UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA PROTEOMA DO PLASMA SEMINAL, FLUIDO EPIDIDIMÁRIO E DOS ESPERMATOZOIDES COLHIDOS DO EJACULADO E DA CAUDA DO EPIDÍDIMO DE TOUROS DANIEL SAMITH SALGADO CÁRDENAS Botucatu - SP Abril/2017 i UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA PROTEOMA DO PLASMA SEMINAL, FLUIDO EPIDIDIMÁRIO E DOS ESPERMATOZOIDES COLHIDOS DO EJACULADO E DA CAUDA DO EPIDÍDIMO DE TOUROS DANIEL SAMITH SALGADO CÁRDENAS Dissertação apresentada á Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de Botucatu, para a Defesa de Mestrado do Programa de Pós-graduação em Biotecnologia Animal Orientadora: Profa. Dra. Fabiana Ferreira de Souza Botucatu – SP Abril/2017 ii ii Nome do autor: Daniel Samith Salgado Cárdenas PROTEOMA DO PLASMA SEMINAL, FLUIDO EPIDIDIMÁRIO E DOS ESPERMATOZOIDES COLHIDOS DO EJACULADO E DA CAUDA DO EPIDÍDIMO DE TOUROS BANCA EXAMINADORA Profa. Dra. Fabiana Ferreira de Souza Presidente e orientadora Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária FMVZ - UNESP - Botucatu /SP Profa. Dra. Lucilene Delazari Dos Santos Membro Departamento Centro de Estudos de Venenos e Animais Peçonhentos (CEVAP) - UNESP - Botucatu /SP Dra. Priscilla Nascimento Guasti Membro Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária FMVZ - UNESP - Botucatu /SP Data da Defesa: 24 de Abril de 2017. iii Dedico A os meus pais, pela oportunidade da vida, pelo incentivo ao estudo, pelo amor, carinho e respeito. Minha filha que vem em caminho, que é o mais precioso que deus me deu. Minha irmã pelo apoio incondicional. À mim, por realmente acreditar que os sonhos são possiveis de cumprir e de fazer-se realidade. iv AGRADECIMENTOS Chegou o momento de escrever e relatar em poucas palavras e escrever em algumas folhas, tantos sentimientos, vivencia aprendidas e experiências de estes anos, desde que se iniciou á ilusão e o sonho de cursar meus estudos de mestrado. Tenho em minha mente tantas coisas que lembrar gratos momentos vividos e também de momentos difícieis como meu trabalho de laboratório. Foram muitas as pessoas que contribuiram para que eu consiguiera este objetivo, por isso eu quero expresar meus agradecimentos. A Deus por me permitir fazer uma realidade este sonho e pela perseverância que me deu para poder alcansar esta meta, que desde que era uma criança sonhava em fazer um Mestrado, que me tem permitido crescer pessoal e profissionalmente. A meus pais. Por seu apoio incondicional durante toda minha vida, por seus sábios conselhos, seus ensinamentos, sua formação em valores e por estar sempre ali para que este sonho não falhasse ante as dificuldades, por permitirme ter tido a experiência de vivir neste lindo país, e por ter conhecido a tantas maravilhosas pessoas ao longo de minha estadía, amigos que levo no meu coração com infinito carinho. A minha irmã. Por sua companhia, apoio e por estar me incentivando cada etapa, cada momento de felicidade ou dificuldade, por estos momentos compartilhados na distância de este sonho vivido em Brasil. Aos familiares, minha namorada Marcela Betin e amigos, que não participaram diretamente deste trabalho, mas que sempre me apoiaram incondicionalmente desde á distancia, para eu ter forças para não desistir e continuar com meus sonhos. A professora Eunice Oba pela oportunidade que me deu de fazer o mestrado, meus mais sinceros e profundos agradecimentos. v A professora Fabiana Ferreira de Souza. Agradeço pela incansável dedicação e valiosa contribuição na minha formação, por dar-me A oportunidade de iniciar meus estudos de Mestrado, por seus ensinamentos, seu constante apoio científico e confiança no desenvolvimento do meu trabalho de dissertação, é para mim um orgulho de ter como orientadora a uma excelente pessoa, mãe e grande investigadora. Ao professor Angelo Gardim de Cesar por facilitarme os animais para á colheita do material necessário para a realização do meu projeto, por que pessoas como ele fizeram a difrerença para que meu sonho de ser Mestre seja uma realidade de vida. A Dra Bertha Irina Gastelbondo Pastrana, por contribuir a que este projeto hoje seja uma realidade e por esse apoio a não desistir. Ao grupo de Pesquisa da Reprodução Animal, pelo apoio durante a realização desse trabalho. Aos incríveis colegas Viviana, Carol, Laiza, que fizeram tudo ser mais fácil e animado. vi LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS DNA Ácido desoxirribonucleico RNAm Ácido ribonucleico mensageiro RNAr Acido ribonucleico ribossomal MIF Macrophage migration inhibitory fator MiRNA Micro ácido ribonucleico PGs Prostaglandinas pH Potencial hidrogeniônico, escala logarítmica que mede o grau de acidez, neutralidade ou alcalinidade de uma determinada solução AMPc Adenosina monofosfato cíclico EROS Espécie reativa de oxigênio TP Proteínas de transição nuclear HBP Proteínas de ligação a heparina OPN Osteopontina BSP Proteína do plasma seminal bovino, Proteínas de ligação espermática aSFP Proteína ácida do fluido seminal pI Ponto isoeléctrico PLA-2 Fosfolipase A2 SPLN Plasmina seminal GAG Glicosaminoglicanos HDL Lipoproteína de alta densidade ELSPBP1 Proteína ligadora do espermatozoide epididimal GPI Glicosilfostatidilinositol BLVRA Biliverdina reductase A ADAM Disintegrina A and metaloprotease MDC Desintegrina metaloprotease rica em cisteína RA Reação acrossomal PDGS Prostaglandina D-sintetase tipo Lipocalina SPP1 Fosfoproteína secretória 1 vii SUMARIO CAPÍTULO 1 ................................................................................................................... 1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA ............................................................................ 1 2. REVISÃO DA LITERATURA ..................................................................................... 2 2.1. Características morfológicas e fisiológicas das células espermáticas ................ 2 2.2. Síntese proteica na célula espermática .............................................................. 4 2.3. O epidídimo ....................................................................................................... 6 2.3.1. Transporte dos espermatozoides no epidídimo ............................................... 6 2.3.2. Maturação espermática no epidídimo ............................................................. 7 2.3.3. Armazenamento de espermatozoides no epidídimo ........................................ 8 2.3.4. Proteção dos espermatozoides no epidídimo .................................................. 9 2.3.5. Fluido epidídimário .........................................................................................10 2.4. Glândulas sexuais acessórias ...........................................................................10 2.5. Formação e componentes do ejaculado ...........................................................11 2.6. Proteômica espermática e dos fluidos do trato reprodutor masculino ...............11 2.6.1. Proteínas espermáticas .................................................................................12 2.6.2. Proteínas flagelares .......................................................................................14 2.6.3. Proteínas do fluido epididimário .....................................................................15 2.6.4. Proteínas do plasma seminal .........................................................................18 REFERÊNCIAS ........................................................................................................... 23 HIPÓTESE .................................................................................................................. 37 OBJETIVO GERAL ..................................................................................................... 37 OBJETIVOS ESPECIFICOS ....................................................................................... 