UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JULIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS BÁRBARA REGINA KAPP Investigação da produção de enzimas celulolíticas em fungos filamentosos para aplicação na biodegradação de bagaço de cana-de-açúcar ARARAQUARA-SP 2016 2 BÁRBARA REGINA KAPP Investigação da produção de enzimas celulolíticas em fungos filamentosos para aplicação na biodegradação de bagaço de cana Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Área de Pesquisa e Desenvolvimento de Fármacos e Medicamentos, da Faculdade de Ciências Farmacêuticas, UNESP, como parte dos requisitos necessários para a obtenção do Título de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Orientadora: Prof. Dra. Rosemeire Cristina Linhari Rodrigues Pietro ARARAQUARA – SP 2016 3 4 5 “Quando você decide parar ou começar alguma coisa, seja como for, você tem que seguir em frente. Tudo que precisa é de atitude e determinação” Yuuko Ichihara 6 AGRADECIMENTOS Aos meus pais José Carlos e Maria Isabel pelo apoio, carinho e aconselhamentos. Por sempre acreditarem no meu futuro. Aos demais familiares, irmãos, cunhadas e sobrinhos por todo apoio e momentos de alegrias. À minha orientadora Dra. Rosemeire Cristina Linhari Rodrigues Pietro, pela oportunidade, ensinamentos, conselhos e dedicação para este trabalho. Ao James Ribeiro, por todo o apoio nesta nova etapa da minha vida, por conselhos e por estar comigo em todos os momentos. A toda equipe do laboratório de Biotecnologia Farmacêutica da UNESP, que sem dúvidas este trabalho não seria concluído. Ao Professor Doutor Marcel Otávio Cerri por todo auxílio e conselhos. Ao Professor Doutor Fernando Masarin e o aluno Fernando Paz por toda ajuda na reta final do trabalho. A todos os meus amigos que fizeram parte da minha jornada: Vanessa, Renata Ribeiro, Alice, Rafael, Cindy, Isabella, Renata Kurokawa, Ivy e Heloisa. Ao Prof. Dr. Fernando Masarin e ao Fernando Paz por toda a ajuda e ensinamentos na reta final. Ao CNPq pelo apoio financeiro que possibilitou a realização deste trabalho. 7 SUMÁRIO 1. Introdução 16 2. Revisão da Literatura 18 2.1. Enzimas Celulolíticas 18 2.2. Fungos Filamentosos 21 2.3. Biodegradação de Bagaço de Cana 23 3. Objetivos 28 3.1. Objetivos Específicos 28 4. Materiais e Métodos 29 4.1. Materiais 29 4.2. Equipamentos 30 4.3. Métodos 31 4.3.1. Microrganismo e Manutenção 31 4.3.2. Meios de Cultura 32 4.3.2.1. Meio de cultura para a metodologia de coloração por Vermelho congo 32 4.3.2.2. Meios de cultura para produção de celulase por fungos filamentosos 32 4.3.3. Produção Enzimática em Agitador Orbital 33 4.3.4. Curva de Produção Enzimática em diferentes meios 33 4.3.5. Avaliação da Influencia da Composição do Meio de cultura na Produção enzimática 35 4.3.6. Recuperação das Enzimas Produzidas 36 4.3.7. Determinação de Atividade Enzimática 36 4.3.7.1. Determinação de Celulase Total (FPAse) 36 4.3.7.2. Determinação de Atividade Endoglucanase 37 4.3.7.3. Determinação de Atividade Exoglucanase 37 4.3.7.4. Determinação de Atividade β-Glicosidase 38 4.3.8. Parâmetros Bioquímicos Enzimáticos 39 4.3.8.1. Estabilidade quanto à temperatura 39 4.3.8.2. Estabilidade quanto ao pH 39 4.3.9. Determinação de Proteínas 40 4.3.10. Perfil de Atividade Enzimática por Tempo de Incubação 40 4.3.11. Purificação Parcial das Enzimas 40 4.3.11.1. Precipitação por Sulfato de Amônio e Diálise 40 4.3.11.2. Precipitação por Etanol 41 4.3.11.3. Precipitação por Acetona 41 4.3.12. Eletroforese 41 4.3.13. Pré-Tratamento do Bagaço de Cana 42 4.3.14. Análise de composição de Bagaço de Cana in natura e pré –tratado 43 4.3.15. Hidrolise Enzimática do Bagaço de Cana-de-Açúcar 44 4.3.16. Análise da Hidrólise Enzimática do Bagaço de Cana in natura e pré-tratado 45 5. Resultados 46 5.1. Recuperação Fúngica e Técnica de Congo Red 46 5.2. Perfil de Atividade Enzimática 47 5.2.1. Perfil de Atividade Enzimática dos Fungos em Meio A 47 5.2.2. Perfil de Atividade Enzimática dos Fungos em Meio B 48 5.2.3. Perfil de Atividade Enzimática dos Fungos em Meio C 49 5.2.4. Perfil de Atividade Enzimática dos Fungos em Meio D 50 8 5.3. Avaliação da Influencia da Composição do Meio de Cultura A na Produção Enzimática 52 5.4. Estabilidade Enzimática 56 5.4.1. Estabilidade Enzimática de Aspergillus niger cultivado em Meio A 56 5.4.1.1. Estabilidade ao pH 56 5.4.1.1.1. β-Glicosidase 56 5.4.1.1.2. Endoglucanase 57 5.4.1.1.3. Exoglucanase 58 5.4.1.1.4. FPAse 59 5.4.1.2. Estabilidade à Temperatura 61 5.4.1.2.1. β-Glicosidase 61 5.4.1.2.2. Endoglucanase 62 5.4.1.2.3. Exoglucanase 63 5.4.1.2.4. FPAse 64 5.4.2. Estabilidade Enzimática de Aspergillus terreus cultivado em Meio B 65 5.4.2.1. Estabilidade ao pH 65 5.4.2.1.1. β-Glicosidase 65 5.4.2.1.2. Endoglucanase 66 5.4.2.1.3. Exoglucanase 67 5.4.2.1.4. FPAse 68 5.4.2.2. Estabilidade à Temperatura 69 5.4.2.2.1. β-Glicosidase 69 5.4.2.2.2. Endoglucanase 70 5.4.2.2.3. Exoglucanase 71 5.4.2.2.4. FPAse 72 5.4.3. Estabilidade Enzimática de Aspergillus terreus cultivado em Meio C 73 5.4.3.1. Estabilidade ao pH 73 5.4.3.1.1. β-Glicosidase 73 5.4.3.1.2. Endoglucanase 74 5.4.3.1.3. Exoglucanase 75 5.4.3.1.4. FPAse 76 5.4.3.2. Estabilidade à Temperatura 77 5.4.3.2.1. β-Glicosidase 77 5.4.3.2.2. Endoglucanase 78 5.4.3.2.3. Exoglucanase 79 5.4.3.2.4. FPAse 80 5.4.4. Estabilidade Enzimática de Penicillium simplicissimum cultivado em Meio C com 4 dias de cultivo 81 5.4.4.1. Estabilidade ao pH 81 5.4.4.1.1. β-Glicosidase 81 5.4.4.1.2. Endoglucanase 81 5.4.4.1.3. Exoglucanase 82 5.4.4.1.4. FPAse 83 5.4.4.2. Estabilidade à Temperatura 84 5.4.4.2.1. β-Glicosidase 84 5.4.4.2.2. Endoglucanase 84 5.4.4.2.3. Exoglucanase 85 5.4.4.2.4. FPAse 86 9 5.4.5. Estabilidade Enzimática de Penicillium simplicissimum cultivado em Meio C com 13 dias de cultivo 87 5.4.5.1. Estabilidade ao pH 87 5.4.5.1.1. β-Glicosidase 87 5.4.5.1.2. Endoglucanase 87 5.4.5.1.3. Exoglucanase 88 5.4.5.1.4. FPAse 89 5.4.5.2. Estabilidade à Temperatura 90 5.4.5.2.1. β-Glicosidase 90 5.4.5.2.2. Endoglucanase 90 5.4.5.2.3. Exoglucanase 91 5.4.5.2.4. FPAse 92 5.4.6. Estabilidade Enzimática de Aspergillus terreus cultivado em Meio D 93 5.4.6.1. Estabilidade ao pH 93 5.4.6.1.1. β-Glicosidase 93 5.4.6.1.2. Endoglucanase 94 5.4.6.1.3. Exoglucanase 95 5.4.6.1.4. FPAse 96 5.4.6.2. Estabilidade à Temperatura 97 5.4.6.2.1. β-Glicosidase 97 5.4.6.2.2. Endoglucanase 98 5.4.6.2.3. Exoglucanase 99 5.4.6.2.4. FPAse 100 5.5. Perfil de Atividade Enzimática por Tempo de Incubação 101 5.6. Purificação Parcial 102 5.7. Eletroforese 104 5.8. Biodegradação de bagaço de cana in natura e pré-tratado 105 6. Discussão 107 7. Conclusões 126 8. Referências 127 Anexo I 136 10 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Esquema de degradação enzimática do complexo celulolítico 21 Figura 2. Modelo de estrutura de lignina presente nas coníferas 25 Figura 3. Fungos Filamentosos em meio PDA 46 Figura 4. Crescimento de fungos filamentosos em meio com Congo Red. 47 Figura 5. Curva de Atividade enzimática dos fungos filamentosos em Meio A 48 Figura 6. Curva de Atividade enzimática dos fungos filamentosos em Meio B 49 Figura 7. Curva de Atividade enzimática dos fungos filamentosos em Meio C 50 Figura 8. Curva de Atividade enzimática dos fungos filamentosos em Meio D 51 Figura 9. Atividade Enzimática Específica e proteína de triplicata do ensaio 8 de Plackett & Burman 55 Figura 10. Porcentagem de Atividade residual de β-Glicosidase produzida por Aspergillus niger no Meio A em função do pH 57 Figura 11. Porcentagem de Atividade residual de Endoglucanase produzida por Aspergillus niger no Meio A em função do pH 58 Figura 12. Porcentagem de Atividade residual de Exoglucanase produzida por Aspergillus niger no Meio A em função do pH 59 Figura 13. Porcentagem de Atividade residual de FPAse produzida por Aspergillus niger no Meio A por tempo, em função do pH 60 Figura 14. Porcentagem de Atividade residual de β-Glicosidase produzida por Aspergillus niger no Meio A em função da Temperatura 61 Figura 15. Porcentagem de Atividade residual de Endoglucanase produzida por Aspergillus niger no Meio A em função da Temperatura 63 Figura 16. Porcentagem de Atividade residual de Exoglucanase produzida por Aspergillus niger no Meio A em função da Temperatura 64 Figura 17. Porcentagem de Atividade residual de FPAse produzida por Aspergillus niger no Meio A em função da Temperatura 65 Figura 18. Porcentagem de Atividade residual de β-Glicosidase produzida por Aspergillus terreus no Meio B em função do pH 66 Figura 19. Porcentagem de Atividade residual de Endoglucanase produzida por Aspergillus terreus no Meio B em função do pH 67 Figura 20. Porcentagem de Atividade residual de Exoglucanase produzida por Aspergillus niger no Meio B em função do pH 68 Figura 21. Porcentagem de Atividade residual de FPAse produzida por Aspergillus niger no Meio B em função do pH 69 Figura 22. Porcentagem de Atividade residual de β-Glicosidase produzida por Aspergillus terreus no Meio B em função da Temperatura 70 Figura 23. Porcentagem de Atividade residual de Endoglucanase produzida por Aspergillus terreus no Meio B em função da Temperatura 71 Figura 24. Porcentagem de Atividade residual de Exoglucanase produzida por Aspergillus niger no Meio B por tempo, variando a temperatura 72 Figura 25. Porcentagem de Atividade residual de FPAse produzida por Aspergillus terreus no Meio B em função da Temperatura 73 Figura 26. Porcentagem de Atividade residual de β-Glicosidase produzida por Aspergillus terreus no Meio C em função do pH 74 Figura 27. Porcentagem de Atividade residual de Endoglucanase produzida por Aspergillus terreus no Meio C em função do pH 75 11 Figura 28. Porcentagem de Atividade residual de Exoglucanase produzida por Aspergillus terreus no Meio C em função do pH 76 Figura 29. Porcentagem de Atividade residual de FPAse produzida por Aspergillus niger no Meio C em função do pH 77 Figura 30. Porcentagem de Atividade residual de β-Glicosidase produzida por Aspergillus terreus no Meio C por tempo, variando a temperatura 78 Figura 31. Porcentagem de Atividade residual de Endoglucananase produzida por Aspergillus terreus no Meio C em função da Temperatura 79 Figura 32. Porcentagem de Atividade residual de Exoglucananase produzida por Aspergillus terreus no Meio C em função da Temperatura 80 Figura 33. Porcentagem de Atividade residual de FPAse produzida por Aspergillus terreus no Meio C em função da Temperatura 81 Figura 34. Porcentagem de Atividade residual de Endoglucanase produzida por Aspergillus terreus no Meio C em 4 dias de incubação em função do pH 82 Figura 35. Porcentagem de Atividade residual de Exoglucanase produzida por Aspergillus terreus no Meio C em 4 dias de incubação em função do pH 83 Figura 36. Porcentagem de Atividade residual de FPAse produzida por Aspergillus terreus no Meio C em 4 dias de incubação em função do pH 84 Figura 37. Porcentagem de Atividade residual de Endoglucanase produzida por Aspergillus terreus no Meio C em 4 dias de incubação em função da Temperatura 85 Figura 38. Porcentagem de Atividade residual de Exoglucanase produzida por Aspergillus terreus no Meio C em 4 dias de incubação em função da Temperatura 86 Figura 39. Porcentagem de Atividade residual de FPAse produzida por Aspergillus terreus no Meio C em 4 dias de incubação em função da Temperatura 87 Figura 40. Porcentagem de Atividade residual de Endoglucanase produzida por Aspergillus terreus no Meio C em 13 dias de incubação em função do pH 88 Figura 41. Porcentagem de Atividade residual de Exoglucanase produzida por Aspergillus terreus no Meio C em 13 dias de incubação em função do pH 89 Figura 42. Porcentagem de Atividade residual de FPAse produzida por Aspergillus terreus no Meio C em 13 dias de incubação em função do pH 90 Figura 43. Porcentagem de Atividade residual de Endoglucanase produzida por Aspergillus terreus no Meio C em 13 dias de incubação em função da Temperatura 91 Figura 44. Porcentagem de Atividade residual de Exoglucanase produzida por Aspergillus terreus no Meio C em 13 dias de incubação em função da Temperatura 92 Figura 45. Porcentagem de Atividade residual de FPAse produzida por Aspergillus terreus no Meio C em 13 dias de incubação em função da Temperatura 93 Figura 46. Porcentagem de Atividade residual de β-Glicosidase produzida por Aspergillus terreus no Meio D em função do pH 94 Figura 47. Porcentagem de Atividade residual de Endoglucanase produzida por Aspergillus terreus no Meio D em função do pH 95 Figura 48. Porcentagem de Atividade residual de Exoglucanase produzida por Aspergillus terreus no Meio D em função do pH 96 Figura 49. Porcentagem de Atividade residual de FPAse produzida por Aspergillus terreus no Meio D em função do pH 96 12 Figura 50. Porcentagem de Atividade residual de β-Glicosidase produzida por Aspergillus terreus no Meio D em função da Temperatura 98 Figura 51. Porcentagem de Atividade residual de Endoglucanase produzida por Aspergillus terreus no Meio D em função da Temperatura 99 Figura 52. Porcentagem de Atividade residual de Exoglucanase produzida por Aspergillus terreus no Meio D em função da Temperatura 100 Figura 53. Porcentagem de Atividade residual de FPAse produzida por Aspergillus terreus no Meio D em função da Temperatura 101 Figura 54. Perfil de Atividade Enzimática por tempo de incubação do Extrato Enzimático Bruto produzido pelo Meio D 102 Figura 55. Eletroforese desnaturante em gel de 10% 105 Figura 56. Cromatogramas de CLAE coluna BIORAD AMINEX HPX-87H com ácido sulfúrico 0,005 mol.L -1 a 85°C por 12 minutos de corrida. 