UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP CÂMPUS DE JABOTICABAL IDENTIFICAÇÃO DE FATORES DE VIRULÊNCIA DE Bremia lactucae EM ALFACE NOS ESTADOS DO RIO DE JANEIRO, SÃO PAULO E SUL DO BRASIL Izabella Garbeline Okuma Engenheira Agrônoma 2023 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP CÂMPUS DE JABOTICABAL IDENTIFICAÇÃO DE FATORES DE VIRULÊNCIA DE Bremia lactucae EM ALFACE NOS ESTADOS DO RIO DE JANEIRO, SÃO PAULO E SUL DO BRASIL Discente: Izabella Garbeline Okuma Orientador: Prof. Dr. Pablo Forlan Vargas Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – Unesp, Câmpus de Jaboticabal, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Agronomia (Genética e Melhoramento de Plantas) 2023 Sistema de geração automática de fichas catalográficas da Unesp. Biblioteca da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Jaboticabal. Dados fornecidos pelo autor(a). Essa ficha não pode ser modificada. O41i Okuma, Izabella Garbeline Identificação de fatores de virulência de Bremia lactucae em alface nos estados do Rio de Janeiro, São Paulo e Sul do Brasil / Izabella Garbeline Okuma. -- , 2023 41 p. Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista (Unesp), Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Jaboticabal, Orientador: Pablo Forlan Vargas 1. Míldio. 2. Lactuca sativa. 3. Resistência. 4. Fenótipos de Virulência. 5. Cultivares diferenciadoras. I. Título. Impacto potencial desta pesquisa Esta pesquisa, realizada em colaboração com empresa privada, visa a monitorização do agente causal do míldio da alface (Bremia lactucae) nas regiões de produção dessa hortaliça, localizadas no sul e sudeste do Brasil. Desempenhando papel fundamental nos programas de aprimoramento genético da alface, buscando desenvolver resistência genética a essa doença. Dado que existem diferentes fenótipos de virulência, identificar essas variações torna-se fundamental para o sucesso desses programas de melhoria genética. Potential impact of this research This research, carried out in collaboration with a private company, aims to monitor the causal agent of downy mildew on lettuce (Bremia lactucae) in the regions where this vegetable is produced, located in the south and southeast of Brazil. Playing a key role in lettuce genetic improvement programs, seeking to develop genetic resistance to this disease. Given that there are different virulence phenotypes, identifying these variations is essential for the success of these genetic improvement programs. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA Câmpus de Jaboticabal CERTIFICADO DE APROVAÇÃO TÍTULO DA DISSERTAÇÃO: IDENTIFICAÇÃO DE FATORES DE VIRULÊNCIA DE Bremia lactucae EM ALFACE NOS ESTADOS DO RIO DE JANEIRO, SÃO PAULO E SUL DO BRASIL AUTORA: IZABELLA GARBELINE OKUMA ORIENTADOR: PABLO FORLAN VARGAS Aprovada como parte das exigências para obtenção do Título de Mestra em Agronomia (Genética e Melhoramento de Plantas), pela Comissão Examinadora: Prof. Dr. PABLO FORLAN VARGAS (Participaçao Virtual) Agronomia e Recursos Naturais / FCAVRUnesp Registro Pesquisador Dr. MARCUS VINÍCIUS MARIN (Participaçao Virtual) Departament of Plant Pathology / University of Florida - Wimauma/Flórida - EUA Profa. Dra. RITA DE CÁSSIA PANIZZI (Participaçao Virtual) Departamento de Ciências da Produção Agrícola / FCAV UNESP Jaboticabal Jaboticabal, 28 de junho de 2023 Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias - Câmpus de Jaboticabal - Via de Acesso Professor Paulo Donato Castellane, s/n, 14884900, Jaboticabal - São Paulo https://www.fcav.unesp.br/#!/pos-graduacao/programas-pg/agronomia-genetica-e-melhoramento-de-plantasCNPJ: 48.031.918/0012-87. http://www.fcav.unesp.br/%23!/pos-graduacao/programas-pg/agronomia-genetica-e-melhoramento-de-plantasCNPJ DADOS CURRICULARES DA AUTORA IZABELLA GARBELINE OKUMA, nascida em 11 de março de 1996, na cidade de Yokkaichi, no Estado de Mie, Japão, filha de Marcelo Okuma e Keli Regina Carpena Garbeline Okuma. Ingressou no curso de Engenharia Agronômica em março de 2015, na Universidade Estadual Paulista/UNESP – Câmpus Dracena, Faculdade de Ciências Agrárias e Tecnológicas/FCAT, graduando-se em fevereiro de 2020. Durante a graduação foi bolsista de Iniciação Científica por dois anos na área de Melhoramento e Produção de soja e milho, e desenvolveu projetos na mesma área por dois anos sem bolsa. Realizou o estágio obrigatório na Empresa de Pesquisa Agropecuária e Extensão Rural de Santa Catarina/EPAGRI, na área de Melhoramento e produção de cebola e batata-doce. Em agosto de 2020 iniciou o curso de mestrado na Universidade Estadual Paulista/UNESP – Câmpus Jaboticabal, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias/FCAV, pelo programa de Agronomia (Genética e Melhoramento de Plantas) sob a orientação do Prof. Dr. Pablo Forlan Vargas. “Jamais considere seus estudos como uma obrigação, mas como uma oportunidade invejável para aprender a conhecer a influência libertadora da beleza do reino do espírito, para seu próprio prazer pessoal e para proveito da comunidade à qual seu futuro trabalho pertencer.” (Albert Einstein) AGRADECIMENTOS A Deus, pelas bençãos recebidas em minha vida. Aos meus pais e irmão, por sempre me apoiarem nessa e em outras empreitadas, me dando todo o suporte que necessitei. Aos meus avós, Darci e Osvaldo, por me incentivarem e apoiarem nas minhas decisões. Ao professor Pablo, pelas orientações, incentivo e receptividade durante o período do mestrado. À Carol Franco, pela parceria com a empresa Agristar do Brasil, pelas orientações durante o desenvolvimento do projeto e por me fazer amar Bremia. Às minhas amigas e porto seguros, Jéssica e Melissa, que levarei pro resto do vida. Aos colegas e funcionários do NEOM, pelo auxílio no desenvolvimento do projeto, companheirismo e tornarem minha estadia em Jaboticabal melhor. Aos amigos que fiz em Jaboticabal, por tornarem meus dias melhores. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES), pela concessão da bolsa, que me permitiu realizar o curso. O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001. À Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias/FCAV pela oportunidade de realização do mestrado. i SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 1 2 REVISÃO DE LITERATURA .................................................................................... 2 3 MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................... 7 3.1 Coleta dos isolados ............................................................................................ 7 3.2 Multiplicação dos isolados ............................................................................... 17 3.3 Diferenciação dos fenótipos de virulência e obtenção dos códigos sextetos ... 18 3.4 Determinação da frequência, diversidade e complexidade .............................. 19 4 RESULTADOS ....................................................................................................... 20 4.1 Determinação e frequência dos fenótipos de virulência ................................... 20 4.2 Frequência dos fatores de virulência ............................................................... 32 4.3 Avaliação da diversidade e complexidade ....................................................... 34 5 DISCUSSÃO .......................................................................................................... 35 6 CONCLUSÕES ...................................................................................................... 37 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................... 38 ii IDENTIFICAÇÃO DE FATORES DE VIRULÊNCIA DE Bremia lactucae EM ALFACE NOS ESTADOS DO RIO DE JANEIRO, SÃO PAULO E SUL DO BRASIL RESUMO - O míldio é uma doença que afeta a cultura da alface, durante inverno, sob condições de alta umidade e baixa temperatura. O aparecimento de novos fenótipos de virulência tem sido motivo de estudo para programas de melhoramento para detectar novos genes de resistência. Para isso faz-se constante monitoramento para que se possa estudar o desenvolvimento do patógeno. Objetivou-se monitorar o comportamento dos isolados de B. lactucae presentes em regiões produtoras do Rio de Janeiro, São Paulo e sul do Brasil em 2020 e 2021. As amostras de folhas com sintomas de B. lactucae foram coletadas e posteriormente multiplicadas em genótipo suscetível para início da fase de diferenciação. Os genótipos diferenciadores foram avaliados, atribuindo os seguintes sinais para interpretação dos resultados +, (+), - e (-), conforme a porcentagem de níveis de danos presentes nos genótipos de alface. Em 2020, o fator de resistência presente na cultivar ‘Balesta’, comum em todos os estados estudados, e o fator de resistência ‘Kibrile’ encontrado em 2021, concederam resistência aos isolados de B. lactucae. Em 2020, os fenótipos de virulência de códigos sextetos 51/00/00, 31/00/00, 29/02/03 e 31/10/02 foram mais frequentes. Em 2021, os mais frequentes foram 31/00/00, 31/01/00, 51/00/00 e 31/00/02. O fator de resistência encontrado na cultivar diferenciadora ‘Balesta’ é a mais indicada para programas de melhoramento de alface visando resistência ao míldio para as regiões sul e sudeste do Brasil, uma vez que nos últimos anos de monitoramento a maioria dos isolados apresentou resistência a ela. Palavras-chave: Míldio; Lactuca sativa; resistência; fenótipo de virulência; cultivares diferenciadoras. iii IDENTIFICATION OF VIRULENCE FACTORS OF Bremia lactucae IN LETTUCE IN RIO DE JANEIRO, SÃO PAULO AND SOUTH OF BRAZIL ABSTRACT - Downy mildew is a disease that affects lettuce crops during winter under conditions of high humidity and low temperature. The appearance of new virulence phenotypes has been a subject of study for breeding programs to detect new resistance genes. For this, constant monitoring is carried out so that the development of the pathogen can be studied. The objective was to monitor the behavior of B. lactucae isolates present in producing regions of Rio de Janeiro, São Paulo and southern Brazil in 2020 and 2021. Leaf samples with symptoms of B. lactucae were collected and subsequently multiplied into a susceptible genotype to start the differentiation phase. The differentiating genotypes were evaluated, assigning the following signs for interpretation of the results +, (+), - and (-), according to the percentage of damage levels present in the lettuce genotypes. In 2020, the resistance factor present in the 'Balesta' cultivar, common in all states studied, and the 'Kibrile' resistance factor found in 2021, granted resistance to the B. lactucae isolates. In 2020, the virulence phenotypes of sextets codes 51/00/00, 31/00/00, 29/02/03 and 31/10/02 were more frequent. In 2021, the most frequent were 00/31/00, 01/31/00, 00/51/00 and 00/31/02. The resistance factor found in the differentiating cultivar 'Balesta' is the most suitable for lettuce breeding programs aiming at resistance to downy mildew in the south and southeast regions of Brazil, since in the last years of monitoring most of the isolates showed resistance to it. Keywords: Downy mildew; Lactuca sativa ; resistance; virulence phenotype; differentiating cultivar. 