Dedico este trabalho aos meus pais Yukio e Yolanda e ao meu irmão Hélio. “Tudo no fim dá certo, se não der certo, é porque não chegou ao fim”. (Fernando Sabino) AGRADECIMENTOS Gostaria de agradecer ao meu pai por todos os ensinamentos e lições de vida, as quais vou levar sempre comigo, por me ensinar a nunca desistir de lutar, mesmo que a vida nos imponha os mais difíceis obstáculos, por me ensinar a ser uma pessoa correta, a me ensinar valores importantíssimo. À minha mãe, que sempre me ensinou a ter garra e lutar pelo que quero, que me ensinou que mesmo nos momentos mais difíceis aprendemos coisas importantíssimas, obrigada pela educação que me deu e pelo apoio nos estudos, mesmo não entendendo muito bem o que eu fazia. Obrigada por ser sempre um exemplo de educação, de conduta, de vida, de amizade, de perseverança, de cumplicidade, de amor. Pena que você e o meu pai não estão presentes para ver mais esta etapa vencida, mas sei que onde quer que estão, vocês torcem por mim. Ao meu "pequeno" grande irmão, por sempre estar ao meu lado, me apoiando em todas as minhas decisões, por segurar na minha mão e andar comigo lado a lado, por ser meu confidente, meu pai, meu filho, meu amigo, meu psicólogo, por ser o meu maior torcedor, por me querer bem, por não me fazer desistir dos meus sonhos. À minha orientadora Marin, que mais uma vez se mostrou minha "Mãerin", por sempre acreditar no meu potencial como profissional e como pessoa, por não desistir de mim, por todas as broncas merecidas, por todos os conselhos, as dicas, o carinho, a preocupação. Aos meus amigos Zé, Tati , Thaís e Bruna por sempre me ajudarem quando eu precisei, principalmente durante a realização do cometa. (a técnica mais chata do mundo!) Ao Flávio por me apoiar nos momentos em que mais precisei, por ser meu ombro amigo nas horas em que queria desistir de tudo, pelas "broncas", pelas conversas, por me fazer rir quando queria chorar, por ser enérgico e compreensivo ao mesmo tempo. A Thaís e Tatão pelos desabafos e pelos conselhos, pelos bate-papos de madrugada, pelo bom humor e por sempre estar presente na minha vida, vocês são minhas irmãs de coração. A Rê Carmona e Milene por sempre se preocuparem comigo. A Mari por sempre ser essa pessoa animada e maravilhosa que é, pelas viagens, brincadeiras, mensagens de madrugada. Á minha tia Elcídia, minha prima Celi, meu primo Jaime e meu primo Celso, por sempre torcerem por mim e sempre me ajudarem, por me mostrar que uma das coisas mais importantes da vida é a família. À Milena por sempre estar presente na minha vida, por me mostrar que a loucura nem sempre é ruim, por ser esta pessoa engraçada e especial que você é. Ao Fred, Bixão, Matheus pelos momentos mais bizarros e hilários, por me fazerem esquecer dos meus problemas de vez em quando, que o diga o Cotoco, o Ananias, a garagem.... Ao Zé por sempre estar disposto a me ajudar, por me apoiar, por me ajudar a fazer a biliografia (coisa mais chata!), por entender os meus mau-humores, por me emprestar a sua família. À Sílvia pelas dicas, toques, pela amizade. Aos marinzetes: Du, Jana, Jaque, Dani, Dânia, Rê Caritá Ao PRH-05 pela concessão do auxílio financeiro Ao Dimas, coordenador do PRH-05. Ao Zé Maria, por sempre me ajudar nas partes burocráticas. À Refinaria de Paulínia (REPLAN) pela permissão concedida para a realização de todas as coletas. À Profº Dejanira e ao Zito pelas coletas e por todo o auxílio que me deram, pela disponibilidade e por sempre me ajudarem no que precisava. À Profº Drº Lúcia Ribeiro pela amizade, pelas dicas profissionais, pela preocupação, pela disponibilidade em ajudar no que fosse necessário. À Rogilene, a técnica mais divertida do mundo. À Cris por todas as ajudas no computador. Aos meus amigos: Emílio, Milla, Heleninha, Shurato, Davi, Lye, Êlcior, Jordan, Cadu, Michel, Leandro e Roberta, Leandrinho, Léo e Ira, Maína, Salada, Bota, Marina, Fofô, Luci, Luciene, Fer B., Ângela. Aos colegas de departamento: Douglas, Marielle, Reinaldo, Bombeiro, Anita, Gislaine, Andrigo, Silvana, Ju, Izabela, Sandra, Fábio, Érica, Giselly, Jaú, Aos professores do Departamento, em especial as Profº Carmem, Sanae e Dora. Enfim, a todos que me ajudaram de algum modo na realização desse trabalho, se eu esqueci de alguém me desculpe, mas é que no final da dissertação, quando tudo fica pronto, você acaba ficando um pouco mais louco e esquecido, você acaba queimando metade dos seus neurônios e a outra metade você queima na apresentação. ÍNDICE Páginas 1. INTRODUÇÃO GERAL E RELEVÂNCIA DO TEMA............................................ 1 2. REVISÃO DA LITERATURA...................................................................................... 3 2.1. Sistema-teste vegetal: Allium cepa.......................................................................... 6 2.2. Peixes como sistema teste animal............................................................................ 8 2.3. Teste de aberrações cromossômicas........................................................................ 9 2.4. Morte celular: Apoptose e necrose.......................................................................... 11 2.5. Teste de micronúcleo e anormalidades nucleares.................................................... 18 2.6. Ensaio do cometa..................................................................................................... 20 2.7. Localização e caracterização da área de estudo....................................................... 21 2.8. Classificação das águas dos rios Atibaia e Jaguarí.................................................. 22 3. ARTIGO 1....................................................................................................................... Mutagenicidade de Efluentes de Refinaria, Avaliada pelo Teste de Aberrações Cromossômicas, em Allium cepa. 24 4. ARTIGO 2....................................................................................................................... Efeito Mutagênico de Efluentes de Refinaria, Evidenciado por meio do Teste de Micronúcleo e de Anormalidades Nucleares em Oreochromis niloticus (tilápia). 54 5. ARTIGO 3 Avaliação da Genotoxicidade de Efluentes de Refinaria, pelo Ensaio do Cometa, em Oreochromis niloticus. 78 6. ARTIGO 4 O Uso da Técnica de Corantes Vitais, sob Sistema teste de Allium cepa, para Identificaçãoo do Potencial Citotóxico de Xenobiontes 94 7. RESULTADOS GERAIS E DISCUSSÃO 115 7.1. Sistemas teste 115 7.2. Análises físicas e químicas das amostras coletadas nos rios e na refinaria 116 7.3. Análise dos efeitos genotóxicos 125 7.4. Análise dos efeitos mutagênicos 126 8. CONCLUSÃO 131 9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 133 10.ANEXO 158 RESUMO Atualmente, a degradação dos recursos hídricos é uma das maiores preocupações do homem, uma vez que pode causar danos diretos ou indiretos à biota associada, bem como à saúde e à sobrevivência desses organismos expostos. Um dos fatores que contribui para a alteração da qualidade das águas é a emissão de efluentes, seja ela industrial, doméstica ou de outra origem. Dentre os processos industriais que são considerados preocupantes para o meio ambiente, temos a indústria petrolífera, ligadas ao refino de petróleo. Os efluentes destas indústrias podem causar drásticas alterações nos recursos hídricos, devido à emissão de hidrocarbonetos, podendo comprometer corpos d´água que são utilizados em abastecimento de muitas cidades. O presente estudo teve como objetivo investigar os possíveis efeitos citotóxico, genotóxico e mutagênico de efluentes de refinaria de petróleo, que são lançados no rio Atibaia, município de Paulínia/SP. Para isso, foram coletadas amostras de água de seis pontos distintos: 1) Montante do Rio Jaguarí (acima da captação da água utilizada pela refinaria); 2) Entrada da lagoa de estabilização da REPLAN; 3) Saída da lagoa de estabilização (água destinada aos despejos no Rio Atibaia); 4) 1Km a montante do ponto 3, no Rio Atibaia; 5) 1 Km a jusante do ponto 3; 6) Após o tratamento físico- químico e antes do tratamento bacteriológico. Foram empregadas as metodologias de aberrações cromossômicas e de Corantes Vitais em Allium cepa (cebola) e teste de micronúcleo e ensaio de cometa em Oreochromis niloticus (tilápia). A partir dos dados obtidos, pode-se inferir que as águas do ponto 1 apresentaram baixo potencial citotóxico, genotóxico e mutagênico. O ponto 6 apresentou o mais alto índice de citotoxicidade, genotoxicidade e de mutagenicidade. As águas dos pontos 2 e 3 apresentaram níveis inferiores aos observados para o ponto 6. Foi observado que o efluente lançado no rio Atibaia (ponto 3) apresentou um índice mais baixo que os dos pontos 4, 5 e 6, o que indica que os tratamentos realizados pela empresa foram eficazes para minimizar os efeitos citotóxicos, genotóxicos e mutagênicos dos seus efluentes. Porém, os índices do ponto 5 (jusante do despejo) foram mais elevados que os observados para o ponto 4 (montante do despejo do efluente), o que indica que, apesar da eficiência dos tratamentos realizados pela refinaria de petróleo, deve haver alguns efeitos sinergísticos entre os compostos existentes no efluente final da refinaria com outros compostos existentes no rio Atibaia, visto que esse rio recebe efluentes domésticos e de outras indústrias, a montante do lançamento do efluente da refinaria. Palavras-chave: efluentes de refinaria de petróleo, citotoxicidade, genotoxicidade, mutagenicidade, Allium cepa, Oreochromis niloticus. ABSTRACT The degradation of the hydric resources is one of the man's main preoccupation, because it can cause direct or indirect damages to health and to the survival of the exposed organisms. One factor that can contribute for the alteration of the water quality is the effluents emissions, such as industrial, domestic or of other origin. These effluents can cause drastic alterations in the hydric resources, due to the emission of hydrocarbons, which can compromise the water that is used in the supplying of many cities. The present work had the objective to investigate the possible citotoxic, genotoxic and mutagenic effects of these petroleum refinery effluents, that are discharged in the Atibaia river, municipality of Paulínia/SP. Water samples were collected in six different sites: 1) Jaguarí river upstream (above the site were the water is collected by the industry); 2) entrance of the stabilization lake of REPLAN; 3) exit of the stabilization lake (water that is destined to be discharged in the Atibaia river); 4) 1 Km upstream of site 3, in the Atibaia river; 5) 1 Km downstream of site 3; 6) after the physic-chemical treatment and before the biological treatment. The methodologies of chromosome aberrations, and vital staining were used in the Allium cepa (onion) and the micronucleus test and comet assay were applied in Oreochromis niloticus (tilápia). From the results observed, we can suggest that the waters of site 1 has low citotoxic, genotoxic and mutagenic potentials. Site 6 had shown the highest citotoxic, genotoxic and mutagenic rates. The waters from sites 2 and 3 presented inferior levels from those observed in the site 6. It has been observed that the effluent that is discharged in the Atibaia river (site 3) had a lower level when compared with sites 4, 5 and 6, wich means that the treatments used by the company are efficient in minimizing the citotoxic, genotoxic and mutagenic effect of these effluents. However, rates of site 5 (downstream of the discharge) were higher than those observed in site 4 (upstream of the discharge), which means that, despite the efficiency of the treatments performed by the petroleum refinery, there must be some synergistic effects between the compounds of the final refinery effluents and other compounds that exist in the Atibaia river, since this river receive other industrial and domestic effluents, in the upstream of the discharge of the refinery effluent. Key-words: petroleum refinery effluents, citotoxicity, genotoxicity, mutagenicity, Allium cepa, Oreochromis niloticus. 