106 Figura 57. Porcentagem de conversão de celulose em glicose por tempo de hidrólise 107 13 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Composição dos diferentes meios de cultura utilizados para produção das enzimas celulolíticas par aos fungos filamentosos. 33 Tabela 2. Composição do Meio A e as variáveis em Plackett & Burman 34 Tabela 3. Disposição da combinação fatorial no modelo de Plackett & Burman de 16 ensaios 35 Tabela 4. Fatorial de Plackett & Burman com 16 ensaios e atividade específica de β- glicosidase, endoglucanse, exoglucanase e FPAse 52 Tabela 5. Análise do efeito e de estatísticas dos componentes do fatorial de Plackett & Burman para β-Glicosidase. 53 Tabela 6. Análise do efeito e de estatísticas dos componentes do fatorial de Plackett & Burman para Endoglucanase. 53 Tabela 7. Análise do efeito e de estatísticas dos componentes do fatorial de Plackett & Burman para Exoglucanase. 54 Tabela 8. Análise do efeito e de estatísticas dos componentes do fatorial de Plackett & Burman para FPAse. 54 Tabela 9. Análise da atividade específica das enzimas celulolíticas após processos de purificação parcial e taxas de recuperação 103 Tabela 10. Composição Química de bagaço de cana in natura e tratado com sulfito- alcalino 105 Tabela 11. Porcentagem de Conversão de Celulose em Glicose por tempo de hidrólise 107 14 RESUMO O complexo celulolítico é composto principalmente por endoglucanases, exoglucanases e β- glicosidases. As endoglucanases atuam clivando a celulose nas ligações internas da fibra, enquanto as exoglucanases hidrolisam as ligações externas. A necessidade de novas pesquisas de enzimas celulolíticas capazes de degradar eficientemente resíduos industriais como bagaço de cana-de-açúcar para diminuir o custo da hidrólise enzimática e favorecer a produção de etanol de segunda geração. Neste trabalho foram estudadas as melhores condições dos fungos filamentosos em agitação orbital, além de caracterizar os parâmetros bioquímicos como pH e temperatura ótimos e determinar o melhor produtor do complexo celulolítico e analisar a capacidade quanto à biodegradação de bagaço de cana-de-açúcar comparado com enzima comercial. Através da análise de atividade enzimática, o Aspergillus terreus mostrou-se o fungo com a maior produção nos diferentes meios de cultivo, atingindo a maior atividade enzimática no meio contendo CMC, apresentando 230,65 UI.mg proteína -1 de endoglucanase, 10,79 UI.mg proteína -1 de β-glicosidase, 57,79 UI.mg proteína -1 de exoglucanase e 68,60 UI.mg proteína -1 de atividade celulolítica total (FPAse). A análise realizada através do delineamento experimental de Plackett & Burman realizada no meio contendo glicose e celulose cristalina não mostrou influencia da composição do meio de cultura na produção das enzimas do complexo celulítico. O estudo de estabilidade ao pH revelou que o pH 3 influencia negativamente todas as enzimas do complexo celulolítico. A purificação parcial do complexo enzimático produzido por A. terreus em meio contendo CMC resultou em melhores resultados para a precipitação com acetona para β-glicosidase e exoglucanase e FPAse e que a enzima exoglucanase fica retida na membrana de diálise. O peso molecular do complexo enzimático purificado parcialmente produzido por A. terreus em meio contendo CMC é de 73 kDa. A conversão de celulose em glicose do complexo produzido por A. terreus purificado parcialmente foi inferior à enzima comercial sobre bagaço de cana pré-tratado com sulfito alcalino, porém, com conversão superior à enzima comercial no bagaço de cana in natura nos tempos de 4 e 8 horas de incubação. Palavras-chave: Fungos filamentosos. Enzimas. Enzimas celulolíticas. Aspergillus terréus. Bioconversão. Bagaço de cana. 15 ABSTRACT The cellulolytic complex is composed mainly of endoglucanases, exoglucanases and β- glycosidases. Endoglucanases act by cleaving the cellulose in the internal bonds of the fiber, while the exoglucanases hydrolyze the outer bonds. The need for new research on cellulolytic enzymes capable of efficiently degrading industrial residues such as sugarcane bagasse to reduce the cost of enzymatic hydrolysis and favor the production of second generation ethanol. In this work the best conditions of the filamentous fungi were studied in orbital agitation, besides characterizing the biochemical parameters as pH and temperature optimum and to determine the best producer of the cellulolítico complex and to analyze the capacity regarding the biodegradation of sugarcane bagasse compared to Commercial enzyme. Through enzymatic activity analysis, Aspergillus terreus showed the fungus with the largest output in the different culture media, achieving higher production in D medium, showing 230,65 65 μmol.min -1 .mg protein -1 for endoglucanase, 10788,34 nmol.min -1 .mg protein -1 for β-glycosidase, 57.79 μmol.min -1 .mg protein -1 for exoglucanase and 68,60 μmol.min -1 .mg protein -1 for Total Cellulolytic Activity – Filter Papel Activity (FPAse). The analysis made with the Plackett & Burman design for the medium content glucose and crystal cellulose showed that the medium composition not show an influence on the enzyme production of cellulolytic complex. The enzymatic stability of pH showed that pH 3 has a negative influence for all enzymatic complex. The endoglucanase and FPAse tend to 0% of residual activity after 24 hours of incubation in all studied pHs for all fungi. The partial purification showed best results with the acetone precipitation and, also, the exoglucanase enzyme was the only one retained on the dialysis membrane. The enzymatic complex produced by A. terreus in medium content CMC has a molecular weight of 73 kDa. The conversion of cellulose to glucose from the partially purified A. terreus complex was lower than the commercial enzyme on alkali sulfite pretreated sugarcane bagasse, but with conversion higher than the commercial enzyme in the cane bag in natura at times of 4 and 8 hours incubation. Keywords: Filamentous fungi. Enzymes. Cellulolytic enzymes. Aspergillus terreus, Bioconversion. Sugar cane bagasse. 16 1. INTRODUÇÃO A biotecnologia é a aplicação dos conceitos de engenharia e biologia através da utilização de organismos vivos no objetivo de criar novos produtos para modificar e melhorar a saúde e o ambiente. A aplicação das técnicas biotecnológicas está inserida em diversas áreas, tanto para a saúde, como para vacinas, transplantes e órgãos, quanto para a indústria, polímeros, produtos químicos e enzimas, e atualmente para a biorremediação e área ambiental (JUDICE, 2006). O histórico da biotecnologia data de milhares de anos através da observação dos processos que ocorriam naturalmente, como à seleção de sementes gerando a agricultura, domesticação de animais e processos fermentativos, como a panificação e fermentados alcoólicos, que pode ser classificada como biotecnologia antiga. A partir de meados de 1800, a biotecnologia passa a ser científica e não apenas observativa devido a inúmeras descobertas como a descoberta dos microrganismos e tranferência de genes hereditários dentre outras descobertas levaram ao uso dos microrganismos na forma como são encontrados na natureza na produção de produtos de interesse, caracterizando a biotecnologia clássica. Em meados de 1950, a ciência desvendou a molécula de DNA e sua conformação de dupla hélice, o conceito de operons e a produção do primeiro anticorpo monoclonal e a tranferência de DNA exógeno em diversos microrganismos, dessa forma, pode-se melhorar geneticamente os microrganismos que passaram a produzir compostos que naturalmente não faziam parte de seu genoma e aumentando a produção em larga escala de medicamentos, enzimas entre outros produtos, caracterizando a era moderna da biotecnologia, sendo hoje uma área de grande interesse no mercado internacional e nacional (VERMA et al, 2011; CLARK et al., 2002). Na área da saúde, a pesquisa e desenvolvimento biotecnológico levaram a uma inovação das tecnologias atuais, que facilitam a acessibilidade a medicamentos, diagnósticos e terapias, além de reduzir os custos com doenças infecciosas e crônicas, além da redução da 17 pobreza e possibilidade de crescimento econômico do país (SALICRUP & FEDORKOVÁ, 2006). A produção de enzimas através de processos biotecnológicos torna-se importante em diversas indústrias, como de alimentos, papel e têxtil, que possuem em suas matérias primas substâncias que são alvos de degradação enzimática, como as fibras de tecido e a celulose, entre outros. A escolha da utilização das enzimas nos processos citados é viável para um processo economicamente vantajoso, muitas vezes, ecologicamente favorável em relação ao uso de ácidos e bases fortes bem solventes orgânicos, que geram efluentes de difícil descarte (BEILEN & LI, 2002; MILLER JR & NAGARAJAN, 2000). As enzimas celulolíticas são um diferencial na produção de etanol de segunda geração pois há um benefício ambiental vantajoso comparado aos processos utilizando ácidos ou bases para a hidrólise de celulose, principalmente porque os processos enzimáticos são realizados em condições medianas de temperatura e pH. O uso de bactérias para a produção de celulases para hidrólise enzimática foi cogitado a principio com os gêneros Clostridium, Erwinia e Streptomyces, mas foi observado que a produção bacteriana era baixa quando comparada a fúngica (SUN & CHENG, 2002). Os fungos mais estudados para produção enzimática de celulases são dos gêneros, Trichoderma, Aspergillus, Schizophyllum e Penicillium, sendo o Trichoderma o mais extensivamente estudado. A celulose é o polímero que compõem majoritariamente a composição das plantas e no Brasil, uma das maiores culturas é a cana-de-açúcar que é utilizada na obtenção de açúcar e etanol. Contudo, ainda há a geração de subprodutos como a vinhaça e bagaço de cana, materiais ricos em lignina, hemicelulose e principalmente a celulose. Dentre as utilizações para os subprodutos, o bagaço de cana pode ser utilizado para gerar energia elétrica através da queima, contudo, o componente com maior capacidade calorífica é a lignina e não a celulose e hemicelulose, dessa forma, a separação dos compostos através de pré-tratamento pode melhorar a queima e ainda separar celulose e hemicelulose para outros processos 18 biotecnologicamente vantajosos. O pré-tratamento do material pode separar essas frações, separando parte da lignina insolúvel e da solúvel das demais porções, deixando assim, a celulose passível de degradação pela ação das enzimas celulolíticas, que é uma das aplicações para o bagaço de cana e um início para a produção de etanol de segunda geração (GALBE & ZACCHI, 2002; PANDEY et al, 2000). 