1 1 INTRODUÇÃO Devido ao seu elevado consumo, a alface (Lactuca sativa L.) vem sendo considerada a principal hortaliça folhosa cultivada no Brasil, por seu relevante volume de produção e valor comercializado serem atrativos aos produtores (Silva et al., 2020). Desta forma, vem sendo bastante difundida, compondo a nutrição da população mundial, uma vez que é uma hotaliça fonte de vitaminas, fibras e contém propriedades medicinais que promovem e regulam o adequado funcionamento do nosso organismo (Santos Veras et al., 2019). Em pesquisa realizada pela Associação Brasileira do Comércio de Sementes e Mudas (Abcsem, 2020), a alface mobilizou cerca de R$ 8 bilhões apenas no varejo, chegando a uma produção de aproximadamente 2000 a 4000 engradados por hectare, concentrada nas regiões Sudeste e Sul, ficando em terceiro lugar entre as hortaliças, perdendo apenas para batata e tomate. Presume-se que no Brasil há cerca de 66.301 propriedades rurais comerciais produtoras de alface, considerando 30% na região Sudeste, 30% na região Sul, 26% na região Nordeste, 7% na região Centro-Oeste e 6% na região Norte, com produção em torno de 525.602 toneladas (Mendes et al., 2020). Contudo, vários são os fatores que dificultam e limitam o cultivo desta hortaliça. Um deles é o míldio (Bremia lactucae Regel), uma doença que pode acometer a cultura em qualquer estádio de desenvolvimento, desde a fase de mudas até a fase em que a planta atinge o ponto comercial em campo, prestes a ser colhida. O patógeno pode ser transportado por sementes contaminadas, plantas hospedeiras do mesmo gênero próximas ao local de cultivo, restos culturais contaminados das safras anteriores, água de irrigação ou chuvas, assim como pelo vento (Franco et al., 2021). O controle do míldio, pode ser realizado por meio de cultivares resistentes e/ou aplicações de fungicidas. Porém, o uso de agroquímicos, tem uma série de fatores prejudiciais, como alto custo, tanto para aquisição quanto de aplicação; permanência dos resíduos no solo e na planta; eficiência reduzida, pois o ciclo da 2 alface é curto; e a pressão de seleção do patógeno, que pode acarretar em resistência ao fungicida (Petrzelová et al., 2013). O uso de cultivares resistentes é uma alternativa de controle eficiente devido ao baixo custo paro o produtor e por ser ambientalmente correto, pois reduz o uso de produtos fitossanitários. Entretanto, a falta de conhecimento em relação às cultivares resistentes aos comportamentos de míldio encontrados nas regiões produtoras, ainda desfavorece o seu uso (Franco et al., 2021). Por isso, a importância de realizar monitoramentos e visitas anuais aos produtores de alface, com o intuito de verificar a distribuição e evolução do patógeno nas áreas produtoras, verificar o tipo de manejo realizado e divulgar novas cultivares resistentes ao míldio a partir dos avanços tecnológicos desenvolvidos pelas empresas produtoras de sementes que direcionam trabalhos futuros visando a introgressão de genes de resistência aos diferentes fatores de virulência encontrados. Por isso, o controle de Bremia lactucae, requer uma busca constante por novos genes de resistência e para que se obtenham cultivares resistentes e com características desejáveis, são desenvolvidas pesquisas em programas de melhoramento que visam atender às demandas e exigências tanto do produtor quanto do consumidor, uma vez que o interesse de ambos os grupos são interligados. Portanto, objetivou-se identificar fenótipos de virulência de Bremia lactucae em São Paulo, Rio de Janeiro e na região Sul do Brasil nos anos de 2020 e 2021. 2 REVISÃO DE LITERATURA A alface (Lactuca sativa L.), procedente da Ásia Ocidental, foi descoberta desde 4.500 a.C., pertence a família das Asteraceaes, subfamília Cichoriaceae, inserida no gênero Lactuca, que contém mais de 100 espécies. Já era conhecida no antigo Egito quando chegou ao Brasil no século XVI, através dos imigrantes portugueses (Demartelaere et al., 2020a). Seu elevado consumo, a estima como principal hortaliça folhosa cultivada no Brasil, com um volume de produção considerável e valor de comercialização 3 atrativos aos produtores (Silva et al., 2020). E para os consumidores: excelente fonte de vitaminas e minerais, rico valor nutricional contendo: ferro, vitamina C, cálcio e potássio, fibras e ainda propriedades anticancerígenas (Demartelaere et al., 2020b). Normalmente, cultiva-se a alface em canteiros, sendo indispensável o uso de irrigação, principalmente, por aspersão convencional. Ainda, com o aumento da utilização de derivados de plásticos, têm-se observado uma expansão do cultivo da alface em estufas e sob túneis plásticos (Reis Nascimento et al., 2022). No Brasil as alfaces são classificadas em seis grupos para a comercialização de acordo com o tipo de folha: Crespa; Americana; Lisa; Mimosa; Romana e Roxa, podendo ser colhidas e comercializadas em pacotes com apenas folhas ou a cabeça (Huber e Xavier, 2020). A alface é uma planta herbácea, de aspecto tenro, com caule reduzido, onde se aderem as folhas (Queiroz et al., 2017). Sendo uma espécie autógama, devido aos mecanismos botânicos presentes na estrutura floral, exibe inflorescência do tipo capítulo composta por aproximadamente 10 a 25 floretes. Cada flor apresenta um óvulo que, posteriormente, formará um só aquênio (Sala e Nascimento, 2014). A planta cresce em forma de roseta, em volta do caule, formando ou não uma “cabeça”, sua raiz é pivotante com ramificações finas e curtas, e conforme diferentes cultivares podem apresentar folhas lisas ou crespas, com coloração em vários tonalidades de verde ou roxa (Filgueira, 2013). É uma planta anual com florescimento em condições de dias longos e altas temperaturas, ambientes com temperaturas amenas e dias curtos favorecem a etapa vegetativa do ciclo (Filgueira, 2013). A temperatura ideal para o desenvolvimento está na faixa de 15,5ºC a 18,3ºC, apesar de tolerar faixas entre 26,6ºC a 29,4ºC por alguns dias, desde que as temperaturas noturnas sejam baixas. Por ter sua origem em locais de clima temperado, a alface é pouco adaptável a regiões de elevada temperatura e fotoperíodos longos, o que acarreta na redução do ciclo e antecipa a fase reprodutiva (pendoamento), impedindo assim, o ápice do seu potencial genético (Huber e Xavier, 2020). Doenças e pragas são alguns dos principais fatores que interferem negativamente na produtividade da cultura. Na caso da alface, as doenças que 4 atingem a parte aérea são as de maior preocupação devido ao dano direto causado na parte comercial do produto, podendo ainda ser acometida por outros patógenos que também afetam as raízes e caule. Dessa forma, o conhecimento das características de cada uma delas é de grande importância para alcançar um manejo apropriado para a cultura (Nogueira et al., 2020). Segundo Lopes et al. (2010) as doenças da parte área que mais afetam a alface durante o ciclo produtivo são: Míldio (Bremia lactucae Regel); Mancha bacteriana [Xanthomonas campestris pv. vitians (Brown) Dye]; Septoriose (Septoria lactucae Passerini); Mancha de Cercóspora [Cercospora longissima (Cugini.) Sacc.]; Podridão de Botrytis (Botrytis cinerea Pers); Rizoctoniose (Rhizoctonia solani Kuhn); Mosaico (Lettuce mosaic virus-LMV); Vira-cabeça [várias espécies: (Tomato spotted wilt virus –TSWV), (Tomato chlorotic spot virus – TCSV) e (Groundnut ringspot virus – GRSV)]; Mosqueado (Lettuce mottle virus – LMoV); Engrossamento-das-nervuras [(Big-vein-Lettuce big vein virus – LBVV) e (Mirafiori lettuce big-vein virus – MLBVV)]; Lettuce Dieback [Tomato bushy stunt virus – TBSV e Lettuce necrotic stunt virus – LNSV] e outras viroses [(Cucumber mosaic virus – CMV) e (Turnip mosaic virus – TuMv)]. As doenças radiculares e de caule que restringem o cultivo da alface são: Tombamento (Pythium spp.); Podridão de Esclerotínia [Sclerotinia minor Jagger, S. sclerotiorum (Lib.) de Bary]; Podridão-mole [Pectobacterium spp. ou Dickeya = Erwinia spp. (Jones) Waldee], Nematóide das galhas (Meloidogyne spp.) (Lopes et al., 2010). Destas destaca-se o Míldio, (Bremia lactucae Regel), principal doença que acomete a cultura da alface durante o inverno, coincidindo com sua principal época de cultivo, quando há baixas temperaturas. O genêro Bremia engloba oomicetos da família Peronosporaceae, uma vez que a espécie B. lactucae se caracteriza por ser um parasita biotrófico obrigatório, significa que ele tem seu ciclo de desenvolvimento completo somente enquanto o hospedeiro estiver vivo, restringindo à espécie Lactuca sativa e algumas outras pertencentes a família das Asteraceas (Runge et al., 2021). As condições climáticas durante o inverno brasileiro, com temperatura média de 15,7ºC e aumento do período de molhamento foliar, que consequentemente 5 aumenta a umidade, favorecem o desenvolvimento do patógeno Bremia lactucae Regel durante o cultivo da alface, acarretando grandes perdas econômicas e produtivas ao alfacicultor. A maior incidência de míldio ocorre em regiões de