1. INTRODUÇÃO GERAL E RELEVÂNCIA DO TEMA O homem, assim como todos os outros organismos, está exposto a diversos agentes, sejam eles químicos, físicos e biológicos, que podem causar, direta ou indiretamente, sérios danos à saúde e à sobrevivência. Atualmente, é crescente a preocupação do homem com relação à poluição ambiental pois, a cada dia, são produzidas e lançadas no meio ambiente, novas substâncias químicas capazes de promover danos e até mesmo a morte dos organismos vivos. A formação de grandes aglomerados urbanos e industriais e a crescente necessidade de água para o seu abastecimento, além da agricultura e atividades de lazer, fazem com que hoje a quase totalidade das atividades humanas seja cada vez mais dependente da disponibilidade e qualidade das águas continentais. A dependência do homem moderno para com os ecossistemas aquáticos é ainda mais evidente nas regiões altamente industrializadas, nas quais a demanda de água, per capita, tem se tornado cada vez maior (SILVA et al., 2003). A água é um recurso mineral finito e um dos fatores indispensáveis à manutenção da vida, sendo que, por essa razão, o seu uso racional, bem como a conservação da sua qualidade, devem ser incentivados. Após a revolução industrial, um grande número de substâncias químicas tem sido lançadas nos ambientes terrestre, aquático e na atmosfera. Estas substâncias podem ser transportadas e transformadas, por diferentes processos, em subprodutos que podem causar efeitos adversos ao homem, assim como danos aos ecossistemas terrestres e aquáticos (BERTOLETTI, 1996). Os corpos hídricos de muitas regiões brasileiras, como por exemplo as que abrigam pólos industriais e as áreas de concentração agrícola, onde são utilizados diversos tipos de biocidas para o controle das pragas das lavouras, vêm sofrendo uma degradação ambiental contínua causada pelos efluentes industriais, domésticos e pelas águas remanescentes das aplicações de biocidas (CETESB, 1987). Com a crescente industrialização, diversas substâncias químicas são produzidas e lançadas nos corpos d´água, sendo que essas substâncias podem ter efeitos citotóxicos, genotóxicos e mutagênicos sobre diferentes organismos, além de poderem induzir efeitos teratogênicos. Dentre as diversas indústrias que lançam seus efluentes nos recursos hídricos pode-se citar a indústria de refino de petróleo. Após o processo de refino, uma grande quantidade de água é despejada, juntamente com diversas outras substâncias derivadas do processo, em corpos d´água, comprometendo a qualidade desses recursos hídricos. Diversos organismos são utilizados como bioindicadores para se avaliar e monitorar a qualidade dos ecossistemas aquáticos. Dentre estes organismos, pode-se citar as espécies Allium cepa (Asparaginales, Alliaceae) e Oreochromis niloticus (Perciformes, Cichlidae), amplamente utilizados em estudos para esse fim. A interação entre diferentes métodos de avaliação do potencial tóxico, genotóxico e mutagênico pode fornecer uma visão mais global e abrangente sobre os efeitos de determinada substância sobre os organismos vivos. Desse modo, para o presente estudo foram realizados, em Allium cepa e Oreochromis niloticus, ensaios para se avaliar o possível potencial citotóxico, genotóxico e mutagênico de águas do rio Atibaia, que recebem derivados de resíduos de efluentes da refinaria de petróleo (Refinaria de Paulínia - REPLAN), município de Paulínia-SP. Para melhor apresentação, os resultados obtidos no presente trabalho, bem como a discussão de cada tema abordado, foram subdivididos em capítulos, escritos em forma de artigo a serem submetidos em periódicos especializados na área. Após a apresentação dos referidos artigos, foram realizadas a discussão e a conclusão geral de todos os dados apresentados, a fim de correlacioná-los entre si, para se obter uma visão mais holística dos efeitos dos efluentes de refinaria, sobre os organismos teste utilizados. 2. REVISÃO DA LITERATURA A água é um solvente versátil amplamente usado para transportar produtos residuais para longe do local de produção. Infelizmente, os produtos residuais transportados são freqüentemente tóxicos e sua presença pode degradar, seriamente, o ambiente do rio, lago ou riacho receptor (WHITE & RASMUSSEN, 1998). Um aumento significativo no número de compostos químicos industriais, agrícolas e comerciais no ambiente aquático levam a vários efeitos deletérios nos organismos aquáticos (LIVINGSTONE, 2001). Muitos desses químicos podem exibir atividades genotóxicas, levando a desordens genéticas, a doenças e a mortalidade de organismos expostos (NEHLS & SEGNER, 2001). Em baixas concentrações, estas substâncias podem não ter efeitos agudos detectáveis nos organismos, mas podem, a longo prazo, reduzir a sua sobrevivência. Tais efeitos podem ser manifestados por um dano maior ou menor nas células somáticas ou germinativas, e pelo aparecimento de desordens como, por exemplo, o câncer, que requer períodos longos e latentes antes de tornar-se clinicamente detectável (WHITE & RASMUSSEN, 1998). O aumento da contaminação do ambiente aquático, por vários resíduos de compostos químicos, tem causado efeitos diretos e indiretos na saúde humana (AL- SABTI et al., 1994). A poluição ambiental aquática é um problema sério e crescente e embora exista uma legislação pertinente, ela ainda ocorre. Algumas vezes, agentes tóxicos são emitidos diretamente no ambiente aquático, tornando-se genotóxicos pelas transformações biológicas ou químicas sofridas pós-emissão (CLAXTON et al., 1998). A toxicologia aquática estuda as interferências que os compostos químicos e outros xenobióticos podem causar nos organismos aquáticos, com ênfase especial aos efeitos adversos ou danosos. Inúmeros testes toxicológicos são utilizados para avaliar as concentrações e o tempo de exposição necessários para que esses agentes tóxicos possam produzir efeitos sobre os organismos. Assim, um teste toxicológico é desenvolvido para mensurar o grau da resposta produzida por um nível específico de estímulo-concentração do composto em estudo (RAND & PETROCELLI, 1985). As atividades humanas têm provocado, ao longo dos anos, grandes impactos nos ecossistemas aquáticos, sendo que os despejos de efluentes industriais e domésticos constituem-se, indiscutivelmente, a maior fonte antrópica de compostos químicos que são lançados nos corpos d’água (JUNGCLAUS et al., 1978; STAHL, 1991; VEGA et al., 1996). Muitos desses efluentes contêm misturas tóxicas, tais como agrotóxicos, metais pesados, produtos industriais e uma variedade de outras substâncias que, conjuntamente, podem agravar ainda mais as condições ambientais e, conseqüentemente, toda a vida do ecossistema. Problemas decorrentes dos efeitos tóxicos nos ecossistemas aquáticos não se restringem, apenas, aos desequilíbrios ecológicos provocados nos corpos d’água, mas como podem, a longo prazo, afetar a saúde humana, se considerada a possibilidade da ocorrência dos fenômenos de persistência e bioacumulação de poluentes tóxicos, ao longo da cadeia alimentar (ALVES, 1990; HOUK, 1992). Várias evidências de efeitos de substâncias genotóxicas à saúde, tais como anomalias reprodutivas, defeitos congênitos e câncer, têm sido citadas. Aumento de incidência de carcinomas gastro-intestinais, de bexiga, anomalias reprodutivas e malformações congênitas têm sido encontradas em populações que vivem próximas a depósitos de despejos perigosos. Os danos genéticos mais citados são as induções de lesões cromossômicas estruturais e numéricas específicas, decorrentes dos danos provocados no DNA. Segundo Houk (1992), três grandes classes de danos podem ser descritas: mutagênicos (ou de ponto), referentes às mutações no gene, que são alterações do DNA dentro de seqüências gênicas; clastogênicos, referentes às alterações na estrutura cromossômica, usualmente resultando em ganho, perda, ou rearranjo de peças cromossômicas; e aneugênicos, referentes ao ganho ou perda de cromossomos inteiros no complemento cromossômico. Segundo Schull (1962), as mutações são alterações na seqüência normal de nucleotídeos de um organismo. Deste modo, a mutagenicidade é um efeito tóxico que danifica, especificamente, o material genético da célula, causando uma mudança no DNA ou no cromossomo. Uma substância pode causar mutações por diversos modos de ação e, conseqüentemente, diferentes tipos de componentes estranhos podem ser considerados mutagênicos. Os efeitos dos agentes mutagênicos podem ser diversos, tais como reação direta com o DNA nuclear; incorporação do DNA durante a replicação celular; interferência na divisão celular mitótica ou meiótica, decorrendo em divisão incorreta da célula (TIMBRELL, 1999; MATSUMOTO et al., 2000). O petróleo é uma fonte energética não renovável derivada da decomposição orgânica animal e vegetal, composto por uma mistura de hidrocarbonetos e uma pequena quantidade de impurezas como enxofre, nitrogênio e metais. A partir do refino do petróleo são extraídos diversos produtos como gasolina, diesel, querosene, gás de cozinha, óleo combustível, lubrificante, além de produzir diversos compostos químicos que são utilizados como matéria prima por várias indústrias. Com o aumento acelerado da produção de petróleo, houve também um aumento concomitante deste produto e de seus derivados em recursos hídricos (FELLENBERG, 1980). Os hidrocarbonetos (HC) podem originar-se de fontes naturais ou antropogênicas. As fontes naturais são vegetação, decomposição microbiana, queima espontânea de florestas e formação natural de gás. As fontes antropogênicas resultam da combustão incompleta dos combustíveis fósseis evaporados. Entre os hidrocarbonetos oriundos da queima incompleta dos combustíveis de petróleo, da evaporação de combustíveis líquidos e solventes durante sua estocagem, refino ou manuseio, destacam-se os hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HPAs), substâncias estas com reconhecido potencial mutagênico (SILVA et al., 2003). É fato conhecido que os efluentes lançados pela indústria de petróleo pode conter uma grande variedade de poluentes orgânicos e metálicos, incluindo fenóis, óleo e graxa, sulfetos, amônia nitrogenada e hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) (DASGUPTA & ZDUNEK, 1992). Alguns desses compostos são utilizados ou produzidos durante o processo de refino do petróleo, mas muitos deles estão contidos no óleo bruto (PORTE & ALBAIGÉS, 1993). Os contaminantes, como os HPAs, são descritos como carcinogênicos, enquanto outros são conhecidos pelo seu potencial oxidante (PAGLIA & VALENTINE, 1967). O processamento dos hidrocarbonetos é uma prática que requer grandes quantidades de água. Desse modo, a indústria de petróleo utiliza-se de grandes volumes de água e descarta grandes volumes de efluentes nas águas superficiais. Embora muitos dos contaminantes sejam tratados e recuperados para serem reutilizados na refinaria, uma grande quantidade de compostos tóxicos pode estar presente no efluente final a ser descartado pela indústria (AVCI et al., 2005). Apesar de ser de suma importância para a sociedade atual, a utilização do petróleo traz riscos potenciais para o meio ambiente, desde o processo de extração, transporte, refino, até o consumo de seus produtos, com a produção de gases poluentes. No entanto, algumas medidas foram e estão sendo tomadas para minimizar esses riscos. Dentre essas medidas, o monitoramento ambiental é uma importante estratégia para se avaliar os impactos ambientais que o petróleo e seus derivados possam promover no ambiente. 