REPROGRAMAÇÃO DE FIBROBLASTOS DE PELE E CÉLULAS DO CORDÃO UMBILICAL POR MEIO DE PLASMÍDEOS VIRAIS E TRANSPOSONS NA PRODUÇÃO DE IPS EQUINAS MIDYAN DAROZ GUASTALI Tese apresentada ao Instituto de Biociências, Câmpus de Botucatu, UNESP, para obtenção do título de Doutor no Programa de Pós- Graduação em Biologia Geral e Aplicada, Área de concentração Biologia Celular, Estrutural e Funcional. Profa. Dra. Fernanda Da Cruz Landim BOTUCATU – SP 2016 Programa de Pós-graduação em Biologia Geral e Aplicada Distrito de Rubião Júnior s/n CEP 18618-000 Cx Postal 510 Botucatu-SP Brasil Tel (14) 3811-6148 Fax (14) 3811-6148 posgraduacao@ibb.unesp.br UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “Júlio de Mesquita Filho” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU REPROGRAMAÇÃO DE FIBROBLASTOS DE PELE E CÉLULAS DO CORDÃO UMBILICAL POR MEIO DE PLASMÍDEOS VIRAIS E TRANSPOSONS NA PRODUÇÃO DE IPS EQUINAS MIDYAN DAROZ GUASTALI FERNANDA DA CRUZ LANDIM Tese apresentada ao Instituto de Biociências, Câmpus de Botucatu, UNESP, para obtenção do título de Doutor no Programa de Pós- Graduação em Biologia Geral e Aplicada, Área de concentração Biologia Celular, Estrutural e Funcional. Profa. Dra. Fernanda Da Cruz Landim BOTUCATU – SP 2016 Programa de Pós-graduação em Biologia Geral e Aplicada Distrito de Rubião Júnior s/n CEP 18618-000 Cx Postal 510 Botucatu-SP Brasil Tel (14) 3811-6148 Fax (14) 3811-6148 posgraduacao@ibb.unesp.br DEDICATÓRIA À minha família que cоm muito carinho е apoio nãо mediu esforços para que eu chegasse а esta etapa da minha vida. AGRADECIMENTOS Aos meus pais Olga e Antonio, meu padrasto-pai Joel e ao meu irmão Mathias que sempre estiveram presentes e são fundamentais em minha vida, dando-me suporte, carinho e segurança nos momentos importantes, suportaram minha ausência diária e compartilham desta conquista. Ao meu esposo Renê e ao meu filho Arthur, que são minhas fontes de energia para seguir em frente e são responsáveis pelo sucesso até aqui. À minha orientadora, Profª. Drª. Fernanda da Cruz Landim, pela oportunidade, pela confiança, pelo auxílio e orientação em todos os momentos da realização do projeto e acima de tudo pela amizade e ensinamentos. Aos meus amigos do Laboratório Lança: Amanda, Bianca, Bruna, Carol Guapa, Carolzinha IC, Carol Destro, Carol Moraes, Danielle, Elaine, Isadora, Leandro obrigada pela convivência diária, partilhando cada descoberta, dividindo medos, incertezas e inseguranças, mas somando entusiasmos, forças e alegrias, que tornaram os meus dias sempre melhores. Às minhas amigas Dani e Rosiara pela profunda amizade de tantos anos, que sempre estiveram ao meu lado apesar da distância. À Fabiana Fernandes Bressan, pela paciência infinita, parceria e contribuição preciosa neste trabalho. À Cláudia de Camargo Tozato, pela sintonia, amizade e transmissão de conhecimento de PCR em tempo real. À Camila de Paula Freitas Dell´Aqua pela disponibilidade e discussão dos resultados das citometria de fluxo. À Mariana de Lara Campos Arcuri pela colaboração, troca de experiências e realização dos experimentos de eletroporação. Aos professores Flávio Vieira Meirelles, João Pessoa Araújo Júnior e Ivan de Godoy Maia que generosamente cederam os respectivos laboratórios para a realização de parte dos experimentos, meu muito obrigada. Aos colegas dos demais laboratórios e funcionários do FMVZ, pela convivência diária e ajuda na realização do projeto. Ao Instituto de Biociências de Botucatu pelo conhecimento científico adquirido ao longo do curso de pós-graduação. À FAPESP (2012/18735-4) pelo auxílio financeiro e incentivo à pesquisa. À Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, por permitir a realização dos experimentos deste trabalho. Aos integrantes da banca examinadora, por disponibilizarem parte de seu tempo para a análise da tese. A todas as pessoas que contribuíram, direta ou indiretamente, para a realização desse trabalho, que acreditaram em meu sucesso e caminharam ao meu lado, meus mais sinceros agradecimentos. RESUMO As pesquisas envolvendo a biologia das células-tronco abordam um amplo espectro de fenômenos, que vão desde o nível tecidual e celular, até o seu uso em terapias celulares. Esta crescente atenção sugere que é necessário estudar conceitos básicos da biologia das células- tronco para compreender completamente os processos de diferenciação funcional. Desta forma, o instrumento da reprogramação celular por meio da manipulação gênica fornece subsídios para melhor compreender os processos de renovação e diferenciação que constituem as características fundamentais das células-tronco. A obtenção dessas células em medicina veterinária visa validar diversos modelos experimentais domésticos, como o equino, na busca de novos fármacos e terapias alternativas para reabilitação. Uma série de estudos, porém, ainda são necessários para que tais aplicações sejam viáveis, uma vez que os mecanismos fundamentais das técnicas empregadas ainda não estão totalmente elucidados. Embora a reprogramação celular por meio de vetores virais tenha sido relatada com sucesso em diversas espécies animais, outras técnicas também podem ser empregadas, como o uso de transposons, sequências de DNAs capazes de se movimentar de uma região para outra no genoma de uma célula. Não se tem conhecimento de qual o melhor tipo celular a ser utilizado, e nem tão pouco qual a metodologia de reprogramação mais eficiente. Sabe-se que o cordão umbilical possui uma reserva rica em células-tronco mesenquimais, as quais por serem multipotentes podem melhorar a eficiência de obtenção de células de pluripotência induzida (iPS) em comparação ao uso de fibroblastos, pouco eficientes ao serem reprogramados. O objetivo deste trabalho foi obter iPS por meio de mecanismo viral e não-viral de fibroblastos adultos e células do cordão umbilical equino, visando observar qual o tipo de infecção e qual o tipo de célula é mais eficiente para reprogramação celular. Ambos os tipos celulares foram infectados com vetores virais e transposons contendo os genes OCT-4, SOX-2, c-MYC, KLF-4; as células transformadas foram avaliadas quanto a morfologia, imunocitoquímica e citometria de fluxo com os marcadores típicos de células-tronco pluripotentes e também quanto as alterações causadas no perfil de expressão gênica das células pelo método de PCR em tempo real; por fim as células reprogramadas foram induzidas a se diferenciarem em tecidos dos 3 folhetos germinativos. Os resultados demostraram que tanto os fibroblastos quanto as células do cordão umbilical submetidos à infecção viral apresentaram características de células pluripotentes como morfologia característica, marcação positiva para fatores de pluripotência e expressão gênica específica. Os corpos embrióides formados também apresentaram marcação imunocitoquimica para ectoderme, mesoderme e endoderme. Apesar do tempo para inicio da formação das colônias serem parecidos (7 dias para os fibroblastos e 6 dias para as células do cordão umbilical), a expansão das colônias dos fibroblastos reprogramados foi lenta, com a 1ª passagem realizada 30 dias após a infecção em comparação com as colônias de cordão umbilical, nas quais a 1ª passagem foi realizada após 15 dias. Não foi verificada reprogramação efetiva as infecções com transposons em nenhum dos dois tipos celulares. Conclui-se que o método de infecção por vetor viral em células do cordão umbilical é mais eficiente do que em fibroblastos e que em ambos os tipos celulares, o mecanismo de transposons não resultou em células reprogramadas. Palavras-chave: Caracterização celular, Células-tronco de pluripotência induzida, Cordão umbilical equino, Fibroblastos equinos, Reprogramação celular. ABSTRACT Researches on the biology of stem cells cover a broad spectrum of phenomena, ranging from tissue and cellular level, to their use in cell therapy. This growing attention suggests that is necessary to study basic concepts of stem cells organization in order to fully understand the functional differentiation processes. Thus, the cell reprogramming through gene manipulation provides grants to better understand the processes of renewal and differentiation which are the essential characteristics of stem cells. Obtaining these cells in veterinary medicine aims to validate various household experimental models, such as horses, on the search for new drugs and alternative therapies for rehabilitation. However, a number of studies is still necessary for such applications to be feasible, since the fundamental mechanisms of techniques employed are not fully elucidated yet. Although cell reprogramming using viral plasmid has been reported with success in several animal species, other techniques may also be employed, such use transposons, this is, DNAs sequences capable of moving from one region to another in the cell genome. The unawereness of what the best cell type to be used, and nor what is the most efficient reprogramming methodology. It is known that the cord has rich reserves mesenchymal stem cells, which are multipotent and can improve the efficiency of obtaining the induced Pluripotent Stem Cells (iPS) compared to the use of fibroblast, inefficient to be reprogrammed. The aim of this study was to obtain iPS through viral transfection and non- viral adult fibroblasts and equine cord cells, aiming to observe which transfection and cell type is more efficient for cell reprogramming. Both cell types was infected with viral vectors and transposons containing the genes OCT-4, SOX-2, c-MYC, and KLF-4; transformed cells were evaluated for morphology, immunocytochemistry and flow cytometry with the typical pluripotent stem cells markers and also for the changes caused in the gene expression profile of the cells by the PCR real time method; finally reprogrammed cells were induced to reprogram to differentiate into three germ layers tissues. The results showed that fibroblasts and cord cells subjected to viral infection presented pluripotent cell characteristics such as morphology, positive staining for antibodies and specific gene expression, immunocytochemistry of the formed embryoid bodies also showed labeling for ectoderm, mesoderm and endoderm. Despite the time to start colonies formation is very similar (7 days for fibroblasts and 6 days for cord cells), the expansion of reprogrammed fibroblasts colonies was slow, with the 1st performed 30 days post-infection in comparison with umbilical cord colonies, in which the 1st pass on cord colonies after 15 days. No effective reprogramming of transposon infections was observed in either cell type. It is concluded that the method of viral vector infection in umbilical cord cells is more efficient than in fibroblasts and that in both cell types, the mechanism of transposons did not result in reprogrammed cells. Keywords: Cell Characterization, induced Pluripotent Stem Cells, Equine cord, Equine Fibroblasts, Reprogramming Cell. LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1. Delineamento experimental.......................................................................................15 Figura 2. Processamento do cordão umbilical equino. A. Materiais utilizados: placa de Petri, amostra do cordão umbilical, pinça, tesoura, bisturi e cabo. B. Divulcionamento da matriz para retirada de veia e artérias umbilicais. C. Fragmentos da matriz. D. Tecido sob ação da enzima colagenase. E. Filtração da solução para obtenção das células. F. Pellet formado após centrifugação da solução. G. Plaqueamento das células. H. Início da expansão do cultivo celular (20X). I. Confluência do cultivo (20X).........................................................................19 Figura 3. Mapa do vetor lentiviral EF1a-hSTEMCCA (OKSM) Figura adaptada do catálogo n. SCR544 (humano) Millipore................................................................................................21 Figura 4. Mapa do vetor transposon PiggyBac e Super PiggyBac Transposase. . Adaptado do catálago PB 1-PiggyBac™ Transposon Vector System. System Biosciences.........................24 Figura 5. Imagem do plasmídeo STEMCCA indicando as regiões dos genes–alvo e primers. Geneious version 7.1.3..............................................................................................................33 Figura 6. Cultivos celulares em 1ª passagem. A. Fibroblastos adultos equinos (100X), B. Células da matriz do cordão umbilical equino (100x). C. Fibroblastos embrionários murinos (200X).......................................................................................................................................34 Figura 7. Células em cultivo pós-reprogramação. Fibroblastos adultos reprogramados: A: 7 dias, C: 11 dias e E: 18 dias. Células reprogramadas do cordão umbilical equino: B: 7 dias, D: 11 dias e F: 18 dias. Os círculos vermelhos delimitam as colônias sem formação. Em A, a: barra de escala representa 1:100µm, em B, C, D, E e F, as barras representam 1:200µm.......36 Figura 8. Imunofluorescência das colônias de fibroblastos adultos reprogramados, expressando marcação positiva para Oct-4 (A) e Nanog (C), sendo (B) e (D) suas respectivas marcações de núcleo com DAPI.