UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA RECUPERAÇÃO ENZIMÁTICA NA PRODUÇÃO DE ETANOL 2G: UM ESTUDO SOBRE CAPACIDADE DE ADSORÇÃO ENTRE LIGNOCRESOL E CELULASES. MARIANA TERESA BARDUCO FERREIRA Botucatu 2019 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA RECUPERAÇÃO ENZIMÁTICA NA PRODUÇÃO DE ETANOL 2G: UM ESTUDO SOBRE CAPACIDADE DE ADSORÇÃO ENTRE LIGNOCRESOL E CELULASES. Mariana Teresa Barduco Ferreira Doutoranda Prof. Dr. Mario de Oliveira Neto Orientador Botucatu 2019 Tese apresentada ao Instituto de Biociências, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista, para obtenção do título de Doutora no Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Palavras-chave: Enzimas; Lignina; Lignocresol; Recuperação enzimática. Ferreira, Mariana Teresa Barduco. Recuperação enzimática na produção de etanol 2g : um estudo sobre capacidade de adsorção entre lignocresol e celulases / Mariana Teresa Barduco Ferreira. - Botucatu, 2019 Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", Instituto de Biociências de Botucatu Orientador: Mario de Oliveira Neto Capes: 90400003 1. Enzimas. 2. Lignina. 3. Energia - Fontes alternativas. DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CÂMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: LUCIANA PIZZANI-CRB 8/6772 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. TRATAMENTO DA INFORM. MARIANA TERESA BARDUCO FERREIRA RECUPERAÇÃO ENZIMÁTICA NA PRODUÇÃO DE ETANOL 2G: UM ESTUDO SOBRE CAPACIDADE DE ADSORÇÃO ENTRE LIGNOCRESOL E CELULASES. BANCA EXAMINADORA Prof. Dr.Mario de Oliveira Neto UNESP- Botucatu Orientador Prof. Dra.Carla dos Santos Riccardi UNESP-Botucatu Prof.Dra. Sarita Cândida Rabelo UNESP-Botucatu Prof.Dr. Joel Mesa Hormaza UNESP-Botucatu Dra. Daniele Fernanda Chiarelli Gonçalves Botucatu 2019 Tese apresentada ao Instituto de Biociências, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista, para obtenção do título de Doutora no Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Dedico este trabalho: Aos meus pais, Neusa e José Marcio e a minha sobrinha, Maria Luiza. Agradecimentos À Deus, sem Ele eu nada seria obrigada por me amparar e por me permitir chegar até aqui; Aos meus pais, Neusa e José Marcio, por estarem sempre ao meu lado, me inspirando, orientando e pelo apoio incondicional em todas as decisões da minha vida; Ao meu irmão Marcio por todo apoio, incentivo e carinho; À minha sobrinha Maria Luiza por alegrar os meus dias mesmo distante; Ao meu orientador, Prof. Dr. Mario de Oliveira Neto pela oportunidade, confiança e orientação; À minha família, tios e primos que me acolheram e me apoiaram ao longo dessa caminhada; Aos amigos, que mesmo distantes, sempre me ouviram, aconselharam e apoiaram; Aos amigos que Botucatu me deu, que foram uma verdadeira família, sou muito grata por ter encontrado vocês, obrigada por toda a ajuda e bons momentos compartilhados; À amiga Karine Kettener, por todo o apoio e amizade; Aos colegas de laboratório, Mariana, Lucas, Manoel e Guto; Ao Thiago Zuccari por toda ajuda no desenvolvimento desse trabalho e pela amizade; Ao técnico Alex Basseto por todo suporte e amizade; Aos membros da banca, os Profs Dr.Joel Hormaza, Dra.Daniele Chiarelli, Dra.Sarita Rabelo e Dra.Carla dos Santos Riccardi pela atenção e disponibilidade em compartilhar seus conhecimentos; To Dr. Michael Ladisch and Dr. Eduardo Ximenes for opportunity and all support. To LORRE team. A special thank you to David Orrego, Daehwan Kim, Vanessa Molina, Jonathan Overton, and Pablo Vega; Ao Dr. Antonio Santos por toda a ajuda no desenvolvimento do trabalho e pela amizade; À Raquel Peron pela ajuda no dia a dia em um país estrangeiro e pela amizade que construímos; Aos amigos brasileiros de Purdue, Talita, Victor Hugo, Allyne, Pedro, Renato e Doug pela amizade e pelos momentos compartilhados; Aos amigos da Pós-Graduação; A todos os professores da Pós-Graduação em Biotecnologia pelos ensinamentos compartilhados; O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento PDSE –Processo 88881.135961/2016-01); A todos dos Departamento de Física e Biofísica; À Seção de Pós-Graduação pela dedicação no atendimento; A todos que de alguma maneira contribuíram para o desenvolvimento dessa pesquisa. Muito Obrigada! Lista de Figuras Capítulo 1: Considerações Gerais Figura 1: Esquema da composição do material lignocelulósico...............................................19 Figura 2: Monômeros fenólicos (unidades de fenilpropeno) precursores da lignina...............21 Figura 3: Ação das celulases.....................................................................................................25 Figura 4: Modelo esquemático do Sistema de Separação de fases...........................................32 Figura 5: Fluxograma do processo de recuperação enzimática utilizando lignocresol...........33 Capítulo 2: Capacidade de adsorção de β-glicosidases em lignocresol visando a reciclagem enzimática em bioprocessos. Figura 1: Modelos tridimensionais das β-glucosidases...........................................................54 Figura 2: Esquema do processo de obtenção do lignocresol...................................................56 Figura 3: Fluxograma do processo de adsorção......................................................................56 Figura 4: Ajuste linear aos pontos de absorbância encontrados para concentrações de BSA (R² ajustado de 0,99962) ................................................................................................................59 Figura 5: Curva padrão baseada na relação entre concentração de p-nitrophenol (mM) e absorbância.............................................................................................................................60 Figura 6: Início da separação de fases após adição de ácido sulfúrico.................................62 Figura 7: Resultado da primeira centrifugação da síntese de lignocresol.............................62 Figura 8: Pipetagem gota a gota da fase orgânica (1ª centrifugação) em éter etílico...........63 Figura 9: Resultado da segunda centrifugação da síntese de lignocresol..............................63 Figura 10: Redução da amostra por Rotaevaporador em banho maria................................64 Figura 11: Lignocresol após secagem em estufa................................................................64 Figura 12: Porcentagem de TpBgl1 (GH1) e TpBgl3 (GH3) adsorvida para diferentes concentrações iniciais de lignocresol e lignina não modificada.............................................66 Figura 13: Potencial Zeta do lignocresol (LC) e lignina (LG) em função do pH.................68 Figura 14: Modelo esquemático da interação entre o lignocresol e lignina com as β- glicosidases.............................................................................................................................69 Figura 15: Avaliação a capacidade de adsorção de TpBgl1 e TpBgl3 em lignocresol na presença de glicose + CMC.....................................................................................................69 Figura 16: Efeito do efeito de adsorção na atividade enzimática das β-glicosidases............70 Capítulo 3: Capacidade de Adsorção e Funcionalidade de Celulases adsorvidas em Lignocresol Figura 1: Adsorção de celulases pelo lignocresol....................................................................83 Figura 2: Estabilidade do complexo lignocresol-celulase.......................................................84 Figura 3: Sacarificação por papel de filtro..............................................................................85 Capítulo 4: Avaliação da capacidade de adsorção de lignocresol proveniente de bagaço de cana-de-açúcar Figura 1: Adsorção de celulases em lignocresol proveniente de cana-de-açúcar...................96 Lista de Tabelas Capítulo 1. Considerações gerais Tabela 1. Vantagens e desvantagens dos métodos de reciclagem enzimática .......................29 Capítulo 2: Capacidade de adsorção de β-glicosidases em lignocresol