UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA Fábio Oliveira Maciel EFEITO DA ESTIMULAÇÃO ELÉTRICA E DO LASER TERAPÊUTICO NA RECUPERAÇÃO MUSCULAR E NERVOSA APÓS NEURORRAFIA LÁTERO-TERMINAL DO NERVO FIBULAR EM RATOS Tese apresentada à Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de Botucatu, para obtenção do título de Doutor em Bases Gerais da Cirurgia. Orientador (a): Prof. Dr. Fausto Viterbo de Oliveira Neto Botucatu 2019 Fábio Oliveira Maciel EFEITO DA ESTIMULAÇÃO ELÉTRICA E DO LASER TERAPÊUTICO NA RECUPERAÇÃO MUSCULAR E NERVOSA APÓS NEURORRAFIA LÁTERO-TERMINAL DO NERVO FIBULAR EM RATOS Tese apresentada à Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de Botucatu, para obtenção do título de Doutor em Bases Gerais da Cirurgia. Orientador: Prof. Dr. Fausto Viterbo de Oliveira Neto Botucatu 2019 Maciel, Fábio Oliveira. Efeito da estimulação elétrica e do laser terapêutico na recuperação muscular e nervosa após neurorrafia látero-terminal do nervo fibular em ratos / Fábio Oliveira Maciel. - Botucatu, 2019 Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", Faculdade de Medicina de Botucatu Orientador: Fausto Viterbo de Oliveira Neto Capes: 40102149 1. Estimulação elétrica. 2. Lasers. 3. Microcirurgia. 4. Músculos - Regeneração. Palavras-chave: Estimulação elétrica; Laser; Microcirurgia; Nervo fibular; Regeneração nervosa. FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. TRATAMENTO DA INFORM. DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CÂMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: LUCIANA PIZZANI-CRB 8/6772 3 Dedicatória À minha esposa Suzane e aos meus filhos Artur e Alice 4 Agradecimentos Gostaria de agradecer... A Deus por tudo!!! Aos meus pais Sérgio e Fátima pela formação como pessoa!!! Ao meu orientador Professor Fausto Viterbo por ter acreditado em mim e por todo o ensinamento!!! Às alunas Fernanda de Sanctis, Kerully Caetano Soares Santos e Karine Silveira Machado por doarem seu tempo me ajudando no laboratório!!! À Professora Selma Maria Michelin Matheus pelo suporte!!! À Professora Lídia Raquel de Carvalho por sempre me ajudar nas análises estatísticas!!! Aos membros da UNIPEX, principalmente do Bloco 2 e especialmente ao Luiz Carlos Edivalter Bardella!!! Ao Escritório de Apoio a Pesquisa EAP por todo o apoio!!! À UFAM por permitir que isso fosse possível!!! À FAPESP por financiar a pesquisa!!! À UNESP por investir na minha formação!!! A todos que de alguma maneira me ajudaram nessa caminhada, pois não construímos um trabalho dessa importâncias sozinhos!!! 5 SUMÁRIO DEDICATÓRIA.................................................................................................... 03 AGRADECIMENTOS.......................................................................................... 04 RESUMO............................................................................................................. 06 ABSTRACT......................................................................................................... 07 1 INTRODUÇÃO................................................................................................. 08 2 OBJETIVO....................................................................................................... 20 3 MÉTODO.......................................................................................................... 21 4 RESULTADOS................................................................................................. 39 5 DISCUSSÃO.................................................................................................... 61 6 CONCLUSÃO.................................................................................................. 73 REFERÊNCIAS................................................................................................... 74 ANEXO 1............................................................................................................. 90 6 RESUMO INTRODUÇÃO: Os nervos periféricos, assim como os demais tecidos do organismo, estão sujeitos a doenças inflamatórias, traumáticas, metabólicas, tóxicas, genéticas e neoplásicas. Estas doenças levam a diferentes tipos e graus de lesões. As lesões nervosas são bem conhecidas pela redução da capacidade funcional e diminuição da qualidade de vida dos pacientes, essas lesões induzem altos gastos socioeconômicos devido à reabilitação prolongada e absenteísmo dos jovens vítimas de trauma. Questiona-se se a Estimulação Elétrica (EE) e a terapia por Laser de Baixa Potência (LBP) teriam capacidade de melhorar a recuperação muscular e nervosa pós - neurorrafia látero - terminal (NLT). OBJETIVO: Analisar a eficiência da EE e da terapia por LBP na manutenção do músculo tibial cranial (MTC) e regeneração do nervo fibular comum pós NLT. MÉTODO: Trabalho aprovado pelo CEUA FMB - UNESP Nº 1154/2015. Foram utilizados 100 ratos da linhagem Wistar, machos, com massa média de 384,33 g e aproximadamente 9 semanas de vida. Os animais foram divididos em seis grupos experimentais. Grupo Controle, Grupo Desnervado, Grupo com Neurorrafia Látero -Terminal (NLT), Grupo com NLT e Estimulação Elétrica (EE), Grupo com NLT e LASER de baixa potência (LBP) e Grupo com NLT e combinação de EE e LBP (LBP+EE). O tratamento foi realizado durante 180 dias. Foram realizados testes funcionais e histológicos. Análise Estatística: Quando comparados os grupos, foi utilizado predominantemente teste Kruskal Wallis e método de Dunn, ANOVA, seguido pelo teste de TUKEY e o teste de Friedman para avaliar a evolução funcional ao longo do tempo. Em toda a análise, foi utilizado nível de significância p<0,05. RESULTADOS: O Índice Funcional do Fibular (IFF) não mostrou diferença estatisticamente significativa entre os grupos EE, LBP e LBP+EE e o grupo controle. A morfometria muscular mostrou superioridade dos grupos EE e LBP em relação aos grupos NLT e LBP+EE. A morfometria das fibras nervosas mostrou superioridade dos grupos NLT e EE em relação aos grupos LBP e LBP+EE. A razão G mostrou o grupo EE superior aos demais. CONCLUSÃO: Com base em nosso modelo experimental, concluímos que todos os tratamentos puderam promover um gral de recuperação muscular, nervosa e funcional porém o grupo EE se destacou em relação aos demais. Palavras chave: Estimulação Elétrica, LASER, Microcirurgia, Nervo Fibular Comum, Regeneração Nervosa 7 ABSTRACT INTRODUCTION: Peripheral nerves, as well as other tissues of the body, are subject to inflammatory, traumatic, metabolic, toxic, genetic and neoplastic diseases. These diseases lead to different types and degrees of injury. Nerve injuries are well known for reducing functional capacity and decreasing patients' quality of life. These injuries induce high socioeconomic costs due to prolonged rehabilitation and absenteeism of young trauma victims.It is questioned whether Electric Stimulation (ES) and Low Power Laser Therapy (LPLT) would have the capacity to improve muscle and nerve recovery after end to side neurorrhaphy (SEN). OBJECTIVE: To analyze the efficiency of ES and LPLT in the maintenance of cranial tibial muscle (CTM) and regeneration of the common fibular nerve post SEN. METHOD: Work approved by certificate No. 1154/2015 CEUA FMB - UNESP. One hundred Wistar rats, male, with a mean mass of 384.33 g and approximately 9 weeks of life, were used. The animals were divided into six experimental groups. Control group, denervated group, group with neurorrhaphy. Grupo Controle, Grupo Desnervado, Group with SEN, Group with SEN and Electrical Stimulation (ES), Group with SEN and low power LASER (LPL) and Group with SEN and combination of ES and LPL (LPL + ES). The treatment was performed for 180 days. Functional and histological tests were performed. Statistical analysis: When comparing the groups, were used predominantly, the Kruskal Wallis test followed by Dunn´s method and ANOVA, followed by the TUKEY test and the Friedman test to evaluate the functional evolution over time. Throughout the analysis, significance level was used p <0.05. RESULTS: The Fibular Functional Index (FFI) showed that there was no statistically significant difference between the EE, LBP and LBP+EE groups and the control group. The muscular morphometry showed superiority of the EE and LBP groups over NLT and LBP+EE groups. The nerve fibers morphometry showed superiority of the NLT and EE groups in relation to the LBP and LBP+EE groups. The G ratio showed the EE group higher than the others. CONCLUSION: Based on our experimental model, we conclude that all treatments could promote a gral of muscular recovery, nervous and functional, but the EE group stood out in relation to the others. Key words: Electrical Stimulation, LASER, Microsurgery, Common Fibular Nerve, Nervous Regeneration 8 1 INTRODUÇÃO Os nervos periféricos, assim como os demais tecidos do organismo, estão sujeitos a doenças inflamatórias, traumáticas, metabólicas, tóxicas, genéticas e neoplásicas (Girolami et al., 2000). Estas doenças levam a diferentes tipos e graus de lesões (Politis et al., 1982; Lundborg et al., 1986). As lesões em nervos periféricos usualmente provocam alterações na estrutura, metabolismo e atividade fisiológica do corpo celular neuronal, podendo interromper a inervação dos órgãos distais à lesão e, tratando-se de neurônio motor, o órgão comprometido é o músculo (Chem, 1978; Da-Silva, 1995; Valent et al, 2018). Os nervos periféricos compõem-se de tecido nervoso e de tecidos conectivos, os quais são auxiliares na manutenção da continuidade, nutrição e proteção aos neurônios. As fibras nervosas apresentam-se envolvidas por tecido conjuntivo, organizados em três níveis: epineuro, perineuro e endoneuro (Junqueira & Carneiro, 1999; Millesi et al., 2007). Em um corte transversal, o nervo é revestido por uma camada externa de tecido conjuntivo com boa vascularização, o epineuro. No epineuro, encontram-se fibroblastos organizados em camadas concêntricas e separados por fibras colágenas dispostas longitudinalmente (Junqueira & Carneiro, 1999). Mais internamente, as fibras nervosas são organizadas em fascículos e, ao redor dos fascículos, encontra-se uma camada de tecido conjuntivo formada por fibroblastos e fibras colágenas dos tipos I e III. Esta camada é denominada de perineuro. O perineuro constitui uma barreira químico-mecânica às substâncias difusíveis e às lesões externas, mantendo o microambiente intrafascicular e conferindo resistência aos nervos (Junqueira & Carneiro, 1999). No interior dos fascículos, encontram-se os feixes de fibras nervosas, as quais são formadas por um axônio envolvido por uma fina camada de tecido conjuntivo chamado endoneuro (Millesi et al., 1995; Junqueira & Carneiro, 1999). Ao redor das fibras nervosas, encontra-se uma camada de células de Schwann, as quais podem apresentar-se como mielínicas, que são formadoras de bainha de mielina, ou amielínicas, que não formam esta bainha (Burt, 1995). Os nervos periféricos podem apresentar três padrões básicos de arquitetura intraneural de acordo com o número de fascículos: os monofasciculares, os oligofasciculares e os polifasciculares (Junqueira & Carneiro, 1999). 