37 CAPÍTULO 2 ................................................................................................................... ARTIGO ...................................................................................................................... 36 RESUMO .................................................................................................................... 37 ABSTRACT ................................................................................................................. 38 1. Introdução ............................................................................................................... 39 2. Material e métodos .................................................................................................. 40 2.1. Reagentes ........................................................................................................40 2.2. Aspectos éticos .................................................................................................40 2.3. Animais .............................................................................................................40 2.4. Colheita dos espermatozoides do ejaculado e da cauda do epidídimo .............40 2.5. Análise seminal .................................................................................................41 viii 2.6. Preparação das amostras para análise de proteínas ........................................41 2.8. Precipitação de proteínas em acetona ..............................................................42 2.9. Digestão tríptica dos peptídeos e espectrometria de massas ...........................42 Análise estatística ....................................................................................................44 3. Resultados .............................................................................................................. 45 4. Discussão................................................................................................................ 53 Referências ................................................................................................................. 62 ix RESUMO SALGADO, D. S. PROTEOMA DO PLASMA SEMINAL, FLUIDO EPIDIDIMÁRIO E DOS ESPERMATOZOIDES COLHIDOS DO EJACULADO E DA CAUDA DO EPIDÍDIMO DE TOUROS. Botucatu – SP. 2017, p. 102. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus Botucatu, Universidade Estadual Paulista. As proteínas dos fluido e células do sitema reprodutor são constantes objetos de estudo, a fim de elucidar eventos fisiológicos e buscar biomarcadores das funções reprodutivas, facilitando a escolha de reprodutores. Em vista disso, este estudo objetivou caracterizar as proteínas dos espermatozoides do ejaculado e da cauda do epidídimo, do plasma seminal e do fluido epididimário de touros. Foram utilizados 10 touros adultos da raça Brangus. O sêmen foi colhido por eletroejaculação e, posteriormente os machos foram orquiectomizados para a colheita dos espermatozoides e fluido do epidídimo. As células do ejaculado e da cauda do epidídimo foram analisadas subjetivamente após a colheita, e o plasma seminal e fluido do epidídimo foram separados por centrifugação. Então, as amostras foram preparadas para a espectrometria de massas (ESI-QTof MS/MS), com um pool de cada grupo. A concentração de proteínas totais não diferiu entre os grupos. Foram encontradas 67 e 66 proteínas nos espermatozoides do ejaculado e da cauda do epidídimo, e 20 e 16 no plasma seminal e líquido epididimário, respectivamente. Além disso, 52 proteínas foram comuns entre os espermatozoides obtidos do ejaculado e epidídimo, e 9 entre o plasma seminal e fluido epididimário. Atividade catalítica foi a principal função molecular nas células espermáticas; já no plasma seminal foi de ligação e no fluido epididimário, atividade catalítica. As proteínas que se destacaram foram: 14-3-3 protein zeta/delta, A-kinase anchor protein, Calmodulin, Cytochrome c oxidase subunit 5A, mitochondrial, Disintegrin and metalloproteinase domain- containing protein 2, Fibronectin type III domain-containing protein 8, Glucose-6- phosphate isomerase, L-amino-acid oxidase, Phosphoglycerate mutase 2, Ropporin-1, Seminal ribonuclease, T-complex protein 1 subunit epsilon, Clusterin, Epididymal secretory protein E1, Serum albumin. Com base nos resultados, conclui-se que há uma importante contribuição das proteínas do plasma seminal para a célula espermática, fornecendo macromoléculas essenciais para a capacitação espermática, reação do acrossomo, ligação espermatozoide-oócito e fertilização; já o fluido epididimário apresenta como principal função manter a integridade e imobilidade dos espermatozoides. Palavras-chaves: Célula-espermática; Capacitação; Epidídimo; Proteômica; Reação- acrossomo x ABSTRACT SALGADO, D. S. PROTEOMICS OF SEMINAL PLASMA, EPIDIDYMAL FLUID, SPERMATOZOA COLLECTED OF EJACULATED AND CAUDA OF EPIDIDYMIS. Botucatu – SP. 2017, p. 102. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus Botucatu, Universidade Estadual Paulista. Proteins of fluid and cells from reproductive system are constant objects of study, in order to elucidate physiological events and to search biomarkers of the reproductive functions, facilitating the breeding selection. Thus, this study aimed to characterize the proteins of the ejaculate and epididymis spermatozoa, the seminal plasma and the epididymal fluid of bulls. Ten adult Brangus bulls were used. The semen was collected by electroejaculation and then, the males were orchiectomized for collection of spermatozoa and fluid from the epididymis. The ejaculate and epididymis cells were subjectively analyzed after collection, and the seminal plasma and epididymis fluid were separated by centrifugation. The samples were prepared for mass spectrometry (ESI-QTOF MS/MS), with a pool of each group. Total protein concentration did not differ between groups. We found 67 and 66 proteins in the ejaculate and epididymis spermatozoa, and 20 and 16 in the seminal plasma and epididymal fluid, respectively. Moreover, 52 proteins were common in the spermatozoa obtained from ejaculate and epididymis, and 9 in the seminal plasma and epididymal fluid. Catalytic activity was the main molecular function in sperm cells and epididymal fluid; in the seminal plasma was binding. The main proteins found were: 14-3-3 protein zeta/delta, A-kinase anchor protein, Calmodulin, Cytochrome c oxidase subunit 5A, mitochondrial, Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 2, Fibronectin type III domain-containing protein 8, Glucose-6-phosphate isomerase, L-amino-acid oxidase, Phosphoglycerate mutase 2, Ropporin-1, Seminal ribonuclease, T-complex protein 1 subunit epsilon, Clusterin, Epididymal secretory protein E1, Serum albumin. Based on the results, we concluded that there is an important contribution of seminal plasma proteins to the sperm cell, providing macromolecules essential for sperm capacitation, acrosome reaction, spermatozoa-oocyte binding and fertilization; whereas the epididymal fluid has main function maintained the integrity and nonmotile sperm cells. Keywords: Acrosome-reaction; Capacitation; Epididymus; Proteomic; Sperm-cell; xi CAPÍTULO 1 1 1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA Em vista da necessidade de identificar touros de alta fertilidade, seja para utilização em centrais de comercialização do sêmen, assim como para aplicação em propriedades rurais, ferramentas moleculares têm sido estudadas. Estas ferramentas visam substituir o teste de progênie, um método utilizado para avaliar a capacidade reprodutiva de um macho, o qual é oneroso e demanda tempo para ser conduzido (LARSSON, 2000). Além disso, defeitos subcelulares nas células espermáticas, como as alterações nos componentes da sua superfície, só podem ser estudados utilizando métodos de avaliação molecular (LARSSON, 2000; SARSAIFI et al., 2015). Tanto a célula espermática como o oócito possuem proteínas indispensáveis para a fertilização (ALBERTS et al., 2002). Assim, as transformações