2. REVISÃO DA LITERATURA 2.1. Enzimas Celulolíticas As enzimas são, em geral, proteínas e a sua atividade é dependente da integridade da sua conformação tridimensional nativa. Os primeiros relatos datam de procedimentos de Pasteur, que a principio foi chamado de fermentos. Só a partir de 1878, Wilhelm Kühne empregou o termo enzima. Elas pertencem a uma classe de moléculas que possuem o peso molecular bem variável e podem ou não depender de outra molécula para ter sua ação catalítica, o cofator. Íons inorgânicos, como por exemplo Fe +2 , Mg +2 , Mn +2 ou Zn +2 , uma molécula orgânica complexa ou uma molécula metalorgânica chamada de coenzima podem ser cofatores. A descoberta das enzimas modificou a visualização do metabolismo de todos os organismos. As enzimas são classificadas de acordo com as reações que catalisam e podem ser: oxidorredutases, transferases, hidrolases, liases, isomerases e ligases. (LEHNINGER & NELSON, 2011) As enzimas celulolíticas, classificadas como hidrolases, que na nomenclatura EC (Enzyme Commission Number) recebem o número 3, são capazes de catalisar a degradação de materiais celulósicos entre outros. As enzimas são utilizadas largamente em indústrias têxteis, detergentes, colorantes e tratamentos de efluentes, além da sua aplicação em industriais alimentícias e de alimentação animal, através da clivagem de compostos 19 celulolíticos que aumentam o conteúdo de carboidrato disponível e disponibilidade de diversos componentes (CHERRY & FIDANTSEF, 2003; BHAT, 2000) A degradação da celulose pela ação do complexo enzimático possui diversas aplicações, dentre elas podemos destacar duas, o processo de sacarificicação e a facilitação de extração de compostos de origem vegertal. A sacarificação consiste em converter a celulose em monômeros de glicose, de grande importância à indústria sucroalcooleira visando o aumento da produção de etanol, através do bagaço de cana de açúcar (HASUNUMA et al., 2012). A extração de compostos vegetais, por sua vez, utiliza a degradação da celulose como uma etapa do processo extrativo, decomponte a parede celular e componentes estruturais, facilitanto assim a extração de metabólitos primários e secundários das plantas, principalmente de cascas e raízes que necessitam de processos técnicas com aquecimento, o que aumenta o custo e a probabilidade de degradar os compostos de interesse. (CASTRO et al., 2010) O primeiro estudo em enzimas celulolíticas foi durante a Segunda Guerra Mundial através da verificação da deterioração de roupas e barracas nas trincheiras. O resultado foi uma linhagem de um fungo filamentoso, codificado como QM6a, que foi identificado como Trichoderma viride, pelo Dr. Elwyn T. Reese (CASTRO et al., 2010). Mais tarde, o Trichoderma viride passou a se denominado Trichoderma reesei em homenagem ao Dr. Reese pelos seus trabalhos. Este fungo é amplamente distribuído no mundo e produz colônias brancas, com filamentos de esporulação verdes ou amareladas (GAMS & BISSET, 1998). O complexo enzimático celulolítico possui um comportamento diferente das outras enzimas que avaliam a sua atividade através da correspondência com a quantidade de glicose liberada, ou seja, a atividade do complexo não é linear entre a taxa de glicose liberada e a ação enzimática (ESTERBAUER et al., 1991). 20 Dentre as enzimas com ação celulolíticas as principais são a endoglucanases, exoglucanases e β-glicosidases. As endoglucanases ou 1,4-β-D-glucana-4-glucanohidrolase (EC 3.2.1.4) são enzimas que atuam clivando as ligações β-1,4 nas regiões amorfas internas na fibra celulósica. Contudo, as endoglucanases podem degradar uma grande variedade de substratos como carboximetil celulose e hidroxietil celulose, que são derivados de celulose. Através da análise de peso molecular foram descobertos três grupos de endoglucanases, sendo o primeiro grupo o maior que compreende 10% das proteínas secretas, com massa molecular de 54kDa (SHOEMAKER et al., 1983; BHIKHABHAI et al., 1984; HENRISAT et al., 1985; NIKU-PÄAVOLA et al., 1985; GOYAL et al., 1991). O segundo grupo é mais comum em espécies e subespécies de Trichoderma, com 49,8kDa (SALOHEIMO et al., 1988; GOYAL et al., 1991). Entretanto, o terceiro grupo das endoglucanases possui os menores pesos moleculares, variando de 20 a 23,5kDa e são conhecidas por serem mais termolábeis que as demais, o que dificulta a sua caracterização (BELDMAN et al., 1985; GOYAL et al., 1991). As enzimas exoglucanases compreendem as enzimas denominadas de celobiohidrolases (1,4- β-D-Glucanohidrolase) com EC 3.2.1.9.1 e enzimas denominadas também de exoglucohidrolases (1,4- β-D-Glucano-glucanohidrolase) com EC 3.2.1.7.4. Estas enzimas tem como ação a clivagem de terminais redutores e não redutores da fibra celulósica, porém, diferentemente das endoglucanases, estas atuam em regiões cristalinas e em alguns oligossacarídeos. Trichoderma reesei , por exemplo, possui dois tipos de celobiohidrolases, denominadas de CBI e CBII , e esse grupo de enzimas compõem cerca de 60% das enzimas secretadas, o peso molecular varia de 42 a 72 kDa (BHIKHABHAI et al., 1984; GOYAL et al., 1991). As últimas enzimas do complexo enzimático são a celobiase e β-glicosidase (β-D- glicosideo-glucohidrolase) com EC 3.2.1.2.1. A celobiase hidrolise a celobiose, dissacarídio compostos por duas D-glicose enquanto a β-glicosidase tem capacidade de hidrolisar 21 oligossacarídeos, com dois ou mais monômeros de D-glicose. A clivagem da celulose por essas enzimas se dão nas ligações O-glicosídicas e a β-glicosidase sofre uma repressão de atividade pelo produto, glicose (KUBICEK et al., 1996; BELDMAN et al., 1985; GOYAL et al., 1991). Essas enzimas do complexo celulolítico atuam de forma sinérgica a sacarificar a celulose em D-glicose e, portanto, uma das formas para determinar a atividade das celulases é quantificar o açúcar formado pela hidrolise. (DASHTBAN et al, 2010). O esquema da atividade sinérgica do complexo enzimático pode ser visualizado na Figura 1. Figura 1. Esquema de degradação enzimática do complexo celulolítico (Adaptada de CASTRO, 2010) 2.2. Fungos Filamentosos Trichoderma reesei foi o primeiro fungo a ter confirmada presença e atividade de enzimas celulolíticas. Este fungo faz parte dos Deuteromicetos incompletos, capazes de crescer em meio inorgânico com apenas uma fonte de carbono, produz longas hifas septadas e sua reprodução é assexuada por conídiosporos em formato de garrafas ou cilíndricas. O micélio é de crescimento branco e algodonoso, passando a verde ou às vezes amarelado quando produz seus conídios. 22 Contudo as linhagens de Trichoderma são capazes de produzir uma variedade de enzimas de interesse biotecnológico como hemicelulases, xilanases, glucomananases, proteases, amilases, lactases entre outras. A primeira linhagem de T. reesei estudada foi a QM 6a que em meados dos anos 70 passou por diversos processos de mutações com o objetivo de aumentar a produção de enzimas celulolíticas, que resultaram em linhagens básicas como a QM 9414, RUT C30 e MCG77, sendo que estes dois últimos são capazes de produzir enzimas celulolíticas em meios de cultura contendo apenas lactose como única fonte de carbono. Através de novas mutações, chegamos às linhagens VTT-D, L-27, SVG17, CL847 que são produtoras de larga escala usadas até hoje (ESTERBAUER et al., 1991; RECZEY et al., 1996; VELKOVSKA et al., 1997). Os fungos do gênero Penicillium são normalmente encontrados em soo, pois possuem a característica de decomposição de matéria orgânica. Seus micélios são geralmente de coloração esverdeada, sua reprodução é assexual por conídios, em sua maioria. O gênero é famoso pela produção de metabólitos secundários que são utilizados como antibióticos e produtos farmacêuticos, sendo o mais famoso o Penicillium chrysogenum com a produção de penicilina, contudo, outras espécies de Penicillium também são importantes na indústria farmacêutica como por exemplo Penicillium citrinum na produção de estatinas. O gênero normalmente é saprofítico, contudo P. marneffei é um conhecido patógeno humano no sul da Ásia em imunodeficientes, esta espécie é uma das poucas do gênero capaz de crescer dimorficamente (ROYER et al., 2004; HOUBRAKEN et al., 2014). Na indústria de alimentos, são largamente utilizados na produção de queijos pela capacidade de degradar componentes do meio como gordura e proteínas do leite, dentre os mais famosos temos o P. camemberti e P. roqueforti. O gênero também é capaz de produzir uma variedade de enzimas como amilase, protease, xilanase e celulases (ROYER et al., 2004; VISAGIE et al., 2014; HOUBRAKEN et al., 2014) 23 Ambos Aspergillus e Penicillium pertencem família Aspergilaceae da ordem Eurotialis, porém diferentemente do gênero Penicillium os fungos do gênero Aspergillus são bastante conhecidos por causar danos à saúde humana pela produção de micotoxinas como a aflatoxina, patulina, ocratoxina, citrinina e fumonisina, além de causar infecções das vias aéreas, sendo o mais conhecido A. fumigatus (HOUBRAKEN et al., 2014; SAMSON et al., 2014). Contudo, existem espécies do gênero Aspergillus que são de uso biotecnológico como o A. oryzae e A. sojae utilizados na Ásia para fermentações de alimentos a fim de produzir molho de soja, misô, saquê e diversos outros produtos, além de uma linhagem de A. terreus que produz lovastatina, importante redutor de colesterol utilizado na indústria farmacêutica (HOUBRAKEN et al., 2014; SAMSON et al., 2014). Outros exemplos de produtos de interesse biotecnológico produzidos por Aspergillus é o ácido cítrico (A. niger), ácido glucorônico (A. niger), ácido itacônico (A. terreus) e diversas enzimas como proteases, amilases, lípases pelo Aspergillus oryzae (HOUBRAKEN et al., 2014; SAMSON et al., 2014). 