9 As fibras que compõem um nervo podem ser motores, sensitivos ou autonômicos, porém, em geral, os nervos apresentam mais de um tipo de axônio, sendo denominados de nervos mistos (Burt, 1995). Após uma lesão do nervo periférico, ocorrem alterações morfológicas, fisiológicas, moleculares e metabólicas no segmento distal à lesão, em alguns nodos terminais do coto proximal e no corpo celular do neurônio. Esta série de alterações, relatadas inicialmente por Waller, em 1851, foram denominadas de degeneração “Walleriana” e propiciam o meio adequado à regeneração dos axônios (Fu & Gordon, 1997). De acordo com o envolvimento anatômico do nervo e os achados clínicos após as injúrias, as lesões no nervo periférico foram, inicialmente, classificadas por Seddon (1943) em três níveis: neuropraxia (lesão tipo I), caracterizada por bloqueio localizado da condução elétrica, sem interrupção da continuidade axonal ou degeneração; axoniotmese (lesão tipo II), em que ocorre ruptura na continuidade do axônio, porém os tubos endoneurais permanecem intactos; e neurotmese (lesão tipo III), na qual ocorre ruptura de uma ou mais camadas de tecido conectivo do nervo periférico. Sunderland (1968) subdividiu esta classificação em cinco níveis de lesões. Na lesão Tipo I (correspondente à neuropraxia de Seddon), ocorre um bloqueio da condução do impulso nervoso devido a uma alteração exclusivamente na bainha de mielina do nervo. A continuidade dos axônios, excitabilidade da fibra nervosa e a integridade dos órgãos distais à lesão são preservadas. Na lesão Tipo II (correspondente à axoniotmese de Seddon), ocorre perda da condução do impulso nervoso no sítio da injúria e no segmento distal do nervo devido à lesão do axônio do nervo, sendo preservado apenas o tubo endoneural. As lesões do Tipo III, IV e V de Sunderland correspondem à neurotmese de Seddon. Sunderland subdividiu a neurotmese de acordo com o envolvimento anatômico do nervo, ou seja, lesão ao nível do endoneuro, perineuro e/ou epineuro. Na lesão Tipo III, o endoneuro é comprometido estando preservados o perineuro e a bainha de mielina. Deste modo, a lesão fica limitada ao fascículo. Na lesão do Tipo IV, ocorre a interrupção dos fascículos, devido ao comprometimento do endoneuro e do perineuro. Apenas o epineuro permanece preservado. 10 Nas lesões do Tipo V, ocorre a transecção total do tronco nervoso, envolvendo tubos endoneurais, perineuro e epineuro. Neste caso, é necessário reparo cirúrgico onde conseguimos boa recuperação, porém ainda abaixo dos resultados funcionais ideais. As lesões nervosas são bem conhecidas pela redução da capacidade funcional e diminuição da qualidade de vida dos pacientes, essas lesões induzem altos gastos socioeconômicos devido à reabilitação prolongada e absenteísmo dos jovens vítimas de trauma (Huckhagel, 2018). Nesse contexto, a microcirurgia vem apresentando papel fundamental no prognóstico dos pacientes vítimas desse mal. Dessa forma, estudos para o aprimoramento das técnicas microcirúrgicas de reparação nervosa são de vital importância e têm surtido grande interesse no meio científico a fim de reduzir o número de pessoas inválidas (Sato, 2005; Huckhagel, 2018). O primeiro relato de regeneração nervosa foi feito por Galeno (131-201 d.C.) que estudou lesões de nervos periféricos mesmo estando limitado pela tecnologia da época, a observar apenas o que era visível a olho nu, no entanto, a primeira referência cirúrgica de reparo de lesões nervosas data de alguns séculos mais tarde, com Rhazes (850-932) e Avicenna (980-1037) (Majno, 1975; Brushart & Seiler, 1987; Sunderland, 1991; Zhao et al., 1992). Porém, foi atribuído a William de Saliceto (1210-1277) o primeiro registro de uma neurorrafia (Terzis et al., 1997). Em 1873, Hueter (apud Murray et al., 1994) descreveu a neurorrafia epineural como meio de restaurar a função moto-sensitiva após lesões nervosas. A neurorrafia perineural foi descrita por Langley & Hashimoto em 1917. Sunderland (1945) propagou o reparo de nervos periféricos. Kurze (1964) e Smith (1964) propuseram, simultaneamente, o uso do microscópio cirúrgico para melhorar a visualização e auxiliar nas técnicas cirúrgicas e, com isso, possibilitaram a obtenção de melhores resultados funcionais (Terzis et al., 1997). No reparo de lesões de nervos periféricos, quando se dispõem dos cotos proximais e distais, a neurorrafia término-terminal (NTT) é frequentemente, utilizada para fazer a união dos cotos do nervo lesado através de uma sutura (Rovak et al., 2001). Neste procedimento, realiza-se a aproximação dos condutos do epineuro, possibilitando a regeneração das fibras nervosas através da lesão. Essa técnica é conhecida como sutura epineural (Colemam, 1944; Bora, 1967; Bora Jr. et al., 1976; 11 Bora Jr., 1978; Rouleau et al., 1981; Millesi, 1985). Para se obter melhor orientação fascicular, pode-se utilizar a sutura perineural, também chamada de interfascicular ou funicular (Bora, 1967; Grabb et al., 1970; Millesi et al., 1972; Kleinert & Griffin, 1973; Ito et al., 1976; Orgel & Terzis, 1977; Van Dulken & Thomeer, 1978; Millesi, 1982; McQuarrie, 1985). Normalmente é utilizada, com maior frequência, a sutura epineural, por ser mais rápida e igualmente eficiente (Bratton et al., 1981; Braun ,1982). Porém, uma das limitações da NTT é a necessidade de não haver perda de tecido nervoso (Seddon, 1963; Lundborg, 1987). Quando existe perda de tecido nervoso impedindo a junção da extremidade proximal e distal para realizar-se a sutura, pode-se usar enxerto de nervo autólogo (Millesi, 1972, 1986; Narakas, 1989; Wong & Scott, 1991; Millesi, 2007). Também existem os implantes com tubos de materiais aloplásticos ou enxertos de tubos de tecido autólogo (Colin & Donoff, 1984; Evans et al., 1991; Hentz, 1991; Rodrigues & Silva, 2001; Colomé et al., 2008; Patel, Lyon e Huang, 2018). Enquanto os auto-enxertos de nervo são o padrão ouro atual para a reconstrução de danos extensivos aos nervos, o suprimento limitado de nervos autólogos e complicações associadas à retirada de nervos a partir de um segundo local cirúrgico conduziu grupos de várias disciplinas a desenvolver uma alternativa adequada ao auto enxerto (Patel, Lyon e Huang, 2018). Quando há perda da extremidade distal do nervo pode-se utilizar a neurotização muscular direta (NMD), método descrito por Heineke, em 1914 (apud Papalia et al., 2001), e por Elsberg (1917). Porém, existem situações em que ocorre a perda do coto proximal. Nestes casos, sacrifica-se um nervo vizinho, menos importante, e o mesmo é seccionado, sendo seu coto proximal suturado ao coto distal do nervo a ser reconstruído. Pode- se usar enxerto de nervo entre estes dois cotos se for necessário. No entanto, esse procedimento determina déficit motor ao nervo doador e às estruturas por ele inervadas (Harris & Tindal, 1991; Lohman et al., 1997). Além disso, a qualidade da recuperação funcional é menor quando a distância entre os cotos dos nervos forem maiores que seis centímetros (Ögün et al., 2003). Em 1903, Ballance et al. propuseram uma nova técnica como opção para evitar o sacrifício do nervo doador. Tratava-se da neurorrafia látero-terminal (NLT), na qual o coto distal do nervo a ser reconstruído era suturado à face lateral do nervo 12 doador. Porém, os movimentos dos músculos reinervados eram acompanhados de movimentos dos músculos inervados pelo nervo doador. Outros autores desta época (Ballance, 1923; Stookey, 1923; Gatta, 1938) também empregaram esta técnica, mas todos faziam incisão parcial no nervo doador. Esta lesão no nervo doador determinava união tipo término-terminal dos tubos endoneurais e prejuízo no nervo doador e às estruturas por ele inervadas. Isto levou Babcock (1927) a sugerir o abandono desta técnica. Em 1992, Viterbo e Viterbo et al. propuseram a neurorrafia látero-terminal sem lesão no nervo doador e, até mesmo, sem a remoção do epineuro (Viterbo et al., 1994a e b). Em trabalho experimental em ratos, Viterbo et al. (1992) realizaram a secção do nervo fibular comum, que inerva o músculo tibial cranial (MTC), e seu coto distal foi suturado à face lateral do nervo tibial intacto, sem a remoção do epineuro. Obtiveram, pela primeira vez, reinervação muscular sem prejuízo ao nervo doador. Essa técnica trouxe grande contribuição, pois, a partir daí, qualquer nervo pode ser utilizado como nervo doador sem prejuízos para este ou para as estruturas por ele inervadas. Diversos trabalhos comprovaram os achados de Viterbo, tanto experimental como clinicamente (Lundborg et al., 1994; Viterbo et al., 1994; Al- Qattan & Al-Thunyan, 1998; Liu et al., 1999; Müeller, 2001; Rovak et al., 2001; Jaberi et al., 2003; Ögün et al., 2003; Pardini et al., 2005; Haninec et al., 2007; Maciel et al., 2013; Viterbo et al.,2017). Com relação à denominação de neurorrafia término-lateral (NTL) ou látero- terminal, há controvérsias na literatura. Ballance et al. (1903) descreveram o procedimento realizado como sendo anastomose término-lateral. Viterbo et al. (1992, 1994a, 1994b) utilizam os dois termos, neurorrafia látero-terminal ou término-lateral, conforme o nervo doador. Se o doador é suturado na lateral do receptor empregam o termo término-lateral. Quando o receptor é suturado na lateral do doador, denominam o procedimento de NLT. Embora existam diferenças básicas, o termo término-lateral é usado num sentido geral, podendo significar ambas as situações. Dellon et al. (2010) chama a atenção para a correta nomenclatura proposta por Viterbo et al. (1992). Pelo seu ineditismo, a neurorrafia látero-terminal despertou grande interesse na comunidade científica. Por apresentar potencial considerável (Viterbo et al., 1994a), diversos estudos experimentais de NLT vêm sendo realizados e muitos mostrando resultados bem sucedidos com esse tipo de neurorrafia (Viterbo, 1993; 13 Yoleri et al., 2000; Galli et al., 2002; Koh et al., 2002; Kumar & Hassan, 2002; Yamamoto et al., 2003; Hayashi et al., 2004; Maciel et al., 2013; Viterbo et al., 2017). A neurorrafia látero-terminal de nervo periférico tem sido sugerida em situações clínicas em que o segmento proximal do nervo lesionado não esteja disponível (Lundborg et al., 1994, 2000). No entanto, com todo o avanço técnico obtido com a microcirurgia, ainda não se obtém total recuperação motora, por melhor que tenha sido realizada a reparação do nervo (Sundeland, 1985), pois a recuperação completa da função motora depende da regeneração dos axônios e, durante o tempo de regeneração dos axônios, ocorre o processo de hipotrofia ou mesmo atrofia da musculatura inervada por este nervo, fato que promove prejuízo funcional para o músculo (Low & Reed 2001; Robinson & Snyder-Mackler, 2001; Starkey, 2001; Romão et al., 2007; Maciel et al., 2013). Para tentar melhorar a recuperação funcional pós NLT, foram realizados estudos para avaliar o LASER como terapia regenerativa em casos de lesões de nervos periféricos (Camargo et al, 2006; Câmara et al, 2011; Wang CZ et al, 2014; Andraus et al, 2017; Andreo et al, 2017; Rochkind, 2017). A denominação LASER (Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation), é uma sigla oriunda da língua inglesa que significa “amplificação da luz por emissão estimulada de radiação (Low & Reed 2001). O primeiro aparelho foi construído em 1960 por Theodore Maiman, cientista norte americano, em Malibu nos Estados Unidos da América. Ele utilizou o rubi como ativador e a luz produzida apresentou um comprimento de onda de 694, 3 nm (Andraus, 2009). Atualmente os Lasers mais utilizados na prática da reabilitação englobam Hélio-Neônio (HeNe), Arsenieto de Gálio (GaAs), Arsenieto de Gálio e Alumínio (AsGaAl) e Arsenieto de Gálio e Índio (AsGaIn), que apresentam efeitos biomodeladores não térmicos, os chamados “Laser de Baixa Potência” (LBP) ou Low-level laser therapy (LLLT) (Low & Reed 2001). A aplicação de laser de baixa potência tem sido utilizada para uso terapêutico no controle de mediadores envolvidos nos processos inflamatórios e para promover a maturação neural e regeneração após o nervo lesado (Camargo, 2006 Chen Y-J et al, 2014). Os efeitos não térmicos produzidos pela radiação da baixa potência são amplamente discutidos, pois de certo modo não são conhecidos todos os 14 mecanismos nem todos os elementos que participam da conversão da energia luminosa em energia bioquímica, capaz de gerar processos tão discutidos como o analgésico ou o regenerativo (Abreu et al, 2011; Chen Y-J et al, 2014; Wang CZ et al, 2014; Takhtfooladi et al. 2015). A terapia com LBP é uma técnica capaz de acelerar o processo de reparação de tecidos biológicos traumatizados (Abreu et al, 2011; Chen Y-J et al, 2014). Os