ou modificações sofridas na célula espermática, para a fertilização, incluem várias fases, tais como maturação pós-testicular no epidídimo, capacitação, reação do acrossomo e ligação entre os gametas. Em cada uma dessas fases estão envolvidas proteínas específicas, que exercerão funções na célula espermática durante a fecundação (YANAGIMACHI, 1993). A adição de proteínas às membranas durante a passagem dos espermatozoides pelo epididimo e na ejaculação influencia sua capacidade fertilizante (ROBAIRE et al., 2006; MOURA et al., 2007; MOURA et al., 2010). Desta maneira, a análise das proteínas associadas ao espermatozoide durante a espermatogênese ou seu trânsito pelo trato reprodutor masculino, pode ser considerada uma ferramenta multiparamétrica, que além de apresentar uma visão global, também pode identificar marcadores proteicos específicos (BISSONETTE et al., 2009). Em vista disso, os espermatozoides ejaculados diferem dos espermatozoides do epidídimo em muitos fatores, incluindo os tipos de proteínas que estão ligadas à membrana plasmática e as suas características (GOOVAERTS et al., 2006). Apesar disto, as proteínas espermáticas ligadas no epidídimo e sua associação com a fertilidade têm sido pouco estudadas. Estabelecer a composição das proteínas espermáticas e entender sua relação com a fertilidade, pode ser um ponto de partida para alcançar resultados mais favoráveis nos sistemas de produção bovina (BELLIN et al., 1994), já que a subfertilidade tem que ser avaliada tendo como base transcritos e proteínas 2 codificadas e adicionadas aos espermatozoides, embora a maioria destas informações sejam consideradas resultado da formação da célula durante a espermatogênese, mas que pode refletir o potencial de fertilidade do ejaculado (BISSONETTE et al., 2009). Desta maneira, o objetivo deste estudo foi descrever as proteínas do plasma seminal, fluido epididimário e das células espermáticas colhidas do ejaculado e da cauda do epidídimo de touros, a fim de identificar a relação das células com os fluidos do trato reprodutor durante sua armazenagem e na ejaculação. 2. REVISÃO DA LITERATURA 2.1. Características morfológicas e fisiológicas das células espermáticas O espermatozoide é uma célula altamente especializada constituída pelo núcleo, mitocôndrias e estruturas membranosas, cuja única função é fertilizar o oócito. Consiste em uma célula com a metade do número de cromossomos em um núcleo condensado e citoplasma restrito, contendo algumas organelas celulares (SUTOVSKY; MANANDHAR, 2006). O espermatozoide é composto de cabeça e cauda, e é totalmente recoberto pela membrana plasmática (FLESCH; GADELA, 2000). A estrutura do espermatozoide pode se observar na Figura 1. A cabeça é formada pelo acrossomo que recobre os dois terços anteriores do núcleo, a lâmina pós-acrossomal que recobre o restante do núcleo, e o núcleo fica recoberto por uma membrana dupla. O DNA nuclear é enovelado e altamente condesado, em vista de proteínas denominadas protaminas que substituem ás histonas de outros tipos celulares (BREWER et al., 2002; DADOUNE, 2003). Pequenos vacúolos nucleares podem ser observados na cromatina condensada, e o perforatorium é uma estrutura observada entre o acrossomo e a porção anterior do núcleo do espermatozoide. O citoesqueleto participa no suporte da membrana plasmática e da membrana acrossomal. O principal elemento do citoesqueleto da cabeça do espermatozoide é a teca perinuclear, que é uma cápsula rígida que recobre o núcleo do espermatozoide e tem como função a união das membranas espermáticas e a preservação de sua integridade. A teca perinuclear está subdividida em duas regiões: subacrossomal (ancora as 3 vesículas derivadas do complexo de Golgi) e a pós-acrossomal. A região pós- acrossomal participa na ativação do oócito durante a fertilização e é o lugar de união entre os gametas e a região sub-acrossomal que esta conformada por as membranas do acrossomo. (SUTOVSKY; MANANDHAR, 2006). Figura 1: Estrutura do espermatozoide. Modificado de https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=699220 O acrossomo é uma única e grande vesícula secretora que rodeia o núcleo, e se encontra na região apical da cabeça espermática (EDDY E O'BRIEN, 1994; YANAGIMACHI, 1994). Esta vesícula contém diferentes enzimas, principalmente hialuronidase e acrosina, as quais desenvolvem papeis importantes na fertilização (FLÖRKE et al., 1983). O acorssomo é envolvido por duas membranas, a externa, que está situada subjacente a membrana plasmática, e a que se encontra sobre o núcleo que é denominada membrana acrossomal interna (CARDULLO AND FLORMAN, 1993). Durante a fertilização há a exocitose desta vesícula (reação do acrossomo), processo no qual ocorrem múltiplas fusões entre estas membranas, com consequente exposição da membrana acrossomal interna e liberação do conteúdo acrossomal enzimático. Além do conteúdo acrossomal, as membranas possuem receptores envolvidos na união do espermatozoide e oócito, e fatores ativadores do oócito localizados na bainha pós-acrossomal, que são elementos proteicos sinalizadores (CARDULLO; FLORMAN, 1993; SUTOVSKY; MANANDHAR, 2006). Esta alteração morfológica do acrossomo deve ocorrer antes da penetração do espermatozoide a zona pelúcida (CARDULLO; 4 FLORMAN, 1993). A cauda é a região encarregada pelo movimento espermático. É dividida em colo, peça intermediária, a qual é conformada por um conjunto helicoidal de mitocôndrias firmemente empacotadas sobre ao redor do citoesqueleto flagelar, a peça principal, que compreende a maior parte da cauda, e peça final (EDDY et al., 2003). Cada região cauda tem funções específicas no momento do reconhecimento do oócito e na fecundação (SUTOVSKY; MANANDHAR, 2006. Durante a formação da cauda ocorre a aglomeração de aproximadamente 100 mitocôndrias na peça intermediária, e estas estruturas serão responsáveis pelo funcionamento aeróbico da célula espermática (GADELA; LUNA, 2014). A integridade e funcionalidade mitocondrial do espermatozoide indicam o estado de energia da célula e a consequente motilidade, a qual tem sido relacionada com a fertilidade (GÜRLER et al., 2016). A motilidade é importante para o transporte a partir do local da ejaculação até as tubas uterinas, onde ocorre a fertilização (GÜRLER et al., 2016). A membrana plasmática envolve todo o espermatozoide e é o componente mais externo da célula. Possui uma estrutura fina, flexível e sua composição e organização facilita a regulação da permeabilidade seletiva aos solutos polares, afinidade aos fatores de adesão, sinalização celular e fusão celular (FLESCH; GADELLA, 2000). Neste sentido, uma alteração da permeabilidade seletiva da membrana espermatica reduz a motilidade, em vista da diminuição da produção de energia. Além disso, modificações na composição lipídica da membrana, o que ademais pode influir no comportamento dinâmico da membrana (HE et al., 2001). 