2.3. Biodegradação de Bagaço de Cana-de-açúcar O bagaço-de-cana requer um pré-tratamento do material lignocelulósico, necessário para facilitar a acessibilidade do complexo de celulases, aumentando a conversão a D-glicose. Vários pré-tratamentos foram analisados e os mais clássicos são moagem, explosões a vapor (steam explosion), explosão das fibras com amônia (Ammonia fiber explosion – AFEX), água quente, hidrólise alcalina e hidrólise ácida (GALBE & ZACCHI, 2002). Entretanto, grandes partes destes processos clássicos dependem de energia excessiva e geram efluentes que devem ser tratados para serem descartados ou podem servir como base a novos processos biotecnológicos (TAHERZADEH & KARIMI, 2008). A lignina é uma macromolécila produzida por plantas terrestres apenas com alta estabilidade química, está depositado nas 24 paredes celulares que recobrem a célula fornecendo rigidez, relativa impermeabilidade e resistência ao vegetal, tanto a impacto mecânico e torção, quanto à degradação por microrganismos, como bactérias e fungos. A resistência à degradação microbiana é devido à baixa acessibilidade da lignina aos organismos por ser uma macromolécula sem padrão de repetição conhecido, ou seja, os constituintes são randômicos. A polimerização da lignina é iniciada pela dehidrogenação de três precursores, álcool trans-coniferílico, álcool trans- sinapílico e álcool p-trans-cumárico, além de anéis aromáticos com cadeiras laterais e grupos hidroxila e metoxila ligados à molécula por ligações éter e carbono-carbono e um modelo da estrutura da lignina pode ser visualizado na figura 2 (MARCHAND et al, 2005; THEVENOT et al, 2010). Enquanto a celulose é composta apenas por monômeros de glicose, a hemicelulose é um termo utilizado para denominar polissacarídeos de grupos distintos compostos por pentosos, como xilose e arabinose, e hexoses, como glicose, manose e galactose, além de ácidos urônicos e grupos acetila com reatividade maior do que a celulose, altamente ramificada e apenas amorfa (FENGEL & WEGENER, 1989; LYND, 1996). Os pré-tratamentos do bagaço de cana-de-açúcar são utilizados para facilitar o acesso da celulose para processos biotecnológicos e eles podem ser classificiados como físicos, químicos e biológicos. O pré-tratamento deve levar em consideração fatores chave para ser efetivo como não degradar os açúcares, produção mínima de compostos tóxicos, não produzir resíduos sólidos, obter alta concentração de açúcar, ser compatível com fermentação para produção de etanol, possibilitar a recuperação da lignina e utilizar o menor aquicimento e energia (ANWAR et al, 2014; KARP et al, 2013; ALVIRA et al, 2010). O pré-tratamento mecânico pode-se salientar a trituração mecânica que consiste em reduzir o tamanho do bagaço de cana-de-açúcar a fim de aumentar a superfície, contudo, é um processo de depende de grandes quantidades de energia para o processamento do bagaço 25 e normalmente é associado a outros métodos de pré-tratamento, pois não fornecer quantidades significativas de açúcar liberado (ANWAR et al, 2014; KARP et al, 2013; ALVIRA et al, 2010). Figura 2. Modelo de estrutura de lignina presente nas coníferas (BROWNING, 1963). O pré-tratamento ácido utiliza comumente o ácido sulfúrico, mas também o clorídrico e nítrico, combinado com uma temperatura moderada, podendo ser concentrado ou diluído, variando de 100 a 150°C, que degrada a hemicelulose solubilizando-a totalmente enquanto que a celulose e lignina permanecem praticamente inalteradas no material sólido. A fração 26 líquida possui componentes da degradação da hemicelulose e é rica em açúcares e produtos da degradação dos polissacarídeos e monômeros, como oligopolímeros, furfural e hidroximetilfurfural, sendo esses dois últimos fortes inibidores de crescimento microbiano. Alternativas aos ácidos comumente usados são os ácidos orgânicos como o ácido fumárico e malico que tem seu efeito comparado com o ácido sulfúrico em quesito de rendimento da hidrólise e produzem menor quantidade de hidroximetilfurfural e furfural (CARDONA et al, 2010; SOCCOL et al, 2010). O pré-tratamento alcalino degrada a lignina em um álcali solúvel, tornando a celulose e hemicelulose disponíveis à degradação enzimática, dentre as bases utilizadas tem-se o hidróxido de sódio, potássio, cálcio e amônio, sendo que o hidróxido de sódio aumenta a surperficie da celulose e diminui também a cristalização que causa a quebra da lignina. Este processo é amplamente utilizado na obtenção de polpa de celulose e de derivados de celulose, que necessita de grandes quantidades de álcali e de elevadas temperaturas. Apesar de utilizar um tratamento térmico geralmente no binômio de 170°C/ 2 horas como ótimo para a degradação de hemicelulose, que é superior a temperatura de 150°C e produz menor degradação dos monômeros que a temperatura de 190°C, o processo pode ser realizado a temperatura ambiente o que pode levar até dias mas possui efeito positivo na menor degradação de açúcares. Contudo, este processo apenas extrai a hemicelulose e há presença de polímeros de cadeira longa, assim o tratamento térmico é utilizado combinado a outros tratamentos (CARDONA et al, 2010; SOCCOL et al, 2010). Há outros pré-tratamentos que são utilizados como a explosão a vapor (steam explosion) que combina o método físico e químico, no qual o bagaço de cana-de-açúcar é pressurisado com vapor contendo sulfito alcalino e subtamente despressurizado. Neste processo, a água permeada no interior do bagaço de cana-de-açúcar na forma de vapor quando despressurizada para ao estado liquido rompendo as células e parede celulares e combinado com o sulfito 27 alcalino há a hidrosolubilização da hemicelulose (ANWAR et al, 2014; KARP et al, 2013; ALVIRA et al, 2010). O pré-tratamento biológico consiste no uso de microrganismo para degradar os componentes da biomassa. Dentre esses microrganismos os Basidiomycetes são os fungos mais capazes de degradar materiais lignocelulósicos pela presença de enzimas específicas para oxidar a lignina. Outras opções cogitadas e utilizadas após um tratamento de retirada de lignina são os fungos Ascomycetes como os gêneros Penicillium, Aspergillus e Trichoderma (CARDONA et al, 2010; SOCCOL et al, 2010). Comparando os métodos de pré-tratamento pode-se observar que o pré-tratamento biológico é capaz lignina e hemicelulose, possui baixo consumo de energia contudo a taxa de hidrólise é baixa. O pré-tratamento físico que diminui as a cristalinidade da celulose, mas necessita de muita potencia e consumo de energia. O pré-tratamento com ácidos pode ser dividido em concentrado e diluído. O ácido concentrado tem maior rendimento de glicose, pode ser feito em temperatura ambiente, mas como desvantagem há o alto custo do ácido e que necessita de recuperação, problema de corrosão do reator e a formação de inibidores. O pré-tratamento com ácido diluído possui menor problema de corrosão do que o ácido concentrado e forma menos inbidores porém há geração de produtos de degradação e menor concentração de açúcar no final. Por fim, o pré-tratamento alcalino possui um alto aumento da superfície acessível, altera eficientemente a estrutura da lignina e pouca geração de compostos tóxicos, todavia possui baixa solubilização da hemicelulose (ANWAR et al, 2014; KARP et al, 2013; ALVIRA et al, 2010). A produção de enzimas com capacidade celulolítica é de grande importância, contudo o custo de produção do pull de enzimas tem um custo elevado e significativo para a utilização das mesmas, tornando baixa a viabilidade econômica dos processos biodegradativos. Uma forma de contornar o alto custo das enzimas comerciais é a produção por microrganismos 28 com custos mais baixos de produção, como os fungos filamentosos, através da seleção de melhores produtores, utilizando resíduos e matérias primas brutas e melhorias de técnicas de cultivos que aumentem a produção sem aumentar o custo (PIROTA et al, 2014; DELABONA et al, 2012; JOUDIER et al, 2012). Dessa forma, após a etapa de pré-tratamento do bagaço de cana-de-açúcar, é necessário a etapa de produção das enzimas celulolíticas ou o uso das enzimas comercial, a uso das enzimas no processo de hidrólise enzimática do bagaço de cana-de-açúcar e por fim, o possível uso dos monômeros de glicose resultantes em fermentações etanólicas, sendo este ultimo passo ainda em processos de pesquisa para aplicação em larga escala. A etapa limitante é a produção de enzimas celulolíticas com alto poder de hidrólise a baixo custo além da necessidade de concentrar a glicose gerada através da biodegradação a uma porcentagem que favoreça a inoculação de levedura, como Sacharomyces cerevisae, para a fermentação alcoólica (RABELO et al, 2014; MESA et al, 2010). 3. OBJETIVOS O objetivo geral do projeto foi avaliar cepas de fungos filamentosos quanto à sua produção e atividade de complexos enzimáticos celulolíticos. Faz parte do objetivo a aplicação das enzimas visando à produção de etanol de segunda geração. 3.1. Objetivos Específicos  Determinação de melhores meios de cultivo para produção de enzimas celulolíticas.  Determinação de parâmetros bioquímicos enzimáticos.  Seleção do melhor meio de cultura e melhor fungo produtor de enzimas celulolíticas  Purificação parcial das enzimas do melhor fungo produtor  Análise eletroforética das enzimas 29  Aplicação das enzimas parcialmente purificadas em biodegradação de bagaço de cana-de-açúcar in natura e pré-tratado com sulfito-alcalino 4. MATERIAIS E MÉTODOS 4.1. Materiais  Acetona PA – Synth  Ácido Cítrico – Neon  Ácido Dinitrossalicílico (DNS) - Vetec  Agar Bacteriológico - BD  Carboximetil Celulose – Synth  Celulose Microcristalina Avicell®  Celulose Microcristalina USP – Synth  Citrato de Sódio - Neon  Cloreto de Cálcio – Vetec  Cloreto de Cobalto – Synth  Cloreto de Potássio – JT Baker  Corante Congo Red – Neon  Corn Streep Solids - Sigma  Erlenmeyers  Etanol PA – Synth  Extrato de Levedura – Himeda  Extrato de Malte Agar – Acumedia  Fenol - Synth  Filtro de Papel Whatman #1 30  Fosfato de Potássio Dibásico Anidro PA - Qhemis  Glicose – Synth  Hidróxido de Sódio – Synth  Metabissulfito de Sódio - Synth  Peptona - Merck  Potato Dextrose Ágar – Synth  Potato Dextrose Broth - Acumedia  p-Nitrofenil-β-D-glicopiranosídeo – Sigma  Pipetadores volumétricos  Ponteiras de 5000μL, 1000 μL e 200μL  Potato Dextrose Agar (PDA) – Merck  Reagente de Bradford - Sigma  Sulfato de Amônio - Synth  Sulfato Férrico - Synth  Sulfato de Magnésio – Sigma  Sulfato de Manganês – Sigma  Sulfato de Zingo – Synth  Tartarato de Sódio e Potássio - Synth  Tris-HCl – JT Baker  Ureia – GE Healthcare  YNB (Base Nitrogenada de Levedura) - Sigma 4.2. Equipamentos  Amersham ECL Gel Box – GE HEALTHCARE 31  Autoclave Vertical FABBE 103  Autoclave Vertical PRISMATEC C5  Balança Analítica – Metter Toledo AB204  Balança Semi Analítica  Banho de Aquecimento FANEM 1101  Banho de Aquecimento tipo DUBNOFF-QUIMIS Q226M1  Banho de Fervura – FISATOM 550  Bomba de Vácuo – Prismatec 132  Câmara de Fluxo Laminar – Veco (VLFS 12)  Centrífuga Refrigerada – Eppendorf 5804R  Espectrofotômetro UV-Visível – Bel Photonic (UV-M51)  Estufa Microrganismo – FABRE 116  Estufa de Secagem e Esterilização – Odontobras  Incubadora Refrigerada com Agitação – Tecnal TE422  Incubadora Refrigerada com Agitação – SOLAB Sl222  Microscópio Óptico – Olympus CX41  Microscópio Óptico – ZEISS Prismo Star  Ultrapurificador de água MiliQ – Millipore (Direct Q3) 4.3. Métodos 4.3.1. Microrganismos e Manutenção O material utilizado foram cepas fúngicas isoladas pela Prof.ª Dra. Suraia Said da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto (FCFRP-USP) e Prof.ª Dra. Rosemeire Cristina Linhari Rodrigues Pietro e que atualmente fazem parte do cepário do 32 Laboratório BiotecFar – FCF/UNESP. As cepas avaliadas foram: Penicillium simplicissimum (CCT 7686), Aspergillus niger (CCT 7687), Aspergillus terreus (CCT 7693), Aspergillus sp (CCT 7697), Trichoderma reesei QM9414 e Trichoderma reesei RUTC30. A manutenção das cepas fúngicas foi realizada com meio PDA (Potato Dextrose Agar – Ágar Batata Glicose) 15 dias com repiques periódicos. 4.3.2. Meios de Cultura 4.3.2.1. Meios de cultura para a metodologia de coloração por Vermelho Congo O meio de cultura para esta metodologia é composto por sais e apenas o CMC como fonte de carbono. (NaNO3: 3,0 g.L -1 ; KH2PO4: 1,0 g.L -1 ; MgSO 4 : 0,5 g.L -1 ; KCl :0,5 g.L -1 ; FeSO4.7H2O: 10,0 m g.L -1 ; CMC: 10,0 g.L -1 ; ágar: 20,0 g.L -1 ). Os inóculos dos microrganismos são executados através de agulhas na placa de Petri e as mesmas serão incubadas a 28ºC por 4 dias. Após o período, uma solução de Vermelho Congo 2,5 g.L-1 em tampão Tris-HCl (0,1 Mol.L-1, pH 8,0) durante 30 minutos. A solução de Vermelho Congo é descartada após o período e então a placa é lavada com solução de 0,5 Mol.L-1 em Tampão Tris-HCl (0,1 Mol.L-1, pH 8,0). A degradação do CMC presente no meio é avaliada através do halo claro formado. A metodologia foi adaptada de Ruegger e Tauk-Tornisielo (2003). 4.3.2.2 Meios de cultura para produção de celulases por fungos filamentosos Os meios de cultura utilizados para o cultivo de todos os fungos filamentosos citados estão listados na Tabela 1. O inóculo do meio de produção foi de 1,0 x 10 7 esporos.mL -1 contados em câmara de Newbauer, pois a literatura utiliza quantidades de 1,0 x 10 6 a 1,0 x 10 8 esporos. mL -1 . 