visando a reciclagem enzimática em bioprocessos. Tabela 1: Absorbâncias para concentrações de BSA (mg/mL) ............................................58 Tabela 2: Diluições para o prepararo da curva padrão.........................................................60 Capítulo 4: Avaliação da capacidade de adsorção de lignocresol proveniente de bagaço de cana-de-açúcar Tabela 1:Resultado Hidrólise Enzimática..............................................................................97 Lista de abreviações BSA: Soro albumina Bovina CBM:Módulo de ligação ao carboidrato FES: Fermentação em estado sólido FSeq:Fermentação sequencial FSm: Fermentação submersa LC: Lignocresol LG: Lignina pI: Ponto Isóeletrico TpBgl1: β-glucosidades da família GH1 TpBgl3: β-glucosidades da família GH3 Resumo A busca por fontes de energias renováveis vêm ganhando cada vez mais importância, pois, com a eminente escassez dos combustíveis fósseis, que são as principais fontes energéticas utilizadas mundialmente e ao mesmo tempo com os problemas ambientais causados por esses combustíveis, o etanol de segunda geração (2G) surge como uma alternativa de energia renovável já que é obtido a partir de biomassa lignocelulósica. Entretanto, as tecnologias para a conversão desta biomassa em açúcares fermentáveis ainda possuem fatores limitantes. Um dos grandes problemas do processo de obtenção do etanol 2G está relacionado ao custo das enzimas celulolíticas. Sendo assim, desenvolver estratégias para a recuperação dessas enzimas é necessário para assegurar a viabilidade econômica do processo de conversão de biomassa. Diversas técnicas estão sendo estudadas e colocadas em prática para promover a recuperação, reciclagem e imobilização enzimática. Entretanto, nenhuma das metodologias utilizadas demonstram, de maneira geral, alta eficiência, custo baixo, rapidez e manutenção da atividade enzimática. A partir da lignina, subproduto da indústria de papel e celulose, pode-se sintetizar o lignocresol. Este, apresenta grandes expectativas de interação enzimática uma vez que apresenta características físico-químicas favoráveis à adsorção. Frente a isto, propusemos a produção deste composto para promover a interação com enzimas para promover recuperação enzimática. A síntese de lignocresol, oriundo da lignina Kraft de Pinus spp., foi feita pela adaptação à metodologia do sistema de separação de fases. Nesse processo, mais especificamente na primeira fase, a madeira é solvatada com o p-cresol (derivado do fenol) para evitar o ataque do ácido concentrado a lignina e assim ela não se dissolver. Desse modo, apenas os carboidratos são dissolvidos pelo ácido concentrado na segunda fase. Para obtenção do complexo, foram realizadas duas suspensões de lignocresol em tampão citrato de sódio (50 mM), ambas com concentração fixa 10 mg/mL. Ensaios de adsorção foram realizados entre o lignocresol e β-glicosidases (TpBgl1 e TpBgl3), e o coquetel enzimático Cellic Ctec 3 (Novozymes). Em relação a adsorção das β-glicosidases, os resultados encontrados demonstram grande adsorção (100-90%) do lignocresol para com TpBgl1 e TpBgl3, em concentrações inferiores à 0,25 e 0,40 mg/mL, respectivamente. Ensaios de adsorção utilizando somente a lignina apresentaram resultados muito inferiores aos de lignocresol, comparados também em concentrações inferiores como demonstradas anteriormente, sendo ausente adsorção de lignina à TpBgl1 e adsorção de lignina à TpBgl3 de 70-50%. Os ensaios de ELS, demonstraram que lignocresol e lignina apresentam potencial-zeta (mV) negativo entre a faixa de pH 4-7. Vale ressaltar que, entre o pH 5-7, o lignocresol apresenta valores maiores negativamente se comparado à lignina. A adsorção do lignocresol proveniente da lignina Kraft com o coquetel Cellic Ctec 3 foi eficiente, a celulase foi efetivamente imobilizada pelo lignocresol. O desempenho da hidrólise enzimática de celulases imobilizadas em lignocresol é de aproximadamente 33% em relação ao da celulase livre na conversão de açúcares. A celulase manteve uma atividade residual após a adsorção em lignocresol. A estabilidade do complexo celulase de lignocresol também foi testada e a atividade foi mantida a partir da formação do complexo. Portanto, todos estes resultados mostram boa adsorção do lignocresol às enzimas, demonstrando que o lignocresol pode ser utilizado como suporte para recuperação enzimática, sendo uma alternativa para redução dos custos na produção de etanol 2G. Palavras-Chave: Recuperação enzimática. Lignina.Lignocresol. Enzimas. Abstract The search for renewable energy sources is gaining increasing importance because, with the imminent shortage of fossil fuels, which are the main energy sources used worldwide and at the same time with the environmental problems caused by these fuels, second-generation ethanol (2G) arises as a renewable energy alternative since it is obtained from lignocellulosic biomass. However, the technologies for the conversion of this biomass to fermentable sugars still have limiting factors. One of the major problems in the process of obtaining 2G ethanol is related to the cost of cellulolytic enzymes. Thus, developing strategies for the recovery of these enzymes is necessary to ensure the economic viability of the biomass conversion process. Several techniques are being studied and put into practice to promote recovery, recycling, and enzymatic immobilization. However, none of the methodologies used shows, in general, high efficiency, low cost, fastness and maintenance of the enzymatic activity. From lignin, a byproduct of the pulp and paper industry, lignocresol can be synthesized. This one presents high expectations of enzymatic interaction since it presents physicochemical characteristics favorable to the adsorption. In view of this, we proposed the production of this compound to promote interaction with enzymes to promote enzymatic recovery. The lignocresol synthesis from Pinus spp. Kraft lignin was made by adapting to the phase separation system methodology. In this process, more specifically in the first step, the wood is solvated with the p-cresol (phenol derivative) to avoid the attack of the concentrated acid on the lignin and so it does not dissolve. Thus, only the carbohydrates are dissolved by the acid concentration in the second phase. To obtain the complex, two lignocresol suspensions were made in sodium citrate buffer (50 mM), both with fixed concentration 10 mg / mL. Adsorption assays were performed between lignocresol and β-glycosidases (TpBgl1 and TpBgl3), and the enzymatic cocktail Cellic Ctec 3 (Novozymes). Regarding the adsorption of the β-glycosidases, the results showed high adsorption (100-90%) of lignocresol to TpBgl1 and TpBgl3, at concentrations below 0.25 and 0.40 mg / mL, respectively. Adsorption tests using lignin alone showed much lower results than lignocresol, also compared at lower concentrations as demonstrated previously, absent adsorption of lignin to TpBgl1 and adsorption of lignin to TpBgl3 of 70-50%. The ELS tests showed that lignocresol and lignin present negative zeta potential (mV) between pH range 4-7. It is worth mentioning that, between pH 5-7, lignocresol presents higher values negatively when compared to lignin. The adsorption of lignocresol from Kraft lignin with Cellic Ctec 3 cocktail was efficient, cellulase was effectively immobilized by lignocresol. The performance of the enzymatic hydrolysis of immobilized cellulases in lignocresol is approximately 33% in relation to that of free cellulase in the conversion of sugars. Cellulase was active even after adsorption on lignocresol. The stability of the lignocresol cellulase complex was also tested and activity was maintained from the complex formation. Therefore, all these results show good adsorption of lignocresol to the enzymes, demonstrating that lignocresol can be used as support for enzymatic recovery, being an alternative to reduce costs in the production of 2G ethanol. Keywords: Enzymatic Recycling:Lignin:Lignocresol; Enzymes Sumário Capítulo 1 ................................................................................................................................. 