2.1. Sistema-teste vegetal: Allium cepa A avaliação da genotoxicidade de químicos perigosos/danosos tem sido feita há anos, por meio de testes com vegetais superiores (RANK et al., 2002). Durante a década de 30, Levan (1938) demonstrou que a colchicina poderia causar distúrbios no fuso mitótico, levando a uma poliploidização em células meristemáticas de raízes de Allium. Posteriormente, Levan (1945) demonstrou que várias soluções de sais inorgânicos induziam diferentes tipos de aberrações cromossômicas, nestas mesmas células de meristemas radiculares de Allium (A. cepa). Desde então, muitos novos testes de mutagenicidade, utilizando microorganismos, linhagens celulares de mamíferos e outros sistemas biológicos, têm sido desenvolvidos, mas os testes com vegetais ainda são utilizados, rotineiramente, em muitos laboratórios de todo mundo, como indicadores de potencial mutagênico de diversos agentes. Além disso, ensaios com vegetais são úteis para se testar amostras ambientais complexas como esgotos industriais e domésticos (GROVER & KAUR, 1999; HOSHINA, 2002; MATSUMOTO, 2004), águas de rios (RANK & NIELSEN, 1998; HOSHINA, 2002; MATSUMOTO, 2004), e solos contaminados (CHANG et al., 1997; KOVALCHUCK et al., 1998; COTELLE et al., 1999). Alguns dos ensaios vegetais realizados com Allium cepa, Vicia faba e Tradescantia paludosa, que foram utilizados nos estudos dos efeitos mutagênicos das radiações ionizantes e mutágenos químicos, são hoje empregados para se avaliar a mutagenicidade/clastogenicidade de poluentes ambientais. Estudos realizados por GROVER & KAUR (1999) mostraram que os ensaios com vegetais apresentam resposta positiva, com relação aos poluentes. Grover et al. (1990) avaliaram os efeitos genotóxicos de pesticidas, utilizando vegetais (teste de aberrações cromossômicas) e mamíferos (teste de micronúcleo) como organismos testes e observaram a existência de uma correlação significativa (91,5%) entre os dois sistemas testados. A eficácia dos sistemas teste vegetais foi também registrada por Constantin & Owens (1982), Matsumoto (2004), Ventura (2004) e Fernandes (2005). Como já citado, os testes utilizando-se Allium são realizados desde o final da década de 30, sendo padronizados por Fiskejö em 1985. Esse teste constitui um ensaio muito sensível e confiável para monitoramento ambiental e é baseado na avaliação do potencial genotóxico e mutagênico de substâncias químicas em espécies do gênero Allium, onde se registra as alterações na atividade mitótica (exemplo: mudanças no índice mitótico); anormalidades mitóticas e aberrações cromossômicas em células meristemáticas das raízes de plantas deste gênero (VIDAKOVIC-CIFREK et al., 2002). A espécie mais freqüentemente utilizada é Allium cepa, devido ao conhecimento da duração do seu ciclo celular e da sua reação a muitos agentes mutagênicos conhecidos (EVSEEVA et al., 2003). O teste de Allium cepa tem sido aplicado para a determinação de efeitos citotóxicos e/ou genotóxicos de várias substâncias (GRANT, 1982; FERNANDES, 2002; HOSHINA, 2002; VENTURA, 2002; 2004; MATSUMOTO, 2004). É considerado como um procedimento padrão para testes rápidos e para se determinar a toxicidade e os níveis de poluição no meio ambiente. Os efeitos tóxicos e genotóxicos podem ser avaliados pela análise macroscópica (diminuição do crescimento radicular) ou também por parâmetros citológicos (tipos e freqüência de aberrações e divisões celulares anormais), respectivamente. Resultados provenientes do teste de Allium cepa podem indicar a presença de certas substâncias citotóxicas, genotóxicas ou mutagênicas no ambiente, que representam riscos, diretos ou indiretos, para os organismos vivos expostos (SMAKA-KINCL et al., 1997). Segundo Fiskejö (1985), a espécie Allium cepa tem sido indicado como um eficiente organismo-teste de citotoxicidade e genotoxicidade, devido às características que possui na sua cinética de proliferação, pelo crescimento rápido de suas raízes, pelo grande número de células em divisão, pela sua alta tolerância a diferentes condições de cultivo, pela sua disponibilidade durante o ano todo e pelo seu fácil manuseio. A essas características somam-se número reduzido de cromossomos (2n=16), além do grande tamanho dos mesmos (QUINZANI-JORDÃO, 1987). Testes com Allium cepa são adequados para a avaliação de parâmetros microscópicos como anáfases prematuras, aderências cromossômicas, pontes e fragmentação cromossômica, C-mitoses e micronúcleos, que são indicadores de eventuais mutações no conteúdo genético celular. O teste de mutagenicidade com Allium tem recebido grande atenção depois de ter sido adaptado para examinar poluentes no solo e na água, como os ácidos clorofenoxiacéticos e os clorofenóis (FISKEJÖ et al., 1981), alumínio (BERGGREN & FISKEJÖ, 1987), sais de metais pesados (LIU et al., 1995; MATSUMOTO, 2004) e outros rejeitos químicos industriais (VIDAKOVIC et al., 1993), bem como de agrotóxicos (FRANEKIC et al., 1994; GROVER et al., 1988; VENTURA, 2004; FERNANDES, 2005). A sensibilidade do teste de mutagenicidade com Allium foi calculada como sendo superior aos resultados obtidos com roedores, em 82% (RANK & NIELSEN, 1993). Os testes com Allium cepa, como já foi citado, também apresentam uma alta correlação com os resultados obtidos com outros sistemas teste em mamíferos (GRANT, 1982). 2.2. Peixes como sistema teste animal O acúmulo de substâncias químicas em peixes pode se dar através da exposição direta aos químicos presentes nas águas dos rios e mares, ou através da cadeia alimentar do ecossistema de maneira indireta (ATEEQ et al., 2002). Segundo Powers (1989) e Ateeq et al. (2002), os peixes reúnem características que os tornam excelentes modelos experimentais para estudos de toxicologia aquática, em que são, particularmente, utilizáveis, pois alertam sobre o potencial de perigo de novas substâncias químicas introduzidas no ambiente ou para a possibilidade da poluição ambiental. De acordo com Harshbarger & Clark (1990), os peixes constituem bons organismos-teste para monitoramento toxicológico, especialmente espécies pequenas de aquário, pois podem ser mantidos em laboratório e, facilmente, expostos a substâncias tóxicas, de maneira similar aos vertebrados superiores, podendo ser usados para a avaliação da presença de substâncias que tenham o potencial de causar efeitos teratogênicos e carcinogênicos em humanos. De acordo com Alves-Costa (2001), as espécies Oreochromis niloticus (tilápia) e Hoplias malabariscus (traíra) são excelentes sistemas-teste para ensaios laboratoriais, realizados com o objetivo de investigar a toxicidade de substâncias contaminantes em ecossistemas aquáticos. Oreochromis niloticus é uma importante espécie de peixe comercializável do sudeste do Brasil, particularmente do estado de São Paulo. É também uma espécie comumente encontrada em estuários pelo mundo todo, conhecida por responder, rapidamente, a alterações ambientais (VIJAYAN et al., 1996). 2.3. Teste de aberrações cromossômicas Devido a sua grande dimensão, a molécula de DNA acaba sendo alvo permanente de danos causados por poluentes (KOVALCHUCK et. al., 1998). Segundo Kirsch-Volders et. al. (1998) se esses danos não forem reparados, ou se forem reparados de forma incorreta, eles podem acarretar em mutações. As lesões no DNA podem promover alterações no conteúdo genético dos organismos. Segundo Kirsch-Volders (2002), mutações no material genético podem ser de dois tipos: mutações gênicas (que ocorrem nos genes) e mutações cromossômicas (visualizadas pela presença de aberrações cromossômica). Testes citogenéticos são úteis para identificar os efeitos danosos de uma substância particularmente conhecida, em suas várias concentrações e após diferentes tempos de exposição. Estes testes também são importantes para avaliar influência dos xenobiontes sobre os organismos (AL-SABTI & KURELEC, 1985; AL-SABTI, 1989; ABDOU et al., 1989; ARRIGONI et al., 1989; KAK & KAUL, 1989; KUMAR & SINHA, 1989; RAO, 1989; CHAUHAN & SUNDERARAMAN, 1990; EL- KHODARY et al., 1990; PANDA et al., 1990; SINGH et al., 1990; KUMAR et al., 1991; DE-SERRES, 1992). Desta forma, são comumente usados para se biomonitorar a extensão da poluição e avaliar o efeito combinado que todas as substâncias tóxicas e mutagênicas, presentes no meio ambiente, causam nos organismos expostos (DEGRASSI e RIZZONI, 1982; AL-SABTI & KURELEC, 1985; DIXIT & NERLE, 1985; FISKEJÖ, 1988; DE MARCO et al., 1988; AL-SABTI, 1989). Testes biológicos de toxicidade e genotoxicidade são, segundo Moraes (2000), indispensáveis para se avaliar as reações dos organismos vivos à poluição ambiental e para indicar os possíveis efeitos sinergísticos de vários poluentes, enquanto que as análises físicas e químicas determinam a presença ou a concentração de diferentes poluentes presentes no meio ambiente. Uma das mais antigas e utilizadas ferramentas para se realizar estudos de avaliação de genotoxicidade e de mutagenicidade é o teste de aberrações cromossômicas. Esse teste, baseado na citogenética clássica, é um dos poucos métodos diretos usados para mensurar mutações em sistemas expostos a mutágenos ou carcinógenos potenciais (RANK et al., 2002). O teste de aberrações cromossômicas com Allium cepa fornece um rápido exame dos efeitos genotóxicos e mutagênicos de substâncias químicas dispostas no meio (GRANT, 1982; GRANT, 1994; FISKEJÖ, 1985; FISKEJÖ, 1988; FISKEJÖ, 1993a; FISKEJÖ, 1993b; NIELSEN & RANK, 1994). Este teste tem sido amplamente utilizado para se monitorar os efluentes de rios (FISKEJÖ, 1993b; RANK & NIELSEN, 1994; SMAKA-KINCL et al., 1997). A contagem da incidência de aberrações cromossômicas e de micronúcleos em células de meristemas radiculares constitui um método fácil para se estudar os efeitos de diferentes agentes mutagênicos, como, por exemplo, os compostos de mercúrio, selênio, zinco e cádmio, bem como de muitos pesticidas (FISKEJÖ, 1988; FISKEJÖ, 1979; BORBOA & DE LA TORRE, 1996; GULATI et al., 1994). Os resultados obtidos com este teste estão de acordo com os resultantes de outros sistemas teste, como os de células V79 do hamster chinês e de linfócitos humanos (PAVLICA et al., 1991; FISKEJÖ, 1995; GRANT, 1994). Curiosamente, foi observada uma maior eficiência do teste de micronúcleo com células de raízes de Allium cepa do que com células de Vicia faba (MA et al., 1995), quando se avaliou a clastogenicidade do raio-X. Devido à sua simplicidade, ao seu relativo baixo custo, à sua versatilidade e as mínimas facilidades requeridas, estes ensaios se tornaram indicados para a avaliação dos efeitos de xenobiontes e para o monitoramento da poluição (GROVER & KAUR, 1999). Testes citogenéticos são adequados para identificação de efeitos perigosos de substâncias, em suas diversas concentrações sobre diferentes tempos de exposição, e para avaliação da sua influência nos organismos. Estes testes também permitem a compreensão dos efeitos de agentes físicos e químicos sobre os organismos-teste e são, comumente, usados no biomonitoramento da extensão da poluição, bem como para a avaliação dos efeitos combinados de todas as substâncias tóxicas e mutagênicas sobre os organismos no ambiente natural (MORAES, 2000). Resultados provenientes de bioensaios genéticos são, segundo Houk (1992), relevantes à saúde humana porque o alvo toxicológico é o DNA, o qual existe em todas as formas celulares vivas. Portanto, pode ser extrapolado que compostos que se mostram reativos com o DNA de uma espécie têm o potencial para produzir efeitos semelhantes em outras espécies. Em geral, perturbações do material genético são deletérias para o organismo e podem conduzir a severas e irreversíveis conseqüências à saúde. As aberrações cromossômicas têm sido largamente reconhecidas como importantes conseqüências de ações genotóxicas de agentes químicos, aos quais muitos organismos, inclusive o homem, estão expostos. Tanto as aberrações estruturais como numéricas têm sido associadas com alterações da saúde humana, como nos casos de neoplasias e de anormalidades congênitas de recém-nascidos (NATARAJAN, 2002). 2.4. Morte celular: Apoptose e necrose De acordo com Mello et al. (2001), agentes indutores de estresse, tais como: radiação, drogas, choques térmicos, metais pesados, álcoois, hipóxia, jejum, inibidores metabólicos, agentes oxidantes e infecções virais, dentre outros, podem induzir a morte celular. Segundo Kaioumova et al. (2001), a perturbação de células por agentes químicos pode levar a uma seqüência complexa de eventos, levando a morte celular, tanto por apoptose como por necrose. A definição de apoptose foi primeiramente baseada em uma seqüência distinta de eventos morfológicos observados por microscopia eletrônica, descrita por Kerr et al. (1972) e depois por vários outros autores como Wyllie (1980), Gavrieli et al. (1992), Lazebnik et al. (1993), Solary et al. (1993), Kerr et al. (1994); MacCarthy et al. (1997), Messam & Pittmam (1998), Brunet et al. (1998), que observaram uma mudança na morfologia do núcleo (condensação), bem como uma condensação da célula. A apoptose pode ser induzida no curso normal de crescimento e desenvolvimento de tecidos e, além disso, por uma variedade de compostos químicos e condições ambientais específicas. A apoptose, considerada a principal via natural de morte celular, é necessária para a manutenção da cinética e do equilíbrio de tecidos sadios. A apoptose tem sido descrita como um tipo fisiológico de morte celular, com pouco ou nenhum impacto para os tecidos vizinhos. Evidências indicam que a apoptose pode representar um mecanismo para a deleção seletiva de células, cuja sobrevivência prejudicaria o organismo como um todo (STEINERT, 1996). De acordo com Raff et al. (1998), a apoptose não é um processo exclusivo de células animais. A morte programada da célula também pode ocorrer em plantas durante o desenvolvimento, na senescência de flores e folhas e em resposta às injúrias e infecções. O início da apoptose se caracteriza pela diminuição da célula e do núcleo, bem como pela condensação da cromatina nuclear em massas bem definidas que começam a se deslocar para as membranas nucleares (MAENO et al., 2000). Logo depois, o núcleo se condensa, progressivamente, e se quebra (cariorrexis). A célula se desprende do resto do tecido e o seu contorno começa a se deformar e a formar extensões (DARZYNKIEWICZ et al., 1992). As extensões celulares, chamadas de brotos, se formam por um processo de migração do material nuclear que se desprendem do núcleo e migram para a periferia da célula, até que haja a completa independência dessas porções. Esse material é envolvido por membranas e recebem o nome de corpos apoptóticos. Esses corpos apoptóticos estão repletos de organelas celulares, altamente condensadas, e dos já citados fragmentos nucleares. As estruturas finas, incluindo as membranas e a mitocôndria, ficam bem preservadas dentro desses corpos. Os corpos apoptóticos são, rapidamente, fagocitados em células vizinhas, incluindo macrófagos e células parenquimáticas (STALDEMANN & LASSMANN, 2000). Os corpos apoptóticos podem ser reconhecidos dentro dessas células, mas, eventualmente, elas começam a se degradar (KERR et al., 1972; WYLLIE et al., 1980). Se a célula fragmentada não é fagocitada ela passa por um processo de degradação que se assemelha ao processo de necrose (KERR et al., 1972; WYLLIE, 1980; GAVRIELI et al., 1992; LAZEBNIK et al., 1993; SOLARY et al., 1993; KERR et al., 1994; MAcCARTHY et al., 1997; MESSAM & PITTMAM, 1998; BRUNET et al., 1998). O processo de morte celular por apoptose tem sido baseada em características específicas da morfologia celular e pela detecção de fragmentação de DNA, visualizadas pela aplicação de técnicas bioquímicas e histoquímicas (HUPPERTZ et al., 1999; WILLINGHAM, 1999). A apoptose é um tipo de morte celular associado a alterações funcionais e a eventos bioquímicos que incluem a perda do potencial transmembrana da mitocôndria (PETIT et al., 1995; KROEMER et al., 1997), peroxidação da cardiolipina, ativação das caspases (ZHENG e FLAVELL, 2000), fragmentação do DNA em fragmentos oligonucletotídicos (WALKER et al., 1995) e perda da assimetria lipídica pela translocação de resíduos da fosfatidilserina para a camada externa da membrana plasmática (MORRIS et al., 1984; FADOK et al., 1992; KOOPMAN et al., 1994; VERMES et al., 1995). Verhoven et al. (1995) propuseram que a exposição da fosfatidilserina seria resultante tanto da diminuição da regulação da aminofosfolipídio translocase, quanto do aumento da saída dos fosfolipídios da membrana, o que facilita a movimentação bidirecional da bicamada de todos os fosfolipídios. Zhao et al. (1998) demonstraram que a saída dos fosfolipídios interfere na redistribuição dos fosfolipídios da membrana plasmática em células ativadas, em células em necrose ou em apoptose. Está bem estabelecido que os fosfolipídios das membranas biológicas estão arranjadas de forma assimétrica entre a bicamada lipídica (DEVAUX, 1991; SHROIT & ZWAAL, 1991; ZACHOWSKI, 1993). Em membranas plasmáticas de seres eucarióticos, os aminofosfolipídios, como fosfatidilserina, residem, predominantemente, na camada externa da membrana plasmática. Embora pouco se saiba sobre a função fisiológica da assimetria da membrana lipídica, há evidências de que um aumento do Ca2+ intracelular, devido a ativação celular, necrose, ou apoptose, promove um rápido movimento bidirecional dos fosfolipídios da superfície celular, resultando numa exposição da fosfoftidilserina na superfície celular (ZHAO et al., 1998). O movimento transmembrana dos fosfolipídios pode ser importante para regular outras enzimas da membrana ou para regular o movimento dinâmico das membranas, tais como a fusão e tráfego de vesículas, embora não haja nenhuma evidência experimental que comprovem esses fatos. Estudos realizados por Umeda & Emoto (1999) mostraram que a redistribuição dos fosfolipídios na bicamada atua como um regulador da reorganização dos filamentos de actina e desempenha um papel crucial em mediar o movimento coordenado entre a membrana plasmática e o citoesqueleto, para atingir, com sucesso, uma divisão celular. Os autores ainda sugerem que a completa perda da distribuição assimétrica dos fosfolipídios da membrana plasmática pode ocorrer durante o processo de apoptose, resultando na exposição de aminofosfolipídios. Os mesmos autores observaram que a redistribuição da fosfatidilserina na bicamada da membrana plasmática foi especificamente aumentada nos “brotos” de células apoptóticas, o que implica que a fosfatidilserina presente na membrana plasmática deve desempenhar algum papel regulatório na formação dos “brotos” na membrana de células apoptóticas. Outras estruturas que parecem estar relacionadas com a formação dos “brotos” são os filamentos de miosina II (MILLS et al., 1998). Até hoje, os eventos que levam a ativação da morte celular por apoptose permanecem desconhecidos. Consideráveis mudanças morfológicas ocorrem na apoptose e tem sido proposto que o citoesqueleto deve estar envolvido neste processo. Estudos realizados por Cotter et al. (1992) indicaram que a actina está, diretamente, relacionada ao processo de apoptose e particularmente, nos corpos apoptóticos. Pittman et al. (1997) focaram seus estudos na tubulina e demonstraram que ela se reorganiza de forma congruente, com as mudanças características da apoptose. Esses autores ainda demonstraram que a apoptose pode ser induzida por drogas que despolimerizam ou estabilizam os microtúbulos. Estudos recentes indicam que quebras proteolíticas de uma série de proteínas chave, como por exemplo a actina, espectrina, lamina A e B, por proteases ativadas por caspases, desempenham um papel importante na morfologia da apoptose (MARTIN & GREEN, 1995). Embora o exato mecanismo de como a degradação dessas proteínas resultam na morfologia das células apoptóticas permaneça desconhecido, muitas proteínas alvo das caspases participam na formação e na regulação do microfilamento cortical, associado a membrana do citoesqueleto, que é muito importante para a determinação da morfologia celular. A expressão excessiva das formas clivadas, pelas caspases, de Gas2 e gelsolin resultam em mudanças dramáticas na morfologia celular, assemelhando-se a apoptose. Outras proteases, como a calpaína, têm sido associadas com a sinalização de mudanças apoptóticas no citoesqueleto (KAYALAR et al., 1996; VANAGS et al., 1996; BRANCOLINI et al., 1997; BROWN et al., 1997; MASHIMA et al., 1997; RUDEL e BOKOCH, 1997). Duas proteína-quinases localizadas nos sítios de ligação entre célula-célula e entre célula-matriz também são alvos das caspases. A sua clivagem pelas caspases resulta num aumento da sinalização pró-apoptótica (CARDONE et al., 1997) e no possível desligamento da célula do tecido (WEN et al., 1997). A desorganização da lâmina nuclear, estrutura de suporte do envelope nuclear, também é uma característica importante da desestruturação nuclear durante a apoptose, uma vez que a lâmina nuclear é uma das responsáveis pela manutenção da morfologia do núcleo. A desestruturação da lâmina pode afetar, também, o correto funcionamento do núcleo (LAZEBNIK et al., 1993). Esse processo depende da degradação das lâminas nucleares A e B, mediadas pela caspase (ORTH et al., 1996). Proteínas envolvidas com a regulação da estrutura da cromatina (NICHOLSON & THORNBERRY, 1997) ou proteínas envolvidas com a interação entre a cromatina e a matriz nuclear (CASIANO et al., 1996) também são clivadas pelas caspases. As caspases proteases também têm sido associadas com a externalização da fosfatidilserina, que promovem o reconhecimento dos corpos apoptóticos pelas células vizinhas (FADOK et al., 1992; MARTIN et al., 1996; VANAGS et al., 1996). A necrose, ao contrário da apoptose, parece ser um tipo acidental de morte celular que ocorre como conseqüência de uma grave injúria celular. Uma célula em apoptose passa por uma seqüência de eventos bem definidos, enquanto que na necrose, embora inicialmente passe pela condensação da cromatina, as organelas incham e as membranas celulares perdem, rapidamente, a sua integridade (KERR et al., 1972; WYLLIE et al., 1980; WYLLIE, 1980). A necrose primária, ou morte celular acidental (DARZYNKIEWICZ et al., 1997), é um processo passivo, catabólico e degenerativo, que geralmente representa uma resposta a injúrias graves e que pode ser induzida, tanto por uma overdose de agentes citotóxicos, quanto por injúrias sérias ou por patógenos intracelulares (OSHIMI et al., 1996; LEIST et al., 1997, DARZYNKIEWICZ et al., 1997; PALOMBA et al., 1999). A necrose é um tipo de morte celular, antigamente considerada como descontrolada. Para Zakeri e Lockshin (2002), se uma célula encontra qualquer insulto ou injúria grave à sua existência, seus mecanismos de geração de ATP, ou de integridade e permeabilidade de membrana, ficam comprometidos. A necrose pode ocorrer pela presença de toxinas ou componentes químicos tóxicos, os quais promovem a lise celular, cujas funções mitocondriais e dos canais iônicos do sistema de membranas das células tornam-se, totalmente, comprometidos. A necrose não é determinada por fatores intrínsecos da própria célula, mas por perturbações do meio ambiente, injúrias estas que causam uma agressão letal, por ser grave, intensa, contínua ou não, ultrapassando o nível de habilidade homeostática da célula. Os agentes agressores podem ser agrupados em agentes físicos (ação mecânica, temperatura, radiação, efeitos magnéticos, eletricidade), químicos (substâncias tóxicas e não tóxicas), e biológicos (toxinas, infecções viróticas, bacterianas, micóticas, parasíticas, etc). Esses agentes provocam um comprometimento da integridade das membranas celulares e da manutenção da capacidade de multiplicação celular, por interferências no RNA e no DNA. A ação dos agentes agressores sobre os sistemas biológicos provoca a perda da homeostase e da morfostase celular, de tal forma que a célula perde a sua viabilidade (KAIOUMOVA et al., 2001). Diferentemente da apoptose, que é um fenômeno ocorrente em células únicas, a necrose tem sido, freqüentemente, descrita como um fenômeno multicelular. Estudos moleculares têm demonstrado que o primeiro evento observado na necrose é a alteração na bomba de sódio e potássio da membrana celular, provocando edema intracelular. Quando as enzimas lisossomais digerem as organelas citoplasmáticas, o citoplasma adquire um aspecto vacuolizado, podendo ocorrer um processo associado de calcificação nas células mortas. As alterações nucleares ocorrem, reversivelmente, até a etapa de condensação da cromatina, formando blocos nucleares ligados à membrana nuclear e ao nucléolo (cariorrexis). Entretanto, quando as alterações degenerativas progridem, pode aparecer retração do núcleo, que se transforma em uma massa densa e enrugada de cromatina (com reação picnótica positiva). Esta cromatina sofre uma dissolução progressiva (cariólise), aparentemente, como resultado da ação hidrolítica das DNAses de origem lisossomal. O citoplasma perde a basofilia e o limite celular se torna indistinto. Observa-se que a perda da homeostase compromete o sistema enzimático (comprometimento dos lisossomos) e o sistema de membranas, o que leva a lesões irreversíveis para a célula (ZAKERI & LOCKSHIN, 2002). Dados recentes indicam que, em contraste com a necrose que é causada por condições muito extremas, a apoptose é um tipo de morte celular caracterizado por um evento fisiologicamente normal e regulado (programado). Atualmente, sabe-se que tanto a apoptose como a necrose, possuem caminhos de sinalização, como receptores de morte celular, cascatas de quinases e eventos mitocondriais. Pela modulação desses caminhos de sinalização, em ambos os processos de morte celular, é possível identificar e distinguir a apoptose da necrose (WOODLE & KULKARNI, 1998; HUPERTZ et al., 1999; STADELMAN & LASSMANN, 2000; PROSKURYAKOV et al., 2003). O aumento da permeabilidade de membrana pode ser evidenciado pela incorporação de um corante fluorescente, intercalante de DNA, como por exemplo Hoescht 33342 (ORMEROD et al., 1993) e iodeto de propídio (ORMEROD et al., 1993; ZAMAI et al., 2001). O Hoescht 33342 é um marcador que apresenta baixa citotoxicidade e se intercala entre as regiões A-T do DNA (TAS & WESTERNENG, 1981). A exclusão do corante fluorescente iodeto de propídio tem sido comprovada como, particularmente, útil para estudos de morte celular. A natureza altamente polar dessa molécula faz com que ela seja também altamente impermeável em células íntegras. No entanto, ela consegue penetrar na célula, quando esta apresenta uma membrana plasmática com comprometimento da sua integridade. Uma vez dentro da célula, o iodeto de propídio se combina com o DNA, conferindo ao núcleo uma coloração vermelha altamente fluorescente (BRANA et al., 2002), evidenciando assim as células em processo de morte celular. As células “vivas”, ou seja, com a sua membrana plasmática íntegra apresentam núcleos com coloração azulada. 