33 Tabela 1. Composição dos diferentes meios de cultura utilizados para produção das enzimas celulolíticas para os fungos filamentosos Composição Meio A Meio B Meio C Meio D Celulose (g.L -1 ) 10,0 - 7,5 - Extrato de Levedura (g.L -1 ) 10,0 - 0,3 - Glicose (g.L -1 ) 10,0 10,0 - 10,0 (NH4)2SO4 (g.L -1 ) 1,4 1,4 1,4 - KH2PO4 (g.L -1 ) 2,0 2,0 2,0 4,0 CaCl2.2H2O (g.L -1 ) 0,4 0,5 0,3 - MgSO4.7H2O (g.L -1 ) 0,3 0,3 0,3 - FeSO4.7H2O (mg.L -1 ) 5,0 5,0 5,0 - CoCl2. .6H2O (mg.L -1 ) 3,7 - 20,0 - MnSO4.H2O (mg.L -1 ) 1,6 1,6 1,6 - ZnSO4.7H2O (mg.L -1 ) 1,4 1,4 1,4 - Corn Steep Solids (g.L -1 ) - 5,1 - - Peptona (g.L -1 ) - - 0,8 - Ureia (g.L -1 ) - - 3,0 - YNB (g.L -1 ) - - - 6,7 CMC sódica (g.L -1 ) - - - 20 Meios de cultura baseados em AHAMED e VERMETTE (2009). 4.3.3. Produção Enzimática em Agitador Orbital A produção em agitador orbital consiste em Erlenmeyers contendo meio de cultura contido na Tabela 1 e os fungos filamentosos do item 4.3. Os cultivos foram realizados nos agitadores orbitais, a 30°C e 150 rpm por diferentes dias segundo a curva de crescimento realizada para cada fungo em cada meio. 4.3.4. Curva de produção Enzimática em Diferentes Meios A fim de avaliar a máxima produção de cada fungo nos meios de cultura foram realizadas curvas de crescimento. Desta forma, foi possível observar quais os fungos se destacaram na produção de enzimas celulolíticas em função do tempo e dos meios, na tentativa de aperfeiçoar e aumentar a produção, o período de tempo foi de quinze dias. 34 4.3.5. Avaliação da Influência da Composição do Meio de Cultura na Produção Enzimática A fim de avaliar a influência da composição do meio de cultura A na atividade enzimática foi utilizado o modelo fatorial de Plackett & Burman, baseado na matriz de 16 experimentos, variando os onze componentes do meio de cultura em níveis padrões do meio A e inferiores. Na Tabela 2 está listada a proposta de modelo com os componentes das variáveis e os valores de 1 e -1 e na Tabela 3 a disposição das variáveis na matriz. Tabela 2. Composição do Meio A e as variáveis em Plackett & Burman Componente Variável 1 -1 Celulose (g/L) x1 10,0 5,0 Ext. Levedura (g/L) x2 10,0 5,0 Glicose (g/L) x3 10,0 5,0 (NH4)2SO4 (g/L) x4 1,4 0,0 KH2PO4 (g/L) x5 2,0 0,0 CaCl2.H2O (g/L) x6 0,4 0,0 MgSO4.7H2O (g/L) x7 0,3 0,0 FeSO4.7H2O (mg/L) x8 5,0 0,0 CoCl2.6H2O (mg/L) x9 3,7 0,0 MnSO4.H2O (mg/L) x10 1,6 0,0 ZnSO4.7H2O (mg/L) x11 1,4 0,0 A variável x12 e os parâmetros V11, V12, V13 foram utilizados para o calculo T calculado. Para cada ensaio, de 1 a 16, foram realizadas as dosagens de β-Glicosidase, Endoglucanase, Exoglucanase, FPAse e Proteínas Totais no extrato enzimático bruto de cada ensaio para o cálculo da atividade específica para cada enzima. Para os cálculos, uma coluna com todos os sinais positivos é adicionada, chamada de coluna identidade antes da coluna da variável x1 para determinação da media global. Uma linha de Soma + e uma linha de Soma –, foram utilizadas para checar a soma dos valores positivos e negativos que devem ser iguais à soma da coluna identidade. 35 Tabela 3. Disposição da combinação fatorial no modelo de Plackett & Burman de 16 ensaios Ensaios x1 x2 x3 x4 x5 x6 x7 x8 x9 x10 x11 x12 VI1 VI2 VI3 1 1 -1 -1 -1 1 -1 -1 1 1 -1 1 -1 1 1 1 2 1 1 -1 -1 -1 1 -1 -1 1 1 -1 1 -1 1 1 3 1 1 1 -1 -1 -1 1 -1 -1 1 1 -1 1 -1 1 4 1 1 1 1 -1 -1 -1 1 -1 -1 1 1 -1 1 -1 5 -1 1 1 1 1 -1 -1 -1 1 -1 -1 1 1 -1 1 6 1 -1 1 1 1 1 -1 -1 -1 1 -1 -1 1 1 -1 7 -1 1 -1 1 1 1 1 -1 -1 -1 1 -1 -1 1 1 8 1 -1 1 -1 1 1 1 1 -1 -1 -1 1 -1 -1 1 9 1 1 -1 1 -1 1 1 1 1 -1 -1 -1 1 -1 -1 10 -1 1 1 -1 1 -1 1 1 1 1 -1 -1 -1 1 -1 11 -1 -1 1 1 -1 1 -1 1 1 1 1 -1 -1 -1 1 12 1 -1 -1 1 1 -1 1 -1 1 1 1 1 -1 -1 -1 13 -1 1 -1 -1 1 1 -1 1 -1 1 1 1 1 -1 -1 14 -1 -1 1 -1 -1 1 1 -1 1 -1 1 1 1 1 -1 15 -1 -1 -1 1 -1 -1 1 1 -1 1 -1 1 1 1 1 16 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 Foi calculada a diferença entre a Soma + e Soma- e através desta diferença realizou-se o cálculo do efeito das variáveis. O efeito das variáveis é a divisão entre a diferença da Soma+ e Soma – pelo número de ensaio na condição + ou -. O delineamento de Plackett & Burman utilizado foi de 16 ensaios, portanto, as condições + e – estavam em número idêntico, 8. O valor de t é calculado pela razão do efeito pelo erro padrão, sendo o erro padrão calculado através da equação 1: Onde ep(ef) é uma equação a parte, calculada pela equação 2: No qual o calculo de ep(ef) é uma somatória das variáveis não utilizadas através da equação 3: Em que: Equação 3 Equação 1 Equação 2 36 U = Somatória da multiplicação entre as colunas inertes e a atividade enzimática obtida no ensaio, dividida pelo número de ensaios realizados. VI = variáveis inertes (Colunas da matriz PB não utilizadas como variáveis do estudo) Y = Valores da coluna de atividade enzimática correspondente a cada ensaio. q = número de variáveis inertes n = número de ensaios 4.3.6. Recuperação das Enzimas Produzidas (EEB – Extrato Enzimático Bruto) Após a incubação, o extrato contendo o meio de cultura e a biomassa foi filtrado a vácuo utilizando funil de Buchner contendo papel de filtro. O filtrado foi armazenado a -20ºC para análises. 4.3.7. Determinação de Atividade Enzimática 4.3.7.1. Determinação de Celulase Total (FPAse) A atividade enzimática de FPAse (Filter Papel Activity ou Atividade de Papel de Filtro) foi determinada com tiras de aproximadamente 1,0 x 8,0 cm (70 mg) de papel de filtro Whatman #1, recortadas e enroladas, foram adicionadas a tubos de ensaio pré-incubados a 50° C, contendo 1,0 mL de tampão citrato de sódio (50 mmol/L, pH 5,0) e 1,0 mL do EEB. A hidrólise foi interrompida após 1h de incubação com a adição de 2,0 mL de DNS (Ácido dinitrosalicílico) e alíquotas de 1 ou 2 mL foram coletadas para a análise em espectrofotômetro a 540nm (WOOD & BHAT, 1988; MILLER, 1959). A concentração de açúcar redutor total foi determinada através de uma curva de calibração utilizando D-glicose como padrão em diferentes concentrações conhecidas. A atividade, calculada pela equação 4 descrita abaixo, onde ε é a absortividade molar retirada da 37 curva de calibração, cuja unidade é (µmol. mL -1 ) -1 , ou seja, a quantidade de μmol de glicose por mL de água absorve em 540 nm. Sendo a equação 4: Uma unidade de atividade enzimática foi definida como a quantidade mínima de enzima necessária para liberar um µmol de glicose por minuto, por mL de reação, considerada com o UI (Unidades Internacionais). 4.3.7.2. Determinação de atividade de Endoglucanase A atividade da endoglucanase foi determinada através de soluções de carboximetil celulose (CMC) (MANDELS et al., 1976). Dessa forma alíquotas das amostras de 1,0 mL de EEB serão incubadas a 50ºC e a reação se dará pela adição de 0,5 mL de uma solução de CMC de viscosidade média (2% em tampão citrato de sódio 50 mmol/L, pH 5,0). A reação foi interrompida após 30 minutos pela adição de 2,0mL da solução de DNS como descrito anteriormente. Para a concentração de glicose convertida foi determinada através de curva de calibração com padrão de D-glicose. (MILLER, 1959). A concentração de açúcar redutor total foi determinada da mesma forma apresentada para a atividade de Celulase Total. Uma unidade de atividade enzimática foi definida como a quantidade mínima de enzima necessária para liberar um µmol de glicose por minuto, por mL de reação. 4.3.7.3. Determinação de atividade de Exoglucanase Utilizou-se a metodologia de Deshpande ET AL (1984) incubando 250 µL do EEB com 500 µL de solução 1% (p/v) de celulose microcristalina tipo 50 Avicell® , em solução tampão citrato de sódio (50 mmol/L, pH 5,0) a 50ºC durante 2 horas. Para paralisar a reação, Equação 4 38 os tubos foram adicionados de 2 mL de DNS e colocados em água fervente por 5 minutos, e após resfriamento, as amostras foram centrifugadas por 30 minutos à 12000g. A concentração de açúcar foi realizada mediante a adição de DNS nas mesmas condições para Celulase total e a mesma equação utilizada (MILLER, 1959). A concentração de açúcar redutor total foi determinada da mesma forma apresentada para a atividade de Celulase Total. Uma unidade de atividade enzimática foi definida como a quantidade mínima de enzima necessária para liberar um µmol de glicose por minuto, por mL de reação. 4.3.7.4. Determinação de atividade de β-glicosidase Para determinar a atividade de β-glicosidase, segundo Wood & Bhat (1988) adicionou- se 0,25mL de extrato enzimático bruto (EEB) a tubos de ensaio, juntamente com 0,5 mL de uma solução de tampão citrato (50 mmol, pH 5,0). O meio foi incubado a 42ºC, em seguida adicionou-se 0,25 mL da solução 4,0 mmol/L de p-nitrofenil-β-D-glicopiranosídeo em tampão citrato. Após 10 minutos, adicionou-se 1,0 mL de solução 1,0 mol/L carbonato de sódio, para interromper a reação por deslocar o pH para o meio básico, enzimas não atuam neste pH e p- nitrofenol possui coloração amarela. A concentração de glicose produzida pela atividade enzimática foi determinada indiretamente pela medida da concentração de p-nitrofenol no meio reacional, por leitura em espectrofotômetro a 410nm. A curva de calibração foi construída com soluções padrões de p-nitrofenol. A atividade, calculada pela equação 5, onde ε é a absortividade molar retirada da curva de calibração, cuja unidade é (nmol. mL -1 ) -1 , ou seja, a quantidade de nmol de glicose por mL de água absorve em 410 nm, no qual ε utilizado foi de 0,079. Sendo a equação 5: Equação 5 39 Uma unidade foi definida como sendo a quantidade de enzima necessária para liberar um μmol de ρ-nitrofenol por mL, por minuto de reação considerada com o UI (Unidades Internacionais). 4.3.8. Parâmetros Bioquímicos Enzimáticos Os fungos cuja atividade foram diferenciadas ao analisar as curvas de crescimento foram incubados e então avaliados quanto a sua estabilidade frente ao pH e Temperatura. A atividade residual foi obtida através da equação 6, na qual AE contato é a Atividade Enzimática calculada após contato com o pH e temperatura no determinado tempo e AE sem contato é a Atividade Enzimática calculada sem o contato com o pH e temperatura. Sendo a equação 6: 4.3.8.1. Estabilidade quanto à temperatura Após a recuperação do EEB as enzimas foram avaliadas em relação à estabilidade de Endoglucanase, Exoglucanase, FPAse e β-Glicosidase em diferentes temperaturas, sendo estas de 30, 40, 50, 60, 70 e 80°C por períodos de tempo de 0; 0,17; 0,5; 1, 2, 3, 4 e 5 horas de incubação. 4.3.8.2. Estabilidade quanto ao pH Após a recuperação do EEB as enzimas foram avaliadas em relação à estabilidade de Endoglucanase, Exoglucanase, FPAse e β-Glicosidase em diferentes pHs, sendo estes de 3, 4, 5, 6, 7 e 8 por períodos de tempo de 0, 1, 2, 3, 4, 5 e 24 horas de incubação. Equação 6 40 4.3.9. Determinação de Proteínas A determinação de proteínas totais foi feita com base no método de Bradford (1976) que utiliza uma curva padrão de Soro Albumina Bovina. Foi realizado através da adição de uma alíquota do extrato enzimático bruto de 200μL com 200 μL do reagente de Bradford e completado para 1mL com Água MilliQ. 4.3.10. Perfil de Atividade Enzimática por tempo de incubação A atividade das enzimas celulolítcas foi avaliada conforme o tempo para determinar o seu perfil de atividade. A β-Glicosidase foi avaliada no período de 0; 2,5; 5; 10; 20; 25; 30; a endoglucanase no período de 0, 10, 15, 20, 25, 30, 45, 60; a exoglucanase no período de 0, 10, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180; e por fim, a FPAse no período 0, 10, 20, 30, 50, 60, 70, 90, 120. 4.3.11. Purificação Parcial das Enzimas 4.3.11.1. Precipitação por Sulfato de Amônio e Diálise As proteínas do meio de cultura contidas no extrato enzimático bruto foram precipitadas com a adição de sulfato de amônio na concentração final de 75%. O sulfato de amônio foi adicionado aos poucos sob agitação e em banho de gelo. Após, a mistura foi centrifugada por 20 minutos a 7000 rpm e o sobrenadante descartado. O precipitado obtido a partir da precipitação por sulfato de amônio foi resuspenso em tampão citrato de sódio 50 mM pH 5,0 e dialisado em sacos de diálise de celulose para retirar o sulfato de amônio. Como as enzimas são celulolíticas, a diálise foi realizada através de um fracionamento de duas horas, com troca da água e da membrana de diálise, mantida em temperatura variando de 4 a 10°C. Para recuperar todas as enzimas que poderiam estar aderidas as membranas, as mesmasforam maceradas em tampão citrato de sódio 50 mM e analisadas quanto às atividades enzimáticas. 