação de múltiplas sondas dependentes de ligação (MLPA), hibridização genômica comparativa em microarranjos (aCGH) e o sequenciamento de nova geração (SNG) de exoma. Este trabalho realizou o exoma de 22 pacientes com diagnóstico clínico de SWB e exame da FISH (-). A análise do exoma revelou em 10 pacientes variantes patogênicas nos genes ARID1B, ARID2, NAA15, GIGYF1, MED13L, KAT6B, KAT6A, PTPN11, TRRAP, RFX7, GGCX e GJA1. Entretanto, novos estudos precisam realizados. ABSTRACT Williams-Beuren syndrome (WSB) is caused by a microdeletion in the 7q11.23 region. These deletions are called typical and can be 1.5Mb and 1.8Mb. The phenotype of WSB is characterized by a typical face, specific cognitive profile, and cardiac alterations. Due to this established phenotype, scoring systems have been developed based on the characteristics found in patients in order to aid in the clinical diagnosis and indicate when to make the laboratory diagnosis. This diagnosis can be made by different techniques, such as fluorescence in situ hybridization (FISH), multiplex ligation-dependent amplification (MLPA), comparative genomic hybridization on microarrays (aCGH), and next-generation sequencing (NGS) of the exome. This study performed the exome analysis of 22 patients with a clinical diagnosis of WSB and FISH (-). The exome revealed pathogenic and probably pathogenic variants in genes ARID1B, ARID2, NAA15, GIGYF1, MED13L, KAT6B, KAT6A, PTPN11, TRRAP, RFX7, GGCX e GJA1 genes in 10 cases. However, further studies are needed SUMÁRIO 1.INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 11 1.1. Características Clínicas ............................................................................................... 11 1.2. Diagnóstico Clínico ...................................................................................................... 13 1.3. Características genéticas ............................................................................................. 14 1.4. Diagnostico Laboratorial ............................................................................................ 16 2. OBJETIVOS ....................................................................................................................... 18 2.1. Geral ............................................................................................................................. 18 2.1.1. Específico ............................................................................................................... 18 3. MATERIAIS E MÉTODOS .............................................................................................. 19 3.1. Casuística ...................................................................................................................... 19 3.2. Aspectos éticos .............................................................................................................. 20 3.3. Avaliação clínica .......................................................................................................... 20 3.4. Análise Molecular ........................................................................................................ 20 3.4.1. Obtenção do DNA genômico. ................................................................................... 21 3.4.2. Exoma ........................................................................................................................ 21 3.4.2.1. Análise das variantes ........................................................................................... 21 4.RESULTADOS .................................................................................................................... 25 4.1. Grupo amostral ............................................................................................................ 25 4.2. Análises moleculares .................................................................................................... 26 4.2.1. ARID1B e ARID2- Casos 2 e 16 ............................................................................ 26 4.2.2. KAT6A- Caso 13 .................................................................................................... 30 4.2.3. PTPN11- Caso 19 ................................................................................................... 33 4.2.4. GJA1- Caso 22 ........................................................................................................ 36 4.2.5. KAT6B- Caso 9 ...................................................................................................... 37 4.2.6. NAA15-Caso 4 ....................................................................................................... 41 4.2.7. MED13L- Caso 5 .................................................................................................... 44 4.2.8. Caso 12- TRRAP .................................................................................................... 46 4.2.9. Caso 17- RFX7 ....................................................................................................... 49 4.2.10. CLIP2- Caso 10 .................................................................................................... 52 4.2.11. Casos sem hipótese diagnóstica molecular ........................................................... 55 5. DISCUSSÃO ....................................................................................................................... 64 6.CONCLUSÃO ...................................................................................................................... 74 7. REFERÊNCIAS .................................................................................................................. 75 8.ANEXOS ............................................................................................................................... 82 8.1. Anexo I. Ficha de Anamnese da SWB ....................................................................... 82 8.2. Anexo II. Sistemas de pontuação utilizados para o diagnostico clínico da SWB. . 89 8.3. Anexo III. Aprovação do Comitê de Ética e Pesquisa. ............................................. 91 8.4. Anexo IV. Termo de Consentimento Livre e Esclarecido para menores de 18 anos. .............................................................................................................................................. 96 8.5.Anexo V. Fotografias do grupo amostral. .................................................................. 99 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Visualização gráfica da região 7q11.23 deletada na síndrome de Williams-Beuren..16 Figura 2. Diagrama de Venn com as características clínicas da síndrome de Williams-Beuren e da síndrome de Coffin-Siris....................................................................................................61 Figura 3. Diagrama de Venn com as características faciais da síndrome de Williams-Beuren e da síndrome de Coffin-Siris.......................................................................................................61 LISTA DE TABELAS Fluxograma 1. Desenho do grupo amostral................................................................. Tabela 1. Caracterização das mutações encontradas nos genes ARID1B e ARID2...... Tabela 2. Características clínicas da síndrome de Coffin-Siris e dos casos 2 e 16...... Tabela 3. Caracterização da variante encontrada no gene KAT6A............................... Tabela 4. Características clínicas da síndrome de Arboleda-Tham............................. Tabela 5. Caracterização da variante encontrada no gene PTPN11............................. Tabela 6. Características clínicas da síndrome de Noonan de pacientes com alterações no gene PTPN11.......................................................................................................................... Tabela 7. Caracterização da variante encontrada no gene GJA1.................................. Tabela 8. Características clínicas da DODD................................................................ Tabela 9. Caracterização da variante encontrada no gene KAT6B.............................. Tabela 10. Características clínicas da síndrome de SBBYSS..................................... Tabela 11. Caracterização das variantes encontradas nos genes NAA15.................... Tabela 12. Características clínicas da MRD50........................................................... Tabela 13. Caracterização da variante encontrada no gene MED13L......................... Tabela 14. Características clínicas da MRFACD....................................................... Tabela 15. Caracterização da variante encontrada no gene TRRAP............................ Tabela 16. Características clínicas da síndrome de DEDDFA.................................... Tabela 17. Caracterização da variante encontrada no gene RFX7............................... Tabela 18. Características clínicas do transtorno MRD71........................................... Tabela 19. Caracterização da variante do gene CLIP2................................................ Tabela 20. Características clínicas da síndrome de Williams-Beuren......................... Tabela 21. Caracterização das variantes encontradas no caso 1................................... Tabela 22. Caracterização das variantes encontradas no caso 3.............................. Tabela 23. Caracterização das variantes encontradas no caso 20............................. Tabela 24. Características clínicas da SWB dos casos complexos........................... LISTA DE ABREVIATURAS et al. e outros LISTA DE SÍMBOLOS Mb megabase (s) ml mililitro Maior ou igual < menor que % porcentagem - negativo e/ou ausência + positivo e/ou presente ≥ 8 LISTA DE SIGLAS AA Aminoácido AAP Associação Americana de Pediatria ABraOM Arquivo Brasileiro Online de Mutações ABSW Associação Brasileira da Síndrome de Williams-Beuren aCGH microarray-based Comparative Genomic Hybridization (array-CGH) AD Autossômica dominante Ala Alanina AR Autossômica recessiva Arg Arginina Asn Asparagina Asp Aspartato AVC Acidente vascular cerebral CADD Combined Annotation Dependent Depletion CEP Comitê de ética em pesquisa CNV Variação do número de cópias (copy number variation) Cys Cisteina DANN Deep neural network (DNN) algorithm dbSNP Single Nucleotide Polymorphism Database DECIPHE R Database of Genomic Variation and Phenotype in Humans using Ensembl Resources del Deleção DNA Ácido desoxirribonucleico DODD Displasia Oculodentodigital dup Duplicação EAP Estenose da artéria pulmonar EASV Estenose aórtica supravalvar EDTA Ácido etileno diamino tetra-acético Exoma Sequenciamento de éxons FATHMM Functional Analysis through Hidden Markov Models FCM Faculdade de Ciências Médicas 9 FISH Hibridação in situ por fluorescência (Fluorescence