(Kit: SCR078 Fluorescent Human ES/iPS Cell Characterization Kit-Millipore). Em A e B as barras representam 1: 50µm, em C e D as barras representam 1:100µm................................................................................................................38 Figura 9. Imunofluorescência das colônias de células reprogramadas de cordão umbilical, expressando marcação positiva para Oct-4 (A), Sox-2 (C) e Tra-1-81 (E), sendo (B), (D) e (F) suas respectivas marcações de núcleo com DAPI. Em A, B, C e D as barras representam 1:50µm, em E e F as barras representam 1:100µm...................................................................39 Figura 10: Marcação positiva da enzima fosfatase alcalina em fibroblastos adultos reprogramados equinos. As setas vermelhas evidenciam a monocamada de sustentação (FEM). Em A e B as barras representam 1:200µm. Em C e D aumento 200X........................41 Figura 11: Marcação positiva da enzima fosfatase alcalina em células reprogramadas do cordão umbilical equino. As setas vermelhas evidenciam a monocamada de sustentação (FEM). Aumento 200X.............................................................................................................41 Figura 12. Morfologia dos corpos embrióides originados dos experimentos em suspensão. A, B, C e D originados de fibroblastos adultos reprogramados, E e F originados de células reprogramadas do cordão umbilical. As barras representam 1:200µm.....................................43 Figura 13. Imunocitoquímica dos corpos embrióides originados de fibroblastos adultos reprogramados. A: MAP-2; B: Tubulina; C: Troponina; D: Vimentina. Os asteríscos representam a marcação positiva dos respectivos anticorpos. As barras representam 1:50µm......................................................................................................................................44 Figura 14. Imunocitoquímica dos corpos embrióides originados de fibroblastos adultos reprogramados. E: Alfafetoproteina; F: Citoqueratina. Os asteríscos representam a marcação positiva dos respectivos anticorpos As barras representam 1:50µm.........................................45 Figura 15. Imunocitoquímica dos corpos embrióides originados de células reprogramadas do cordão umbilical. A: MAP-2; B: Tubulina; C: Troponina; D: Vimentina. . Os asteríscos representam a marcação positiva dos respectivos anticorpos As barras representam 1:50µm......................................................................................................................................46 Figura 16. Imunocitoquímica dos corpos embrióides originados de células reprogramadas do cordão umbilical. E: Alfafetoproteina; F: Citoqueratina. G e H: Controle técnico. . Os asteríscos representam a marcação positiva dos respectivos anticorpos As barras representam 1:50µm......................................................................................................................................47 Figura 17. Gráficos de amplificação do plasmídeo STEMCCA puro e diluições seriadas para teste dos oligonucleotídeos. Os números indicam as reações para cada gene: 1. OCT-4; 2. SOX-2; 3. C-MYC; 4.KLF-4....................................................................................................49 Figura 18. Curva de Melting das reações de qPCR plasmídeo STEMCCA. Os números indicam os genes avaliados: A: OCT-4; B: SOX-2; C: c-MYC; D: KLF-4.............................49 Figura 19. Gráfico de amplificação das amostras de fibroblastos adultos, fibroblastos adultos reprogramados, células do cordão umbilical e células reprogramadas do cordão umbilical nas reações de qPCR sem a enzima transcriptase reversa (A) e com a enzima transcriptase reversa (B).............................................................................................................................................50 Figura 20. Gráfico de amplificação da curva padrão e amostras para o gene OCT-4 (A). Curva de Melting da curva padrão e amostras para o gene OCT-4 (B)...............................................51 Figura 21. Gráfico de amplificação da curva padrão e amostras para o gene SOX-2 (A). Curva de Melting da curva padrão e amostras para o gene SOX-2 (B)...............................................52 Figura 22. Gráfico de amplificação da curva padrão e amostras para o gene c-MYC (A). Curva de Melting da curva padrão e amostras para o gene c-MYC (B)...................................53 Figura 23. Gráfico de amplificação da curva padrão e amostras para o gene KLF-4 (A). Curva de Melting da curva padrão e amostras para o gene KLF-4 (B)...............................................54 Figura 24. Gráfico de amplificação da curva padrão e amostras para o gene GAPDH equino (A). Curva de Melting da curva padrão e amostras para o gene GAPDH equino (B).............................................................................................................................................55 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Anticorpos utilizados e as respectivas marcações dos folhetos embrionários..........28 Tabela 2. Contagem das colônias nos cultivos.........................................................................37 Tabela 3. Porcentagem de marcação dos anticorpos entre 8 a 10 mil eventos analisados na citometria de fluxo....................................................................................................................40 Tabela 4: Produção dos corpos embrióides por duas técnicas diferentes de ambos os tipos celulares reprogramados...........................................................................................................42 Tabela 5: Imunohistoquímica dos corpos embrióides originados de fibroblastos adultos reprogramados e de células reprogramadas do cordão umbilical.............................................43 Tabela 6. Sequência de oligonucleotídeos iniciadores..............................................................48 Tabela 7. Quantificação do RNA das amostras........................................................................50 Tabela 8. Desempenho das reações de PCR em tempo real para os genes...............................56 Tabela 9. Quantificação relativa dos genes nas amostras.........................................................56 LISTA DE ABREVIAÇÕES E SIGLAS CO2 – dióxido de carbono C-MYC – v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog CTE – célula-tronco embrionária (plural ou singular) dNTP – desoxirribonucleotídeos trifosfatados EF1α – Elongation factor 1α (Fator de alongamento 1 alfa) EGFP – enhanced green fluorescent protein (proteína verde fluorescente melhorada) FEM- Fibroblastos embrionários murinos FT – fator de transcrição (plural ou singular) iPS – célula-tronco de pluripotência induzida IRES – Internal ribosome entry site (Sítio interno de ligação ao ribossomo) KLF-4 – Krüppel-like factor 4 OCT-4 – octamer-binding transcription factor 4 OSKM – OCT-4 (ou POU5F1), SOX-2, KLF-4 e c-MYC PCR – Polymerase chain reaction (reação em cadeira da polimerase) qPCR – PCR quantitativo RNA – ácido ribonucleico RT – Reverse transcriptase (Transcriptase reversa) SOX-2 – SRY (sex determining region Y-box 2 (região determinante do sexo no cromossomo Y, box 2) SSEA – stage-specific embryonic antigen (antígeno embrionário estágio-específico) TRA – tumor-related antigen LISTA DE SÍMBOLOS E UNIDADES cm – centímetro g – grama L – litro mg – miligrama mL – mililitro nm – nanômetro nM - nanomol PB – PiggyBac U – unidades μL – microlitro μm - micrômetro μg - micrograma oC – graus Celsius % – porcentagem α – alfa β – beta ® – Marca Registrada ™ – Trademark LISTA DE REAGENTES E MATERIAIS DE CONSUMO Aminoácidos essenciais - BME Amino Acids Solution 50× – (Sigma 6766) Aminoácidos não-essenciais – Eagle′s minimum essential medium (MEM) - (Sigma M7145)- Anfotericina B – (Gibco 15290) Azul de Triplan – Tryplan Blue (Sigma T8154) B-Mercaptoetanol – (Sigma 6250) DAPI – 4',6-diamidino-2-phenylindole (4’,6-diamidino-2-fenilindol) DMEM baixa glicose – Dulbecco's modified eagle's médium (Gibco - 10567) DMEM alta glicose - Dulbecco's modified eagle's médium (Gibco 11995-065) DMEM/F12 Knockout (Gibco-12660-012) DMSO – dimetilsulfóxido (Sigma 2650) F12- Ham´s F12 Nutrient Mixture (Gibco 11765-054) FGF- Fibroblast Growth Factor Basic Human Recombinant, expressed in E.coli (Sigma - F0291). Frascos de cultivo 25cm2: (Sarstedt, 83.1810): Produzida em Poliestireno, Área de crescimento: 25cm2, 50 ml, estéril, Volume de trabalho: 5mL. LB Ágar – (Sigma – L2897) L-Glutamina – (Sigma - G3126) LIF- Leukemia Inhibitory Factor, Human Recombinant, expressed in E. coli (Sigma- L5283) KSR- knockout sérum replacement (Gibco 10828-028) PBS – Phosphate buffered saline (Tampão fosfato salino) (Gibco 10010-023) Penicilina/Estreptomicina (Gibco 15140) Placa 6 poços: (Sarstedt, 83.1839): Produzida em Poliestireno, Dimensões Externas: 85,4x127,6 mm, Dimensões dos poços: 35x17,5 mm, Área de Crescimento: 9,6 cm², Volume de trabalho: 3 mL Placa de Petri 100mm - Área de Crescimento: 60,8cm2, Diâmetro: 87,8mm- Dimensões: 22,0mm x 95,6mm Polibreno - (Sigma - TR1003) SFB – soro bovino fetal (origem: América do Sul) (Gibco 12657-029) Tripsina- Tryple Express – (Gibco 12604-021) SUMÁRIO Introdução...................................................................................................................................1 Revisão da Literatura..................................................................................................................3 1.Células-tronco: definição e classificação.................................................................................3 2.Células-tronco Embrionárias (CTE)........................................................................................3 3.Células-tronco de pluripotência induzida (iPS).......................................................................5 4.Regulação molecular da pluripotência.....................................................................................8 5.Métodos de reprogramação......................................................................................................9 Objetivos e Hipóteses................................................................................................................14 Objetivo geral............................................................................................................................14 Objetivos específicos................................................................................................................14 Hipóteses...................................................................................................................................14 