2.2. Síntese proteica na célula espermática Os espermatozoides, resultantes do processo de espermatogênese, se originam a partir de espermatogônias indiferenciadas, situadas nos túbulos seminíferos. Após divisões mitóticas e meióticas, as espermatogônias dão origem aos espermatócitos primários e secundários (espermatocitogênese). A partir dos espermatócitos secundários, num processo de diferenciação celular são formadas as espermátides iniciais e finais, e posteriormente os espermatozoides (espermiogênese), os quais são células haploides (HESS, 1999). Durante o processo de diferenciação, as espermátides sofrem mudanças na morfologia 5 celular e organização das organelas celulares, sendo as principais alterações a perda de organelas, o alongamento da célula, com formação de flagelo na porção distal do núcleo, e na zona apical, a formação do acrossomo (SUTOKSKY; MANANDHAR, 2006). Nestes processos ocorre transcrição pós-meiotica e tradução de RNAm (BOERKE et al., 2007), porém, ao final da formação da espermátide, a expressão gênica é cessada e inicia-se uma fase de condensação do DNA, até um estado máximo, na qual as proteínas nucleares histonas são trocadas por protaminas (DACHEUX et al., 2005; COOPER; YEUNG, 2006). A ausência de síntese de proteínas, ao final da maturação das espermátides, tem como consequência, a diminuição progressiva do conteúdo de transcritos na célula. Assim, a transcrição do DNA é inativada (silenciamento gênico), antes e durante a condensação do DNA (WARD, 1993; SHAMAN; WARD, 2006). Durante o final da diferenciação das espermátides, o DNA é uma estrutura supercondensada, a qual contém estruturas toroidais (enoveladas) do DNA (BOERKE et al., 2007). Essas estruturas estão ligadas entre si por uniões determinadas regiões sensíveis as DNAses ligadas aos toroides. Nessas regiões o DNA ainda se encontra ligado as histonas, evidenciando que todo o DNA não está protaminado (98% do DNA é protaminado na maioria das espécies, incluindo a espécie bovina) (GATEWOOD et al., 1990; BENCH et al., 1996; SOTOLONGO et al., 2003). Apesar disso, os espermatozoides podem carregar diferentes tipos de RNAs, incluindo mRNA (mensageiro), asRNA (antisense) e miRNA (micro) (LALANCETTE et al., 2008). Embora o papel dos RNAs presentes no espermatozoide tem sido discutido (LALANCETTE et al., 2008), estes transcritos podem estar envolvidos em funções estruturais, empacotamento do genoma paterno e/ou funções essenciais para o desenvolvimento embrionário inicial (LALANCETTE et al., 2008). Adicionalmente, as moléculas de RNA presentes nos espermatozoides, incluindo o RNAm, podem ser consideradas remanescentes da espermatogênese. Acredita-se que os RNAs espermáticos se mantêm estáveis até o momento da expressão do genoma embrionário, tendo como potencial função o início do desenvolvimento do embrião (GUR et al., 2006; BOERKE et al., 2007). 6 2.3. O epidídimo Apesar da liberação dos espermatozoides no lúmen dos túbulos seminíferos marcar o final da espermatogênese, a célula ainda não está pronta para fecundação. Após a espermatogênese e é necessária a passagem pelo epidídimo, local onde as células espermáticas sofrem transformações, a fim de potencializar suas funções (JONES et al., 2007). Com este propósito, o epitélio do epidídimo tem funções complexas, o que o diferencia de outros tecidos no organismo (CABALLERO et al., 2010), cujas principais funções são transporte, maturação, armazenamento e proteção da população espermática (ROBAIRE, 2006). O epidídimo é dividido em 3 principais porções, cabeça (seguimento mais proximal ao testículo), corpo e cauda. Cada porção do epidídimo é especializada em promover alterações na célula espermática, contribuindo para sua maturação (DACHEUX et al., 2005). 2.3.1. Transporte dos espermatozoides no epidídimo Uma vez liberados no lúmen dos túbulos seminíferos, os espermatozoides são transportados pela rete testis até os ductos eferentes e, posteriormente, iniciam seu trânsito pelo epidídimo (ROBAIRE, 2006). O tempo mínimo requerido para o trânsito dos espermatozoides pelo epidídimo bovino é aproximadamente 8 ou 9 dias, mas pode variar entre os touros, tendo em promedio de 4 até 15 dias de duração (AMANN et al., 1974). Os espermatozoides entram no epidídimo, propulsados pelo fluido testicular e, possivelmente, ao ritmo das células ciliadas dos ductos eferentes. Inicialmente, os espermatozoides são imóveis ou demonstram somente uma leve contração da cauda (ROBAIRE, 2006), contudo adquirem motilidade ao longo do epidídimo. Além disso, o epitélio epididimário está recoberto por estereocílios imóveis, os quais fazem absorção massiva dos fluidos provenientes dos ductos eferentes, no segmento inicial do epidídimo, reduzindo drasticamente o fluxo do fluido testicular. Outra força capaz de impulsionar os espermatozoides em direção ao epidídimo é o fluxo oposto ao gradiente da pressão hidrostática crescente, conseguindo evitar o refluxo em direção ao testículo (JOHNSON; HOWARD, 1976). Apesar de todos estes mecanismos de fluxo contínuo no epidídimo, as 7 contrações da musculatura lisa que margeia os tubos epidimários, são as principais responsáveis pela condução dos espermatozoides pelo lúmen do epidídimo (ROBAIRE, 2006). Essa contratilidade pode ser atribuída às prostaglandinas (COSENTINO, 1986), já que seus níveis endógenos regulam contratilidade basal do epidídimo proximal. Além disso, peptídeos neurohipofisários, como a ocitocina e a vasopressina, mediadas por receptores presentes no epidídimo, também auxiliam na contratilidade epididimária (COSENTINO; COCKETT 1986). 2.3.2. Maturação espermática no epidídimo Entre as mudanças que se produzem nos espermatozoides estão o aumento da motilidade e o aumento do potencial de fertilidade (GATTI et al., 2004). O processo de maturação dos espermatozoides depende de uma sequência de modificações espermáticas, resultantes da interação da superfície do espermatozoide com diferentes componentes do fluido epididimário, mas, também dependem dos processos inerentes aos próprios espermatozoides (DACHEUX et al., 2005). O trânsito dos espermatozoides pelo epidídimo induz mudanças celulares e nos fluidos que os rodeiam (COSENTINO; COCKETT, 1986; GATTI et al., 2004). Durante a passagem pela cabeça e corpo do epidídimo, as células espermáticas sofrem um processo de maturação, a qual é consequência da atividade de proteínas especificas presentes no lúmen do túbulo epididimário (DACHEUX et al., 2005). A maior parte dos componentes do líquido epididimário é produto das secreções do tecido epitelial do epidídimo (GATTI et al., 2004). Estas secreções são representadas por mais de 100 tipos diferentes de proteínas, contudo há regiões mais ativas. A cabeça e o corpo podem sintetizar aproximadamente 80% das proteínas presentes no fluido epididimário, demostrando que as atividades do órgão se encontram regionalizadas (GATTI et al., 2004). A síntese de proteínas e secreções do epidídimo no lúmen é regulada por andrógenos testiculares, que varia9m em concentração de um segmento para outro no epidídimo (DACHEUX et al., 2005). Isto resulta, numa mistura complexa de proteínas interagindo com o espermatozoide no lúmen do epidídimo 8 (DACHEUX et al., 2005). O fluido do epidídimo contém um fator de inibição da motilidade que pode servir para conservar as reservas de energia das células espermáticas, e o espermatozoide modifica algumas vias metabólicas, adquirindo características de motilidade nas regiões mais distais do epididimo (COSENTINO; COCKETT, 1986). Além da secreção e interação com proteínas, a maturação espermática no epidídimo é dependente do transporte de sódio e potássio, dos andrógenos, e da temperatura escrotal (SUTOTSKY; LOVERCAMP, 2010). As mudanças na estrutura dos espermatozoides se devem aos fosfolipídios e colesterol da membrana espermática, que são utilizados como substratos, durante a maturação (DACHEUX et al., 2005). Assim, o espermatozoide sofre mudanças significativas na sua morfologia, durante o trânsito epididimário (DACHEUX et al., 2005). Porém, a morfologia espermática não é a principal alteração nestas células, durante a passagem pelo epidídimo (ROBAIRE, 2006). Nota-se a migração da gota citoplasmática (GATTI et al., 2004;SUTOTSKY; LOVERCAMP, 2010), um remanescente citoplásmico da espermátide separado durante a espermiação (SUTOTSKY; LOVERCAMP, 2010). Nos espermatozoides testiculares, a gota citoplasmática encontrasse na região anterior da peça intermediária (GATTI et al., 2004). Durante o trânsito pelo epidídimo, a gota migra para região anular mais distal e durante a ejaculação se desprende da célula espermática por completo (GATTI et al., 2004; SUTOTSKY; LOVERCAMP, 2010). Durante a maturação no epidídimo também ocorre a compactação final da cromatina (associação do DNA às protaminas) (GOLAN et al., 1996). No núcleo do espermatozoide, ocorre uma alteração na quantidade de proteínas nucleares, produzindo a compactação. Desta maneira, a cromatina estabiliza-se no núcleo do espermatozoide, em vista da formação progressiva de pontes de dissulfeto entre as proteínas nucleares entrelaçadas (GADELLA; LUNA, 2014). Durante este processo, as células adquirem ainda proteínas de superfície, que estão envolvidas na fertilização (ROBAIRE, 2006). 