in situ hybridization) fitcons fitness consequences of functional annotation FMB Faculdade de Medicina de Botucatu FRX Fator regulador X fs* Frameshift GERP Genomic Evolutionary Rate Profiling Gln Glutamina Gly Glicina gnomAD Genome Aggregation Database GRCh38 Genome Reference Consortium Human Build 38 Organism: Homo sapiens (human) His Histidina HPO Human Phenotype Ontology IGV Integrative Genomics Viewer indel insertion-deletion LCR Sequências de baixo número de cópias (low copy repeats) Lys Lisina MetaLR Logistic regression (LR) based ensemble prediction score MLPA Amplificação de sondas multiplex dependente de ligação MRD50 Intellectual developmental disorder, autosomal dominant 50, with behavioral abnormalities MRFACD Impaired intellectual development and distinctive facial features with or without cardiac defects MRD71 Intellectual developmental disorder, autosomal dominant 71, with behavioral abnormalities N/A Not applicable NAHR Recombinação alélica não homologa (non allelic homologous recombination) ND Não descrito NGS New generation sequencing OMIM Online Mendelian Inheritance in Man Poly-Phen- 2 Polymorphism Phenotyping v2 Pro Prolina RCSWB Região crítica da síndrome de Williams-Beuren 10 REVEL Rare exome variant ensemble learner RNA Ácido ribonucleico SAG Serviço de aconselhamento genético SARTH Síndrome de Arboleda-Tham SBBYSS Síndrome de Say-Barber-Biesecker-Young-Simpson SCS Síndrome de Coffin-Siris Ser Serina SIFT Sorting Intolerant From Tolerant SMS Síndrome de Smith-Magenis SNG Sequenciamento de nova geração SNV Single Nucleotide Variant SWB Síndrome de Williams-Beuren TCLE Termo de consentimento livre e esclarecido Ter Terminal Thr Treonina Trp Triptofano Tyr Tirosina UCSC University of California Santa Cruz UNESP Universidade Estatual Paulista UNICAMP Universidade de Campinas US Ultrassonografia Val Valina WBS Williams-Beuren syndrome 11 1.INTRODUÇÃO A síndrome de Williams-Beuren (SWB; OMIM 194050) é uma afecção genética rara e multissistêmica, descrita por Williams et al., 1961 e Beuren et al., 1962 independentemente. Eles descreveram grupos de pacientes distintos, que apresentavam dismorfismos faciais, anomalias cardiovasculares congênitas, deficiência intelectual e de crescimento, perfil cognitivo característico e ocasionalmente hipercalcemia infantil transitória (AAP, 2001). A ocorrência desta afecção é estimada em 1/7.500 nascidos vivos (STROMME; RAMSTAD, 2002; KRUSZKA et al., 2018). É uma síndrome pan-etnica e acomete ambos os sexos (KRUSZKA et al., 2018). A maioria dos casos é considerada uma síndrome esporádica, resultado de uma deleção de novo (CAMPO et al., 2006) embora herança autossômica dominante já tenha sido descrita (MORRIS; THOMAS; GREENBERG, 1993). Estudos envolvendo os pais não encontraram predominância de origem parental, nem relação com a idade dos pais ou diferenças fenotípicas (PEREZ JURADO,’ et al., 1996; DUTLY; SCHINZEL, 1996; ROBINSON et al., 1996; BAUMER et al., 1998; WANG et al., 1999; BAYÉS et al., 2003; THOMAS et al., 2006). Contudo uma inversão na região cromossômica da SWB (SWBinv- 1) em pais de pacientes com SWB, aumenta a probabilidade de um subsequente rearranjo meiótico como a deleção (BAYÉS et al., 2003). A SWB é causada por uma microdeleção hemizigótica no braço longo do cromossomo 7(7q11.23) abrangendo de 1.5Mb à 1.8Mb contendo 28 genes. A haploinsuficiência desses genes leva a um fenótipo característico, mas a correlação genótipo–fenótipo ainda não é estabelecida (SCHUBERT, 2009)(FIGURA 1). A região cromossômica deletada na SWB envolve o gene da elastina (ELN), que codifica a proteína elastina, importante componente das fibras do tecido conjuntivo o que explica as várias características da síndrome como alterações faciais, voz rouca, cardiopatia, envelhecimento precoce da pele, divertículos vesicais, hérnias, contratura ou frouxidão de articulações (CURRAN et al., 1993; EWART’ et al., 1993; OSBORNE et al., 1996; AAP, 2001). 1.1. Características Clínicas A SWB possui uma grande variabilidade fenotípica, mas algumas características se destacam, como a face típica, as alterações cardíacas e o perfil cognitivo. 12 As características faciais típicas incluem estreitamento bitemporal, edema periorbital, estrabismo, íris estrelada, sobrancelhas largas, epicanto, ponte nasal baixa, nariz curto e arrebitado ou narinas antevertidas, nariz bulboso, hipoplasia malar, filtro nasal longo, lóbulos das orelhas proeminentes, bochechas proeminentes, boca grande, lábios proeminentes, dentes pequenos e espaçados, maloclusão e queixo pequeno (MORRIS et al., 1988; AAP, 2001). A estenose aórtica supravalvar (EASV) é um tipo de arteriopatia severa encontrada em 75% dos casos com SWB (MORRIS,2018), que pode resultar numa hipertensão (40% a 50%) ou até numa insuficiência cardíaca (ERONEN et al., 2002; BOUCHIREB et al., 2010). Já a estenose da artéria pulmonar (EAP) é outro tipo de arteriopatia, vista com maior frequência na infância e apresenta melhora com o tempo (MORRIS,2018). Devido à presença de problemas cardíacos na SWB há um risco maior de episódios de infarto do miocárdio, acidente vascular cerebral (AVC) e morte súbita (WESSEL et al., 2004). O que representa a maior parte da morbidade e mortalidade da síndrome. As alterações no tecido conjuntivo estão relacionadas aos seguintes aspectos: voz rouca, presença de hérnias umbilical e/ou inguinal, frouxidão das articulações e anomalias cardiovasculares (MORRIS,2018). Já os aspectos musculoesqueléticos que podem ser observados são: a hipotonia e a frouxidão das articulações na infância, enquanto nos adolescentes e adultos estão presentes a hipertonia e contratura das articulações (KAPLAN et al., 1989; LOPEZ-RANGEL et al., 1992). Na primeira infância, observamos refluxo gastresofágico, vômitos, dificuldades alimentares e cólicas prolongadas. Também notamos constipação e alterações endócrinas, como a hipercalcemia idiopática infantil transitória, presente em 6 a 15% dos casos (MORRIS et al., 1988; FERRERO et al., 2007). Esses sintomas gastrointestinais levam a uma desnutrição que resulta em baixo peso e crescimento. Assim, pacientes com a SWB tem um seu próprio padrão de crescimento com restrição de crescimento intrauterino e ao nascimento baixo peso, comprimento e perímetro cefálico. Durante a infância e adolescência apresenta um atraso global no crescimento responsável por uma altura final abaixo da média da população o mesmo para o peso e perímetro cefálico (DE SOUSA LIMA STRAFACCI et al., 2020; STANLEY; LEONG; POBER, 2021). Ambos meninos e meninas com SWB tem início da puberdade 1-2 anos mais cedo que a população em geral incluindo menarca 1-2 anos mais cedo que a média e pode contribuir para a altura final do adulto (MORRIS et al., 1988; STANLEY; LEONG; POBER, 2021). Curvas de crescimento e peso específicas para SWB foram desenvolvidas com o passar do tempo. Por exemplo, em 2001 a Academia Americana de Pediatria publicou em seu guideline de 13 tratamento da SWB as curvas que sugerem ser usadas (AAP, 2001). Na Inglaterra, num estudo com 169 pacientes com SWB desenvolveram as suas curvas de crescimento para peso, altura e perímetro encefálico (MARTIN et al., 2007). Recentemente foi publicado um estudo com 245 pacientes brasileiros com a SWB e assim elaborou-se curvas de crescimento e peso específicas para o Brasil (STRAFACCI et al., 2024). O perfil cognitivo da SWB também é particular, os pacientes apresentam um padrão típico de debilidades e habilidades. As áreas com debilidades incluem a construção visuoespacial, a deficiência intelectual que pode ser de leve a moderada; e as habilidades motoras finas (SMOOT et al., 2005; SERRANO-JUÁREZ et al., 2022). No entanto, eles apresentam um desenvolvimento superior em linguagem, reconhecimento facial, talento musical e hipersociabilidade, um traço distintivo da síndrome (SMOOT et al., 2005; POBER, 2010). Além dessas características os pacientes podem apresentar déficit de atenção, hiperatividade, ansiedade, fobias, hiperacusia e distúrbios do sono (AAP, 2001). 1.2. Diagnóstico Clínico Apesar das características clínicas serem conhecidas, a síndrome ainda demora a ser diagnosticada. Tal situação pode ocorrer, pois, as características faciais típicas podem ser sutis no nascimento. Os bebês podem apresentar vômitos, constipação e irritabilidade, esses sintomas podem estar relacionados à hipercalcemia. Entretanto, não são específicos e a dosagem de cálcio sérico não é realizada de rotina. Já os atrasos no desenvolvimento são frequentemente atribuídos aos problemas crônicos (MORRIS et al., 1988). O estudo realizado por Souza et al., 2007 demonstrou que a SWB possui um diagnóstico tardio. Pois, na maioria dos casos os pacientes tinham mais de sete anos ao diagnóstico, dados . Apenas em três casos o diagnóstico foi realizado com idade abaixo de três anos. Esse estudo corrobora com o estudo de Morris et al., 1988, onde a idade média do diagnóstico foi de 6,4 anos. Nas últimas décadas nos países mais ricos a idade do diagnóstico apresentou uma queda devido ao acesso maior aos testes moleculares. Entretanto, para os demais países o diagnóstico continua sendo tardio, ocorrendo depois da primeira infância (KOZEL et al., 2021). Conhecer as características clínicas da SWB permitiu que sistemas de pontuações fossem elaborados a fim de auxiliar no diagnóstico clínico da síndrome e indicar se deve-se fazer a confirmação laboratorial. 14 Os sistemas de pontuação ou escores, atribuem pontos para as características clínicas apresentadas pelos pacientes, ao final esses pontos são somados e de acordo com o seu valor de corte estabelecem se o paciente é SWB clássico ou não. Para a SWB foram desenvolvidos quatro sistemas de pontuações: o primeiro de Preus, 1984; Lowery et al., 1995; Academia Americana de Pediatria (AAP, 2001); e Sugayama et al., 2007 (ANEXO II). O sistema descrito por Preus em 1984 caiu em desuso por ser de difícil aplicação. O nosso grupo avaliou os três sistemas de pontuação e encontram entre eles uma alta sensibilidade e baixa especificidade (LEME et al., 2013). Nos últimos anos estudos passaram a relacionar algumas características observadas em exames de ultrassonografias (US) realizadas durante o pré-natal a SWB. Apesar de não haver um quadro clínico específico, as características mais frequentes observadas foram às alterações cardiovasculares, a restrição de crescimento intrauterino e o poli-hidrâmnio (HUANG et al., 2022; COURDIER et al., 2023; LV et al., 2023). 1.3. Características genéticas A SWB é causada pela deleção em 7q11.23. Essa região é conhecida como região crítica da SWB (RCSWB). E possui uma arquitetura genômica complexa sendo composta por: uma região de 1.2Mb de genes de cópia única; ligada a duas regiões repetitivas, repetições de cópias baixas (LCR: Low Copy Repeats) (SCHUBERT, 2009). As LCRs estão divididas em 3 blocos: A, B e C; que estão organizados em segmentos centrométrico, medial e telomérico. Essas LCRs representam o substrato para a ocorrência de crossing-over durante a divisão meiótica (INOUE; LUPSKI, 2002), como apresentado na Figura 1. Nas LCRs podemos encontrar tanto genes quanto pseudogenes (HOBART et al., 2010). 