Materiais e Métodos..................................................................................................................13 1.Delineamento experimental...................................................................................................15 2.Colheita, cultivo e criopreservação das células......................................................................16 2.1.Fibroblastos adultos equinos...............................................................................................16 2.2.Células da Matriz do Cordão Umbilical Equino.................................................................18 2.3.Cultivo Primário de Fibroblastos Embrionários Murinos (FEM).......................................19 3.Transfecção, expansão e reprogramação................................................................................20 3.1.Vetores lentivirais...............................................................................................................20 3.2.Transformação, clonagem bacteriana e purificação plasmidial..........................................21 3.3.Produção das partículas lentivirais......................................................................................22 3.4.Transdução celular com lentivírus......................................................................................22 3.5.Repique celular...................................................................................................................23 3.6.Avaliação da eficiência de reprogramação.........................................................................24 3.7.Replicação dos transposons................................................................................................24 4.Caracterização celular............................................................................................................26 4.1.Imunomarcação das colônias e citometria de fluxo............................................................26 4.2.Atividade da fosfatase alcalina............................................................................................27 4.3.Diferenciação celular espontânea e imunocitoquímica.......................................................28 4.4.Diferenciação celular induzida- formação de corpos embrióides em suspensão e imunocitoquíma........................................................................................................................29 4.5.Diferenciação celular induzida-formação de corpos embrióides em gotas suspensas (hanging drop) e imunocitoquímica..........................................................................................29 4.6.PCR em tempo real.............................................................................................................30 4.6.1.Extração de RNA.............................................................................................................30 4.6.2.Tratamento com DNAse..................................................................................................31 4.6.3.Quantificação do RNA.....................................................................................................31 4.6.4.Síntese de cDNA..............................................................................................................31 4.6.5.PCR quantitativa (qPCR).................................................................................................31 4.6.6.Desenho dos oligonucleotídeos iniciadores.....................................................................32 4.6.7.Teste dos primers.............................................................................................................33 Resultados.................................................................................................................................32 1.Cultivos celulares...................................................................................................................32 1.1.Fibroblastos adultos equinos...............................................................................................32 1.2.Células da matriz do cordão equino....................................................................................32 1.3.Fibroblastos embrionários murinos (FEM).........................................................................34 2.Transfecção, expansão e reprogramação................................................................................35 3. Caracterização celular...........................................................................................................37 3.1.Imunofluorescência.............................................................................................................37 3.2.Citometria de fluxo.............................................................................................................39 3.3. Atividade da fosfatase alcalina...........................................................................................40 3.4. Diferenciação celular espontânea e imunocitoquímica......................................................42 3.5. Diferenciação celular induzida - formação de corpos embrióides em suspensão e em gotas suspensas e imunocitoquímica..................................................................................................42 4. PCR em tempo real...............................................................................................................48 4.1. Sequências de oligonucleotídeos iniciadores.....................................................................48 4.2. Teste dos primers...............................................................................................................48 4.3. Teste da enzima DNAse.....................................................................................................50 4.4. Quantificação relativa das amostras...................................................................................51 Discussão..................................................................................................................................57 Conclusão..................................................................................................................................65 Referências Bibliográficas........................................................................................................66 INTRODUÇÃO 1 INTRODUÇÃO Em 2006, Shinya Yamanaka desenvolveu uma técnica revolucionária para a produção de células pluripotentes, através da reprogramação genética de células adultas de camundongos e, em 2007, de células humanas. As células foram reprogramadas pela adição de quatro genes - OCT-4, SOX-2, KLF-4 e C-MYC – por meio do uso de vetores virais (vírus modificados que integram os fatores para dentro da célula a ser reprogramada) (TAKAHASHI & YAMANAKA, 2006). Após o sucesso na criação de células pluripotentes induzidas humanas experimentos mediados por transdução viral em fibroblastos de pele em cães (KWON et al., 2012), ovinos (BAO et al., 2011), caprinos (REN et al., 2011), suínos (ROBERTS et al., 2009), bovinos (CAO et al., 2012) e equinos (NAGY et al., 2012). A maior parte das pesquisas utiliza a interferência genética viral na geração de iPS. Esta reprogramação pode ser conseguida usando uma série de técnicas com eficiências diferentes (SOMMER et al, 2009), porém trata-se de um método pouco seguro em que o DNA do vírus pode replicar-se ao mesmo tempo que reprograma as células causando danos silenciosos e letais. Sendo assim, Kim et al (2012) iniciaram pesquisas utilizando microRNA, Patel et al (2010) e Belay et al (2011) começaram a explorar a reprogramação celular mediada por transposons (segmentos de DNA que têm a capacidade de mover-se e replicar-se dentro do genoma). A tecnologia do transposon pode simplificar bastante a maneira com que a reprogramação é conduzida, além de ser um método mais seguro, pois a eliminação da partícula viral, reduz os custos e o tempo na prática laboratorial. Apesar das técnicas para geração de iPS constituírem possíveis aliadas à terapia celular autóloga, é importante ressaltar que a aplicação prática dessas células modificadas ainda precisa ser estudada e avaliada antes de qualquer tipo de transplante ou uso indiscriminado (LIU, 2008). Os estudos relacionados à biologia básica das iPS são recentes, limitados e há pouca informação sobre essas células em animais de grande porte. Entretanto, os campos de pesquisa em medicina regenerativa e clonagem reprodutiva estão se expandindo rapidamente em animais. Esta área é de especial interesse para muitos investigadores em equinos, pois há a possibilidade de isolar e/ou gerar de células pluripotentes desses animais para biotecnologia da reprodução. Neste contexto, torna-se interessante utilizar o cavalo como um organismo 2 modelo para o estudo da geração de células pluripotentes induzidas utilizando-se de uma técnica alternativa e segura. A reprogramação pode ser realizada em diferentes tipos celulares, majoritariamente são usadas células de pele, e poucos experimentos com outros tipos celulares. Em contraste, os fibroblastos humanos são passíveis de manipulações em cultura, mas apresentam baixa eficiência (< 0,01%) e sua fase de reprogramação é lenta (~ 1 mês) (TAKAHASHI & YAMANAKA, 2006, TAKAHASHI et al., 2007). Dessa forma, Panopoulos et al. (2011) procuraram encontrar um tipo de célula que poderia ser facilmente isolado e expandido, e ainda poderia ser rapidamente e eficientemente reprogramada. Estes autores estudaram a reprogramação rápida de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs), com uma eficiência de aproximadamente 2,5-3% (300 vezes maior que a eficiência de reprogramação dos fibroblastos). As HUVECs podem ser obtidas facilmente em grandes quantidades sem etapas de purificação (BAUDIN et al., 2007), fazendo destas uma fonte de células somáticas indicada para avanços dos conhecimentos dos mecanismos que regem a reprogramação. Células-tronco mesenquimais derivadas das membranas placentárias, líquido amniótico, cordão umbilical ou tecidos fetais possuem grande potencial de expansão e de diferenciação (SAITO et al, 2005; GUCCIARDO et al, 2008). Pesquisas de diversos grupos mostraram que células-tronco derivadas dos anexos fetais, como as do cordão umbilical equino são abundantes, e por apresentarem multipotencialidade, poderiam ser mais facilmente reprogramáveis. Tais células exibem algumas características de células-tronco embrionárias como a expressão de alguns marcadores de pluripotência como Oct-4, grande capacidade proliferativa, sem demonstrar imunogenicidade e tumorogenicidade. Desta forma, o potencial de diferenciação das células do cordão umbilical seria intermediário, ou seja, seu grau de diferenciação estaria entre o das pluripotentes embrionárias e o das multipotentes adultas (CREMONESI et al., 2011). Estas características abriram uma nova perspectiva no estudo da biotecnologia da reprodução, clonagem ou terapia celular das mais variadas espécies. Estudos sobre a manutenção e diferenciação de células pluripotentes são longos, complexos e caros, além de não garantirem uma elevada porcentagem do tipo celular ou estado de maturação desejados, sendo necessária a utilização de várias técnicas de otimização para cada tecido e organismo a fim de maximizar o rendimento e qualidade das linhagens (LEWITZKY e YAMANAKA, 2007). A obtenção de uma linhagem mais semelhante possível com as células-tronco embrionárias é imprescindível para modelagem de algumas 3 doenças genéticas e o desenvolvimento de fármacos (GONZÁLEZ et al, 2011; VIERBUCHEN e WERNIG, 2012). Diante da baixa eficiência de reprogramação dos fibroblastos utilizando-se vetores virais, torna-se necessário estudar melhores mecanismos para reprogramação de outros tipos celulares. Assim sendo, as células do cordão umbilical aliada à metodologia de reprogramação