41 4.3.11.2. Precipitação por Etanol As enzimas produzidas e contidas no extrato enzimático bruto foram precipitadas através da adição de etanol gelado na proporção 1:3, ou seja, uma parte de extrato enzimático para três partes de etanol gelado. Após a agitação em vortex e repouso por 30 minutos, a mistura foi centrifugada por 20 minutos a 700 rpm e o sobrenadante descartado. O pellet de proteína foi resuspendido no menor volume de tampão citrato de sódio 50 mM pH 5,0 e posteriormente analisado quando à atividade enzimática. 4.3.11.3. Precipitação por Acetona As enzimas produzidas e contidas no extrato enzimático bruto foram precipitadas através da adição de acetona gelada na proporção 1:4, ou seja, uma parte de extrato enzimático para quatro partes de acetona gelado. Após a agitação em vortex e repouso por 60 minutos, e foram mantidos no freezer a -20°C por 60 minutos. A mistura foi centrifugada por 20 minutos a 7000 rpm, o sobrenadante descartado e a acetona evaporada a temperatura ambiente em capela. O pellet de proteína foi resuspendido no menor volume de tampão citrato de sódio 50 mM pH 5,0 e posteriormente analisado quando à atividade enzimática. 4.3.12. Eletroforese A partir da enzima parcialmente purificada pelo melhor método, uma análise eletroforética foi realizada em gel desnaturando (com SDS – Dodesilsulfato de sódio). O tampão de corrida foi preparado diluindo o tampão 10x da Amersham ECL Gel para a concentração de 1x e este tampão foi adicionado a cada tanque do Amersham ECL Gel Box. O gel, obtido já preparado pela Amersham foi lavado com água MilliQ e adicionado no ECL Gel Box com o lado dos poços junto ao anodo, foi realizado uma pré-corrida por 12 minutos a 160V. 42 Adicionou-se 6 mL de tampão de corrida no recipiente dos poços e as amostras foram preparadas adicionando o tampão de amostra: glicerol (1,0 mL), solução tampão 1x (0,5 mL), azul de bromofenol (0,5 mg) e água MilliQ para 5,0 mL de volume final. A aplicação das amostras foi realizada em cada poço de forma a não exceder 35μL em cada poço e aos poços não utilizados foram adicionados o tampão de corrida para não ocorrer ressecamento do gel sendo então foi realizada a corrida em 160V. Ao término da corrida, as porções dos poços e da parte inferior, cerca de 2 cm, foram removidos e então foi realizada a coloração com Comassie Blue constituído de Comassie Blue (0,3% v/v), metanol (50% v/v), ácido acético (10% v/v) e água qsp 1L e para visualização das bandas foi utilizado uma solução descolorante constituída de metanol (30% v/v), ácido acético (7% v/v) e água MilliQ qsp 1L. 4.3.13. Pré-Tratamento do Bagaço de Cana O bagaço de cana foi cedido gentilmente pelo Prof. Dr. Fernando Masarin do Departamento de Bioprocessos e Biotecnologia, que utilizou o processo alcalino como pré- tratamento. Aproximadamente 50g de bagaço (dados em base seca) foram pesados, em Becker de polipropileno de 1L e posteriormente adicionado em um reator de 1,5 L. Foram adicionados 250 mL de uma solução de NaOH 1% (massa/volume) e 250 mL de uma solução de sulfito alcalino (Na2SO4) a 2% (m/v), onde nesta condição a relação mássica é de 5g de NaOH e 10g de Na2SO4 para cada 100g de bagaço de cana em base seca, com consistência igual a 10%. Os reatores foram fechados e com a temperatura selecionada de 140°C e agitação de 4 rpm. Quando a temperatura do reator atingiu os 140°C desejados, o tempo de 30 minutos foi cronometrado e após esse tempo, o equipamento foi desligado. As válvulas foram abertas para saída de vapor até o resfriamento completo do reator. Após, o material foi lavado com água 43 destilada e o processo de lavagem foi interrompido quando o pH da água de lavagem atingiu a neutralidade. O material foi recolhido e seco em estufa a 40°C por 24 horas. 4.3.14. Análise de composição de Bagaço de Cana in natura e pré-tratado pós hidrólise enzimática Uma análise prévia do bagaço de cana in natura e pré-tratado foi realizada pelo Prof. Dr. Fernando Masarin do Departamento de Bioprocessos e Biotecnologia e pelo aluno de mestrado Fernando Paz do Programa de Alimentos e Nutrição, afim de analisar a composição de carboidratos e lignina. Porções de 300mg de base seca das amostras foram tratadas com 3mL de ácido sulfúrico 72% (massa/massa) por 1 hora a 30°C. Em seguida, o conteúdo dos tubos de ensaio foi transferido para frascos de erlenmeyer de 250 mL com adição de 79 mL de água destilada para lavagem do tubo. A mistura foi autoclavada por 1 hora, 121 °C, resfriada e filtrada em filtros de vidro. O material retido foi lavado com duas porções de 5 mL de água e seco em estufa, 60°C por 12 horas, posteriormente, o material foi seco a 105°C por 2 horas, resfriado em dessecador munido de sílica e pesado, sendo este material referente aos aromáticos insolúveis. A detecção dos açúcares monoméricos foi utilizada uma pequena alíquota do filtrado que foi passada através de membranas de 0,45µm e na sequencia, passado através de cartuchos do tipo SEP-PACL C18 e injetados em um sistema de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). A análise cromatográfica utilizou uma coluna BIORAD AMINEX HPX-87, com ácido sulfúrico 0,005 mol.L -1 como eluente a um fluxo de 0,6 mL.min -1 a 80°C e detecção por índice de refração a temperatura de 60°C. Nesta coluna foram detectados e quantificados glicose e xilose. Os experimentos foram realizados em triplicata e para quantificação foi elaborada uma curva de calibração com padrões autênticos de glicose e xilose (Sigma), ou 44 seja, valores conhecidos de concentrações de glicose e xilose passadas pela mesma coluna. A massa total de glicose foi multiplicada pelo fator de hidrólise de glicose para glucana (0,9) e o resultado foi considerado como massa de glucana na amostra. Este fator de conversão é o desconto da inserção de uma molécula de água na quebra da celulose. 4.3.15. Hidrolise Enzimática do Bagaço de Cana-de-Açúcar O teste de biodegradação utilizou bagaço de cana in natura, seco e moído apenas, e bagaço pré-tratado com sulfito-alcalino como desrito no item 4.3.13. Aproximadamente 200mg de bagaço de cana foram pesados, em base seca, em tubos tipo falcons de 50 mL e 8,3 mL de tampão acetato de sódio 0,05 mol.L -1 foram adicionados. Foram pesados 200 mg de bagaço de cana, in natura e tratado com sulfito alcalino, descontando a umidade do bagaço de cana, sendo 13,93% e 11,45% respectivamente. O complexo enzimático foi adicionado a uma concentração de 2,0 UI.mg proteína -1 da FPAse (Atividade Celulolítica total), sendo que para atingir a concentração das enzimas foram necessários 1,7 mL das enzimas purificadas por acetona. Adicionalmente, foi realizado o teste com os mesmos substratos com a enzima comercial Celic Cetec 2 (Novozymes), que possui 89 UI.mg proteína -1 da FPAse, que foi adionado apenas 0,224 mL do extrato diluído 10 vezes, como comparação do potencial do extrato enzimático produzido e purificado dos por A. terreus com enzima comercial. Os falcons foram incubados em agitador orbital, a 45°C, 120 rpm por 72 horas. Alíquotas de 0,5 mL foram retiradas nos tempos de 4, 8, 24, 48 e 72 horas recolhidas em eppendorfs e fervidas por 10 minutos para a inativação das enzimas e armazenadas até a - 20°C até a análise em CLAE (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência). Controles abióticos foram realizados adicionando apenas o bagaço, in natura e pré-tratado, e o tampão, para 45 observar e se necessário descontar se o processo não libera glicose. Ainda foram realizados controles das enzimas purificadas de A. terreus para verificar se não há glicose contaminante. O cálculo da quantidade de glicose foi realizado através da integração da área dos picos de glicose e convertida em concentração de glicose através de uma curva de calibração realizada através de valores conhecidos de soluções de glicose e a área correspondente. A concentração de glicose foi descontada a concentração de glicose presente na solução enzimática, tanto a de A. terreus quanto a da Cellic Cetec2, quanto os controles abióticos que foram realizados da mesma forma que a hidrólise apenas excluindo a adição de enzimas a fim de descontar possíveis glicoses que poderiam ser liberadas do bagaço de cana pelo tempo e temperatura empregados na hidrólise. A taxa de conversão de celulose a glicose foi realizada utilizando a porcentagem de celulose calculada nos bagaços em relação à polpa básica, sendo 34,6% para in natura e 52,7% para o bagaço tratado com sulfito-alcalino. Dessa forma, das 200mg de bagaço pesado 69,2mg e 105,4mg correspondem a celulose passível de hidrolisar, respectivemente. 4.3.16. Análise da Hidrólise Enzimática do Bagaço de Cana in natura e pré-tratado Os sobrenadantes recolhidos dos tempos de coleta da hidrólise enzimática foram descongelados e analisados por CLAE nas mesmas condições do item 4.3.14. exceto que a coluna é a BIORAD AMINEX HPX-87H, com ácido sulfúrico 0,005 mol.L -1 como eluente a um fluxo de 0,6 mL.min -1 a 85°C e detecção por índice de refração a temperatura de 60°C. A partir dos dados de composição química e os fatores de hidrólise enzimática (0,9 para conversão da glicose) foram calculadas as porcentagens de conversão de glucanas em glicose e de galactanas em galactose. Para o cálculo, também foram previamente descontadas as massas de glicose e galactose presentes nos extratos enzimáticos utilizados em cada reação. 46 5. Resultados 5.1. Recuperação Fúngica e Técnica de Congo Red Os microrganismos foram repicados em meio PDA como pode ser visualizado na Figura 3. As placas contendo o meio foram coradas com Vermelho Congo de acordo com a metodologia de Ruegger & Tauk-Tornisielo (2003) na Figura 4 e os halos de degradação. As placas contendo o meio com Vermelho Congo foram incubadas por mais tempo a 50ºC e houve o aparecimento de halos claros devido ao rompimento da ligação entre o corante e as ligações β-1,4-glicopiranosil, como estudado por Theater & Wood (1982). O maior halo foi obtido para T. reesei QM9414 de 27,90mm, seguido de P. simplicissimum (25,45mm), A. terreus (17,33mm), T. reesei RUT C30, Aspergillus sp (11,65mm) e por fim, A. niger (3,37mm). Podemos notar que o maior halo foi obtido para o T. reesei QM9414 sendo 8,27 vezes maior que o menor halo obtido por A. niger. Figura 3. Fungos filamentosos celulolíticos em meio PDA. (A) Aspergillus niger .(B) Trichoderma reesei QM9414, (C) Trichoderma reesei RUTC30, (D) Aspergillus sp, (E) Aspergillus terreus, (F) Penicillium simplicissimum (arquivo próprio). 47 Figura 4. Crescimento de fungos filamentosos em meio com Congo Red. (A) Aspergillus sp, (B) Aspergillus niger, (C) Trichoderma reesei RUTC30, (D) Penicillium simplicissimum e (E) Trichoderma reesei QM9414 e (F) A. terreus (arquivo próprio). 