mecanismos que envolvem o processo de bioestimulação estão em nível molecular (Abreu et al, 2011; Wang CZ et al, 2014). Neste caso, a luz penetra o interior do tecido onde é absorvido por determinados cromóforos, resultando no aumento do metabolismo celular através do aumento da síntese de ATP pelas mitocôndrias (Abreu et al, 2011). Pesquisas demonstram que a aplicação do LBP em determinadas patologias cutâneas possui a capacidade de estimular a proliferação de fibroblastos, além de diminuir o edema local, favorecendo a neovascularização e a regeneração neural (Abreu et al, 2011; Câmara et al, 2011; Chen Y-J et al, 2014; Takhtfooladi et al. 2015). Os efeitos benéficos da terapia por raios laser de baixa potência sobre o tecido cutâneo já são conhecidos há longa data. De fato, a irradiação laser, principalmente do laser derivado dos gases Hélio e Neônio (HeNe), foi usada em diferentes disciplinas médicas para promover a regeneração epitelial (Nissan et al, 1986; Reddy et al, 2001), em cultura de células visuais de ratos (Rochkind et al., 1987), em regeneração óssea (Saito & Shimizu, 1997). Mais recentemente, avanços tecnológicos em microeletrônica têm possibilitado a construção de diodos geradores de laser que paulatinamente estão substituindo as antigas ampolas de HeNe, barateando, sobremaneira, os custos de produção e de aquisição. As publicações que demonstram os efeitos benéficos do LBP ainda são poucas, principalmente quando falamos de regeneração nervosa periférica, além disso, da mesma maneira que ocorre com a estimulação elétrica, não existe um consenso que defina qual o melhor comprimento de onda, dosagem e os demais parâmetros a serem usados para cada tipo de efeito desejado. Para Karu (1987), entre os efeitos fisiológicos da terapia laser de baixa potência em longo prazo está o aumento da mitose e consequente divisão celular. A irradiação de fibroblastos humanos com um laser de HeNe aumentou significativamente o número de células em comparação com seus respectivos controles não irradiados. Um possível mecanismo é que a irradiação cause uma 15 recolocação no metabolismo celular, com a luz tendo o papel de controlador de disparo. Mudanças no nível de AMPc (Adenosina monofosfato cíclico) sugerem que os “quanta” de luz podem atuar como um estímulo proliferativo porque o AMPc está programado para estimular eventos de transcrição numa ampla variedade de células e possivelmente estes eventos poderiam gerar aumento da mitose. Akgul et al. em 2014, encontraram efetividade no tratamento de lesões de nervos periféricos utilizando o LBP com 650 nm de comprimento de onda em modelo animal. As análises morfológicas desse estudo indicaram que o LBP tem a capacidade de reduzir a migração de células mononucleares ao nervo danificado, levando a uma diminuição das áreas de edema e regeneração mais rápida. Em 2016, Mandelbaum-Livnat et al. encontraram, em modelo animal com o uso do LASER para preservação e recuperação do músculo conectado a um nervo periférico lesionado, que o LBP aumentou a atividade bioquímica e melhorou a recuperação morfológica muscular e por este motivo indicaram o uso com aplicações terapêuticas ao músculo especialmente na progressão da hipotrofia resultante de lesão nervosa periférica. Andraus et al. em 2017, realizaram um estudo com ratos e lesão por esmagamento do nervo isquiático tratados com LBP de 830 nm nas densidades energéticas de (35, 70, 140 e 280 J/cm2) durante 21 dias. Os resultados funcionais, com o Índice Funcional do Isquiático e teste de força, mostraram que os grupos irradiados foram superiores ao grupo lesionado sem tratamento demonstrando recuperação da função neuromuscular. Andreo et al., 2017, em uma revisão sistemática, além de mostrarem os efeitos positivos no processo de reparo neuromuscular usando tanto LBP vermelho quanto o infravermelho, com melhora funcional e morfológica, ainda chamam a atenção para a importância dos parâmetros que devem ser aplicados para alcançar regeneração em lesões de nervos periféricos. A maioria dos estudos com resultados positivos utilizam LASER com potência superior a 50 mW e energia total superior a 15 J aplicada em múltiplos pontos. Andreo et al. (2017) ainda chamam a atenção para a descrição inadequada dos parâmetros de radiância que impedem entendimento de muitos estudos que relatam resultados promissores. A falta da descrição do modo de aplicação, frequência (modo pulsado), área do feixe, energia e também início e a frequência do tratamento, torna a reprodutibilidade de experimentos impossíveis, já que diferenças 16 nessas parâmetros têm efeitos diferentes. Esta falha em descrever o protocolo constitui um obstáculo à interpretação das descobertas. Outro agente que poderia apresentar algum resultado positivo neste tratamento seria a estimulação elétrica com finalidade regenerativa, que embora controvertida, (Nemeth, 1982; Kanaya & Tajima, 1992; Williams, 1996; Iñigo, 1998; Kotwal & Schmidt, 2001; Souza et al., 2001; Carvalho et al., 2002), tornou-se objeto de estudo na recuperação funcional muscular, pois a mesma pode ser aplicada como método de prevenção da atrofia muscular que retardaria e, em alguns casos, evitaria a perda de tecido muscular resultante de um período de inatividade ou por desnervação (Guyton, 1986; Low & Reed 2001; Robinson & Snyder-Mackler, 2001; Maciel et al., 2013). No final do século XVIII, Galvani foi quem primeiro publicou experiências com preparados neuromusculares e eletricidade em animais. Por mais de dois séculos, os biólogos trabalharam com a revelação de que o músculo esquelético se contrai ao ser estimulado com eletricidade e que, ao contrair-se por qualquer motivo, gera uma corrente ou tensão perceptível. As descobertas de Galvani marcaram o início da neurofisiologia e do estudo da dinâmica da contração muscular (Basmajian, 1976). As investigações sobre o uso da eletroestimulação com finalidade regenerativa são extensas, porém os procedimentos utilizados ainda são controvertidos. Portanto, não há consenso quanto à intensidade, à frequência, à duração e aos métodos de avaliação utilizados. Vários autores, como Tagami et al. (2009) e Maciel et al. (2013), que observaram regeneração axonal durante a aplicação de eletroestimulação em ratos referem ser benéfica e sem prejuízos funcionais (Nemeth, 1982; Kanaya & Tajima, 1992; Williams, 1996; Iñigo, 1998), ao contrário de outros, que afirmam ser nociva, provocando contraturas e espasmos (Kotwal & Schmidt, 2001; Souza et al., 2001; Carvalho et al., 2002). Alguns pesquisadores afirmam que a EE provoca fadiga muscular mais rapidamente que a contração voluntária (Ruffin & Kiningham, 1993; Ward & Shkuratova, 2002; Kisner & Colby, 2005). Porém, o real mecanismo que provoca este efeito ainda está sendo estudado. Acredita-se que este mecanismo envolve o tipo de fibra muscular estimulada. Segundo Tessitore et al. (2008) as fibras musculares fásicas apresentam pequena concentração de mioglobina, têm grande potência e velocidade de contração porém 17 entram em fadiga rapidamente. Já as fibras tônicas têm grande quantidade de mioglobina e são resistentes à fadiga. Conforme Henneman et al. (1965), a ativação das unidades motoras nas contrações voluntárias ocorre das menores para as maiores unidades. Isto é conhecido como “princípio do tamanho das fibras de Henneman” e serve como uma proteção contra a fadiga, uma vez que as menores unidades motoras são formadas por fibras musculares tônicas e, por isso, menos susceptíveis à fadiga. A fadiga muscular precoce provocada por EE ocorre devido a uma reversão deste princípio ocorrendo ativação das fibras fásicas antes das fibras tônicas levando a uma fadiga muscular precoce (Neto, 2007). Gregory (2005) e Bickel et al. (2003) discordam do reversão do princípio de Henneman e sustentam que a eletroestimulação realiza um recrutamento não seletivo das fibras musculares e, por este motivo, as fibras fásicas entram em funcionamento antes do necessário provocando fadiga precoce. As duas explicações só reforçam que o uso da EE deve ser muito bem controlado, devendo-se buscar o protocolo ideal para cada situação, pois existe grande variedade de parâmetros para serem ajustados, do contrário, corremos o risco de não alcançarmos os resultados esperados (Maciel, 2010; Maciel et al., 2013). Atualmente, a estimulação elétrica para aumentar o desempenho do músculo esquelético já é aceita e, constantemente, demonstrada em estudos experimentais e clínicos (Ruffin & Kiningham, 1993; Snyder-Mackler et al., 1994; Gordon, 2016). Diversos estudos disponíveis investigam o papel da estimulação elétrica como forma de induzir fortalecimento muscular em humanos (McIntyre & Robertson, 1992; Fonseca et al., 2001; Wilk & Reinold, 2001; Stiene et al., 1996; Cabral & Monteiro- Pedro, 2003; Maciel 2010). A força muscular é uma propriedade que pode ser alterada por fatores externos, como a atividade física voluntária, e, segundo alguns autores, pela estimulação elétrica (Fox, 1975; Ruffin & Kiningham, 1993; Thomeé et al., 1995; Baker & Juhn, 2000; Cowan et al., 2001; MacGregor et al., 2004; Doucette & Child, 1996; Sperandei, 2005). Rutherford & Jones (1986) sugerem que parte do efeito do treinamento realizado por estimulação elétrica pode estar na facilitação neural em função de um número maior de unidades motoras ativas e aumento na taxa de impulsos ou em um padrão mais eficiente de recrutamento. Muitos trabalhos sugerem que a estimulação 18 elétrica sozinha ou combinada com exercícios voluntários pode ser mais eficiente no aumento de força muscular do que apenas os exercícios voluntários (Fox, 1975; McIntyre & Robertson, 1992; Ruffin & Kiningham, 1993). O estudo da regeneração nervosa e da recuperação de um músculo após neurorrafia pode ser realizado pela observação das alterações histológicas, pela medida da velocidade de condução elétrica, pela análise eletromiográfica ou pela resposta isométrica do músculo submetido à contração tetânica, ou em situações especiais, como no caso do nervo isquiático em ratos, em que o animal é submetido à análise da marcha (De Medinacelli et al., 1982; Bain et al., 1989; Sato, 2005). Através da observação destes atributos, diversos autores confirmaram a ocorrência tanto de brotamento colateral motor quanto sensorial, após a neurorrafia látero-terminal, com subsequente recuperação fisiológica do músculo previamente desnervado e recuperação funcional significante (McCallister et al., 1999; Lutz et al., 2000a; Goheen-Robillard et al., 2002; Hayashi et al., 2004; Beris et al., 2007; Brenner et al., 2007; Matsuda et al., 2008; Beris & Lykissas, 2009; Maciel et al., 2013; Viterbo et al., 2017). Goheen-Robillard et al. (2002) mostraram que a regeneração sensorial ocorre, predominantemente, em uma neurorrafia látero-terminal quatro a seis meses após a cirurgia enquanto Yamamoto et al. (2007) observaram regeneração motora com 21 meses de pós-operatório. A EE é capaz de aumentar a atividade de enzimas oxidativas em fibras musculares, realçar a regeneração muscular e prevenir a atrofia muscular esquelética (Pette & Staron, 1997). Além dos efeitos metabólicos, a EE está relacionada à redução dos danos da imobilização, minimizando a redução da área de secção transversal, fibrose intersticial e deficiência de suprimento sanguíneo (Qin et al., 1997). A EE também promove o aumento da efetividade contrátil das fibras musculares, viabilizando, desse modo, a dinâmica de captação via GLUT-4, metabolismo da glicose e a atividade das vias metabólicas celulares (Guirro et al., 2004). O transportador de glicose expressado, predominantemente, no músculo esquelético é o GLUT-4 (James et al., 1989) e sua expressão, além de ser dependente da ação da insulina, também é relacionada à contratilidade do músculo, existindo, assim, clara associação entre o transporte de glicose nas fibras musculares e o grau de contração muscular basal (Gaster et al., 2000). http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term= http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term= http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term= 19 Por esses motivos, parte das pesquisas tem ocorrido com objetivo de avaliar a funcionalidade de um músculo reinervado por neurorrafia látero-terminal e também se preocupa em propor intervenções pós NLT visando aperfeiçoar a recuperação funcional na região reinervada (Tang, 1995; Fansa et al., 1999; Durigan et al., 2006). Uma dessas possibilidades é a estimulação elétrica neuromuscular que, durante anos, tem sido objeto de estudo em eletrofisiologia (Dow et al., 2004; Durigan et al., 2006; Romão et al., 2007; Russo et al., 2008; Carvalho et al., 2009; Polônio et al., 2010; Maciel et al., 2013; Wang CZ et al, 2014; Elzing et al., 2015; Willand et al., 2015; Gordon, 2016). Ainda não se conhece todas as possibilidades de recuperação de uma musculatura reinervada por neurorrafia látero-terminal, porém, alguns trabalhos confirmam a passagem de estímulo elétrico através da mesma e registro de atividade no músculo reinervado (Giovanoli et al., 2000; Isaacs et al., 2005; Maciel et al., 2013; Viterbo et al., 2017). No entanto, a necessidade funcional de um paciente vai além da passagem do estímulo pela junção entre o nervo doador e o nervo receptor. O músculo reinervado deve apresentar características fisiológicas que permitam boa função. Uma das características mais importantes que um músculo hígido deve apresentar é a capacidade de produzir tensão durante a contração objetivando promover movimento (Enoka, 2000). Dentro desse vasto universo de possibilidades terapêuticas, questiona-se se a EE e o LBP teriam capacidade de melhorar a recuperação muscular e nervosa pós NLT. Acreditamos que os resultados encontrados neste estudo também se aplicarão na NTT, porém como a NLT é mais recente e o fato de não lesar o nervo doador aumentar seu potencial e, por isso, certamente foi cada vez mais utilizada, nós resolvemos estudar na NLT. A expectativa de responder a esse questionamento justificou a realização desta pesquisa. 20 2 OBJETIVO Analisar a eficiência da EE e da terapia por LBP na manutenção do músculo tibial cranial e regeneração do nervo fibular comum pós NLT em ratos. 21 3 MÉTODO Este trabalho foi realizado no Laboratório de Cirurgia Experimental do Departamento de Cirurgia e Ortopedia da Faculdade de Medicina de Botucatu- UNESP. Animais Todo o procedimento foi realizado de acordo com os Princípios Éticos na Experimentação Animal adotado pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA), e passou por análise da Comissão de Ética em Experimentação Animal da Faculdade de Medicina da UNESP – Campus de Botucatu, sendo aprovado sob o Protocolo nº. SIPE-70/2015 -- CEUA-1154 (Anexo 1). Os animais foram fornecidos pelo Biotério Central da UNESP – Campus de Botucatu. Foram utilizados 100 ratos (Rattus norvegicus) da linhagem Wistar, machos, com massa média de 385,3 (±48.04) g. Os animais foram divididos, através de sorteio, em seis grupos experimentais. Os animais foram sacrificados após 180 dias de tratamento. Grupos experimentais No Grupo Controle (Controle), com 10 animais, foi dissecado o nervo fibular comum, contudo, este não sofreu secção ou neurorrafia (Fig. 1). Figura 1 – Indica o procedimento cirúrgico do grupo Controle. MTC: Músculo Tibial Cranial. 22 No Grupo Desnervado (Desnervado), com 10 animais, o nervo fibular comum foi seccionado e seus cotos foram invertidos 180 graus. O coto distal foi fixado à musculatura subjacente. O coto proximal foi transpassado por uma incisão na musculatura glútea e suturado no plano subcutâneo a fim de impedir contaminação motora (Fig. 2). Figura 2 – Indica o procedimento cirúrgico do grupo Desnervado. A: Coto distal do nervo fibular comum. B: Coto proximal do nervo fibular comum. MTC: Músculo Tibial Cranial. No Grupo Neurorrafia Láteroa-teminal (NLT) com 20 animais, o nervo fibular comum foi seccionado e seu coto proximal encurvado medialmente 100°, transfixado à musculatura adjacente e foi suturado na face superficial dessa musculatura, impedindo a regeneração espontânea. O coto distal do nervo fibular comum foi encurvado, aproximadamente 80°, e suturado lateralmente ao nervo tibial (Fig. 3) Figura 3 – Indica o procedimento cirúrgico do grupo NLT. A: Coto distal do nervo fibular comum. B: Coto proximal do nervo fibular comum. C: Neurorrafia Látero- terminal. MTC: Músculo Tibial Cranial. 23 No Grupo Neurorrafia Látero-terminal e Estimulação elétrica (EE), com 20 animais, o procedimento realizado foi o mesmo que no grupo NLT, porém, após a cirurgia, os animais receberam estimulação elétrica no músculo tibial cranial como tratamento (Fig. 4). Figura 4 – Indica o procedimento cirúrgico do grupo NLTE. A: Coto distal do nervo fibular comum. B: Coto proximal do nervo fibular comum. C: Neurorrafia Látero- terminal. MTC: Músculo Tibial Cranial. Raio Vermelho: Indica tratamento com EE do MTC. No Grupo Neurorrafia Látero-terminal e LASER de Baixa Potência (LBP), com 20 animais, o procedimento realizado foi o mesmo que no grupo NLT, porém, após a cirurgia, os animais receberam tratamento por LASER (Fig. 5). Figura 5 – Indica o procedimento cirúrgico do grupo NLTE. A: Coto distal do nervo fibular comum. B: Coto proximal do nervo fibular comum. C: Neurorrafia Látero- terminal. MTC: Músculo Tibial Cranial. Raio Amarelo: Indica tratamento com LASER. 24 No Grupo Neurorrafia Látero-terminal com EE e LASER (LBP+EE), com 20 animais, o procedimento realizado foi o mesmo que no grupo NLT, porém, após a cirurgia, os animais receberam tratamento por LASER e Estimulação Elétrica (Fig. 6). Figura 6 – Indica o procedimento cirúrgico do grupo LBP+EE. A: Coto distal do nervo fibular comum. B: Coto proximal do nervo fibular comum. C: Neurorrafia Látero-terminal. MTC: Músculo Tibial Cranial. Raio Amarelo: Indica tratamento com LASER. Raio vermelho: Indica tratamento com Estimulação Elétrica. Cirurgia Todos os procedimentos cirúrgicos e de coleta foram realizados pelo pesquisador, padronizando-se o método. Precedendo cada procedimento cirúrgico, os animais foram anestesiados com ketamina (70 mg/Kg) e xilasina (30 mg/Kg) intramuscular e tricotomizados. A face dorsolateral de um dos membros pélvicos, direito ou esquerdo, escolhidos por sorteio e marcados adequadamente, sofreu incisão de 2 a 3 cm longitudinalmente ao maior eixo do membro, comprometendo pele e subcutâneo com posterior divulsão da musculatura. Os nervos isquiático, fibular comum, tibial e sural foram dissecados. Após, foi realizado o procedimento, de acordo com o grupo experimental. As cirurgias foram realizadas com o auxílio de microscópio cirúrgico DF Vasconcelos com aumentos de 10 e 16 vezes. 25 Todo o procedimento foi realizado no mesmo ato cirúrgico. As neurorrafias foram realizadas com fio monofilamentar de nylon 10-0 com agulha cilíndrica e circular, sem retirada de janela de epineuro e com dois pontos simples (Fig. 7). Figura 7 – Indica o procedimento cirúrgico em membro pélvico esquerdo do animal. a: Nervo Fibular Comum. b: Nervo Tibial. c: Nervo Sural. A: Exposição do nervo isquiático e seus ramos, nervo fibular comum, nervo tibial e nervo sural. B: Coto proximal do nervo fibular comum transfixando a musculatura adjacente e sendo suturado na face superficial dessa. C: Neurorrafia Látero-terminal do nervo fibular comum na lateral do nervo tibial. D: Outra visão da NLT. Após o procedimento, a incisão foi suturada por planos com pontos simples utilizando-se fio monofilamentar de náilon 4-0 na musculatura e pele. Os animais foram mantidos em caixas apropriadas, contendo três animais cada, em temperatura controlada (25 ± 2ºC), ciclo claro-escuro de 12 horas, com ração e água ad libitum, até o momento do sacrifício. Estimulação Elétrica A estimulação elétrica foi iniciada com cinco dias de pós-operatório. Os animais dos grupos EE e LBP+EE passaram por três sessões semanais durante os 180 dias. Receberam aplicações de estimulação elétrica para o músculo tibial cranial com Corrente Alternada Sincronizada, com frequência de base de 1Khz, modulação em 10 Hz, com duração de 2 ms (da modulação), tempo de contração de 10 26 segundos por 20 segundos de relaxamento, durante 10 minutos. A corrente inicial foi de 8 mA sendo aumentada para 12 mA após cinco minutos para evitar o efeito de acomodação do tecido muscular. Foi utilizado estimulador elétrico Neurodyn 10 Canais da empresa Ibramed (Fig. 8). O protocolo utilizado foi determinado após dois estudos pilotos, um para determinar a intensidade de corrente necessária para provocar contração muscular no rato sem anestesia e outro para determinar a frequência de estimulação e número de tratamentos semanais. O protocolo foi o mesmo utilizado em Maciel et al. (2013). Figura 8 – Estimulador Elétrico Neurodyn 10 Canais (IBRAMED) (Auxílio FAPESP 2010/09866-2). Os animais foram estimulados acordados e sem anestesia. Para isto foi utilizado uma cápsula metálica com abertura posterior para a cauda e duas aberturas laterais para fixação dos membros posteriores. Após esta imobilização, os eletrodos de um centímetro quadrado de área foram fixados sobre o ventre do MTC com fita crepe. Foram utilizadas 10 cápsulas, ao mesmo tempo, para otimizar o tempo de estimulação (Figs. 9 e 10). 27 Figura 9 – Animais recebendo estimulação elétrica. Figura 10 – Posicionamento dos animais na cápsula de estimulação. Laserterapia Foi utilizado o aparelho de LASER infra vermelho (IV) de Arsenieto de Galio (GaAs) denominado Endophoton da empresa (Amparo – SP) (Fig. 11), com comprimento de onda de 904 nm, potência de 50 mW, área do feixe de 0,067 cm2, penetração aproximada de 1,5 cm, da forma contínua. A forma de aplicacão foi pelo 28 método transcutâneo pontual e em contato (para reduzir a reflexão), com energia de 4J (80 s por ponto), em cada ponto, com o total de 3 pontos ao longo da cicatriz cirúrgica com os ratos tricotomizados. A laserterapia foi iniciada no quinto dia de pós-operatório, com aplicações três vezes por semana durante os 180 dias (Fig. 12). Figura 11 – Aparelho de Laserterapia Endophoton da KLD (Amparo – SP) Figura 12 – Pontos de aplicação do LASER ao longo da cicatriz cirúrgica do animal. 