15 Figura 1. Visualização gráfica da região 7q11.23 deletada na síndrome de Williams-Beuren. A localização e orientação dos blocos LCRs (A, B e C) centromérico (c), médios (m) e teloméricos (t) estão indicados por setas coloridas, nota-se que os genes estão representados nos blocos apenas uma vez. Abaixo, as deleções típicas de 1.5Mb e 1.8Mb estão representadas com pontos de quebra dentro dos blocos B centromérico e B medial e blocos A centromérico e A medial, respectivamente. Logo abaixo há a duplicação dos blocos de LCRs B medial, B centromérico e C medial; há também a representação da triplicação. Por último há a representação da inversão dos blocos A medial, B medial, C medial e B telomérico (Modificado de MERLA et al., 2010). O pareamento não homólogo (non allelic homologous recombination — NAHR) entre blocos diferentes de LCRs ocorre, pois, estas possuem uma alta similaridade de sequências homólogas. Nessa situação, a recombinação poderá resultar em uma deleção em uma cromátide e/ou duplicação da região na outra cromátide, (OSBORNE et al., 2001). Aproximadamente, 95% dos pacientes com diagnóstico clínico de SWB apresentam uma deleção de ∼1.5 Mb causada por uma recombinação meiótica desigual entre os blocos B-centromérico e B-medial, enquanto, 3–5% exibem uma deleção de ∼1.8 Mb entre os blocos A-centromérico e A- medial. Na literatura, com frequência menor, existem relatos de deleções maiores ou menores que 16 esses limites e estas são nomeadas de atípicas (BELLUGI et al., 2000; NICA BAYÉS et al., 2003; SCHUBERT, 2009) (Figura 3). Na literatura há estudos que identificaram a presença de uma inversão paracêntrica hemizigótica na região crítica da SWB. Esta inversão poderia aumentar a possibilidade de um pareamento desequilibrado em 7q11.23 que resultaria na deleção ou duplicação da região (OSBORNE et al., 2001; BAYÉS et al., 2003; SCHUBERT, 2009; HOBART et al., 2010). Assim, as pessoas que possuem a inversão têm um risco maior de ter um filho com a SWB em comparação a população que não possui a inversão (HOBART et al., 2010). Na região crítica da SWB foram identificados 28 genes, entretanto, a correlação genótipo- fenótipo das características da SWB ainda não foi esclarecida para todos os genes deletados. Ewart et al., 1993 estabeleceu a ligação entre a haploinsuficiência da proteína ELN e os problemas cardiovasculares e alterações de tecido conjuntivo. Uma vez que, a elastina forma as fibras elásticas da matriz extracelular do tecido conjuntivo e de regular a proliferação de células musculares lisas vasculares. 1.4. Diagnostico Laboratorial A técnica preconizada para o diagnóstico da SWB é a técnica da FISH, por ser uma técnica específica (EWART’ et al., 1993; LOWERY et al., 1995; SOUZA et al., 2007). Essa técnica é realizada pela hibridação de uma sequência específica de DNA marcada com uma sonda na sequência de DNA alvo complementar, a fim de verificar se a mesma possui ou não as duas cópias da sequência alvo. Assim na SWB, a sequência de DNA a ser marcada com a sonda está na RCSWB, onde se encontram os genes da ELN, o mais comumente marcado, e o gene LIMK1, além de marcadores de microssatélites (LOWERY et al., 1995). A ausência da fluorescência da região 7q11.23 em um dos cromossomos indica que houve deleção, ou seja, FISH (+) e, portanto, confirma a hipótese diagnóstica para a SWB (MERVIS et al., 2000). Contudo, há situações em que os pacientes têm o diagnóstico clínico da SWB e são FISH (-), ou seja, a fluorescência é observada em ambos os cromossomos 7. Esses últimos representam 4% dos casos e não possuem a confirmação laboratorial. Tal situação pode ocorrer pois: • A microdeleção é atípica e não envolve os genes utilizados como marcadores (ELN) (PANI et al., 2010). • Pode ser uma variante nos genes da região crítica da SWB. 17 • Deleções ou mutações em outras regiões do genoma apresentando aspectos semelhantes à SWB. • Diagnóstico clínico errôneo. Com o advento tecnológico, outras técnicas mais recentes de citogenética molecular passaram a ser utilizadas no diagnóstico da SWB. Como a amplificação multiplex de sondas dependentes de ligação (MLPA), microarranjos de alta densidade (aCGH) e sequenciamento de nova geração (SNG). Essas técnicas novas possuem um maior poder de resolução e têm auxiliado na detecção de alterações genéticas complexas. A MLPA é uma técnica de varredura genômica de alto rendimento e específica, que permite detectar deleções e/ou duplicações no número de cópias (CNVs) em sequências de DNA alvo em uma única reação (RIEGEL et al., 2014). A sua eficácia depende da qualidade do DNA e não é uma técnica capaz de identificar rearranjos balanceados e mosaicismos (HONJO et al., 2015). Os microarranjos de DNA permitem avaliar variações ou alterações de genoma completo. Por isso, pode identificar anomalias cromossômicas raras e a sua resolução irá variar conforme a plataforma utilizada (de dez a centenas de quilobases), ou seja, quanto maior a cobertura do genoma maior será a resolução (BI et al., 2012). As técnicas de microarranjos são eficazes, mas as técnicas de sequenciamento são capazes de detectar variantes ainda mais raras (SHENDURE, 2008). Dentre as diferentes abordagens, o sequenciamento de éxons (Exoma) conquistou espaço como um método de diagnóstico para doenças genéticas. Por exemplo, na identificação de novas mutações em genes relacionados a doenças raras que ainda não possuem bases genéticas esclarecidas (KU et al., 2012). A SWB e outras patologias que apresentam uma ampla heterogeneidade fenotípica podem ter as bases genéticas evidenciadas com o emprego dessa abordagem de Exoma (RABBANI; TEKIN; MAHDIEH, 2014). 18 2. OBJETIVOS 2.1. Geral Realizar triagem genômica de pacientes com diagnóstico clínico de SWB e FISH (-), aplicando técnicas para identificar contribuintes genéticos que se correlacionam com as alterações fenotípicas, a fim de esclarecer o quadro clínico desses pacientes. 2.1.1. Específico Melhorar a acuidade diagnóstica da SWB, para melhorar os critérios clínicos e apoiar o aconselhamento genético para pacientes e familiares 19 3. MATERIAIS E MÉTODOS 3.1. Casuística Dos arquivos do Serviço de Aconselhamento Genético (SAG) foram selecionados 35 indivíduos com diagnóstico clínico da SWB, que foram encaminhados pela Associação Brasileira de Síndrome de Williams (ABSW)(24 casos), São Paulo- SP; Hospital de Base da Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto-SP(5 casos); Departamento de Genética Médica- FCM/UNICAMP (2 casos); Universidade Federal do Rio de Janeiro-RJ (1 caso); Conjunto Hospitalar de Sorocaba (1 caso); Hospital das Clinicas da Faculdade de Medicina de Botucatu (1 caso); Universidade Estadual de Londrina (1 caso). Os pacientes foram avaliados clinicamente e foi proposto aos pais participação nesta pesquisa. A pesquisa foi apresentada e após tirarem todas as dúvidas os responsáveis assinaram o termo de consentimento livre esclarecido em duas vias. Após esse processo os pacientes foram fotografados e o sangue foi coletado para a realização da técnica da FISH e extração do DNA. Para os pacientes encaminhados dos outros centros de genética foi solicitado o envio das amostras de sangue para realização da FISH e extração de DNA, juntamente com tabela de sinais clínicos preenchidos pelos geneticistas desses centros, além de fotografias e os termos de consentimento livre esclarecido assinado pelos pais ou responsáveis. Critérios de inclusão • Diagnóstico clínico para a SWB, estabelecido pela classificação de escore clínico AAP ≥ 3 com base na ficha de anamnese genético-clínico do paciente (ANEXO I); • Análise citogenética negativa para SWB estabelecida pela técnica da FISH com sondas para a região da síndrome envolvendo o gene da ELN segundo protocolo dos fabricantes (CYTOCELL®, VYSIS® e LIVE®). Critérios de exclusão: Contrapor-se à participação no estudo, não assinando o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) e não comparecimento ao retorno quando solicitado novas amostras de DNA. 20 3.2. Aspectos éticos O projeto possui aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da Faculdade de Medicina de Botucatu (FMB-UNESP), sendo este o número de primeiro parecer: 2.370.344 (08 de novembro de 2017)(ANEXO III). O Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) com todas as informações necessárias sobre o estudo foi fornecido aos responsáveis quando o paciente era menor de 18 anos (ANEXO IV) e aos próprios pacientes quando eram maiores de 18 anos. Aos pacientes maiores de 12 anos um termo de assentimento também apresentado com todas as informações compatíveis com a idade do paciente. Uma vez aceita a participação no estudo, os termos foram assinados em duas vias, uma ficando com os responsáveis pela pesquisa e a outra com os pacientes ou responsáveis. Como o diagnóstico clínico é baseado na classificação do escore clínico AAP, é necessário o uso de imagens dos pacientes, com possibilidade futura de publicação. Em vista disso, a autorização foi solicitada juntamente aos TCLEs. 3.3. Avaliação clínica A descrição clínica e fotografias dos pacientes estão no Anexo V. Para estabelecer o diagnóstico clinico da SWB foi utilizado o sistema de pontuação da Associação Americana de Pediatria (AAP, 2001). Segundo esse score quando a pontuação total for < 3, o diagnóstico de SWB é improvável; enquanto pontuações totais ≥ 3 são classificadas como SWB clássicos. AAP (2001) também descreveu curvas antropométricas para a SWB, assim durante a avaliação clínica foram obtidas essas medidas como peso, altura e perímetro cefálico que foram comparadas essas curvas da AAP. 3.4. Análise Molecular Todos os pacientes durante as consultas foram coletados amostras de sangue para a extração de DNA. Assim, as amostras de DNA dos pacientes com SWB do SAG foram armazenadas num banco de amostras. 21 3.4.1. Obtenção do DNA genômico. O DNA foi extraído de uma alíquota de sangue do tubo de 5 ml com EDTA, com o kit comercial de extração de DNA da QIAGEN® (Flexigene Genomic Purification Kit), seguindo o protocolo fornecido pelo fabricante. As amostras de DNA foram quantificadas e qualificadas através de leitura em espectrofotômetros NanoDrop 8000 (Thermo Fisher Scientific). Neste processo utilizou-se de 0,5 até 1,0μl da amostra. As amostras foram armazenadas em freezer a temperatura de -20ºC. 3.4.2. Exoma O exoma foi realizado pela empresa Genewiz-Azenta Life Technologies pela plataforma Illumina NovaSeq™ 6000 Sequencing System e a configuração NovaSeq 2x150 bp S4 lane. As leituras foram alinhadas com o genoma de referência GRCh38. 