2.5. Teste de micronúcleo e anormalidades nucleares Para Landolt & Kocan (1983) e Heddle et al. (1983), uma das mais promissoras, baratas e rápidas técnicas de avaliação genotoxicológica é o teste do micronúcleo. Micronúcleos são massas de cromatina com aparência de um pequeno núcleo, resultante da condensação de fragmentos cromossômicos acêntricos ou cromossomos inteiros que atrasaram sua migração para os pólos na anáfase (SCHMIDT, 1976; AL-SABTI & METCALFE, 1995). Durante a telófase, um envelope nuclear se forma ao redor do cromossomo ou do fragmento cromossômico perdido, que então se descondensa e, gradualmente, assume a morfologia de um núcleo interfásico, com a exceção ao tamanho, pois este é bem menor que o núcleo principal, razão pela qual é chamado de micronúcleo (FENECH, 2000). Segundo Fenech (2000), para uma estrutura ser considerada um micronúcleo ela deve ser morfologicamente semelhante ao núcleo principal, porém com tamanho menor, cujo diâmetro esteja entre 1/16 até 1/3 do núcleo principal; além de outras características como não ser refringente, não estar ligado ou conectado ao núcleo principal e possuir a mesma intensidade de coloração do núcleo principal, embora às vezes possa apresentar coloração um pouco mais intensa. Hayashi et al. (1998), descrevem o teste do micronúcleo como uma técnica vantajosa, pelo fato de poder ser usada em qualquer população celular em proliferação, sem que seja necessário o conhecimento prévio do cariótipo do organismo teste utilizado. Embora o micronúcleo possa se originar espontaneamente, a sua indução é, comumente, usada para se detectar danos genotóxicos, resultantes de exposição a um agente mutagênico (HEDDLE et al., 1983). O teste do micronúcleo foi, originalmente, desenvolvido como um teste que utilizava eritrócitos policromáticos de medula óssea de roedores (SCHMIDT, 1976), e mais tarde estendido a eritrócitos circulantes (MACGREGOR et al, 1980). Hooftman & Raat (1982) modificaram a técnica original desenvolvida para roedores, para a aplicação laboratorial em peixes. Essa modificação, conhecida como o “teste do micronúcleo písceo”, tem sido recentemente proposta como uma técnica, potencialmente, rápida e barata, a ser usada como indicadora de contaminação ambiental (HOSE et al., 1987). Os eritrócitos de peixes são especialmente preferidos para esse teste, pois, sendo nucleados, os seus micronúcleos podem ser indicativos seguros de atividade clastogênica (AL-SABTI & METCALFE, 1995). O teste de micronúcleos em eritrócitos de peixes tem sido utilizado largamente para detectar os efeitos genotóxicos de mutágenos no meio ambiente e sua freqüência é considerada o reflexo dos danos genotóxicos nas células, principalmente nos cromossomos (ATEEQ et al., 2002). O teste de micronúcleo é um teste também indicado para aplicação em biomonitoramento da qualidade da água. Muitos estudos usando o teste de micronúcleos em anfíbios e em peixes têm sido descritos na literatura (BURGEOT et al., 1995; GRISOLIA & STARLING, 2001; MATSUMOTO, 2004; VENTURA, 2004; FERNANDES, 2005; SOUZA, 2005). Testes de micronúcleo, realizado em eritrócitos de sangue periférico de Oreochromis niloticus, têm sido utilizados para detectar a presença de mutágenos ambientais por Grisolia e Starling (2001), Matsumoto (2004), Ventura (2004), Fernandes (2005), Souza (2005). A técnica de micronúcleos em eritrócitos de peixes tem, convencionalmente, sido utilizada devido à facilidade de obtenção dessas células, à taxa mitótica relativamente alta do tecido hematopoiético, características estas que oferecem uma rápida resposta genotóxica, em relação à exposição a xenobióticos (SCHMID, 1976; TICE & IVETT, 1985). Al-Sabti et al. (1994) investigaram os efeitos citotóxicos causados pelo Cromo (tri e hexavalente) em carpas da Prússia (Carassius auratus gibelio), empregando o teste do micronúcleo. Os autores observaram que, tanto em laboratório como no campo, a exposição dos animais a vários níveis de concentração desta substância levou a um aumento na freqüência de micronúcleos, quando comparados com o grupo controle. Minissi et al. (1996) utilizaram o teste do micronúcleo em Barbus plebejus para monitorar, in situ, dois rios italianos caracterizados por diferentes níveis de poluição por compostos químicos. Os autores verificaram que a freqüência de micronúcleos parecia estar, fortemente, relacionada com a qualidade da água dos locais examinados, corroborando assim na indicação do teste para este fim (monitoramento ambiental). Hose et al. (1987), por sua vez, usando o teste do micronúcleo em eritrócitos de peixes (Genyonemus lineatus e Paralabras clathratus) de um rio do sul da Califórnia, mostraram que a presença de pesticidas como o DDT e o PCB no ambiente não resultou em um aumento significativo na freqüência de micronúcleos. Outros estudos realizados por Hose et al. (1984) e Das & Nanda (1986) constataram que muitos agentes clastogênicos e mutagênicos, tais como o benzo(a)pireno e a mitomicina C, induzem a formação de micronúcleos. Segundo Ateeq et al. (2002), o aumento da freqüência de micronúcleos e de células alteradas foi significativo, quando eritrócitos do peixe-gato Clarias batrachus foram analisados, após a exposição aos herbicidas 2,4-D e butacloro. Houve uma relação positiva de dose-resposta em todas as exposições realizadas para os dois herbicidas e em todos os tempos testados (ATEEQ et al., 2002). Os ensaios de anormalidades nucleares e de micronúcleos, realizados com peixes, têm sido largamente aplicados para a investigação dos efeitos de genotoxicidade ambiental (AL-SABTI, 1986; HOSE et al., 1987; CARRASCO et al., 1990; HUGHES & HEBERT, 1991). 2.6. Ensaio do cometa No curso dos estudos de danos e reparo de DNA, o ensaio cometa se mostrou uma técnica capaz de detectar danos citotóxicos de DNA, resultante de uma conseqüente ação apoptótica (WYLLIE et al., 1980). Considerada, atualmente, como uma das mais eficientes ferramentas no biomonitoramento ambiental, o ensaio do cometa pode ser utilizado para se avaliar danos em células em proliferação ou não, in vivo ou in vitro e podem ser aplicadas com o propósito de análises genotoxicológicas (MONTEITH & VANSTONE, 1995). O ensaio do cometa, por ser considerado sensível, rápido, econômico, além de requerer poucas células para a sua execução (MITCHELMORE & CHIPMAN, 1998; SASAKI et al., 1997; KOSZ-VNENCHAK & ROKOSZ, 1997), tem sido indicado como um método para detectar mudanças muito pequenas na estrutura do DNA célula a célula, tais como as atividades de reparo, o modo de seu empacotamento e sua integridade (KOPPEN et al., 1999). O método do ensaio do cometa foi desenvolvido por Singh et al. (1988), que adaptaram outras metodologias já utilizadas, desenvolvendo uma técnica de eletroforese de célula única (SCGE-single-cell gel eletrophoresis), sob condições alcalinas. Essa técnica evidencia a ocorrência de quebras em cadeias simples do DNA. A visualização subseqüente da mobilidade dos fragmentos de DNA nuclear tornou-se um meio bastante adequado para se detectar os danos no DNA em células únicas. Os protocolos para o ensaio do cometa variam entre laboratórios. Porém, recentemente, McNamee et al. (2000) propuseram modificações nos métodos ortodoxos de célula única, fazendo com que várias células fossem processadas de uma só vez, aumentando a eficiência da técnica, sem comprometer a sua confiabilidade. Os resultados obtidos por eles demonstraram-se similares àqueles previamente reportados, quando utilizaram o ensaio de cometa convencional. Monteith & Vanstone (1995) compararam o potencial do ensaio do cometa como teste genotoxicológico com outras técnicas in vitro (aberrações cromossômicas e mutações, utilizando células pulmonares V79 de hamsteres chineses) e in vivo (micronúcleos de medula óssea em camundongos e reparo de DNA em ratos), demonstrando que o cometa tem a habilidade de detectar danos no DNA, tanto quanto as demais metodologias. Mitchelmore & Chipman (1998), concluíram que o ensaio do cometa é um método adequado como biomarcador não específico de genotoxicidade em peixes e outros organismos aquáticos, destacando a sensibilidade das células sangüíneas destes animais aos efeitos genotóxicos. 2.7. Localização e caracterização da área de estudo Os rios Atibaia e Jaguarí, pertencentes a bacia do Piracicaba, Capivari e Jundiaí (PCJ), passam pelo município de Paulínia-SP, região esta que abriga 51.242 habitantes, 107 indústrias, dentre elas a Refinaria de Paulínia (REPLAN). A REPLAN capta água do rio Jaguarí, para o desenvolvimento de suas atividades e despeja, após passagem por tratamentos (físico-químicos, biológicos e lagoa de estabilização), os seus efluentes no rio Atibaia (Fig. 1) A REPLAN possui uma área de 9.125 milhões de m2 e é a maior refinaria de petróleo do sistema PETROBRÁS, responsável pelo refino de cerca de 20% do petróleo no Brasil. 2.8. Classificação das águas dos rios Atibaia e Jaguarí. A resolução CONAMA 20 - decreto 8468 estabelece e limita alguns parâmetros específicos indicadores para cada classe, a serem considerados (como oxigênio dissolvido, coliformes fecais, pH, turbidez, entre outros), para avaliação das condições de qualidade das águas (ANEXO 1). Segundo o comitê das Bacias Hidrográficas do Piracicaba, Capivari e Jundiaí e regiões; na situação atual, o rio Jaguarí encontra-se como de Classe 2 e o rio Atibaia de classe 4. Posteriormente, esses dois rios se unem para formar o rio Piracicaba, que segundo a mesma classificação, é caracterizado como pior que classe 4. 3. ARTIGO 1 MUTAGENICIDADE DE EFLUENTES DE REFINARIA, AVALIADA PELO TESTE DE ABERRAÇÕES CROMOSSÔMICAS, EM ALLIUM CEPA. Márcia M. Hoshina1 e *Maria A. Marin-Morales1 1Universidade Estadual Paulista, IB-Campus de Rio Claro, Av. 24 A, 1515, CEP: 13506-900, Rio Claro/SP-Brasil *Autor responsável pela correspondência: fone (19)3526-4143; Fax: (19) 3536-0009. Agência de Fomento: ANP/PRH-05. RESUMO A emissão de efluentes de indústrias em ecossistemas aquáticos faz com que ocorra, a cada dia, um aumento no comprometimento na qualidade desse recurso mineral e isso acaba refletindo na sobrevivência dos seres vivos, visto que o consumo direto ou indireto de águas contaminadas podem constituir certo perigo à saúde do homem e de todos os outros seres vivos expostos. O presente trabalho teve como objetivo avaliar se os efluentes de refinaria de petróleo que são lançados no rio Atibaia, município de Paulínia/SP, apresentam potencial mutagênico sob células meristemáticas de Allium cepa. Para isso, foram coletadas amostras de água à Montante do Rio Jaguarí, (antes da captação da refinaria), na entrada da lagoa de estabilização da REPLAN, na saída da lagoa de estabilização (água de despejos no Rio Atibaia), a 1Km a montante do ponto de despejo, no rio Atibaia, a 1 Km a jusante do ponto de despejo e após o tratamento físico-químico (antes do tratamento biológico). Sementes de Allium cepa foram colocadas para germinar nas águas derivadas dos diferentes pontos de coleta, em água milli-Q (controle negativo) e em metilmetano sulfonato (controle positivo). Os meristemas foram coletados e analisados citologicamente. A análise do potencial mutagênico foi feito pela metodologia de avaliação de indução de aberrações cromossômicas, de presença de micronúcleos e de avaliação da indução de morte celular. Da análise dos resultados pode-se inferir que as amostras de águas coletadas após a utilização pela empresa e antes do tratamento biológico apresentaram as mais altas taxas de mutagenicidade e citotoxicidade. Índices menores foram observados para as outras amostras analisadas. Pelos nossos resultados podemos sugerir que, mesmo passando por tratamentos, o efluente final da refinaria da cidade de Paulínia ainda possui em sua composição substâncias químicas capazes de promoverem mutagenicidade em células meristemáticas de Allium cepa. Os efluentes da refinaria também apresentam substâncias químicas como os HPAs, que promoveram a morte celular em meristemas de Allium cepa, decorrente da desestruturação do envoltório celular. Palavras-chave: mutagenicidade, aberrações cromossômicas, Allium cepa, micronúcleos, efluentes de refinaria, morte celular. 