29 Testes realizados Todos os testes foram realizados e os resultados analisados pelo pesquisador. Teste de avaliação da marcha A cada 30 dias os animais foram submetidos ao teste de avaliação da marcha. Os animais previamente treinados andaram em uma canaleta de 9 cm de largura por 78 cm de comprimento tendo seu assoalho coberto com uma tira de papel branco de tamanho apropriado, após terem seus pés posteriores pintadas com tinta nanquim preta para marcar a pegada no papel (Fig. 13). Figura 13 – Teste de avaliação da marcha. As pegadas deixadas na folha de papel foram analisadas através das medidas descritas a seguir: CPN (Comprimento da pegada do pé normal); CPE (Comprimento da pegada do pé experimental); APN (Abertura total do pé normal); APE (Abertura total do pé experimental). A partir destas medidas foram realizados os cálculos do índice funcional do nervo fibular comum (IFF), segundo Bain et al. (1989) (Fig. 14). IFF = 174,9 x + CPE – CPN + APE – APN 30 CPE + 80,3 APN -13,4 Figura 14 – Medidas realizadas para cálculo do índice funcional do nervo fibular (IFF). Teste eletrofisiológico Para a realização do teste eletrofisiológico a temperatura ambiente ficou mantida em torno de 25ºC. O teste eletrofisiológico foi realizado antes do sacrifício dos animais. Após anestesia com ketamina (70 mg/Kg) e xilasina (30 mg/Kg) intramuscular, os animais foram imobilizados em decúbito ventral. Foram realizadas tricotomia e ampla incisão no membro posterior previamente operado, permitindo acesso aos nervos isquiático, fibular comum, tibial e músculo tibial cranial. O potencial de ação composto foi registrado por eletrodos de agulha ativo e de referência. O eletrodo vermelho (referência) foi colocado no tendão do músculo tibial cranial do rato; o eletrodo preto (ativo), no ventre do músculo tibial cranial do rato, e o eletrodo cinza (dispersivo), introduzido em local distante da região estudada. Os eletrodos registraram a área, a duração, a amplitude e a latência do potencial de ação muscular. Foram realizados três conjuntos de medidas para cada animal com o nervo tibial seccionado distalmente à NLT, sendo escolhido um conjunto, aquele que apresentava a maior amplitude registrada. A avaliação das propriedades funcionais do músculo foi feita através de estímulos elétricos deflagrados por um eletrodo bipolar, especialmente desenvolvido para este propósito, cujo cátodo e ânodo estavam a 2 mm um do outro. O eletrodo de estimulação bipolar foi posicionado diretamente sobre o nervo isquiático ou tibial, proximalmente à neurorrafia, possibilitando a propagação dos impulsos elétricos através dela. A frequência do estímulo foi fixada em 1 pps e a duração em 100 µs. A 31 intensidade de estímulo que foi utilizada, constante em todos os animais, foi de 5,1 volts. Foi utilizado eletromiógrafo da marca Sapphire II 4ME (Fig. 15). Figura 15 – Teste eletrofisiológico. A: Estimulação bipolar proximalmente à neurorrafia e os eletrodos de captação em agulha localizados no MTC. B: Eletromiógrafo. C: Traçado eletrofisiológico. Força de contração do MTC Após a realização do teste eletrofisiológico, o tendão distal do músculo tibial cranial foi seccionado e acoplado a um transdutor de força FT03 da empresa Grass Technologies, usando sutura com fio de náilon 4-0. O músculo foi tracionado pelo fio de náilon aumentando seu comprimento até que esta tração determinasse uma tensão com carga de 0,18 N. Este valor de pré-tensionamento foi determinado durante a calibração do dispositivo e foi reajustado entre os testes. Os eletrodos do estimulador elétrico Neurodyn 10 foram posicionados diretamente no MTC exposto. O ensaio de contração muscular consistiu em três aplicações sequenciais de 1s com corrente nas mesmas especificações da corrente utilizada para o tratamento dos animais do grupo EE. Um computador registrou os 32 picos de força. A tensão muscular foi reajustada entre as medições. O teste de contração tetânica foi realizado com 100 mA com frequência de 100 Hz (Fig. 16). Figura 16 – Teste de força de contração muscular. A: Componentes do transdutor de força. B: Transdutor de força FT03 (Auxílio FAPESP 2010/09866-2). C: Esquema de conexão do MTC com o transdutor de força. Coleta das peças histológicas e sacrifício Após a realização do teste de força muscular os animais receberam dose letal de pentobarbital sódico, administrado intraperitonealmente, e procedeu-se à coleta de segmentos do nervo fibular comum, das neurorrafias, assim como à coleta do músculo tibial cranial direito e esquerdo (Figs. 17-19). 33 Figura 17 – Estão indicados nessa figura os fragmentos que foram coletados para realização da histologia no grupo Controle. N1: Corte transversal do coto distal do nervo fibular comum. MTC: Músculo tibial cranial. Figura 18 – Estão indicados nessa figura os fragmentos que foram coletados para realização da histologia no grupo Desnervado. N1: Corte transversal do coto distal do nervo fibular comum. N2: Corte longitudinal da extremidade do coto proximal do nervo fibular comum. MTC: Músculo tibial cranial. 34 Figura 19 – Estão indicados nessa figura os fragmentos que foram coletados para realização da histologia nos grupos NLT, LBP, EE e LBP+EE. N1: Corte transversal do coto distal do nervo fibular comum. N2: Corte longitudinal da extremidade do coto proximal do nervo fibular comum. N3: Corte longitudinal da extremidade do coto distal do nervo fibular comum e NLT. MTC: Músculo tibial cranial. Os músculos tibiais craniais foram retirados, tiveram suas massas aferidas e foram mantidos imersos em nitrogênio líquido (-196ºC) até o momento do processamento histológico. Os segmentos de nervo coletados foram fixados e mantidos em solução de Karnovisk e refrigerados a 4ºC até o momento do processamento histológico. Processamento histológico do músculo tibial cranial Os músculos tibiais craniais, congelados em nitrogênio líquido, foram submetidos a secções transversais de 7 µm em criostato Leica CM1850. As secções foram realizadas na região central, transversalmente ao maior eixo do músculo. Foram realizados de 4 a 6 cortes de um mesmo músculo possibilitando a escolha, durante a análise, de um corte com menos artefatos histológicos. Os cortes histológicos foram corados pela técnica de Hematoxilina – Eosina (HE). As lâminas foram identificadas com o número de registro no laboratório para que o pesquisador não soubesse a que animal ou grupo pertencia. A numeração real foi revelada apenas no momento da análise estatística. 35 Digitalização das imagens da lâmina histológica do músculo tibial cranial. As imagens foram capturadas por uma Scanner de Imagens Pannoramic Viewer e salvas em um computador. Foram selecionadas, aleatoriamente, 5 imagens de diferentes campos de um mesmo corte histológico (uma de cada quadrante mais o centro) de cada lâmina. Foi utilizado aumento de 100 vezes para a análise das fibras musculares. Medidas de área, diâmetro menor e perímetro das fibras musculares. As imagens digitalizadas e salvas foram analisadas através de medidas de área, diâmetro mínimo e perímetro das fibras musculares. As medidas foram feitas de modo semi-automático, utilizando-se software Sigma Pro Image Analysis, versão 5, da Jandel Scientific Corporation. As fibras foram medidas, tomando-se o mínimo de 20 fibras por imagem salva (quatro por quadrante e mais quatro ao centro da imagem), ou seja, 100 fibras por lâmina, o que representará 100 fibras por músculo. Processamento histológico dos segmentos de nervo Após fixação por período superior a 24 horas em solução de Karnovisk (100 ml de Paraformaldeído a 8%, 168 ml de Gluteraldeído a 25%, 83,2 ml de Tampão Fosfato 0,2 M) e lavagem em tampão fosfato 0,1 M (pH 7,3), por três vezes, com duração de cinco minutos cada vez, os segmentos de nervo sofreram pré-coloração com tetróxido de ósmio a 1% por duas horas. Após nova lavagem com tampão fosfato, foi realizada desidratação por uma bateria de concentrações crescentes de acetona (50%, 70%, 90% e 100%). A inclusão em resina Araldite® foi realizada em duas etapas: em solução de resina e acetona (1:1), permanecendo por 24 horas em dessecador; e em resina, após 10 minutos em dessecador, permanecendo em estufa a 37ºC por uma hora. O emblocamento foi realizado posicionando-se o 36 segmento de nervo em resina Araldite® e mantido em estufa a 60ºC por 48 horas para polimerização. Antes do corte histológico os blocos foram preparados para o corte através da eliminação do excesso de resina ao redor do segmento de nervo com auxílio de uma lupa Carl Zeiss Jema adaptada, em aumento de 1,6 x, e lâmina Gillette®. Com os blocos de N1 preparados, foram realizados cortes transversais semifinos (0,5 µm) em micrótomo Leica MZ6. Após o corte, a lâmina foi aquecida sobre uma chapa a 45ºC para secagem e pré-aderência. A seguir, a lâmina permanecerá em estufa a 60ºC por 12 horas para aderência do corte à lâmina de vidro. A coloração foi realizada manualmente, lâmina por lâmina, com azul de toluidina 1% durante 5 minutos. Após a secagem, a lamínula foi colada e a lâmina identificada com o número de registro no laboratório. Os fragmentos nervosos submetidos a cortes longitudinais (N2 e N3) foram incluídos em parafina e corados com prata de Bielschowsky, com o objetivo de comprovar o neuroma de amputação ou contaminação motora e brotamento na neurorrafia látero-terminal. Digitalização das imagens das lâminas histológicas de nervos As imagens foram capturadas por um Scanner de Imagens Pannoramic Viewer e salvas em um computador. Foi utilizado aumento de 200 vezes para a análise das fibras nervosas. Foram salvas duas imagens de cada corte histológico para que fosse obtida, com isso, a totalidade do nervo. Medidas de área, diâmetro mínimo e contagem total das fibras nervosas As imagens digitalizadas e salvas foram analisadas através de medidas de área, diâmetro mínimo, número de fibras e dos axônios além da espessura e área da bainha de mielina. As medidas foram feitas de modo semiautomático utilizando-se software Sigma Pro Image Analysis, versão 5, da Jandel Scientific Corporation. 37 Foram realizadas as medidas da área e diâmetro mínimo da fibra nervosa e do axônio. A medida da área da bainha de mielina foi obtida subtraindo-se a área axonial da área da fibra nervosa, e a espessura da bainha de mielina foi obtida subtraindo-se o diâmetro mínimo do axônio do diâmetro mínimo da fibra e dividindo- se por dois. Foi realizada contagem do número total de fibras nos segmentos N1. Os resultados obtidos de área e diâmetro mínimo axonial foram organizados em uma tabela e, então, calculada a média das medidas obtidas para cada animal. A partir destas médias, foi realizada a análise estatística para comparação entre os grupos (Fig. 20). Figura 20 – Seleção das fibras nervosas para medidas de área, diâmetro mínimo e área, e espessura da bainha de mielina. Os números 4, 5, 8 e 9 marcam axônios e os números 6, 7 e 10 marcam Fibras nervosas. Razão G Também foi medido, no seguimento N1, a razão G que representa a relação entre o diâmetro do axônio e o diâmetro da fibra nervosa. A razão G está relacionada à velocidade de condução do impulso nervoso. Segundo Ansselin et al. (1997), os axônios mielínicos devem apresentar razão G entre 0,6 e 0,7. Os valores abaixo de 0,6 indicam bainha de mielina espessa, enquanto valores acima de 0,7 indicam bainha de mielina delgada. Análise Estatística 38 Quando comparados os grupos que passaram no teste de normalidade e igualdade de variâncias, foi utilizado o teste de análise de variância (ANOVA), seguido pelo teste de TUKEY, quando detectada diferença significativa. Quando a distribuição dos dados apresentava-se fora da normalidade, foi utilizada análise de variância em ranques de Kruskal-Wallis, seguido pelo método de Dunn, quando detectada diferença. Para o IFF utilizamos o teste de Friedman para medir a evolução dos grupos ao longo do tempo. Em todas as análises, foi utilizado nível de significância p<0,05. 39 4 RESULTADOS Massa corporal A tabela 1 representam a massa corporal dos ratos no início e no final do experimento, respectivamente. As massas foram comparadas entre os grupos. No início do experimento, os grupos eram homogêneos em massa corporal, porém, ao final, houve uma diferença estatística entre os grupos. Tabela 1. Mediana, 1° e 3° intervalos interquartílicos da massa inicial e massa final dos animais em gramas (g). Grupo *Massa Inicial # Massa Final Controle 375,5 (358 / 385) 547,5 (528 / 599)ab Desnervado 376 (365 / 403) 582,5 (563 / 643)a NLT 383 (344,5 / 427) 580 (528,25 / 648)a EE 377 (345 / 418) 493 (466 / 534,5)b LBP 383 (363 / 415,5) 523 (481,75 / 573)ab LBP+EE 380 (343 /408,5) 490 (445 / 542)b *Kruskal – Wallis (p = 0,934) Controle = Desnervado = NLT = EE = LBP = LBP+EE; # Kruskal – Wallis seguido pelo Método de Dunn (P = <0,001) Controle = Desnervado = NLT = LBP; Controle = EE = LBP = LBP+EE; (Desnervado = NLT) > (EE = LBP+EE) Índice da Massa do Músculo Tibial Cranial (IMM) e Preservação do MTCE A tabela 2 representa o índice da massa do músculo tibial cranial experimental (MTCE) e músculo tibial cranial normal (MTCN). O cálculo foi realizado dividindo-se a massa do MTCE e do MTCN pela massa corporal final dos animais e multiplicando por 1000. Os resultados demonstraram que o lado normal foi equivalente entre os grupos e no lado experimental os grupos NLT, EE, LBP e LBP+EE foram equivalentes entre si, porém, o grupo NLT não foi equivalente ao Controle como os demais. Também está representado a preservação do MTCE em relação ao MTCN em porcentagem. Os grupos NLT, EE, LBP, LBP+EE foram equivalentes. 