15 Considerações Gerais ............................................................................................................ 15 1.Introdução....................................................................................................................... 16 2. Objetivos ....................................................................................................................... 18 3. Revisão de Literatura ........................................................................................................ 19 3.1. Material lignocelulósico ............................................................................................. 19 3.2. Lignina ....................................................................................................................... 20 3.3 Enzimas ....................................................................................................................... 23 3. 4 Reciclagem enzimática ............................................................................................... 28 3.5 Lignocresol .................................................................................................................. 31 4. Referências Bibliográficas ............................................................................................ 34 Capítulo 2 ................................................................................................................................. 51 Capacidade de adsorção de β-glicosidases em lignocresol visando reciclagem enzimática. 51 1. Introdução...................................................................................................................... 53 2.Métodologia ................................................................................................................... 55 3.Resultados e Discussão .................................................................................................. 61 4.Conclusão ....................................................................................................................... 71 5. Referências Bibliográficas ............................................................................................ 72 Capítulo 3 ................................................................................................................................. 76 Capacidade de Adsorção e Funcionalidade de Celulases adsorvidas em Lignocresol ......... 76 1.Introdução....................................................................................................................... 78 2. Metodologia .................................................................................................................. 79 3.Resultados e Discussão .................................................................................................. 81 4.Conclusão ....................................................................................................................... 86 5. Referências Bibliograficas ............................................................................................ 87 Capítulo 4 ................................................................................................................................. 91 Avaliação da capacidade de adsorção de lignocresol proveniente de bagaço de cana-de- açúcar. ................................................................................................................................... 91 1.Introdução....................................................................................................................... 92 2..Metodologia .................................................................................................................. 94 3.Resultados e Discussão....................................................................................................94 4.Conclusões.......................................................................................................................... 5.Referencias Bibliográficas................................................................................................... Capítulo 5 ............................................................................................................................... 100 14 Estrutura da Tese A tese foi dividida em cinco capítulos, sendo: • Capítulo 1 - Considerações Gerais: Contendo a revisão bibliográfica, a introdução e os objetivos gerais e específicos de todo o trabalho; • Capítulo 2 – Capacidade de adsorção de β-glicosidases em lignocresol visando a reciclagem enzimática em etanol 2G: Teve como objetivo a síntese de lignocresol a partir da lignina obtida do licor negro proveniente de Pinus spp, para promoção da adsorção enzimática entre o lignocresol e β-glucosidades da família GH1(TpBgl1 e TpBgl3), para a formação de um complexo lignocresol-enzima, visando a reciclagem enzimática na produção de etanol 2G. • Capítulo 3 - Capacidade de Adsorção e Funcionalidade de Celulases adsorvidas em Lignocresol: Teve como objetivo o estudo entre a adsorção do lignocresol com o complexo enzimático Cellic Ctec 3. Verficamos a adsorção das enzimas ao lignocreol e atividade enzimática do complexo lignocresol-celulases. • Capítulo 4- Avaliação da capacidade de adsorção de lignocresol proveniente de bagaço de cana-de-açúcar.Referente ao período sanduíche realizado no Laboratory of Renewable Resources Engineering (LORRE) – Purdue University, sob a orientação do Prof. Dr. Michael Ladisch e Prof. Dr. Eduardo Ximenes. • Capítulo 5 – Conclusões Finais. 15 Capítulo 1 Considerações Gerais 16 1.Introdução Com os avanços industriais e aumento da população, o consumo de energia no mundo vem aumentando continuamente. Sendo assim, o uso indiscriminado de combustíveis fósseis, como petróleo e carvão, poderá futuramente se esgotar. Com isso, existe uma necessidade de utilização de fontes de energia sustentáveis. Os produtos lignocelulósicos, como biomassa de plantas, são recursos potenciais para a substituição desses combustíveis. Nos últimos anos, observa-se um crescente interesse na utilização de material lignocelulósico como fonte de energia renovável, como o etanol de segunda geração (2G), por exemplo (NAGAMATSU; FUNOAKA, 2003). Os materiais lignocelulósicos são predominantemente compostos por lignina, celulose e hemiceluloses. O material lignocelulósico é bastante vantajoso pois além de ser uma fonte de energia renovável, e favorável para o meio ambiente , não é utilizado para a alimentação humana, ou seja , não compete com a agricultura voltada para esta finalidade, e pode ser encontrado em grandes quantidades , como em resíduos agrícolas e florestais e a baixo custo ( SANTIAGO & RODRIGUES, 2017; GHATAK, 2011). Porém esse material tem uma estrutura complexa e compacta e precisa de pré- tratamentos que auxiliam principalmente na retirada da lignina e hemicelulose, permitindo a diminuição da cristalinidade e aumento da porosidade do material, permitindo que a celulose se torne apta à hidrólise enzimática (UNICA, 2017). Existem duas principais vias pelas quais é possível quebrar as ligações da celulose, são hidrólise ácida e a enzimática. Os processos ácidos são eficientes e mais baratos mas geram vários subprodutos indesejáveis . Essa desvantagem ocorre pela degradação de uma parte da glicose, da fração hemicelulósica e da lignina, além disso, em alguns casos, é necessário o uso de altas temperaturas e/ou pressões (RABELO, 2007; PEREIRA, 2019). Sendo assim, hidrólise enzimática é um processo promissor para a bioconversão do material lignocelulósico pois proporciona maiores rendimentos e é feita a pressão ambiente, sem formação de subprodutos inibidores da fermentação (RABELO, 2007). No entanto, mesmo com esse processo sendo favorável economicamente ainda existem algumas limitações econômicas e tecnológicas, como o alto custo das enzimas utilizadas na conversão da biomassa em açúcares fermentescíveis (FLORENCIO