temperatura amena, de 4ºC a 20ºC, que corresponde com as principais regiões produtoras de alface (Souza, 2021). Este patógeno tem a capacidade de infectar a planta desde a produção de mudas até a colheita, danificando os tecidos foliares, o que compromete a taxa fotossintética da planta (Souza, 2021). Suas lesões têm colorações cloróticas características, passando para amarela ou necrótica na face adaxial, após a esporulação do patógeno na face abaxial da folha (van Bruggen e Scherm, 1997). Sob condições ambientais ótimas, a esporulação fica visível após uma semana, principalmente na face abaxial das folhas. Os esporângios podem ser transportados pelo ar ou pela água, advindos de outras plantas de alface doentes ou hospedeiros alternativos do gênero Lactuca, como a Serralha, ademais de restos culturais infectados (Carvalho, 2021). Segundo Franco et al. (2021), a influência do míldio sobre a alface é baseada na interação entre seus genes, ou seja, os genes de resistência da alface correlacionam-se aos fatores de avirulência no patógeno, podendo ocasionar hospedeiros hipersensíveis, consequentemente não ocorrendo a doença. A ocorrência de virulência do míldio é tida por diversos fatores de virulência, raças fisiológicas ou fenótipos de virulência, que são identificados devido a reação ao conjunto de cultivares diferenciadoras (Marin et al., 2020). O genes Dm (“Downy mildew”) e FR (fatores de resistência), presentes nos conjuntos de diferenciadoras, retratam alto nível de resistência. Porém com o surgimento de novas raças, a eficácia tem sido temporária devido ao surgimento de novos fatores de virulência (Lebeda et al., 2007). Os parâmetros de controle de uma doença englobam o manejo químico, físico e biológico de maneira preventiva ou curativa, ainda a introgressão de genes de resistência ao patógeno (Jacinto et al., 2020). O manejo químico, é um dos principais meios para o controle do míldio. Entretanto, o uso de defensivos agrícola, apresentam alguns fatores limitantes: alto custo de aquisição e aplicação; baixa eficiência, devido ao ciclo curto da alface; 6 toxicidade ao produtor e retenção dos resíduos no solo quando aplicado de maneira incorreta; e a pressão de seleção do patógeno, que pode acarretar em resistência ao fungicida (Petrzelová et al., 2013). Outra vertente, é o uso de cultivares resistentes, que é um método mais eficaz e menos oneroso para o controle do míldio (Franco et al., 2021), pois reduz o uso de produtos fitossanitários. A relação entre a alface e a B. lactucae é fundamentada na interação gene a gene, sendo a resistência conferida por um gene dominante (Dm ou FR) correspondente a fatores de avirulência no patógeno (Avr), e o gene recessivo (dm) conferindo suscetibilidade (Sala e Costa, 2016). A combinação de um gene Dm ou FR com um fator Avr resulta em incompatibilidade, indicando a não ocorrência da doença devido a hipersensibilidade do hospedeiro (Crute, 1992; Lebeda et al., 2002; Lebeda et al., 2007). Os genes Dm ou FR estabelecem alto nível de resistência ao patógeno. Contudo, sua eficácia é temporária, até que novos fatores de virulência ocorram dentro da população do patógeno. Desta forma, o controle permanente do míldio da alface requer busca contínua por novos genes de resistência (Caprio, 2021). Ademais, a eficiência do controle para reduzir a frequência dos fatores de virulência na população do patógeno, depende da pressão de seleção ocorrente no ambiente. Com o intuito de reduzir essa pressão, recomenda-se utilizar regularmente cultivares com diferentes genes Dm ou FR (Jacinto et al., 2020). Caracteriza-se a variabilidade de virulência em B. lactucae pelos distintos fatores de virulência (v), raças fisiológicas ou fenótipos de virulência, que por sua vez são discernidos através da reação nos conjuntos de cultivares diferenciadoras. Van Ettekoven e van der Arend (1999), padronizaram códigos para cada raça, denominados Códigos Sexteto, com a finalidade de uniformizar o sistema de identificação de raças de míldio presente nas distintas regiões do mundo. Com a ampla variabilidade genética de B. lactucae, é imprescindível a identificação e monitoramento anual dos comportamentos nas principais regiões produtoras de alface para que os programas de melhoramento possam desenvolver linhagens com genes de resistência mais eficazes no manejo da doença. 7 3 MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Coleta dos isolados Folhas de alface contendo esporulações visíveis de Bremia lactucae foram coletadas em diferentes municípios produtores dos estados do Rio de Janeiro, São Paulo, Rio Grande do Sul, Santa Catarina e Paraná, entre os meses de junho a setembro de 2020, e de maio a agosto de 2021, quando o clima é favorável ao desenvolvimento do míldio da alface. As amostras foram embaladas individualmente em potes coletores identificados e acondicionados em caixa térmica com gelo para o transporte até o Laboratório de Genética e Melhoramento de Olerícolas, do Departamento de Ciências da Produção Agrícola (UNESP-FCAV), onde ficaram armazenadas em freezer a -20°C. Ao término das coletas, procedeu-se a partir das amostras armazenadas do material vegetal (tecido foliar com a doença míldio da alface), o processamento para isolamento do patógeno, do qual derivou-se de cada amostra um único isolado de B. lactucae nomeado de acordo com o estado, a ordem e o ano de coleta, respectivamente (por exemplo, RJ01/20), para determinação dos fenótipos de virulência pelo teste de diferenciação. No ano de 2020 foram diferenciados 178 isolados de B. lactucae coletados nos estados do Rio de Janeiro (RJ), São Paulo (SP), Rio Grande do Sul (RS), Santa Catarina (SC) e Paraná (PR) (Tabela 1). Tabela 1. Relação dos isolados de folhas de alface coletadas em 2020 para identificação dos fenótipos de Bremia lactucae no Rio de Janeiro, São Paulo, Rio Grande do Sul, Santa Catarina e Paraná. Isolados Local Grupo de Alface Cultivar RJ12/20 Nova Friburgo Americana - RJ20/20 Nova Friburgo Americana - RJ25/20 Nova Friburgo Crespa Samira RJ26/20 Nova Friburgo Crespa Samira RJ35/20 Nova Friburgo Americana Gloriosa Continua 8 Continuação RJ13/20 Sumidouro Americana - RJ31/20 Sumidouro Americana Pedrola RJ32/20 Sumidouro Americana Pedrola RJ35/20 Sumidouro Americana Pedrola RJ14/20 Teresópolis Mimosa TPC29875 RJ16/20 Teresópolis Crespa - RJ17/20 Teresópolis Crespa Roxa TPX29875 RJ19/20 Teresópolis Crespa Renata SP54/20 Tupã Americana Lucy Brown SP58/20 Tupã Crespa Vanda SP61/20 Tupã Lisa Elisa SP65/20 Araçatuba Americana Lucy Brown SP68/20 Araçatuba Americana Lucy Brown SP75/20 Araçatuba Crespa Vanda SP79/20 Araçatuba Americana Lucy Brown SP144/20 Bebedouro Americana Lucy Brown SP40/20 Presidente Prudente Americana Lucy Brown SP41/20 Presidente Prudente Americana Lucy Brown SP46/20 Presidente Prudente Crespa Vanda SP113/20 Taquaritinga Americana Lucy Brown SP117/20 Taquaritinga Crespa Vanda SP90/20 São José do Rio Preto Americana Lucy Brown SP92/20 São José do Rio Preto Americana Lucy Brown SP82/20 São José do Rio Preto Americana Lucy Brown SP86/20 São José do Rio Preto Americana Lucy Brown SP10/20 Marília Americana Mauren SP12/20 Marília ´- - SP168/20 Marília Americana Diva SP167/20 Marília Americana Diva SP169/20 Marília Americana Diva SP150/20 Monte Alto Americana Lucy Brown SP154/20 Monte Alto Crespa Vanda SP159/20 Bauru Lisa Elisa SP161/20 Bauru Americana Lucy Brown SP163/20 Bauru Crespa Valentina SP179/20 Bauru Americana Lucy Brown SP181/20 Bauru Americana Salad Bowl SP184/20 Bauru Crespa Vanda SP243/20 Araraquara Americana Lucy Brown SP253/20 Araraquara Crespa Crocantela Continua 9 Continuação SP256/20 Araraquara Crespa Crocantela SP259/20 Araraquara Crespa Isadora SP261/20 Araraquara Crespa Brida SP262/20 Jaboticabal Crespa - SP263/20 Jaboticabal Crespa - SP264/20 Jaboticabal Crespa - SP265/20 Jaboticabal Crespa - SP266/20 Jaboticabal Crespa Vanda SP267/20 Jaboticabal Crespa Vanda SP268/20 Jaboticabal Americana Lucy Brown SP272/20 Jaboticabal Americana Lucy Brown SP171/20 Botucatu - Scarlet SP172/20 Botucatu - Thaís SP175/20 Botucatu Crespa Larissa SP201/20 Ribeirão Preto Crespa - SP204/20 Ribeirão Preto Americana - SP240/20 Ribeirão Preto Americana Lucy Brown SP241/20 Ribeirão Preto Americana - SP242/20 Ribeirão Preto Americana Lucy Brown SP226/20 Ribeirão Preto Crespa Vanda SP222/20 Ribeirão Preto Americana Lucy Brown SP210/20 Dumont Americana Lucy Brown SP215/20 Dumont Americana Lucy Brown SP16/20 Ourinhos Americana Lucy Brown SP19/20 Ourinhos Americana Lucy Brown SP239/20 Guariba Americana Lucy Brown SP234/20 Guariba Americana Lucy Brown SP104/20 Taiaçú - - SP134/20 Barretos Americana Lucy Brown SP147/20 Barretos Americana Lucy Brown SP186/20 Catanduva Americana Lucy Brown SP187/20 Catanduva Americana Lucy Brown SP189/20 Catanduva Crespa Valentina SP190/20 Pitangueiras Americana - SP191/20 Pitangueiras Americana - SP195/20 Pitangueiras Americana - SP23/20 Cândido Mota Americana Lucy Brown SP30/20 Cândido Mota Crespa Vanda SP33/20 Cândido Mota Lisa Elisa SP1/20 Itápolis Americana Lucy Brown Continua 10 Continuação SP4/20 Itápolis Americana Lucy Brown SP331/20 Mogi das Cruzes Mimosa Eagle SP328/20 Mogi das Cruzes Crespa Elisa SP329/20 Mogi das Cruzes Crespa - SP332/20 Mogi das Cruzes Mimosa TP SP303/20 Mogi das Cruzes Lisa Larissa SP306/20 Mogi das Cruzes Mimosa Salad Bowl SP310/20 Mogi das Cruzes Americana Ludimila SP312/20 Mogi das Cruzes Crespa Jade SP434/20 Piedade Americana - SP437/20 Piedade Romana - SP427/20 Piedade Roxa - SP429/20 Piedade Crespa - SP417/20 Piedade Americana AA062 SP319/20 Rio Claro Crespa Vanda SP322/20 Rio Claro Americana Lucy Brown SP326/20 Biritiba Mirim Crespa Solaris SP389/20 Biritiba Mirim Romana - SP393/20 Biritiba Mirim Crespa - SP398/20 Biritiba Mirim Lisa - SP415/20 Campinas Crespa Valentina SP408/20 Campinas Crespa Ariel SP380/20 Campinas Americana Lucy Brown SP381/20 Jacareí Crespa Brida SP384/20 Jacareí Crespa Roxa SP387/20 Jacareí Lisa Elisa SP341/20 Conchal Americana Lucy Brown SP347/20 Conchal Americana Lucy Brown SP349/20 Conchal Americana AA0067 SP366/20 Salesópolis