UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara Departamento de Alimentos e Nutrição EFEITO DA HESPERIDINA NO PERFIL LIPÍDICO DE RATOS TRATADOS COM DIETA ACRESCIDA DE ÁCIDOS GRAXOS SATURADOS JULIO VINUEZA GALARRAGA ARARAQUARA - SP 2008 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara Departamento de Alimentos e Nutrição EFEITO DA HESPERIDINA NO PERFIL LIPÍDICO DE RATOS TRATADOS COM DIETA ACRESCIDA DE ÁCIDOS GRAXOS SATURADOS Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em “Alimentos e Nutrição” – Área de Ciência dos Alimentos – da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade Estadual Paulista “Julio de Mesquita Filho” para obtenção do grau de mestre. Orientadora: Profa. Dra. Thaís Borges César Co-orientador: Prof. Dr. João Bosco Faria ARARAQUARA - SP 2008 Caminante son tus huellas el camino y nada más; caminante, no hay camino se hace camino al andar. Al andar se hace camino y al volver la vista atrás se ve la senda que nunca se ha de volver a pisar. Caminante no hay camino sino estelas en la mar.. . Antonio Machado Dedico este trabalho, Aos meus queridos pais, Guillermo Vinueza Figueroa e Maria Victoria Galárraga Silva, que sempre me apoiaram e, o mais importante, me ensinaram diversas lições que não podem ser encontradas em livros. À minha filha Samantha Carolina, que trouxera alegria e felicidade à minha vida e mesmo que longe de mim é a força para continuar em frente. Aos meus irmãos, que sempre acreditaram em mim, mesmo com o problema de saúde que eu tinha. Dedico ainda àqueles que pude conviver diariamente bem como àqueles que estavam distantes, familiares e eternos amigos, pelas orações e pelo apoio emocional constante. Agradeço a Iawe, por conceder-me sabedoria e força em todos os momentos de minha vida. Agradeço a todos que participaram da realização deste trabalho. Em especial, à minha orientadora Profa. Dra. Thaís Borges César, por sua competência, dedicação, atenção, respeito e, sobretudo, pelo apoio desde o início desta caminhada. Ao Professor João Bosco Faria, pela sua colaboração como co-orientador e pelo auxílio oferecido na obtenção dos materiais e reagentes para a pesquisa. Aos docentes do Departamento de Alimentos e Nutrição da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da UNESP/ Campus Araraquara, pelo conhecimento transmitido durante o curso de Mestrado. Aos funcionários do Departamento de Alimentos e Nutrição da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da UNESP/Araraquara, pelo estímulo e ajuda sempre demonstrada. Aos funcionários da Seção de Pós-graduação, pela atenção e colaboração durante todo o período do mestrado. Aos funcionários dos distintos Laboratórios Experimentais da Faculdade de Ciências Farmacêuticas, pela amizade e enorme auxílio na realização do trabalho experimental. À Profa. Dra. Ana Dóris de Castro, professora da Disciplina de Fármacos e Medicamentos, pelo apoio e colaboração na formulação e elaboração da dieta experimental. À Profa. Dra. Maria Virgínia Scarpa Gomes, professora do Departamento de Fármacos e Medicamentos, pela colaboração com o biotério do departamento para a realização do trabalho experimental. À Profa.Dra. Cleópatra da Silva Planeta, professora do Departamento de Princípios Ativos Naturais e Toxicologia, pela colaboração com o biotério do Departamento para a realização do projeto piloto. À Profa. Dra. Regina Célia Vendramini, professora do Departamento de Análises Clínicas, pela realização das análises bioquímicas das amostras da pesquisa. Aos funcionários da Biblioteca da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da UNESP, Campus Araraquara, pelo auxílio na obtenção do material bibliográfico. ÀS secretárias do departamento de Alimentos e Nutrição da Faculdade de Ciências farmacêuticas da UNESP, Campus de Araraquara, pela presteza e competência com a que sempre fizeram as suas tarefas. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e ao Conselho Nacional de desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq), pela bolsa de estudo outorgada. Finalmente, agradeço aos meus amigos do Mestrado: Principalmente Ederlan, Caio, Michelle, Juliana, Arnóbio, Alessandra, Gustavo e a todos os colegas pela troca de conhecimentos, pelo companheirismo e apoio em todos os momentos. RESUMO O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da hesperidina na concentração dos lípides sanguíneos em ratos tratados com dieta acrescida de gordura saturada (17%). A hesperidina foi administrada isolada ou associada ao suco de laranja nas dietas dos ratos e após 30 dias de tratamento foram realizadas as análises bioquímicas de colesterol total, HDL-C e tr igl icérides no soro dos animais. Não foram observadas diferenças estatísticas entre os grupos para as concentrações de colesterol total e tr igl icérides, como também não houve diferenças no ganho de peso dos animais tratados com hesperidina ou com suco de laranja mais hesperidina. Houve, todavia, uma diminuição signif icativa no HDL-C com a suplementação da hesperidina (-20%), mas não com o suco isolado ou em associação com a hesperidina. Estes resultados apontam um papel regulador e especif ico da hesperidina no metabolismo dos lípides no rato. Palavras-chave: hesperidina, suco de laranja, l ípides sanguíneos, rato. ABSTRACT The objective of this study was to evaluate the effect of hesperidin on the blood l ipids in rats treated with a diet added with saturated fat (17%). Hesperidin was administrated isolated or associated to orange juice in the animal diets, and after 30 days of dietary treatment it was carried out biochemical analysis in the serum of the rats. It was not observed any statistical differences among groups for the concentration of total cholesterol or tr iglycerides, neither for the weight gained in the rats that had received hesperidin or orange juice. However, i t was verif ied a signif icant reduction on HDL-C with hesperidin supplementation (-20%), but no effect was observed with orange juice, alone or in association with hesperidin. These results showed a regulatory and specif ic role for hesperidin on the l ipid metabolism of the rat. Keywords : hesperidin, orange juice, blood l ipids, rat. LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Grupos de animais e respectivos tratamentos dietéticos. 30 Tabela 2 - Análise centesimal da ração preparada para os outros grupos experimentais. 33 Tabela 3 - Ganho de peso, tecido adiposo e índice da gordura víscero-somática dos grupos experimentais. Grupo controle (C), Grupo gordura saturada (GS),) Grupo gordura saturada + suco de laranja (GS+SL, Grupo gordura saturada + hesperidina (GS+H), Grupo gordura saturada + suco de laranja + hesperidina (GS+SL+H). 40 Tabela 4 - Valores médios ± desvios padrão do colesterol total (CT); HDL colesterol e Trigl icérides (TG), no soro sanguíneo em ratos alimentados com as diferentes dietas. Valores seguidos de letras iguais não diferem entre si. 45 LISTA DE QUADROS Quadros 1 - Nutrientes do suco de laranja pronto para beber, em uma porção (249 g ou 250 mL). 17 Quadro 2 - Concentração de hesperidina nos sucos de laranja brasileiros. 