et al., 2017). As enzimas chamadas de celulases ou enzimas celulolíticas, que são , Endo-1,4-beta-D- glucanase (E.C.3.2.1.4), Exo-1,4-beta-D-glucanase (E.C.3.2.1.176) ,Exo-1,4-beta-D- glucanase (E.C.3.2.1.91) e β-glucosidase (E.C.3.2.1.21) hidrolisam o material lignocelulósico agindo sinergicamente no polímero de celulose e são produzidas geralmente por uma grande 17 variedade de bactérias, fungos, anaeróbios e aeróbios, mesófilos e termófilos via fermentação submersa (SmF) (FLORENCIO et al., 2017; JUTURU, WU et al., 2014). Porém, alguns parâmetros devem ser considerados. Como tipo e concentração de fontes de carbono, nitrogênio e fósforo, pH, umidade e temperatura pois representam variáveis operacionais determinantes no processo de fermentação (SINGHANIA et. al., 2010). Recentemente, empresas estão desenvolvendo processos de obtenção de celulases a partir de organismos geneticamente modificados (OGMs), mas o processo de desenvolvimento ainda está em escala de bancada devido ao alto custo de produção (BHALLA et al., 2013; SRIVASTAVA et al., 2018). Assim, diversos estudos têm buscado alternativas para diminuir os custos desses biocatalizadores. O uso de técnicas para a reutilização das celulases é interessante porque possibilita o reuso das enzimas, e como consequência diminui os custos do processo de obtenção dos açúcares fermentescíveis. Existem várias técnicas sendo propostas, uma das mais utilizadas industrialmente para este fim consiste, de modo geral, em separação de membrana, cujo processo pode ser por micro-filtração, ultra-filtração, nano-filtração e osmose reversa (SZÉPÁL et al., 2013). Entretanto, segundo Echavarría et al. (2012), um dos principais problemas nas aplicações práticas da filtração por membrana é a redução do fluxo de permeado ao longo do tempo, causada pelo acúmulo de componentes na estrutura porosa da membrana, interação química entre solutos e material de membrana e crescimento bacteriano. Estes empecilhos levam a uma queda no fluxo através da membrana, tornando o processo de recuperação ineficiente em certos momentos. A aplicação de metodologias por HPLC também consiste em práticas para promover a recuperação enzimática, mas, notoriamente, representam um processo custoso e demorado (HEROLD et al., 1991). Sendo assim, uma alternativa proposta para solucionar esse problema consiste no desenvolvimento de uma metodologia a partir do material lignocelulósico. Esse material é um recurso importante para a biorrefinaria de combustíveis, produtos químicos e materiais de base biológica (GANDLA et al., 2018). As matérias-primas do material lignocelulósico incluem culturas energéticas, madeira e resíduos agrícolas (palha de cana, palha de milho, bagaço de cana, mandioca, etc.) (MENG & RAGAUSKAS, 2014). Dos três macrocomponentes lignocelulósicos, celulose, hemiceluloses, a lignina é um ponto limitante na sacarificação enzimática da celulose, pois diminui a acessibilidade das enzimas hidrolíticas às fibras celulósicas (PALONEN et al., 2004; AKIMKULOVA et al., 2016; QIN et al., 2016). Esse processo chamado adsorção improdutiva, ocorre por 18 hidrofobicidade, ligação eletrostática ou ligação de hidrogênio (NAKAGAME et al.,2011; LOU et al., 2013). Entretanto, podemos utilizar a adsorção improdutiva como um ponto positivo, principalmente, pela elevada afinidade com biopolímeros, devido ao seu caráter hidrofóbico, que consegue se ligar a essas enzimas (NAGAMATSU; FUNAOKA, 2003). A partir de lignina, pode-se obter o lignocresol, que é composto por unidades de 1,1-bis(aril)propano, que preserva características da lignina (MIKAME; FUNAOKA, 2006). Este composto é sintetizado utilizando o sistema de separação de fases, que consiste basicamente na utilização de um ácido concentrado e um derivado de fenol (FUNAOKA; ABE, 1989; FUNAOKA et al., 1995; FUNAOKA, 1998; NAGAMATSU e FUNAOKA, 2003; FUNAOKA, 2013). O lignocresol se torna uma alternativa para contornar tais problemáticas, pois possui alta capacidade de adsorver enzimas, se tornando um método promissor para a diminuição dos custos na produção de etanol 2G (FUNAOKA; ABE, 1989; FUNAOKA,1998). Dessa forma este trabalho procurou estudar a adsorção do lignocresol proveniente da lignina Kraft sobre β-glicosidases purificadas e celulases de um dos principais coquetéis enzimáticos comerciais utilizados no processo de hidrólise do material lignocelulósico e verificar a capacidade de adsorção e funcionalidade dessas enzimas após a interação com o lignocresol. 2. Objetivos Sintetizar uma solução de lignocresol, que possui alta afinidade com enzimas, a partir do liquor negro proveniente de Pinus spp. e promover uma adsorção enzimática entre o lignocresol e celulases, visando a recuperação enzimática na produção de etanol 2G. 2.2 Objetivos específicos • Obter lignocresol através do método de separação de fases; • Avaliar a interação entre o lignocresol e β-glicosidases (TpBgl1 e TpBgl3) de Thermotoga petrophila; • Avaliar a interação entre o lignocresol e do coquetel enzimático Cellic CTec3; • Verificar possíveis diferenças na adsorção do lignocresol e de lignina não modificada com as β-glicosidases (TpBgl1 e TpBgl3); • Pesquisar possíveis diferenças na adsorção do lignocresol e de lignina não modificada e do coquetel enzimático Cellic CTec3; 19 • Avaliar possíveis efeitos inibitórios de glicose no meio reacional sobre a adsorção das β-glicosidases (TpBgl1 e TpBgl3) no lignocresol; • Avaliar a atividade enzimática do complexo lignocresol- β-glicosidases; • Investigar a estabilidade do complexo lignocresol-celulases; • Avaliar a sacarificação enzimática do complexo lignocresol-celulases. 3. Revisão de Literatura 3.1. Material lignocelulósico Todo recurso renovável proveniente da matéria orgânica, vegetal ou animal é definido como biomassa, e é utilizada para produção de energia e produtos quimícos.. A biomassa lignocelulósica consiste principalmente de celulose, hemiceluloses, lignina e algumas quantidades menores de pectina, cinzas, proteínas e extrativos (Figura 1). Porém a composição não é exata, já que depende do material botânico de origem, das condições de crescimento, da parte da planta escolhida, da idade de colheita, entre outras circunstâncias (RAGAUSKAS et al., 2014; SCHELLER; ULVSKOV,2010; SANTOS et al., 2012). Figura 1. Esquema da composição do material lignocelulósico (Adaptado de Volynets et al.,2017) 20 A celulose é o principal constituinte do material lignocelulósico, é um polissacarídeo que consiste em uma cadeia linear de D-glicose ligada por ligações β- (1,4) -glicosídicas entre si. Fibras de celulose são ligadas umas às outras por de ligações de hidrogênio intra e intermoleculares (FENGEL; WEGENER,1989). Portanto, a celulose é insolúvel em água e a maioria dos solventes orgânicos (Figura 1) (CIOLACU et al.,2011). Hemiceluloses, estão localizadas nas paredes celulares secundárias, são macromoléculas ramificadas heterogêneas contendo pentoses (β-Dxilose, α-L-arabinose), hexoses (β-D-manose, β-D-glicose, α-D galactose) e / ou ácidos urônicos (ácidos α-D- glucurônico, α-D-4-O-metilgalacturônico e a-D-galacturônico). Outros açúcares como ramnose e fucose também podem estar presentes em pequenas quantidades, e, os grupos hidroxil dos açúcares podem ser substituídos por grupos acetil (XIAO et al., 2001), que são relativamente fáceis de hidrolisar por causa da sua estrutura amorfa e ramificada assim além de apresentar peso molecular mais baixo (Figura 1) (FENGEL& WEGENER,1989). Lignina é uma macromolécula aromática sintetizada a partir de precursores fenilpropanóides (CHUNDAWAT et al.,2011). Geralmente, a lignina está distribuída junto com as hemiceluloses no espaço entre as microfibrilas de celulose em ambas as paredes celulares, primária e secundária, e na lamela média, para adesão celular (ERIKSSON & BERMEK, 2009). Essa estrutura aromática, muito estável, é um grande obstáculo para a hidrólise enzimática da lignocelulose (PRASAD et al., 2007; KO et al., 2009). A lignina forma um bloqueio de proteção em torno da celulose e da hemicelulose, protegendo esses polissacarídeos da degradação enzimática (DAWSON & BOOPATHY, 2007; LI et al., 2009). Estudos recentes estão focando no uso de lignina para fins específicos. É possível ter uma variedade de produtos feitos com lignina, como por exemplo, na indústria de fertilizantes, na construção civil, que é utilizada como aditivos de concreto e na área médica. Essa macromolécula também é utilizada na indústria alimentícia. Sendo utilizada em embalagens de alimento de contato e nos tratamentos de couro, devido sua capacidade de retardar o crescimento bacteriano. (SANTOS, 2011; JOHNSON et al., 2005; TEN & VERMERRIS,2015). 