mediada por transposons podem resultar na geração de linhagens de iPS equinas em tempo reduzido e mais confiáveis para aplicação terapêutica no futuro próximo. Revisão da literatura 1. Células-tronco: definição e classificação Células-tronco são, por definição, células com capacidade de autorenovação e de diferenciação (WATT e HOGAN, 2000). As células-tronco humanas já foram isoladas de diferentes fontes, desde embriões até variados tecidos adultos, e seu maior interesse reside na possibilidade de utilização na medicina regenerativa, substituindo tecidos adultos. Essas células podem ser classificadas, de acordo com sua origem, em células-tronco embrionárias (CTE), quando derivadas da massa interna do blastocisto, ou células-tronco adultas, quando derivadas de tecidos somáticos (WANG et al, 2010). As células-tronco também podem ser classificadas de acordo com seu potencial de diferenciação. Desse modo, células-tronco totipotentes possuem a capacidade de diferenciar- se em todos os tecidos que formam o organismo, em mamíferos, os representantes são o zigoto e os blastômeros até o estágio de 8-16 células. Progressivamente, as células-tronco pluripotentes são células que possuem a capacidade de gerar todos os diferentes tipos celulares adultos, mas perderam a capacidade de gerar alguns tecidos extra-embrionários. As células-tronco embrionárias, obtidas da massa celular interna do embrião, são exemplos de células pluripotentes. Por sua vez, as células-tronco multipotentes podem se diferenciar em apenas alguns tipos celulares de uma determinada linhagem, por exemplo, as células-tronco hematopoéticas e as células-tronco mesenquimais. Por fim, as células-tronco unipotentes constituem as células-tronco que podem se diferenciarem um único tipo celular, como a espermatogônia que só se diferencia em espermatozoides (JAENISCH e YOUNG, 2008). 2. Células-tronco embrionárias (CTE) 4 As células-tronco embrionárias (CTE) tem origem de embriões mamíferos em estágio de blastocisto. Retiradas da massa celular interna, tais células, ainda não diferenciadas, podem dar origem a todos os tecidos do indivíduo adulto, e assim, podem ser mantidas em cultura, estabelecendo uma linhagem de células pluripotentes (ZAGO & COVAS, 2006). As células embrionárias apresentam características específicas que as caracterizam como células-tronco pluripotentes, tais como proliferação prolongada, capacidade de autorrenovação, capacidade de diferenciação clonal nas três linhagens germinativas (ectoderme, mesoderme e endoderme) e a presença de marcadores específicos associados ao estado altamente indiferenciado, como, por exemplo, Oct-4 e Nanog (IVANOVA et al., 2003). As CTE foram primeiramente estabelecidas em 1981, a partir de embriões de camundongo e demonstraram capacidade de se diferenciar em uma grande variedade de tipos celulares (MARTIN,1981). Em 1998, culturas de CTE humanas foram estabelecidas pela primeira vez. O interesse nas CTE está na possível aplicação no tratamento de diversas doenças crônico-degenerativas, como a Doença de Parkinson, lesões da coluna espinhal e diabetes (THOMSON et al., 1998). As células-tronco adultas, isoladas da medula óssea e do sangue de cordão umbilical, por exemplo, possuem uma capacidade limitada de diferenciação e não podem se diferenciar em muitos tipos celulares. Ao contrário, as CTE possuem a capacidade de originar todos os tipos de células somáticas e germinativas, com potencial para serem utilizadas em terapias de transplantes, e também no descobrimento de novas drogas (THOMSON et al., 1998). Além disso, derivar uma linhagem de CTE implica em congelar um estágio muito precoce e transiente do desenvolvimento embrionário in vitro. Isso permite estudar e investigar os princípios e mecanismos que controlam a pluripotência e a diferenciação dos diferentes tipos celulares (WANG et al, 2010). Entretanto, existem algumas dificuldades éticas e técnicas relacionadas ao uso de CTE humanas. A utilização de CTE retiradas de blastocistos humanos implica na destruição desses embriões, gerando discussões de fundo religioso e ético. Dentre as dificuldades técnicas, há a problemática da possibilidade de formação de tumores e de rejeição ao transplante alogênico (HENTZE et al., 2009). Nesse contexto, a reprogramação de células somáticas para um estágio progenitor pluripotente mostra-se uma alternativa para o uso de CTE. Essa reprogramação pode ser obtida por meio da transferência do núcleo de uma célula somática para um oócito que teve 5 seu núcleo previamente retirado (WILMUT et al.,1997), ou ainda quando células somáticas são fusionadas com CTE (COWAN et al., 2005). Isto indica que oócitos não fertilizados e CTE possuem fatores que podem conferir pluripotencialidade. Entretanto, essas técnicas esbarram em dificuldades técnicas e na dependência de doações voluntárias de um grande número de oócitos (BOYER et al, 2006). Deste modo, alguns estudos se concentraram na identificação de fatores de transcrição (FT) responsáveis por conferir a pluripotencialidade e em induzir a expressão desses fatores em células somáticas com o objetivo de gerar células-tronco de pluripotência induzida (iPS) (TAKAHASHI e YAMANAKA,2006; MAHERALI et al., 2007; WERNIG et al., 2007). Essas células mostram-se uma importante alternativa para o uso de CTE, sem esbarrar nas questões éticas. 3.Células-tronco de pluripotência induzida (iPS) As células-tronco de pluripotência induzida (iPS) são células obtidas a partir da expressão forçada de fatores de transcrição relacionados à pluripotência, permitindo que uma célula já diferenciada tenha seu estado diferenciado revertido a um estado semelhante ao de célula tronco embrionária (TAKAHASHI e YAMANAKA, 2006). A reprogramação in vitro de células somáticas, para a geração de iPS possibilita a transposição de barreiras que restringem o uso das CTE humanas, visto que ela consiste na geração de células pluripotentes sem a necessidade do uso de um embrião ou de transferências nucleares de células somáticas, contornando questões éticas e evitando uma possível reação imunológica do organismo, no caso da utilização terapêutica (BELLIN et al., 2012). A descoberta da tecnologia de produção das células iPS foi fundamentada na hipótese de que a reprogramação nuclear é um processo conduzido por fatores solúveis que estão presentes no oócito e que desempenham papéis críticos na manutenção do estado pluripotente das CTE (YAMANAKA, 2008). Inicialmente, a geração de iPS foi possível pela combinação de quatro genes relacionados a pluripotência, OCT-4 (ou POU5F1), SOX-2, KLF-4 e c-MYC (OSKM), e este se tornou o método mais comum aplicado na reprogramação in vitro de células somáticas (TAKAHASHI & YAMANAKA, 2006; OKITA et al., 2007; WERNIG et al., 2007; LOWRY et al., 2008). 6 Embora essa combinação original de FT seja a mais utilizada, células iPS podem ser obtidas substituindo KLF4 e C-MYC por NANOG e LIN28 (YU et al., 2007) e utilizando-se diferentes combinações dos FT tradicionais (KIM et al., 2008; HUANGFU et al., 2008; NAKAGAWA et al., 2008; SHI et al., 2008; WERNIG et al., 2008). A reprogramação celular já foi realizada com células provenientes de diferentes espécies e fontes, e também já foram estabelecidos diferentes protocolos que utilizam diferentes formas de indução, tais como vírus não-integrativos a proteínas, vetores epissomais a microRNAs (GONZÁLEZ, 2011). A introdução desses genes de pluripotência exógenos em células somáticas induz a expressão de genes endógenos pertencentes à rede autorregulatória transcricional de pluripotência (JAENISCH & YOUNG, 2008). Essa regulação positiva dos fatores endógenos direciona ao silenciamento dos genes exógenos através da metilação dos promotores. O silenciamento total dos FT exógenos estabelece o limite entre células iPS parcialmente reprogramadas e as totalmente reprogramadas, sendo que nas iPS totalmente reprogramadas os FT exógenos estão silenciados e a manutenção do estado pluripotente torna-se completamente dependente do circuito transcricional endógeno (HOTTA & ELLIS, 2008). Com relação as suas características, Takahashi e Yamanaka (2006) demonstraram que estas células adquirem propriedades similares as CTE com relação à morfologia, proliferação, expressão de alguns dos genes marcadores de CTE e formação de tumores contendo uma variedade de tecidos originários dos três folhetos embrionários após o transplante subcutâneo destas células em camundongos NOD/SCID. Esse resultado foi confirmado e expandido em uma série de trabalhos, utilizando diversos tipos celulares animais e humanos, que estabeleceram que as células iPS são molecular e funcionalmente similares as CTE (MAHERALI et al., 2007; WERNIG et al., 2007; OKITA et al., 2008; AOI et al., 2008; LOWRY et al., 2008; ZHAO et al., 2009; PICANÇO-CASTRO et al., 2011), compartilhando similaridades como o potencial de crescimento celular, a atividade da telomerase, os padrões de metilação do DNA e de modificações de histonas e a expressão de marcadores de superfície, incluindo Ssea-1, Ssea-3, Ssea-4, Tra (‘tumor-related antigen’)-1-60, Tra- 1-81 (LEWITZKY, 2007; WANG et al., 2010; SCHEPER & COPRAY, 2009), assim como o padrão de expressão gênica. Quanto a esta última, as células iPS expressam um grande número de marcadores de pluripotência, mas em um nível de expressão mais baixo comparado as CTE (WANG et al, 2010). 7 O potencial das células iPS de originar uma progênie diferenciada capaz de restaurar funções fisiológicas in vivo foi explorado em modelos murinos de anemia falciforme (HANNA et al., 2007), doença de Parkinson (WERNIG et al., 2008) e Hemofilia A (XU et al., 2009). Em humanos, a reprogramação tem sido realizada a partir de células de pacientes com várias doenças neurodegenerativas como esclerose lateral amiotrófica (ELA) (DIMOS et al., 2008), atrofia muscular espinhal (AME) (EBERT et al., 2009), e doença de Parkinson (SOLDNER et al., 2009), além de várias doenças genéticas de herança complexa ou Mendeliana (PARK et al., 2008). Recentemente, as iPS estão sendo empregadas como plataforma experimental para modelo de doenças in vitro. Vários grupos demonstraram que tipos celulares relacionados com uma doença são diferenciados a partir de células iPS e são capazes de reproduzir fielmente os fenótipos das doenças (EBERT et al., 2009; KU et al., 2010; ITZHAKI et al., 2011; LIU et al., 2011; ZHANG et al., 2011). A descoberta das iPS abriu uma nova possibilidade para o desenvolvimento de modelos de doença in vitro em humanos para a investigação da fisiopatologia e no auxílio ao desenvolvimento de drogas (MARCHETTO et al., 2010; RASHID et al., 2010; JANG et al., 2011; NGUYEN et al.,2011; YAZAWA et al., 2011), e esse, em curto prazo, é um dos aspectos mais importantes dessa tecnologia. Os primeiros estudos clínicos em humanos iniciaram-se em 2014 em que o grupo liderado pela pesquisadora Masayo Takahashi iniciou os estudos com interesse em transplantar células autólogas reprogramadas e diferenciadas em pacientes com Degeneração Macular associada à idade. Foram removidas algumas células da pele de um paciente, estas foram reprogramadas para um estágio de pluripotência e então induzidas a produzir células do pigmento da retina. O transplante dessas células foi realizado sem complicações. Inúmeros testes de controle foram realizados em macacos e camundongos, não observando rejeição ou formação de tumores. Existem outros estudos que estão em andamento cujos resultados vão esclarecer ainda mais o assunto (SUGITA et al, 2016). Com um crescimento acelerado, a área da pluripotência induzida reconheceu a necessidade de protocolos eficientes e reprodutíveis, que permitissem a geração de células iPS clinicamente seguras. Eficiência, reprodutibilidade e segurança são determinados principalmente pelos métodos utilizados para introduzir os fatores de transcrição nas células somáticas de interesse e pela extensão das modificações genômicas necessárias para a geração destas células (WANG et al, 2010). 