40 Tabela 2. Mediana, 1° e 3° intervalos interquartílicos do Índice de massa do MTCN, do MTCE. Média e DP da Preservação do MTCE (%) comparado com o MTCN. Grupo *Índice Massa MTCN # Índice Massa MTCE &Preservação do MTCE (%) Controle 1,6 (1,4/1,74) 1,71 (1,47/2,0)a 107,33±12,28a Desnervado 1,55 (1,5/1,7) 0,31 (0,28/0,33)c 19,212±3,02b NLT 1,61 (1,46/1,77) 1,33 (1,19/1,45)b 85,362±10,18b EE 1,69 (1,64/1,75) 1,4 (1,29/1,47)ab 81,471±10,58b LBP 1,67 (1,6/1,75) 1,37 (1,24/1,5)ab 80,739±14,06b LBP+EE 1,72 (1,64/1,87) 1,4 (1,22/1,49)ab 79,695±11,25c *Kruskal – Wallis (p = 0,091) Controle = Desnervado = NLT = EE = LBP = LBP+EE; # Kruskal – Wallis seguido pelo Método de Dunn (P = <0,001) Controle > NLT; Desnervado < (Controle = EE = LBP = LBP+EE); Desnervado < (NLT = EE = LBP = LBP+EE) &ANOVA seguido pelo teste de Tukey (P = <0,001) Controle > (NLT = EE = LBP = LBP+EE) > Desnervado. Teste Eletrofisiológico A tabela 3 representa os testes eletrofisiológicos para latência e amplitude. O Grupo LBP obteve a pior latência entre os grupos testados. Para amplitude os grupos foram equivalentes. Tabela 3. Média e desvio padrão da latência (ms) e amplitude (mV) do teste eletrofisiológico. Grupo *Latência # Amplitude Controle 1,749 (±0,192)b 15,907 (±7,628) NLT 1,835 (±0,314)b 10,688 (±6,037) EE 1,758 (±0,339)b 11,468 (±6,190) LBP 2,440 (±0,576)a 8,734 (±4,865) LBP+EE 1,877 (±0,495)ab 9,005 (±3,784) *ANOVA seguido pelo Teste de Tukey (P = 0,023) LBP = LBP+EE; LBP > (Controle = NLT = EE); Controle = NLT = EE = LBP+EE # ANOVA (P = 0,126) Controle = NLT = EE = LBP = LBP+EE A tabela 4 representa os testes eletrofisiológicos para área e duração. O Os grupo foram equivalentes para as duas medidas. Tabela 4. Mediana, 1° e 3° intervalos interquartílicos da área e duração do teste eletrofisiológico. Grupo *Área # Duração Controle 29,9 (13,975 / 38,1) 3,08 (2,78 / 3,215) NLT 14,0 (7,995 / 20,325) 2,88 (2,56 / 3,375) EE 15,3 (6,67 / 22,175) 2,62 (1,83 / 3,065) LBP 18,6 (6,855 / 29,0) 3,44 (2,03 / 8,42) LBP+EE 15,7 (10,3 / 18,9) 3,38 (2,97 / 3,62) *Kruskal – Wallis *(p = 0,343) Controle = NLT = EE = LBP = LBP+EE; # (p = 0,131) Controle = NLT = EE = LBP = LBP+EE 41 Teste de Força Máxima A tabela 5 e a figura 21 representam a força máxima do MTC experimental entre os grupos quando estimulado eletricamente. O grupo Desnervado foi inferior aos demais, que se equivaleram. Tabela 5. Média e desvio padrão da força de contração do MTC (N). Grupo *Força de contração Controle 1,403 (±0,182)a Desnervado 0,433 (±0,107)b NLT 1,288 (±0,213)a EE 1,322 (±0,258)a LBP 1,233 (±0,209)a LBP+EE 1,253 (±0,137)a *ANOVA seguido pelo Teste de Tukey (P < 0,001) (Controle = NLT = EE = LBP = LBP+EE) > Desnervado Figura 21. Média e desvio padrão da força de contração do MTC (N). ANOVA seguido pelo Teste de Tukey (P < 0,001) Desnervado < (Controle = NLT = EE = LBP = LBP+EE) 42 Teste de Avaliação da Marcha com Índice Funcional do Fibular (IFF) A tabelas 6 e a figura 22 representam o índice funcional do fibular para 30 dias. Com 30 dias de pós-operatório o grupo controle foi superior aos demais grupos, que se igualaram entre eles. Tabela 6. Mediana, 1° e 3° intervalos interquartílicos do IFF com 30 dias. Grupo *IFF 30 dias Controle -14,897 (-33,193 / -8,403)a Desnervado -108,134 (-125,222 / -73,074)b NLT -82,254 (-112,178 / -46,664)b EE -75,835 (-98,647 / -52,819)b LBP -62,628 (-94,274 / -52,331)b LBP+EE -69,812 (-99,672 / -42,27)b *Kruskal – Wallis seguido pelo Método de Dunn (P = <0,001) Controle > (Desnervado = NLT = EE = LBP = LBP+EE) Figura 22. Mediana, 1° e 3° intervalos interquartílicos do IFF com 30 dias. Kruskal – Wallis seguido pelo Método de Dunn (P = <0,001) Controle > (Desnervado = NLT = EE = LBP = LBP+EE) 43 A tabelas 7 e a figura 23 representam o índice funcional do fibular para 180 dias. Com 180 dias de pós-operatório os grupos EE, LBP e LBP+EE foram equivalentes ao Controle. Tabela 7. Média e DP do IFF com 180 dias. Grupo IFF 180 dias Controle -18,720 ± 16,24a Desnervado -123,23 ± 22,23c NLT -52,88 ± 28,51b EE -39,34 ± 26,75ab LBP -49,15 ± 34,37ab LBP+EE -41,77 ± 31,55ab Anova seguido do teste de Tukey (P = <0,001) Desnervado > (Controle = EE = LBP = LBP+EE) Controle > (Desnervado = NLT) NLT = EE = LBP = LBP+EE Figura 23. Média e DP do IFF com 180 dias. ANOVA seguido pelo teste de Tukey (P = <0,001) Controle = EE = LBP = LBP+EE; Controle > NLT > Desnervado; (NLT = EE = LBP = LBP+EE) > Desnervado A figura 24 e a tabela 8 mostram comparativamente a evolução de todos os grupos ao longo do seu desempenho funcional nos períodos de 30, 60, 90, 120, 150 e 180 dias. Os grupos Controle e NLT não apresentaram evolução significativa ao longo do tempo. O grupo desnervado apesar de apresentar evolução manteve 44 sempre seu nível funcional abaixo do mínimo desejado. Os grupos EE, LBP e LBP+EE apresentaram evolução funcional ao longo do tempo. Figura 24 - Evolução do IFF entre 30 e 180 dias de pós-operatório. Friedman Repeated Measures: Controle (P = 0,301); Desnervado (P = 0,002); NLT (P = 0,085); EE (P = 0,007); LBP (P = 0,001); LBP+EE (P = 0,001). Tabela 8. Mediana do IFF dos grupos em relação aos momentos com evolução entre 30 e 180 dias de pós operatório (resumo de todos os dados do IFF). 30 Dias 60 Dias 90 Dias 120 Dias 150 Dias 180 Dias Friedman (p) GC -14,897 -18,549 -9,530 -12,899 -25,419 -12,492 0,301 GD -108,134 -166,026 -126,543 -160,323 -123,773 -121,158 0,002 NTL -82,254 -50,971 -52,922 -57,079 -57.225 -84.601 0,085 EE -75,835 -39,949 -36,624 -33,439 -31.240 -34.611 0,007 LBP -62,628 -36,558 -43,803 -34,161 -43.380 -47.211 0,001 LBP+EE -69,812 -44,258 -40,703 -38,046 -25.089 -44.561 0,001 Kruskal W (p) <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 45 Análise Morfométrica Análise morfométrica do músculo tibial cranial experimental (MTCE). A tabela 9 e a figura 25 mostram a comparação da área da fibra muscular do MTCE. Os grupo EE e LBP foram equivalentes ao grupo controle e superiores aos demais. Tabela 9. Mediana, 1° e 3° intervalos interquartílicos da área das fibras do MTCE. Grupo Área fibra MTCE (µm 2 ) Controle 3656,1 (2540,4 / 5482,8)a Desnervado 840,2 (521,6 / 1541,5)d NLT 3008,5 (2276,8 / 3703,8)b EE 3407,7 (2668,6 / 4524,5)a LBP 3673,4 (2627,5 / 4663,4)a LBP+EE 2509,3 (2132,6 / 3010,9)c *Kruskal – Wallis seguido pelo Método de Dunn (P = <0,001) (Controle = EE = LBP) > NLT > LBP+EE > Desnervado Figura 25 – Área da fibra do MTC experimental (µm2). Kruskal-Wallis seguido pelo Método de Dunn. (p<0,001). (Controle = EE = LBP) > NLT > LBP+EE > Desnervado A tabela 10 e a figura 26 representam o perímetro da fibra muscular do músculo tibial cranial experimental. Para este parâmetro, o grupo LBP foi equivalente 46 ao controle e ao grupo EE e ambos foram superiores aos demais grupos experimentais. Tabela 10. Mediana, 1° e 3° intervalos interquartílicos do perímetro das fibras do MTCE. Grupo Perímetro Fibra MTCE (µm) Controle 260,1 (214,3 / 322,6)a Desnervado 118,1 (95,7 / 160,3)d NLT 189,4 (144,3 / 217,8)c EE 237,5 (205,5 / 278,1)b LBP 250,0 (211,5 / 280,7)ab LBP+EE 201,5 (185,5 / 223,7)c *Kruskal – Wallis seguido pelo Método de Dunn (P = <0,001) (Controle = LBP) > (NLT = LBP+EE) > Desnervado (LBP = EE) > (NLT = LBP+EE) > Desnervado Figura 26 – Perímetro do MTCE (µm). Kruskal-Wallis seguido pelo Método de Dunn. (Controle = LBP) > (NLT = LBP+EE) > Desnervado; (LBP = EE) > (NLT = LBP+EE) > Desnervado 47 A tabela 11 e a figura 27 representam o diâmetro mínimo da fibra muscular do músculo tibial cranial experimental. O grupo EE foi equivalente ao grupo controle e ao grupo LBP e ambos foram superiores aos demais grupos experimentais. Tabela 11. Mediana, 1° e 3° intervalos interquartílicos do diâmetro mínimo das fibras do MTCE. Grupo Diam. Min. Fibra MTCE (µm) Controle 60,75 (50,11 / 75,24)a Desnervado 29,053 (21,83 / 3784)e NLT 41,92 (33,53 / 48,51)d EE 59,3 (49,4 / 68,85)ab LBP 57,35 (48,32 / 68,52)b LBP+EE 50,14 (44,53 / 56,65)c *Kruskal – Wallis seguido pelo Método de Dunn (P = <0,001) (Controle = EE) > LBP+EE > NLT > Desnervado (EE = LBP) > LBP+EE > NLT > Desnervado Figura 27 – Diâmetro mínimo da fibra do MTCE (µm). Kruskal-Wallis seguido pelo Método de Dunn. (Controle = EE) > LBP+EE > NLT > Desnervado; (EE = LBP) > LBP+EE > NLT > Desnervado 48 Análise morfométrica dos segmentos nervosos A análise morfométrica da fibra nervosa do seguimento N1 foi realizada sem a presença do Grupo Desnervado, pois o mesmo não apresentou fibras para serem medidas. A tabela 12 e a figura 28 representam o número de fibras nervosas do segmento N1 em cada grupo. O único grupo que não foi equivalente ao grupo controle foi o NLT. Tabela 12. Média e desvio padrão do número de fibras nervosas . Grupo Nº Fibras Nervosas Controle 1239,7± (357,2)a NLT 570,7 ± (332,6)b EE 895,7 ± (165,6)ab LBP 1263 ± (630,9)a LBP+EE 1353,8 ± (305,6)a ANOVA seguida pelo Teste de Tukey (P <0,001) (Controle = LBP = LBP+EE) > NLT Controle = EE = LBP = LBP+EE EE = NLT Figura 28 – Número de fibras por nervo no segmento N1. ANOVA seguido pelo Teste de Tukey (p < 0,001). (Controle = LBP = LBP+EE) > NLT; Controle = EE = LBP = LBP+EE; EE = NLT 49 A tabela 13 e a figura 29 representam a área dos axônios do segmento N1 em cada grupo. O grupo Controle está superior aos demais e o grupo NLT está superior aos demais grupos experimentais. Tabela 13. Mediana, 1° e 3° intervalos interquartílicos da área dos axônios. Grupo Área do axônio (µm 2 ) Controle 18,48 (12,73 / 29,55)a NLT 13,15 (7,96 / 21,26)b EE 9,3 (5,81 / 12,79)c LBP 8,29 (5,83 / 12,48)c LBP+EE 8,35 (5,29 / 12,83)c *Kruskal – Wallis seguido pelo Método de Dunn (P = <0,001) Controle > NLT > (EE = LBP = LBP+EE) Figura 29 – Área dos axônios (µm2). Kruskal-Wallis seguido pelo Método de Dunn. (p<0,001). Controle > NLT > (EE = LBP = LBP+EE) 50 A tabela 14 e a figura 30 representam o diâmetro mínimo dos axônios do segmento N1 em cada grupo. O grupo Controle está superior aos demais e o grupo EE está superior ao grupo NLT e aos demais. Tabela 14. Mediana, 1° e 3° intervalos interquartílicos do diâmetro mínimo doa axônios. Grupo Diâm. Min. axônio (µm) Controle 7,22 (5,99 / 8,49)a NLT 3,08 (2,14 / 4,08)c EE 5,49 (4,39 / 6,98)b LBP 2,33 (1,82 / 2,95)d LBP+EE 2,04 (1,49 / 2,91)d *Kruskal – Wallis seguido pelo Método de Dunn (P = <0,001) Controle > EE > NLT > (LBP = LBP+EE) Figura 30 – Diâmetro mínimo dos axônios (µm). Kruskal-Wallis seguido pelo Método de Dunn. (p<0,001). Controle > EE > NLT > (LBP = LBP+EE) 51 A tabela 14 e a figura 31 representam a área das fibras nervosas do segmento N1 em cada grupo. O grupo Controle está superior aos demais e o grupo NLT em relação aos outros grupos experimentais. Tabela 15. Mediana, 1° e 3° intervalos interquartílicos da área da fibra nervosa. Grupo Área da fibra (µm 2 ) Controle 70,42 (53,43 / 95,74)a NLT 52,96 (36,04 / 73,12)b EE 31,26 (21,58 / 40,84)c LBP 24,72 (17,96 / 35,19)d LBP+EE 27,97 (17,72 / 39,72)cd Kruskal – Wallis seguido pelo Método de Dunn (P = <0,001) Controle > NLT > (EE = LBP+EE); Controle > NLT > (LBP = LBP+EE); EE > LBP Figura 31 – Área das fibras nervosas do segmento N1 (µm²). Kruskal – Wallis seguido pelo Método de Dunn (P = <0,001). Controle > NLT > (EE = LBP+EE); Controle > NLT > (LBP = LBP+EE); EE > LBP 52 A tabela 16 e a figura 32 representam o diâmetro mínimo das fibras nervosas do segmento N1 em cada grupo. Aqui observamos o grupo controle superior aos demais com o grupo EE superando os outros grupos experimentais. Tabela 16. Mediana, 1° e 3° intervalos interquartílicos do diâmetro mínimo das fibras nervosas. Grupo Diâm. Min. fibras (µm) Controle 11,81 (9,84 / 13,68)a NLT 6,92 (5,78 / 8,25)c EE 8,48 (6,86 / 9,86)b LBP 4,47 (3,75 / 5,32)d LBP+EE 4,45 (3,55 / 5,41)d Kruskal – Wallis seguido pelo Método de Dunn (P = <0,001) Contrle > EE > NLT > (LBP = LBP+EE) Figura 32 – Diâmetro mínimo das fibras nervosas do segmento N1 (µm). Kruskal – Wallis seguido pelo Método de Dunn (P = <0,001). Contrle > EE > NLT > (LBP = LBP+EE) 53 A tabela 17 e a figura 33 representam a área da bainha de mielina das fibras nervosas no segmento N1 em cada grupo. O grupo NLT é superior aos demais grupos experimentais porém inferior ao grupo controle. Tabela 17. Mediana, 1° e 3° intervalos interquartílicos da área bainha de mielina. Grupo Área bainha de mielina (µm 2 ) Controle 53,43 (39,27 / 71,19)a NLT 37,56 (27,28 / 50,26)b EE 21,29 (13,72 / 28,57)c LBP 16,32 (11,94 / 22,76)d LBP+EE 18,35 (8,72 / 29,93)cd Kruskal – Wallis seguido pelo Método de Dunn (P = <0,001) Controle > NLT > EE > LBP; Controle > NLT > EE = LBP; LBP = LBP+EE Figura 33 – Área da bainha de mielina das fibras nervosa no segmento N1 (µm²). Kruskal-Wallis seguido pelo Método de Dunn. (p<0,001). Controle > NLT > EE > LBP; Controle > NLT > EE = LBP; LBP = LBP+EE 54 A tabela 18 e a figura 34 representam a espessura da bainha de mielina das fibras nervosas no segmento N1 em cada grupo. Os resultados mostram o grupo NLT superior aos demais grupos experimentais e inferior ao grupo controle. Tabela 18. Mediana, 1° e 3° intervalos interquartílicos da espessura da bainha de mielina. Grupo Espes Bai Mielin (µm) Controle 2,42 (1,94 / 2,89)a NLT 1,92 (1,64 / 2,18)b EE 1,35 (0,91 / 1,93)c LBP 1,04 (0,87 / 1,28)e LBP+EE 1,12 (0,66 / 1,69)d Kruskal – Wallis seguido pelo Método de Dunn (P <0,001) Controle > NLT > EE > LBP+EE > LBP Figura 34 – Espessura da bainha de mielina das fibras nervosas do segmento N1 (µm). Kruskal-Wallis seguido pelo Método de Dunn. (P < 0,001). Controle > NLT > EE > LBP+EE > LBP 55 A tabela 19 e a figura 35 representam a Razão G das fibras nervosas no segmento N1 em cada grupo. Os resultados mostram o grupo EE superior aos demais grupos inclusive do controle, porém o grupo controle também se encontra na faixa de normalidade para essa medida. Tabela 19. Mediana, 1° e 3° intervalos interquartílicos da Razão G. Grupo Razão G Controle 0,60 (0,53 / 0,65)b NLT 0,44 (0,36 / 0,51)d EE 0,67 (0,56 / 0,76)a LBP 0,54 (0,46 / 0,59)c LBP+EE 0,45 (0,34 / 0,66)c Kruskal – Wallis seguido pelo Método de Dunn (P = <0,001) EE > Controle > (LBP = LBP+EE) > NLT Figura 35 – Razão G das fibras nervosas do segmento N1 (µm). Kruskal-Wallis seguido pelo Método de Dunn. (P < 0,001). EE > Controle > (LBP = LBP+EE) > NLT 56 A figura 36 representa a correlação entre o IFF 180, Força Muscular, Diâmetro Mínimo das Fibras Musculares e Área das Fibras Musculares. Podemos observar uma correlação positiva entre todos esses parâmetros. Figura 36: Correlação de Pearson. a: IFF180 x Diâmetro mínimo do MTCE. b: IFF180 x Área das fibras do MTCE. c: Força Máxima de contração do MTCE x Diâmetro Mínimo do MTCE. d: Força Máxima de contração do MTCE x Área das Fibras do MTCE. Morfologia dos músculos e nervos Os músculos tibiais craniais do grupo controle apresentaram características de músculo normal com fibras poligonais, núcleos, na maioria das fibras, em posição periférica e pouco tecido conjuntivo. Os músculos tibiais craniais dos grupos NLT, EE, LBP e LBP+EE apresentaram características semelhantes ao grupo Controle, porém algumas lâminas mostravam quantidade maior de tecido conjuntivo. Os músculos tibiais craniais do grupo Desnervado apresentaram fibras musculares com menor diâmetro e um aumento na quantidade de tecido conjuntivo, polimorfismo e 57 desorganização, núcleos, na maioria das fibras, centralizados, demonstrando atrofia muscular (Fig. 37). Figura 37 - Cortes transversais do MTC nos diversos grupos, mostrando a semelhança entre os grupos Controle, EE, NLT; LBP e LBP+EE enquanto o grupo Desnervado apresenta um desarranjo das fibras com núcleos centralizados e grande quantidade de tecido conjuntivo. Quanto ao segmento de nervo estudado, denominado N1, observamos no grupo Controle grande quantidade de axônios, bainha de mielina espessa e bem definida. Nos grupos NLT, EE, LBP e LBP+EE observamos fibras menores, com bainha de mielina menos espessas e área das fibras nervosas menor e aumento do tecido conjuntivo em relação ao grupo Controle. Observamos também um padrão heterogêneo quanto ao tamanho das fibras nervosas nos quatro grupos experimentais. No grupo Desnervado observamos uma grande quantidade de tecido conjuntivo sem a presença de fibras nervosas (Fig. 38). 58 Figura 38 - Corte transversal do coto distal do nervo fibular comum (N1), mostrando o grupo Controle fibras nervosas bem definidas com presença de bainha de mielina, os grupos NLT, EE, LBP e LBP+EE apresentam aparências semelhantes e o grupo Desnervado sem presença de fibras nervosas e grande quantidade de tecido conjuntivo. Quanto ao segmento N2, ou seja, porção distal do coto proximal do nervo fibular comum, observou-se a presença de neuroma de amputação e descontinuidade da formação de brotos terminais e colaterais (Fig. 39A). No segmento N3, ou seja, corte longitudinal do ponto da neurorrafia, observamos brotamento nervoso ocorrendo da lateral do nervo tibial, que é o doador, para o coto distal do nervo fibular comum que é o receptor. O tecido nervoso observado apresenta a mesma densidade do nervo tibial no nervo fibular comum (Figs. 39B). 59 Figura 39 – A: Corte longitudinal do coto proximal do nervo fibular comum (N2) mostrando o neuroma de amputação. B: Corte longitudinal da neurorrafia látero- terminal entre o coto distal do nervo fibular comum com a face lateral do nervo tibial (N3) mostrando o brotamento nervoso do nervo tibial para o nervo fibular comum. Dados gerais Durante o experimento tivemos intercorrências com alguns animais. No quadro 1 observa-se quais animais, seus grupos, momento da intercorrência e qual a intercorrência. Quadro 1: Indicação das intercorrências com os animais. Rato n° Grupo Momento Intercorrência 7 Controle 180 Óbito anestesia 8 Controle 180 Óbito anestesia 28 NTL 120 Sacrificado infecção 32 NTL 180 Nervo seccionada na dissecção 47 EE 150 Óbito asfixia no cápsula 52 EE 20 Sacrificado infecção 58 EE 50 Óbito (morto na caixa) 59 EE 10 Óbito asfixia na cápsula 71 LBP 180 Óbito anestesia 76 LBP 180 Deiscência da musculatura 81 EE+LBP 60 Óbito (morto na caixa) 82 EE+LBP 180 Óbito anestesia 83 EE+LBP 180 Óbito anestesia 95 EE+LBP 10 Sacrificado infecção 96 EE+LBP 180 Óbito anestesia 60 R es ult ado s 60 Quadro 2 – Visão geral das médias e desvios padrões dos resultados obtidos. IMM = Índice de Massa Muscular; FM 100 = Força Muscular 100 Hz; AFM = Área da Fibra Muscular; DMFM = Diâmetro Mínimo da Fibra Muscular; NFN = Número de Fibras Nervosas; AFN = Área da Fibra Nervosa; DMFN = Diâmetro Mínimo da Fibra Nervosa; ABM = Área da Bainha de Mielina; EBM = Espessura da Bainha de Mielina e Razão G. 61 R es ult ado s 61 5 DISCUSSÃO Toda a parte experimental e de coleta deste estudo foi realizada no Bloco 2 da Unidade de Pesquisa Experimental (UNIPEX) da FMB - UNESP, e a parte de preparo histológico foi realizada no Bloco 3 da mesma unidade. Estes dois laboratórios juntos apresentam todas as condições estruturais e técnicas para a realização de pesquisas experimentais na nossa linha de estudo. Neste trabalho, foram utilizados ratos machos (Rattus norvegicus) da linhagem Wistar por serem de fácil obtenção, manipulação e manutenção. Estes animais ocupam pouco espaço, facilitando estudos de longa duração (Ellis & McCaffrey, 1984), além de representarem a espécie mais utilizada na literatura (Pereira et al., 1998). Ratos do sexo masculino estão menos suscetíveis à ação dos hormônios adenohipofisários e hormônios gonadais, como o estrógeno e a progesterona (Lincoln, 1980; Carandente et al., 1989). Estes hormônios podem exercer efeitos neurotróficos e influenciar no brotamento de axônios sensoriais mielínicos, além de serem mais fáceis de adquirir, pois não servem como matriz de reprodução. O modelo experimental utilizado foi o “nervo tibial-fibular e músculo tibial cranial” do nervo isquiático introduzido por Viterbo et al. (1992). Segundo estes autores este modelo apresenta duas vantagens: músculo tibial cranial é inervado exclusivamente pelo nervo fibular comum e sua localização superficial possibilita o acompanhamento clínico da reinervação. Alguns autores usam um modelo experimental envolvendo os membros de ratos no estudo da NLT. Estes modelos envolvem, principalmente, os nervos mediano, ulnar e musculocutâneo (Bertelli et al., 1996; Lutz et al., 2000a; Lutz et al. 2000b; Papalia et al., 2003; Liao et al., 2009). A NLT tem se mostrado uma boa opção para a resolução de reinervação sem que haja prejuízo ao nervo doado e por esse motivo vem sendo usada até o momento para vários modelos experimentais (Jia et al., 2017). Também existem modelos experimentais com outros animais. Sundine et al. (2003) avaliaram a reinervação do músculo orbicular dos olhos em cães. Jaberi et al. (2003) utilizaram coelhos, seguindo o mesmo modelo do tibial e fibular comum utilizado em ratos. Myckatyn et al. (2004) utilizaram camundongos transgênicos. 62 R es ult ado s 62 Mennen (1998) utilizou a NLT em primatas, assim como Schmidhammer et al. (2007). Os animais foram sacrificados após 180 dias de tratamento. Acreditamos ser esse prazo suficiente para ocorrer brotamento e amadurecimento axonial, assim como a chegada dos axônios à placa motora, provocando a reinervação das fibras musculares e consequente recuperação funcional do músculo. Gigo-Benato et al. (2010a), observaram durante 14 dias a recuperação funcional de ratos após lesão por esmagamento do nervo isquiático e concluíram que a EE foi prejudicial à recuperação do músculo e nervo após a lesão, porém devemos indagar se 14 dias de recuperação seriam suficientes para que a reinervação muscular ocorra, mesmo em modelo de esmagamento nervoso e não secção total do nervo. Acreditamos que seja necessário um tempo maior para que possamos chegar a conclusões mais concretas quanto à reinervação do músculo. Russo et al. (2008) observaram regulação da expressão gênica MMP-2 em músculos esqueléticos desnervados e concluíram que a EE pode ser útil na elaboração de novas estratégias terapêuticas para a reabilitação em pacientes com desnervação do músculo. Porém estes autores observaram 28 dias após desnervação muscular e não realizaram testes funcionais. Buchaim et al. (2016) fizeram a secção do ramo bucal do nervo facial bilateral em ratos. O lado direito foi reconstruído com neurorrafia término terminal e o lado esquerdo foi utilizado cola de fibrina. O trabalho foi divido em 4 grupos com neurorrafia com e sem LBP e grupos com cola de fibrina com e sem LBP. Após 10 semanas no total, observaram que o LBP apresentou um resultado satisfatório na regeneração do nervo facial sendo, portanto uma técnica que ajuda na estimulação do processo de regeneração axonal. Andraus et al. (2017) após a utilização de LBP na regeneração do nervo isquiático de ratos com duração de 21 dias de tratamento, concluíram que a lesão no nervo isquiático com desnervação muscular consequente, foram beneficiadas pela laserterapia promovendo a recuperação da função neuromuscular, atividade da MMP-2 e aumentando a força máxima de ruptura mecânica do músculo. Muitos estudos que utilizam estimulação elétrica no músculo desnervado não observaram evolução funcional dos animais com observação entre 7 e 52 dias, e as 63 R es ult ado s 63 avaliações foram apenas histológicas (Durigan et al., 2006; Caierão et al., 2008; Carvalho et al., 2009; Polônio, 2010; Teodori et al., 2011; Du et al., 2018). Esses trabalhos, por serem de curto tempo de observação, realizaram a estimulação elétrica com os animais anestesiados. Como nosso tempo de estimulação foi longo e, por este motivo, os ratos passariam por muitas sessões de EE, achamos arriscado anestesiar os animais três vezes por semana durante 180 dias. Optamos por estimular os animais acordados. Para tal, desenvolvemos um método de