3.2. Lignina Lignina é uma macromolécula tridimensional amorfa não polissacarídica encontrada associada com fibras de celulose e hemiceluloses na parede celular das plantas. A estrutura da lignina é formada por compostos de unidades de p-propilfenol, com subunidades metoxila no 21 anel aromático e unidas por ligações tridimensionais C-O-C e C-C. É formada por três diferentes precursores de monômeros fenólicos tais como, álcoois cumarílico (p-hidroxifenil “H”), coniferílico (guaiacil “G”) e sinapílico (siringil “S”) (LEWIS ;YAMAMOTO, 1990; SUN et al., 2003), como demostrados na Figura 2. Figura 2. Monômeros fenólicos (unidades de fenilpropeno) precursores da lignina. (Barbosa et al.,2008). As ligninas podem se diferenciar de acordo com sua estrutura. Em coníferas, por exemplo, contém quase em seu total derivados de álcool coniferílico. A lignina de folhosas tem estrutura a partir dos álcoois coniferílico e sinapílico, e a lignina de gramíneas, apresenta os três precursores em sua estrutura (BURANOV& MAZZA, 2008; HENRIKSSON, 2009). Cada espécie tem seu tipo de lignina ou até mesmo dentro de uma mesma espécie pode ocorrer variação. Em estudos feitos com eucaliptos cultivados na Europa e no Brasil foram encontradas diferenças na constituição de suas ligninas, que pode ser explicado pelas diferenças climáticas e de solo, e pode ocorrer diferenças também pelo método de extração isolado das paredes celulares (MORAIS 1987, 1992). A lignina possui diversas funções nos vegetais, entre elas proporciona resistência e rigidez na parede celular, protege as células da ação de enzimas hidrolíticas advindas de patógenos e saprófitos e de várias outras condições de estresse ambiental. Devido ao caráter hidrofóbico, as ligninas atuam no transporte interno de água, nutrientes e metabólitos por evitar a permeabilidade de água dos tecidos condutores do xilema (CONESA et al., 2002; ZHAO et al.,2012; SHARMA et al.,2012). 22 A lignina, apresenta também a capacidade adsortiva de enzimas, sendo assim durante a hidrólise enzimática faz com que as celulases se liguem a ela, expondo o seu núcleo hidrofóbico e assim as inativando, levando a um efeito denominado adsorção improdutiva, que ocorre entre estas enzimas e a estrutura aromática da lignina (ECKARD et al., 2013). 3.2.1 Adsorção improdutiva A adsorção improdutiva é considerada um importante mecanismo, que prejudica o processo da degradação enzimática da celulose (LIU et al., 2016;). Estudos mostram a adsorção de celulases em lignina isolada a partir de vários tipos de biomassa, como a palha de milho, por exemplo, que adsorve menos celulases que a lignina de madeiras, tanto de coníferas quanto de folhosas. Isso se deve ao fato de que as ligninas podem se diferenciar pelos conteúdos de unidades G (guaiacila), S (siringila) e H (hidroxifenila) e assim apresentam diferentes capacidades de adsorção (KO et al., 2014; GUO et al., 2014). Os principais mecanismos que causam esse efeito são as interações hidrofóbicas, eletrostáticas e ligações de hidrogênio (SAMMOND et al., 2014; TU et al., 2009; LAN et al., 2013; YARBROUGH et al., 2015). No entanto, mais recentemente, foi demostrado que várias interações entre os diferentes grupos químicos na lignina e nas enzimas podem estar ocorrendo simultaneamente e promovendo a adsorção (LIU et al.,2016; NAKAGAME et al, 2011; RAHIKAINEN et al., 2013). Trabalhos realizados com celulases produzidas por T. reesei mostram que estas enzimas são capazes de interagir com a superfície hidrofóbica da lignina pois possuem resíduos de aminoácidos hidrofóbicos expostos em sua superfície causando adsorção improdutiva das celulases (PALONEN et al.,2004; REINIKAINEN et al.,1995). Ko e colaboradores (2015) mostraram que as enzimas produzidas por T. reesei e A. niger demostram comportamentos diferentes na adsorção pela lignina. A β-glicosidase de A. niger adsorve menos que a β-glicosidase produzida por T. reesei. Os domínios de ligação a carboidratos (CBMs – carbohydrate binding modules) encontrados em algumas dessas enzimas, influenciam na adsorção improdutiva, por meio de três resíduos de tirosina alinhados (Y5, Y31, Y32), que são fundamentais para o pareamento de anéis de interação CBM-celulose (RAHIKAINEN et al., 2013;LINDER et al.,1995). Para poder minimizar o efeito da lignina no processo de sacarificação, processos de pré – tratamento são utilizados. Esses métodos podem ser por meio físico, químico e biológico (HU et al., 2018). O pré-tratamento da biomassa tem como objetivo quebrar a ligação da lignina e romper a estrutura cristalina da celulose. A eficiência de um pré-tratamento é definida por 23 vários pontos como: a redução do tamanho das partículas da biomassa, limitar a formação dos produtos da degradação que inibem o crescimento dos microrganismos fermentativos, minimizar a demanda de energia (NATIONAL RESEARCH COUNCIL, 1999). Porém, existem limitações já que em alguns métodos, ocorre o aumento de hidroxilas fenólicas que podem aumentar a capacidade adsortiva da lignina residual (RAHIKAINEN et al.,2013). Além dos processos de pré-tratamentos, outras alternativas estão sendo feitas como o uso de aditivos e/ou agentes bloqueadores de lignina (proteínas não-catalíticas, surfactantes, polímeros) na hidrólise enzimática com a finalidade de melhorar o rendimento do processo (FLORENCIO et al., 2016). No entanto, algumas estratégias são economicamente inviáveis para serem utilizados nas indústrias. A lignina é um farto recurso natural com estruturas aromáticas que pode servir como material para a síntese de produtos químicos de alto valor, por isso uma melhor compreensão da sua estrutura e de métodos para sua valorização são necessários, recursos renováveis como a lignina são importantes para a sustentabilidade ambiental. 3.3 Enzimas Enzimas são de grande importância aos sistemas biológicos uma vez que são utilizadas como catalisadores de reações químicas especificas aumentando a velocidade de reações químicas sem alterar o equilíbrio e sem serem consumidas, além da não formação de produtos secundários e operam em soluções aquosas diluídas (tampões), em condições muito características de temperatura e pH (MARZZOCO et al., 1999). As reações catalisadas por enzimas se dão em dois passos, sendo que no primeiro, a enzima se liga de forma reversível ao substrato, formando um complexo enzima-substrato, enquanto que na segunda etapa, ocorre a liberação do produto e a enzima fica livre para se ligar à outra molécula de substrato. A velocidade de reação é diretamente proporcional à concentração de substrato (MARZZOCO et al., 1999). As enzimas são de grande importância em usos industriais comerciais e possuem uma série de características que as tornam mais vantajosas quando comparadas a catálise química convencional. Dessa forma, vale ressaltar o alto grau de eficiência catalítica de uma enzima, a alta especificidade e seletividade. Essas características evitam formação de subprodutos indesejados gerando um aumento no grau de pureza do produto final. As enzimas, atuam em condições brandas de temperatura e pressão, e sua atividade pode ser regulada de acordo com as condições operacionais, enquanto os catalisadores químicos operam em condições críticas 24 (RODRIGUES, 2009). Além disso, enzimas podem ser selecionadas geneticamente e quimicamente modificadas para a melhoria de suas propriedades-chave: estabilidade, especificidade do substrato e atividade específica (ADRIO; DEMAIN,2008; ADRIO; DEMAIN, 2005; LI et al., 2012). As enzimas são utilizadas na fabricação de alimentos, nutrição animal, cosméticos, medicamentos, indústria têxtil, indústria de papel, produção de etanol 2G, entre outros (ADRIO; DEMAIN, 2005; LI et al., 2012). 