18 Quadro 3 - Gordura Vegetal Colméia em porção de 10g. 31 Quadro 4 - Análise centesimal da ração comercial para ratos Labina, produzida pela Purina para o grupo controle. 33 LISTA DE ANEXOS Anexo 1 – Parecer do Comitê de Ética 68 Anexo 2 – Laudo do Suco de laranja Lanjal 69 Anexo 3 – Laudo da análise da Hesperidina 71 LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Estrutura geral e padrão de numeração dos f lavonóides. As l igações, posições de insaturações e grupos funcionais são específicos para cada classe de flavonóides. 15 Figura 2 - Estrutura dos metabólitos da hesperidina. 20 Figura 3 - Esquema de classif icação dos flavonóides cítr icos. 24 Figura 4 - Valores médios ± desvios padrão do ganho de peso dos grupos experimentais. 41 Figura 5 - Valores médios ± desvios padrão do tecido adiposo dos grupos experimentais. 42 Figura 6 - Valores médios ± desvios padrão do IGV dos grupos experimentais. 43 Figura 7 - Valores médios ± desvios padrão do Colesterol Total no soro sanguíneo em ratos alimentados com as diferentes dietas experimentais. 46 Figura 8 - Valores médios ± desvios padrão do HDL-C no soro sanguíneo em ratos alimentados com as diferentes dietas experimentais. 47 Figura 9 - Valores médios ± desvios padrão dos Trigl icérides no soro sanguíneo em ratos alimentados com as diferentes dietas experimentais. 48 LISTA DE ABREVIATURAS ACAT Acetil-Coenzima-A transferase AGS Ácido graxo saturado AMDR Taxa de Variação de Recomendação de Macronutrientes Apo-B Apoproteína B Apo-E Apoproteína E DAC Doença arterial coronária CBG ß-glicosidase citosólica CT Colesterol total DRI Recomendações de Ingestão Dietética GS Gordura saturada HDL-C Lipoproteína de alta densidade - colesterol HepG2 Linhagem de células do hepatócito HMG-CoA Hidroxi -Metil-Glutaril Coenzima A IGV Índice de gordura víscero somático Kcal Quilocalorias LDL Lipoproteína de baixa densidade LH Lípase hepática LLP Lípase lipoprotéica LPH Florisina hidrolase lactase MTP Proteína transferidora de triglicerídeos microssomal Nob Nobelitina PMF Flavonas polimetoxiladas RER Retículo Endoplasmático Rugoso rpm Rotações por minuto Tan Tangeritina TG Triglicerídeos USDA Departamento de Agricultura dos Estados Unidos VLDL Lipoproteína de muito baixa densidade SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO 14 2. REVISÃO DA LITERATURA 16 3. OBJETIVO GERAL 29 3.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 29 4. MATERIAL E MÉTODOS 30 4.1. ENRIQUECIMENTO DAS DIETAS 31 4.2. COMPOSIÇÃO CENTESIMAL DA DIETA EXPERIMENTAL 32 4.3. ADMINISTRAÇÃO DA HESPERIDINA E DO SUCO DE LARANJA AOS RATOS 34 4.4. GANHO DE PESO DOS RATOS 34 4.5. ÍNDICE DE GORDURA VÍSCERO–SOMÁTICA (IGV) 34 4.6. OBTENÇÃO DE MATERIAL BIOLÓGICO 35 4.7. EXAMES LABORATORIAIS DOS LIPÍDEOS SÉRICOS 35 4.8. DETERMINAÇÃO DO COLESTEROL TOTAL SÉRICO 36 4.9. DETERMINAÇÃO DE HDL-COLESTEROL 36 4.10. DETERMINAÇÃO DE TRIGLICÉRIDES 37 4.11. ANÁLISE ESTATÍSTICA 38 5. RESULTADOS 39 5.1. GANHO DE PESO DOS RATOS 39 5.2. EFEITO DA SUPLEMENTAÇÃO COM HESPERIDINA E DO SUCO DE LARANJA SOBRE OS LIPÍDEOS SÉRICOS NOS GRUPOS EXPERIMENTAIS 44 6. DISCUSSÃO 49 6.1. EFEITO DA HESPERIDINA NA EVOLUÇÃO PONDERAL E ÍNDICE DE GORDURA VÍSCERO-SOMÁTICA 49 6.2. EFEITO DA HESPERIDINA NO PERFIL LIPÍDICO DE RATOS TRATADOS COM ÁCIDOS GRAXOS SATURADOS 52 7. CONCLUSOES 57 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 58 ANEXOS 67 14 1. INTRODUÇÃO Com o desenvolvimento da ciência e tecnologia dos alimentos, da nutrição, da medicina e de áreas afins, aumentaram as evidências científ icas da l igação entre a dieta e a saúde do consumidor. As conseqüências da presença de substâncias conhecidas como antinutricionais têm sido rediscutidas, devido a descobertas recentes que evidenciam o potencial de algumas delas em exercer funções benéficas ao organismo humano (KUROWSKA et al., 2000 a e b; MIDDLETON et al., 2000; ERLUND, 2004). As substâncias químicas de origem vegetal e ativas biologicamente são conhecidas como fitoquímicos, e dentre estes, os compostos fenólicos constituem o maior grupo. Os estudos sobre a influência dos compostos fenólicos na alimentação humana são ainda controversos. Há pesquisas demonstrando suas propriedades: anti-carcinogênica, e inibidora da digestão e da absorção dos alimentos, bem como sua eficiência em converter os nutrientes absorvidos em novas substâncias (AMEER et al., 1996; MIDDLETON et al. 2000). Entre as diversas classes que compõem os compostos fenó l icos, os f lavonó ides são considerados muito importantes para a alimentação humana devido a sua ampla distribuição em frutas, hortaliças e legumes, além de grãos cereais e leguminosas. Quimicamente, os f lavonóides são compostos de baixa massa 15 molecular, encontrados naturalmente em certas frutas, hortaliças, chás, vinhos, nozes, sementes e raízes. Esta subclasse de polifenóis é caracterizada por conter dois ou mais anéis aromáticos, cada qual consistindo de um anel conectado com um oxigênio que une os dois anéis (A e B), formando um terceiro anel (C) (Figura 1). Figura 1 - Estrutura geral e padrão de numeração dos flavonóides. As l igações, posições de insaturações e grupos funcionais são específicos para cada classe de flavonóides. Embora não sejam consideradas vitaminas, os f lavonóides têm várias funções nutricionais que têm sido descritas como modif icadores da resposta biológica; a maioria atua como antioxidantes, e alguns têm propriedades antiinflamatórias (MIDDLETON et al., 2000). Tem sido ainda demonstrado que os f lavonóides previnem ou retardam o desenvolvimento de alguns tipos de câncer (HEIM et al., 2002; SILALAHI 2002; GUTHRIE & KUROWSKA 2001). 16 Há ainda os f lavonóides cítr icos que são apontados como redutores da hipercolesterolêmia, da hipertensão e da obesidade (MANTHEY et al., 2001; KUROWSKA et al., 2000 a,b; KUROWSKA & MANTHEY, 2004; FUJIOKA & LEE, 2007). O conhecimento sobre a relação dos compostos f lavonóides e o colesterol sanguíneo é ainda pequeno e estudos complementares são necessários para um melhor esclarecimento sobre o efeito desta interação. Buscando contribuir com uma nova abordagem sobre o papel dos compostos f lavonóides para a saúde, este trabalho teve como objetivo avaliar, em animais de experimentação a influência da hesperidina sobre as concentrações do colesterol total, HDL-C, tr igl icérides e a evolução ponderal de ratos tratados com dieta suplementada com ácidos graxos saturados e suco de laranja, uma fonte natural do f lavonoide hesperidina. 2. REVISÃO DA LITERATURA Um dos maiores grupos de fi tonutrientes que apresentam efeitos benéficos à saúde são os f lavonóides. Sabe-se que o suco de laranja natural possui quantidades apreciáveis destes compostos, como os f lavonóides cítr icos (hesperidina e naringina), além da vitamina C (Quadro 1), que apresentam ação antioxidante, vaso protetora e hipocolesterolêmica (RISO et al., 2005; ERLUND, 2004; USDA, 2006). 