8 4.Regulação molecular da pluripotência O balanço entre manutenção da pluripotência e indução da diferenciação celular é mantido por um conjunto de fatores genéticos e epigenéticos. No cerne desse controle molecular, encontra-se a tríade de fatores de transcrição (FT) OCT-4, SOX-2 e NANOG, que detém um complexo mecanismo de auto-regulação, dependente de seus níveis de expressão. Oct-4, Sox-2 e Nanog podem se ligar aos seus próprios promotores, co-ocupar sítios genômicos de centenas de genes comuns (JAENISCH e YOUNG, 2008) e também podem se ligar aos promotores dos outros dois genes, KLF-4 e c-MYC facilitando assim, a manutenção do estado de pluripotência. Ainda, esses três fatores podem controlar outros FT que atuam na pluripotencialidade ou induzem a diferenciação (BOYER et al., 2006). A interconexão dos fatores OCT-4, SOX-2 e NANOG justifica como a reprogramação celular pode se iniciar apenas com a superexpressão de Oct-4 e Sox-2 nos fibroblastos. Esses dois fatores exógenos podem ativar os lócus endógenos da tríade, promovendo assim a indução e manutenção da pluripotência (JAENISCH e YOUNG, 2008). Fatores epigenéticos e transcricionais também são responsáveis pela manutenção da pluripotência. A cromatina das CTE se apresenta na forma de eucromatina, isto é, transcricionalmente acessíveis, com numerosas histonas acetiladas. Ao contrário, durante a diferenciação, há uma redução na acetilação e um concomitante aumento de formação de heterocromatina (BOYER et al., 2006). Na tentativa de esclarecer as alterações moleculares que ocorrem durante a geração de iPS, foi proposto um modelo em que as alterações ocorrem em duas principais “ondas”. Durante a primeira onda, as células somáticas sofrem alterações transcricionais e mudanças na cromatina, que afetam genes envolvidos no ciclo celular, na replicação do DNA e no processo denominado transição mesenquimal-epitelial, que também ocorre durante o desenvolvimento normal. Em paralelo, as células apresentam redução da expressão de genes que culminam com a supressão da identidade de células diferenciadas (GUEST e ALLEN, 2007). Na fase intermediária onde ocorre o aumento da expressão de genes envolvidos nos estágios iniciais da transição para a pluripotência, as células refratárias à reprogramação e células competentes à reprogramação co-existem. Durante a segunda onda, as células ativam 9 hierarquicamente genes envolvidos no estabelecimento e manutenção da pluripotência e sofrem alterações nos padrões de metilação do DNA, que ajudam a consolidar o estágio reprogramado (BUGANIM et al., 2012; HANSSON et al., 2012; POLO et al., 2012; SANCHO-MARTINEZ I, 2013). Estudos nesse sentido ajudam a compreender o processo de reprogramação e contribuem para o desenvolvimento de estratégias mais eficientes, rápidas e seguras de geração de iPS. Apesar de já serem conhecidas novas combinações de fatores que são capazes de reverter o estado de diferenciação celular estabelecido em diferentes tipos celulares, os quatro fatores de Yamanaka, OSKM continuam sendo os mais utilizados, principalmente pela sua robustez e capacidade de reprogramar a maioria dos tipos celulares. Os fatores OSKM têm um efeito sinergético, funcionando em conjunto para ultrapassar os resilientes sistemas celulares intrínsecos de proteção de identidade (JAENISCH e YOUNG, 2008). Assim, neste sistema, a expressão de OCT-4 E SOX-2 promovem majoritariamente um efeito desestabilizador da ordem transcricional estabelecida, recrutando NANOG, formando um núcleo autoregulatório de pluripotência. Este “núcleo”, uma vez estabelecido, ativa vias de sinalização como a via da MAPK1 (responsável pela integração de vários sinais bioquímicos como proliferação, diferenciação, regulação e desenvolvimento de transcrição) e WNT3 (consiste de genes estruturalmente relacionados que codificam para proteínas secretadas de sinalização e atuam em diversos processos do desenvolvimento, regulação do destino celular e padronização durante a embriogênese). Por outro lado, os fatores KLF4 E C- MYC, como reguladores da divisão celular, têm uma atividade mitogênica, forçando alterações constantes no estado epigenético da célula, o que aumenta fortemente a cinética e eficiência do processo (LIU, 2008). 5.Métodos de reprogramação Trabalhos mostram reprogramação favorável e eficiente (RAIS et al. 2013) utilizando os métodos integrativos, nos quais vetores principalmente virais semelhantes aos usados por Yamanaka ainda são os mais comuns (EGLI et al., 2008;YAMANAKA, 2012; EL-KARIM et al 2013;. TAKAHASHI E YAMANAKA,2013; TURKSEN, 2013). Porém, os métodos 10 integrativos induzem mutações insercionais, não sendo nem seguros nem desejáveis para aplicações clínicas. Além disso, embora os vetores retrovirais e lentivirais fiquem reprimidos em células imaturas como nas iPS, quando diferenciadas estas células podem reativar essas inserções, agindo como um contador de estímulo para o processo de diferenciação, diminuindo o rendimento final do processo, evitando uma manutenção estável do fenótipo diferenciado e produzindo uma população heterogênea em vários estados de diferenciação (LIU, 2008). Já no mecanismo de reprogramação não-integrativa como adenoviral e transfecção plasmidial são gerados clones de iPS com algum nível de marcação epigenética reminiscente do tipo celular a partir do qual foram desenvolvidas e por isso alguns autores a avaliam como ineficientes (LI et al, 2013). Desde a publicação do primeiro método de reprogramação por entrega retroviral, vários métodos e abordagens para induzir a pluripotência em células somáticas foram desenvolvidos. Paralelamente a estas novas técnicas um conjunto padrão de testes tem sido definido, a fim de resolver adequadamente a contribuição e melhoria que cada método traz (LI et al, 2013). Uma estratégia de reprogramação que encaixa todos os propósitos e fins de aplicação ainda não foi concebida. Porém há uma variedade de estratégias que podem ser usadas, dependendo da aplicação final para obter uma linhagem de iPS útil Há duas principais aplicações de pesquisa quando se considera células iPS: a primeira está relacionada à pesquisa básica, com foco em decifrar os mecanismos de reprogramação, diferenciação e identidade da célula e, uma segunda está direcionada às aplicações clínicas e terapias baseadas em iPS. (BELAY et al, 2011). Quando as células não são necessárias para uso clínico, um método rápido, eficiente e reprodutível é desejável, e dessa forma, a presença de DNA integrado é tolerável. No estudo de mecanismos de doença e o desenvolvimento de modelos para teste farmacológicos, a utilização de lentivírus integrativos induzíveis fornecem resultados eficientes e robustos. Por outro lado, quando são consideradas aplicações clínicas, a prevenção de modificações genômicas é estritamente necessária por razões de segurança, e então os métodos não- integrativos representam a única opção razoável (TURKSEN, 2013). 11 Neste contexto, com a necessidade de um método de alta eficiência que preserva a sequência genômica original, os sistemas transponíveis podem ser bons candidatos como vetores de entrega, devido às suas características incorporadas de vetor integrativo, com uma expressão estável e a eficiência relativamente alta de reprogramação, juntamente com a possibilidade de ser excisado do genoma. O desenvolvimento de protocolos de entrega de fatores e de reprogramação tem permitido uma transposição segura com geração de células de melhor qualidade para a pesquisa, garantindo a qualidade e confiança nos resultados. Dentre os vários transposons utilizados em células de mamíferos, a maioria pertence à família TC1, como Sleeping Beauty e hAT-like Tol2, e à superfamília PiggyBac (KIM E PYYKKO et al, 2011). O transposon PiggyBac (PB) foi isolado pela primeira vez a partir de lagarta da couve, Trichoplusia ni, em 1989. No entanto, só recentemente surgiu como uma ferramenta confiável em biologia molecular para a entrega de carga genética e mutagênese de inserção. Rapidamente essa ferramenta tornou-se a opção de escolha devido à sua capacidade de reprogramação, ausência de repressão de transposase e, acima de tudo, sua perfeita mobilização de “cortar-colar” restituindo a sequência original em mais de 98% após remobilização (LI, 2013). As primeiras iPS reprogramadas com um transposon PiggyBac foram obtidos por Woltjen et al em 2009, que utilizou como fonte fibroblastos fetais de humanos e de camundongos. A derivação de iPS livre de inserção permite o estabelecimento de melhores modelos celulares de iPS e adiciona um novo nível de segurança para o uso dessas células em aplicações biomédicas. No entanto, por ser baseada em várias tentativas de baixa eficiência que consistem em transfecções consecutivas, com diluição de plasmídeo resultaram num baixo rendimento global. Além disso, a possibilidade constante de integração aleatória força a uma caracterização molecular de cada clone produzido, o que é trabalhoso e dispendioso (KIM e PYYKKO, 2011). O transposon PiggyBac foi recentemente demonstrado como funcional em várias linhagens de células humanas e de camundongo. O sistema de PB transposon/transposase requer apenas as repetições terminais invertidas flanqueando um transgene e a expressão transiente da enzima transposase para catalisar eventos de inserção ou excisão (KIM E PYYKKO et al, 2011). Woltjen et al (2009) demonstraram reprogramação eficiente e bem sucedida de fibroblastos embrionários murino e humano utilizando o sistema PB. Células iPS 12 estáveis foram geradas e expressaram marcadores de pluripotência característicos, assim como ensaios de diferenciação, mostraram também que as inserções PB individuais podem ser removidas das linhagens de células iPS estabelecidas, e que é possível a reprogramação independente de vírus. Ao aliar a eficiência e reprodutibilidade dos métodos de reprogramação integrativos com a possibilidade de posterior excisão, os transposons, nomeadamente o PiggyBac, devido à sua ínfima taxa de mutação após excisão, surge como vetor promissor para a administração de fatores de reprogramação celular (KIM E PYYKKO et al, 2011). Assim, torna-se essencial o estudo de métodos mais eficientes na geração de células iPS, associado a protocolos de caracterização molecular e funcional com o intuito de validar a pluripotência das células geradas, garantindo a segurança do método e a possível aplicação terapêutica. JUSTIFICATIVA 13 JUSTIFICATIVA Avaliar qual o tipo celular (fibroblastos adultos ou células da matriz do cordão umbilical) apresenta reprogramação mais efetiva e qual o método de reprogramação (mediada por transdução lentiviral ou mediada por transfecção de transposons) é mais eficiente. OBJETIVOS E HIPÓTESES 14 OBJETIVO GERAL Obter e caracterizar células equinas pluripotentes por meio da tecnologia de reprogramação induzida mediante a utilização de fatores de transcrição dispostos em vetores virais ou em transposon PiggyBac. OBJETIVOS ESPECÍFICOS -Estabelecer uma linhagem celular pluripotente geneticamente induzida de células-tronco equinas (eiPS) originadas de fibroblastos adultos e de células da matriz do cordão umbilical equino. - Comparar a eficiência de reprogramação celular in vitro de fibroblastos adultos e de células da matriz do cordão umbilical equino. - Comparar a eficiência da transdução lentiviral e da transfecção mediada por transposons em fibroblastos adultos e em células da matriz do cordão umbilical. HIPÓTESES Devido à multipotência e menor idade das células da matriz do cordão umbilical, espera-se que sejam mais facilmente reprogramadas do que fibroblastos adultos, que são unipotentes e com idade avançada. O método de infecção celular mediado por transposons é mais seguro e rápido, por isso espera-se que seja mais eficiente para reprogramar os tipos celulares estudados do que o método de transdução lentiviral. MATERIAIS E MÉTODOS 15 MATERIAIS E MÉTODOS 1. Delineamento experimental Neste estudo, fibroblastos adultos equinos e células da matriz do cordão umbilical equino cultivados in vitro foram submetidos à reprogramação celular induzida por meio de inserção lentiviral, e por meio de inserção de transposons segundo esquema baseado na Figura 1 e descrito a seguir. Após aproximadamente 20 dias de indução in vitro, as colônias formadas foram individualmente repicadas e cultivadas. Estas células foram cultivadas in vitro e caracterizadas quanto à morfologia, expressão de fosfatase alcalina, imunofluorescência, citometria de fluxo, formação e morfologia de corpos embrióides e expressão gênica. Figura 1. Delineamento experimental. 