3.4.2.1. Análise das variantes Para iniciar as análises das variantes, foi utilizado os programas Franklin, by Genoox; e Integrative Genomics Viewer (IGV). No Franklin foram anexados os arquivos .csv e adicionados para todos os pacientes: o ano de nascimento e as características clínicas presentes nas fichas de anamnese seguindo a nomenclatura Human Phenotype Ontology (HPO). As variantes foram selecionadas e aplicadas conjuntos de filtros. O programa IGV foi utilizado para visualizar as variantes. As variantes autossômicas dominantes foram filtradas por um conjunto de filtros que denominamos AD. Os filtros presentes em AD eram: • Frequência agregada: 0-0.1 e N/A • Confiança: alta e média • Características fenotípicas adicionadas • Tipo de herança: autossômica dominante • Zigosidade: heterozigoto 22 • Região: região de splicing (+ ou -3->10), aceitador de splicing (-2), doador de splicing (+2), éxon • Efeito: stop gain, start gain, non-frameshift, start loss, frameshift, stop loss, não sinônima e outro. As variantes autossômicas recessivas também foram filtradas por um conjunto de filtros que denominamos AR. Os filtros presentes em AR eram: • Frequência agregada: 0-0.1 e N/A • Confiança: alta e média • Zigosidade: homozigoto • Região: região de splicing (+ ou -3->10), aceitador de splicing (-2), doador de splicing (+2), éxon • Efeito: stop gain, start gain, non-frameshift, start loss, frameshift, stop loss, não sinônima e outro O programa permite filtrar variantes que podem estar em combinação com outra variante no mesmo gene e assim poder ter alguma importância clínica. Esse filtro procura um par de variantes que possa ser possivelmente relevante em termos de classificação, região, efeito e confiança. • O conjunto de filtros presentes em suspected compound eram: • Frequência agregada: 0-0.1 e N/A • Confiança: alta e média • Zigosidade: homozigoto e heterozigoto • Região: região de splicing (+ ou -3->10), aceitador de splicing (-2), doador de splicing (+2), éxon • Efeito: stop gain, start gain, non-frameshift, start loss, frameshift, stop loss, missense e outro. • Suspected compound het. Os bancos de dados ClinVar, dbSNP, Franklin by Genoox, DECIPHER, UCSC, Ensemble e UniProt foram utilizadas para consultar se as variantes foram relatadas anteriormente, quando sim 23 qual a sua classificação. Enquanto para verificar as frequências populacionais, foram consultados os seguintes bancos: gnomAD v.4.1, BraVE-BIPMed e ABraOM. Sendo os dois últimos da população brasileira. Para a análise de predição computacional foram usados a predição agregada do Franklin by Genoox, que incluem a ferramentas de previsão in-silico: SIFT, FATHMM, DANN, MetaLR, REVEL, MutationAssessor, PolyPhen-2, MutationTaster, SpliceAI, dbscSNV, GERP, GenoCanyon e fitCons. Em conjunto com esses programas também foi utilizado o CADD. A partir das listas de variantes geradas por esses filtros, foi realizada a análise segundo o guideline da ACMG 2015. 24 25 4.RESULTADOS 4.1. Grupo amostral Dos 35 pacientes avaliados clinicamente, 22 eram do sexo masculino e 13 do sexo feminino. A idade no primeiro atendimento variou de um ano a 38 anos; a idade média foi de aproximadamente 11 anos. Ainda com relação a idade no primeiro atendimento em 16 casos a investigação se iniciou com menos de 10 anos, enquanto os demais pacientes, 19, tinham 10 anos ou mais; e desses quatro tinham idade superior a 20 anos. Todos os responsáveis pelos 35 pacientes da presente casuística concordaram em participar desta pesquisa e assinaram o TCLE que consta nos arquivos dos pacientes no SAG. Durante o estudo 13 casos foram eliminados por diferentes motivos (FLUXOGRAMA 1). Fluxograma 1. Desenho do grupo amostral. 26 4.2. Análises moleculares Foram realizados 22 exomas e para apresentar os resultados moleculares agrupamos os casos por hipóteses diagnosticas moleculares. 4.2.1. ARID1B e ARID2- Casos 2 e 16 O exoma do caso 2 revelou a variante NM_001374828.1:c.5715dup no gene ARID1B, essa variante ocorre por duplicação de um nucleotídeo que resulta em uma mudança na leitura, um frameshift, e assim numa proteína truncada. Já o exoma do caso 16 revelou a variante NM_152641.4:c.103A>T, esse SNV resulta em um stop gain no éxon 2 do gene ARID2 (TABELA 1). Ambas as variantes não foram observadas nos bancos de frequência populacionais. A análise baseada no ACMG guideline de 2015 as variantes foram classificadas como: provavelmente patogênicas (PM2 e PVS1). Tabela 1. Caracterização das mutações encontradas nos genes ARID1B e ARID2. Notação HGVS NM_001374828.1:c.5715dup NM_152641.4:c.103A>T Gene ARID1B ARID2 Tipo de variante Indel SNV Cromossomo 6 12 Posição 157.206.486 45.730.054 AA Referência G A AA Alternativo GT T dbSNP ND rs2137959592 Transcrito NM_001374828.1 NM_152641.4 AA mudado p.Lys1906Ter p.Lys35Ter 27 Notação HGVS NM_001374828.1:c.5715dup NM_152641.4:c.103A>T Nucleotídeo c.5715dup c.103A>T Éxon 20 2 Herança ND ND Zigosidade heterozigoto heterozigoto Efeito frameshift stop gain Contagem de Alelos no gnomAD ND ND Frequência alélica no gnomAD ND ND Frequência alélica estimada ND ND REVEL - 0 CADD - 35 Splice AI - 0 Literatura - - Condição (OMIM e herança) Síndrome de Coffin Siris 1 (OMIM #135900; AD) Síndrome de Coffin Siris 6 (OMIM #617808; AD) ClinVar ND ND AA: aminoácido; AD: autossômico dominante; SNV: single nucleotide variant; ND= não descrito Variantes patogênicas em ambos os genes resultam na síndrome de Coffin-Siris. Apesar do fenótipo dessa síndrome ser muito variável, os sinais observados nos pacientes são semelhantes as características clínicas descritas para a síndrome de Coffin-Siris (TABELA 2). 28 Tabela 2. Características clínicas da síndrome de Coffin-Siris e dos casos 2 e 16. Síndrome de Coffin- Siris ARID1B literatura* Caso 2 ARID2 literatura* Caso 16 Ansiedade ND - ND + Deficiência intelectual 32% + 13% + Atraso de desenvolvimento 35% + 41% + Atraso na fala ND ND ND + Não-Verbal 7% ND 0% ND Transtorno do espectro autista 16% ND 0% ND Hipotonia 44% + 38% + Convulsões 13% ND 0% ND Agenesia do corpo caloso 40% ND 13% ND Baixa estatura ND + ND + Escoliose 15% ND 25% ND Voz rouca ND + ND + Defeito do septo cardíaco 12% ND 0% - Constipação crônica 21% ND 25% + Problemas de alimentação ND - ND - Refluxo gastroesofágico 17% ND 25% - Infecções frequentes do trato respiratório superior e inferior (início da vida) ND ND ND + Criptorquidismo (homens) 44% ND 0% ND 29 Síndrome de Coffin- Siris ARID1B literatura* Caso 2 ARID2 literatura* Caso 16 Fácies dismórficas ND + ND + Macrocefalia 24% ND 13% ND Microcefalia 8% - 13% - Testa alta ND - ND + Testa grande ND + ND + Sobrancelhas espessas ND + ND + Fissuras palpebrais inclinadas para baixo ND - ND ND Epicanto ND - ND - Cílios longos ND + ND - Ptose 13% ND 0% + Estrabismo 31% - 13% - Orelhas rotacionadas posteriormente ND - ND ND Orelhas de inserção baixa ND - ND - Ponte nasal plana ND + ND - Ponta nasal larga ND + ND + Filtro proeminente ND + ND + Filtro curto ND - ND - Boca grande ND + ND + Lábio inferior espesso ND + ND - 30 Síndrome de Coffin- Siris ARID1B literatura* Caso 2 ARID2 literatura* Caso 16 Lábio superior fino ND + ND - Micrognatia ND + ND + Hipertricose (diminui com a idade em alguns pacientes) 62% ND 13% ND Esparso cabelo do couro cabeludo 48% ND 63% ND Unhas hipoplásicas ND + ND ND Hipoplasia da falange distal 33% ND 13% ND *Vasko et al., 2021; ND= não descrito. 4.2.2. KAT6A- Caso 13 O exoma do caso 13 revelou uma variante no gene KAT6A, NM_006766.5:c.499T>C, que está presente na população em baixíssima frequência. Por se tratar de uma variante não sinônima foi realizada a análise de predição computacional e essa indicou que a variante é provavelmente patogênica (TABELA 3). Tabela 3. Caracterização da variante encontrada no gene KAT6A. Notação HGVS NM_006766.5:c.499T>C Gene KAT6A Tipo de variante SNV Cromossomo 8 Posição 42,048,478 AA Referência A 31 Notação HGVS NM_006766.5:c.499T>C AA Alternativo G dbSNP ND Transcrito NM_006766.5 AA mudado p.Tyr167His Nucleotídeo c.499T>C Éxon 2 Herança ND Zigosidade heterozigoto Efeito não sinônimo Contagem de Alelos no gnomAD 1 Frequência alélica no gnomAD 6.20e-7 Frequência alélica estimada ND REVEL 0.469 CADD 28.1 Splice AI 0.03 Literatura ND Condição (OMIM e herança) Síndrome de Arboleda-Tham (OMIM #616268; AD) ClinVar ND AA: aminoácido; AD: autossômico dominante; SNV: single nucleotide variant; ND= não descrito 32 A síndrome de Arboleta-Tham (SARTH) é causada por mutações heterozigotas no gene KAT6A. Essas mutações podem ser não sinônimas, frameshift e stop gain. Essa síndrome é caracterizada pela deficiência intelectual, atraso na fala, microcefalia, problemas cardíacos e complicações gastrointestinais. Tais características são compatíveis com os sinais observados no caso 13 (TABELA 4). Tabela 4. Características clínicas da síndrome de Arboleda-Tham. Características da síndrome de Arboleda-Tham Total de casos, excluindo as não sinônimas (70)* Casos com mutação não sinônimas (6)* Total casos (76)* Caso 13 Sexo F=35; M=35 F=2; M=4 F=37; M=39 M Microcefalia 32% 20% 31% + Deficiência Intelectual 100% 100% 100% + Hipotonia 75% 83% 76% + Convulsões 9% 17% 9% ND Atraso na fala 100% 100% 100% + Estrabismo 56% 20% 54% - Ptoses 18% 0% 16% ND Deficiência Visual 65% 33% 63% ND Ponta nasal larga 87% 60% 85% + Lábio superior fino 68% 50% 67% + Dificuldades alimentares 79% 67% 78% - 33 Características da síndrome de Arboleda-Tham Total de casos, excluindo as não sinônimas (70)* Casos com mutação não sinônimas (6)* Total casos (76)* Caso 13 Refluxo 65% 50% 60% - Constipação 51% 50% 51% + Defeito cardíaco congênito 56% 0% 51% + Infecções recorrentes 50% 20% 47% + Problemas comportamentais 33% 100% 39% - Distúrbios de sono 36% 50% 37% ND * Kennedy et al., 2019; ND= não descrito. 