17 Quadro 1 : Nutrientes do suco de laranja pronto para beber em uma porção (249 g ou 250 mL) (USDA, 2006). Nutrientes g mg g Nutrientes mg g Água 222 Vitamina A 22 Proteína 1,5 Vitamina C 86 Gordura total 0,4 Vitamina B-6 0,2 Carboidrato 25,0 Vitamin E, alfa tocoferol 0,5 Açúcar total 21,0 Folato total 45 Fibra dietética total 0,5 Vitamina K 0,2 Cálcio 20 Niacina 0,8 Cobre 0,1 Riboflavina 0,1 Ferro 1,1 Thiamina 0,2 Magnésio 27 Beta Caroteno 72 Fósforo 35 Alfa Caroteno 12 Potássio 436 Beta Criptoxantina 369 Selênio 0,2 Luteina + zeaxantina 286 Sódio 5 Zinco 0,2 Flavonóides mg Energia kcal Hesperit ina 13,75 2,41 105 Naringinina 3,86 0,27 A ingestão média de f lavonas/flavononas é de cerca de 25 mg/dia em muitos países da Europa, com variações em função dos hábitos alimentares. As laranjas e seus sucos são boas fontes destes f lavonóides e contêm cerca de 40 mg/100g do alimento, mas perdas consideráveis ocorrem com a remoção da casca, antes do consumo ou no processo industrial (ALIMENTOS FUNCIONAIS, 2001). 18 Em geral, as concentrações de flavonóides nos alimentos processados são aproximadamente 50% menores do que nos produtos frescos e sua absorção é mais eficiente quando se encontra conjugado a glicose (ANDALAUER et al., 1998; WISEMAN, 1999). O Quadro 2 apresenta a concentração da hesperidina em alguns sucos de laranja industrial izados no Brasil. Quadro 2 - Concentração de hesperidina nos sucos de laranja brasileiros. SUCO HESPERIDINA (mg/L) Suco de laranja espremido manualmente 104-537 Suco de laranja concentrado e congelado 531-690* Suco de laranja concentrado sem a polpa 1089-1200 * após di lu ição para 12º Br ix. (Pupin, et a l 1998) De modo geral, os f lavonóides podem ocorrer em sua forma l ivre (aglicona) ou então conjugada a açúcares (glicosídeos). Nos alimentos, estes compostos estão na forma glicosídica, e após serem ingeridos e chegarem ao intestino grosso, a molécula de açúcar é degradada e os f lavonóides passam para a forma aglicona. Os açúcares mais comuns encontrados conjugados aos f lavonóides são: gl icose, galactose, ramnose, xi lose e arabinose, e menos freqüentemente, alguns dissacarídeos (LEE et al., 1999; KIM et al., 2003; HARBORNE & WILLIAMS, 2000). Mais de 80 espécies de açúcares têm sido descritos como l igados aos f lavonóides (LIU, 2004). 19 A grande variedade de compostos pode ser explicada pelas modificações estruturais na composição básica da molécula, como reações de hidroxilação, meti lação, acilação, glicosilação, entre outras. A glicosilação pode ocorrer nos grupos hidroxilas, l igando o flavonóide à molécula de açúcar através de um átomo de oxigênio, ou diretamente no núcleo do flavonóide, através de um átomo de carbono (AMEER et al., 1996; LEE et al., 1999; KIM et al., 2003; YAMADA et al., 2006). Os flavonóides das frutas cítr icas hesperidina e naringina são resistentes ao suco gástrico do estômago sendo absorvidos no trato gastrintestinal (KUROWSKA et al., 2000ab; AMEER et al., 1996; HOLLMAN & KATAN, 1999), após deglicosilação por enzimas de bactérias intest inais (HAVSTEEN, 1983). A baixa solubil idade da hesperidina em água dif iculta sua absorção, que é menor que 0,01%, entretanto, um derivado da hesperidina, a glicosil hesperidina (G-Hesperidin) é marcadamente mais solúvel em água que a hesperidina (YAMADA et al., 2006). Alguns t ipos de f lavonóides podem ser dissolvidos em carboximetil celulose sódica ou em propileno glicol para elevar sua absorção no organismo (YAMADA et al., 2006). Previamente, outros autores reportaram que o metabólito hesperit ina, da hesperidina (Figura 2) inibe a HMG-CoA redutase e reduz a concentração plasmática do colesterol em ratos (LEE et al., 1999; KIM et al., 2003). 20 Hesperitina Ácido m-hidroxicinamico Ácido 3,4-dihidroxi-fenilpropionico Ácido ferúlico Figura 2 - Estrutura dos metaból i tos da hesperidina (KIM et al . , 2003). A hesperidina encontrada quase que exclusivamente nos sucos cítr icos, reduz o colesterol e os tr igl icérides do plasma, inibe a taxa de oxidação da LDL e o crescimento da placa ateromatosa, tanto em animais experimentais como no ser humano (COOK e SAMMAN, 1996; MONFORTE et al., 1995; KUROWSKA et al., 2000a,b). Tem sido demonstrado que a hesperidina inibe a absorção intestinal do colesterol al imentar e aumenta o catabolismo do colesterol hepático, contribuindo assim para um balanço negativo de colesterol (MONFORTE et al. 1995). Tem sido sugerido que hidrolases e glicosidases, f lorisina hidrolase lactase (LPH), -gl icosidades e -glicosidade citosólica 21 (CBG), atuam sobre os f lavonóides em geral (FORMICA & REGELSON, 1995; TAPIERO et al., 2002; ERLUND, 2004). A análise dos produtos de excreção urinária, após a ingestão de flavanonas isoladas (naringina e hesperidina), de suco de laranja ou “grapefruit”, evidenciou a presença de metabólitos destes compostos na urina, comprovando sua absorção pelo organismo (AMEER et al., 1996). Foi verif icada ainda uma variação considerável na taxa de absorção entre os indivíduos, possivelmente devido às diferenças da ação da microflora gastrintestinal na deglicosilação das flavanonas (ERLUND et al., 2001, 2002). Alguns estudos têm mostrado que as concentrações plasmáticas máximas de hesperit ina e naringenina variam após o consumo de sucos cítr icos (ERLUND et al., 2001, 2002; MANACH et al., 2003). Após a ingestão de cerca de 500 mL de suco de laranja essas concentrações variaram entre 0,46 ± 0,07 mol/L e 2,20 ± 1,58 mol/L para hesperit ina, e de 0,06 ± 0,02 mol/L a 0,64 ± 0,40 mol/L para a naringenina (MANACH et al., 2003; ERLUND et al., 2001). No entanto, ainda não foi observado o acúmulo de flavanonas no plasma (ERLUND et al., 2002). O tempo de meia-vida plasmática destes compostos é de cerca de 1 a 2 horas após a ingestão e a excreção urinária é dose-dependente, isto é, proporcional à ingestão de flavanonas. Após 24 horas da ingestão, as f lavanonas são quase totalmente eliminadas pela urina, indicando que estes compostos 22 não atuam como biomarcadores de ingestão a longo prazo (ERLUND et al., 2001). Já de acordo com Brevik et al. (2004), que analisaram a excreção urinária de indivíduos consumindo duas ou cinco porções de frutas e hortaliças, as excreções urinárias de naringenina e hesperit ina estavam aumentadas no grupo que consumiu cinco porções diárias de frutas e hortaliças. O mecanismo de absorção e ação dos flavonóides no organismo ainda não está totalmente esclarecido. No intestino delgado a absorção dos flavonóides parece ocorrer através da especif icidade das enzimas intest inais pela molécula de açúcar l igada ao composto (ERLUND, 2004). Sabe-se que os f lavonóides conjugados são levados pelo sistema porta dos enterócitos ao fígado, onde sofrem outras reações, como meti lação, sulfatação e glicuronidação, resultando uma variedade de formas conjugadas (SCALBERT et al., 2002). Os flavonóides conjugados podem ser excretados pela bile ou levados aos tecidos periféricos pelo sistema sanguíneo, onde desempenham ações, tais como atividade antioxidante, prevenção de estresse oxidativo e de doenças crônicas (HOLLMAM & KATAN, 1997; TAPIERO et al., 2002; LIU, 2004). Pesquisas com animais de experimentação têm demonstrado ação hipolipidêmica da hesperidina sobre a concentração de colesterol plasmático. A