2.3.3. Armazenamento de espermatozoides no epidídimo Entre as mais importantes funções do epidídimo, a que está diretamente 9 envolvida na reprodução masculina, é o armazenamento de espermatozoides produzidos pelos testículos (DACHEUX et al., 2016) na cauda do epidídimo (CONSENTINO, 1986; ROBAIRE, 2006). Quando os espermatozoides entram na cabeça do epidídimo, ocorre a reabsorção do líquido testicular, obtendo assim, alta concentração espermática na cauda do epidídimo, desde milhões a bilhões de espermatozoides/mL que permanecem armazenados até a ejaculação ou eliminação na urina (DACHEUX et al., 2016). A concentração luminal de íons, pequenas moléculas orgânicas, proteínas, e glicoproteínas presentes entre a cauda e o restante do epidídimo, são condições especiais que auxiliam no armazenamento dos espermatozoides na cauda num estado quiescente. Esta manutenção se refere a um metabolismo com baixa atividade, próprio do estado quiescente, o qual previne a ativação prematura dos espermatozoides (HINTON; PALLADINO, 1995). 2.3.4. Proteção dos espermatozoides no epidídimo Para controlar os estádios pós-gonadais finais da diferenciação espermática, a morfologia e composição do fluido luminal do epidídimo são fatores chaves envolvidos na proteção da sobrevivência e maturação dos espermatozoides (DACHEUX et al., 2016). A barreira hemato-epidídimária tem a funcão de impeder, seletivamente, a passagem de proteínas séricas, propiciando um microambiente luminal especializado para a maturação espermática. Além disso, há uma sequência de mecanismos de defesa no epidídimo, para auxiliar na proteção dos espermatozoides ao sistema imune, aos xenobióticos e as espécies reativas de oxigênio (ROS) (HINTON et al., 1995). Os mecanismos de defesa incluem ainda a restrição de alguns tipos de compostos que podem penetrar o lúmen do epidídimo, a síntese e secreção de proteínas específicas, tais como as defensinas e moléculas similares as defensinas, além da rápida eliminação dos possíveis agentes nocivos e pela síntese e secreção de enzimas antioxidantes, e conjugação, síntese e secreção de compostos antioxidantes tais como a glutationa peroxidase e a taurina (COSENTINO; COCKETT, 1986). Ademais, em vista dos espermatozoides 10 encontrarem-se num ambiente hiperosmótico, o epidídimo deve garantir que as células estejam protegidas de possíveis modificações abruptas na osmolaridade, o que pode influenciar o volume celular (ROBAIRE, 2006). É fundamental que os espermatozoides sejam protegidos dos efeitos deletérios das ROS, na medida em que avançam ao longo do ducto epididimário. Os efeitos da peroxidação lipídica das membranas têm sido associados com alterações na peça intermediária, diminuição da motilidade, em vista de defeitos no axonema, e a redução dos níveis intracelulares de ATP, assim como a consequente alteração da capacidade de fertilização (GADELLA; LUNA, 2014). Os espermatozoides estão principalmente protegidos das ROS pela enzima superóxido dismutase, a qual protege as células da peroxidação de lipídios (GADELLA; LUNA, 2014; COSENTINO; COCKETT, 1986). As principais enzimas antioxidantes presentes no epidídimo incluem a superóxido dismutase, γ-glutamil transpeptidase, glutationa peroxidase, glutatitiona transferase, e a indolamina dioxigenase. Cada uma das enzimas e moléculas antioxidantes se encontra em diferentes quantidades ao longo do epidídimo (COSENTINO; COCKETT, 1986). 2.3.5. Fluido epidídimário Como quase todos os componentes do fluido da rete testis são reabsorvidos, a maior parte dos componentes presentes do fluido epididimário é resultado da secreção ativa das células epiteliais ao longo do ducto epididimário (DACHEUX, 2016). O microambiente luminal do epidídimo resulta das contribuições dos íons, solutos orgânicos e proteínas (WALES et al., 1966; DACHEUX, 2016). Então, o fluido do epidídimo proporciona ao gameta masculino, um ambiente análogo ao proporcionado pelo plasma sanguíneo aos tecidos celulares (COOPER, 1998). Devido à presença das barreiras hemato-testicular e a hemato-epididimária, a maioria das proteínas do sangue não são encontradas no fluido do epidídimo, a exceção da albumina e transferrina (ROBAIRE, 2006). 2.4. Glândulas sexuais acessórias No touro, as glândulas sexuais acessórias são próstata, vesícula seminal, ampola e glândulas bulbouretrais (FAYRER-HOSKEN, 1997). Estas glândulas secretam um fluido que consiste de mistura complexa de íons inorgânicos, 11 açúcares, sais orgânicos, lipídios, enzimas, prostaglandina, proteínas e diversos outros fatores. Este fluido se mistura às células espermáticas durante a ejaculação e potencializada sua capacidade fertilizante (MOURA et al., 2007; DRUART, 2013; SYLLA, 2015). 2.5. Formação e componentes do ejaculado O ejaculado é formado por espermatozoides, originários da cauda do epidídimo, e plasma seminal, que é composto por secreções epidimárias e das glândulas sexuais acessórias (FAYRER-HOSKEN, 1997). O plasma seminal é meio de suporte e transportador das células espermáticas até o trato genital da fêmea. No touro, o ejaculado tem em média 4 mL, embora pode haver uma variação entre 1 a 15 mL, de acordo com a idade, raça e a genética do animal (FAYRER-HOSKEN, 1997). 2.6. Proteômica espermática e dos fluidos do trato reprodutor masculino A proteômica é o grupo de tecnologias que nasceu da finalidade de pesquisar a estrutura e função do conjunto de proteínas que formam determinado proteoma. Estudos proteômicos são realizados por comparações qualitativas e quantitativas das proteínas identificadas nos tecidos ou nos fluidos (BARBOSA et al., 2012; CARBONARO, 2004). As comparações entre as proteínas permitem identificar ou estabelecer os mecanismos celulares, como alterações de genes, seus transcritos e os produtos proteicos envolvidos nos diferentes processos biológicos de determinado organismo (BARBOSA et al., 2012; CARBONARO, 2004). Estudos das proteínas do plasma seminal de bovinos iniciaram-se na década de 50 (LARSON; SALISBURY, 1954; BERTOK; PASZTOR, 1957) e atualmente vários estudos têm sido desenvolvido, tanto das células espermáticas, assim como de outros fluidos do trato reprodutor masculino, com o principal propósito de conhecer a fisiologia espermática e investigar a influências do perfil proteíco sobre a fertilidade (JOBIM et al., 2004; MOURA et al., 2010; DRUART et al., 2013; ASLAM et al., 2014; REGO et al., 2014; BOE-HANSEN et al., 2014; SARSAIFI et al., 2015; DACHEUX et al., 2016; WESTFALEWICZ et al., 2017). 12 2.6.1. Proteínas espermáticas Proteínas nucleares do espermatozoide tem ganhado destaque em muitos estudos (MAIER et al., 1990; SIMÕES et al., 2009; Ganguly et al., 2013; FORTES et al., 2014). A célula espermática é especializada e seu conteúdo nuclear contem tipos diferenciados de proteínas. Durante sua formação, as histonas, proteínas presentes nas células somáticas, são substituídas pelas protaminas, e estão presentes até a espermátide inicial (BALHORN, 2007). As protaminas são consideradas pequenas proteínas de cadeia curta de aminoácidos (entre 50 a 110 aminoácidos). Nesta cadeia são encontrados, especialmente aminoácidos básicos, como a arginina, que compõe mais de 70% na cadeia, e a císteina (BALHORN, 2007). A arginina e a císteina, por serem aminoácidos básicos, confere-lhe a propriedade de ser fortemente básica e de carga positiva (CARREL et al., 2007). Os altos níveis de arginina e cisteína promovem a união entre os filamentos de DNA e a formação de pontes dissulfetos, indispensáveis para o adequado empacotamento da cromatina espermática (CARREL et al., 2007). As protaminas podem se encontrar de duas formas nas diferentes espécies. A protamina tipo 1 (PRM1) está presente em todos os mamíferos, e a protamina