1. INTRODUÇÃO A poluição ambiental aquática é um problema sério e crescente. Embora exista uma legislação pertinente, este tipo de poluição, decorrente da emissão de resíduos tóxicos, ainda ocorre. Os efeitos tóxicos de diversas substâncias em ecossistemas aquáticos não se restringem apenas aos desequilíbrios ecológicos observados em corpos d’água, mas podem afetar, a longo prazo, a saúde humana, se considerada a possibilidade da ocorrência dos fenômenos de persistência e bioacumulação de poluentes tóxicos, ao longo da cadeia alimentar (ALVES, 1990; HOUK, 1992). As atividades humanas têm provocado, ao longo dos anos, grandes impactos nos ecossistemas aquáticos, sendo que os despejos de efluentes industriais e domésticos constituem-se, indiscutivelmente, a maior fonte antrópica de compostos químicos que são lançados nos corpos d’água (JUNGCLAUS e col. 1978; STAHL, 1991; VEGA et al., 1996). Muitos desses efluentes contêm misturas tóxicas, tais como agrotóxicos, metais pesados, produtos industriais e uma variedade de outras substâncias que, conjuntamente, podem agravar ainda mais as condições ambientais e, conseqüentemente, todo o ecossistema. Os efluentes industriais podem conter substâncias potencialmente mutagênicas e que causam efeitos diretos ou indiretos à saúde e à sobrevivência dos seres vivos, incluindo o homem. Dentro dessas substâncias, pode-se citar os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs), que são reconhecidamente mutagênicos (RANK & NIELSEN, 1998). Os efluentes industriais derivados de atividade de refinaria de petróleo contém quantidades variadas de HPAs, o que os caracterizam como substâncias complexas, quanto à constituição. Poucos estudos foram realizados com o intuito de se investigar os efeitos dos HPAs em misturas complexas, sendo comumente avaliados os efeitos de compostos isolados (WHITE, 2002). Com o aumento acelerado da produção de petróleo, houve também um aumento de seus derivados encontrados nos corpos d´água (FELLENBERG, 1980) e, segundo Houk (1992), as refinarias de petróleo possuem efluentes com um alto potencial mutagênico. No entanto, algumas medidas foram e estão sendo tomadas para minimizar estes riscos. Dentre essas medidas, o monitoramento ambiental é uma importante ferramenta para se avaliar os eventuais impactos causados pelo petróleo e seus derivados. A avaliação da genotoxicidade de químicos perigosos/danosos tem sido feita, há anos, por meio de testes com vegetais superiores (RANK et al.,2002). Ensaios com vegetais são úteis para se testar amostras ambientais complexas como esgotos industriais e domésticos (GROVER & KAUR, 1999; HOSHINA, 2002; MATSUMOTO, 2004), águas de rios (RANK & NIELSEN, 1998; HOSHINA, 2002; MATSUMOTO, 2004), e solos contaminados (CHANG et al., 1997; KOVALCHUCK et al., 1998; COTELLE et al., 1999). Testes de mutagenicidade utilizando-se Allium são realizados desde o final da década de 30 e foram padronizados por Fiskejö (1985). Esse teste constitui um ensaio muito sensível e confiável para monitoramento ambiental. Ele é baseado na avaliação do potencial genotóxico e mutagênico de substâncias químicas em espécies do gênero Allium, onde se registra as alterações na atividade mitótica (mudanças no índice mitótico); anormalidades mitóticas e aberrações cromossômicas em células meristemáticas das raízes dessa planta (VIDAKOVIC-CIFREK et al., 2002; HOSHINA, 2002; MATSUMOTO, 2004; VENTURA, 2004; FERNANDES, 2005). Diferentes espécies de Allium têm sido utilizadas como sistemas testes biológicos para se estudar poluições ambientais por substâncias químicas (GRANT, 1982; FISKEJÖ, 1988; HOSHINA, 2002; MATSUMOTO, 2004; VENTURA, 2004; FERNANDES, 2005), bem como efeitos da radioatividade (KOVALCHUCK et al., 1998; EVSEEVA & KHRAMOVA, 2002). A espécie mais freqüentemente utilizada deste gênero é Allium cepa, devido ao conhecimento da duração do seu ciclo celular e da sua reação a muitos agentes mutagênicos conhecidos (EVSEEVA et al., 2003). Esta espécie é considerada eficiente para testes de citotoxicidade e genotoxicidade (FISKEJÖ, 1985), devido às características que possui na sua cinética de proliferação, pelo crescimento rápido de suas raízes, pelo grande número de células em divisão, pela sua alta tolerância a diferentes condições de cultivo, pela sua disponibilidade durante o ano todo, pelo seu fácil manuseio e por possuir cromossomos em número reduzido (2n=16) e de grande tamanho (QUINZANI-JORDÃO, 1987). Os testes realizados com Allium cepa são adequados para a avaliação de parâmetros microscópicos como anáfases prematuras, aderências cromossômicas, pontes e fragmentação cromossômica, C-mitoses e micronúcleos, que são indicadores de eventuais mutações no conteúdo genético celular. Uma das mais antigas e utilizadas ferramentas para se realizar estudos de avaliação de genotoxicidade e de mutagenicidade é o teste de aberrações cromossômicas. Esse teste, baseado na citogenética clássica, é um dos poucos métodos diretos usados para mensurar mutações em sistemas expostos a mutágenos ou carcinógenos potenciais (RANK et al., 2002). O teste de aberrações cromossômicas com Allium cepa fornece um rápido exame dos efeitos genotóxicos e mutagênicos de substâncias químicas dispostas no meio (GRANT, 1982; GRANT, 1994; FISKEJÖ, 1985; FISKEJÖ, 1988; FISKEJÖ, 1993a; FISKEJÖ, 1993 b; NIELSEN & RANK,1994). Este teste tem sido amplamente utilizado para se monitorar os efluentes de rios (FISKEJÖ, 1993b; RANK & NIELSEN, 1994; SMAKA-KINCL et al., 1996; HOSHINA, 2002; MATSUMOTO, 2004). De acordo com Mello et al. (2001), agentes indutores de estresse, tais como: radiação, drogas, choques térmicos, metais pesados, álcoois, hipóxia, jejum, inibidores metabólicos, agentes oxidantes e infecções virais, dentre outros, podem induzir a morte celular. Segundo Kaioumova et al. (2001), a perturbação de células por agentes químicos pode levar a uma seqüência complexa de eventos, levando a morte celular, tanto por apoptose como por necrose. Está bem estabelecido que os fosfolipídios das membranas biológicas estão arranjadas de forma assimétrica entre a bicamada lipídica (DEVAUX, 1991; SHROIT e ZWAAL, 1991; ZACHOWSKI, 1993). Em membranas plasmáticas de seres eucarióticos, os aminofosfolipídios como fosfatidilserina residem, predominantemente, na camada externa da membrana plasmática. Verhoven et al. (1995) propuseram que a exposição da fosfatidilserina seria resultante tanto da diminuição da regulação da aminofosfolipídio translocase, quanto do aumento da saída dos fosfolipídios da membrana, o que facilita a movimentação bidirecional da bicamada de todos os fosfolipídios. Zhao et al. (1998) demonstraram que a saída dos fosfolipídios mediam a redistribuição dos fosfolipídios da membrana plasmática em células ativadas, em células em necrose ou em apoptose. Consideráveis mudanças morfológicas ocorrem durante a morte celular e tem sido proposto que o citoesqueleto deve estar envolvido neste processo. Estudos realizados por Cotter et al. (1992) indicaram que a actina está, diretamente, relacionada ao processo de morte celular. Pittman et al. (1997) focaram seus estudos na tubulina e demonstraram que ela se reorganiza de forma congruente, com as mudanças características da morte celular. Esses autores ainda demonstraram que a morte celular pode ser induzida por drogas que despolimerizam ou estabilizam os microtúbulos. Estudos recentes indicam que quebras proteolíticas de uma série de proteínas chave, como por exemplo a actina, espectrina, lamina A e B, por proteases ativadas por caspases, desempenham um papel importante no processo da morte celular (MARTIN e GREEN, 1995). O presente trabalho teve como objetivo avaliar se os efluentes de refinaria de petróleo, que são lançados no rio Atibaia, município de Paulínia/SP, continham substâncias potencialmente mutagênicas, pelo teste de aberrações cromossômicas, realizados com o sistema teste de Allium cepa. 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1. Coleta das amostras Amostras de água foram coletadas, sazonalmente, durante os anos de 2003 e 2004, em seis pontos distintos: 1) Montante do Rio Jaguarí (acima da captação da água utilizada pela refinaria); 2) Entrada da lagoa de estabilização da REPLAN; 3) Saída da lagoa de estabilização (água destinada aos despejos no Rio Atibaia); 4) 1Km a montante do ponto 3, no Rio Atibaia; 5) 1 Km a jusante do ponto 3; 6) Após o tratamento físico- químico e antes do tratamento biológico (Fig.1) 2.2. Material biológico O material biológico utilizado como sistema–teste, para se avaliar os efeitos mutagênicos das águas coletadas nos diversos pontos de coleta, constituiu-se de sementes de Allium cepa (2n=16 cromossomos) de um mesmo lote (variedade Baia periforme), estocadas em local escuro e acondicionadas a temperatura de 6-10° C. A utilização de sementes de Allium cepa para o desenvolvimento dos ensaios, justifica-se pela necessidade de repetições em períodos diferentes do ano, o que poderia levar ao uso de diferentes variedades, pela disponibilidade variada de mercado. Segundo Leme et al. (2005), os ensaios utilizados com bulbo e com sementes de Allium cepa apresentam resultados estatisticamente similares, quanto às potencialidades da espécie em responder a xenobiontes observáveis pelos testes de aberrações cromossômicas. Cinqüenta sementes de Allium cepa foram colocadas para germinar em placas de Petri, diretamente expostos às águas dos pontos de coleta estudados (um para cada ponto). Para os testes controle, as sementes foram expostas a germinação em água milli-Q (controle negativo) e em metilmetano sulfonado, concentração de 4X10-4M (controle positivo). As sementes permaneceram nas placas de Petri até que as raízes atingissem um tamanho médio de 2 cm de comprimento. Posteriormente, essas raízes foram coletadas e fixadas em Carnoy 3:1 (três partes de etanol para uma parte de ácido acético). Para a realização das análises citológicas, os meristemas foram submetidos a uma hidrólise ácida em HCl 1 N a 60º C, durante 8 minutos e, posteriormente, submetidas ao reativo de Schiff, por 2 horas em local escuro, conforme metodologia de Feulgen & Rossenbeck (1924) com modificações. As pontas das raízes foram seccionadas, em lâmina, para a extração das suas regiões meristemáticas. Para intensificar a coloração e promover um melhor contraste das células, foi adicionada aos meristemas uma gota de carmim acético (1%). O material foi recoberto por lamínula, onde, com o auxílio de um estilete de madeira, foi feita uma leve pressão, somente para proporcionar um melhor espalhamento das células sobre a lâmina. As lamínulas foram extraídas em nitrogênio líquido e as lâminas montadas em Enthelan, para serem, posteriormente, observadas. O material foi analisado em microscopia de luz (Germany, Carl Zeiss) no aumento de 40X10 vezes. Os melhores registros foram fotodocumentados. Os índices das anormalidades foram obtidos pela relação entre pelas células portadoras de alterações e total de células observadas, segundo a fórmula: Índice de alterações cromossômicas (IAC) = Número total de células alteradas Total de células observadas X 100 Os resultados foram analisados estatisticamente pelo método Kruskal-Wallis. Este é um teste não-paramétrico, conhecido como teste H, destinado a comparar 3 ou mais amostras independentes de mesmo tamanhos ou desiguais, cujos escores devem ser mensurados, pelo menos, a nível ordinal. 3. RESULTADOS Os resultados observados nas análises estão reunidos na Tabela 1 e nas Figuras 2, 3 e 4. Pelas análises realizadas, foi possível observar a presença de aberrações dos tipos: quebras cromossômicas e micronúcleos (aberrações cromossômicas mutagênicas – Tabela 1, Figura 2), C-metáfases, metáfases poliplóides, metáfases com aderências cromossômicas, anáfases multipolares, anáfases e telófases com atrasos, perdas e pontes cromossômicas, células polinucleadas e células poliplóides (aberrações cromossômicas potencialmente mutagênicas – Tabela 1, Figura 3), além de células em processo de morte celular (núcleos heteropicnóticos, células com fragmentação nuclear e células com citoplasma vacuolizado - Tabela 1, FIGURA 4). Os micronúcleos e quebras cromossômicas foram reunidas em uma mesma categoria, nomeada de aberrações cromossômicas mutagênicas, por caracterizar alterações consideradas efetivamente mutagênicas. As demais aberrações (C-metáfases, metáfases poliplóides, metáfases com aderências cromossômicas, anáfases multipolares, anáfases e telófases com atrasos, perdas e pontes cromossômicas, células polinucleadas, células poliplóides) foram reunidas na categoria de aberrações cromossômicas potencialmente indutoras de mutagenicidade, por serem apenas indicativos de possível efeito citotóxico. Pela análise dos dados, podemos observar que o controle negativo não apresentou índice de células portadoras de aberrações cromossômicas mutagênicas e nem de células em processo de morte celular, apresentando, somente, células portadoras de aberrações potencialmente mutagênicas, porém com índices muito baixos (0,12%±0,046), como pode ser visto na Tabela 1, Figuras 2, 3 e 4. O controle positivo (MMS) apresentou índice de aberrações mutagênicas igual a 0,36%±0,14, de aberrações cromossômicas potencialmente mutagênicas igual a 0,87%±0,1 e de células em processo de morte celular de 0,05%±0,1. O ponto 1 (montante do Rio Jaguarí - acima da captação da água utilizada pela refinaria), apesar de apresentar o menor índice de aberrações cromossômicas potencialmente mutagênicas (0,06%±0,11), apresentou índices de aberrações cromossômicas mutagênicas igual a 0,135%±0,045 e de células em morte celular igual a 0,22%±0,07 (Tabela 1, Figuras 2 , 3 e 4). O ponto 2 (entrada da lagoa de estabilização da REPLAN) apresentou valores de 0,2%±0,14 para células portadoras de aberrações cromossômicas mutagênicas. O índice observado para as aberrações cromossômicas potencialmente mutagênicas foi de 0,73%±0,085 e de células em processo de morte celular igual a 0,3%±0,52. O ponto 3 (saída da lagoa de estabilização - água destinada aos despejos no Rio Atibaia) apresentou um índice de células em morte celular com valor de 0,069%±0,086, uma freqüência de células portadoras de aberrações cromossômicas mutagênicas de 0,135%±0,15 e uma frequência de células com aberrações cromossômicas potencialmente mutagênicas de 0,415%±0,24 (Tabela 1, Figuras 2 , 3 e 4). O ponto 4 (1Km a montante do ponto 3, no Rio Atibaia) apresentou células com aberrações cromossômicas mutagênicas com um índice de 0,067%±0,086. O valor observado para células portadoras de aberrações cromossômicas potencialmente mutagênicas foi de 0,34%±0,23 e não apresentou células em processo de morte celular. O ponto 5 (1 Km a jusante do ponto 3) também não apresentou células em processo de morte celular, porém apresentou uma freqüência de células com aberrações cromossômicas mutagênicas de 0,31%±0,45 e um índice de aberrações cromossômicas potencialmente mutagênicas igual a 0,32%±0,36 (Tabela 1, Figuras 2, 3 e 4). O ponto 6 (após o tratamento físico-químico e antes do tratamento biológico) apresentou índice de células portadoras de aberrações cromossômicas mutagênicas igual a 0,36%±0,27. O índice observado para células portadoras de aberrações cromossômicas potencialmente mutagênicas foi de 0,99%±0,44 e de células em processo de morte celular de 1,31%±0,74 (Tabela 1, Figuras 2, 3 e 4). 4. DISCUSSÃO E CONCLUSÃO O teste de aberrações cromossômicas com Allium cepa caracteriza-se como um instrumento que fornece um rápido exame dos efeitos genotóxicos e mutagênicos de substâncias químicas presentes no meio (GRANT, 1982; GRANT, 1994; FISKEJÖ, 1985; FISKEJÖ, 1988; FISKEJÖ, 1993a; FISKEJÖ, 1993b; NIELSEN & RANK,1994). Este teste tem sido, amplamente, utilizado para se monitorar os efluentes de rios (FISKEJÖ, 1993b; RANK & NIELSEN, 1994; SMAKA-KINCL et al., 1997). Os dados referentes à análise de células portadoras de alterações cromossômicas, observadas nos ensaios realizados com meristemas radiculares de Allium cepa foram divididos em duas categorias: as alterações cromossômicas mutagênicas e as alterações potencialmente mutagênicas. Essa classificação se explica pela característica da informação que se pode inferir, em cada tipo de anormalidade observada. As anormalidades cromossômicas envolvendo alterações como C-metáfases, metáfases poliplóides, metáfases com aderências, anáfases multipolares, anáfases e telófases com atrasos, perdas de cromossomos inteiros e pontes cromossômicas, não foram consideradas mutagênicas, pois muitos desses efeitos são derivados da atuação do xenobionte sobre estruturas celulares e não, diretamente, sobre o material genético. Embora essas alterações possam, indiretamente, levar ao comprometimento do material genético, não podemos nos certificar se a célula, após essa ação, poderá permanecer viável e assim portadora de uma alteração genética. Desta forma, consideramos estas anormalidades como aberrações cromossômicas potencialmente mutagênicas. As células portadoras de micronúcleos e de fragmentos cromossômicos nos sugerem uma ação mutagênica, pois decorre em um efeito sobre o material genético da célula, podendo então ser considerada como aberrações cromossômicas mutagênicas. Desse modo, os micronúcleos foram considerados como aberrações cromossômicas mutagênicas, porque são observáveis em células em interfase (células estas que já passaram por um ciclo completo de divisão) confirmando a persistência da alteração, pois o evento não foi suficiente para promover a inviabilidade celular (morte celular). As quebras cromossômicas foram classificadas como aberrações mutagênicas, pois evidenciam uma ação direta de um dado xenobionte sobre a molécula de DNA, promovendo assim a fragmentação do mesmo. Esses fragmentos resultantes, por não serem portadores de centrômeros, não se ligaria ao fuso, podendo assim se organizar em pequenas estruturas, caracterizando os chamados micronúcleos. Apesar dos micronúcleos poderem se originar de perda de cromossomos inteiros, as perdas cromossômicas não podem ser classificadas como mutagênica, mas sim como potencialmente mutagênica. Quando cromossomos inteiros são perdidos, eles podem, em algum momento, readquirir a sua capacidade em se ligar aos fusos de um dos pólos e assim se segregar normalmente, se reincorporando ao núcleo principal. Todas as demais aberrações cromossômicas (C-metáfases, metáfases poliplóides, metáfases com aderências cromossômicas, anáfases multipolares, anáfases e telófases com atrasos e pontes cromossômicas, células polinucleadas, células poliplóides) foram reunidas em aberrações potencialmente mutagênicas porque as células portadoras destas alterações podem desencadear efeitos adversos à célula, levando-a à morte e não a mudanças. A análise dos resultados mostrou um alto índice de células portadora de C- metáfases, para os pontos 6, 2 e 3. A C-metáfase (células com cromossomos condensados e distribuídos aleatoriamente e com ausência de fuso) foi, originalmente, observada após o tratamento das células com concentração, suficientemente, alta de colchicina. Esse tipo de anormalidade mitótica pode, às vezes, levar a formação de núcleos poliplóides, embora o resultado mais freqüente seja a formação de vários micronúcleos (KIRSCH-VOLDERS, 2002; FERNANDES, 2005). Nas C-metáfases ou C-mitoses, o fuso nuclear é completamente inativado, o que significa que nenhuma placa equatorial torna-se organizada e, conseqüentemente, a divisão do centrômero é atrasada ou ausente. Desta forma, um tratamento C-metafásico contínuo conduzirá a uma duplicação do número de cromossomos das células que passam por mitose (FERNANDES, 2005). Como efeito da C-metáfase, também temos a produção de números cromossômicos variáveis, decorrendo na produção de células com números superiores ou inferiores aos originais. Então, um desvio muito grande em relação ao número normal induziria um desbalanço cromossômico, com perda da viabilidade, inativação parcial ou completa do fuso nuclear e o aumento da contração cromossômica. A C-metáfase deve ser referida como um mecanismo causador de sérios danos, podendo ser incluída entre os parâmetros utilizados para avaliação dos efeitos genotóxicos (FISKEJÖ, 1985; FISKEJÖ, 1993c). Foram também observadas a presença de células portadoras de anáfases multipolares, cromossomos perdidos ou com atrasos de segregação, anáfases com ponte, aderências cromossômicas, além de células poliplóides, sendo os mais altos índices observados, decrescentemente, para os pontos 6, 2 e 3. Anáfases multipolares e com cromossomos perdidos são consequências de C- metáfases fracas e podem levar a aneuploidia (KOVALCHUCK et al., 1998; FERNANDES, 2005). C-metáfases, anáfases multipolares, cromossomos perdidos, atrasos cromossômicos e poliploidia são fenômenos que podem ser derivados de problemas com os microtúbulos (microtúbulos interrompidos ou desenvolvidos de forma incompleta), uma vez que essas estruturas são importantes componentes do fuso mitótico e os fusos são os responsáveis pela segregação correta dos cromossomos para as células filhas (VIDAKOVIC-CIFREK et al., 2002; FERNANDES, 2005). De acordo com Fiskejö & Levan (1993), Marcano & Del Campo (1995) e por Marcano et al. (1999), aderência cromossômica é um sinal comum da influência tóxica nos cromossomos e decorre, provavelmente, em um efeito irreversível para a célula. A aderência é um tipo de anormalidade que envolve a matriz protéica do material cromatínico e não, propriamente, a molécula de DNA. Por ser um processo irreversível, geralmente promove a morte da célula (FISKEJÖ, 1988; FISKEJÖ, 1995; FISKEJÖ, 1997; FERNANDES, 2005). A formação de pontes anafásicas, rupturas nos cromossomos, cromossomos perdidos (não migração das cromátides) e cromossomos que não sofreram disjunção (cromátides que não se separaram) são fenômenos que podem ocorrer como conseqüência da aderência (MARCANO et al., 2004). Neste caso, os cromossomos permanecem unidos e, quando separados, podem levar a ruptura ou a perda dos cromossomos (MARCANO et al., 1999), bem como a aneuploidia e a poliploidia (FISKEJÖ, 1985; MATSUMOTO, 2004; FERNANDES, 2005). Quando as pontes cromossômicas resultam de rearranjos estruturais, são acompanhadas de fragmentos cromossômicos (GIACOMELLI, 1999). Os fragmentos cromossômicos, segundo Fiskejö (1993a), podem ser derivados de quebras cromossômicas que aparecem em decorrência de pontes anafásicas. Essas pontes podem ser originadas de translocações cromossômicas coesivas. Segundo Rank & Nielsen (1997) e Fernandes (2005), a presença de anáfases multipolares ocorre devido ao mau funcionamento do fuso mitótico, que distribui os cromossomos irregularmente, encaminhando-os para mais de dois pólos das células, contrariamente ao que ocorre em células de divisão celular normal. A poliploidia pode ser induzida pela ausência de fuso mitótico funcional e a conseqüente falha na migração dos cromossomos filhos para os pólos. Esse processo também é conhecido como atraso mitótico (ELHAJOUJI et al., 1998). Também foi observado em nossas análises a presença de células portadoras de micronúcleos, sendo, novamente, as mais altas freqüências observadas para os pontos 6, 2 e 3 respectivamente. Micronúcleos podem aparecer em células que passaram pelo processo de divisão, onde houve a ocorrência de fragmentos