estimulação que envolve a imobilização dos animais em uma cápsula metálica (Figs. 10 e 11). Esta cápsula prende o membro pélvico do animal na região inguinal de forma anatômica sem provocar lesão ou sofrimento. O mesmo modelo de imobilização foi utilizado para a realização da laserterapia, pois a cápsula mantinha exposta a cicatriz cirúrgica que é o local da aplicação do LBP (Fig. 12). A exemplo da eletroterapia os estudos com LBP não apresentam tempo de observação tão grande quanto o nosso ficando entre 3 dias como Alcântara et al. (2013) a 12 semanas como Shen et al. (2013). Por esse motivo a sessão de LBP pode ser realizada com o animal sob anestesia e isso diferencia muito em relação ao nosso modelo experimental. A estimulação elétrica utilizada durante este estudo não provocou dor ou sofrimento, pois os níveis de estimulação foram ajustados para que permanecessem dentro do limiar motor e não alcançassem o limiar doloroso (Robinson & Snyder- Mackler, 2001; Low & Reed, 2001, Nelson et al., 2003). Além disso esse modelo já foi testado pelo nosso grupo em Maciel et el. (2013). A corrente de estimulação foi determinada baseada em parâmetros criteriosamente pré-estabelecidos. Conforme Ward (2009), a corrente de média frequência com curta duração, entre 2 a 4 ms, são ideais para produzir fortalecimento muscular. A frequência foi determinada de acordo com o tipo de fibra muscular predominante no músculo tibial cranial. A intensidade da corrente foi determinada conforme Maciel et al. (2013) para diferenciar dos 1 mA e 5 mA usualmente utilizados por trabalhos que estimulam os ratos anestesiados ou com eletrodos implantados. Estes fatores podem causar alteração na condutibilidade da corrente no corpo do animal. (Dow et al., 2004; Durigan et al., 2006; Carvalho et al., 2009; Polônio et al., 2010; Teodori et al., 2011). 64 R es ult ado s 64 Contudo, quando observamos as massas finais dos grupos pudemos perceber que os grupos que receberal EE como tratamento apresentaram em média massas musculares menores. Esse fato também ocorreu em nosso estudo realizado anteriormente (Maciel et al., 2013), o que poderia nos levar a crer que mesmo com todos os critérios estabelecidos e controlados, os animais ainda podem estar sofrendo algum tipo de estresse com a EE. A dosificação do LBP que utilizamos foi baseada em estudos realizados por Andraus, Barbieri e Mazzer (2010) que também utilizaram a dose de 4 J (equivalente à 59,7 J/cm2) por ponto e obtiveram bons resultados na regeneração nervosa após lesão do nervo isquiático em ratos. Rochkind (1992) já chamou a atenção para a dosificação da terapia a LASER, pois reparou que o efeito do LBP no tecido nervoso é dose-dependente e quando doses menores que 3,5 J/cm2 eram utilizadas não ocorria mudanças nos potenciais de ação dos nervos, por esse motivo já em 1992, Rochkind, contrariando uma tendência da época, sustentava o uso de doses mais elevadas para a regeneração nervosa. A NLT foi realizada sem retirada de epineuro, pois as fibras regeneradas após a NLT têm a capacidade de absorver e transpor o endoneuro, perineuro e epineuro em nervos delgados, com diâmetro inferior a 1,5 mm (Viterbo et al., 1992; Viterbo et al., 1994 a, b; Lundborg et al., 1994; Zhao et al., 1997; Viterbo et al.,1998). Em nervos mais espessos, é recomendado que a janela epiperineural seja realizada. (Viterbo et al., 1998). O número de 20 ratos em cada grupo com NLT nos pareceu adequado quando delineamos o trabalho, pois essa quantidade difere para mais em relação aos estudo equivalentes porém devemos observar que a variabilidade do WTA é bem elevada e requer um número maior de animais. Já o número de 10 ratos nos grupos controles e desnervado também nos pareceu adequado, uma vez que estes dois grupos apresentam resultados mais homogêneos (Viterbo et al., 1992; Franco, 2010; Maciel et al., 2013). Na literatura, esse número é muito variável, de 5 a 40 animais (McCallister et al., 1999; Caierão et al., 2008; Goheen-Robillard et al., 2002; De Sá et al., 2004). 65 R es ult ado s 65 Massa corporal e massa do MTC A massa inicial dos animais estudados não demonstrou diferença entre os grupos, mostrando que houve homogeneidade na amostra ao iniciarmos o experimento. Contudo, a massa final não apresentou o mesmo resultado, pois os grupos que passaram por EE apresentaram massas corporais menores que os demais. Podemos associar este fato à dois procedimentos, a própria EE elétrica pode ter provocado um estresse elevado nos animais e também o tempo de contenção nas cápsulas de estimulação, que foi maior para os grupos com EE. Estes dois fatores podem ter elevado o nível de estresse dos animais muito mais que dos outros grupos levando ao um menor ganho de massa corporal no final do trabalho. Por esse motivo, ao invés de analisarmos a massa do MTC diretamente, utilizamos o índice da Massa Muscular (IMM), que foi calculada dividindo a massa do MTC pela massa corporal final de cada animal e multiplicada por 1000. É esperado que um animal de maior massa corporal também apresente maior massa muscular, por isso utilizando este índice, equivalemos os grupos (Vieira & Hossne, 2001). O IMM mostrou que os grupos NLT, EE, LBP e LBP+EE foram equivalentes porém, os grupos EE, LBP e LBP+EE também se equivaleram ao grupo controle. Quando observamos a porcentagem de preservação da massa do MTCE em relação ao MTCN podemos percebr que todos os grupos que passaram por cirurgia de neurorrafia apresentam boa preservação do músculo e não apresentaram diferenças estatísticas neste parâmetro. Isso nos indica que todos os tratamentos apresentam um bom potencial de preservação muscular. Segundo Gigo-Benato et al. (2010b) o tecido muscular é fortemente afetado pelas lesões de nervos periféricos por isso a inervação se torna um ponto crítico para a integridade estrutural e funcional do músculo. A desnervação muscular leva a uma profunda perda de massa e inabilidade do músculo de gerar força. Por esse motivo a medida da massa muscular ou do índice de massa muscular se torna uma importante medida para determinar como está a função muscular do rato após o tratamento. Viterbo et al. (2017) usou a massa do músculo tibial cranial de ratos, após reparação do nervo fibular comum, como parâmetro para demonstrar que não houve 66 R es ult ado s 66 diferença em relação à preservação muscular quando comparados três tipos de neurorrafia, a NTT, a NTL, e a NLT. Gigo-Benato et al. (2004) aplicaram a irradiação com o LBP sobre o nervo mediano, seccionado e reparado por neurorrafia látero-terminal do coto distal no nervo ulnar, em ratos. Este estudo demonstrou que, no grupo tratado com LBP, ocorreu recuperação da massa muscular mais rapidamente que nos demais grupos além de apresentar melhora significativa da função, em comparação com o grupo controle. Teste de Avaliação da Marcha com Índice Funcional do Fibular (IFF) O teste da marcha analisa o modo de andar do animal através do cálculo da expressão, como porcentagem, de perda da função do membro tratado em relação ao contralateral. O teste de marcha foi desenvolvido por De Medinaceli et al. (1982) através do Índice Funcional do Isquiático (IFI) que avalia a função relacionada ao nervo isquiático, porém foi aperfeiçoado por Bain et al. (1989), que desenvolveu métodos específicos para o nervo tibial (Índice Funcional do Tibial – IFT) e para o nervo fibular (Índice Funcional do Fibular - IFF). Como nosso modelo experimental envolve especificamente o nervo fibular comum, usamos o IFF de Bain et al. (1989). Estes testes funcionais da caminhada são de baixo custo e fácil aplicação, permitindo acompanhar a evolução clínica dos ratos. Além disto, revelam a função muscular e plasticidade cerebral, resultado final desejado em qualquer reconstrução de nervo periférico. Por isto estes testes vêm sendo utilizados por inúmeros autores (Carlton & Goldeberg, 1986; Dellon & Mackinnon, 1989; Dellon & Dellon, 1991; Bervar, 2000; Monte-Raso et al., 2008; Andraus et al., 2010; Maciel et al., 2013; Viterbo et al., 2016). Aos 30 dias, os ratos do grupo Controle se diferenciavam de todos os ratos dos demais grupos, apresentando os melhores índices funcionais. Esse resultado já era esperado, pois com 30 dias ainda não foi possível perceber os efeitos dos tratamentos propostos. Após 180 dias, já podemos perceber as diferentes evoluções entre os grupos experimentais. Com exceção do grupo NLT, os demais grupos experimentais foram estatisticamente equivalentes ao grupo controle ao final do experimento, demonstrando a importância, em termos funcionais, dos tratamentos propostos após a realização da cirurgia de reconstrução nervosa periférica. 67 R es ult ado s 67 Também é muito importante perceber quando observamos a figura 24 que os grupos Controle e NLT não apresentaram evolução ao longo do tempo em relação ao momento inicial para o final do tratamento. Esse achado era esperado para o grupo controle que já partiu de um estado funcional normal. O grupo Desnervado apesar de demonstrar estatisticamente uma diferença ao longo do tempo, essa diferença foi negativa em relação ao ponto de partida, ou seja, os animais do grupo desnervado pioraram ainda mais a função neuromuscular. Os grupos EE, LBP e LBP+EE apresentaram melhorar significativa em relação ao início do tratamento nos levando a entender que o tratamento pós cirúrgico com os métodos empregados foram importantes para a melhora funcional dos animais. Esta observação corrobora os achados de Takano et al. (2010) sobre aumento da força e da massa muscular em idosos após EE combinada com contração voluntária. Andraus et al. (2017) encontraram melhora funcional dos grupos irradiados por LBP em diversas doses em relação ao grupo sem LBP após lesão por esmagamento de nervo isquiático de ratos. Takhtfooladi et al. (2015) em um trabalho semelhante encontraram evolução funcional após aplicação de LBP na recuperação de lesão por esmagamento do nervo isquiático em ratos quando comparado ao grupo controle. Teste Eletrofisiológico Os animais do grupo desnervado não apresentaram resposta muscular ao estímulo elétrico, justamente por não apresentarem a conexão entre o nervo e o músculo, por este motivo, os valores de latência tenderam ao infinito e os valores de amplitude, ao infinito negativo, sendo retirados da análise estatística. O teste eletrofisiológico nos fornece dados de latência e amplitude. A latência traduz-se na condução nervosa, ou seja, o número de fibras mielinizadas. Já a amplitude nos informa o número de fibras musculares que respondem ao estímulo elétrico e, consequentemente, ao número de axônios excitáveis (Robinson & Snyder- Mackler, 2001). O teste foi realizado com o nervo tibial seccionado distalmente à NLT e repetimos o teste três vezes por animal. A frequência, duração e intensidade do 68 R es ult ado s 68 estímulo foram constantes para que a única variável fosse relativa ao grupo experimental. O teste eletrofisiológico demonstrou uma diferença entre o grupo LBP e os demais para Latência e os demais parâmetros não detectaram diferença entre os grupos. Isto pode significar que, fora para a latência, os grupos experimentais conseguiram resultados positivos e se equivaleram ao grupo Controle, ou que este teste não foi suficientemente sensível. Cabe ressaltar que tivemos intercorrências durante os testes eletrofisiológicos, pois o aparelho apresentou problemas técnicos como agulha de captação quebrada, ou falha na hora de captar sinal elétrico entre outros. Com isso perdemos a coleta de 9 ratos no grupo LBP de um total 19 coletas além de não podermos garantir que as medidas realizadas estão dentro dos padrões desejados. Teste de Força Máxima do MTC O teste de força máxima foi elaborado seguindo os padrões de Isaacs et al. (2005), com as adaptações necessárias para cumprir o objetivo do nosso modelo experimental. Isaacs et al. (2005), realizaram o estímulo elé