tipo 2 (PRM2) presente apenas nas células espermáticas de mamíferos placentários (OLIVA, 2006; DOGAN et al., 2015) No bovino, embora o gene da PRM2 seja transcrito e traduzido em níveis baixos nas espermátides, o seu produto é ausente no espermatozoide (COELING et al., 1972; MAIER et al., 1990), já a variante PRM1 está presente nesta espécie (CORZET et al., 2002). As funções das protaminas são proteção e reorganização do DNA constituindo uma estrutura altamente condensada, o que desencadeia outras funções como a condensação do genoma paterno, geração do núcleo hidrodinâmico para o transporte do material genético e a proteção da mensagem genética paterna (OLIVA, 2006; RIOS, 2010). A diminuição no conteúdo das protaminas está relacionada à condensação incompleta da cromatina espermática e a uma inadequada integridade do DNA. A cromatina está susceptível a agentes endógenos e exógenos como radicais livres ou fatores mutagênicos, o que levaria a danos no material genético e infertilidade. Esta susceptibilidade é maior durante a maturação espermática que vai ocorrer no 13 percurso pelo epidídimo (SMITH et al., 2006; DOGAN et al., 2015). Apesar desta diferença entre as proteínas nucleares e sua importância como agente protetor do material genético espermático, a funcionalidade dos espermatozoides está associada principalmente as proteínas que aderidas à célula ao longo do seu trânsito pelo epidídimo e após a ejaculação, as quais são consideradas as mais importantes para conferir-lhes capacidade fertilizante (GADELLA; LUNA, 2014). Porém, é imprescindível a presença e a expressão de várias proteínas específicas para cada uma das fases da espermatogênese. A IZUMO, uma proteína transmembrana tipo I, que faz parte da família IgSF (superfamilia das imunoglobulinas) (YOUNG et al., 2015), amplamente estudada em humanos, mas já descrita em muitas espécies, está localizada abaixo da membrana até a ejaculação (INOUE et al., 2008). Durante o trânsito pelo epidídimo, a IZUMO é modificada, sofrendo uma fragmentação da forma não-glicosilada, por ação de proteases acrossomais, como a acrosina (BABA et al., 1994). IZUMO foi descrita inicialmente na cabeça de espermatozoides de ratos, FUKUDA et al. (2016) descreveram pela primeira vez sua função em espermatozoides de touros durante a maturação, reação do acrossomo e criopreservação (INOUE et al, 2005; FUKUDA et al., 2016). A proteína foi relacionada a fertilidade bovina por ser considerada uma proteína essencial na interação e fusão do espermatozoide ao oócito (INOUE et al, 2005; INOUE et al., 2008; FUKUDA et al., 2016). As tetkinas (TEKTs) formam um grupo de proteínas filamentosas constitutiva, localizadas na lâmina nuclear, nos cílios e nos flagelos (ROY et al., 2009; OIKI et al., 2014). Nos mamíferos, têm sido identificadas 5 TEKTs (TEKT1, 2, 3, 4 e 5) nos espermatozoides associada com o axonema flagelar. Nos espermatozoides imaturos, contidos nos testículos, estudos ultraestruturais e bioquímicos, demonstraram que a proteína TEKT3, está também associada com a superfície das mitocôndrias e fibras densas exteriores da peça intermediária (OIKI et al., 2014; TAKIGUCHI et al., 2011). Além disso, a TEKT3 também está presente na região equatorial da membrana acrossomal da cabeça de espermatozoides de ratos (TAKIGUCHI et al., 2011). Ainda em ratos, a ausência de TEKT3 foi associada com a redução da motilidade espermática e maior porcentagem de defeitos estruturais na cauda dos espermatozoides (ROY et al., 14 2009). Em bovinos, foi um polipeptideo de sequência similar à TEKT3 foi identificado em espermatozoides do epidídimo, o qual se encontrava na região acrossomal interna, e foi associado à função de regulação das hidrolases que são liberadas durante a reação do acrossomo (NAGDAS et al., 2015). 2.6.2. Proteínas flagelares O flagelo da célula espermática possui quatro regiões distintas, a peça de conexão (colo), adjacente à cabeça; a peça intermediária, que forma um conjunto helicoidal de mitocôndrias empacotadas ao redor do citoesqueleto; a peça principal; e peça final (EDDY et al., 2003). Recentemente, têm sido identificadas proteínas que tem o papel de regular a função do flagelo e dos componentes das suas regiões. Estas proteínas contribuem na regulação da motilidade espermática, e dentre as mais estudadas no bovino encontra-se o complexo rhophilin-ropporin, proteínas 3 e 4 de ancoragem a quinase A (AKAP3 e AKAP4) (EDDY et al., 2003). As proteínas AKAPs (AKAP3 e AKAP4) são consideradas as proteínas estruturais mais abundantes da bainha fibrosa, além de participar da montagem do flagelo, participam da aquisição inicial da motilidade (EDDY et al., 2003). A AKAP3 é sintetizada nas espermátides redondas, se incorporando na bainha fibrosa e tem como função a organização desta estrutura (BROWN et al., 2003). AKAP 4 é sintetizada posteriormente no desenvolvimento das espermátides, e tem a função de finalizar a montagem da bainha fibrosa (BROWN et al., 2003). O complexo rhophilin-ropporin é formado por estas duas proteínas constitutivas da bainha fibrosa dos espermatozoides de mamíferos, que podem estar localizadas tanto na peça principal como na peça final do flagelo espermático. rhophilin é uma proteína caracterizada por três domínios denominados domínios de união Rho, localizados no aminoácido 70 do seu N- terminal. A rhophilin atua como um adaptador de proteínas, promovendo a união entre o domínio Rho e as proteínas de interação com a rhophilin, tais como a ropporin (FUJITA et al., 2000). A ropporin é uma proteína reguladora de AMPc kinase dependente (CHEN et al., 2011). No touro a ropporin 1 já foi relacionada a motilidade espermática (YOON et al., 2016). 15 2.6.3. Proteínas do fluido epididimário Várias proteínas de origem epididimária, as quais são inseridas ao espermatozoide durante o seu trânsito pelo epidídimo, já foram identificadas (COOPER, 1998). Estas proteínas podem atuar como proteínas integrais da membrana, e outras são ancoradas a superfície da membrana espermática via GPI (COOPER, 1998; PHELPS et al., 1988). Estas proteínas são transportadas para as células espermáticas de diferentes maneiras e, atualmente dois mecanismos foram estabecidos, por partículas tipo vesículas ou exossomos, denominados de epididimossomos e também como proteínas em fase solúvel (COOPER, 1998; THÉRY et al., 2002). A descoberta de vesículas extracelulares nos fluidos biológicos que transportam os espermatozoides permitiu demostrar que a presença de complexos com alta massa molecular no fluido epididimário, os epididimossomos, é uma característica especial do trato reprodutor masculino (YANAGIMACHI et al., 1985;FRENETTE et al., 2002; SULLIVAN, 2015). Uma característica dos epididimossomos e das vesículas provenientes, sintetizadas na próstata (prostassomos) está relacionada com a capacidade para transferir novas proteínas aos espermatozoides (FRENETTE et al., 2002). Estas estruturas estão presentes no fluido epididimário e prostático (prostassomos) e se encontram relacionadas com a maturação espermática pós-testicular e a aquisição da capacidade fecundante (Figura 2; SAEZ, 2003; GATTI, 2004). Nos epididimosomos já foram encontradas proteínas hidrofóbicas (FRENETTE et al., 2002; SAEZ et al., 2003; GATTI et al., 2004), o que lhes confere a carcaterísticas de carrear proteínas que não serião transportadas de outra maneira. Os epididimossomos são secretados por vias apócrinas envolvidas na maturação do espermatozoide, e a população de epididimiossomos presentes em determinado segmento do epidídimo pode ser heterogênea (FORNÉS et al., 1995., SULLIVAN, 2015). Apesar desta importante via de transporte de proteínas, poucas moléculas foram associadas aos epididimossomos. Dentre as identificadas nos bovinos, destaca-se a P25b, uma proteína de ancoragem ao Glicosilfosfatidilinositol GPI, cuja transferência dos epidídimossomos ao espermatozoide tem sido considerada indispensável para a fertilidade bovina, por estar