4.2.3. PTPN11- Caso 19 O exoma do caso 19 identificou a variante patogênica NM_002834.5:c.922A>G no gene PTPN11, essa variante não sinônima foi observada em baixa frequência na população e já foi descrita como patogênica na literatura (TABELA 5). Tabela 5. Caracterização da variante encontrada no gene PTPN11. Notação HGVS NM_002834.5:c.922A>G Gene PTPN11 Tipo de variante SNV Cromossomo 12 Posição 112,477,718 AA Referência A AA Alternativo G dbSNP rs28933386 Transcrito NM_002834.5 AA mudado p.Asn308Asp 34 Notação HGVS NM_002834.5:c.922A>G Nucleotídeo c.922A>G Éxon 8 Herança ND Zigosidade Heterozigoto Efeito Não sinônimo Contagem de Alelos no gnomAD 12 Frequência alélica no gnomAD 0.000007443 Frequência alélica estimada 0.00000124 REVEL 0.838 CADD 24.5 Splice AI 0.02 Literatura + Condição (OMIM e herança) Síndrome de Noonan (OMIM #163950; AD) ClinVar Patogênica e provavelmente patogênica AA: aminoácido; AD: autossômico dominante; SNV: single nucleotide variant; ND= não descrito Mutações no gene PTPN11 foram relatadas na literatura na síndrome de Noonan, essa condição autossômica dominante caracterizada pela baixa estatura, dismorfismos faciais, problemas cardíacos, pescoço pequeno e criptorquidismo nos homens. O fenótipo é semelhante ao apresentado pela paciente (TABELA 6). Tabela 6. Características clínicas da síndrome de Noonan de pacientes com alterações no gene PTPN11. Características clínicas da síndrome de Noonan PTPN11 (N=50)* Caso 19 Atraso no desenvolvimento 9 - Dificuldades de alimentação 13 + Incapacidade de prosperar na infância ND + 35 Características clínicas da síndrome de Noonan PTPN11 (N=50)* Caso 19 Baixa estatura (início pós-natal) 37 + Perda auditiva neurossensorial 10 ND Cabelos grossos e cacheados ou cabelos finos e ralos 19 ND Linha fina posterior baixa 30 ND Macrocefalia relativa 25 ND Rosto triangular (com a idade) ND + Orelhas baixas 36 + Sobrancelha esparsa 30 - Anormalidades oculares 8 + Ptose 46 ND Hipertelorismo 46 ND Fissuras palpebrais inclinadas 37 ND Epicanto 22 + Filtro profundamente sulcado 13 - Picos altos da borda do lábio superior 45 ND Paladar alto e arqueado 40 ND Má oclusão dentária ND + Micrognatia 25 + Excesso de pele nucal 9 ND Pescoço curto e alado 25 - Defeito cardíaco congênito 41 + Cardiomiopatia hipertrófica obstrutiva 7 ND Defeitos do septo atrial 30 ND Defeitos do septo ventricular 5 ND Estenose da válvula pulmonar 21 ND Persistência do canal arterial 3 ND Insuficiência mitral 4 ND Regurgitação tricúspide 2 ND Outros problemas cardíacos 6 + Deformidade torácica 33 ND Pectus carinatum superiormente 12 ND Pectus excavatum inferiormente 16 ND 36 Características clínicas da síndrome de Noonan PTPN11 (N=50)* Caso 19 Tumores 5 ND Anormalidade renal 3 ND Defeitos de coagulação 2 ND *Xi et al., 2019; ND= não descrito. 4.2.4. GJA1- Caso 22 O exoma do caso 22 identificou uma mutação no gene GJA1, NM_000165.5:c.1126C>T. Essa variante não sinônima está presente em baixa frequência na população e por se tratar de uma variante não sinônima foi realizada a análise de predição computacional e essa indicou que a variante é provavelmente patogênica (TABELA 7). Tabela 7. Caracterização da variante encontrada no gene GJA1. Notação HGVS NM_000165.5:c.1126C>T Gene GJA1 Tipo de variante SNV Cromossomo 6 Posição 121.447.972 AA Referência C AA Alternativo T dbSNP rs1212579631 Transcrito NM_000165.5 AA mudado p.Arg376Trp Nucleotídeo c.1126C>T Éxon 2 Herança ND Zigosidade Heterozigoto Efeito Não sinônimo Contagem de Alelos no gnomAD 7 Frequência alélica no gnomAD 0,000004339 37 Frequência alélica estimada 6,80E-07 REVEL 0,61 CADD 27,6 Splice AI 0 Literatura + Condição (OMIM e herança) Displasia Oculodentodigital (OMIM #164200; AD) ClinVar VUS AA: aminoácido; AD: autossômico dominante; SNV: single nucleotide variant; ND= não descrito Mutações no gene GJA1 está relacionada com a displasia oculodentodigital (DODD) e variante NM_000165.5:c.1126C>T já foi relatada na literatura na DODD. Além disso, a paciente possui sinais clínicos semelhantes a DODD (TABELA 8). Tabela 8. Características clínicas da DODD. Características clínicas Casos de ODDD* Caso 22 Deficiência intelectual 7/161 + Microcornea 55/161 ND Microftalmia 21/161 ND Glaucoma 26/161 ND Anomalias da íris 31/161 ND Características de crânio-face 105/161 + Dentes 69/161 + Problemas cardíacos 6/161 ND Membros 118/161 + *Huang et al., 2015; ND: não descrito. 4.2.5. KAT6B- Caso 9 O exoma do caso 9 revelou a variante NM_012330.4:c.3519_3523dup. A adição de cinco nucleotídeos e resulta em um frameshift. Essa variante é provavelmente patogênica, se encontra no gene KAT6B e esta ausente na população (TABELA 9). 38 Tabela 9. Caracterização da variante encontrada no gene KAT6B. Notação HGVS NM_012330.4:c.3519_3523dup Gene KAT6B Tipo de variante Indel Cromossomo 10 Posição 75,025,101 AA Referência G AA Alternativo GAGCCT dbSNP ND Transcrito NM_012330.4 AA mudado p.Thr1175Serfs*17 Nucleotídeo c.3519_3523dup Éxon 10 Herança ND Zigosidade Heterozigoto Efeito Não sinônimo Contagem de Alelos no gnomAD 0 Frequência alélica no gnomAD ND Frequência alélica estimada ND 39 Notação HGVS NM_012330.4:c.3519_3523dup REVEL - CADD - Splice AI 0.03 Literatura ND Condição (OMIM e herança) Síndrome Say-Barber-Biesecker- Young-Simpson (OMIM #603736; AD) ClinVar ND AA: aminoácido; AD: autossômico dominante; SNV: single nucleotide variant; ND= não descrito O gene KAT6B está relacionado com duas síndromes, a Genitopatelar (OMIM 606170) e a Síndrome Say-Barber-Biesecker-Young-Simpson (SBBYSS). Ambas as condições são autossômicas dominantes e possuem características clínicas semelhantes. O paciente 9 possui características clínicas semelhantes a síndrome de SBBYSS (TABELA 10) e não possui alterações em genital e em patela. Tabela 10. Características clínicas da síndrome de SBBYSS. Características clínicas Síndrome SBBYSS* Caso 9 Gênero M Microcefalia + + Occipital proeminente + ND Fácies dismórficas NR + Micrognatia + + 40 Características clínicas Síndrome SBBYSS* Caso 9 Orelhas baixas + ND Orelhas anguladas posteriormente + ND Blefarofimose + ND Epicanto inverso + ND Ponte nasal plana + + Nariz bulboso + + Fissura orofacial + ND Dentes pequenos + ND Cardiomiopatia dilatada + ND Defeitos cardíacos estruturais + ND Criptorquidia + ND Clinodactilia do quinto dedo + ND Retardo psicomotor grave ND + Hipotonia + + Desenvolvimento intelectual prejudicado, leve a grave ND + Marcos motores atrasados + + Fala prejudicada + + Hipotireoidismo + ND *As características clínicas foram retiras do OMIM; ND= não descrito. 41 4.2.6. NAA15-Caso 4 O exoma do caso 4 identificou uma variante provavelmente patogênica NM_057175.5:c.2133T>A no gene NAA15, essa variante resulta em um stop gain, que produz uma proteína truncada. Além de estar ausente na população (TABELA 11). Tabela 11. Caracterização das variantes encontradas nos genes NAA15. Notação HGVS NM_057175.5:c.2133T>A Gene NAA15 Tipo de variante SNV Cromossomo 4 Posição 139,378,832 AA Referência T AA Alternativo A dbSNP ND Transcrito NM_057175.5 AA mudado p.Cys711Ter Nucleotídeo c.2133T>A Éxon 17 Herança ND Zigosidade Heterozigoto Efeito Stop gain Contagem de Alelos no gnomAD 0 42 Notação HGVS NM_057175.5:c.2133T>A Frequência alélica no gnomAD ND Frequência alélica estimada ND REVEL - CADD 38 Splice AI 0.14 Literatura ND Condição (OMIM e herança) Transtorno do desenvolvimento intelectual, autossômico dominante 50, com anormalidades comportamentais (OMIM # 617787; AD) ClinVar ND AA: aminoácido; AD: autossômico dominante; SNV: single nucleotide variant; ND= não descrito O gene NAA15 é conhecido por causar Transtorno do desenvolvimento intelectual, autossômico dominante 50, com anormalidades comportamentais (MRD50) (OMIM 617787), um distúrbio autossômico cujas características clínicas se a semelham ao fenótipo do paciente 4 (TABELA 12). Tabela 12. Características clínicas da MRD50. Características clínicas de MRD50* Caso 4 Gênero M 43 Características clínicas de MRD50* Caso 4 Baixa estatura (em alguns pacientes) + Atraso no crescimento + Faces dismórficas, inespecíficas, variáveis (em alguns pacientes) + Filtro amplo + Deficiência auditiva (em alguns pacientes) ND Sobrancelhas espessas - Fissuras palpebrais inclinadas para baixo ND Estrabismo (em alguns pacientes) - Astigmatismo (em alguns pacientes) ND Deficiência visual cortical (raro) ND Síndrome do QT longo (em alguns pacientes) ND Dificuldades de alimentação - Disfagia (em alguns pacientes) ND Atraso do desenvolvimento + Desenvolvimento intelectual prejudicado, variável + Atraso do motor + Hipotonia + Atraso de fala + Discurso limitado ND Convulsões (em alguns pacientes) ND 44 Características clínicas de MRD50* Caso 4 RM anormal (em alguns pacientes) ND Transtorno do espectro do autismo ND Características autistas ND Problemas comportamentais + Distúrbio do sono ND *As características clínicas foram retiras do OMIM; ND= não descrito. 4.2.7. MED13L- Caso 5 O exoma do caso 5 identificou uma variante frameshift no gene MED13L. A NM_015335.5:c.3857dup leva a adição de um nucleotídeo que altera a matriz leitura e não foi relatada nos bancos de dados populacionais (TABELA 13). Tabela 13. Caracterização da variante encontrada no gene MED13L. Notação HGVS NM_015335.5:c.3857dup Gene MED13L Tipo de variante Indel Cromossomo 12 Posição 115,991,096 AA Referência C AA Alternativo CA dbSNP ND Transcrito NM_015335.5 AA mudado p.Asp1287Glyfs*2 Nucleotídeo c.3857dup Éxon 17 Herança ND Zigosidade Heterozigoto Efeito Frameshift 45 Notação HGVS NM_015335.5:c.3857dup Contagem de Alelos no gnomAD 0 Frequência alélica no gnomAD ND Frequência alélica estimada ND REVEL - CADD - Splice AI 0.25 Literatura ND Condição (OMIM e herança) Desenvolvimento intelectual prejudicado e características faciais distintas com ou sem defeitos cardíacos (6 OMIM #16789; AD) ClinVar ND AA: aminoácido; AD: autossômico dominante; SNV: single nucleotide variant; ND= não descrito O gene MED13L foi relacionado a uma condição chamada de Desenvolvimento intelectual prejudicado e características faciais distintas com ou sem defeitos cardíacos (MRFACD), tal fenótipo é semelhante ao caso 5 (TABELA 14). Tabela 14. Características clínicas da MRFACD. Características Clínicas da MRFACD Casos da literatura Caso 5 Gênero M Atraso de desenvolvimento ou deficiência intelectual 70/70 ND Atraso na fala 69/70 ND Hipotonia 47/67 ND 46 Problemas de coordenação 21/61 ND Defeitos congênitos do coração 12/64 + Características do autismo 16/69 ND Ressonância magnética cerebral anormal 27/59 ND Convulsões 10/63 ND Problemas comportamentais 17/52 ND Estrabismo 4/25 - Assimetria de face ND + Braquicefalia ND ND Plagiocefalia ND ND Frontal bossing ND ND Face triangular ND - Estreitamento bitemporal 8/33 ND Sobrancelhas horizontais 8/34 ND Orelhas grandes ND + Orelhas de inserção baixa 17/33 ND Fissuras palpebrais ascendentes 27/66 ND Hipertelorismo ND + Testa larga/proeminente 17/22 + Ponta nasal bulbosa 51/68 + Ponte nasal deprimida/plana 20/34 + Boca aberta hipotônica ND ND Macrostomia 15/35 ND Macroglossia 9/33 ND *Dawidziuk et al., 2021 ou 2020; ND= não descrito. 4.2.8. Caso 12- TRRAP No caso 12, o exoma identificou uma mutação do gene TRRAP. A variante é não sinônima, NM_001375524.1:c.2759A>G e foi observar em baixa frequência na população (TABELA 14). Tabela 15. Caracterização da variante encontrada no gene TRRAP. 