5.2. Perfil de Atividade Enzimática 5.2.1. Perfil de Atividade Enzimática dos Fungos em Meio A Os fungos descritos no item 4.3. foram incubados no meio A por 15 dias. A cada dia eram coletadas amostras dos sobrenadantes para realizar uma curva de atividade enzimática para cada enzima do complexo enzimático e a atividade de celulase total. Os maiores valores de atividade enzimática específica estão demonstrados na Figura 5 e os valores completos dos quinze dias de cultivo estão no Anexo I, Tabela 1. Pode-se notar que a β-Glicosidase apresentou níveis elevados para A. terreus no décimo dia. Os demais fungos mostraram menores níveis com máximas atividades em nove dias para P. simplicissimum, sete dias para T. reesei QM9414, quatro dias T. reesei RUTC30, quatro dias para Aspergillus sp e nove dias para A. niger. P. simplicissimum obteve a maior atividade de endoglucanase no segundo dia. Para T. reesei QM9414 a maior atividade deu-se no sexto dia, seguida da atividade específica de A. niger no décimo segundo dia. Para o A. terreus foram obtidos dois picos de atividades máximas em sete e dez dias de incubação. Os fungos T. reesei RUT C30 e Aspergillus sp 48 forneceram os menores valores de atividade específica no décimo quarto e décimo primeiro dia, respectivamente. Figura 5. Curva de Atividade enzimática dos fungos filamentosos em Meio A. Período de 15 dias de incubação. (A) β-Glicosidase; (B) Endoglucanase; (C) Exoglucanase; (D) FPAse. A maior atividade específica de exoglucanase foi obtida par A. niger em seis dias de incubação e os demais fungos atingiram valores baixos de atividade específica, sendo o A. terreus o segundo maior em cinco dias de incubação. A ação celulolítica total teve a maior atividade para P. simplicissimum com 4 dias de incubação, seguida de A. terreus e T. reesei QM9414 ambos com seis dias de incubação. 5.2.2. Perfil de Atividade Enzimática dos Fungos em Meio B Os fungos descritos no item 4.3. foram incubados no meio B por 15 dias. A cada dia eram coletadas amostras dos sobrenadantes para realizar uma curva de atividade enzimática para cada enzima do complexo enzimático e a atividade de celulase total. Os maiores valores de atividade enzimática específica estão demonstrados na Figura 6 e os valores completos dos quinze dias de cultivo estão no Anexo I, Tabela 2. Pode-se notar que a maior atividade de β-glicosidase foi obtida para a A. niger aos sete dias de cultivo, seguida de A. terreus aos doze dias. O P. simplicissimum apresentou pico de 49 produção enzimática aos dez dias, T. reesei QM9414 e Aspergillus sp aos oito dias, enquanto T. reesei RUT C30 aos sete dias, sendo deste os menores níveis. Figura 6. Curva de Atividade enzimática dos fungos filamentosos em Meio B. Período de 15 dias de incubação. (A) β-Glicosidase; (B) Endoglucanase; (C) Exoglucanase; (D) FPAse. A maior atividade específica de endoglucanse e FPAse foram observadas para A. terreus em oito e dez dias de incubação, respectivamente. Os demais fungos obtiveram atividades baixas comparadas a A. terreus nas duas enzimas. A exoglucanase teve a maior atividade específica para T. reesei QM9414 em onze dias de incubação seguida de A. terreus com dez dias, A. niger e P. simplicissimum com dez e sete dias respectivamente. 5.2.3. Perfil de Atividade Enzimática dos Fungos em Meio C Os fungos descritos no item 4.3. foram incubados no meio C por 15 dias. A cada dia eram coletadas amostras dos sobrenadantes para realizar uma curva de atividade enzimática para cada enzima do complexo enzimático e a atividade de celulase total. Os maiores valores de atividade enzimática específica estão demonstrados na Figura 7 e os valores completos dos quinze dias de cultivo estão no Anexo I, Tabela 3. Os maiores níveis enzimáticos ocorreram para β-glicosidase de A. terreus que apresentou pico de produção aos doze dias. Neste mesmo tempo foi notado a produção de β- 50 glicosidase para Aspergillus sp, A. niger e T. reesei RUT C30, enquanto T. reesei QM9414 teve sua maior produção aos sete dias e P. simplicissimum com onze dias. Figura 7. Curva de Atividade enzimática dos fungos filamentosos em Meio B. Período de 15 dias de incubação. (A) β-Glicosidase; (B) Endoglucanase; (C) Exoglucanase; (D) FPAse. A endoglucanase mostrou os melhores níveis de atividade para A. terreus em doze dias de incubação, seguida de T. reesei QM 9414 em oito dias de incubação, sendo que os demais fungos apresentaram valores similares de atividade específica para endoglucanase. P. simplicissimum obteve a maior atividade para exoglucanase em meio C com catorze dias de incubação seguida do T. reesei QM9414 no mesmo período de tempo, que também foi o tempo necessário para o T. reesei RUTC30, Aspergillus sp e A. terreus, apenas diferindo para o A. niger com quatro dias de incubação. A atividade celulolítica total foi maior para o P. simplicissimum com quatro dias de incubação seguida de T. reesei RUTC30 em catorze dias e T. reesei QM9414 em treze dias, e os demais fungos com valores similares. 5.2.4. Perfil de Atividade Enzimática dos Fungos em Meio D Os fungos descritos no item 4.3., foram incubados no meio D por 15 dias. A cada dia eram coletadas amostras dos sobrenadantes para realizar uma curva de atividade enzimática para cada enzima do complexo enzimático e a atividade de celulase total. Os maiores valores 51 de atividade enzimática específica estão demonstrados na Figura 8 e os valores completos dos quinze dias de cultivo estão no Anexo I, Tabela 4. Pode-se notar que os melhores níveis enzimáticos ocorreram para a β-glicosidase de T. reesei RUTC30 com quinze dias de incubação, seguido de T. reesei QM9414 em onze dias de incubação e A. terreus com doze dias de incubação. Os demais fungos obtiveram valores similares para o P. simplicissimum em onze dias, A. niger em catorze dias e Aspergillus sp em treze dias. Figura 8. Curva de Atividade enzimática dos fungos filamentosos em Meio B. Período de 15 dias de incubação. (A) β-Glicosidase; (B) Endoglucanase; (C) Exoglucanase; (D) FPAse. A. terreus obteve a maior atividade para A. terreus em sete dias de incubação, seguido de P. simplicissimum com dez dias, T. reesei QM9414 com onze dias e T. reesei RUTC30 com treze dias e ambos com valores similares. Para a exoglucanase a maior atividade específica foi obtida para Aspergillus sp com quatro dias de incubação, seguido de P. simplicissimum em oito dias, T. reesei QM9414 em sete dias e A. terreus em sete dias. A menor atividade foi observada para A. niger com oito dias de incubação. A atividade celulolítica total foi observada para T. reesei QM9414 em sete dias de incubação, seguida de P. simplicissimum em dez dias de incubação, T. reesei RUTC30 em treze dias de incubação, Aspergillus sp em seis dias de incubação e A. terreus com treze dias. A menor atividade máxima foi observada para A. niger em treze dias de incubação. 52 5.3. Avaliação da Influencia da Composição do Meio de Cultura A na Produção Enzimática Os ensaios foram realizados pesando os meios de culturas individuais e o cultivo foi realizado no dia de maior produção da atividade enzimática para o A. niger no meio A, sendo dez dias de cultivo. Após o período de cultivo, o extrato enzimático bruto foi submetido aos ensaios de atividade enzimática, além de mensurada a quantidade de proteínas para o cálculo da atividade específica. A disposição das variáveis e do fatorial de 16 ensaios de Plackett & Burman estão descritas no item 4.3.5. e as atividades enzimáticas específicas estão dispostas na Tabela 4. A partir da obtenção das atividades específicas foram realizadas as análises estatísticas do efeito descritas no item 4.3.5. e estão dispostas na Tabela 5. para β-glicosidase, Tabela 6. para endoglucanase, Tabela 7. para exoglucanase e Tabela 8. para FPAse. Tabela 4. Fatorial de Plackett & Burman com 16 ensaios e atividade específica de β-glicosidase, endoglucanse, exoglucanase e FPAse Ensaio β-Glicosidase* Endoglucanase* Exoglucanase* FPAse* Proteína** 1 0,17008 0,08500 0,46560 0,33744 0,07824 2 0,00449 1,37142 1,36152 2,73625 0,03042 3 0,11875 0,78587 0,83048 2,81656 0,05424 4 1,63181 2,72199 1,25196 3,74319 0,03187 5 0,74455 0,88398 1,04976 0,91820 0,07660 6 0,78063 0,69570 0,53023 0,93888 0,08951 7 0,15496 0,44689 1,89247 1,27684 0,03315 8 12,47058 6,80491 11,11498 1,72826 0,00466 9 0,00869 0,92309 3,26201 3,60252 0,02915 10 0,08863 1,73570 0,97232 1,70755 0,06078 11 1,43302 0,00000 1,80570 2,65182 0,01733 12 0,67913 2,15610 0,73203 0,88020 0,05678 13 0,67553 2,69634 0,75974 2,52365 0,03442 14 0,55044 2,90509 0,96980 1,84642 0,03569 15 0,01579 0,72270 1,14103 0,32208 0,07696 16 0,01180 0,65729 2,34753 1,17767 0,05151 * μmol.min-1.mg proteína-1 ** mg de proteína 53 Tabela 5. Análise do efeito e de estatísticas dos componentes do fatorial de Plackett & Burman para β- Glicosidase. Componentes Efeito Erro Padrão t-valor p-valor Confiança Celulose 1,5237 2,5493 0,5633 0,6033 39,67 Ext. Levedura (g/L) -1,5877 2,5493 0,5861 0,5893 41,07 Glicose (g/L) 2,0122 2,5493 0,7439 0,4983 50,17 (NH4)2SO4 (g/L) -1,0802 2,5493 0,3999 0,7100 29,00 KH2PO4 (g/L) 1,4987 2,5493 0,5540 0,6091 39,09 CaCl2.H2O (g/L) 1,5772 2,5493 0,5831 0,5911 28,97 MgSO4.7H2O (g/L) 1,0794 2,5493 0,3990 0,7103 28,97 FeSO4.7H2O (mg/L) 1,6800 2,5493 0,6215 0,5679 43,21 CoCl2.6H2O (mg/L) -1,5226 2,5493 0,5629 0,6036 39,64 MnSO4.H2O (mg/L) -1,4934 2,5493 0,5521 0,6103 38,97 ZnSO4.7H2O (mg/L) -1,0889 2,5493 0,4026 0,7079 29,21 Observando a atividade enzimática específica pode-se inferir o efeito daquele componente na produção e atividade da enzima β-Glicosidase, sendo que a celulose, glicose, KH2PO4, CaCl2.H2O e FeSO4.7H2O obtiveram efeitos positivos para a enzima, enquanto que extrato de levedura, CoCl2.6H2O e MnSO4.H2O obtiveram efeitos negativos. O ensaio 8, obteve atividade enzimática específica de 12,47058 nmol.min -1 .mg proteína -1 e neste ensaio as variáveis com efeito positivos estavam em +1 e as negativas, -1. Tabela 6. Análise do efeito e de estatísticas dos componentes do fatorial de Plackett & Burman para Endoglucanase. Componentes Efeito Erro Padrão t-valor p-valor Confiança Celulose 0,6870 1,0657 0,3723 0,7285 27,15 Ext. Levedura (g/L) -0,3077 1,0657 0,1668 0,8757 12,43 Glicose (g/L) 0,9343 1,0657 0,5064 0,6392 36,08 (NH4)2SO4 (g/L) -1,0614 1,0657 0,5752 0,5959 40,41 KH2PO4 (g/L) 0,6771 1,0657 0,3670 0,7322 26,78 CaCl2.H2O (g/L) 0,7619 1,0657 0,4129 0,7001 29,99 MgSO4.7H2O (g/L) 0,9211 1,0657 0,4992 0,6238 37,62 FeSO4.7H2O (mg/L) 0,7234 1,0657 0,3921 0,7150 28,50 CoCl2.6H2O (mg/L) -0,3839 1,0657 0,3707 0,7297 27,03 MnSO4.H2O (mg/L) -0,6581 1,0657 0,3566 0,7394 26,06 ZnSO4.7H2O (mg/L) -0,2497 1,0657 0,1353 0,8989 10,11 Os efeitos positivos na produção e atividade da enzima Endoglucanase foram observadas para Glicose e MgSO4.7H2O e os efeitos negativos foram observados apenas para 54 (NH4)2SO4. O ensaio 8 forneceu a maior atividade enzimática específica 6,80491 μmol.min - 1 .mg proteína -1 , sendo este o ensaio que as variáveis com efeito positivos estavam em +1 e as negativas, -1. Tabela 7. Análise do efeito e de estatísticas dos componentes do fatorial de Plackett & Burman para Exoglucanase. Componentes Efeito Erro Padrão t-valor p-valor Confiança Celulose 1,0763 1,7589 0,3359 0,7538 24,62 Ext. Levedura (g/L) -0,9658 1,7589 0,3014 0,7781 22,19 Glicose (g/L) 0,8204 1,7589 0,2560 0,8105 18,95 (NH4)2SO4 (g/L) -0,8946 1,7589 0,2792 0,7939 20,61 KH2PO4 (g/L) 0,5684 1,7589 0,1774 0,8678 13,22 CaCl2.H2O (g/L) 1,6132 1,7589 0,5035 0,6411 35,89 MgSO4.7H2O (g/L) 1,4179 1,7589 0,4425 0,6810 31,90 FeSO4.7H2O (mg/L) 1,3824 1,7589 0,4314 0,6884 31,16 CoCl2.6H2O (mg/L) -1,1562 1,7589 0,3608 0,7364 26,36 MnSO4.H2O (mg/L) -1,7776 1,7589 0,5548 0,6086 39,14 ZnSO4.7H2O (mg/L) -1,6340 1,7589 0,5099 0,6369 36,31 Os efeitos positivos para a produção e atividade enzimática foram observados para CaCl2.H2O, MgSO4.7H2O e FeSO4.7H2O e os efeitos negativos para MnSO4.H2O e ZnSO4.7H2O. O ensaio 8 forneceu novamente a maior atividade específica para exoglucanase, 11,11498 μmol.min -1 .mg proteína -1 , sendo que o ensaio 8 no qual as variáveis com efeito positivos estavam +1 e as variáveis com efeito negativo, -1. Tabela 8. Análise do efeito e de estatísticas dos componentes do fatorial de Plackett & Burman para FPAse. Componentes Efeito Erro Padrão t-valor p-valor Confiança Celulose 0,5449 0,1229 0,2285 0,8304 16,96 Ext. Levedura (g/L) 1,1802 0,1229 0,4949 0,6466 35,34 Glicose (g/L) 0,4368 0,1229 0,1831 0,8636 13,64 (NH4)2SO4 (g/L) -0,6775 0,1229 0,0283 0,9788 2,12 KH2PO4 (g/L) -1,0732 0,1229 0,4500 0,6760 32,40 CaCl2.H2O (g/L) 0,6752 0,1229 0,2831 0,7911 20,89 MgSO4.7H2O (g/L) -0,1058 0,1229 0,0444 0,9667 3,33 FeSO4.7H2O (mg/L) 0,5032 0,1229 0,2110 0,8432 15,68 CoCl2.6H2O (mg/L) 0,0192 0,1229 0,0080 0,9939 0,61 MnSO4.H2O (mg/L) 0,0067 0,1229 0,0028 0,9979 0,21 ZnSO4.7H2O (mg/L) 0,3680 0,1229 0,1543 0,8848 11,52 55 A FPAse forneceu os efeitos com menores valores positivos, sendo estes a celulose, extrato de levedura e CaCl2.H2O e efeito negativo apenas KH2PO4. O ensaio 4 com atividade específica de 3,74319 μmol.min -1 .mg proteína -1 , no qual a celulose e extrato de levedura estavam +1 e o KH2PO4 estava -1, contudo o CaCl2.H2O estava -1, ou seja, ausente na composição. Outro ensaio que forneceu uma atividade e produção elevado foi o 9, 3,60252 μmol.min -1 .mg proteína -1 , nas mesmas condições para a celulose e extrato de levedura +1 e KH2PO4 estava -1, contudo, neste caso o CaCl2.H2O estava +1, ou seja, presente na composição do ensaio. Apesar do intervalo de confiança não ser p<0,05 o fato da atividade e efeito das três enzimas quando analisadas separadas obterem no ensaio 8 suas melhores analises foi realizado um novo estudo em triplicata deste ensaio para avaliar a atividade enzimática e os resultados estão demonstrados na Figura 9. Figura 9. Atividade Enzimática Específica e proteína de triplicata do ensaio 8 de Plackett & Burman. (A) β-glicosidase; (B) Endoglucanase; (C) Exoglucanase; (D) FPAse Apesar das triplicatas demonstrarem desvio padrão pequeno nas triplicatas realizadas no doseamento o teor de proteína foi o grande diferencial entre o primeiro ensaio e a triplicata, sendo 0,00466 e uma média de 0,05211 respectivamente, uma quantidade dez vezes 56 superior o que resultou em atividades específicas baixas quando comparadas ao primeiro ensaio. 