presente em touros de alta 16 fertilidade. Desta maneira, esta macromolécula é considerada como um marcador de fertilidade em bovinos (PARENT et al., 1999; FRENETE et al, 2002). A função da P25b está relacionada com o reconhecimento e união dos gametas (BERUBE; SULLIVAN, 1994). Outra proteína associada aos epididimossomos é a ELSPBP1, já identificada no epidídimo bovino. A ELSPBP1 apresenta é similar a BSP, e tem afinidade por uma enzima denominada BLVRA (biliverdin reductase A). O complexo formado; o complexo formado ELSPBP1/BLVRA se liga aos espermatozoides mortos no epidídimo, e a BLVRA tem atividade contra as ROS geradas por estas células, além de proteger os espermatozoides sobreviventes do estresse oxidativo (SULLIVAN, 2015). Figura 2. Características das vesículas extracelulares de transporte proteíco do epidídimo (epididimossomos) e da próstata (prostassomos). Adaptado de http://www.reproduction-online.org A proteína MIF (Macrophage migration inhibitory fator), identificada como uma citocina secretada pelo epididimo, é transferida pelos epidídimossomos para as fibras densas da cauda espermática (EICKHOFF et al., 2001), que contém na sua sequência três cisteínas como tiols livres. Estes grupos tiols quelam o zinco 17 associado às fibras densas flagelares externas, ajudando na formação de pontes dissulfeto entre as proteínas estruturais do flagelo (EICKHOFF et al., 2004), contribuindo para a modulação da motilidade espermática no trânsito pelo epididimo (EICKHOFF et al., 2004; FRENETTE et al., 2005). Outra proteína associada aos epididimossomos em bovinos é a ubiquitina uma proteína envolvida no reconhecimento e eliminação de espermatozoides defeituosos do fluido epididimal (SUTOVSKY et al., 2001). Além dos epididimossomos, várias proteínas são solúveis no fluido epididmário. Dentre esta fertilina (PH30), uma proteína da família ADAM (disintegrin e metalloprotease), também conhecida como MDC (desintegrinas- metaloproteases ricas em cisteína). Este tipo proteíco possue um domínio desintegrina e um domínio metaloprotease. São proteínas implicadas na união espematozoide-oócito e na fusão de membranas durante a fertilização (WATERS; WHITE, 1997). A clusterina é uma glicoproteína ácida heterodimérica, com uma massa molecular de 80 a 85 kDa, também conhecida como glicoproteína-2 sulfatada ou SGP-2. É uma proteína de origem testicular (rete testis) e epidídimária (fluido epidídimário) que possui dois sítios de união á heparina em humanos (TUNG, 1985; PANKHURST et al., 1998; IBRAHIM et al., 1999). No touro está presente no tecido hepático, cérebro e testículos (PALMER DJ; CHRISTIE DL, 1992). Esta proteína se liga aos espermatozoides anormais de touros, induzindo sua aglutinação, o que explica sua correlação negativa com índices de fecundação e motilidade espermática (O’BRIAN, 1994). A avaliação da concentração de clusterina no ejaculado pode indicar disfunção da espermatogênese e seus efeitos sobre a fertilidade (IBRAHIM et al., 2000). Além disso, a clusterina também foi relacionada com a adesão celular e a maturação espermática (BLASCHUK et al., 1983; SYLVESTER et al., 1991). Alem, a presença da clusterina pode expressar uma resposta ao choque termino e ao estrese oxidativo; tem sido estudado que esta proteína protege ao espermatozoide contra o estrese oxidativo, atuando como chaperona nos processos tóxicos que envolvem a precipitação das proteinas da membrana espermatica, assim atua controlando a desnaturação e estabilização dessas proteinas (MOURA et al., 2006; REYES-MORENO et al., 2002) 18 A proteína prostaglandina-D sintetase tipo lipocalina (PDGS ou SP26) é a principal proteína secretada pelas células epiteliais do epidídimo e pode ser identificada no plasma seminal, na cauda do epidídimo e nas células de Sertoli. Possui massa molecular de 26 kDa e esta localizada na região apical do acrossomo espermático (GERENA et al., 1998; GERENA et al., 2000). Pela sua localização nas células de Sertoli, seu papel na espermatogênese e no armazenamento dos espermatozoides no epidídimo, foi relacionada com a maturação espermática, mas sua função na fertilidade bovina é ainda contraditório (MORTARINO et al., 1998;GERENA et al., 2000; MOURA et al., 2006; JOBIM et al., 2009). 2.6.4. Proteínas do plasma seminal Na última decada, diferentes pesquisas, usando distintas metodologias proteômicas tiveram como foco comprovar a hipótese que o plasma seminal da espécie bovina contém proteínas associadas com a fertilidade de touros (LAFLEUR et al., 2010, DRUART et al., 2013; FOLHADELLA et al., 2013, ASLAM et al., 2014, REGO et al., 2014, BOE-HANSEN et al., 2015, SARSAIFI et al., 2015, PATEL et al., 2016, RODRIGUEZ-VILLAMIL et al., 2016). Neste sentido, as proteínas presentes no plasma seminal podem influenciar nas funções dos espermatozoides, de modo que a capacitação espermática, a reação do acrossomo, bem como a motilidade, a integridade do DNA e a interação com o oócito, são dependentes da ação de proteínas específicas que desencadeiam processos celulares produzindo determinadas funções nas células espermáticas (MOURA et al., 2007; MANJUNATH, 2009; SYLLA, 2015). Nos bovinos, o plasma seminal contémem maior quantidade, proteínas que fazem parte de duas famílias, as espermadesinas e o grupo com domínios fbronectina tipo II, as BSP, as quais incluem BSP1, BSP3 e BSP5 (MANJUNATH et al., 2009, RODRIGUEZ-VILLAMIL et al.,2016). As proteínas BSPs e as espermadesinas não são as únicas proteínas que atuam na capacitação espermática e tem implicação na fertilidade bovina. Outras proteínas do plasma seminal, produzidas pelas glândulas sexuais secundárias, como PLA-2 (fosfolipase A2), SPLN (plasmina seminal), OPN (osteopontina), Clusterina e a Prosaposina tem sido avaliadas e encontradas em touros de alta 19 fertilidade (TEDESCHI et al., 2000; KELLY et al., 2006; SOUZA et al., 2008). As BSPs podem ser encontradas no plasma seminal de quase todos os mamíferos (MANJUNATH et al., 2009). Estas proteínas perfazem, aproximadamente, 40 a 57% do total das proteínas do plasma seminal bovino. A BSP1 representa a maior percentagem das BSPs (25 a 47%), seguida pela BSP3 com 0,4 a 0,9%. A BSP5 está em menor concentração com 0,5 a 1% da fração proteica total das BSP (NAUC; MANJUNATH, 2000). As proteínas da família BSPs são proteínas de natureza ácida, tem massa molecular relativamente baixa, entre 12 a 30 kDa e podem estar ou não glicosiladas (MANJUNATH et al., 2007). As BSP tem uma estrutura secundária comum, composta por um domínio N-terminal variável, seguido de dois fibronectinas tipo II dispostas a cada lado (cada uma de 40 aminoácidos) de um ligador linker composto por sete aminoácidos e um domínio C-terminal curto que pode ser variável. A família das proteínas BSPs possui importante capacidade de interação com vários ligantes, incluindo diferentes tipos de colágeno, fibrinogênio, heparina, apolipoproteina A1, lipoproteínas de alta densidade (HDL) e espermatozoide bovino (MANJUNATH; SAIRAM 1987; MANJUNATH et al., 1989; CHANDONNET, et al., 1990; GASSET et al., 1997). A capacidade de ligação é conferida pela presença dos domínios tipo fibroectina II (MANJUNATH et al., 2009). As BSPs são essenciais para a capacitação espermática bovina, especialmente a BSP1 (LAFLEUR, 2010), processo que ocorre no trato genital feminino, e envolve a adesão de moléculas originárias dos fluidos da fêmea (THERIEN, 2013). A capacitação e reação do acrossomo são processos necessários para a fertilização. A capacitação espermática é constituída por múltiplas etapas, que promove várias mudanças bioquímicas e estruturais na membrana espermática (THERIEN, 1998). Uma destas alterações inclui as BSPs, que se ligam a membrana espermática na ejaculação. Inicialmente, a ligação das BSPs aos fosfolipídios de membrana podem prevenir a movimentação dos fosfolipídios e estabilizar a membrana e o espermatozoide pode transitar pelo trato reprodutor feminino, sem que ocorra a capacitação precoce. Porém no