Crespa Brida SP369/20 Salesópolis Crespa Brida SP379/20 Salesópolis Lisa Larissa SP378/20 Salesópolis Lisa Offtype de Larissa SP399/20 Piracicaba Americana Lucy Brown SP400/20 Piracicaba Mimosa Salad Bowl SP336/20 Ibiúna Crespa Cristal SP339/20 Ibiúna Americana Silvana SP356/20 Araras Crespa Valentina SP357/20 Araras Crespa Valentina Continua 11 Continuação SP361/20 Araras Americana Lucy Brown RS01/20 Maquiné Crespa Samira RS05/20 Maquiné Lisa Regina 500 RS08/20 Maquiné Lisa Regina 500 RS10/20 Maquiné Romana Parma RS11/20 Maquiné Crespa Roxa Pira Roxa RS13/20 Maquiné Crocante - RS27/20 Maquiné Crespa - RS33/20 Maquiné Americana Silvana RS38/20 Maquiné Crespa AC0055 RS42/20 Maquiné Americana - RS44/20 Maquiné Crespa Cristal RS50/20 Maquiné Mimosa verde Brava RS53/20 Maquiné Americana Rider plus RS04/20 Terra da Areia Lisa Regina 500 RS55/20 Terra da Areia Crespa AC0055 RS56/20 Terra da Areia Americana Raider Plus RS18/20 Feliz Crespa Vanda RS19/20 Feliz Crespa Lirice RS20/20 São José do Hortêncio Americana Angelina RS21/20 São José do Hortêncio Lisa Regina RS24/20 São José do Hortêncio Mimosa roxa - SC12/20 Antônio Carlos Americana Silvana SC15/20 Antônio Carlos Lisa Regiane SC18/20 Antônio Carlos Americana Dinamite SC22/20 Antônio Carlos Americana Piedade SC26/20 Antônio Carlos Americana Piedade SC27/20 Biguaçu Crespa AC0068 SC28/20 Biguaçu Crespa Vanda SC29/20 Biguaçu Americana Lucy Brown SC32/20 Chapecó Crespa Vanda SC34/20 Chapecó Americana Raider Plus SC36/20 Chapecó Lisa Regina 500 SC37/20 Chapecó Crespa Celina SC38/20 Chapecó Crespa Celina SC40/20 Chapecó Mimosa roxa Mirella SC41/20 Chapecó Lisa Stella SC44/20 Chapecó Americana Mauren PR01/20 Colombo Crespa Vanda PR02/20 Colombo Crespa Vanda Continua 12 Continuação PR03/20 Colombo Crespa AC0055 PR05/20 Colombo Crespa Veneranda PR17/20 Colombo Americana Silvana PR18/20 Colombo Americana Piedade PR08/20 São José dos Pinhais Crespa Vanda PR10/20 São José dos Pinhais Americana Raider Plus PR11/20 São José dos Pinhais Americana Raider Plus PR20/20 São José dos Pinhais Americana Silvana PR24/20 São José dos Pinhais Crespa Vanda PR27/20 São José dos Pinhais Americana Lucy Brown PR30/20 São José dos Pinhais Crespa AC0055 PR31/20 São José dos Pinhais Lisa Regiane PR32/20 São José dos Pinhais Mimosa roxa AMR0076 PR34/20 São José dos Pinhais Americana AA0067 - : dado não fornecido. No ano de 2021, foram diferenciados 188 isolados de B. lactucae coletados nos estados do Rio de Janeiro (RJ), São Paulo (SP), Rio Grande do Sul (RS), Santa Catarina (SC) e Paraná (PR) (Tabela 2). Tabela 2. Relação dos isolados de folhas de alface coletadas em 2021 para identificação dos fenótipos de Bremia lactucae no Rio de Janeiro, São Paulo, Rio Grande do Sul, Santa Catarina e Paraná. Isolados Local Grupo de Alface Cultivar RJ70/21 Sumidouro Crespa Samira RJ72/21 Sumidouro Crespa Roxa Pira Roxa RJ74/21 Sumidouro Crespa Renata RJ75/21 Sumidouro Crespa Renata RJ76/21 Sumidouro Crespa Renata RJ77/21 Sumidouro Crespa Renata RJ82/21 Teresópolis Crespa Ariel RJ83/21 Teresópolis Crespa Ariel RJ85/21 Teresópolis Americana Astra RJ87/21 Teresópolis Americana Mayumi RJ88/21 Teresópolis Lisa Regina SS RJ89/21 Nova Friburgo Americana AA0065 RJ92/21 Nova Friburgo Americana NI RJ94/21 Nova Friburgo Americana NI continua 13 Continuação RJ95/21 Nova Friburgo Americana NI RJ96/21 Nova Friburgo Americana Romana offtype de AA0065 RJ97/21 Nova Friburgo Crespa AC0053 RJ99/21 Nova Friburgo Crespa Brida RJ100/21 Nova Friburgo Americana Astra RJ101/21 Nova Friburgo Americana Ironwood RJ102/21 Nova Friburgo Americana Ironwood RJ103/21 Nova Friburgo Americana AA0067 RJ104/21 Nova Friburgo Americana Romana offtype de AA0067 SP403/21 Bebedouro Americana Lucy Brown SP404/21 Bebedouro Americana Lucy Brown SP408/21 Barretos Crespa - SP409/21 Barretos Americana Lucy Brown SP414/21 Barretos Americana Lucy Brown SP415/21 Barretos Americana Lucy Brown SP418/21 Barretos Crespa - SP420/21 Pitangueiras Crespa Vanda SP422/21 Pitangueiras Americana - SP424/21 Pitangueiras Americana - SP425/21 Pitangueiras Crespa Vanda SP427/21 Ribeirão Preto Americana - SP430/21 Ribeirão Preto Americana - SP429/21 Ribeirão Preto Americana - SP433/21 Ribeirão Preto Crespa Vanda SP431/21 Ribeirão Preto Crespa Vanda SP434/21 Ribeirão Preto Crespa Vanda SP437/21 Ribeirão Preto Americana - SP439/21 Ribeirão Preto Crespa - SP441/21 Ribeirão Preto Crespa - SP442/21 Ribeirão Preto Americana - SP443/21 Dumont Americana Lucy Brown SP446/21 Dumont Mimosa Lavinia SP448/21 Dumont Mimosa Lavinia SP449/21 Dumont Americana Lucy Brown SP450/21 Dumont Mimosa Mauren SP452/21 Guariba Americana Lucy Brown SP453/21 Guariba Americana Lucy Brown SP456/21 Guariba Crespa Verônica Continua 14 continuação SP460/21 Jaboticabal Crespa - SP461/21 Jaboticabal Crespa - SP462/21 Jaboticabal Crespa - SP463/21 Jaboticabal Crespa - SP464/21 Jaboticabal Crespa - SP465/21 Jaboticabal Crespa - SP466/21 Jaboticabal Crespa - SP01/21 Piedade Crespa Cristal SP04/21 Piedade Crespa Cristal SP07/21 Piedade Crespa Roxa - SP105/21 São José do Rio Preto Americana Lucy Brown SP107/21 São José do Rio Preto Americana Lucy Brown SP109/21 São José do Rio Preto Americana Lucy Brown SP110/21 São José do Rio Preto Americana Lucy Brown SP115/21 Bauru Americana Lucy Brown SP116/21 Bauru Americana Lucy Brown SP117/21 Bauru Americana Lucy Brown SP118/21 Bauru Americana Lucy Brown SP121/21 Bauru Crespa Cida SP122/21 Bauru Crespa Cida SP124/21 Botucatu Lisa Larissa SP125/21 Botucatu Americana Mayumi SP126/21 Botucatu Lisa Larissa SP127/21 Botucatu Americana Mayumi SP129/21 Botucatu Americana Mayumi SP130/21 Botucatu Lisa Larissa SP131/21 Botucatu Crespa Samira SP132/21 Botucatu Crespa Samira SP134/21 Limeira Americana Silvana SP136/21 Limeira Americana Silvana SP138/21 Limeira Crespa Valentina SP139/21 Limeira Crespa Valentina SP140/21 Ibiúna Americana Silvana SP144/21 Ibiúna Crespa Valentina SP145/21 Ibiúna Crespa Valentina SP146/21 Ibiúna Lisa Elisa SP275/21 Ibiúna Crespa AC0063 SP279/21 Ibiúna Crespa Margarete SP151/21 Porto Ferreira Americana Lucy Brown SP247/21 Biritiba Mirim Americana Piedade continua 15 continuação SP251/21 Biritiba Mirim Lisa Larissa SP263/21 Biritiba Mirim Crespa Brida SP257/21 Mogi das Cruzes Americana - SP260/21 Mogi das Cruzes Lisa Larissa SP262/21 Mogi das Cruzes Crespa Jade SP293/21 Rio Claro Americana Mauren SP296/21 Rio Claro Americana Mauren SP299/21 Rio Claro Crespa Valentina SP303/21 Campinas Crespa - SP308/21 Campinas Lisa - RS158/21 Feliz Crespa verde Vera RS159/21 Feliz Lisa TPX 29423 RS161/21 Maquiné Lisa Regina RS162/21 Maquiné Americana Lucy Brown RS163/21 Maquiné Crespa verde Cristal RS164/21 Maquiné Frisé Roxa - RS165/21 Maquiné Frisé Verde - RS166/21 Maquiné Americana Lucy Brown RS167/21 Maquiné Americana Raider Plus RS168/21 Maquiné Lisa Elisângela RS170/21 Maquiné Americana Raider Plus RS171/21 Maquiné Crespa Roxa Raider Plus RS172/21 Maquiné Lisa Regina RS173/21 Maquiné Crespa roxa - RS174/21 Maquiné Americana Raider Plus RS176/21 Maquiné Lisa TPX 29423 RS177/21 Maquiné Americana NI RS178/21 Maquiné Lisa NI RS179/21 Maquiné Crespa roxa - RS180/21 Maquiné Americana NI RS182/21 Maquiné Lisa Stela RS183/21 Maquiné Americana Silvana RS184/21 Maquiné Crespa verde Thaís RS185/21 Maquiné Lisa TPX 29423 RS186/21 Maquiné Crespa verde Thaís SC187/21 Antônio Carlos Crespa verde Valentina SC189/21 Antônio Carlos Lisa TPX 29423 SC190/21 Antônio Carlos Americana Lucy Brown SC192/21 Antônio Carlos Crespa verde Samira SC193/21 Antônio Carlos Lisa TPX 29423 continua 16 continuação SC194/21 Antônio Carlos Lisa Regiane SC195/21 Antônio Carlos Crespa verde Margarete SC196/21 Antônio Carlos Crespa verde Valentina SC197/21 Antônio Carlos Lisa TPX 29423 SC198/21 Antônio Carlos Lisa Regiane SC199/21 Antônio Carlos Crespa roxa - SC200/21 Antônio Carlos Crespa verde Margarete SC201/21 Antônio Carlos Lisa Regiane SC202/21 Antônio Carlos Americana Lucy Brown SC203/21 Antônio Carlos Crespa verde Valentina SC204/21 Antônio Carlos Crespa verde Lirice SC205/21 Antônio Carlos Crespa 68 SC206/21 Antônio Carlos Lisa TPX29423 SC208/21 Antônio Carlos Lisa Regiane SC209/21 Antônio Carlos Lisa TPX29423 SC211/21 Antônio Carlos Lisa Regiane SC213/21 Antônio Carlos Lisa TPX29423 SC214/21 Antônio Carlos Crespa Lirice SC217/21 Antônio Carlos Crespa Valentina SC219/21 Antônio Carlos Americana Lucy Brown SC222/21 Chapecó Americana Raider Plus SC226/21 Chapecó Americana Raider Plus SC228/21 Chapecó Crespa Bruna SC230/21 Chapecó Crespa Bruna SC232/21 Chapecó Crespa Bruna SC234/21 Chapecó Lisa Elisângela SC237/21 Chapecó Crespa Celina SC240/21 Chapecó Crespa Celina SC244/21 Chapecó Crespa Celina PR18/21 São José dos Pinhais Americana Lucy Brown PR19/21 São José dos Pinhais Americana Lucy Brown PR20/21 São José dos Pinhais Americana Lucy Brown PR21/21 São José dos Pinhais Americana Lucy Brown PR24/21 São José dos Pinhais Crespa AC0055 PR25/21 São José dos Pinhais Crespa AC0055 PR27/21 São José dos Pinhais Americana AA0067 PR28/21 São José dos Pinhais Americana AA0067 PR30/21 São José dos Pinhais Americana NI PR31/21 São José dos Pinhais Crespa AC0055 PR32/21 São José dos Pinhais Lisa Elisa Continua 17 Continuação PR33/21 São José dos Pinhais Lisa Elisa PR34/21 São José dos Pinhais Lisa Elisa PR36/21 São José dos Pinhais Americana AA0067 PR37/21 São José dos Pinhais Americana AA0067 PR38/21 São José dos Pinhais Crespa Vanda PR41/21 São José dos Pinhais Americana AA0067 PR43/21 São José dos Pinhais Americana AA0067 PR46/21 São José dos Pinhais Crespa Vanda PR47/21 São José dos Pinhais Crespa AC0054 PR48/21 São José dos Pinhais Crespa AC0054 PR55/21 São José dos Pinhais Americana Piedade PR56/21 São José dos Pinhais Americana Piedade PR57/21 São José dos Pinhais Crespa AC0054 PR62/21 São José dos Pinhais Crespa Roxa - PR63/21 São José dos Pinhais Crespa Roxa Gabriela PR64/21 São José dos Pinhais Crespa Roxa Gabriela NI : Não identificado; - : dado não fornecido. 3.2 Multiplicação dos isolados Com o intuito de se obterem quantidades suficientes de esporângios para utilização no teste de diferenciação, realizou-se a inoculação dos isolados coletados nos distintos municípios produtores dos estados do Rio de Janeiro, São Paulo, Rio Grande do Sul, Santa Catarina e Paraná, em plântulas de alface da cultivar Solaris (suscetível). A cultivar Solaris foi semeada em caixas plásticas gerbox (11 x 11 x 3,5 cm), forradas com papel germitest umedecido, onde as sementes foram divididas em três partes iguais e em cada uma das partes foram semeadas aproximadamente 20 sementes e tiveram suas tampas fechadas. Posteriormente, as caixas gerbox foram incubadas em câmara de crescimento com fotoperíodo de 12h de luz e 12h de escuro a 18°C, por uma semana. Após este período, todos os cotilédones estavam totalmente expandidos, e então, aptos à inoculação dos isolados. As amostras vegetais com os isolados de B. lactucae foram lavadas e agitadas com água deionizada e autoclavada, obtendo-se uma suspensão de 18 esporângios. A partir disso, procedeu-se a inoculação da suspensão nos cotilédones de alface totalmente desenvolvidos com pipetas do tipo Pasteur até o ponto de escorrimento (Ilott et al.,1987). As caixas plásticas gerbox então foram incubadas em B.O.D. (Biochemical Oxygen Demand) com fotoperíodo de 12h/12h a 13°C por 15 dia, após este período os cotilédones de Solaris com esporos foram recortados, colocados em novos potinhos identificados, agitados e obtidos uma nova suspensão para inoculação em novas caixas de solaris, que foram semeadas com uma semana de antecedência para estarem aptas ao processo de multiplicação dos esporângios de B. lactucae. Este processo foi repetido por quatro ciclos consecutivos para multiplicar a quantidade de esporângios, a fim de uniformizar e estabilizar a população de esporos de cada isolado. Obtendo-se quantidades suficientes de esporângios, foi realizado o teste de diferenciação. 3.3 Diferenciação dos fenótipos de virulência e obtenção dos códigos sextetos Para as cultivares diferenciadoras foi empregada a mesma metodologia descrita anteriormente (item 3.2), com as modificações em semeio de cultivares diferenciadoras do código “sextet” conjunto EU-C (Isf, 2021). Para cada isolado coletado, foi semeado um conjunto de diferenciadoras, que constituiu de três caixas plásticas gerbox (11 x 11 x 3,5 cm), forradas com papel germitest umedecido previamente dividido em seis partes iguais. Em cada uma das partes foram semeadas 20 sementes de cada cultivar diferenciadora, sendo estas: Green Tower, Dandie, R4T57D, UC DM14, Nun DM15, CG DM16, Colorado, FrRsal-1, Argeles, RYZ2164, RYZ910457, Bedford, Balesta, Bartoli, Design e Kibrille. Estas foram mantidas por 10 dias em câmara de crescimento na temperatura de 18ºC e fotoperíodo de 12 h. Transcorrido esse período foi realizada a inoculação com os isolados coletados, de acordo com a técnica de Ilott et al. (1987), utilizando- se de esporângios de tecidos infectados do hospedeiro lavados e agitados em água deionizada e autoclavada. A suspensão foi ajustada para a concentração de 5 x 104 19 esporângios mL-1, em Câmera de Neubauer e aplicada nas plântulas das diferenciadoras com pipetas do tipo Pasteur até o ponto de escorrimento. Após a inoculação, as caixas foram colocadas em câmara de incubação tipo B.O.D com temperatura de 13°C e o fotoperíodo de 12 horas. As avaliações foram realizadas aos 10 dias após a inoculação e repetiu-se a avaliação aos 15 dias após a inoculação para confirmar os dados da primeira avaliação, conforme metodologia proposta por van Ettekoven e van der Arend (1999). Tal metodologia baseia-se na colocação de sinais +, (+), - ou (-), de acordo com a porcentagem de níveis de danos nos tecidos vegetais de alface, sendo: +, quando mais de 80% das plântulas apresentam lesões esporulantes; (+), quando mais de 80% das plântulas apresentam pontos necróticos e com muitas lesões esporulantes; -, quando menos de 5% das plântulas apresentam lesões esporulantes; e (-), quando as plântulas apresentam pontos necróticos e com poucas lesões esporulantes. A determinação dos fenótipos de virulência presentes nas populações dos estados avaliados foi obtida através das respostas de suscetibilidade no conjunto diferencial EU-C. Os materiais que se mostraram suscetíveis a determinado isolado receberam o sinal de + ou (+), de acordo com a porcentagem e de acordo com o valor de cada cultivar dentro do código sexteto, tiveram seus valores somados dentro de cada grupo e obteve-se o código sexteto (por exemplo, 31/00/02). 3.4 Determinação da frequência, diversidade e complexidade dos fenótipos de virulência de B. lactucae A determinação da frequência, diversidade e complexidade foi realizada de acordo com Andrivon (1994) e van Hese et al. (2016). Estimou-se a frequência relativa (fr) dos fatores de virulência identificados nos isolados amostrados, , em que: fv são os fatores de virulência, e N é o número total de fatores de virulência observados. A diversidade da população foi obtida por meio do índice de Gleason (Ig), que reflete quão diversa é a população avaliada, 20 em que: Ni é o número de isolados avaliados e Nf é o número de fenótipos de virulência identificados. A complexidade de virulência por isolado (Ci) e por fenótipo de virulência (Cf) foram calculadas. , em que: j = é uma constante podendo variar de 1 até Nf; pj = é a frequência do fenótipo de virulência j, e vj= é o número de fator de virulência do fenótipo j. Considerou-se o número de fatores de virulência (v) do fenótipo (j) como o número de genes Dm e fatores de resistência (FR) ineficazes contra um isolado do fenótipo (j). 4 RESULTADOS 4.1 Determinação e frequência dos fenótipos de virulência Foi possível determinar, em 2020, 104 fenótipos de virulência dentre todos os estados amostrados, a partir de 178 isolados (Tabela 3). O fenótipo de virulência do código sexteto 31/00/00, foi o mais encontrado presente no RJ, SP, RS e PR, seguido dos códigos 51/00/00 (RJ, SP e PR) e 51/00/01 (RJ, RS e PR), com 14,05%, 5,62% e 2,81% de frequência respectivamente, em relação ao total de fenótipos estudados. O código sexteto 31/00/00 apresentou frequências de 20% em São Paulo, 6,25% no Paraná e 7,69% no Rio de Janeiro e 4,76% no Rio Grande do Sul. Enquanto o código 51/00/00 foi encontrado em 3,6%, 18,75%, 15,38%, para SP, PR e RJ, respectivamente, dos isolados avaliados. Já 51/00/01 apareceu em 4,76% no RS, 23,08% no RJ e 6,25% no PR, dos isolados avaliados. No estado de Santa Catarina, com exceção dos sextetos 49/02/01 e 29/02/03 , todos os outros fenótipos de virulência encontrados não se repetem nos demais estados avaliados, sendo o comportamento das amostras SC27/20, SC29/20 e SC44/20, com o código sexteto 29/02/03, mais frequente com 18,75%. 21 Os fenótipos de virulência mais frequentes no Rio Grande do Sul foram o do sexteto 29/02/01, 33/02/00 e 31/10/02 com 9,52% cada, porém não foram encontrados nos demais estados avaliados. Em São Paulo, o código sexteto 31/00/00 foi o mais encontrado, totalizando 22 isolados distribuídos em várias regiões do estado. Seguido do código 31/01/00 com 9% de frequência. Em relação a complexidade, estabelecida pela quantidade de fatores de virulência presentes [atribuição dos sinais + e (+)], os códigos sextetos 31/27/00 (SC15/20), 31/10/03 (PR31/20), 31/18/06 (PR30/20), 30/10/03 (SP369/20), 31/11/02 (SP319/20), 31/25/02 (SP54/20 e SP5/20), 31/26/02 (SP259/20), 61/03/03 (SP366/20) e 63/11/00 (SP172/20) apresentaram nove fatores de virulência (Tabela 3), enquanto, o código 33/00/00 (RS56/20) apenas dois fatores de virulência, encontrado no Rio Grande do Sul. Tabela 3. Resposta de resistência/suscetibilidade à Bremia lactucae e códigos sextetos identificados no Rio de Janeiro, São Paulo, Rio Grande do Sul, Santa Catarina e Paraná em 2020. Cultivares diferenciadoras Is o la d o s G . T . D a n d ie R 4 T 5 7 D U C D M 1 4 N u n D M 1 5 C G D m 1 6 C o lo ra d o F rR s a l- 1 A rg e le s R Y Z 2 1 6 4 R Y Z 9 1 0 4 5 7 B e d fo rd B a le s ta B a rt o li D e s ig n K ib ri lle C ó d ig o " S e x te t” Gene Dm ou fator de resistência 0 3 4 14 15 16 18 38 Valor no conjunto sexteto 0 1 2 4 8 16 32 1 2 4 8 16 32 1 2 4 RJ12 (+) + - + (-) (+) - (-) (+) - (-) (-) - + (+) (+) 21/02/07 RJ20 (+) + + (+) + + - - (+) - - - - - + + 31/02/06 RJ25 (+) + (+) - - (+) + - - - - - - + - - 51/00/01 RJ26 + + + + + + - - - - - - - - - - 31/00/00 RJ35 + + + + (+) + - (-) (+) - - - - - (+) - 31/02/02 RJ13 + + - - - + + - (+) - (-) - - + - - 49/02/01 RJ14 + + - - - + + (-) (+) (-) (+) - - + (-) - 49/10/01 RJ16 + (+) (+) - - - (+) - - (+) - - - - - - 35/04/00 RJ17 + + + - - (+) + - - - - - - - - - 51/00/00 RJ19 (+) + + - - + (+) - - - - - - (+) - - 51/00/01 continua 22 Continuação RJ31 + (+) (+) - - (+) (+) - - - - - - - - - 51/00/00 RJ32 + (+) + - - + - - - - - - - - - - 19/00/00 RJ34 + (+) (+) - - + (+) - - - - - - (+) - - 51/00/01 SP54 + + + + + + (-) + - - (+) (+) - - (+) - 31/25/02 SP58 + + + + + + - (+) - - + (+) - - + - 31/25/02 SP61 + + + + + + - (+) - - (-) - - - (-) - 31/01/00 SP65 + + + + (+) + - - - - (-) - - - (-) - 31/00/00 SP68 + + + + + + - - - - - - - - (-) - 31/00/00 SP75 + + + + (-) + - - (+) - - - - - - - 23/02/00 SP79 + + + + + + - - - - (-) - - - - - 31/00/00 SP144 + + + + + + - - - - (-) (-) - - (-) - 31/00/00 SP40 + + + + + + - + (-) - - (-) - - - - 31/01/00 SP41 + + + + + + - + (+) - - - - - - (-) 31/03/00 SP46 + + + + + + - + (+) - (-) - - - - - 31/03/00 SP113 + + + + + + - (-) (-) - - - - - (+) - 31/00/02 SP117 + + + (+) + + - - (-) - - - - - (+) (+) 31/00/06 SP90 + + (+) - - - - - - - - - - - - - 03/00/00 SP92 + + + - - + - - - - - - - - - - 19/00/00 SP82 + + + + + + - - (+) - (-) - - - (-) (-) 31/02/00 SP86 + + + + + + - - - - (-) - - - (+) - 31/00/02 SP10 + + + + + + - - - - (+) + - - - - 31/24/00 SP12 + + + + (-) + - + + - (+) - - - - - 23/11/00 SP168 + + + (+) + + - + - - - (-) - - - (-) 31/00/00 SP167 + + + + + + + + - - (-) (-) - - (-) - 63/01/00 SP169 + + + + + + - (+) - - - (-) - - (-) - 31/01/00 SP150 + + + + + + - + (+) - (-) - - - - - 31/03/00 SP154 + + + + + + - (+) (+) - - - - - - - 31/03/00 SP159 + + + + + + - - - - - - - - (-) - 31/00/00 