5.4. Estabilidade Enzimática 5.4.1. Estabilidade enzimática de Aspergillus niger Cultivada em Meio A 5.4.1.1. Estabilidade ao pH 5.4.1.1.1. β-Glicosidase Os valores de atividade específica de β-glicosidase de A. niger produzida em meio A e sua atividade residual após a incubação em diferentes pHs podem ser visualizados na Figura 10 e os valores de atividade específica e porcentagem de atividade estão contidos no Anexo I, Tabela 5. Podemos observar que o perfil de estabilidade ao pH foi similar entre os pH estudados até uma hora de incubação. Porém após duas horas de incubação, no pH 3 há queda de atividade foi de 91,4% enquanto que nos demais pHs a atividade enzimática residual permaneceram entre 45 a 70% da sua atividade enzimática residual. O pH 3 apresentou uma queda de atividade acentuada, e após cinco horas de ensaio a atividade foi de 0%. Os outros valores de pH estudados mantiveram a atividade enzimática relativamente constantes após 1h de incubação e também apresentaram atividade após onde o pH 5 obteve a maior atividade residual (47,9%) seguido pelo pH 4 (45,4%). 57 Figura 10. Porcentagem de atividade residual de β-Glicosidase produzida por Aspergillus niger no Meio A em função do pH. 5.4.1.1.2. Endoglucanase Os valores de atividade específica de endoglucanase de A. niger produzida em meio A e sua atividade residual após a incubação em diferentes pHs podem ser visualizados na Figura 11 e os valores de atividade específica e porcentagem de atividade estão contidos no Anexo I, Tabela 6. Para a endoglucanase, os valores de pH tiveram grande influencia na estabilidade. O pH 3 novamente demonstrou um efeito mais acentuado sobre da queda de atividade enzimática pois no primeiro ponto (1h) a atividade enzimática foi de 24,1%. Neste mesmo período de tempo, o pH 5 manteve uma atividade de 65,0%, seguido do pH 4 e pH 6 (51,7% e 51,2% respectivamente). Entretanto, no último ponto, 24h, todos os pH demonstraram uma queda chegando a valores próximos à zero ou mesmo zero. O pH 5 manteve uma atividade de 4,7% seguido do pH 6 com 1,7 e os demais chegaram a 0. Diferentemente da β-glicosidase, a endoglucanase não possuiu uma estabilidade frente a diferentes valores de pH, ou seja, a atividade enzimática foi decrescendo em relação ao tempo. 58 Figura 11. Porcentagem de atividade residual de Endoglucanase produzida por Aspergillus niger no Meio A por tempo em função do pH. 5.4.1.1.3. Exoglucanase Os valores de atividade específica de exoglucanase de A. niger produzida em meio A e a sua atividade residual após a incubação em diferentes pHs podem ser visualizadas Figura 12 e os valores de atividade específica e porcentagem de atividade estão contidos no Anexo I, Tabela 7. O perfil de estabilidade da exoglucanase não possuiu similaridades entre os pHs. O pH 3 novamente relevou resultados que influenciaram negativamente a atividade enzimática conforme o tempo, no qual após uma hora a atividade obteve uma queda de 92,7% chegando a 0% de atividade residual em três horas de ensaio que foi mantida até o final do ensaio. Os pHs 4, 5, 6, e 7 após uma hora de incubação obtiveram um resultado similar de atividade enzimática remanescente. 59 Figura 12. Porcentagem de atividade residual de Exoglucanase produzida por Aspergillus niger no Meio A por tempo em função do pH. Entretanto, após as duas horas de incubação com o pH 4, a atividade enzimática caiu para 20,4%, ou seja, uma queda de 76,5% de atividade em relação à atividade de uma hora. Os pHs 6 e 7 ocasionaram quedas de atividade, sendo 52,5 e 32,4% respectivamente. Em pH 5 foi obtido uma atividade enzimática consideravelmente constante em relação ao tempo que se manteve após 24h de contato (67,7%). Em pH 8 foi obtida uma atividade enzimática para o tempo de uma hora de 55,5% e se manteve relativamente constante até três horas, porém a partir deste período houve uma queda da atividade enzimática atingindo 7,4% ao final de 24 horas para a exoglucanase produzida por A. niger. 5.4.1.1.4. Atividade de Celulase Total (FPAse) Os valores de atividade específica de FPAse de A. niger produzida em meio A e a sua atividade residual após a incubação em diferentes pH podem ser visualizadas na Figura 13 e os valores de atividade específica e porcentagem de atividade estão contidos no Anexo I, Tabela 8. 60 O perfil de atividade residual de FPAse para o Meio A foram consideravelmente diferentes, exceto pelo tempo de 24 horas, no qual todos os pH analisados obtiveram o resultado de 0% de atividade enzimática. Os pHs 3 e 4 apresentaram perfis similares com perdas de atividades de 38,8 e 53,8% respectivamente após uma hora e após três horas de ensaio, nestes pHs foi mostrado queda de atividade enzimática para 0%. Figura 13. Porcentagem de atividade residual de FPAse produzida por Aspergillus niger no Meio A em função do pH. Em pHs 4, 7 e 8, após uma hora de ensaio, possuíram valores remanescentes da atividade enzimática similares, sendo 53,8%; 59,0% e 52,0% respectivamente. Para o pH 5 foi obtido o maior valor de atividade remanescente 86,0%, mantendo a atividade enzimática de 64,0% no tempo de incubação quatro horas. Porém, após cinco horas de ensaio, a atividade foi de 23,6%, ou seja, uma queda 62,4% em relação à atividade obtida com uma hora de ensaio, para o pH 5. Em pH 6 foi obtido o segundo melhor perfil de estabilidade enzimática, que porém superou o pH 5 após cinco horas, no qual sua atividade enzimática residual foi de 43,4% e o do pH 5 foi de apenas 23,6%, sendo 1,8 vezes maior. A FPAse em pHs 7 e 8 possuíram perfis 61 similares, como por exemplo em cinco horas de ensaio cujas atividades enzimáticas residuais foram 24,04% e 28,66% respectivamente. 5.4.1.2. Estabilidade à Temperatura 5.4.1.2.1. β-Glicosidase Os valores de atividade específica de β-glicosidase de Aspergillus niger produzida em meio A e a sua atividade residual após a incubação em diferentes temperaturas podem ser visualizadas na Figura 14 e os valores de atividade específica e porcentagem de atividade estão contidos no Anexo I, Tabela 9.. Figura 14. Porcentagem de atividade residual de β-glicosidase produzida por Aspergillus niger no Meio em função da Temperatura. A análise dos resultados de estabilidade térmica exibe perfis similares de atividade enzimática para as temperaturas de 40°C e 50°C, ambas possuindo a atividade máxima em uma hora de incubação (133,5% e 79,6% respectivamente). O aumento da atividade enzimática pode ser devido a uma modificação da conformação enzimática, expondo assim o sítio ativo, favorecendo a sua atividade. A temperatura de 30°C no tempo de 30 minutos de incubação manteve uma estabilidade relativamente constante (78,7%) durante o tempo total 62 de ensaio. Entretanto, as temperaturas de 60, 70 e 80°C forneceram valores de atividade enzimática tendendo a zero. 5.4.1.2.2. Endoglucanase Os valores de atividade específica de endoglucanase de A. niger produzida em meio A e a sua atividade residual após a incubação em diferentes temperaturas podem ser visualizadas na Figura 15 e os valores de atividade específica e porcentagem de atividade estão contidos no Anexo I, Tabela 10. A enzima endoglucanase sofreu pouca interferência durante sua incubação na temperatura de 30°C, tendo seu pico de atividade em 30 minutos (95,35%), mesmo período de incubação observado para a β-glicosidase. Na temperatura de 50°C o pico de atividade enzimática ocorreu em uma hora de ensaio, 65,37%, após o qual houve uma queda de 42,72% em relação à atividade máxima. A temperatura de 40°C exibiu valores de atividade enzimática baixas, variando em torno de 25% a atividade remanescente. A temperatura de 60°C mostrou uma baixa estabilidade térmica com atividade remanescente variando de 25 a 30%. A temperatura de 70°C demonstrou um aumento de atividade enzimática em quatro horas de incubação de aproximadamente 50%. Na temperatura de 80°C foi obtido o seu valor máximo de atividade após 1 hora de ensaio (34%) e após este período, houve uma queda de 25% da atividade enzimática, com cerca de apenas 17% de atividade residual no final do ensaio. 63 Figura 15. Porcentagem de atividade residual de Endoglucanase produzida por Aspergillus niger no Meio A em função da Temperatura. 5.4.1.2.3. Exoglucanase Os valores de atividade específica de 3xoglucanase de A. niger produzida em meio A e a sua atividade residual após a incubação em diferentes temperaturas podem ser visualizadas na Figura 16 e os valores de atividade específica e porcentagem de atividade estão contidos no Anexo I, Tabela 11. Nas temperaturas de 30°C, 40°C, 50°C e 70°C foram obtidas valores acima do 100% , sendo na temperatura de 30°C em uma hora de ensaio, e nas demais temperaturas em duas horas de ensaio. A maior atividade foi obtida na temperatura de 70°C, seguida de 40°C, 50°C e 30°C (194,01%;151,88% ;142,43% e 115,71% respectivamente). Podemos sugerir que estes valores são devido à modificação na conformação tridimensional da enzima favorecendo a ligação do sítio ativo com o substrato. Apesar de fornecer a maior atividade enzimática, a temperatura de 70°C levou a uma perda considerável de atividade nas horas seguintes do ensaio chegando ao último ponto de incubação a 15,57% da atividade, ou seja, uma queda de 12,5 vezes da atividade alcançada, e que pode ser explicado pelo inicio da degradação da enzima. As outras temperaturas citadas 64 mantiveram no último período de incubação valores significativos, sendo a de 30°C uma atividade relativa de 84,59%. Figura 16. Porcentagem de atividade residual de Exoglucanase produzida por Aspergillus niger no Meio A em função da Temperatura. 5.4.1.2.4. Atividade Celulolítica Total (FPAse) Os valores de atividade específica de FPAse de A. niger produzida em meio A e a sua atividade residual após a incubação em diferentes temperatura podem ser visualizadas na Figura 17 e os valores de atividade específica e porcentagem de atividade estão contidos no Anexo I, Tabela 12. A temperatura de 40°C forneceu o maior pico de atividade enzimática, acima de 100% em duas horas de ensaio (106,86%), seguida da temperatura de 50°C também em duas horas de ensaio (94,3%). Na temperatura de 30°C foi obtida a maior atividade enzimática em três horas de ensaio, porém m