47 Notação HGVS NM_001375524.1:c.2759A>G Gene TRRAP Tipo de variante SNV Cromossomo 7 Posição 98,921,888 AA Referência A AA Alternativo G dbSNP rs1789812683 Transcrito NM_001375524.1 AA mudado p.Gln920Arg Nucleotídeo c.2759A>G Éxon 21 Herança ND Zigosidade Heterozigoto Efeito Não sinônimo Contagem de Alelos no gnomAD 1 Frequência alélica no gnomAD 6.20e-7 Frequência alélica estimada ND REVEL 0.248 CADD 20.2 Splice AI 0.01 Literatura ND Condição (OMIM e herança) Atraso no desenvolvimento com ou sem face dismórficas e autismo (OMIM #618454; AD) ClinVar ND AA: aminoácido; AD: autossômico dominante; SNV: single nucleotide variant; ND= não descrito 48 Mutações nesse gene foram relacionadas a uma condição cujo fenótipo é semelhante ao do paciente. O Atraso no desenvolvimento com ou sem face dismórficas e autismo (DEDDFA) é um distúrbio autossômico dominante (TABELA 16). Tabela 16. Características clínicas da síndrome de DEDDFA. Características clínicas Casos da literatura de DEDDFA (n=24)* Caso 12 Atraso global no desenvolvimento 100% + Deficiência intelectual 85% + Dismorfismos faciais 79% + Transtorno do espectro do autismo 21% ND Microcefalia (<-2,5 DP) 29% + Baixa estatura 30% + Hipotonia 33% + Dificuldades de alimentação 33% + Convulsões 21% ND Fissura labiopalatina 21% ND Hipoplasia cerebelar 33% ND Anormalidades cerebrais 33% ND Malformações cardíacas 66% + Malformações renais 29% ND Malformações genitais 21% ND 49 Deficiência auditiva 12% ND Deficiência visual 17% ND Filtro curto ND + Epicanto ND + Ponte nasal deprimida ND + Nariz curto ND + Boca grande ND + Atraso na fala ND + *Cognè et al., 2019 e OMIM; DN= não descrito 4.2.9. Caso 17- RFX7 O exoma do caso 17 indicou a presença de uma mutação no gene RFX7. A mutação NM_022841.7:c.812G>T é não sinônima, esta presente na população em baixa frequência e a predição computacional sugere que é patogênica (TABELA 17). Tabela 17. Caracterização da variante encontrada no gene RFX7. Notação HGVS NM_022841.7:c.812G>T Gene RFX7 Tipo de variante SNV Cromossomo 15 Posição 56,098,375 AA Referência C AA Alternativo A dbSNP rs750353636 50 Notação HGVS NM_022841.7:c.812G>T Transcrito NM_022841.7 AA mudado p.Gly271Val Nucleotídeo c.812G>T Éxon 9 Herança ND Zigosidade Heterozigoto Efeito Não sinônimo Contagem de Alelos no gnomAD 9 Frequência alélica no gnomAD 0.000005688 Frequência alélica estimada 0.0000025 REVEL 0.253 CADD 33 Splice AI 0.42 Literatura ND Condição (OMIM e herança) Transtorno do desenvolvimento intelectual, autossômico dominante 71, com anormalidades comportamentais (OMIM #620330) ClinVar ND AA: aminoácido; AD: autossômico dominante; SNV: single nucleotide variant; ND= não descrito 51 Esse gene está relacionado com o Transtorno do desenvolvimento intelectual, autossômico dominante 71, com anormalidades comportamentais (MRD71), cujo fenótipo possui semelhanças ao fenótipo da paciente 17 (TABELA 18). Tabela 18. Características clínicas do transtorno MRD71. Características Clínicas do MRD71 Caso 17 Gênero F Macrocefalia - Microcefalia + Plagiocefalia ND Braquicefalia ND Dismorfismos faciais + Frontal bossing ND Hipoplasia Malar + Micrognatia + Filtro longo + Orelhas proeminentes + Orelhas rotadas posteriormente ND Telecanto ND Fissuras palpebrais viradas para cima ND Atrofia ótica ND Nistagmo ND Ponta nasal larga - Arco do palato alto ND Lábio superior fino + Dificuldades alimentares + Criptorquidismo - Hiperlaxidade articular ND Clinodactilia + 52 Características Clínicas do MRD71 Caso 17 Dedos longos ND Atraso global no desenvolvimento + Hipotonia + Atraso motor ND Atraso de fala + Deficiência intelectual + Convulsões - Movimentos Hipercinéticos ND Anormalidades na imagem cerebral ND Transtorno do espectro do autismo ND TDAH + Agressão ND Hipersensibilidade ND Desregulação emocional ND Mudanças de humor ND Automutilação ND Ansiedade + Distúrbios do sono ND *As características clínicas foram retiras do OMIM; ND= não descrito. 4.2.10. CLIP2- Caso 10 O exoma do caso 10 identificou uma variante não sinônima, que esta presente na população e a predição computacional é provavelmente benigna (TABELA 19). 53 Tabela 19. Caracterização da variante do gene CLIP2. Notação HGVS NM_003388.5:c.445C>A Gene CLIP2 Tipo de variante SNV Cromossomo 7 Posição 74.338.770 AA Referência C AA Alternativo A dbSNP rs200574175 Transcrito NM_003388.5 AA mudado p.Pro149Thr Nucleotídeo c.445C>A Éxon 3 Herança ND Zigosidade Heterozigoto Efeito Não sinônimo Contagem de Alelos no gnomAD 339 Frequência alélica no gnomAD 0.0002108 Frequência alélica estimada 0,004566 REVEL 0,284 CADD 21,5 Splice AI 0 Literatura ND Condição (OMIM e herança) - ClinVar VUS AA: aminoácido; AD: autossômico dominante; SNV: single nucleotide variant; VUS: variant of uncertain significance; ND= não descrito 54 Esse gene está localizado na região crítica da SWB e o paciente possui o fenótipo da condição, com escore da AAP igual a 8 (TABELA 20). Tabela 20. Características clínicas da síndrome de Williams-Beuren. Características da síndrome de Williams-Beuren Caso 10 Gênero M Atraso no desenvolvimento + Limitação ou frouxidão articular + Personalidade excessivamente amigável + Ansiedade + Problema visuoespacial ND Hipersensibilidade ao som + Atraso na aquisição da fala, seguido de fala excessiva + Voz rouca + Deficiência de crescimento/altura e peso - Dificuldade de alimentação + Vômito ou refluxo gastroesofágico + Cólica prolongada > irritabilidade 4m ND Constipação crônica + Hérnia umbilical ou inguinal + Problemas cardiovasculares - Problemas respiratórios - Otite recorrente - Problemas musculoesqueléticos ND Problemas renais - Hipertensão + Hipercalcemia - Hipercalciuria ND Microcefalia + Testa Alargada - 55 Características da síndrome de Williams-Beuren Caso 10 Lóbulos das orelhas proeminentes - Orelhas grandes e salientes - Estreitamento bitemporal + Sobrancelha larga + Plenitude periorbital + Estrabismo (presente ou passado) + Padrão de íris rendada estrelada + Epicanto ou ponte nasal plana - Filtro longo + Nariz curto ou narinas antevertidas + Ponta nasal bulbosa ou cheia - Hipoplasia malar + Bochechas cheias + Boca grande - Lábios carnudos e proeminentes - Anomalias dentárias - Queixo pequeno - Clinodactilia do 5º dígito + Hálux valgo ND Hipoplasia ungueal ND AAP (>3) 8 ND=não descrito. 4.2.11. Casos sem hipótese diagnóstica molecular 4.2.11.1. Casos complexos Os casos complexos são os casos 1, 3 e 20. Nesses casos foram analisadas todas as variantes geradas a partir dos filtros e mais de uma variante de interesse clínico foi identificada, e descritas na Tabela 21, 22 e 23. Tabela 21. Caracterização das variantes encontradas no caso 1. 56 Caso 1 Notação HGVS NM_001374828.1:c.2753G>T NM_001278939.2:c.1382G>C Gene ARID1B ELN Tipo de variante SNV SNV Cromossomo 6 7 Posição 157,133,199 74,057,405 AA Referência G G AA Alternativo T C dbSNP rs138934947 rs1011146056 Transcrito NM_001374828.1 NM_001278939.2 AA mudado p.Gly918Val p.Gly461Ala Nucleotídeo c.2753G>T c.1382G>C Éxon 7 22 Herança Paterna Materna Zigosidade Heterozigoto Heterozigoto Efeito Não sinônima Não sinônima Contagem de Alelos no gnomAD 3 45 Frequência alélica no gnomAD 0.000001874 0.00002977 Frequência alélica estimada 0.00000448 0.0003254 REVEL 0.472 0.136 CADD 32 14.53 Splice AI 0.25 0.1 Literatura ND ND Condição (OMIM e herança) Síndrome de Coffin-Siris (OMIM #135900; AD) Cutis laxa, autossômica dominante (OMIM #123700; AD) Estenose aórtica supravalvar (OMIM #185500; AD) ClinVar ND VUS 57 AA: aminoácido; AD: autossômico dominante; SNV: single nucleotide variant; VUS: variant of uncertain significance; ND= não descrito. Tabela 22. Caracterização das variantes encontradas no caso 3. Caso 3 Notação HGVS NM_017528.5:c.190A>G NM_030665.4:c.1340A>G Gene BUD23 RAI1 Tipo de variante SNV SNV Cromossomo 7 17 Posição 73,686,824 17,794,288 AA Referência A A AA Alternativo G G dbSNP rs952219068 rs1159066427 Transcrito NM_017528.5 NM_030665.4 AA mudado p.Thr64Ala p.Asn447Ser Nucleotídeo c.190A>G c.1340A>G Éxon 4 3 Herança ND ND Zigosidade Heterozigoto Heterozigoto Efeito Não sinônima Não sinônima Contagem de Alelos no gnomAD 0 4 Frequência alélica no gnomAD ND 0.00000248 Frequência alélica estimada ND 0.00002255 REVEL 0.369 0.245 CADD 14.05 16.8 Splice AI 0 0 Literatura ND ND 58 Caso 3 Notação HGVS NM_017528.5:c.190A>G NM_030665.4:c.1340A>G Condição (OMIM e herança) - Síndrome de Smith-Magenis (OMIM #182290; AD) ClinVar ND VUS AA: aminoácido; AD: autossômico dominante; SNV: single nucleotide variant; VUS: variant of uncertain significance; ND= não descrito. 59 Tabela 23. Caracterização das variantes encontradas no caso 20. Caso 20 Notação HGVS NM_030665.4:c.21G>T NM_001379200.1:c.1310G>C NM_001374828.1:c.4834C>T NM_016628.5:c.475A>T Gene RAI1 TBX1 ARID1B WAC Tipo de variante SNV SNV SNV SNV Cromossomo 17 22 6 10 Posição 17,792,969 19,766,662 157,201,059 28,589,829 AA Referência G G C A AA Alternativo T C T T dbSNP ND ND rs1467542976 ND Transcrito NM_030665.4 NM_001379200.1 NM_001374828.1 NM_016628.5 AA mudado p.Arg7Ser p.Gly437Ala p.Pro1612Ser p.Lys159Ter Nucleotídeo c.21G>T c.1310G>C c.4834C>T c.475A>T Éxon 3 7 18 5 Herança ND ND ND ND Zigosidade Heterozigoto Heterozigoto Heterozigoto Heterozigoto Efeito Não sinônima Não sinônima Não sinônima stop gain Contagem de Alelos no gnomAD 0 1 2 0 Frequência alélica no gnomAD ND 6.44E-07 0.000001239 ND 60 Caso 20 Notação HGVS NM_030665.4:c.21G>T NM_001379200.1:c.1310G>C NM_001374828.1:c.4834C>T NM_016628.5:c.475A>T Frequência alélica estimada ND ND 0.00000365 ND REVEL 0.228 0.371 0.152 - CADD 26.2 23 19.61 37 Splice AI 0.01 0 0 0 Literatura ND ND ND ND Condição (OMIM e herança) Síndrome de Smith-Magenis (OMIM #182290; AD) Síndrome de DiGeorge (OMIM #188400; AD); Síndrome Velocardiofacial (OMIM #192430; AD) Síndrome de Coffin-Siris (OMIM #135900; AD) Síndrome de Desanto- Shinawi (OMIM #616708; AD) ClinVar ND ND ND ND AA: aminoácido; AD: autossômico dominante; SNV: single nucleotide variant; VUS: variant of uncertain significance; ND= não descrito 61 As características clínicas da SWB que foram identificadas nesses casos, quando esta afecção estava sendo investigada encontram-se na Tabela 24. Tabela 24. Características clínicas da SWB dos casos complexos. Características da síndrome de Williams- Beuren Caso 1 Caso 3 Caso 20 Gênero M M M Atraso no desenvolvimento + + + Limitação ou frouxidão articular + + + Personalidade excessivamente amigável - + + Ansiedade + + + Problema visuoespacial ND ND ND Hipersensibilidade ao som ND ND + Atraso na aquisição da fala, seguido de fala excessiva - - + Voz rouca - + + Deficiência de crescimento/altura e peso - + + Dificuldade de alimentação - + + Vômito ou refluxo gastroesofágico - - ND Cólica prolongada > irritabilidade 4m ND ND ND Constipação crônica - - - Hérnia umbilical ou inguinal - - - Problemas cardiovasculares - - + 62 Características da síndrome de Williams- Beuren Caso 1 Caso 3 Caso 20 Problemas respiratórios - - + Otite recorrente - + + Problemas musculoesqueléticos ND ND + Problemas renais - - - Hipertensão - - - Hipercalcemia + - ND Hipercalciuria ND ND ND Microcefalia - + + Testa Alargada + + + Lóbulos das orelhas proeminentes - + ND Orelhas grandes e salientes + + + Estreitamento bitemporal + + - Sobrancelha larga - - - Edema periorbital + + - Estrabismo (presente ou passado) + + + Padrão de íris rendada estrelada - + + Epicanto ou ponte nasal plana + + + Filtro longo + + + Nariz curto ou narinas antevertidas + + + Ponta nasal bulbosa ou cheia + + + Hipoplasia malar + + + 63 Características da síndrome de Williams- Beuren Caso 1 Caso 3 Caso 20 Bochechas proeminentes + + + Boca grande + + + Lábios cheios e proeminentes + + + Anomalias dentárias + + + Micrognatia + + + clinodactilia do 5º dígito ND - + Hálux valgo ND - ND Hipoplasia ungueal - + ND AAP (>3) 5 6 7 4.2.12.2. Casos para análises mais aprofundadas. Em alguns casos, como os casos 6, 7, 8, 10, 11, 14, 15, 18 e 21, todas as variantes geradas a partir dos filtros foram analisadas e nenhuma variante provavelmente patogênica foi observada, principalmente para doenças autossômicas dominantes. Assim, esses casos seguirão sendo estudados. 