cromossômicos, derivados de quebras cromossômicas e/ou de cromossomos inteiros que não foram conduzidos pelos fusos aos pólos celulares, durante a divisão celular. Na telófase, esses fragmentos ou cromossomos inteiros são envolvidos por membranas, formando um núcleo menor, separado do núcleo principal, razão pela qual recebe o nome de "micronúcleo" (SUDHAKAR et al., 1998; KIRSCH-VOLDERS, 2002). Da análise dos nossos resultados pudemos observar uma alta incidência de células meristemáticas de Allium cepa com comprometimento na sua morfologia. Estas células, quando observadas ao microscópio óptico, se apresentavam desestruturadas, aparentando fragilidade do envoltório celular e, muitas vezes, com o seu conteúdo citoplasmático excedendo os limites celulares. Após inúmeras repetições, pudemos descartar a hipótese de artefato de técnica. Esse fato pode ser indicativo de morte celular, pois, segundo Cristea & Esposti (2004), células em processo de morte celular, especificamente em necrose, apresentam o seu volume aumentado, o que leva a uma ruptura da membrana plasmática, o que acaba expondo o seu conteúdo intracelular ao meio externo. Segundo Doneli et al. (2003), mudanças no volume celular são consequências diretas na mudança de permeabilidade da membrana celular, que parecem estar associadas às mudanças no citoesqueleto. Esse aumento da permeabilidade da membrana celular pode ser explicado pela translocação da fosfatidilserina da superfície interna da membrana plasmática para a superfície externa (SHOUNAN et al., 1998). Outra explicação para o aumento da permeabilidade seria a de que compostos lipofílicos, como os derivados de petróleo, podem se intercalar entre a membrana plasmática, fazendo com que ocorra uma desestruturação dessa membrana, levando assim a um aumento da sua permeabilidade e a uma conseqüente perda da sua função protetora (THAKKAR et al., 2000). Além de atuar na membrana plasmática, o aumento da permeabilidade celular poderia ser ocasionado por mudanças na estrutura do citoesqueleto. Alguns PAHs podem induzir um aumento na produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), e essas EROs podem afetar, diretamente, o citoesqueleto pela mudança do estado redox de algumas enzimas regulatórias ou até mesmo da actina (elemento presente no citoesqueleto), fazendo com que ocorra uma desestruturação desse citoesqueleto (GÓMEZ-MENDIKUTE & CAJARAVILLE, 2003). Este fato poderia explicar a existência de células em processo de morte celular, devido a exposição aos compostos do petróleo, visto que os efluentes da refinaria em estudo possuem, em sua composição, os HPAs. Além disso, foram observadas em nossas análises, células com o seu citoplasma vacuolizado. Segundo Zakeri & Lockshin (2002), durante o processo de necrose as enzimas lisossomais podem digerir as organelas citoplasmáticas, dando ao citoplasma um aspecto vacuolizado. Desse modo, podemos afirmar que as células observadas estão em processo de morte celular, comprovado pela vacuolização do citoplasma, decorrente da digestão de suas próprias organelas. Através da análise dos resultados, podemos observar que o ponto 6 (após o tratamento físico-químico e antes do tratamento biológico) apresentou um índice de aberrações mutagênicas igual ao observado para o controle positivo (tratamento com MMS - substância conhecidamente mutagênica), e um índice de aberrações cromossômicas potencialmente mutagênicas superiores ao encontrado para o mesmo controle. Desse modo, as águas coletadas no ponto 6 podem ser classificadas como altamente mutagênicas. O índice de células em processo de morte celular, para esse mesmo ponto, foi o mais alto observado, uma vez que o controle positivo não apresentou índices elevados desse tipo de alteração. Isto pode ser explicado pela própria característica da substância usada para o teste controle positivo (MMS) que é uma substância de ação mutagênica e não citotóxica. Desse modo, as águas do ponto 6 podem ser classificadas como, além de mutagênica, altamente citotóxica. O ponto 2 (entrada da lagoa de estabilização da REPLAN) apresentou índices de anormalidade inferiores aos observados para o ponto 6. No ponto 2, a água já passou pelo tratamento biológico, mostrando que este tratamento parece ser, relativamente, efetivo, pois estas águas ainda possuem certa potencialidade mutagênica e citotóxica. Pelas análises realizadas com as águas do ponto 3 (saída da lagoa de estabilização - água destinada aos despejos no Rio Atibaia), que já passaram pelos tratamentos físico-químicos, biológicos e pelo tratamento na lagoa de estabilização, podemos sugerir que esses tratamentos se mostraram efetivos, pois houve uma acentuada diminuição dos índices de aberrações mutagênicas, de aberrações potencialmente mutagênicas e de células em processo de morte celular, quando comparados com as amostras dos pontos 6 e 2. As águas do ponto 3 apresentam baixos índices de aberrações mutagênicas, tendo seus valores foram superiores somente aos observados para as águas do ponto 1 (montante do Rio Jaguarí - acima da captação da água utilizada pela refinaria). As águas do ponto 1 são consideradas, pelos órgãos competentes, como uma água de excelente qualidade. Comparando-se ainda as águas do ponto 3 com as águas do ponto 1, pode-se observar que o índice de células em processo de morte celular do ponto 3 foi menor que o observado para o ponto 1. No entanto, o índice de aberrações potencialmente mutagênicas observado para o ponto 3 foi superior ao observado para o ponto 1. As águas do ponto 4 (1 Km a montante do ponto 3, no Rio Atibaia) apresentaram índices elevados de aberrações cromossômicas potencialmente mutagênicas, provavelmente, pelo fato destas águas receberem, previamente aos efluentes da refinaria de Paulínia, efluentes de diversas outras indústrias, o que pode estar comprometendo ainda mais a qualidade da água do rio Atibaia. No entanto, após o despejo do efluente da refinaria (ponto 5 - 1 Km a jusante do ponto 3), observa-se um aumento na freqüência de aberrações cromossômicas mutagênicas, fazendo com que a qualidade da água deste rio apresente um comprometimento ainda maior, embora as águas do efluente final da refinaria não tenham apresentado características citotóxicas consideráveis. Esses dados nos levam a crer que os efluentes de refinaria, analisados nesse estudo, possuem em sua composição substâncias e/ou compostos químicos que são capazes de atuar nos microtúbulos, no fuso mitótico, na matriz protéica da célula e no material genético, o que podemos inferir que esses efluentes apresentam um potencial citotóxico e mutagênico. Esses efluentes também devem possuir substâncias capazes de alterar a permeabilidade da membrana plasmática das células meristemáticas de Allium cepa ou substâncias ainda capazes de atuar no citoesqueleto dessas células, levando as mesmas à morte. A amostra do ponto 6 mostra um maior comprometimento, quando comparada com amostras de outros pontos de coleta. A medida em que vão se processando os tratamentos, vai se observando uma melhoria na qualidade das amostras, e uma conseqüente diminuição dos efeitos citotóxicos, genotóxicos e mutagênicos dos mesmos. Porém, foi observado que, quando os efluentes são lançados no rio Atibaia, os índices de aberrações cromossômicas mutagênicas voltam a aumentar, fato este, possivelmente, resultante do efeito sinergístico com os outros poluentes já existentes neste recurso hídrico. Os tratamentos empregados pela refinaria de petróleo parecem ser efetivos, porém outros impactos sofridos pelo rio Atibaia podem estar aumentando a potencialidade mutagênica de suas águas. 5. AGRADECIMENTOS Agradeço ao Departamento de Biologia do Instituto de Biociências da UNESP- Rio Claro, à Profº Dejanira de Franceschi de Angelis do Laboratório de Toxicologia de Águas do Departamento de Bioquímica e Microbiologia do Instituto de Biologia da UNESP-Rio Claro, ao programa PRH-05 (Programa de Recursos Humanos-05 da ANP) pelo apoio financeiro. T ab el a 1: Fr eq üê nc ia de ab er ra çõ es cr om os sô m ic as (% ) ob se rv ad as pa ra cé lu la s de A ll iu m ce pa , ap ós ge rm in aç ão em ág ua m ill i- Q (c on tr ol e ne ga ti vo ), em M M S- m et il m et an o su lf on at o (c on tr ol e po si ti vo ) e em ág ua s do s po nt os de co le ta . C on tr ol e ne ga ti vo C on tr ol e po si ti vo Po nt o 1 Po nt o 2 Po nt o 3 Po nt o 4 Po nt o 5 Po nt o 6 A be rr aç õe s cr om os sô m ic as m ut ag ên ic as (m ic ro nú cl eo s e qu eb ra s cr om os sô m ic as ) 0 0, 36 ±0 ,1 4* 0, 13 5± 0, 04 5 0, 2± 0, 14 0, 13 5± 0, 15 0, 06 7± 0, 08 6 0, 31 ±0 ,4 5 0, 36 ±0 ,2 7* A be rr aç õe s po te nc ia lm en te m ut ag ên ic as (o ut ra s ab er ra çõ es ) 0, 12 ±0 ,0 46 0, 87 ±0 ,1 * 0, 06 ±0 ,1 1 0, 73 ±0 ,0 85 0, 41 5± 0, 24 0, 34 ±0 ,2 3 0, 32 ±0 ,3 6 0, 99 ±0 ,4 4* C él ul as em pr oc es so de m or te ce lu la r 0 0, 05 ±0 ,1 0, 22 ±0 ,0 7 0, 3± 0, 52 0, 06 9± 0, 08 6 0 0 1, 31 ±0 ,7 4* N úm er o to ta ld e cé lu la s an al is ad as 21 43 5 21 82 9 21 87 0 20 79 2 21 27 5 21 57 9 21 02 1 21 42 6 N ot a: os va lo re s se gu id os po r * di fe ri ra m si gn if ic at iv am en te (0 ,5 % ) em re la çã o ao co nt ro le ,p el o te st e de K ru sk al -W al lis . Figura 2. Média e desvio padrão de células de Allium cepa, portadoras de aberrações cromossômicas mutagênicas. Figura 3. Média e desvio padrão de células de Allium cepa, portadoras de aberrações cromossômicas potencialmente/possivelmente mutagênicas. Obs: O símbolo “o” presente no gráfico representa um dado “outlier”. Figura 4. Média e desvio padrãode células de Allium cepa, em processo de morte celular. Obs: O símbolo “o” presente no gráfico representa um dado “outlier”. 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ALVES, M.N. Aplicação de bioensaios bacterianos para determinação da toxicidade aguda de efluentes industriais e corpos de água receptores. 1990. [s.n]. Dissertação (Mestrado em Microbiologia) – Universidade de São Paulo, São Paulo. CHANG, L.W.; MEIER, J.R.; SMITH, M.K. Apllication of plant and earthworm bioassays to evaluate remediation of a lead-contamined soil. Archives of Environmental Contamination Toxicology, v. 32, p. 166-171.1997. COTELLE, S.; MASFARAUD, J-F.; FÉRARD, J-F. Assessment of the genotoxicity of contamined soil with the Allium/Vicia- micronucleus and the Tradescantia- micronucleus assays. Mutatation Research, Amsterdam, v. 426, p. 161-171, 1999. COTTER, T.G.; LENNON, S.V.; GLYNN, J.M.; GREEN, D.R. Microfilament- disrupting agents prevent the formation of apoptotic bodies in tumor cells undergoing apoptosis. Cancer Research, Baltimore, v. 52, p. 997, 1992. CRISTEA, I.M.; ESPOSTI, M.D. Membrane lipids and cell death: na overview. Chemistry and Physics of Lipids, v. 129, p. 133-160, 2004. DEVAUX, P.F. Stattic and dynamic lipid assimetry in cell membranes. Biochemistry, v. 30, p. 1163-1173. 1991. DONELI, G.; FIORENTINI, C.; MATARRESE, P.; FALZANO, L.; CARDINES, R.; MASTRANTONIO, P.; PAYNE, W.P.; TITBALL, R.W. Evidence for cytoskeletal chages secondary to plasma membrane functional alterations in the in vitro cell response to Clostridium perfringens epilon-toxin. Comparative Immunology, Microbiology & Infections Diseases, v. 26, p. 145-156, 2003. ELHAJOUJI, A.; CUNHA, M.; KIRSCH-VOLDERS, M. Spindle poisons can induce polyploidy by mitotic slippage and micronucleate mononucleates in the cytokinesis- block assay. Mutagenesis, New York, v. 13, p. 193-198, 1998. EVSEEVA, T.I., KHRAMOVA, E.S. Action of low concentration of 232Th on Tradescantia (clone 02) and meristematic root itp cells of Allium cepa. In: Proceedings of the Fifth International Conference on High Levels of Natural Radiation and Radon Areas, Munich, pp. 489-491, 2002. EVSEEVA, T.I.; GERAS’KIN, S.A. SHUKTOMOVA, I.I. Genotoxicity and toxicity assay of water sampled from a radium production industry storage cell territory by means of Allium-test. Journal of Environmental Radioactivity, v. 68, p. 235-248, 2003. FELLENBERG, G. Introdução aos problemas da poluição ambiental. São Paulo, EDUSP, 1980, 196 p. FEULGEN, R.; ROSSENBECK, H. Mikroskopisch-chemischer Nachweis einer Nucleinsäure vom Typus der Thymonucleinsäure und die darauf beruhende elektive Farbung von Zellkernen in mikroskopischen Präparaten. Hoppe Seyler Z Physiol Chem., v. 135, p. 203–248, 19