trato reprodutor da fêmea, as BSPs se ligam a diferentes proteínas, incluindo as lipoproteínas de alta densidade (HDL) e aos glicosaminoglicanos que iniciarão a mobilização do 20 colesterol e fosfolipídeos (fosfatidilcolina) da membrana e sua desestabilização, dando início à reorganização estrutural, que será o passo inicial da capacitação espermática e reação do acrossomo (CHANDONNET; ROBERTS, 1990; MANJUNATH et al., 2007; MANJUNATH; HERIEN, 2002;THERIEN, 2013). Os fosfolipídeos da membrana espermática são os sítios de ligação das BSPs, principalmente a fostatidilcolina, fosfatidilcolina plasmalogena e a esfingomielina (DESNOYERS; MANJUNATH 1992; MANJUNATH; SOUBEYRAND, 1994). Das BSPs, a BSP1 é a principal proteína do plasma seminal de touros que tem a capacidade de se ligar à heparina (CALVETE et al., 1999) e à moléculas semelhantes, como os GAGs e as HDLs (CHANDONNET; ROBERTS, 1990; THERIEN et al., 2005). As espermadesinas, uma família de polipeptídeos de 12 a 16 kDa com alta similaridade nas sequências (TOPFFER-PETERSEN et al., 1998; MOURA et al., 2007), também estão presentes no plasma seminal dos bovinos (TEDESCHI, 2000). Os principais integrantes desta família são a aSFP (proteína ácida do fluido seminal) e a espermadesina Z13, que se ligam ao espermatozoide durante a ejaculação (TOPFFER-PETERSEN et al., 1998; MOURA et al., 2007). A aSFP é uma espermadesina isolada e purificada do plasma seminal de touros, formada por uma cadeia de 110 a 130 resíduos de aminoácidos, não- glicosilada e com massa molecular de 13 a 14 kDa (MOURA et al., 2007). Não tem afinidade pela heparina, mas se mantem ligada à membrana espermática até capacitação espermática, antes do espermatozoide da união do espermatozoide com o oócito, ou seja, não se une a zona pelúcida (DOSTÁLOVÀ et al., 1994; TEDESCHI, 2000). Desta maneira, não é considerada uma proteína essencial na união espermatozoide-oócito (TEDESCHI, 2000). A aSFP inibe o estresse oxidativo (MOURA ET AL., 2007; MOURA et al., 2010) e possui atividade antioxidante in vitro, sobre o dano oxidativo da membrana espermática (peroxidação lipídica) (SCHONECK, 1996). Além disso, é considerada um fator decapacitante, até o momento da fertilização (DÒSTOLOVÀ et al., 1994). A expressão do gene que codifica aSFP nos bovinos foi identificado na vesícula seminal, na ampola e no epidídimo, indicando seus possíveis locais de produção (WEMPE et al., 1992). 21 A Z13, outra espermadesina, tem sido identificada como a segunda proteína mais abundante do plasma seminal de touros, considerando a BSP1 como a primeira (MOURA et al., 2007). É uma glicoproteína que pode apresentar- se como um dímero de 26 kDa, em condições nativas, e pode ser um monômero de 13 kDa na presença de agentes redutores (TEDESCHI et al., 2000). Possui duas subunidades de 13 kDa conectadas por duas pontes dissulfeto (TEDESCHI et al., 2000). Não é uma proteína glicosilada e possui 50% de similaridade na sua sequência de aminoácidos com a aSFP, e já foi correlacionada com a motilidade espermática (TEDESCHI et al., 2000; MOURA et al., 2007). A osteopontina (OPN) ou fosfoproteína secretada 1 (SPP1), é constituida por 278 resíduos de aminoácidos, e possui uma massa molecular de 25-55 kDa (KILLIAN et al.,1993; MOURA 2005). É outra proteína ácida multifuncional encontrada no plasma seminal de bovinos (LIAW et al., 1995; MAZZALI et al., 2002; WAI AND KUO, 2004; DENHARDT, 2001; SOUZA et al., 2008). É produzida e secretada pela ampola e vesícula seminal (CANCEL et al., 1999; RODRÍGUEZ et al., 2000). A OPN pode ser sintetizada também pelas células de Sertoli e células germinativas dos túbulos seminíferos, mas estudos de expressão gênica demostraram sua presença somente nos túbulos seminíferos que contém espermátides alongadas (SIITERI et al., 1995; SOUZA et al., 2008). Esta proteína se liga na cauda e na cabeça do espermatozoide durante a ejaculação (FRANZEN; HEINEGARD, 1985; LIAW et al., 1995; MAZZALI et al., 2002; WAI AND KUO, 2004; DENHARDT, 2001; SOUZA et al., 2008). A OPN possui uma sequência rica em ácido aspártico, ácido glutâmico e serina (SORENSEN; PETERSEN, 1994), cujas funções foram relacionadas ao remodelamento das membranas, as alterações do citoesqueleto, a modulação imunológica, a prevenção do apoptose (DENHARDT, 2001; WAI; KUO, 2004; ERIKSON et al., 2007; HASHIMOTO et al., 2007; MOURA et al., 2011) e a adesão e migração celular, demostrando potencialmente sua participação nas interações espermatozoide-oócito (GONÇALVES et al., 2007). A sequência rica em ácido aspártico, ácido glutâmico e serina conferem-lhe a esta proteína a capacidade de se ligar com receptores da família das integrinas, por isso é classificada no grupo de proteínas SIBLINGS (small integrin-binding ligand, N linked glycoprotein). O complexo espermatozoide-integrina-OPN tem o potencial 22 de unir-se a outras OPN com uma maior afinidade (MOURA, 2005). A prosaposina é uma proteína de 65-70 kDa que pode ser produzida pelas células de sertoli na forma de lissosomos celulares ou pelas células epiteliais de diferentes ductos nos animais, assim pode estar presente no plasma seminal (AMANN et al., 1999;MORALES et al., 2000). Esta proteína tem sido estudada pela sua participação na interação dos gametas (MAGARGEE et al., 2000). Atualmente existe um peptídeo sintetico com a sequência proteica da prosaposina que tem a capacidade, ao igual que a molécula nativa, ao estar presente na superfície espermática de aumentar a probabilidade de se ligar o espermatozoide ao oocito; permitindo assim, além da aderência, a penetração do espermatozoide e a consequente fusão das membranas, desta forma o peptídeo ajuda ao se dar início ao desenvolvimento embrionário (HAMMERSTEDT; CRAMER, 1997). 23 REFERÊNCIAS* ALBERTS, B.; JOHNSON, A.; LEWIS, J.; RAFF, M.; ROBERTS, K.; WALTER, P. Molecular Biology of the Cell. 4. ed. New York: Garland Science, 2002. AMANN, R.; KAVANAUGH, J.; GRIEL L.; VOGLMAYR, J. Sperm production of Holstein bulls determined from testicular spermatid reserves, after cannulation of rete testis or vas deferens, and by daily ejaculation. J Dairy Sci. v. 57, n. 1, p. 93- 9. 1974. AMANN, R.P., HAMMERSTEDT, R.H., SHABANOWITZ, R.B. 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Em vista disso, este estudo objetivou caracterizar as 16 proteínas dos espermatozoides do ejaculado e da cauda do epidídimo, do plasma seminal e 17 do fluido epididimário de touros. Foram utilizados 10 touros adultos da raça Brangus. O 18 sêmen foi colhido por eletroejaculação e, posteriormente os machos foram 19 orquiectomizados para a colheita dos espermatozoides e fluido do epidídimo. As células do 20 ejaculado e da cauda do epidídimo foram analisadas subjetivamente após a colheita, e o 21 plasma seminal e fluido do epidídimo foram separados por centrifugação. Então, as 22 amostras foram preparadas para a espectrometria de massas (ESI-QTOF MS/MS), com um 23 pool de cada grupo. A concentração de proteínas totais não diferiu entre os grupos. Foram 24 encontradas 67 e 66 proteínas nos espermatozoides do ejaculado e da cauda do epidídimo, 25 e 20 e 16 no plasma seminal e líquido epididimário, respectivamente. Além disso, 52 26 proteínas foram comuns entre os espermatozoides obtidos do ejaculado e da cauda do 27 epidídimo, e 9 entre o plasma seminal e fluido epididimário. Atividade catalítica foi a 28 principal função molecular nas células espermáticas; já no plasma seminal foi de ligação e 29 no fluido epididimário, atividade catalítica. As proteínas que se destacaram foram: 14-3-3 30 protein zeta/delta, A-kinase anchor protein, Calmodulin, Cytochrome c oxidase subunit 31 5A, mitochondrial, Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 2, 32 Fibronectin type III domain-containing protein 8, Glucose-6-phosphate isomerase, L-33 amino-acid oxidase, Phosphoglycerate mutase 2, Ropporin-1, Seminal ribonuclease, T-34 complex protein 1 subunit epsilon, Clusterin, Epididymal secretory protein E1, Seru