64 5. DISCUSSÃO A técnica da FISH é um dos exames padrão ouro para diagnóstico laboratorial da SWB. Dos pacientes com diagnóstico clínico da SWB, 96% possuem o exame da FISH (+); porém 4% destes são FISH (-). O presente trabalho procurou elucidar o diagnóstico de 35 casos com FISH (-). No transcorrer do estudo 13 pacientes saíram do grupo amostral por diversas razões. Assim, o estudo foi realizado com um grupo amostral 22 casos. Nestes pacientes foram realizados o exoma, por Sequenciamento de Nova Geração (SNG). Foram encontradas mutações que explicavam o fenótipo em dez pacientes. Três casos foram considerados de diagnóstico complexos, por apresentarem mais de uma variante patogênica ou provavelmente patogênica. Por fim, em nove pacientes não foi possível localizar mutações patogênicas ou provavelmente patogênicas nas análises dos programas Franklin e IGV. 65 As mutações patogênicas e provavelmente patogênicas correlacionadas a fenótipos clínicas foram: Síndrome de Coffin-Siris (SCS, OMIM#135900): é uma afecção autossômica dominante, caracterizada por atraso de desenvolvimento, dismorfismos faciais, hipoplasia de quinto dígito, unhas hipoplásicas, hipotonia, hipertricose e escassez de cabelo no couro cabeludo. (SCHRIER VERGANO; SANTEN; WIECZOREK, 2013). Essa síndrome é causada por mutações em heterozigose nos genes do complexo BAF (Brahma/BRG1-associated fator): ARID1A, ARID1B, ARID2, DPF2, SMARCA4, SMARCB1, SMARCC2, SMARCE1, SOX11 e SOX4 (VASKO; DRIVAS; SCHRIER VERGANO, 2021). A SCS possui diversas características clínicas e faciais que se sobrepõe com as observadas na SWB (FIGURA X e XX). Figura 2. Diagrama de Venn com as características clínicas da síndrome de Williams-Beuren e da síndrome de Coffin-Siris. 66 Figura 3. Diagrama de Venn com as características faciais da síndrome de Williams-Beuren e da síndrome de Coffin-Siris. No grupo amostral o paciente 2 tem a mutação em heterozigose, NM_001374828.1:c.5715dup no gene ARID1B(OMIM #614556), que resulta em proteína truncada, p.Lys1906Ter. Essa mutação está localizada no éxon 20, onde se localiza várias variantes patogênicas que já foram relatadas (VASKO; DRIVAS; SCHRIER VERGANO, 2021). O fenótipo da SCS e o caso 2 se sobrepõem nos seguintes sinais clínicos: deficiência intelectual, atraso de desenvolvimento, hipotonia, unhas hipoplásicas, voz rouca e nos dismorfismos faciais, testa grande, sobrancelhas espessas, cílios longos, ponte nasal plana, ponta nasal larga, filtro proeminente, boca grande com lábio inferior espesso e lábio superior fino e micrognatia. No caso 16 o exoma revelou uma mutação em heterozigose em outro gene relacionado a SCS, NM152641.4:c.103A>T em ARID2 (OMIM #609539). Essa mutação resulta em um códon de parada no éxon 2 desse gene, que leva a uma proteína truncada, p.Lys35Ter. Assim como o caso 02, o paciente 16 possui diversos sinais clínicos que combinam com a SCS entre eles: ansiedade, deficiência intelectual, atraso de desenvolvimento, atraso na fala, hipotonia, infecções frequentes, voz rouca e os dismorfismos faciais, testa grande e alta, sobrancelhas espessas, ptose, ponta nasal larga, filtro proeminente, boca grande e micrognatia Assim, a hipótese diagnóstica de síndrome de Coffin-Siris foi estabelecida para ambos os casos, 02 e 16. 67 Síndrome de Arboleda-Tham (SARTH, MIM #616268): é uma doença genética causada por mutações em KAT6A(OMIM # 601408). Esse gene pertence à família MYST de histonas acetil transferaseses e possui um domínio MYST altamente conservado (Avv...., 2007). As variantes patogênicas no gene KAT6A já foram relatadas na literatura e fenótipo analisado por Kennedy, 2019. O exoma do caso 13 identificou uma mutação heterozigota não sinônima, NM_006766.5:c.499T>C (p.Tyr167His). Essa mutação é no éxon 2. Por se tratar de uma mutação não sinônima foi realizada a análise de predição computacional e esta sugere que a mutação é patogênica. O fenótipo do paciente é compatível com o descrito para esta síndrome. Incluindo microcefalia, atraso de desenvolvimento, deficiência intelectual, hipotonia, atraso na fala, ponta nasal larga, lábio superior fino, constipação, defeito cardíaco congênito e infecções recorrentes. Devido a essa sobreposição de sinais e a presença dessa mutação provavelmente patogênica, a hipótese diagnóstica para o paciente 13 é a síndrome Arboleda-Tham. Síndrome de Noonan (SN, OMIM #163950): é uma patologia caracterizada por dismorfismos faciais, baixa estatura e diversos tipos de cardiopatias, além dessas características a deficiência intelectual também pode ser encontrada. O gene PTPN11(OMIM #176876) codifica uma proteína que faz parte da via de sinalização RAS-MAPK(RASmitogen activate protein kinase), e é muito conservada (Pawson et al., 1999; Tajan et al., 2015). Mutações em PTPN11 são as mais observadas nos portadores da SN (Tartaglia et al., 2001; Tartaglia et al., 2002). O exoma da paciente 19 identificou a mutação NM_002834.5:c.922A>G (p.Asn308Asp) em heterozigose no éxon 8 do gene PTPN11. Essa mutação foi relatada na literatura em pacientes diagnosticados com a SN (Tartaglia et al., 2002; Kosaki et al., 2002; Jongmans et al., 2005; Li et al. 2019; Orlova et al., 2024). O fenótipo da paciente se sobrepõe ao fenótipo da SN, ela possui baixa estatura, dificuldades alimentares, orelhas baixas, anomalias oculares, epicanto, má oclusão dentária, micrognatia e cardiopatia congênita. Portanto, em conjunto com o fenótipo da paciente, a mutação patogênica confirmada pelas análises sugere a síndrome de Noonan. Displasia oculodentodigital (DODD, OMIM#164200): é uma displasia autossômica dominante que é resultado de mutações no Gap junction alpha 1 (GJA1, OMIM #121014) (Paznekas et al., 2003; Shibayama et al., 2005). A DODD é caracterizada por alterações oculares, como microftalmia, microcornea, atrofia do nervo óptico, estrabismo; anomalias dentárias, como microdontia, hipoplasia, hipodontia; e alterações de membros, como a clinodactilia, sindactilia, 68 hipotelorismo ou hipertelorismo. A paciente possui alterações dentárias e de membros (Cella et al., 2006). O caso 22 apresenta os seguintes sinais deficiência intelectual, características faciais, alterações dentarias e de membros. Assim, devido a essa sobreposição de sinais clínicos e a presença dessa mutação, a hipótese diagnóstica do paciente 22 é a displasia Oculodentodigital. Apesar de não ter alterações oculares relatadas, a hipótese diagnóstica de DODD para esse caso foi feita, pois a primeira hipótese diagnóstica era a SWB e nessa condição não é realizada uma investigação profunda para as alterações oculares. A fim de corroborar com diagnóstico iremos solicitar uma investigação para alterações oculares. Síndrome Say-Barber-Biesecker-Young-Simpson (SSBBYS, OMIM #603736): essa afecção autossômica dominante ocorre quando há mutações patogênicas no gene KAT6B(OMIM #605880). Este gene codifica uma enzima histona acetil transferase. A mutação encontrada no caso 9, NM_012330.4:c.3519_3523dup (p.Thr1175Serfs*17), a duplicação com adição de cinco nucleotídeos que resulta em um frameshift que leva a produção de uma proteína truncada. Os sinais clínicos da SBBYSS são: polegares longos/dedões dos pés longos, face imóvel em forma de máscara, blefarofimose/ptose, anomalias do ducto lacrimal, hipoplasia/agenesia patelar, defeito cardíaco congênito, anomalias dentárias, perda auditiva, anomalias da tireoide, fenda palatina, anomalias genitais, hipotonia, atraso global no desenvolvimento/deficiência intelectual (Lemire et al., 2012; Lonardo et al., 2019). As características observadas no caso 9 são: hipotonia, faces dismórficas, ponte nasal plana, nariz bulboso, micrognatia, atraso motor, atraso global no desenvolvimento, deficiência intelectual e microcefalia. Devido a sobreposição de fenótipos e a mutação identificada no paciente, foi sugerida a síndrome de Say-Barber-Biesecker-Young-Simpson como hipótese diagnostica. Transtorno do desenvolvimento intelectual, autossômico dominante 50, com anomalias comportamentais (MRD50, OMIM #617787): essa afecção foi descrita em pacientes que possuem alterações no gene NAA15 (OMIM #608000). Esse gene é uma das subunidades auxiliares do complexo NatA, que são um grupo de acetiltransferases N-terminais (Deng etal., 2019; Dörfel et al., 2017; Feng et al., 2016; Knorr et al., 2019; Weidenhausen et al., 2021).). O exoma do paciente 4 identificou a mutação NM_057175.5:c.2133T>A, essa alteração resulta em um stop gain, p.Cys711Ter. 69 O transtorno é marcado por deficiência intelectual, atraso na fala e motor, além de anomalias comportamentais. Podem ter dismorfismos craniofaciais e anomalias cardíacas congênitas (Cheng et al., 2019). O paciente 4 possui deficiência intelectual, atraso de desenvolvimento, atraso motor e de fala, hipotonia, problemas comportamentais, baixa estatura e atraso de crescimento, além de faces dismórficas. Portanto, a hipótese diagnóstica do caso 4 é o Transtorno do desenvolvimento intelectual, autossômico dominante 50, com anomalias comportamentais. Desenvolvimento intelectual prejudicado e características faciais distintas com ou sem defeitos cardíacos (OMIM #616789): essa condição está associada a presença de variantes patogênicas no gene MED13L (OMIM #608771). Esse gene codifica uma subunidade do complexo que funciona como um coativador transcricional (Adegbola et al., 2015). O exoma do caso 5 identificou uma mutação em heterozigose cuja adição de um nucleotídeo, resulta em um frameshift, NM_015335.5:c.3857dup (p.Asp1287Glyfs*2). A afecção é caracterizada pela deficiência intelectual, braquicefalia, frontal bossing, alterações capilares, orelhas de inserção baixa, hipertelorismo, hipotonia, hipotonia facial com expressão caída e boca aberta, criptorquidia ou micropênis e comportamento autista e/ou hiperativo. Em alguns as cardiopatias podem ser encontradas (Adegbola et al., 2015). O paciente 5 apresenta em seu fenótipo as seguintes características: cardiopatias, assimetria de face, orelhas grandes, hipertelorismo, testa larga e proeminente, ponte nasal deprimida e ponta nasal bulbosa. Pela combinação de sinais clínicos semelhantes e a presença da mutação provavelmente patogênica. A hipótese diagnóstica neste caso é o desenvolvimento intelectual prejudicado e características faciais distintas com ou sem defeitos cardíacos. Atraso no desenvolvimento com ou sem fácies dismórfica e autismo (OMIM #618454): é um transtorno autossômico dominante causado por mutações heterozigóticas no gene TRRAP. Esse gene funciona como parte de um complexo coativador multiprotéico com atividade de histona acetiltransferase (REF). No caso 12, o exoma identificou a mutação não sinônima, NM_001375524.1:c.2759A>G, p.Gln920Arg. As principais características clínicas dessa afecção incluem o atraso do desenvolvimento, deficiência intelectual, atraso na fala e faces dismórficas, como fissuras palpebrais inclinadas, hipertelorismo, orelhas de implantação baixa e ponte nasal larga ou deprimida (Cogne et al.2019). 70 O caso 12 apresenta os seguintes sinais clínicos: atraso global do desenvolvimento, deficiência intelectual, atraso na fala, microcefalia, baixa estatura, hipotonia, dificuldades alimentares, cardiopatias e dismorfismos faciais. Desse último podemos citar epicanto, filtro curto, ponte nasal deprimida, nariz curto e boca grande. Assim, para o caso 12 foi sugerido como hipótese diagnóstica a condição conhecida por Atraso no desenvolvimento com ou sem fácies dismórfica e autismo. Transtorno do desenvolvimento intelectual, autossômico dominante 71, com anormalidades comportamentais (OMIM #620330): é causada por mutação heterozigótica no gene RFX7 (OMIM #612660). Esse gene pertence a família de fatores de transcrição do fator regulador X (FRX) (Aftab et al., 2008). O exoma do caso 17 identificou a mutação não sinônima NM_022841.7:c.812G>T, p.Gly271Val. Esse distúrbio é caracterizado pelo atraso global no desenvolvimento, hipotonia, atraso na fala, manifestações comportamentais e características dismórficas (Harris et al., 2021). O caso 17 apresenta atraso global de desenvolvimento e deficiência intelectual, ansiedade, atraso de fala, hipotonia, dificuldades alimentares, microcefalia, orelhas proeminentes, hipoplasia malar, filtro longo, lábio superior fino e micrognatia. A sobreposição clínica do fenótipo do paciente e a presença da mutação em RFX7, sugere-se que a hipótese diagnóstica é o Transtorno do desenvolvimento intelectual, autossômico dominante 71, com anormalidades comportamentais. No caso 10, o exoma identificou uma mutação não sinônima em um dos genes da região crítica da SWB. A mutação NM_003388.5:c.445C>A, p.Pro149Thr no CLIP2 (OMIM #603432), ela foi observada em heterozigose. Esse gene normalmente é deletado na SWB, e nenhuma condição clínica foi associada com esse gene. Estudos sugerem que a deleção desse gene, junto com os genes GTF2I, GTF2IRD1 e LIMK1, causaria o perfil cognitivo da SWB (Euteneuer et al. 2014; van Hagen et al., 2007). Os genes CLIP2, GTF2IRD1 e GTF2I estão próximos na região crítica da SWB, na porção mais telomérica da região. Alguns estudos sugerem que deleções de GTF2I e GTF2IRD1podem estar relacionadas às características craniofaciais, a deficiência intelectual e alguns aspectos cognitivos (Dai et al. 2010; Antonell et al., 2010; Fusco et al., 2014). Assim, podemos supor que a presença dessa mutação em CLIP2 pode alterar a leitura dos genes que estão após ele, e tal situação poderia levar a um fenótipo que lembra a SWB. No caso 18, o exoma identificou a presença em heterozigose da mutação NM_000821.7:c.938_939del (p.Pro313Argfs*33). Essa mutação no gene GGCX (OMIM #137167) 71 que já foi descrita na literatura como patogênica em um estudo sobre hipertensão da artéria pulmonar (Na Zhu et al., 2019). Esse gene também está relacionado a duas patologias, Distúrbio semelhante ao pseudoxantoma elástico com deficiência de múltiplos fatores de coagulação (OMIM#610842) e Deficiência combinada de Fatores de coagulação dependentes de vitamina K, (OMIM #277450). O fenótipo do paciente não era semelhante a nenhuma das condições citadas. Dos casos considerados complexos: O exoma do caso 1 identificou duas variantes em genes que estão relacionados a condições que possuem fenótipos que se sobrepõem ao do paciente. A mutação não sinônima, NM_001374828.1:c.2753G>T (p.Gly918Val) no éxon 7 do gene ARID1B. Essa mutação foi observada em baixíssima frequência na população, gnomADv.4.1 e a análise de predição computacional sugere que é patogênica. O gene ARID1B está relacionado com a etiologia de Coffin-Siris. As características clínicas do paciente que se sobrepõe são: atraso global do desenvolvimento, deficiência intelectual, hipotonia, escoliose, estreitamento bitemporal, epicanto, estrabismo, edema periorbitário, ponte nasal deprimida, filtro longo, bochechas proeminentes, boca grande, dentes pequenos, hipoplasia de esmalte dentário e micrognatia. A outra mutação identificada é no principal gene da região crítica da SWB, o gene da ELN (OMIM # 130160). A mutação NM_001278939.2: c.1382G>C (p.Gly461Ala). Esse gene está no meio da região crítica da SWB e normalmente é deletado nessa condição. Além da SWB, o gene da ELN também está associado a outras patologias, a Cutis laxa, autossômica dominante (OMIM #123700) e a Estenose Aórtica Supravalvar (OMIM #185500). Mas o paciente não possui características clínicas compatíveis com essas afecções. Enquanto para a SWB, ele possui o fenótipo da síndrome, além de um escore AAP de 5. O exoma do paciente 3 identificou duas variantes, uma no gene RAI1 (OMIM #607642) e outra no gene BUD23(OMIM #615733). Este gene, já foi chamado de WBSCR22, porque está localizado na região 1.2Mb da região crítica da SWB, próximo do gene STX1A. A mutação NM_017528.5:c.190A>G (p.Thr64Ala) é não sinônima e não foi encontrada em no gnomAD v.4.1. Esse gene não foi relacionado a outras condições, a não ser a SWB. Para essa afecção o paciente apresenta as faces típicas da síndrome, além de outras características como a sociabilidade excessiva e o escore da AAP igual a seis. A variante do gene RAI1 também é não sinônima, NM_030665.4:c.1340A>G (p.Asn447Ser), essa variante está localizada no éxon 3 desse gene. Mutações patogênicas no gene RAI1 resulta na 72 síndrome de Smith-Magenis (OMIM #182290), essas mutações patogênicas normalmente são observadas no éxon 3 de RAI1. Essa síndrome é caracterizada por faces dismórficas, hipotonia, atraso no desenvolvimento, comprometimento cognitivo e de fala, distúrbios do sono, acessos de raiva e impulsividade, a rouca e profunda (GeneReviews® [Internet]. Seattle (WA): University of Washington, Seattle; 1993. 2001 Oct 22 [updated 2022 Mar 10). O paciente 3 apresentou ansiedade, deficiência intelectual, microcefalia, ponte nasal deprimida, retardo de crescimento, hipotonia, micrognatia, estrabismo, voz rouca, dificuldades de alimentação, boca larga, filtro longo, simpatia excessiva, mandíbula pequena e anormalidade do sistema imunológico. Por fim, o exoma do paciente 20 identificou quatro variantes: NM_030665.4:c.21G>T (p.Arg7Ser) em RAI1 (OMIM #607642); NM_001374828.1:c.4834C>T (p.Pro1612Ser) em ARID1B (OMIM #614556); NM_016628.5:c.475A>T (p.Lys159*) em WAC (OMIM #615049); e NM_001379200.1:c.1310G>C (p.Gly437Ala) em TBX1 (OMIM # 602054). A variante em RAI1 é não sinônima e se encontra do no início do éxon 3, não foi encontrada no gnomAD e a predição computacional sugere que a variante é patogênica. E o fenótipo do paciente é compatível. Assim como a anterior, a variante do gene ARID1B também é não sinônima, ela está no éxon 18 deste gene e foi observada em baixa frequência na população. A predição computacional sugere que a variante é provavelmente benigna. Mas o fenótipo do paciente se sobrepõe a diversas características da síndrome. A variante NM_016628.5:c.475A>T (p.Lys159*) em WAC é um stop gain e está localizada no éxon 5 desse gene, e resulta em uma proteína truncada. Estudos apontam que o gene WAC está envolvido no processamento de RNA (Xu and Arnaout, 2002) e que mutações patogênicas nesse gene causam a síndrome de Desanto-Shinawi (OMIM #616708). Esta condição é caracterizada por atraso global no desenvolvimento, faces dismórficas, anomalias gastrointestinais e oculares, e problemas comportamentais (DeSanto et al., 2015). A última variante identificada é no gene TBX1 que se encontra na região que está deletada na síndrome de DiGeorge (OMIM #188400) e na síndrome velocardiofacial (OMIM #192430), mas estudo recentes também apontam que mutações de ponto nesse gene também podem causar ambas as condições. Elas se sobrepõem também no fenótipo. Pode apresentar distúrbios de imunodeficiência, faces dismórficas, doenças coronarianas, hipoparatireoidismo, hipocalcemia, problemas cognitivos e comportamentais (Cuneo et al., 2001; Hacihamdioğlu et al., 2015). 73 A variante, NM_001379200.1:c.1310G>C, é não sinônima e esta localizada no éxon 7. Ela está ausente na população, gnomAD v.4.1. Já a predição computacional sugere que a variante é provavelmente benigna. O paciente 20 apresenta os seguintes sinais clínicos: atraso no desenvolvimento, hipotonia, sociabilidade excessiva, ansiedade, hipersensibilidade ao som, atraso na aquisição da fala, seguido de fala excessiva, voz rouca, deficiência de crescimento, dificuldade de alimentação, problemas cardiovasculares e respiratórios, otites recorrentes, problemas musculoesqueléticos e faces dismórficas. Assim, o fenótipo do paciente se sobrepõe às características presentes na síndrome de Smith- Magenis, na síndrome Coffin-Siris, na síndrome de DeSanto, síndrome de DiGeorge e Velocardiofacial. 74 6.CONCLUSÃO O NGS foi fundamental para podermos elucidar e compreender a sobreposição de sinais clínicos de várias síndromes com a SWB. Nesse contexto chama bastante atenção a presença de dois casos da síndrome de Coffin-Siris (2/22). Assim este diagnóstico deve ser o primeiro a ser considerado nos casos de SWB FISH (-). Os outros oito casos com hipótese molecular de síndromes já descritas devem incluir a SWB no diagnóstico diferencial. Os doze casos (três de diagnóstico complexo e nove casos sem hipótese diagnóstica) requerem estudos mais aprofundados para a determinação etiológica das alterações clínicas apresentadas pelos pacientes. O diagnóstico clínico e molecular é a premissa para um aconselhamento genético preciso. 75 7. REFERÊNCIAS AAP. Health Care Supervision for Children with Williams Syndrome. PEDIATRICS, v. 107, n. 5, p. 1192–1204, 2001. ADEGBOLA, A. et al. Redefining the MED13L syndrome. European Journal of Human Genetics, v. 23, n. 10, p. 1308–1317, 22 out. 2015. AFTAB, S. et al. Identification and characterization of novel human tissue-specific RFX transcription factors. BMC evolutionary biology, v. 8, p. 226, 1 ago. 2008. ANTONELL, A. et al. 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