hesperidina, quando administrada como composto isolado em ratos tratados com colesterol dietético diminuiu o colesterol total, o LDL e os tr igl icérides plasmáticos, ao 23 mesmo tempo em que aumentou o HDL-C (MONFORTE et al., 1995). O tratamento de células HepG2 com hesperidina e naringina reduziu a secreção de Apo B, indicativo da inibição da síntese do colesterol éster e de LDL. Além disso, os sucos cítr icos contêm altas concentrações de l imonóides, os quais parecem ter ação redutora sobre a apo B em células HepG2 (BORRADAILE et al., 1999). Outros estudos em humanos têm demonstrado que o suco de laranja reduz a excreção fecal e a concentração hepática de colesterol, indicando que os efeitos anti-colesterolêmicos são devidos às modificações endógenas no metabolismo do colesterol (KUROWSKA et al. 2000a). Além disso, o suco de laranja elevou o HDL-C e diminuiu a oxidação da LDL, devido à complexa composição em vitaminas, minerais e f lavonóides deste alimento (BORRADAILE et al. 1999; KUROWSKA et al. 2000a). Nas frutas cítr icas, além das flavanonas, são encontradas também as flavonas altamente metoxiladas, também conhecidas como polimetoxiladas (PMF). A Figura 3 apresenta os f lavonóides cítr icos encontrados nas diferentes partes das frutas e em diferentes concentrações, variando de acordo com solo, cl ima, variedade da fruta, época da colheita, entre outros fatores. As PMF cítr icas mais comuns são tangerit ina (Tan) e nobelit ina (Nob), encontradas em laranjas, tangerinas e casca de laranja azeda (Citrus aurantum). Tem sido mostrado que as PMF 24 possuem maior potencial hipolipidêmico do que as f lavanonas cítr icas (KUROWSKA & MANTHEY, 2004). Figura 3 - Esquema de classif icação dos f lavonóides cítr ico (LIU, 2004). Estudos feitos por Kurowska e Manthey (2004) verif icaram o efeito das PMF em hamsters com hipercolesterolêmia induzida pela dieta. Foi observada no grupo suplementado com 1% de PMF, diminuição de 27% do colesterol e 44% de triglicérides no sangue, que foi comparável ao grupo tratado com dieta suplementada com 3% da combinação hesperidina/naringina (1:1), sugerindo um maior potencial hipolipidêmico das PMF. 25 A soja contém um flavonóide conhecido como genisteína, que reduz o colesterol de VLDL e LDL em macacos, ratos e coelhos. Tem sido relatada uma similaridade estrutural entre a genisteína da soja e a hesperidina dos sucos cítr icos, sugerindo que este também pode apresentar propriedades hipocolesterolêmicas (KUROWSKA et al, 2000 a,b). A ação hipocolesterolêmica de compostos polifenólicos tem sido atribuída à ocorrência comum dos grupos hidroxila na posição 3, 4 ou 5 da sua estrutura (MONFORTE et al., 1995). Em outro estudo, as f lavanonas cítr icas retiradas da casca da tangerina e uma mistura de flavonóides contendo hesperidina e naringina foram administradas a ratos hipercolesterolêmicos. Os resultados mostraram que os grupos suplementados tiveram redução das concentrações plasmáticas e hepáticos de colesterol e também de TG hepáticos, quando comparados ao grupo que não recebeu suplementação, sugerindo uma diminuição da síntese de colesterol endógeno devido à inibição da hidroximeti l glutari l coenzima A redutase (HMG-CoA redutase), enzima responsável pela transformação da HMG-CoA em Mevalonato, na cadeia de reações da biossíntese de colesterol, também foi observada uma diminuição na excreção de colesterol fecal (MONFORTE et al. 1995; BOK et al. 1999; LEE et al., 1999; KIM et al. 2003). Há evidências de que as f lavanonas atuariam reduzindo ou inibindo a atividade da proteína transferidora de trigl icerídeos microssomal (MTP), reduzindo assim a formação da VLDL 26 nascente e, conseqüentemente, as concentrações de LDL circulantes (BORRADAILE et al., 2002). Na primeira etapa deste processo ocorre a formação de uma pequena partícula pré-VLDL no retículo endoplasmático rugoso (RER) hepático que se une à apo-B na membrana do RER e é enriquecida com tr igl icerídeos. Na etapa seguinte, há a necessidade de outra MTP, para formar a VLDL flutuante no hepatócito que será, posteriormente, secretada para o sangue. Esta proteína irá transferir os tr igl icerídeos sintetizados para fundirem-se com a apo-B, ambos sintetizados no fígado para então formar a VLDL nascente, que será mais enriquecida com lipídeos e secretada, sendo chamada de VLDL flutuante (LARSSONN et al., 2004). Notou-se ainda que a atividade dos receptores de LDL estava aumentava (WILCOX et al., 2001), corroborando a evidência de que a expressão dos receptores hepáticos de LDL modula a secreção de apo-B (TWISK et al., 2000). Homens e mulheres moderadamente hipercolesterolêmicos suplementados com 750 mL/dia de suco de laranja por várias semanas apresentaram aumento de 21% do HDL-C e redução de 16% da razão LDL/HDL (KUROWSKA et al., 2000a). Em estudo semelhante conduzido por CARNEIRO (2004), onde homens e mulheres foram tratados com 500 mL/dia de suco de laranja durante 60 dias, observou-se aumento signif icativo de 17% do HDL-C em homens e 8% em mulheres (CESAR et al., 2004). 27 Os efeitos da hesperidina devem-se a um ou mais mecanismos envolvendo inibição da absorção intestinal de colesterol, aumento da degradação de colesterol e interferência com lipoproteínas. Além disso, a diminuição da síntese do colesterol, induzida pela hesperidina, pode levar a um aumento de receptores de LDL e consequentemente, a uma diminuição do colesterol de LDL (MONFORTE et al. 1995). A hesperidina parece também aumentar o catabolismo do colesterol hepático, pois estudos sobre a distribuição de isótopos radioativos de flavonóides têm demonstrado que estes compostos estão concentrados especialmente no fígado (GRIFFITHS, 1982; MONFORTE et al. 1995). A HDL no rato é a l ipoproteína que faz o transporte do colesterol para os órgãos do corpo, assemelhando-se, portanto ao papel da LDL no homem (GROENER et al., 1989; KADOWAKI et al., 1992), além do transporte reverso do colesterol. No rato, o sistema de receptores responsáveis pela captação das LDL é semelhante ao do homem, apesar de não ser idêntico (INNERARITY et al., 1980). No plasma dos ratos, quase todas as VLDL, após hidrólise, são removidas da circulação via receptores hepáticos B/E e poucas partículas dão origem às LDL, que também são removidas preferencialmente pelo fígado (HAVEL, 1984). Estudos metabólicos têm verif icado que no rato, o transporte e a distribuição do colesterol para os tecidos são feitos basicamente 28 pelas HDL (INNERARITY et al., 1980; MAHLEY e INNERARITY, 1983; GROENER et al., 1989; KADOWAKI et al., 1992). Mahley e Innerarity (1983) propuseram um modelo para explicar a alta afinidade dos receptores B/E por partículas ricas em apo E. Eles estimaram, baseados no peso molecular das HDL e das apo E, que cada partícula de HDL contém, em média, cerca de 16 moléculas de apo E e as LDL apenas uma molécula de apo B100. No modelo, cada partícula de HDL se l iga a 4 sít ios do receptor, enquanto as LDL se l igam a um único sit io de l igação do receptor. Assim, a alta afinidade das HDL resulta das múltiplas l igações entre 4 apos E com o receptor, o que é compatível com o menor número de partículas necessárias para saturar os sít ios de l igação. 