3.3.1 Celulases Celulases ou enzimas celulolíticas catalisam reações de forma específica e que agem em conjunto para a liberação de açúcares, dos quais a glicose é a molécula de maior interesse industrial, devido à possibilidade de conversão em etanol (CASTRO & PEREIRA, 2010). O uso desses biocatalizadores é uma alternativa importante aos processos químicos convencionais, pois como possuem reações especificas, minimizam a geração de subprodutos indesejáveis, e como conseguem atividade catalítica em temperaturas amenas, reduzem os custos energéticos do processo (FLORENCIO et al., 2017). A hidrólise da celulose ocorre pela ação das celulases que hidrolisam as ligações β-1,4- d-glucosídica na estrutura da celulose para liberar glicose, celobiose e celo-oligossacarídeos. O complexo enzimático mais estudado, inclui as endo-glucanases (EG; EC 3.2.1.4), celobiohidrolases (CBH; EC3.2.1.91) e β-glicosidases (BGL; EC 3.2.1.21) (SRIVASTAVA, et al.,2018; RAWAT et al.,2014). Endoglucanases hidrolisam ligações glicosídicas nas regiões amorfas da celulose gerando oligômeros de cadeia longa (extremidades não redutoras) para a ação de exoglucanases ou celobiohidrolases, que clivam a longa cadeia de oligossacarídeos resultantes da ação das endoglucanases em oligossacarídeos de cadeia curta. Existem dois tipos de exoglucanases, agindo unidirecionalmente nos oligômeros de cadeia longa das extremidades redutoras (E.C.3.2.1.176) ou não redutoras (E.C.3.2.1.91) liberando a celobiose , que posteriormente é hidrolisada pelas β-glicosidases em glicose (JUTURU;WU, 2014; FLORENCIO et al.,2017; SRIVASTAVA, et al.,2018). A ação dessas enzimas foi demostrada na Figura 3. Outro tipo de celulases chamado tipo oxidativo de celulases foi identificado, recentemente. Essa enzima despolimeriza a celulose por meio de reações de radicais livres (JUTURU; WU, 2014). Juntamente com as três principais celulases, algumas enzimas 25 acessórias, como as oxidases líticas, atuam juntamente com as endoglucanases liberando extremidades redutoras, a proteína Cbp21, por exemplo, produzida por Streptomyces coelicolor, age como uma enzima oxidativa e auxilia na despolimerização de celulose recalcitrante (JUTURU;WU, 2014;SARANRAJ et al.,2012 ; MEDIE et al.,2012). Figura 3. Ação das celulases. A endoglucanase cliva aleatoriamente as ligações glucosídicas β-1,4 no interior da celulose. Celobiohidrolases (exoglucanases) clivam tanto da extremidade redutora quanto da extremidade não redutora das cadeias de celulose, liberando celobiose que posteriormente será convertida em glicose pelas β- glicosidases (Adaptado de Akram, et al., 2018). As celulases são classificadas como hidrolases glicosídicas (GHs) com base nas semelhanças de sequência de aminoácidos, estrutura e função da enzima do núcleo catalítico. Essas enzimas hidrolisam a ligação glicosídica entre 2 carboidratos ou entre 1 carboidrato e uma porção não-carboidrato (HENRISSAT et al., 1998). De acordo com a descrição do banco de dados de enzimas ativas em carboidratos (CAZy), endoglucanases pertencem às famílias GH (5–8, 12, 16, 44, 45, 48, 51, 64, 71,74, 81, 87, 124 e 128), as exoglucanases ou celobiohidrolases estão relacionadas às famílias GH (5-7 e 48) e β-glucosidases são encontradas nas famílias GH (1, 3, 4, 17, 30 e 116) (JUTURU;WU, 2014). Geralmente, as celulases (endoglucanases e exoglucanases) são formadas por dois domínios diferentes, domínio catalítico e domínio de ligação à celulose (CBM -carbohydrate- binding modules). O CBM tem ligação com à adsorção, facilitando a hidrólise da celulose, aproximando o domínio catalítico do substrato insolúvel, permitindo o aumento da 26 concentração de enzima sobre a superfície do substrato sólido por ligações de hidrogênio, interações eletrostáticas ou hidrofóbicas. (GILKES et al., 1991; TOMME et al., 1995; LYND et al., 2002). As endoglucanases aceleram o processo celulolítico atuando sinergicamente com a exoglucanase. A desconstrução de celulose é iniciada pelo ataque de endoglucanases no polímero de celulose de forma aleatória (DASHTBAN et al. 2010). Essas enzimas estão relacionadas com a família GH-5. Geralmente, seu sítio ativo consiste em um sulco aberto, ou em forma de fenda, que permite a arranjo da cadeia linear de celulose de forma aleatória (TOMAS-PEJÓ et al., 2009). A molécula do substrato, para se ligar de forma ativa ao sítio ativo da enzima, interage com vários subsítios (aproximadamente 7) por interações de hidrogênio ou empilhamento dos resíduos aromáticos com aminoácidos do sítio ativo (VLASENKO, et al., 2010). Celobiohidrolases ou β-1,4-exoglucanase atuam de forma processual nas extremidades redutoras ou não redutoras de micro fibrilas de celulose. A cadeia de celulose terminal liga-se ao sítio ativo semelhante a um túnel da exoglucanase e processado convertido em cadeia mais curta. As exoglucanases facilitam a produção de glicose (glucano-hidrolases) ou celobiose (celobio-hidrolase) (RAMESHWAR, et al.,2017). As β- glicosidades são responsáveis na regulação de todo o processo de hidrólise da celulose (SINGHANIA et al. 2013). Entre as enzimas que degradam a celulose, as β- glucosidases são essenciais para uma eficiente hidrólise da biomassa celulósica, uma vez que diminui a inibição das celobiohidrolases e endoglucanases pela redução da acumulação da celobiose (SØRENSEN, et al.,2013). Essas enzimas agem quebrando a ligação β1,4, quando o grupo carboxil do resíduo conservado do sítio ativo, geralmente um ácido glutâmico, doa um próton para a ligação e o íon carbônio formado é estabilizado pelo resíduo do ácido aspártico. Essas enzimas agem nos resíduos de celodextrina e celobiose hidrolisando-os a glicose (LYND, et al,2002). As celulases podem ser produzidas utilizando principalmente dois métodos: a fermentação em estado sólido (FES) e a fermentação submersa (FSm) (SINGHANIA et al.,2010). Os dois processos apresentam vantagens e desvantagens, e a escolha de um dos dois depende do produto final desejado e o microrganismo utilizado. Das duas técnicas, a FSm é utilizada em grande parte dos processos industriais para produção de enzimas microbianas. Nessa técnica, os microrganismos são inoculados diretamente em meio nutriente líquido, o caldo de fermentação, que é uma mistura que favorece o desenvolvimento dos microrganismos. 27 Esse caldo contem água, que equivale de 90 a 99% da massa total, com nutrientes dissolvidos. As vantagens desse processo são relacionadas à instrumentação e controle dos parâmetros físico-químicos, como controle de temperatura, aeração, agitação e pH (RENGE et al.,2012). A Novozymes, empresa líder mundial em produção de enzimas, utiliza esse método para a obtenção de celulases. A Dyadic, é um exemplo, produz celulases pelos cultivos de Myceliophthora thermophila e Trichoderma longibrachiatum por este processo (HANSEN et al., 2015). Já no processo de FES, o crescimento do microrganismo ocorre em substrato sólido, não possui água na forma livre, porém há umidade suficiente somente para conservação do metabolismo e desenvolvimento microbiano (PANDEY,1992;1996). As vantagens da FES, consistem em maior produtividade dos coquetéis enzimáticos, obtenção de enzimas com maior estabilidade de pH e temperatura e menor risco de inibição pelo produto e substrato (BARRIOS-GONZÁLEZ,2015; HOLKER; LENZ, 2005). Outra grande vantagem da FES é ser capaz de utilizar resíduos agroindustriais com o substratos sólidos, que garantem energia para o crescimento do microrganismo e a produção de enzima por servirem como fontes de carbono, sendo assim favorável ao meio ambiente (FARINAS, 2015).O bagaço de cana, por exemplo, está sendo utilizado como matéria-prima em diversos trabalhos que aplicam essa técnica (DELABONA et al.,2012; DELABONA et al.,2013; RODRIGUEZ-ZUNIGA et al.,2014). Recentemente, foi desenvolvido