16 Os experimentos para obtenção das células iPS descritas neste estudo foram realizados com a colaboração da Prof. Dr. Fabiana Fernandes Bressan e do Prof. Dr. Flávio Vieira Meirelles com experiência no desenvolvimento de iPS equinas (Laboratório de Morfofisiologia Molecular e Desenvolvimento – LMMD - Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos –USP- Pirassununga – Brasil). Os experimentos de eletroporações das células foram realizados pela mestranda Mariana de Lara Campos Arcuri e Prof. Dr. Ivan de Godoy Maia com experiência em transfecção plasmidial (Laboratório de Genética Molecular de Plantas do Instituto de Biociências de Botucatu – UNESP) O projeto foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ-UNESP), sob o protocolo 27/2013-CEUA. 2. Colheita, cultivo e criopreservação das células. 2.1 Fibroblastos adultos Fragmentos de aproximadamente 1 cm 3 de tecido epidermal de 5 éguas adultas da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia-UNESP-Botucatu-SP foram coletadas para obtenção dos fibroblastos. Estes fragmentos foram retirados por meio de biópsia de pele realizada na região do flanco. Os animais receberam anestesia local infiltrativa com 10 mL de lidocaína. Os fragmentos foram lavados em solução fisiológica por duas vezes, e colocadas em frasco de transporte com PBS em temperatura ambiente. A amostra coletada foi processada em placas de Petri (60 mm de diâmetro) com PBS. O tecido foi fragmentado (média de 1 mm 3 cada pedaço) com o auxílio de duas lâminas 11 de bisturi tipo Bard-Paker. Os fragmentos foram lavados duas vezes com solução tampão fosfato sem cálcio e magnésio (PBS), com pH 7,4. 17 Os fragmentos foram semeados em quatro frascos de cultivo de 25cm 2 previamente banhados com SFB e incubados durante meia hora em estufa a 37ºC em atmosfera úmida contendo 95% de ar e 5% CO2, para favorecer sua aderência à superfície. Após esse tempo, foi adicionado meio cultivo composto por DMEM alta glicose contendo 10% SFB, 100UI/mL penicilina/100μg/mL estreptomicina, 3 μg/mL anfotericina B. Em cada frasco foi colocado cerca de 5 mL de meio, o suficiente para cobrir os fragmentos. O acompanhamento do crescimento celular foi realizado a cada 24 horas em microscópio invertido. Após 5 dias foi realizada a primeira troca de meio de cultivo dos frascos. Uma vez que se iniciou o crescimento celular ao redor dos explantes, o meio de cultivo foi renovado a cada três dias. Quando 70% do frasco de cultura se encontrava coberto por células (subconfluência), foi realizada a passagem, em que foram removidos os meios das garrafas, estas foram lavadas com solução de PBS, e adicionados de 1 mL de tripsina a 37°C. As garrafas foram mantidas em estufa a 37,5º C por no máximo 10 minutos até que todas as células se soltassem do fundo. Realizou-se então a neutralização com 1 mL de SFB, essa mistura foi centrifugada a 1500 rpm por 5 minutos para lavagem e formação do pellet. O pellet foi ressuspendido em 1 mL de meio de cultivo composto por DMEM alta glicose contendo 10% SFB, 100UI/mL penicilina/100μg/mL estreptomicina, 3μg/mL anfotericina B e as células foram plaqueadas em placas de 6 poços, numa concentração de 1000 células/poço. Quando as células estavam com 70% de confluência, foram criopreservadas em uma solução contendo 10% de DMSO e 90% de SFB, e armazenadas em botijões de nitrogênio líquido. Após o descongelamento à 25ºC, foi realizado teste de viabilidade celular, em que foi estimado o número de células viáveis com o uso do corante azul de Trypan. Resumidamente, 50µL da suspensão celular foi adicionada a 50 µL do azul de Trypan (0,3%) e posteriormente 10µL dessa mistura foram colocados em cada hemi-câmera da câmara de 18 Neubauer para a realização da contagem. A concentração de 10 4 células foi semeada em garrafas de cultivo celular. Ao iniciar a expansão celular, o meio de cultivo foi renovado a cada 3 dias. Quando atingiram novamente 70% de confluência, foi realizada passagem e estavam preparadas para as metodologias de transdução e transfecção. 2.2 Células da Matriz do Cordão Umbilical Equino O cordão umbilical equino foi colhido de 5 animais neonatos, durante partos que ocorreram no Centro de Biotecnologia em Reprodução Equina (CERBEC – Posto de Monta) na cidade Botucatu-SP, e em Haras da região de Botucatu. As amostras de cordão umbilical foram lavadas com PBS, acondicionadas em tubos do tipo Falcon de 50 mL contendo meio de cultivo composto por DMEM baixa glicose, 20% de SFB, 100UI/mL penicilina/100μg/mL estreptomicina, 3μg/mL anfotericina B e transportadas em tubos refrigerados a 4 o C até o laboratório. No laboratório as amostras de cordão umbilical foram lavadas em PBS com 100UI/mL penicilina/100μg/mL estreptomicina, dissecadas para remoção total dos vasos sanguíneos, e então o tecido extravascular foi fragmentado e submetido à digestão enzimática, realizada em uma solução de colagenase a 0,004% (Sigma Aldrich, USA) em PBS, durante 15 minutos a 37ºC. Após o tempo de digestão, as amostras foram filtradas com filtro de 70µm, desprezando os fragmentos retidos, e centrifugadas com 1 ml de DMEM alta glicose por 10 minutos a 2000rpm. Em seguida, o sobrenadante foi descartado e o pellet foi ressuspendido e cultivado em garrafas com meio composto de DMEM alta glicose, 10% de SFB, 100UI penicilina, 100μg/mL estreptomicina, 3μg/mL de anfotericina B a 37,5ºC em atmosfera úmida contendo 95% de ar e 5% CO2. As células foram plaqueadas em placas de 6 poços, numa concentração de 1000 células/poço. O processamento das amostras de cordão umbilical está mostrado na Figura 2. 19 Figura 2. Processamento do cordão umbilical equino. A. Materiais utilizados: placa de Petri, amostra do cordão umbilical, pinça, tesoura, bisturi e cabo. B. Divulcionamento da matriz para retirada de veia e artérias umbilicais. C. Fragmentos da matriz. D. Tecido sob ação da enzima colagenase. E. Filtração da solução para obtenção das células. F. Pellet formado após centrifugação da solução. G. Plaqueamento das células. H. Início da expansão do cultivo celular (20X). I. Confluência do cultivo (20X). As trocas de meio foram realizadas a cada 3 dias até a confluência. Para evitar uma possível diferenciação espontânea devido à presença do meio com alta glicose, nas trocas foi utilizado meio DMEM baixa glicose, contendo 20% de SFB, 100UI penicilina/100µg/mL estreptomicina, 3μg/mL de anfotericina B. As garrafas confluentes (70%) foram submetidas ao processo de tripsinização e, criopreservadas e teste de viabilidade celular da mesma maneira dos fibroblastos adultos equinos. 2.3 Cultivo Primário de Fibroblastos Embrionários Murinos (FEM): Fêmeas murinas foram eutanasiadas no dia 14 de gestação pela técnica de deslocamento cervical. Após lavagem do abdômen com álcool 70%, a pele e peritônio foram abertos com 20 instrumentos estéreis, e o útero foi retirado. O útero foi lavado três vezes em solução PBS com 100UI/mL penicilina/100μg/mL estreptomicina, 3μg/mL anfotericina B e cortado para retirada dos fetos. As vísceras dos fetos foram retiradas e as carcaças lavadas novamente com a solução PBS acrescida de antibióticos. Após a lavagem as carcaças foram maceradas em pedaços muito pequenos, e foi adicionado 5 ml de solução a 0,25% de tripsina e incubando- se o material em estufa de CO2 por 20-30min. Após a retirada do material da estufa realizou- se a neutralização da ação da tripsina com meio DMEM alta glicose acrescido de 20% de SFB e 100UI/mL penicilina/100μg/mL estreptomicina, 3μg/mL anfotericina B. O material foi dividido em garrafas de cultivo (calculou-se tecido de três embriões por garrafa) e incubado durante 12 horas. Após 24 horas o meio foi trocado e as garrafas permaneceram em cultivo até atingir a confluência de 70%. Após realizou-se a criopreservação em nitrogênio líquido e teste da viabilidade celular da mesma maneira dos fibroblastos adultos equinos. Para o recultivo das células, descongelou-se as alíquotas, e o pellet foi cultivado em placas de 6 poços com meio DMEM baixa glicose contendo 20% de SFB, 100UI penicilina/100μg/mL estreptomicina, 3μg/mL de anfotericina B a 37,5ºC em atmosfera úmida contendo 95% de ar e 5% CO2 até atingirem 70% de confluência. Para o bloqueio do crescimento celular, o meio de cultivo foi substituído por 4,0 ml de solução contento mitomicina C (Mitomycin C from Streptomyces caespitosus power), na concentração 10μg/ml, por 12 horas. Em seguida, as garrafas foram lavadas por duas vezes com meio DMEM baixa glicose e mais duas vezes com PBS. Em seguida as células foram tripsinizadas, lavadas e plaqueadas em placas de 6 poços (5x10 3 células por poço) para servirem como monocamada de sustentação (FEM) do cultivo das iPS. 3 Transfecção, expansão e reprogramação. 3.1 Vetores lentivirais 21 Foram utilizados vetores lentivirais policistrônicos excisáveis STEMCCA (Stem Cell cassette, Sommer et al., 2009; Figura. 3) contendo as sequências codificantes de OCT-4, SOX-2, c-MYC e KLF-4 humanos (hSTEMCCA). Figura 3. Mapa do vetor lentiviral EF1a-hSTEMCCA (OKSM). Figura adaptada do catálogo n. SCR544 (humano) Millipore. 3.2 Transformação, clonagem bacteriana e purificação plasmidial Para o plasmídeo utilizado foram realizadas as etapas de transformação e clonagem bacteriana e purificação plasmidial por Maxi-Prep, como descrito a seguir. Para a transformação bacteriana foram utilizados aproximadamente 1μg de DNA plasmidial em 100μL de bactérias quimicamente competentes DH5α. Foi realizado o protocolo de choque térmico que consistiu na incubação da bacteria com o DNA plasmidial em gelo por 15 min, incubação a 42 o C por 45s, nova incubação em gelo por 5 min e cultivo a 37 o C com agitação (225rpm) por 50 min. Em seguida foi realizada o cultivo e seleção clonal em placas de meio LB Ágar adicionado de 100μg/ml do antibiótico de seleção Ampicilina por aproximadamente 16h (durante a noite) em incubadora a 37 o C. 22 Três colônias de bactérias foram selecionadas e cultivadas em um pré-inócuo de 2ml de meio LB Ágar com ampicilina por 8h e congeladas em -80 o C com uma solução de glicerol a 35% para a obtenção de estoques plasmidiais em bactérias ou novamente cultivadas pra a extração e purificação plasmidial. Para tal, um dos cultivos foi novamente incubado por aproximadamente 16h em 100ml de meio LB Ágar com ampicilina a 37 o C em agitação de 225rpm, peletizadas e submetidas à extração do DNA plasmidial pelo kit MaxiPrep EndoFree (Qiagen) segundo recomendações do fabricante. Os estoques plasmidiais purificados foram quantificados por Nanodrop e são mantidos a -20 o C até o momento da utilização. 3.3 Produção das partículas lentivirais As partículas lentivirais foram produzidas através da lipofecção de células 293FT (Invitrogen) com o reagente Lipofectamina 2000 (Invitrogen). Para tal, 5 x 10 6 células 293FT foram plaqueadas no dia anterior em placas de cultivo de 100mm de modo que apresentassem 90% de confluência no momento da transdução. Foram utilizados 12 μg dos vetores STEMCCA e 2 μg de cada vetor auxiliar, de acordo com o protocolo já estabelecido no laboratório LMMD-USP-Pirassununga. O processo de lipofecção ocorreu entre 12 a 16 horas (durante a noite), e então o meio foi recolhido 24, 48 e 72hs pós-transfecção. Em cada um desses tempos os meios eram recolhidos, repostos, filtrados e mantidos a 4ºC até serem concentrados em ultracentrífuga (Beckman Coulter) por 1h40min a 48960g no rotor SW28. 