29 3. OBJETIVO GERAL Avaliar o efeito da hesperidina no controle dos níveis dos l ipídeos sangüíneos em ratos tratados com dieta acrescida de ácidos graxos saturados. 3.1. Objetivos específicos Avaliar nos ratos tratados com hesperidina, isolada ou associada ao suco de laranja e dieta enriquecida com ácidos graxos saturados, os seguintes parâmetros: a) Concentração sangüínea do colesterol total (CT), HDL-C e tr igl icérides nos animais experimentais e controle. b) Evolução ponderal dos animais experimentais e controle. c) O índice de gordura víscero-somático 30 4. MATERIAL E MÉTODOS O experimento foi realizado no Biotério do Departamento de Fármacos e Medicamentos da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da UNESP de Araraquara, SP. No ensaio biológico foram uti l izados ratos machos albinos com 40 dias de idade, da linhagem Wistar, pesando 194 16 g, provenientes do Biotério central da UNESP de Botucatu-SP. Eles receberam uma dieta não purif icada, obtida comercialmente, e água a vontade durante o tempo de aclimatação ou adaptação de cinco dias, em caixas comparti lhadas e em ambiente cl imatizado, com temperatura de 24±1°C, com períodos de claro e escuro de 12 horas, antes de iniciarem os tratamentos da experimentação. Foram constituídos cinco grupos de animais distribuídos ao acaso e submetidos ao tratamento dietético descrito na Tabela 1. Cada grupo continha 8 ratos sendo que foram mantidos 2 animais de cada grupo por gaiola. Tabela 1 - Grupos de animais e respectivos tratamentos dietéticos. Grupos N Dieta = Ração Comercial acrescida de: Controle 8 água com açúcar GS 8 gordura vegetal + água com açúcar GS+SL 8 gordura vegetal + suco de laranja GS+SL+H 8 gordura vegetal + suco laranja com hesperidina GS+H 8 gordura vegetal + água com açúcar + hesperidina Total 40 31 4.1. Enriquecimento das dietas As dietas foram preparadas a partir de ração comercial para ratos Labina, procedente da Purina . Para enriquecimento das dietas foi uti l izada a gordura vegetal comercial, com mistura de óleos de palma (90%) e de soja (10%), da marca Colméia da Vida Alimentos Ltda., em quantidade adequada para se obter a concentração final de 17% de gordura saturada na dieta, a composição da gordura vegetal está apresentada no Quadro 3. Quadro 3 - Gordura Vegetal Colméia em porção de 10g . Quantidade por porção 10g (1 colher de sopa) Valor Energético 90 kcal Carboidratos 0 g Proteínas 0 g Gorduras Totais 10 g Gorduras Trans 2,6 g Gorduras Saturadas 2,4 g Colesterol 0 mg Fibra Alimentar 0 g Sódio 0 mg Após a fusão da gordura vegetal em banho-maria termostatizado a 55°C, esta foi aspergida à ração comercial, uti l izando equipamento de revestimento de núcleos sólidos do tipo drageadeira marca Max H. Neuberger, fabricado no Brasil. Durante o processo de enriquecimento foi uti l izada agitação a 30 rpm e com fluxo de ar de secagem a temperatura ambiente. 32 Depois de produzida, a ração foi adequadamente acondicionada em sacos plásticos escuros e armazenada sob refrigeração (4-8 C) durante todo o período de util ização. A composição centesimal da dieta está apresentada no Quadro 4 e na Tabela 2. 4.2. Composição centesimal da dieta experimental A composição centesimal da dieta experimental foi determinada seguindo-se as recomendações da AOAC (1995). O conteúdo de umidade das amostras foi determinado submetendo-se as amostras em estufa a 105°C, por 4 horas até peso constante. Os teores de proteína das amostras foram obtidos após determinação do nitrogênio total pelo método semi micro-Kjedahl e multipl icação pelo fator 6,25. O extrato etéreo das amostras foi determinado através do aparelho Soxhlet, uti l izando como solvente o éter de petróleo com refluxo continuo através da amostra por 6 horas. O teor de cinzas foi obtido carbonizando-se as amostras em mufla a 550°C, por 4 horas até peso constante. O conteúdo de carboidratos totais presentes nas amostras foi calculado por diferença, ou seja, subtraindo-se de 100g de cada 33 amostra o total em gramas de umidade, proteína, l ipídeos, cinzas (Tabela 2). Quadro 4 - Análise centesimal da ração comercial para ratos Labina, produzida pela Purina para o grupo controle. Componentes Ração Comercial (%) Umidade (Máx.) 13 Proteína Bruta (Mín.) 23 Extrato Etéreo (Mín.) 4 Matéria Fibrosa (Máx.) 5 Matéria Mineral (Máx.) 10 Glicídios (Diferença) 45 Cálcio (Máx.) 1,3 Fósforo (Mín.) 0,85 Tabela 2 - Análise centesimal da ração preparada para os outros grupos experimentais. Componentes Componentes na Ração experimental (%) Umidade 7,1 Proteína Bruta 21,5 Extrato Etéreo 16,9 Matéria Mineral 6,3 Glicídios (Diferença) 43,1 34 4.3. Administração da hesperidina e do suco de laranja aos ratos Para administrar a hesperidina e o suco de laranja aos animais, a água oferecida foi substituída por suco de laranja (Lanjal , Global Sucos, Matão, SP, Brasil), (Anexo 2), na diluição 1:6 e com hesperidina, C28H34O15 (Pharma-Nostra, Campinas, SP, Brasil) na concentração de 25 mg/L. Nas diluições sem o suco de laranja, foi adicionado sacarosa para atingir a concentração de 100g/L de carboidratos, similar à composição do suco de laranja. A ração e a bebida foram oferecidas “ad l ibitum“. 4.4. Ganho de peso dos ratos Durante a realização do experimento os animais foram pesados no início, semanalmente e no final do experimento. 4.5. Índice de gordura víscero–somática (IGV) Os valores foram determinados pela relação entre o peso da gordura visceral (GV) e o peso corporal (PC) do rato, pela equação: IGV = (GV/PC) x 100. 35 4.6. Obtenção de material biológico Depois de quatro semanas de tratamento, e após 16 horas de jejum, os animais foram decapitados e colhidas amostras de sangue e tecido adiposo para análises laboratoriais. Este procedimento foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa animal da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da UNESP/ Campus Araraquara, com o parecer n° 42/2006 apresentado no (Anexo 1). 4.7. Exames laboratoriais dos lipídeos séricos As determinações bioquímicas do colesterol total (CT), colesterol de HDL (HDL-C), e tr igl icerídeos (TG) foram realizadas com o material das coletas supracitadas. As determinações bioquímicas foram realizadas no soro, após jejum de 16 horas. Todas as dosagens bioquímicas foram por método espectrofotométrico enzimático, no equipamento automático RAXT- Technicon , uti l izando-se os kits comerciais: a) COLESTEROL TOTAL CHOD-PAP MS/ANVISA 80115310040 Método: “CHOD-PAP” Teste Fotométrico enzimático da marca Kovalent b) TRIGLICERÍDEOS GPO-PAP MS/ANVISA 80115310039 Método: “GPO-PAP” Teste Colorimétrico enzimático usando Glicerol-3-fosfato 36 Oxidase da marca Kovalent c) HDL-C LE ANVISA 10009010057 Metodologia: Inibição seletiva da marca Labtest 4.8. Determinação do colesterol total sérico O colesterol total foi quantif icado pelo método de Trinder (1969a). Esta reação ocorre em tampão fosfato 50 mmol/L, ph 7,0, o conteúdo colesterol esterase 250UI, colesterol oxidase 250 UI, peroxidase 1000 UI, 4-aminoantipir ina 0,5 mmol/L e fenol 2,4 mmol/L. A colesterol esterase produz a hidrólise dos ésteres de colesterol e ácidos graxos. A enzima colesterol oxidase oxida o colesterol na presença do oxigênio, produzindo colest-4-en-3-ona e peróxido de hidrogênio. Esse, na presença de fenol, 4- aminoantipir ina e sob ação da peroxidase produz a antipir i lquinonimina e água. A antipir i lquinonimina é de cor vermelha, e absorve luz em a 500 m. A intensidade da cor vermelha formada é diretamente proporcional à concentração do colesterol da amostra. 