um novo método de cultivo, chamado de fermentação sequencial (FSeq). Esse novo processo é a junção das vantagens dos processos de cultivo convencionais citados anteriormente. O processo da FSeq consiste no pré-cultivo, feito no estado sólido e posteriormente uma mudança para o estado submerso (CUNHA et al.,2012; CUNHA et al.,2015; FLORENCIO et al.,2015). As celulases podem ser utilizadas em uma grande variedade de atividades industriais, sendo assim considerada de grande importância biotecnológica, essas enzimas subsidiam cerca de 20% do mercado global (CUNHA et al., 2012 ).As principais aplicações são nas indústrias alimentícias, ração animal, têxtil, detergente e cervejarias, indústria de polpa de papel entre outras (VILELA, 2013). Uma área de grande importância é o processo de produção de etanol 2G. A produção de etanol 2G consiste na hidrólise da celulose e da hemiceluloses (polissacarídeos presentes na biomassa lignocelulósica) através da atividade enzimática de celulases, gerando assim açúcares como bioproduto final (LUCARINI et al.,2017). Cada vez mais as empresas que desenvolvem tais enzimas tentam o máximo a redução de custos envolvendo a produção destas. Cellic CTec2 é um biocatalisador concentrado produzido 28 pela empresa Novozymes que na sua formulação contém um coquetel de enzimas com o objetivo de melhorar o desempenho e diminuir a dosagem requerida para a conversão da celulose em açúcares, entretanto, nem todas medidas são eficientes na redução de gastos (LUCARINI, et al., 2017). Portanto, o que se busca principalmente pelas indústrias são estratégias para o aumento da produção das enzimas com substratos mais baratos e a produção com mais estabilidade para cada processo específico e maior atividade específica sobre substratos sólidos e também tecnologias de imobilização (MOREIRA, 2005; ADRIO e DEMAIN, 2005). 3. 4 Reciclagem enzimática Reciclagem enzimática na produção de etanol 2G tem sido testada há mais de 30 anos. Essa tecnologia visa à recuperação das atividades de enzimas adsorvidas na biomassa lignocelulósica para diminuir a quantidade utilizada durante o processo de hidrólise enzimática (MESA, et al.,2016). Humbird e colaboradores (2011) relataram em seu estudo que o custo da enzima a partir de 2012 representa mais de 15% do preço mínimo de venda do etanol. Em trabalhos mais recentes mostram que uma enzima, produzida fora do local de produção, custa até 28% do preço do etanol. Porem a junção da produção da enzima na planta diminui os custos para menos de 10% (JOHNSON,2016). Existem tecnologias com o objetivo de recuperação e reciclagem enzimática em bioprocessos. Inúmeras técnicas estão sendo estudadas e colocadas em prática para promover a reciclagem enzimática (SZÉPÁL et al., 2013; ECHEVARRÍA et al., 2012; DEKKER et al., 1986; QI et al., 2011; HUSTEDT, 1986). Embora tenha sido relatada uma variedade de métodos de reciclagem de enzimas ( Tabela 1), é difícil comparar as eficiências de reciclagem entre esses métodos pois diferentes substratos e/ou diferentes métodos e/ou condições de pré- tratamento foram utilizados. 29 Tabela 1 | Vantagens e desvantagens dos métodos de reciclagem enzimática Adaptado de Jørgensen (2017) Opção de Reciclagem Vantagens Desvantagens Reciclagem em líquido Se o método for feito após a recuperação do produto, é possível evitar a reciclagem de açúcares e produtos. Possibilidade de retirar a água e componentes secundários (inibidores) enquanto se concentram enzimas. Desnaturação enzimática, pode requerer etapa de dessorção, já que nem todas as enzimas estão presentes na fase líquida e é um processo de alto custo. Reciclagem enzimática em resíduos sólidos Grande parte das celulases normalmente é adsorvida em sólidos residuais, os açúcares e outros potenciais inibidores enzimáticos em solução podem ser removidos por separação (e lavagem), e é uma tecnologia de separação simples. Os resíduos de lignina acumulados, enzimas não ligadas a sólidos residuais são perdidas ou exigem uma etapa de recuperação separada. Reabsorção de enzimas em nova biomassa Reutilização de todas as enzimas com alta afinidade por celulose é uma vantagem desse método. Porem nem todas as enzimas adsorvem a substrato fresco, conteúdo de lignina presente no substrato, processo de separação é complexo. Reciclagem de sólidos e líquido Enzimas adsorvidas e livres são recicladas. Técnica simples e de baixo custo para implementação. Produtos (por exemplo, etanol) no líquido de reciclagem podem inibir a Hidrólise.Apenas parte de toda a pasta pode ser reciclada.Acumulação de lignina.Acumulação de inibidores de enzimas e microrganismos Imobilização de enzimas Fácil e seletiva recuperação das enzimas, maior estabilidade operacional contra diferentes condições como temperatura e pH, diminui problemas de acúmulo de compostos indesejados e melhora a estabilidade das enzimas Alto custo. Diminuição da atividade devido a impedimento estérico e transferência de massa. Difícil garantir a boa imobilização de múltiplas enzimas 30 Um processo de reciclagem eficiente da celulase dependeria de três principais condições: (1) uma celulase altamente estável, (2) uma alta eficiência de hidrólise e (3) bom controle sobre os processos de adsorção / dessorção do substrato (GOMES et al.,2015). O processo de hidrólise enzimática envolve as celulases, as fibras lignocelulósicas e a fase líquida (GOMES et al.,2015). A quantidade relativa de celulases livres na fase líquida não é constante, ela muda ao longo da hidrólise. Na composição final do sistema terá a fração de enzima livre e disponível para ser reutilizada e a fração ligada ao sólido final, exigindo uma etapa adicional de dessorção (GOMES et al.,2015). Este processo depende fortemente sobre a afinidade de cada celulase para celulose e lignina (PRIBOWO et al. 2012), sobre a estrutura e composição do substrato (TU et al. 2007), e fatores ambientais (por exemplo, pH, presença de surfactantes) (SHANG et al. 2014; SEO et al. 2011). Muitos estudos já demonstraram que diferentes celulases podem apresentar afinidades distintas com o substrato. Além disso, para uma determinada celulase, afinidades também podem ser encontradas para diferentes substratos (GOMES et al.,2015). Os domínios de ligação das celulases (CBM) presentes em exoglucanases e endoglucanases, como descrito anteriormente são muito importantes para o processo de reciclagem enzimática, pois auxiliam na adsorção das enzimas no substrato. Ishihara e colaboradores (1991), estudaram a ligação entre as celulases e material sem a presença de lignina. Foram observadas maior afinidade para exoglucanases, seguido por endoglucanases e, por fim, β-glucosidases. Em uma análise eletroforética, foi verificado que diferentemente de endoglucanases, os níveis de β-glucosidase na fração líquida permaneceram constantes durante a hidrólise, sugerindo baixa adsorção ao substrato (TU et al.,2007). Outro parâmetro importante é que a presença da lignina no meio influencia fração final de enzimas livres. Um estudo analisou as isotermas de Langmuir para a adsorção de celulases em dois substratos, a Avicel e um contendo lignina. Enquanto a máxima adsorção de celulases foi encontrada para Avicel (8mg/g substrato), o substrato contendo 46% de lignina a adsorção foi de 160mg/g substrato. Após 48h de hidrólise, o teor de proteína na fração líquida foi de 85% para o caso da Avicel, contrastando apenas com 30% para o substrato com 46% de lignina (LIU et al.,2002). Esses resultados sugerem uma clara influência da lignina na fração final de enzimas livres. Como mostrado na tabela 1, técnicas de recuperação podem estar relacionadas à fração de enzimas presente na fase líquida, ou à fração de enzimas ligada na fase sólida (RODRIGUES et al., 2014). 31 Sendo assim, para o desenvolvimento de tecnologias de reciclagem enzimática é muito importante o entendimento das possíveis interações entre enzimas e biomassa. 