3.4 Transdução celular com lentivírus 50 μL do concentrado viral acrescido de 8 ηg/mL de polibreno foram adicionados sob o cultivo prévio dos fibroblastos adultos e sob as células da matriz do cordão umbilical. 23 Ambos os cultivos celulares foram plaqueados no dia anterior com 10 5 células por poço em placa de 6 poços. Cinco dias pós-transdução, as células foram tripsinizadas e transferidas para placas contendo FEM, por no mínimo 14 dias e alimentadas com meio específico para produção de iPS, composto por DMEM/F12 Knockout suplementado com 20% de substituto de soro knockout, 1% de L- glutamina, 1:1000 B-mercaptoetanol, 1% aminoácidos não essenciais, 10μg/mL bFGF (Fibroblast Growth Factor Basic) e antibióticos (100UI/mL penicilina/100μg/mL estreptomicina). Após os 14 dias, as células foram transferidas para placas cobertas previamente com monocamada de fibroblastos embrionários murinos e alimentadas com meio de cultivo de iPS. 3.5 Repique celular O primeiro repique ou passagem celular foi realizado manualmente para os dois tipos celulares reprogramados. A partir da segunda passagem, os clones puderam ser repicados através de incubação com tripsina por aproximadamente 3 minutos em incubadora. Aos 15 dias foram realizados repiques mecânicos, e a cada 3 dias passagens químicas das colônias para novas placas de 6 poços contendo monocamada de fibroblastos embrionários murinos e meio específico para iPS. Após 3 passagens químicas as células foram criopreservadas em uma solução contendo 10% de DMSO e 90% de SFB, e armazenadas em botijões de nitrogênio líquido. Após o descongelamento à 25ºC, as células foram transferidas para placas de 6 poços contendo FEM e o meio de cultivo DMEM:F12 (1:1), suplementado com 20% SFB, 100UI/mL penicilina/100μg/mL estreptomicina, 3μg/mL anfotericina B, 1% de aminoácidos não essenciais, 1% de aminoácidos essenciais, 0,1mM de B-Mercaptoetanol, 0,1mM de Piruvato de Sódio, 1000U/mL de LIF e 10μg/mL de bFGF.O meio de cultivo foi renovado a cada 3 dias. 24 3.6 Avaliação da eficiência de reprogramação As células de ambas as fontes foram fotografadas nos dias 3, 6, 7 e 15 pós-transdução para acompanhar o crescimento das primeiras colônias. A eficiência de reprogramação foi avaliada pelo número de colônias formadas após a quarta passagem, que se estabeleceu em placa de cultivo de 100 mm tratadas com FEM. Para avaliar essa eficiência foram selecionados aleatoriamente 10 campos (aumento de 10x em microscópio ótico invertido) em 4 diferentes placas de cada um dos cultivos, e então foram contadas as colônias encontradas nos 10 diferentes campos. 3.7 Replicação dos transposons Foi utilizado o Piggy Bac transposon PB-EF1a-Oct4-Sox2-Klf4-Myc-IRES-GFP Human 4-in-1 iPSC Vector (System Bioscience SBI, PB630A-1). Os transposons e a respectiva transposase possuem o seguinte mapa, ilustrado na Figura 4: Figura 4: Mapa do vetor transposon PiggyBac e Super PiggyBac Transposase. Adaptado do catálago PB 1- PiggyBac™ Transposon Vector System. System Biosciences. Foram conduzidos experimentos de replicação dos transposons, já que a amostra inicial era insuficiente para realizar todas as reprogramações. Para tanto, foram testadas 3 25 tipos de bactérias eletro-competentes (cepas DH5α de Escherichia coli, cepas de Haemophilus influenzae e cepas de Acinetobacter baylyi) para replicarem um transposon-teste, com a mesma quantidade de bases nitrogenadas dos transposons Piggybac, disponível no laboratório de citogenética do Departamento de Genética do Instituto de Biociências-Botucatu. Adicionou-se 2uL de DNA do transposon-teste a 50 uL de estoque de bactérias eletrocompetentes, misturou-se delicadamente, acondicionando a amostra em gelo por 5 minutos. Transferiu-se a mistura para uma cubeta de eletroporação previamente resfriada e, então, eletroporou-se a amostra com auxílio do equipamento Electroporator 2510 Eppendorf ajustado às seguintes condições: resistência de 200Ω e voltagem 1400V, uma vez ajustados os parâmetros, aplicou-se dois pulsos. Ressuspendeu-se o material em 1 mL de meio SOC (2% de Triton x, 0.5% de extrato de levedura, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, and 20 mM glicose)o qual foi posteriormente coletado da cubeta de eletroporação e cuidadosamente transferido para um microtubo estéril com capacidade de 1,5mL. Uma vez ressuspensas, as células transformadas foram incubadas sob agitação de 140 rpm a 37º em estufa Orbital Shaker Forma Scientific por uma hora. Transcorrido o tempo, o material foi plaqueado em meio seletivo composto por solução nutritiva LB Ágar e o antibiótico Ampicilina, as placas foram mantidas nas condições citadas acima por 12 horas durante a noite e as colônias selecionadas foram utilizadas para o prosseguimento do método. Como a replicação não foi possível nem com o transposon-teste nem com o Piggybac, foram realizadas transfecções com o transposon Piggybac diretamente nas células da matriz do cordão e nos fibroblastos adultos. Adicionou-se 2 ug transposon a 0,5ug transposase em tubo cônico contendo 10 5 células, misturou-se delicadamente. Transferiu-se a mistura para uma cubeta de eletroporação e, então, eletroporou-se a amostra com auxílio do equipamento Electroporator 2510 Eppendorf ajustado às seguintes condições: resistência de 200Ω e voltagem 1400V, uma vez ajustados os parâmetros, aplicou-se dois pulsos. Após a 26 eletroporação, adicionou-se à cubeta 1 mL de meio específico de iPS: DMEM:F12 (1:1), suplementado com 20% SFB, 100UI/mL penicilina/100μg/mL estreptomicina, 3μg/mL anfotericina B, 1% de aminoácidos não essenciais, 1% de aminoácidos essenciais, 0,1mM de B-Mercaptoetanol, 0,1mM de Piruvato de Sódio e 1000U/mL de LIF e 10μg/mL de bFGF, a mistura foi posteriormente coletada da cubeta de eletroporação e cuidadosamente transferido para uma placa de 6 poços contendo FEM e meio de cultivo. O meio de cultivo foi renovado a cada 3 dias. As células foram cultivadas em estufa a 37ºC em atmosfera úmida contendo 95% de ar e 5% CO2 e avaliadas nos dias 3, 6, 7 e 15 pós- transdução, seguindo a mesma metodologia das reprogramações lentivirais já citada. 4 Caracterização celular 4.1 Imunomarcação das colônias e citometria de fluxo Para a imunomarcação, células em sexta passagem foram fixadas com paraformaldeído 4% e seguido o protocolo de imunofluorescência do fabricante. Foram utilizados os seguintes anticorpos primários: Kit 1: SCR001 ES Cell Characterization Kit-Millipore -Oct-4 (monoclonal mouse, MAB4305-20), -Nanog (monoclonal rabbit, ab80892, Abcam), -Ssea-1 (monoclonal mouse, MAB4301-20), -Ssea-3 (monoclonal mouse, MAB4303-20), -Ssea-4 (monoclonal mouse, MAB4304-20), -Tra-1-60 (monoclonal mouse, MAB4360-20), -Tra-1-81 (monoclonal mouse, MAB4381—20). Kit 2: SCR078 Fluorescent Human ES/iPS Cell Characterization Kit-Millipore 27 -Mouse anti-Oct-4 (POU5f1), clone 7F9.2, Alexa Fluor® 488 conjugate (Part No. MAB4419A4). -Mouse anti-Sox-2, clone 10H9.1, Cy3 conjugate (Part No. MAB4423C3), -Mouse anti-Nanog, clone 7F7.1, Alexa Fluor® 488 conjugate (Part No. MABD24A4), -Mouse anti-Tra-1-60, clone Tra-1-60, Cy3 conjugate (Part No. MAB4360C3), -Mouse anti-Tra-1-81, clone Tra-1-81, Cy3 conjugate (Part No. MAB4381C3). As marcações das placas foram analisadas no microscópio invertido de fluorescência (Leica DMI 3000B) do laboratório LANÇA. Para a citometria de fluxo as amostras foram tripsinizadas e ressuspendidas em PBS, divididas em alíquotas contendo 400 mil células e incubadas com os anticorpos do Kit 2 (específicos para citometria de fluxo) por uma hora, seguida de três lavagens e incubação com DAPI para visualização dos núcleos celulares. As amostras foram analisadas no citômetro FACS Calibur BD®, o Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária sob os cuidados da funcionária Camila de Paula Freitas Dell'Aqua. Foram realizados os controles de autofluorescência das células e controle negativo para todos os anticorpos. Analisou-se uma média de 8 a 10 mil células para cada um dos anticorpos. Porcentagens acima de 2% foram consideradas marcação positiva. 4.2 Atividade da fosfatase alcalina A coloração da fosfatase alcalina foi realizada nos cultivos de fibroblastos adultos e células de cordão umbilical em placas de 6 poços. Ambos os tipos celulares foram lavadas uma vez com DPBS, fixadas e coradas com uma solução de Fast Red Violet, Napthol AS-BI e água. O kit de coloração Millipore SCR-078 foi utilizado de acordo com as instruções do fabricante. Depósitos insolúveis de corante vermelho indicam os sítios de atividade da fosfatase alcalina. 28 4.3 Diferenciação celular espontânea e imunocitoquímica Visando conduzir à diferenciação espontânea das células reprogramadas, foi excluído o LIF (fator inibidor de leucemia) e o bFGF do meio de cultivo de iPS. Tal protocolo foi iniciado quando as células estavam em sexta passagem. Após 20 dias de cultivo o meio foi retirado e as células fixadas em paraformoldeído a 4% por 30 minutos. Após 3 lavagens em PBS os cultivos celulares foram incubados seguindo o protocolo do fabricante dos kits. Foram utilizados os seguintes anticorpos primários, listados na Tabela 1: Tabela 1. Anticorpos utilizados e as respectivas marcações dos folhetos embrionários : Anticorpos Marcação α-fetoproteína (Monoclonal mouse Anti α- fetoprotein AFP antibody, clone C3, Sigma,A8452) Endoderme citoqueratina (Monoclonal Mouse Cytoqueratin clones AE1/AE3, Dako, M3515) tropônica cardíaca-I (Polyclonal rabbit Troponic I-C H41-cTnI, Santa Cruz Biotechnology, Sc 98830) Mesoderme vimentina (Monoclonal Mouse Anti-vimentin clone V9, Dako, M0725) β-III-tubulina (Polyclonal Rabbit Anti β- Tubulin III antibody, Sigma, T2200) Ectoderme Map-2 (Monoclonal mouse Anti-MAP2 antibody, clone AP20, Millipore, MAB3418) 29 A metodologia foi realizada em triplicatas, foram avaliadas também amostras controle- técnico para todos os anticorpos. 4.4. Diferenciação celular induzida- formação de corpos embrióides em suspensão e imunocitoquímica Para a produção de corpos embrióides foi semeada uma concentração de aproximadamente 3x10 4 células reprogramadas (em sexta passagem) em placa de Petri (100mm) contendo 8ml de meio de cultivo de iPS sem a presença de LIF, bFGF e FEM. Os cultivos foram incubados em estufa úmida a 37º C numa atmosfera com 5% CO2 durante 7 dias, após esse período os agregados celulares em 3D foram filtrados em filtros de 0,22 µm, lavados em PBS, fixados em 4% de glutaraldeído e encaminhados para o Laboratório de Análises Histológicas, do Departamento de Patologia Veterinária-FMVZ-UNESP-Botucatu, onde foram submetidos ao processamento de inclusão em parafina para realização de cortes e produção de lâminas para avaliação imunohistoquímica das 3 camadas germinativas: ectoderme, mesoderme e endoderme. Para tanto, foram utilizados os mesmos anticorpos listados acima para diferenciação espontânea das células. O protocolo utilizado foi o sugerido pelo fabricante dos kits. As imunomarcações foram analisadas e fotografadas em microscópio de luz. A metodologia foi realizada em triplicatas, foram avaliadas também amostras controle- técnico para todos os anticorpos. 4.5. Diferenciação celular induzida-formação de corpos embrióides em gotas suspensas (hanging drop) e imunocitoquímica Na técnica de “hanging drop” as células são cultivadas em gotas suspensas de 50µl dispostas na tampa da placa de Petri (100mm), e 1 ml de PBS na base da placa para evitar o 30 ressecamento do cultivo. Foram semeadas 3 x 10 4 células/ml (em sexta passagem) em gotas suspensas de meio de cultivo de iPS sem a presença de LIF, bFGF e FEM. Esse sistema foi incubado em estufa 100% úmida, 37ºC e 5% de CO2, metade do meio das gotas foi substituído a cada 2 dias. Após 10 dias em cultivo, os corpos embrióides foram lavados em PBS, fixados em 4% de glutaraldeído e encaminhados para o Laboratório de Análises Histológicas, do Departamento de Patologia Veterinária-FMVZ-UNESP-Botucatu, onde foram submetidos ao processamento de inclusão em parafina para realização de cortes e produção de lâminas para avaliação imunohistoquímica das 3 camadas germinativas: ectoderme, mesoderme e endoderme. Para tanto, foram utilizados os mesmos anticorpos listados acima para diferenciação espontânea das células. O protocolo utilizado foi o sugerido pelo fabricante dos kits. As imunomarcações foram analisadas e fotografadas em microscópio de luz. A metodologia foi realizada em triplicatas, foram avaliadas também amostras controle- técnico para todos os anticorpos. 