4.9. Determinação de HDL-Colesterol As l ipoproteínas de alta densidade (HDL) foram determinadas após precipitação seletiva das l ipoproteínas de baixa 37 e muito baixa densidade (LDL e VLDL) mediante a adição de uma solução de ácido fosfotúngstico 1,5 mmol/L e cloreto de magnésio 54 mmol/L. Após centrifugação, o colesterol HDL foi determinado no sobrenadante, pelo método enzimático de Trinder (1969a), que uti l iza o colesterol oxidase/peroxidase, conforme descrito anteriormente. 4.10. Determinação de triglicérides Os trigl icérides foram quantif icados pelo método enzimático de Trinder (1969b), no qual inicialmente a lípase hidrolisa os tr igl icérides, produzindo ácidos graxos e glicerol. O glicerol é fosfori lado pelo ATP na presença de oxigênio, à dihidroxiacetona, produzindo peróxido de hidrogênio. Este últ imo, com a adição de 4-aminoantipir ina e 4-clorofenol, na presença de peroxidase forma a 4-antipir i lquinonimina, que é colorida e absorve luz em igual a 510 m. As reações são realizadas com a adição de um reagente contendo tampão fosfato 50 mmol/L, pH 7,5, l ipase 1400 UI, gl icerolquinase 1000 UI , gl icerol-3-fosfato oxidase 3500 UI, peroxidase 440 UI, 4-aminoantipir ina 0,7 mmol/L, ATP 0,18 mmol/L, 4-clorofenol 5,44 mmol/L e íons magnésio. A reação é desenvolvida a 37°C. 38 4.11. Análise estatística O delineamento estatístico uti l izado foi inteiramente casualizado com a realização de 5 tratamentos com 8 repetições. Foram realizadas análises de variância (ANOVA), seguidas do test de Tukey para comparação entre as médias, considerando o nível de signif icância menor ou igual a 0,05 (p 0,05). Todas as análises foram realizadas com o software Biostat 4.0, enquanto a representação gráfica dos resultados foram efetuadas com o software OriginPro 7.5 39 5. RESULTADOS O estudo do efeito da hesperidina pura ou associada com o suco de laranja em animais com dieta suplementada com gordura saturada constituiu uma estratégia para verif icar o efeito do principal f lavonóide cítr ico do suco de laranja, a hesperidina, sobre as concentrações séricas de l ipídeos sanguíneos. 5.1. Ganho de peso dos ratos Todos os animais do experimento apresentaram ganho de peso, mas não houve diferença estatística entre os grupos. Apesar disso, os animais do grupo suplementado com gordura saturada (GS) apresentaram em média, um ganho de peso 11,7% maior do que o grupo controle (C). Os animais do grupo GS mais hesperidina (GS+H) foram os que apresentaram maior ganho quando comparados com os demais grupos (22,7 %). O grupo GS mais suco de laranja e hesperidina (GS+SL+H) foi o que apresentou o menor ganho de peso em relação a todos os outros grupos experimentais, igual a (2,3 %). Os valores médios estão apresentados na Tabela 3 e Figura 4. Valores similares foram observados em relação a quantidade de tecido adiposo, cujas médias confirmam a mesma tendência do ganho de peso nos grupos. Os resultados são mostrados na Tabela 3 e Figura 5. 40 Tabela 3 - Ganho de peso, tecido adiposo e índice da gordura víscero-somática dos grupos experimentais. Grupo controle(C), Grupo gordura saturada (GS), Grupo gordura saturada + suco de laranja (GS+SL), Grupo gordura saturada + hesperidina (GS+H), Grupo gordura saturada + suco de laranja + hesperidina (GS+SL+H). Valores seguidos de letras diferentes indicam diferenças signif icantes (p<0,05). DIETAS Ganho de peso(g) Tecido adiposo(g) IGV (%) C 128 ± 20 9,3 ± 2.3 2,9 ± 0,5 b GS 143 ± 30 12,6 ± 2.3 3,7 ± 0,7 a b GS+SL 135 ± 23 11,2 ± 3.0 3,5 ± 0,8 a b GS+H 157 ± 26 14,6 ± 4.0 4,0 ± 1,0 a GS+SL+H 131 ± 18 10,1 ± 3.0 3,1 ± 0,8 a b 41 Figura 4 - Valores médios ± desvio padrão do ganho de peso dos grupos experimentais. Grupo controle(C), Grupo gordura saturada (GS), Grupo gordura saturada + suco de laranja (GS+SL), Grupo gordura saturada + hesperidina (GS+H), Grupo gordura saturada + suco de laranja + hesperidina (GS+SL+H). 42 Figura 5 - Valores médios ± desvios padrão do tecido adiposo dos grupos experimentais. Grupo controle(C), Grupo gordura saturada (GS), Grupo gordura saturada + suco de laranja (GS+SL), Grupo gordura saturada + hesperidina (GS+H), Grupo gordura saturada + suco de laranja + hesperidina (GS+SL+H). A dieta com gordura saturada promoveu um ganho de peso em todos os grupos, representado pela tendência no aumento do ganho de peso corporal dos ratos e pela deposição de maior quantidade de tecido adiposo, quando comparado à dieta do grupo controle, embora as diferenças entre os grupos não tenham sido signif icativas. 43 O índice de gordura víscero-somático (IGV) teve diferença signif icativa (p< 0,05) entre o grupo controle (C) e o grupo (GS+H), como se observa na Tabela 3 e Figura 6. Figura 6 - Valores médios ± desvios padrão do IGV dos grupos experimentais. Grupo controle(C), Grupo gordura saturada (GS), Grupo gordura saturada + suco de laranja (GS+SL), Grupo gordura saturada + hesperidina (GS+H), Grupo gordura saturada + suco de laranja + hesperidina (GS+SL+H). * p< 0,05 em comparação ao grupo C. 44 5.2. Efeito da suplementação com hesperidina e do suco de laranja sobre os lipídeos séricos nos grupos experimentais As concentrações séricas de colesterol total (CT) de cada um dos grupos de ratos alimentados com a dieta controle e dietas experimentais estão apresentados na Tabela 4. A análise estatística dos dados não mostrou diferenças signif icativas entre os grupos, embora os grupos (GS+SL+H) e (GS+H) apresentaram valores médios mais próximos ao controle, enquanto os grupos GS e GS+SL apresentaram medias mais elevadas. As concentrações séricas de HDL-C de cada um dos grupos de ratos alimentados com as dietas experimentais estão apresentados na Tabela 4. 45 Tabela 4 - Valores da média e desvio padrão para colesterol total (CT), l ipoproteína de alta densidade-colesterol (HDL-C) e tr igl icérides (TG) no soro sanguíneo em ratos alimentados com diferentes dietas. Valores seguidos de letras diferentes indicam diferenças signif icantes (p<0,05). Grupo controle(C), Grupo gordura saturada (GS), Grupo gordura saturada + suco de laranja (GS+SL), Grupo gordura saturada + hesperidina (GS+H), Grupo gordura saturada + suco de laranja + hesperidina (GS+SL+H). DIETAS CT (mg/dl) HDL-C (mg/dl) TG (mg/dl) C 62 ± 8 29 ± 6b 167 ± 62 GS 75 ± 10 40 ± 3ª 168 ± 45 GS+SL 76 ± 12 38 ± 6ª 182 ± 58 GS+H 68 ± 22 32 ± 6ab 200 ± 61 GS+SL+H 69 ± 12 36 ± 5ab 183 ± 71 As médias das concentrações séricas do CT para todos os grupos estão i lustradas na Figura 7. 