3.5 Lignocresol Os materiais lignocelulósicos têm mostrado ao decorrer dos anos, interessantes características para sua utilização como matérias-primas para produção de material industrial. Esses materiais são renováveis, disponíveis em abundância no meio ambiente e de baixo custo, mostrando grande potencial de transformação para matérias-primas químicas ou combustíveis (MIKAME; FUNOAKA,2006; PARISI,1989). O lignocresol surge como uma nova alternativa, para utilização da lignina em processos industriais. Esse composto foi desenvolvido por FUNOAKA; ABE (1989), sendo sintetizado pelo sistema de separação de fases(Figura 4), que consiste basicamente na utilização de um ácido concentrado e um derivado de fenol, o p-cresol (FUNAOKA et al., 1995; FUNAOKA, 1998; NAGAMATSU e FUNAOKA, 2003; FUNAOKA, 2013). Nesse sistema, a lignina hidrofóbica, carboidratos hidrofílicos e os componentes da parede celular, são submetidos individualmente a conversão estrutural e seletiva nas diferentes fases e separados quantitativamente à temperatura ambiente dentro de uma hora. Na fase orgânica, a lignina nativa é modificada pelo enxerto seletivo dos derivados fenólicos na posição benzilo (Figura 4). Por outro lado, os carboidratos são hidrolisados em poli, oligo e monossacarídeos solúveis em água. O lignocresol preserva todas as características da lignina nativa, porem têm várias funções únicas, que as ligninas convencionais não possuem, apesar de possuir ligações químicas originais, por exemplo, altas propriedades fenólicas, nenhum sistema conjugado, uma coloração mais clara que a lignina, evidente ponto de transição de fase (hardwood 130°C, softwood 170°C),e alta capacidade de imobilização de enzima. (FUNAOKA; ABE, 1989; FUNAOKA,1998). 32 Figura 4. Enxerto do derivado do fenol (p-cresol) na lignina pelo método de separação de fases (Adaptado de Nonaka et al., 2011). Essas funções do lignocresol são atribuídos à hibridação seletiva de derivados fenólicos monoméricos nas posições C-1, levando a estruturas compostas principalmente de 1,1-bis (aril) propano (MIKAME; FUNOAKA,2006). Mikame e Funaoka (2006) analisaram a morfologia molecular do lignofenol e das ligninas convencionais com o sistema SECMALLS, essa análise foi utilizada como método para obter o peso molecular absoluto dos polímeros. A morfologia molecular do lignocresol foi mais espalhado e linear, em comparação com as ligninas. Essa característica do lignocresol pode estar relacionado com a sua termoplasticidade que as ligninas não possuem. A funcionalidade do lignocresol foi relatada em alguns estudos, como o de Nonaka e colaboradores (2014), que mostraram a eficiência na imobilização de celulases derivadas de Trichoderma reesei, e também o desempenho da hidrólise das enzimas imobilizadas que foi aproximadamente 80-90% e 30-50% em relação ao da celulase livre na hidrólise de carboximetilcelulose (CMC) e papel de filtro, esses resultados mostram que a celulase fica ativa mesmo após a adsorção em lignocresol. Analisando um processo comum de biorrefinaria, por exemplo, produção de etanol a partir do material lignocelulósico, normalmente existem três fluxos de processos que são possíveis fontes de enzimas em um processo de reciclagem; estes são (1) Reciclagem depois da hidrólise; (2) Reciclagem após a fermentação; (3) Reciclagem após a recuperação / separação 33 do produto. A hidrólise e fermentação podem estar em duas etapas consecutivas ou integradas em uma única etapa do processo (JØRGENSEN, 2017). No presente trabalho propomos que o lignocresol pode ser utilizado entre a etapa de hidrólise enzimática e a fermentação para adsorver proteínas ou enzimas onde, posteriormente, passariam por um processo de separação, tornando possível a reutilização de ambos os compostos (Figura 5). Figura 5. Fluxograma do processo de recuperação enzimática utilizando lignocresol Adaptado de JØRGENSEN, 2017 As celulases serão recuperadas pela exposição ao lignocresol, contando com sua alta capacidade de adsorção. O lignocresol será adicionado à suspensão livre de celulase sob condições de promoção de adsorção (por exemplo, agitação). O lignocresol será incorporado ao processo na etapa de hidrólise enzimática e as celulases estarão ligadas e ativas ao polímero de celulose, especificamente endoglucanases e exoglucanases. Considerando isso, a β-glicosidase é a enzima que fica disponível para a recuperação, pois seu substrato é solúvel, a celobiose. Sendo assim, o lignocresol é um novo método para recuperação de enzimas contudo mais especificamente de β-glicosidase na produção de etanol 2G. Porém, no presente trabalho, estudamos a interação com as outras enzimas do complexo enzimático. Já que além de ser utilizado na produção de etanol 2G, o composto pode ser utilizado em outros bioprocessos. 34 4. Referências Bibliográficas ADRIO, J. L.; DEMAIN, A.L. Microbial cells and enzymes - A century of progress. In Methods in Biotechnology. Microbial Enzymes and Biotransformations, v. 17, p. 1–27, 2005. ADRIO, J. L.; DEMAIN, A.L. Contributions of Microorganisms to Industrial Biology. Molecular Biotechnology. v.38, p.38-41,2008. AKIMKULOVA, A., et al. Improving the enzymatic hydrolysis of dilute acid pretreated wheat straw by metal ion blocking of non-productive cellulase adsorption on lignin. Bioresource Technology.v. 208, p. 110-116,2016. AKRAM, F., et al. 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As β-glicosidases são fundamentais para a hidrólise eficaz da celulose, essas enzimas são responsáveis pela liberação de moléculas de glicose, que é o produto final da hidrólise. Além disso, a atividade β-glicosídica potencializa a ação sinérgica das outras celulases, incrementando o rendimento do produto final e também diminui a concentração de celobiose que é um inibidor do complexo celulolítico. Este estudo apresenta o processo de adsorção de duas β-glicosidases de Thermotoga petrophila, pertencentes às famílias 1 e 3 (TpBgl1 e TpBgl3), separadamente, para formar um complexo de enzima lignocresol. A síntese de lignocresol, oriundo da lignina Kraft de Pinus spp., foi realizada pela adaptação à metodologia do sistema de separação de fases que consiste na utilização de ácido sulfúrico 72% e um derivado de fenol (p-Cresol). Para obtenção do complexo, foram realizadas duas suspensões de lignocresol em tampão citrato de sódio (50 mM), ambas com concentração fixa 10 mg/mL. Diferentes concentrações enzimáticas (0,1- 1,0 mg/mL) de β-glicosidases da família 1 e 3 (TpBgl1 e TpBgl3, respectivamente), foram colocadas à interação (ensaios em pH 6,0 para TpBgl1 e pH 4,0 para TpBgl3). Interações com lignina Kraft de Pinus spp. também foram realizadas nas mesmas condições para posterior comparação. A validação da adsorção fora realizada através da quantificação pelo método de Bradford. Os resultados encontrados demonstram grande adsorção (100-90%) do lignocresol para com TpBgl1 e TpBgl3, em concentrações inferiores à 0,25 e 0,40 mg/mL, respectivamente. Ensaios de adsorção utilizando somente a lignina apresentaram resultados muito inferiores aos de lignocresol, comparados também em concentrações inferiores como demonstradas anteriormente, sendo ausente adsorção de lignina à TpBgl1 e adsorção de lignina à TpBgl3 de 70-50%. Os ensaios de ELS, demonstraram que lignocresol e lignina apresentam potencial-zeta na faixa de pH 4-7. Vale ressaltar que, entre o pH 5-7, o lignocresol apresenta valores maiores negativamente se comparado à lignina. Nossos resultados mostram que o lignocresol mantém maior capacidade de adsorção para as β-glicosidases do que a lignina. Essa capacidade pode ser explicada tanto pela sua grande hidrofobicidade e também por características eletrostáticas. Portanto, todos esses resultados demonstram boa adsorção do lignocresol às enzimas, demonstrando potencial para reciclagem enzimática. Palavras chave: Lignina, Lignocresol, β-glicosidase, adsorção 53 1. Introdução As β-glicosidases (3.2.1.21) são enzimas que desempenham um papel importante na eficiência da hidrólise do material vegetal, pois, hidrolisam a celobiose à glicose que é o produto desse processo. Além disso são essenciais no sistema celulolítico, pois, trabalham sinergicamente otimizando a ação de