4.6.PCR em tempo real Todo o procedimento de PCR em tempo real foi realizado no Laboratório de Diagnóstico Molecular (LDM)-IBB-UNESP-Botucatu/SP sob a supervisão da pós-doutoranda Cláudia de Camargo Tozato e do Prof.º Dr. João Pessoa Araújo Júnior. 4.6.1.Extração de RNA Os RNAs totais das amostras de fibroblastos adultos, fibroblastos adultos reprogramados, células de cordão umbilical e células reprogramadas do cordão umbilical foram extraídos através do kit Total RNA Purification kit (Norgen Biotec Corp, 17200), conforme as recomendações do fabricante. Após a extração, armazenamos os RNAs em caixas devidamente especificadas a uma temperatura de -80°C até posterior utilização. 31 4.6.2.Tratamento com DNAse Com a finalidade de eliminar DNA genômico, o RNA extraído foi tratado com a enzima RQ1 RNase-Free DNase (Promega, M6101), conforme as instruções do fabricante. Para verificar a ação da enzima, foram realizadas reações de One-Step RT-qPCR das amostras tratadas com e sem a enzima de transcrição reversa. Para isso, foram utilizados 10 µl de GoTaq® 1-Step RT-qPCR (A6020; Promega), 300 nM de primer do gene Klf4, água q.s.p. e 0.4 µL do mix de RT nas reações que continham a enzima RT. As condições de ciclagem utilizadas foram as indicadas pelo fabricante. 4.6.3. Quantificação do RNA O RNA extraído foi quantificado no espectofotômetro NanoVue Plus, GE Healthcare, nos comprimentos de onda de 260 nm e 280 nm. O grau de pureza das amostras é dado pela relação A260/A280, considerando o RNA puro, ou seja, livre de contaminantes, quando compreendida entre 1.8 ≤ razão ≥ 2,2. A concentração foi calculada em μg/mL. 4.6.4.Síntese de cDNA A síntese do DNA complementar (cDNA) foi realizada através do kit RevertAid First Strand cDNA (K1622 –Thermo Fischer Scientific). Foram utilizados 0.5 µg de RNA previamente tratado com DNAse, 0.2 µg de primer randômico, 1 µL de inibidor de RNAse, 2 µL de DNTP, 4 µL de tampão e 1 µL de MMLV para cada reação de 20 µL, conforme as instruções do fabricante. 4.6.5. PCR quantitativa (qPCR) A qPCR foi realizada utilizando o 10 µl de GoTaq® qPCR Master Mix, 300nM de cada primer, água livre de nuclease q.s.p. e 2 µl de cDNA. Como controle negativo da reação para cada gene foi utilizado água ultrapura livre de nuclease. As leituras da fluorescência foram realizadas pelo equipamento 7500 Real-Time PCR (Applied Biosystems) a cada ciclo 32 de amplificação e, posteriormente, analisados pelo Sequence Detection Software (SDS) v1.3 (Applied Biosystems). Todas as reações foram submetidas às mesmas condições de análise e normalizadas pelo sinal do corante de referência passiva ROX para correção de flutuações na leitura decorrentes a variações de volume e evaporação ao longo da reação. O resultado, expresso em valor de CT (Cycle Threshold), se refere ao número de ciclos de PCR necessários para que o sinal o fluorescente atinja o limiar de detecção. A eficiência da reação de amplificação de cada gene-alvo e cálculo da quantificação relativa foram realizadas utilizando a amostra de cDNA de células reprogramadas do cordão umbilical pura, que recebeu o valor de 100, e diluição seriadas até 10 -3 ( valor de 1). A amostra de células reprogramadas do cordão umbilical foi escolhida para confecção da curva padrão por apresentar o menor CT nas reações de RT-qPCR testadas anteriormente. O gráfico gerado pela concentração de cDNA e os respectivos valores de CT foram empregados para o cálculo da equação de regressão, correlação entre as variáveis pelo R-quadrado e quantificação das amostras. (PFAFFL, 2001). A análise dos resultados e a estatística foram realizados utilizando-se software Sequence Detection Software (SDS) v1.3 (Applied Biosystems. 4.6.6. Desenho dos oligonucleotídeos iniciadores Os oligonucleotídeos iniciadores da PCR foram desenhados através da sequencia do plasmídeo pSTEMCCA com o programa Geneious version 7.1.3 (http://www.geneious.com, Kearse et al., 2012), evidenciados na Figura 5. http://www.geneious.com/ 33 Figura 5. Imagem do plasmídeo STEMCCA indicando as regiões dos genes–alvo e primers. Geneious version 7.1.3. 4.6.7. Teste dos primers Os oligonucleotídeos iniciadores desenhados foram testados para avaliar eficiência utilizando diluições seriadas do plasmídeo STEMCCA. Foram realizadas diluições até 10 -3 em água ultrapura livre de nucleases. A qPCR foi realizada conforme descrito acima. Como controle negativo foi utilizado água ultrapura livre de nucleases. RESULTADOS 34 RESULTADOS 1. Cultivos celulares 1.1 Fibroblastos adultos equinos Os fibroblastos adultos equinos iniciaram sua expansão na placa com 10 dias pós- plaqueamento dos fragmentos de pele. Os cultivos atingiram confluência de 70% em 15 dias, com viabilidade de 95% após o cultivo primário, 90% entre as passagens (Figura 6A) e 85% pós-descongelamento. 1.2. Células da matriz do cordão equino As células da matriz do cordão umbilical equino iniciaram sua expansão na placa com 5 dias pós-plaqueamento. Os cultivos atingiram confluência de 70% em 9 dias, com viabilidade de 95% após o cultivo primário, 90% entre as passagens (Figura 6B) e 85% pós-descongelamento. 1.3. Fibroblastos embrionários murinos Os fibroblastos embrionários murinos iniciaram sua expansão na placa com 10 dias pós-plaqueamento. Os cultivos atingiram confluência de 70% em 17 dias, com viabilidade de 93% após o cultivo primário, 88% entre as passagens (Figura 6C) e 75% pós- descongelamento. Figura 6. Cultivos celulares em 1ª passagem. A. Fibroblastos adultos equinos (100X), B. Células da matriz do cordão umbilical equino (100x). C. Fibroblastos embrionários murinos (200X). 35 2. Transfecção, expansão e reprogramação -Lentivírus STEMCCA As primeiras colônias indicativas da presença de células reprogramadas começaram a se formar com 7 e 6 dias de cultivo, respectivamente para os fibroblastos adultos e células do cordão umbilical. Apesar do tempo para inicio da formação das colônias serem parecidos, a expansão das colônias após a reprogramação de fibroblastos foi mais lenta, sendo a 1ª passagem realizada 30 dias pós-transdução. Já a expansão das colônias de células do cordão umbilical foi mais rápida, sendo que 15 dias pós-transdução já foi possível realizar a 1ª passagem. Após a 1ª passagem, a curva de crescimento de ambos os cultivos se igualou. Os cultivos permaneceram viáveis e as colônias continuaram a se multiplicar no decorrer de 15 dias, conforme mostrado na Figura 7. Ambos os cultivos desenvolveram colônias finas, com bordas definidas, formadas por pequenas células de tamanho uniforme e aparência hexagonal, com núcleo evidente contendo um ou dois nucléolos, tanto nos cultivos primários como após as passagens. 36 Figura 7. Células em cultivo pós-reprogramação. Fibroblastos adultos reprogramados: A: 7 dias, C: 11 dias e E: 18 dias. Células reprogramadas do cordão umbilical equino: B: 7 dias, D: 11 dias e F: 18 dias. Os círculos vermelhos delimitam as colônias sem formação. Em A, a: barra de escala representa 1:100µm, em B, C, D, E e F, as barras representam 1:200µm. Para avaliar a eficiência da reprogramação mediada por transdução lentiviral, foram plaqueadas sob FEM uma concentração de 10 4 fibroblastos reprogramados por placa de Petri (100mm), sob 4 placas, o mesmo foi realizado com as células reprogramadas do cordão umbilical. Os dados encontram-se plotados na Tabela 2. 37 Tabela 2. Contagem das colônias nos cultivos Tipo celular Número de colônias por placa Placa 1 Placa 2 Placa 3 Placa 4 Total Média Desvio- padrão Fibroblastos adultos reprogramados 95 73 87 69 324 81 10,49 Células reprogramadas do cordão umbilical 94 86 84 98 362 90,5 5,72 -Transposon PiggyBac As transfecções realizadas com transposon PiggyBac não resultaram em reprogramações efetivas em nenhum dos dois tipos celulares, os cultivos não apresentaram colônias em 10 dias pós-transfecções, conforme estabelecido pelo protocolo do fabricante e a literatura científica. Os cultivos permaneceram em observação por 30 dias em estufa, com trocas de meio a cada 3 dias, porém sem sucesso. 3. Caracterização celular 3.1.Imunofluorescência Os fibroblastos adultos reprogramados, foram submetidos à análise por imunofluorescência utilizando os dois kits de marcação (Kit 1: SCR001 ES Cell Characterization Kit-Millipore; Kit 2: SCR078 Fluorescent Human ES/iPS Cell Characterization Kit-Millipore), mas a marcação positiva para Oct-4 e Nanog só foi obtida com o kit 2 (Figura 8). 38 Figura 8. Imunofluorescência das colônias de fibroblastos adultos reprogramados, expressando marcação positiva para Oct-4 (A) e Nanog (C), sendo (B) e (D) suas respectivas marcações de núcleo com DAPI.(Kit: SCR078 Fluorescent Human ES/iPS Cell Characterization Kit-Millipore). Em A e B as barras representam 1: 50µm, em C e D as barras representam 1:100µm. Já as colônias de células do cordão umbilical marcaram positivamente para Oct-4 (kit 1), Sox-2 (kit 2) e Tra-1-81 (kit 2), conforme a Figura 9. 39 Figura 9. Imunofluorescência das colônias de células reprogramadas de cordão umbilical, expressando marcação positiva para Oct-4 (A), Sox-2 (C) e Tra-1-81 (E), sendo (B), (D) e (F) suas respectivas marcações de núcleo com DAPI. Em A, B, C e D as barras representam 1:50µm, em E e F as barras representam 1:100µm. 3.2.Citometria de fluxo Através da análise por citometria de fluxo, observou-se que os fibroblastos reprogramados apresentaram marcação positiva para Oct-4, Sox-2, Nanog e Tra-1-60 Já as células reprogramadas do cordão umbilical marcaram positivamente para Oct-4, Nanog, Tra-1-60 e Tra-1-81. Os dados estão descritos na Tabela 3: 40 Tabela 3. Porcentagem de marcação dos anticorpos entre 8 a 10 mil eventos analisados na citometria de fluxo. Marcadores Tipos celulares Células reprogramadas do cordão umbilical equino (%) Células do cordão umbilical equino (%) Fibroblastos adultos reprogramados (%) Fibroblastos adultos (%) Oct-4 12,1 0 30,2 0 Sox-2 0 0 12,0 0 Nanog 71,1 0 14,5 0 Tra-1-60 11,9 0 16,3 0 Tra-1-81 12,1 0 0 0 Média das diferenças percentuais 21,4 0 14,6 0 Desvio- padrão relativo 117,8 0 66,14 0 Foi analisada apenas uma linhagem de cada tipo celular, todos os anticorpos foram analisados em triplicata para cada um dos tipos celulares. 3.3. Atividade da fosfatase alcalina A atividade da fosfatase alcalina pode também ser claramente detectada nos fibroblastos adultos reprogramados e nas células reprogramadas do cordão umbilical, conforme mostrado nas Figuras 10 e 11. 41 Figura 10: Marcação positiva da enzima fosfatase alcalina em fibroblastos adultos reprogramados equinos. As setas vermelhas evidenciam a monocamada de sustentação (FEM). Em A e B as barras representam 1:200µm. Em C e D aumento 200X. Figura 11: Marcação positiva da enzima fosfatase alcalina em células reprogramadas do cordão umbilical equino. As setas vermelhas evidenciam a monocamada de sustentação (FEM). Aumento 200X. 42 3.4. Diferenciação celular espontânea e imunocitoquímica Tanto os fibroblastos quanto as células reprogramadas do cordão umbilical não apresentaram marcação para nenhum dos anticorpos. 3.5. Diferenciação celular induzida - formação de corpos embrióides em suspensão e em gotas suspensas e imunocitoquímica Tanto pela técnica de semeadura das células em suspensão quanto pela técnica de gotas suspensas foi possível produzir corpos embrióides,