46 Figura 7 - Valores médios ± desvios padrão do Colesterol Total no soro sanguíneo em ratos alimentados com as diferentes dietas experimentais. Grupo controle(C), Grupo gordura saturada (GS), Grupo gordura saturada + suco de laranja (GS+SL), Grupo gordura saturada + hesperidina (GS+H), Grupo gordura saturada + suco de laranja + hesperidina (GS+SL+H). A análise estatística dos dados de HDL-C mostrou diferenças signif icativas (p<0,05) entre o grupo (GS) em comparação com o grupo controle (C), demonstrando assim aumento do HDL-C nos ratos GS. Também foi observada diminuição do grupo (GS) quando comparado ao grupo (GS+H), em uma porcentagem de 20%. Os valores de HDL-C do grupo (GS+SL+H) foram 10% menores que os 47 do grupo (GS) e os valores do grupo (GS+SL) foram 5% menores quando comparados ao grupo (GS), como apresentado na Tabela 4 e Figura 8. Figura 8 - Valores médios ± desvios padrão para HDL-C no soro sanguíneo em ratos alimentados com as diferentes dietas experimentais. Grupo controle(C), Grupo gordura saturada (GS), Grupo gordura saturada + suco de laranja (GS+SL), Grupo gordura saturada + hesperidina (GS+H), Grupo gordura saturada + suco de laranja + hesperidina (GS+SL+H). Valores seguidos de letras iguais não diferem entre si, (p< 0,05). As concentrações séricas de tr igl icérides (TG) (mg/dl) dos animais submetidos às diferentes dietas experimentais estão 48 apresentados na Tabela 4. A análise estatística não mostrou diferenças signif icativas entre os grupos. As médias e o desvio padrão podem ser observados na Figura 9. Figura 9 - Valores médios ± desvios padrão para Trigl icérides no soro sanguíneo em ratos alimentados com as diferentes dietas experimentais. Grupo controle(C), Grupo gordura saturada (GS), Grupo gordura saturada + suco de laranja (GS+SL), Grupo gordura saturada + hesperidina (GS+H), Grupo gordura saturada + suco de laranja + hesperidina (GS+SL+H). 49 6. DISCUSSÃO 6.1. Efeito da hesperidina na evolução ponderal e índice de gordura víscero-somática O rato tem sido um animal experimental muito uti l izado nos vários estudos da ação dos flavonóides cítr icos no metabolismo l ipidico (MONFORTE et al., 1995; LEE et al., 1999; BOK et al., 1999; KIM et al., 2003). Seguindo este modelo da l i teratura, no presente estudo foi ut i l izado o rato como modelo experimental. Os animais experimentais deste estudo foram tratados com gordura saturada e não com colesterol dietético, como nos demais trabalhos encontrados na l i teratura (MONFORTE et al., 1995; LEE et al., 1999; BOK et al., 1999; KIM et al., 2003). A opção por este t ipo de tratamento dietético foi baseada na ação pronunciada que os ácidos graxos saturados apresentam sobre o metabolismo dos l ipídeos, maior do que o próprio colesterol dietético. Além disso, quando se uti l iza o colesterol dietético é necessário acrescentar ácido cólico na dieta para obter o efeito desejado, devido à dif iculdade natural do animal em absorver colesterol, o que não ocorre com os tr igl icérides, cuja biodisponibil idade é superior a 90% (ITOKAWA et al., 1973; MACHADO et al., 2003). Os resultados deste estudo mostraram que a dieta controle e as dietas experimentais com gordura saturada, suplementada ou não com hesperidina e suco de laranja, gerou ganho de peso 50 semelhante em todos os grupos experimentais, e levou ao armazenamento de maior quantidade de tecido adiposo apenas nos grupos experimentais. O período de tempo estudado e a quantidade de gordura saturada, entretanto, não foram suficientes para provocar alterações signif icativas no ganho de peso entre os grupos. Resultados similares aos apresentados foram observados em estudos anteriores nos quais não foi observada diferença signif icativa na ingestão do alimento, no ganho de peso, ou peso dos órgãos entre o grupo controle e os grupos experimentais (BOK et al., 1999; KIM et al., 2003). De acordo com os autores, o peso corporal e a ingestão do alimento não foram influenciados pela suplementação com hesperidina. Os resultados obtidos neste estudo mostraram que a gordura víscero-somática dos ratos do grupo hesperidina mais gordura saturada (GS+H) apresentou o maior índice de acúmulo de tecido adiposo (p 0,05). Ao contrário, os ratos submetidos à dieta com ácidos graxos saturados suplementada com hesperidina e suco de laranja (GS+SL+H) foram os que acumularam menos gordura víscero-somática e t iveram resultados mais próximos ao do grupo controle, assim como os demais grupos que não mostraram diferenças em relação ao controle. Assim, pudemos concluir que a hesperidina isolada não afeito o ganho de peso e sim no índice de gordura víscer- somática. 51 Em estudo com ratos alimentados com uma dieta elevada em colesterol (1%) e suplementados com hesperit ina (0,02%), ácido m-hidroxicinámico (m-HC), ácido 3,4-dihidroxi-fenilpropiónico (3,4- DHPP), e ácido 3-metoxi-4-hidroxi-cinámico ou ou ácido ferúlico, não foram observadas diferenças signif icativa no ganho de peso, na ingestão alimentar e no peso dos órgãos entre os grupos experimentais (KIM et al., 2003) Da mesma forma, os resultados de Kurowska e Manthey (2004), em dois estudos nos quais os f lavonóides foram administrados a hamsters, monstraram nenhum efeito no peso corporal, no consumo alimentar e ou eficiência alimentar, que representa a relação entre o nutr iente ingerido e o ganho de peso. 52 6.2. Efeito da hesperidina no perfil lipídico de ratos tratados com ácidos graxos saturados Estudos anteriores demonstraram a influência dos ácidos graxos saturados no aumento das concentrações de colesterol sérico e no desenvolvimento da aterosclerose (GRUNDY & DENKE, 1990). Entre os ácidos graxos saturados, os ácidos graxos láurico, mirístico e palmítico são responsáveis pelo efeito hipercolesterolêmico (KEYS et al. 1965), mas ácidos graxos com menos de doze carbonos e o ácido esteárico tem pequeno ou nenhum efeito no colesterol sérico no homem (BAUDET et al., 1984; REISER et al., 1985). Outros pesquisadores obtiveram efeito hipercolesterolêmico em ratos uti l izando dietas com misturas de tr igl icerídios saturados e insaturados, sem adição de colesterol (CLIFFORD et al., 1986). Esta pesquisa pretendeu verif icar se a hesperidina atua em oposição ao efeito dos ácidos graxos saturados, auxil iando na redução do colesterol sérico mesmo na vigência de uma dieta rica em gordura saturada. Esta abordagem pode ser vista como um aspecto inovador frente aos trabalhos já publicados sobre o efeito do colesterol dietético, pois estudou os efeitos da hesperidina na hipercolesterolemia causada por consumo de trigl icérides. No homem, os tr igl icérides do plasma têm sido associados ao risco de doenças arterial coronária (DAC), devido às alterações que eles causam na composição das l ipoproteínas, tais como 53 diminuição no teor de HDL-C, aumento dos quilomicrons e remanescentes de VLDL, e ainda o aparecimento de LDL pequena e densa, que é mais aterogênica (GRUNDY & DENKE, 1990; CASTELLI, 1986). A inter-relação entre os tr igl icérides e o metabolismo das HDL parece ser regulada em parte pela ação da lípase l ipoprotéica no homem (LEFEVRE & SCHNEEMAN, 1984). No presente estudo não foi identif icado a modificação na concentração