SP161 + + + (+) + + - (+) - - - - - - (-) (-) 31/01/00 SP163 + + + + + + - (+) - - - (-) - - (-) - 31/01/00 SP179 + + + + + + - + (-) - (-) (-) - - (-) - 31/00/00 SP181 + + + + + + - - - - (-) - - - - - 31/00/00 SP184 + + + + + + - + (-) - - - - - - - 31/01/00 SP243 + + + + (+) + - - (+) - - - - - - - 31/02/00 SP253 + + (+) + + - - - - - - - - - - - 15/00/00 SP256 + + + + + - - - - - - - - - - - 15/00/00 SP259 + + + + (+) + - - + - (+) (+) - - (+) - 31/26/02 SP261 + + + + + (+) - - - - - - - - - - 31/00/00 continua 23 continuação SP262 + + + + + + - (-) - - (+) - - - - - 31/08/00 SP263 + + - + + + - - (+) - (+) - - + (-) - 29/10/01 SP264 + (+) + (+) (-) + - + - - - - - - - - 23/01/00 SP265 + + + (+) (+) (+) - - (+) - - - - - - - 31/02/00 SP266 + + + + + (+) - - - - - - - - (-) - 31/00/00 SP267 + + + + (+) + - - (-) - - - - - - - 31/00/00 SP268 + + + (-) (-) (+) - - - - (-) - - - (-) (-) 19/00/00 SP272 + + + + + + - - - - - - - - - - 31/00/00 SP171 + + + - - (+) + - (+) - - - - - - + 51/02/04 SP172 + + + + + + + + (+) (-) (+) - - - - - 63/11/00 SP175 + + (+) - - + + - (-) - - - - - - - 51/00/00 SP201 + + + + + + - (-) - - + + - - - - 31/24/00 SP204 + (+) + (+) + + - - - - - - - - (+) - 31/00/02 SP240 + + + + + + - (-) (-) - - - - - - - 31/00/00 SP241 + + + + + + - - (-) - - - - - - - 31/00/00 SP242 + + + + + + - - (-) - (-) - - - + - 31/00/02 SP226 + + + + + + - (-) - - (-) - - - (-) - 31/00/00 SP222 + + + + + + - (-) - - (-) - - - (+) - 31/00/02 SP210 + + + (+) + + - - - - (-) - - - - - 31/00/00 SP215 + + + + + + - - - - - - - - - - 31/00/00 SP16 + + + (+) + + - - - - (-) - - - (-) - 31/00/00 SP19 + (+) + + (-) + - - (+) - (+) - - - - - 23/10/00 SP239 + + + + + + - + - - (-) - - - - - 31/01/00 SP234 + + + + + + - (+) - - (-) (-) - - (-) - 31/01/00 SP104 + + + + (+) (+) - (-) - - (-) - - - (+) - 31/00/02 SP134 + + + + + + - (-) - - - - - - (-) - 31/00/00 SP147 + + + + + (+) - - - - - - - - - - 31/00/00 SP186 + + + + + + - - + - - - - - - - 31/02/00 SP187 + + + (+) + + - - (-) - - - - - - - 31/00/00 SP189 + + (+) + (+) (+) - - - - - - - - - - 31/00/00 SP190 + + + + + + - - (+) - - - - - - - 31/02/00 SP191 + + + + + + - - - - - - - - - - 31/00/00 SP195 + + + + + + - - - - (-) - - - - - 31/00/00 SP23 + (+) + + (+) + - - - - (+) - - - - - 31/08/00 SP30 + + + + + + - - + - - (-) - - (-) (+) 31/02/04 SP33 + + + + + + - - + (+) - - - - (+) - 31/06/02 SP1 + + + (+) + (+) - - (+) - (+) (+) - - - - 31/26/00 SP4 + + + + + + - - + - - - - - - - 31/02/00 Continua 24 continuação SP331 + + + - - + + + + - + - - - - - 51/11/00 SP328 + + + - + + - + (-) - + - - - (-) (-) 27/09/00 SP329 + (-) + - - (-) + + - - - - - - - - 34/01/00 SP332 - (-) + + + + (+) + (+) - - - - - - - 62/03/00 SP303 + + + + + + - + (-) - (+) - - - - - 31/09/00 SP306 + + - + + + - - - - (-) - - - (+) - 29/00/02 SP310 + + + + (-) + - - + - (-) - - - (-) - 23/02/00 SP312 + + + - - (-) + + (-) - - - - - - - 35/01/00 SP434 + + + - - (-) + - (+) (+) (+) - - - - - 35/14/00 SP437 + + - - - (+) + - (+) (+) - - - + - - 49/06/01 SP427 + + + - - + + - - - - - - - - - 51/00/00 SP429 + + + + + (+) (+) (+) - - (+) - - - - - 63/09/00 SP417 + (+) - - - + + - - (-) - - - + (-) - 49/00/01 SP319 + + + + + + - + + - (+) - - - (+) (-) 31/11/02 SP322 + + + + + + - (-) - - (+) - - - - - 31/08/00 SP326 + + - + (+) + - - (+) - (+) - - + (-) - 29/10/01 SP389 + + - + + + - (-) - - + (-) - - (-) - 29/08/00 SP393 + + + + + + - - (+) - - (+) - - (+) (-) 31/18/02 SP398 + (+) + - - + + + - - - - - - - - 51/01/00 SP415 + + + + + + - + - - (+) - - - - - 31/09/00 SP408 + + + + + + - (+) (-) - (+) (-) - - (-) - 31/09/00 SP380 + + - + + + - - (+) - (-) - - (+) (-) (-) 29/02/01 SP381 + (+) + + + + - - (+ - (-) (+) - - (-) - 31/18/00 SP384 + + + - - + + - (-) (-) (-) - - - - - 51/00/00 SP387 + + + - (-) (+) + - - - - - - - - - 51/00/00 SP341 + + - + + + - - (+) - - - - - - - 29/02/00 SP347 + + + + + + - - (+) - - - - - - (-) 31/02/00 SP349 + + + - - + + (+) - - - - - - - - 51/01/00 SP366 + (+) - + + + (+) + + - - - - + (+) - 61/03/03 SP369 + - (+) (+) + (+) - - (+) - (+) - - (+) (+) - 30/10/03 SP379 + + + - - + + - - - (-) - - - - - 51/00/00 SP378 + + + + + + - - + - (-) - - - (-) - 31/02/00 SP399 + + + + + + - - - - (+) - - - (+) - 31/08/02 SP400 + + - + + + - - (+) - - - - + (+) - 29/02/03 SP336 + + (+) - - - + - (+) (+) (+) - - - - - 35/14/00 SP339 + + - - - + + - - - - - - (+) - - 49/00/01 SP356 + + - + + + - - - - - - - - - - 29/00/00 SP357 (+) + - + (+) + - - (-) - (-) (-) - + (+) - 29/00/03 Continua 25 continuação SP361 + + + + + + - - - - (+) - - - (+) - 31/08/02 RS01 + (+) - - - - (+) - (+) - - - - - - - 33/02/00 RS05 + + + - - + - (-) (+) (+) - - - - - - 19/06/00 RS08 + + + - (-) (+) (-) - (+) (-) - - - - - - 19/02/00 RS10 + (-) + + + + - (-) - - + - - - (-) - 30/08/00 RS11 + (+) (-) - - (-) (+) (-) (+) (-) - - - (-) - - 33/02/00 RS13 + + (-) + + + - - + - - (-) - + - - 29/02/01 RS27 + + - - - (+) (+) (+) (+) - - - - + - - 49/03/01 RS33 + + + - - + + - (-) - + - - - (-) - 51/08/00 RS38 + + + - - + + - (-) (-) - - - + (-) - 51/00/01 RS42 + + - - - + + (-) - (-) (+) - - - - - 49/08/00 RS44 + + + + + + - - (+) - - - - - (+) - 31/02/02 RS50 + + - + + + - - + - (-) - - - (-) - 29/02/00 RS53 + (-) (-) + + + - - + - - (-) - - (-) (-) 28/02/00 RS04 + + - - (-) (-) + (-) (-) - - - - (+) - - 33/00/01 RS55 + + + + + + - (-) + - + - - - + (-) 31/10/02 RS56 (+) (+) - - - - + - (-) - - - - (-) - - 33/00/00 RS18 + + + + + + - - - - - - - - - - 31/00/00 RS19 + + - + + + - - + - - - - + (+) - 29/02/03 RS20 + + + + + + - + - - - + - - + - 31/17/02 RS21 + + + + + + - (-) + - + (-) - - + (-) 31/10/02 RS24 + + - + + + - - + - (-) - - + - - 29/02/01 SC12 + + - - - (+) + (-) (+) - (-) - - + - - 49/02/01 SC15 + + + + + + - + + - + + - - - - 31/27/00 SC18 + + - + (+) + + - (+) (-) - - - (+) - - 61/02/01 SC22 + + + + + - - + + - + + - - - - 15/27/00 SC26 + + - - - (-) + - (+) - (-) - - + (-) - 33/02/01 SC27 + + - + + + - - + - - - - + (+) (-) 29/02/03 SC28 + (+) - + (+) (-) - (+) (+) - - - - - - - 13/03/00 SC29 + + - + + + - - + - (-) - - (+) (+) - 29/02/03 SC32 + + + + + + - - (-) - + (-) - - + - 31/08/02 SC34 + + + + + + - - - - (-) (-) - + (+) - 31/00/03 SC36 + + - + + + - - (-) - - (-) - + (+) - 29/00/03 SC37 + + - + + + - (-) + - (-) - - - (-) (+) 29/02/04 SC38 + + + + + + - - - - + - - - (-) - 31/08/00 SC40 + + - - - (+) + (-) - - - - - - - - 49/00/00 SC41 + + + - - + - - + - + - - - - - 19/10/00 SC44 + + - + (+) + - - (+) - - - - + (+) (-) 29/02/03 Continua 26 Continuação PR01 + + + - - (-) + - - - - - - - - - 35/00/00 PR02 + + + - - + + - (-) (-) - - - - - - 51/00/00 PR03 + + + - - (+) + - - - - - - - - - 51/00/00 PR05 + + + - - + + - - - - - - - - - 51/00/00 PR17 + (+) (+) - - (+) (+) - - - - - - (+) - - 51/00/01 PR18 + (+) (+) - - (-) (+) - (-) (-) - - - - - - 35/00/00 PR08 + (+) - + + + - - (-) - - - - - - - 29/00/00 PR10 + + - - - + + - (-) - - - - + - - 49/00/01 PR11 + + - - - + (+) - (+) (-) (+) - - + - - 49/10/01 PR20 + + - - - (-) + - (-) (-) - - - + - - 33/00/01 PR24 (+) + (+) (+) (+) + - - - - - - - - - - 31/00/00 PR27 (+) + + - - + + - - - (+) - - - (+) - 51/08/02 PR30 + + + (+) + + - - (+) - - + - - (+) (+) 31/18/06 PR31 + (+) (+) + (+) (+) - - (+) - (+) - - + (+) - 31/10/03 PR32 + + - + (+) (+) - - (+) - - (-) - (-) (-) - 29/02/00 PR34 (+) + + - - - (+) - - - (+) - - (+) - - 35/08/01 Total:178 isolados Total: 104 fenótipos Em 2021, foi possível determinar 113 fenótipos de virulência dentre todos os estados amostrados, a partir de 188 isolados (Tabela 4). O fenótipo de virulência do código sexteto 31/00/00 foi mais comum nos estados de SP e RJ, com frequência de 12,65% e 17,40%, respectivamente. Seguido do fenótipo 31/00/02, com frequências de 10,13% e 13,04%, respectivamente. No RS, os códigos sextetos mais frequentes foram o 51/00/00 e 51/02/00, com frequência de 20% e 12%, respectivamente. Em SC, o código sexteto 32/00/00, foi o mais frequente entre os isolados avaliados com 20,58%, seguido do fenótipo de virulência 51/00/00, com 11,76%.Já no PR, o código 31/00/02 foi encontrado em 22,22% dos isolados, seguido do código sexteto 31/00/00 com 11,11% de frequência. Outros fenótipos de virulência comuns a alguns estados foram 51/00/00 (SP, RJ, PR, SC e RS), 33/00/00 (RJ, SC, RS e PR), 31/00/02 (SP, RJ, SC e PR), 32/00/00 (SP, SC, RS e PR), 31/16/00 (RJ, RS e SP) e 51/02/00 (SC, RS e PR), com frequências de 48,57%, 15%, 51,27%, 34,81%, 9,61% e 18,64%, respectivamente, do total de isolados avaliados. 27 Em relação a complexidade, estabelecida pela quantidade de fatores de virulência presentes, atribuição dos sinais + e (+), os fenótipos de virulência dos sextetos 31/18/06 (RS186/21), 31/11/02 (PR32/21), 31/26/02 (PR31/21), 31/18/06 (SP144/21), 31/19/02 (SP464/21) e 63/03/02 (SP415/21) apresentaram nove fatores de virulência (Tabela 4). Enquanto, o código 32/00/00 (RS180/21, SP125/21 e PR56/21) apenas um fator de virulência. Tabela 4. Resposta de resistência/suscetibilidade à Bremia lactucae e códigos sextetos identificados no Rio de Janeiro, São Paulo, Rio Grande do Sul, Santa Catarina e Paraná em 2021. Cultivares diferenciadoras Is o la d o s G . T . D a n d ie R 4 T 5 7 D U C D M 1 4 N u n D M 1 5 C G D m 1 6 C o lo ra d o F rR s a l- 1 A rg e le s R Y Z 2 1 6 4 R Y Z 9 1 0 4 5 7 B e d fo rd B a le s ta B a rt o li D e s ig n K ib ri lle C ó d ig o " S e x te t” Gene Dm ou fator de resistência 0 3 4 14 15 16 18 38 Valor no conjunto sexteto 0 1 2 4 8 16 32 1 2 4 8 16 32 1 2 4 RJ70 + + + + + + - - - - - - - - - - 31/00/00 RJ72 + (+) - - - - + - (+) - - - - - - - 33/02/00 RJ74 + + + + + + - + (+) - - - - - (+) - 31/03/02 RJ75 + + + + + + - - - - - - - - (+) - 31/00/02 RJ76 + + + + + + - - - - (+) (+) - - (+) - 31/24/02 RJ77 + + + + + + - - - - - - - - + - 31/00/02 RJ82 + + + + + + - - - - - - - - - - 31/00/00 RJ83 + + + + + + - - - - - - - - - - 31/00/00 RJ85 + + + + + + - - - - - (+) - - + - 31/16/02 RJ87 + + + + + + - - - - - (+) - - - - 31/16/00 RJ88 + + + + + + - - - - - - - - - - 31/00/00 RJ89 (+) (+) - - - - + - - - - - - - - - 33/00/00 RJ92 + (+) - - - (+) + - - - - - - - - - 49/00/00 RJ94 + + - - - + + - - - - - - - - - 49/00/00 RJ95 + - - - - + + - - - - - - - - - 48/00/00 RJ96 + + + - - + + - - - - - - - - - 51/00/00 RJ97 + + + + + + - + - - - - - - - - 31/01/00 RJ99 + + + + + + - - (+) - - - - - (+) - 31/02/02 RJ100 + + + + + + - - + - - - - - - - 31/02/00 Continua 28 continuação RJ101 + + + (+) (+) (+) + - - - - - - - - - 63/00/00 RJ102 + + + + + + - - - - - - - - (+) - 31/00/02 RJ103 + - - + + + - - - - - (+) - - (+) - 28/16/02 RJ104 + + + + + + - - (+) - - (+) - - (+) - 31/18/02 SP403 + + + + + + - - - - - (+) - - (+) - 31/16/02 SP404 + - + + + + - - - - - - - - - - 30/00/00 SP408 + + + + + + - - - - - - - - - - 31/00/00 SP409 + + + + + + - - - - - - - - (+) - 31/00/02 SP414 + + + + + + - - - - - - - - - - 31/00/00 SP415 + + + + + + + + (+) - - - - - (+) - 63/03/02 SP418 + + + + + + - - - - - - - - - - 31/00/00 SP420 + + + + + + - - - - - - - - - - 31/00/00 SP422 + + + + + + - - - - - (+) - - - - 31/16/00 SP424 + - - + + + - (+) (+) - - (+) - - + - 28/19/02 SP425 + - + + + + - - - - - - - - (+) - 30/00/02 SP427 + + + + + + - - - - - + + - + - 31/48/02 SP429 + - + + + + - - + - - - - - - - 30/02/00 SP433 + + + + + + - - - - - - - - (+) (+) 31/00/06 SP430 + + + + + (+) - - - - - - - - (+) - 31/00/06 SP431 + + - + (+) + - - - - - - - - + - 29/00/02 SP434 + + + + + + - - - - - - - - - - 31/00/00 SP437 + + + + + + - - - - - - - - - - 31/00/00 SP439 + + + + + + - - - - - - - - + - 31/00/02 SP441 + + (+) (+) + + - - - - - - - - (+) - 31/00/02 SP442 + + - + + + - - - - - - - - + - 29/00/02 SP443 + + + + + + - - (+) - (+) - - - - (+) 31/10/04 SP446 + + + + + + - - - - - - - - (+) - 31/00/02 SP448 + + + + + + - - - - - - - - (+) - 31/00/02 SP449 + - - + + + - - - - - (+) - - + - 28/16/02 SP450 + + + + + + - - - - - - - - (+) - 31/00/02 SP452 + + - + + + - - - - - - - - - - 29/00/00 SP453 + + + + + + - - - - - - - - - - 31/00/00 SP456 + + + + + + - - - - - - - - (+) - 31/00/02 SP460 + + + + + + - + - - - - - - (+) - 31/01/02 SP461 (+) - + + + + - - - - - - - - - + 30/00/04 SP462 + + + + + + - - - - - - - - - - 31/00/00 SP463 + + + + + + - + - - - - - - + - 31/01/02 SP464 + + + + + + - + (+) - - (+) - - (+) - 31/19/02 Continua 29 continuação SP465 + + + + + + - + - - - (+) - - (+) - 31/17/02 SP466 + + + + + + - (-) (+) - - - - - (+) - 31/02/02 SP01 (+) (+) (+) - (+) + - - - - - - - - (+) - 27/00/02 SP04 (+) (+) - (+) (+) (+) - - - - (+) - - - - - 29/08/00 SP07 + + + - - + - - - - - - - - - - 19/00/00 SP105 + + + + + + - - + - - - - - (+) - 31/02/02 SP107 + + + + + + - - (+) - - - - - (+) - 31/02/02 SP109 + + + + + + - - - - - (+) - - (+) - 31/16/02 SP110 + + + + + + - (-) - - (-) - - - (-) - 31/00/00 SP115 + - - (+) (+) (+) - - - - - - - - (+) - 28/00/02 SP116 + (+) - + (+) (+) - (+) - - - - - - (+) - 29/01/02 SP117 + + + + + + - + - - - - - - + - 31/01/02 SP118 + + + (+) + + - - - - - - - - (+) - 31/00/02 SP121 + + - - (+) (+) - - - - - (+) - - (+) + 25/16/06 SP122 + + + + + + - - - - - - - - - - 31/00/00 SP124 + + + - - + + - - - - - - - - - 51/00/00 SP125 + - - - - - + - - - - - - - - - 32/00/00 SP126 + - (+) - - (+) + - - - (+) - - - - - 50/08/00 SP127 (+) (+) (+) - - + (+) - - - (+) - - - - - 51/08/00 SP129 + + - - (+) - - - - - - - - - - - 09/00/00 SP130 + (+) - - - (+) + - - (+) (+) - - - - - 49/12/00 SP131 + + + - - - (+) - - - (+) - - - - - 35/08/00 SP132 + (+) (+) - - - (+) - - - - - - - - - 35/00/00 SP134 (+) - (+) - - (+) (+) + - - - - - - - - 50/01/00 SP136 + + (+) - - (+) + - - - - - - - - - 51/00/00 SP138 + + + + + + - + - - - - - - - - 31/01/00 SP139 + + + + + + - + - - - - - - - - 31/01/00 SP140 + + + - - + + - - - - - - - - - 51/00/00 SP144 + + + + + + - - (+) - - (+) - - (+) (+) 31/18/06 SP145 + + + - - + + + + - - - - - - - 51/03/00 SP146 + + + + + + + - + - - - - - - - 31/01/00 SP151 + - (+) + + + - - - - - - - - (+) (+) 30/00/06 SP275 + + - - + + - - - - - - - - - - 25/00/00 SP279 + + + - - + + - - - - - - - - - 51/00/00 SP247 + - + + + + - - - - - - - - - - 30/00/00 SP251 + - - - - - + + - - - - - - - - 32/01/00 SP263 + + + + + + - - - - + (+) - - (+) - 31/24/02 SP257 + + + + + + - - - - - + - - + - 31/16/02 Continua 30 continuação SP260 + - - - - - + - - - - - - - - - 32/00/00 SP262 + - + - - - + + - - - - - - - - 34/01/00 SP293 + - - + + + - + - - - - - - - - 28/01/00 SP296 + - + + + + - - - - - - - - (+) - 30/00/02 SP299 + + + + + + - + - - - - - - + - 31/01/02 SP303 + + + + - + - + - - (+) (+) - - (+) - 23/25/02 SP308 + - + + + + - + - - - - - - - - 30/01/00 RS158 + + + + + + - - - - - - - - - - 31/00/00 RS159 + + + + + + - - - - - (+) - - - - 31/16/00 RS161 + - - + - + + - - - - - - - - - 52/00/00 RS162 + + + - - + + - (+) - - - - - - - 51/02/00 RS163 + + + + + + - - + - - - - - - - 31/02/00 RS164 + + + + + + - - + - - - - - - - 31/02/00 RS165 + + + + + + + - + - - - - - - - 63/02/00 RS166 + + + - - + + - - - - - - - - - 51/00/00 RS167 + + + - - + + - - - - - - - - - 51/00/00 RS168 + (+) - - - - + - - - - - - - - - 33/00/00 RS170 + - - - - - + - - - - - - - - - 32/00/00 RS171 + - - + - + + - - - - - - - - - 52/00/00 RS172 + (+) - - - - + - (+) - - - - - - - 33/02/00 RS173 + + + - - + - - - - - - - - - - 19/00/00 RS174 + + + - - + + - (+) - - - - - - - 51/02/00 RS176 + + + - - + + - - - - - - - - - 51/00/00 RS177 + + + - - + + - - - - - - - - - 51/00/00 RS178 (+) (+) - - - (+) + - (+) - - - - - - - 49/02/00 RS179 + + + - - + + - - - - - - - - - 51/00/00 RS180 + - - - - - (+) - - - - - - - - - 32/00/00 RS182 + + + - - + + - (+) - - - - - - - 51/02/00 RS183 + (+) - - - (+) + - (+) - - - - - - (+) 49/02/04 RS184 - - - - + + - - - - - - - - - - 24/00/00 RS185 + + + + + + - - - - - - - - - - 31/00/00 RS186 + + + + + + - - (+) - - (+) - - (+) (+) 31/18/06 SC187 + + + + + + - - - - - - - - + - 31/00/02 SC189 + + + + + + - - - - - - - - - - 31/00/00 SC190 + + + + (+) (+) - - - - - (+) - - - (+) 31/16/04 SC192 + + + + + + - - - - - - - - (+) - 31/00/02 SC193 + + + + + + - - (+) - - - - - (+) - 31/02/02 SC194 + (+) (+) + + + - - - - - - - - - - 31/00/00 Continua 31 continuação SC195 + - (+) - - (+) + - - - - - - - - - 50/00/00 SC196 + + - - - - + - - - - - - - - - 33/00/00 SC197 + + + + + + - + + - - - - - - - 31/03/00 SC198 + + + - - (+) + - + - - - - - - - 51/02/00 SC199 + + + - + + - - - - - - - - - - 59/00/00 SC200 + + + + + + - + - - - - - - - - 31/01/00 SC201 + + + - - + + - - - - - - - - - 51/00/00 SC202 + + + - - + + - - - - - - - - - 51/00/00 SC203 + + + + (+) + - + - - - - - - - - 31/01/00 SC204 + + + + + + - + - - - - - - - - 31/01/00 SC205 + - - + + + - - - - - - - - - - 28/00/00 SC206 + + + + + + - + - - (+) - - - + - 31/09/02 SC208 + - - - - - + - - - - - - - - - 32/00/00 SC209 + + + + - + - - - - - - - - - - 23/00/00 SC211 + + + - - + + - - - - - - - - - 51/00/00 SC213 + - + + - + - - - - - - - - - - 22/00/00 SC214 + + + + + + - + - - - - - - + + 31/01/06 SC217 + - - - - - + - - - - - - - - - 32/00/00 SC219 + - - - - - + - - - - - - - - - 32/00/00 SC222 + - - - - - + - - - - - - - - - 32/00/00 SC226 + - - - - - + - - - - - - - - - 32/00/00 SC228 + + + - - + + - - - - - - - - - 51/00/00 SC230 + - - - - - + - - - - - - - - - 32/00/00 SC232 + - (+) - - + + - - - - - - - - - 50/00/00 SC234 + - - - - - + - - - - - - - - - 32/00/00 SC237 + + + + + + - - - - - + - - - (+) 31/16/04 SC240 + + + + + + - - - - - - - - - - 31/00/00 SC244 + + + + + + - - + - - - - - + - 31/02/02 PR18 + + + + + + - - - - - - - - (+) - 31/00/02 PR19 + + - + - (+) - - - - - (+) - - (+) - 21/16/02 PR20 (+) (+) - (+) (+) (+) - - - - - - - - - - 29/00/00 PR21 (-) + (+) + + + - - - - - - - - - - 31/00/00 PR24 + + + + + + - - - - - - - - - - 31/00/00 PR25 + (+) + (+) (+) + - - - - - - - - + - 31/00/02 PR27 + + + - (+) + - - (+) - - - - - + - 27/02/02 PR28 (+) + (+) (+) + + - - - - - - - - (+) - 31/00/02 PR30 + + (+) (+) (+) (+) - - - - - - - - (+) - 31/00/02 PR31 + + + + + + - - (+) - (+) (+) - - + - 31/26/02 Continua 32 continuação PR32 (+) + (+) (+) (+) + - (+) (+) - (+) - - - (+) - 31/11/02 PR33 + - - (+) + + - - - - - - - - + - 28/00/02 PR34 + + - + (+) (+) - - + - (+) - - - (+) - 29/10/02 PR36 + (+) (+) - - (+) (+) - - - - - - - - - 51/00/00 PR37 (+) (+) - - - - (+) - - - - - - - - - 33/00/00 PR38 + + + + + + - - (+) - - (+) - - + - 31/18/02 PR41 + + + (+) (+) (+) - - - - - - - - (+) - 31/00/02 PR43 + + + + + + - - - - - - - - - - 31/00/00 PR46 + + + - - + + - (+) - - - - - - - 51/02/00 PR47 + (+) (-) (+) (+) (+) - - - - (+) - - - (+) - 29/08/02 PR48 (+) + (+) + + + - - - - (+) - - - (+) - 31/08/02 PR55 + + + - - + + - - - - - - - - - 51/00/00 PR56 + - - - - - (+) - - - - - - - - - 32/00/00 PR57 + + + + + + - - - - - - - - (+) + 31/00/06 PR62 + + (+) + + + - + - - (+) - - - - - 31/09/00 PR63 + + (+) (+) + + - - - - (-) - - - (+) - 31/00/02 PR64 (+) (+) + - - + - - - - - - - - - - 19/00/00 Total:188 isolados Total: 113 fenótipos 4.2 Frequência dos fatores de virulência Nas populações avaliadas de cada estado, encontrou-se os seguintes fatores de virulência: v3, v4, v14, v15, v16, v18, vFRsal-1, v38, vRYZ2164, vRYZ910457, vBedford, vBartoli, vDesing e vKibrille no ano de 2020 (Figura 1) e no ano de 2021 (Figura 2), e vBalesta somente em 2021. Os genes de virulência que ocorreram em menor frequência em 2020 foram vFRsal-1, vRYZ2164, vRYZ910457, vBedford, vDesign e vKibrille. O gene vBalesta, não ocorreu em nenhum dos estados estudados. Os fatores de virulência que apresentaram maior variação entre os isolados avaliados foram v3, v4, v14, v15, v16, v18 e v38. Os genes de virulência que ocorreram em menor frequência em 2021 foram vFRsal-1, v38, vRYZ910457, vBedford, vDesign e vKibrille. O gene vBartoli, não 33 ocorreu em nenhum dos estados estudados. Os genes vRYZ910457 e vBalesta ocorreram somente em São Paulo. Os fatores de virulência que apresentaram maior variação entre os isolados avaliados foram v3, v4, v14, v15, v16 e v18. Figura 1. Frequência dos fatores de virulência observados nas populações de Bremia lactucae nos estados do Paraná, Rio de Janeiro, Rio Grande do Sul, Santa Catarina e São Paulo em 2020. Figura 2. Frequência dos fatores de virulência observados nas populações de Bremia lactucae nos estados do Rio de Janeiro, Santa Catarina, Rio Grande do Sul, Paraná e SãoPaulo em 2021. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Fr e q u ê n ci a (% ) Fatores de Virulência PR RJ RS SC SP 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Fr e q u ê n ci a (% ) Fatores de Virulência SP RJ SC RS PR 34 4.3 Avaliação da diversidade e complexidade dos fenótipos de virulência O Índice de Gleason (Ig) representa o nível de diversidade nos isolados amostrados dentro da população estudada, ressaltando a população de isolados de São Paulo em 2020 com Ig = 10,17, indicando que houve maior quantidade de fenótipos. O menor nível de diversidade foi observado no estado do Rio de Janeiro, indicando uma população mais homogênea (Ig = 3,51), isso pode estar relacinado a quantidade de isolados avaliados em cada estado (Tabela 5). As expedições para coleta de tecidos com esporos de B. lactucae envolve recursos humanos e econômicos, além da difícil logística. Esse fato torna essa etapa complexa, contudo, há necessidade de equilibrar a proporção de coletas em função da representatividade de produção de alface em cada estado. Em 2021, a população coletada em São Paulo apresentou maior diversidade nos isolados avaliados, com um Ig = 10,07, ou seja, mais fenótipos avaliados, enquanto a população do Rio Grande do Sul apresentou menor Índice de Gleason, possivelmente relacionado ao menor número de fenótipos avaliados (Ig = 4,34) (Tabela 6). Na avaliação conjunta dos isolados identificados nos estados estudados, a diversidade apresentada pelo Índice de Gleasson encontrada foi alta com uma média de 5,65 em 2020, e 5,9 em 2021. Tabela 5. Caracterização da diversidade e complexidade dos fenótipos de virulência de Bremia lactucae, presentes nos estados do Rio de Janeiro, São Paulo, Rio Grande do Sul, Santa Catarina, Paraná e do total de isolados amostrados em 2020. Estados Ni Nf Ig Ci Cf Rio de Janeiro 13 10 3,51 5,23 5,40 São Paulo 112 49 10,17 5,88 6,25 Rio Grande do Sul 21 18 5,58 5,19 5,11 Santa Catarina 16 14 4,69 6,19 6,07 Paraná 16 13 4,32 4,69 5,23 Total Amostrado 178 104 28,27 27,18 28,06 Número de isolados identificados (Ni), número de fenótipos de virulência identificados (Nf), índice de Gleason (Ig), Complexidade de virulência por isolado (Ci) e complexidade de virulência por fenótipo (Cf). 35 Tabela 6. Caracterização da diversidade e complexidade dos fenótipos de virulência de Bremia lactucae, presentes nos estados do Rio de Janeiro, São Paulo, Rio Grande do Sul, Santa Catarina, Paraná e do total de isolados amostrados em 2021. Estados Ni Nf Ig Ci Cf Rio de Janeiro 23 17 5,10 5,30 5,41 São Paulo 79 45 10,07 5,48 5,50 Rio Grande do Sul 25 15 4,34 4,28 4,40 Santa Catarina 34 17 4,53 4,32 4,94 Paraná 27 19 5,46 5,55 5,58 Total Amostrado 188 113 29,50 24,93 25,83 Número de isolados identificados (Ni), número de fenótipos de virulência identificados (Nf), índice de Gleason (Ig), Complexidade de virulência por isolado (Ci) e complexidade de virulência por fenótipo (Cf). 5 DISCUSSÃO O míldio da alface vem sendo monitorado no estado de São Paulo desde 2003. Já nos estados do Rio Grande do Sul e Paraná desde 2015 e 2016, respectivamente. No Rio de Janeiro e Santa Catarina, o monitoramento teve início em 2019. O monitoramento do míldio era baseado no conjunto EU-A e EU-B, até os anos de 2013 e 2015, respectivamente. A partir de 2016 foi estabelecido o conjunto EU-C, conceituando os fatores de virulência que foram mais proeminentes ao decorrer dos monitoramentos realizados ao longo dos anos, conforme surgimento nas populações do patógeno, e também devido aos estudos realizados pelos programas de melhoramento. A partir de 2014, teve-se a avaliação da reação as cultivares RYZ2164, RYZ910457, Bedford e Balesta. Já as cultivares FRsal-1, Bartoli e Kibrille, só foram inseridas ao conjunto de diferenciadoras a partir de 2016 (Isf, 2021). Dos 105 fenótipos de virulência encontrados em 2020, dois são equivalentes a códigos sextetos (EU-C) já identificados na Europa. O código 19/00/00, corresponde à raça Bl:EU16, encontrado em São José do Rio Preto/SP, Jaboticabal/SP e Sumidouro/RJ, e o código 51/00/00, corresponde à Bl:EU20, encontrado em Botucatu/SP, Piedade/SP, Jacareí/SP, Salesópolis/SP, Sumidouro/RJ, Teresópolis/RJ e Colombo/PR. 36 Os mesmos comportamentos de códigos sextetos 19/00/00 e 51/00/00, correspondentes às raças Bl:EU16 e Bl:EU20, respectivamente, também foram encontrados no ano de 2021. Sendo a raça BI:EU16 encontrada em Piedade/SP, São José dos Pinhais/PR e Maquiné/RS e a raça BI:EU20 encontrada em Botucatu/SP, Ibiúna/SP, Limeira/SP, Nova Friburgo/RJ, Antônio Carlos/SC, Maquiné/RS e São José dos Pinhais/PR. Em 2020, o fator de resistência presente na cultivar ‘Balesta’, comum em todos os estados estudados, ainda concedia resistência aos isolados de B. lactucae. Ainda, o gene de resistência ‘RyZ2164’ pode ser estudado para conferir resistência em Santa Catarina e Paraná; enquanto o gene ‘Kibrille’ pode ser usado para conceder resistência aos isolados do Rio Grande do Sul; ademais no Rio de Janeiro, pode ser utilizado os genes ‘Frsal-1’ e ‘Bedford’ para conferir resistência aos seus isolados. Em 2021, os fatores de resistência ‘Balesta’ e ‘RyZ2164’ concedem resistência aos isolados de todos os estados estudados, com excessão de São Paulo. O fator de resistência ‘Bartoli’, concede resistência a todos os estados estudados. Sendo o fator de resistência de ‘Kibrille’ utilizado para conceder resistência também para os isolados do Rio de Janeiro; e os fatores ‘Frsal-1’ e ‘RyZ910457’ para conceder resistência aos isolados do Rio Grande do Sul. O estado de São Paulo, em 2021, apresentou pelo menos um isolado suscetível para cada cultivar diferenciadora. Sendo a avaliação do isolado SP427/21, encontrado em Ribeirão Preto/SP, surpreendente ao apresentar possível quebra de resistência ao fator de resistência presente na cultivar ‘Balesta’, uma vez que até então ela conferia resistência a população de B. lactucae. Uma vez que, até então, os genes de virulência da cultivar ‘Balesta’ não tinham sido detectados no Brasil, nos EUA, a resistência conferida por esta é eficaz em mais de 95% dos isolados avaliados até 2017 (Franco et al., 2021). A complexidade de virulência por isolado (Ci) e a complexidade de virulência por fenótipo (Cf) foram maiores em Santa Catarina e São Paulo no ano de 2020, e no Rio de Janeiro e em São Paulo em 2021. A similaridade dos resultados de Ci e Cf, indicam que cada fenótipo ocorreu na mesma frequência, como pode ser visto no Rio de Janeiro, Rio Grande do Sul e em Santa Catarina em 2020, e entre todos os 37 estados avaliados em 2021. No Paraná, no ano de 2020, o Cf foi superior ao Ci, o que indica a predominância de fenótipos com menor número de fatores de virulência. Quando a complexidade de virulência por fenótipo (Cf) é maior do que por isolado (Ci), tendem a predominar fenótipos de virulência simples (Andrivon 1994; Lebeda e Zinkernagel 2003), como foi observado no presente estudo quando realizou-se a avaliação por estado (Tabela 5 e 6). Pode-se observar alta diversidade entre as populações estudadas, o que faz com que a introdução de novas cultivares seja mais complexa. Assim sendo, verifica-se a necessidade de monitoramento contínuo dos fenótipos de virulência que ocorrem nas principais regiões produtoras de alface do Brasil, visando identificar àqueles com frequência e distribuição, a fim de direcionar programas de melhoramento por meio da introgressão de genes de resistência nas futuras cultivares de alface. 6 CONCLUSÕES Em 2020, o código sexteto 51/00/00, foi o mais frequente e presente nos estados do Rio de Janeiro e Paraná, enquanto o código sexteto 31/00/00 foi o mais frequente em São Paulo, o código sexteto 29/02/03 mais frequente em Santa Catarina, e o código sexteto 31/10/02 foi o mais frequente no Rio Grande do Sul. Em 2021, os códigos sextetos mais frequentes foram 31/00/00 encontrado em São Paulo e Rio de Janeiro, 31/01/00 em Santa Catarina, 51/00/00 no Rio Grande do Sul e 31/00/02 no Paraná. Os isolados RS56/20 e SP90/20, coletado em Terra de Areia/RS e São José do Rio Preto/SP, no ano de 2020, devem ser utilizados na avaliação de cultivares resistentes para os estados da região sul do Brasil e em São Paulo e Rio de Janeiro, por apresentar menor número de fatores de virulência, indicando possível resistência a maioria das cultivares diferenciadoras, uma vez que apresentaram suscetibilidade a apenas duas cultivares. 38 Os isolados RS180/21 e RS170/21, de Maquiné/RS; PR56/21, de São José dos Pinhais/PR; SC234/21, SC230/21, SC226/21 SC222/21 e SC219/21, de Chapecó/SC; SC217/21, de Antônio Carlos/SC; SP125/21 de Botucatu/SP; SP260/21 de Mogi das Cruzes; e SP263/21 de Biritiba Mirim, coletados no ano de 2021, também devem ser considerados na avaliação de cultivares resistentes para as regiões Sul e Sudeste do país, por apresentarem apenas um fator de virulência, ambos com o código sexteto 32/00/00, indicando suscebilidade a apenas uma das cultivares diferenciadoras. O fator de resistência encontrado na cultivar diferenciadora ‘Balesta’ é a mais indicada para programas de melhoramento de alface visando resistência ao míldio da alface para a região sul do Brasil e os estados de São Paulo e Rio de Janeiro, uma vez que nos dois anos de monitoramento a maioria dos isolados apresentou resistência a ela, apesar de apenas um dos 331 isolados ter manifestado reação. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Abcsem. MANUAL TÉCNICO CULTIVO DE HORTALIÇAS 2020: Alface. Campinas: [s. n.], 2001-2020. Disponível em: https://www.abcsem.com.br/publicacoes. Acesso em: 22 mar. 2022. Andrivon D. (1994) Race structure and dynamics in populations of Phytophthora infestans. Canadian Journal of Botany 72:1681–1687. van Bruggen AHC, Scherm H. (1997) Downy milldew. In: Davis RM, Subbarao KV, Raid RN, Kurts EA. (eds.) Compendium of lettuce diseases. Saint Paul: American Phytopathological Society. p. 17-19. Caprio CH. 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