dos tr igl icérides séricos quando os ratos foram tratados com gordura e/ou hesperidina na concentração de 25mg/L, isolada ou adicionada de suco de laranja. Este resultado foi similar a estudos anteriores nos quais também não se observou efeito sobre os tr igl icérides em ratos com a ingestão de 0,1 até 1,0% de hesperidina (BOK et al., 1999; LEE et al., 1999). A ação especif ica de ácidos graxos saturados e insaturados no rato foi estudada por Kris-Etherton (1984). Segundo este autor em ratos tratados com óleo de palma, que contem cerca de 44% de ácido palmítico e 5% de ácido esteárico, não houve modificação do teor de colesterol total e do colesterol de quilomicrons, VLDL, LDL e HDL, quando comparados a outras fontes de ácidos graxos, como o óleo de açafrão, óleo de milho e óleo de oliva. Resultados semelhantes foram descritos por Ney et al. (1991). O estudo do tamanho e da composição de HDL no rato sob diferentes tratamentos com gorduras saturadas mostrou que o óleo de palma afetou o colesterol plasmático total de forma semelhante 54 a outras fontes de gorduras, como o óleo de milho, a manteiga, gordura de carne e óleo de coco (NEY et al., 1991). Foi mostrado ainda que o óleo de palma aumentou o colesterol de HDL em comparação com o óleo de milho, mas reduziu signif icantemente o teor de apo AI da HDL. Estes resultados sugerem que sob o efeito do óleo de palma, as partículas de HDL carregavam maior proporção de colesterol no seu núcleo l ipídico, como HDL enriquecidas com colesterol, embora não apresentaram aumento signif icante no número de partículas de HDL2. À luz destes conhecimentos, os resultados obtidos no estudo atual mostraram que no rato submetido ao tratamento com uma mistura de óleo de palma (90%) e óleo de soja (10%) não houve alteração do colesterol total. Todavia, no rato tratado com óleo de palma e hesperidina houve uma redução signif icativa do teor de colesterol da HDL, com tendência às concentrações normais dos animais controle. Já no rato tratado com o suco de laranja isolado que contem uma quantidade mais l imitada de hesperidina, não houve efeito reparador as concentrações de HDL, enquanto nos animais suplementados com hesperidina e suco de laranja, o efeito foi intermediário. Em ratos tratados com colesterol dietético foi verif icado que a composição e o metabolismo das HDL foi bastante modificado, e que estas alterações foram relacionadas ao metabolismo dos quilomicrons (DE LAMATRE et al., 1982). No homem, a 55 composição da HDL parece ser relacionada ao metabolismo dos tr igl icérides. Após a l ipólise dos quilomicrons e VLDL pela lípase l ipoprotéica, os fosfolipídios e apolipoproteínas são captados pela HDL, que modifica sua densidade (de HDL3 para HDL2) (TALL et al., 1979; CHAJECK & EISENBERG, 1978). As proporções relativas destas subtrações de HDL estão relacionadas à taxa de catabolismo dos tr igl icérides (TASKINEN et al., 1982). Segundo Lefevre & Schneeman (1984), a correlação negativa entre os níveis de tr igl icérides plasmáticos e a razão HDL-C/Apo AI, sugere uma relação entre a composição e tamanho da HDL e a l ipólise das l ipoproteínas ricas em trigl icérides, o que é verdadeiro também no rato. A HDL atua como um reservatório de apo C transferindo estas apos para o quilomicron e VLDL durante a absorção de gordura, e alterando seu conteúdo da HDL pelas trocas entre as l ipoproteínas durante e após a l ipólise. No plasma dos ratos, quase todas as VLDL, após hidrólise, são removidas da circulação via receptores hepáticos B/E e poucas partículas dão origem às LDL, que também são removidas preferencialmente pelo fígado (HAVEL, 1984). Estudos metabólicos têm verif icado que no rato o transporte e a distribuição do colesterol para os tecidos são feitos basicamente pelas HDL (INNERARITY et al., 1980; MAHLEY e INNERARITY, 1983; GROENER et al., 1989; KADOWAKI et al., 1992). 56 Assim, o efeito redutor da hesperidina sobre o colesterol de HDL (-20%) no rato tratado com óleo de palma, sugere uma ação reparadora deste composto aos níveis anteriores ao tratamento com ácidos graxos saturados. Havendo uma tendência a uma menor quantidade de colesterol circulante, haverá uma menor concentração de HDL-C, que no rato é a l ipoproteína que faz o transporte do colesterol para os órgãos do corpo, assemelhando- se, portanto ao papel da LDL-C no homem (GROENER et al., 1989; KADOWAKI et al., 1992). 57 7. CONCLUSOES A hesperidina não afetou o peso corporal de ratos tratados com ácidos graxos saturados, mas aumentou a porcentagem de tecido adiposo nos animais e elevou o índice de gordura víscer- somática. A hesperidina reduziu o colesterol de HDL no rato tratado com óleo de palma, sugerindo uma ação reparadora deste composto sobre as concentrações de HDL-C. 58 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. AOAC. Official methods of analysis. 16th . ed. Washington, DF, 1995. v.2. ALIMENTOS funcionais. O maravilhoso mundo dos nutracêuticos. Aditivos e Ingredientes, n17, p.38-56, 2001. AMEER, B.; WEINTRAUB, R. A.; JOHNSON, J.V.; YOST, R.A.; ROUSEFF, R.L. Flavone absorption after naringin, hesperidin, and citrus administration. Clin. Pharmacol. Ther . , v. 60, p. 34-40, 1996. ANDAULER, W.; STEHLE, P.; FÜRST, P. Chermo prevention: a novel approach in dietetics. Curr. Opi. Clinic Metabolic Care., v.1, p. 539-547, 1998. BAUDET, M. F.; DACHET, C.; LASSERRE, M.; ESTEVA, O.; JACOTOT, B. Modification in the composit ion and metabolic properties of human low density and high density l ipoproteins by different dietary fats. J. Lipid Res., v.25, p.456-468, 1984. BOK, S.H. 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Seus va l o re s d i á r i o s podem se r ma io re s ou meno re s dependendo de suas ne ce ss i d ade s ene rgé t i ca s . ( ** ) Va l o re s D i á r i o s de r e f e renc i a não e s t abe l e c i do s . mento 1 parte de Lanjal Sem Açúcar + 6 Partes de Água. o 1 parte de Lanjal Sem Açúcar + 9 Partes de Água. dologia Quality Control Manual for Citrus Processing Plants , Refratometria, Densimetria, etria, Contagem Padrão em Placas. agem as BOPP Auto-adesivas ou Silk Screen com as informações: Nome do produto, Data de ão, Validade, Número do lote e todas as informações exigidas pela legislação. 70 Qualidade rigorosamente natural isento de qualquer aditivo químico como: Conservantes, Estabilizantes, ntes, Emulsificantes, Corantes artificiais, etc. Recebimento e qualquer suspeita que comprometa a qualidade do produto, recomendamos a recusar o Registros MAPA 00204 00063-3 Responsável Técnico: Izaias Oliveira dos Santos – CRQ-IV 04435920 IMPLANTAÇÃO MPLEMENTAÇÃO A D O P O R : A D O P O R : D O P O R : E N T A D O P O R : “Assinatura somente no documento original” 71 Anexo 3 CAPA FOLHA DE ROSTO EPÍGRAFE DEDICATÓRIA AGRADECIMENTOS RESUMO ABSTRACT LISTA DE TABELAS LISTA DE QUADROS LISTA DE ANEXOS LISTA DE FIGURAS LISTA DE ABREVIATURAS SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO 2. REVISÃO DA LITERATURA 3. OBJETIVO GERAL 4. MATERIAL E MÉTODOS 5. RESULTADOS 6. DISCUSSÃO 7. CONCLUSÕES 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANEXOS