UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRONÔMICAS CÂMPUS DE BOTUCATU AÇÃO TÓXICA DE INGREDIENTES ATIVOS EM Atta sexdens rubropilosa Forel, 1908 (HYMENOPTERA: FORMICIDAE) VISANDO SEU EMPREGO EM ISCAS FORMICIDAS MARCÍLIO DE SOUZA SILVA Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agronômicas da UNESP – Câmpus de Botucatu, para obtenção do título de Doutor em Agronomia (Proteção de Plantas) BOTUCATU – SP Novembro - 2012 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRONÔMICAS CÂMPUS DE BOTUCATU AÇÃO TÓXICA DE INGREDIENTES ATIVOS EM Atta sexdens rubropilosa Forel, 1908 (HYMENOPTERA: FORMICIDAE) VISANDO SEU EMPREGO EM ISCAS FORMICIDAS MARCÍLIO DE SOUZA SILVA Orientador: Prof. Dr. Luiz Carlos Forti Co-orientador: Dr. Nilson Satoru Nagamoto Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agronômicas da UNESP – Câmpus de Botucatu, para obtenção do título de Doutor em Agronomia (Proteção de Plantas) BOTUCATU – SP Novembro – 2012 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRATAMENTO DA INFORMAÇÃO – SERVIÇO TÉCNICO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - UNESP - FCA - LAGEADO - BOTUCATU (SP) Silva, Marcílio de Souza, 1983- S586a Ação tóxica de ingredientes ativos em Atta sexdens ru- bropilosa Forel, 1908 (Hymenoptera: Formicidae) visando seu emprego em iscas formicidas / Marcílio de Souza Silva. Botucatu : [s.n.], 2012 xii, 86 f. : il., grafs., tabs. Tese(doutorado)- Universidade Estadual Paulista Facul- dade de Ciências Agronômicas, Botucatu, 2012 Orientador: Luiz Carlos Forti Co-Orientador: Nilson Satoru Nagamoto Inclui bibliografia 1. Formiga-cortadeira. 2. Inseticidas. 3. Formiga – cortadeira - Controle. I. Forti, Luiz Carlos.II. Nagamoto, Nilson Satoru. III. Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (Campus de Botucatu).Faculdade de Ciên- cias Agronômicas. IV. Título. III “A ciência não pode prever o que vai acontecer. Só pode prever a probabilidade de algo acontecer” (César Lattes). IV OFEREÇO A Deus, pela criação da vida. À minha querida mãe, Valci Francisca de Souza Santos, por todo amor, incentivo e colaboração. DEDICO V AGRADECIMENTOS À Universidade Estadual Paulista, através da Coordenação de Pós- Graduação em Agronomia/Proteção de Plantas, pela oportunidade de realizar o curso de doutorado. Ao Prof. Dr. Luiz Carlos Forti, pela orientação, amizade, apoio e grande contribuição na minha vida acadêmica; minha eterna gratidão. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, pela concessão de bolsa de estudo. Aos meus queridos irmãos: Marcos Paulo Souza de Almeida, Cícero Carlos Souza de Almeida e Moana Vitória de Souza Silva, por torcerem pelo meu sucesso. À minha amada Nayane Michelle Bezerra dos Santos, pelo carinho, amor, apoio e incentivo nesta reta final do curso de pós-graduação. Aos meus colegas do Laboratório de Insetos Sociais-Praga: Nilson Nagamoto, Roberto Camargo, Ricardo Fujihara, Rafael Barbieri, Sandra Cardoso, Sinara Moreira, Nádia Caldato, Mariana Brugger, Paula Dias, Tierla Barros, Lais Silva, Raphael Travaglini e Maria Alves. Aos colegas da pós-graduação: Anthony Almeida, Cícero Costa, Wilson Dourado, Saulo Almeida, Hermeson Vitorino, Ricardo Ferreira, Marlon Rocha, Plácido Melo, Carlos Silva, Pedro Bento, Leonardo Barbosa, Sihélio Cruz, Silvia Cruz, Adriana Tanaka, Hélio Moreira, Josué Ferreira, Givaldo Neto, Rafael Pombo, Lucas Holanda, Mikael Rodrigues e Adriano Santos, pelo companheirismo e convívio. Aos professores: Dr. Carlos Gilberto Raetano, Dr. Carlos Frederico Wilcken, Dr. Luiz Carlos Forti, Dr. Edson Luiz Lopes Baldin, Dr. Edson Luiz Furtado, Dra. Marli Teixeira de A. Minhoni e Dr. Luiz Carlos Luchini, pelos ensinamentos transmitidos. Ao técnico de laboratório, David Generoso, pelo apoio e convívio. Aos funcionários da Biblioteca “Prof. Paulo de Carvalho Mattos” (FCA/UNESP) pelo atendimento e colaboração. A todos aqueles que direta ou indiretamente, contribuíram com a realização desta tese. VI SUMÁRIO Página LISTA DE FIGURAS ........................................................................................ ........ VIII LISTA DE TABELAS ............................................................................................... IX RESUMO ................................................................................................................... XI SUMMARY ............................................................................................................... XII 1 INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 1 2 REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................... 3 2.1 As formigas-cortadeiras ........................................................................... 3 2.1.1 Importância econômica .................................................................. 4 2.2 Formigas-cortadeiras e seu fungo simbionte versus fungos associados .. 5 2.3 Controle químico de formigas-cortadeiras ............................................... 6 2.4 Características desejadas de princípios ativos .......................................... 7 2.5 Ingredientes ativos.................................................................................... 8 2.5.1 Sulfluramida ................................................................................... 8 2.5.2 Fipronil ........................................................................................... 9 2.5.3 Indoxacarbe .................................................................................... 9 2.5.4 Imidaclopride ................................................................................. 10 2.5.5 Diafentiuron ................................................................................... 10 3 CAPÍTULOS ........................................................................................................... 12 I – PREVALÊNCIA DO FUNGO Leucoagaricus gongylophorus (BASIDIOMYCOTA: AGARICALES) E CONTAMINAÇÃO DE OPERÁRIAS APÓS APLICAÇÃO DE FIPRONIL E SULFLURAMIDA EM Atta sexdens rubropilosa (HYMENOPTERA: FORMICIDAE) .................................................... 12 Resumo ........................................................................................................... 13 1.1 Introdução ................................................................................................ 15 1.2 Material e Métodos .................................................................................. 16 1.3 Resultados ................................................................................................ 19 1.4 Discussão .................................................................................................. 25 1.5 Conclusão ................................................................................................. 27 VII II – TOXICIDADE TÓPICA DE INGREDIENTES ATIVOS EM Atta sexdens rubropilosa (HYMENOPTERA: FORMICIDAE) .................................................... 29 Resumo ........................................................................................................... 30 2.1 Introdução ................................................................................................ 32 2.2 Material e Métodos .................................................................................. 33 2.3 Resultados ................................................................................................ 35 2.4 Discussão .................................................................................................. 39 2.5 Conclusão ................................................................................................. 41 III - MORTALIDADE DE OPERÁRIAS DE Atta sexdens rubropilosa (HYMENOPTERA: FORMICIDAE) APÓS PROCESSO DE FOTÓLISE DE DIAFENTIURON ...................................................................................................... 43 Resumo ........................................................................................................... 44 3.1 Introdução ................................................................................................ 46 3.2 Material e Métodos .................................................................................. 47 3.3 Resultados ................................................................................................ 49 3.4 Discussão .................................................................................................. 54 3.5. Conclusão ................................................................................................ 56 IV – APLICAÇÃO DE ISCAS GRANULADAS CONTENDO DIAFENTIURON EM COLÔNIAS DE Atta sexdens rubropilosa (HYMENOPTERA: FORMICIDAE).. 58 Resumo ........................................................................................................... 59 4.1 Introdução ................................................................................................ 61 4.2 Material e Métodos .................................................................................. 62 4.3 Resultados ................................................................................................ 64 4.4 Discussão .................................................................................................. 70 4.5. Conclusão ................................................................................................ 74 4 CONCLUSÕES ...................................................................................................... 75 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................................ 76 VIII LISTA DE FIGURAS Página Capítulo I Figura 1. Frequência absoluta de fungos após aplicação de ingredientes ativos em colônias de Atta sexdens rubropilosa. A: grupo de ação rápida; B: grupo de ação retardada ..................................................................................................................... 20 Capítulo II Figura 1. Estimativas de mortalidade (%) de operárias de Atta sexdens rubropilosa em função de ingredientes ativos e diferentes níveis de doses estudadas .................................................................................................................... 38 Capítulo III Figura 1. Evolução dos sintomas de intoxicação após a indução de ingestão de sulfluramida (formicida padrão) e diafentiuron (diferentes níveis de exposição à luz UV) em operárias de Atta sexdens rubropilosa ................................................... 53 Capítulo IV Figura 1. Ilustração e descrição da escala de notas no corte de folhas de Acalypha sp. por operárias de Atta sexdens rubropilosa ........................................................... 64 Figura 2. Carregamento de folhas de Acalypha sp. da câmara de forrageamento das colônias por operárias de Atta sexdens rubropilosa após aplicação dos tratamentos ................................................................................................................. 65 Figura 3. Incorporação de substrato vegetal na cultura de fungo por operárias de Atta sexdens rubropilosa após aplicação dos tratamentos ......................................... 66 IX LISTA DE TABELAS Página Capítulo I Tabela 1. Avaliação da porcentagem de glândula pós-faríngea (GPF) corada de acordo com o ingrediente ativo e casta de operárias de Atta sexdens rubropilosa .... 21 Tabela 2. Porcentagem estimada da glândula pós-faríngea (GPF) corada de operárias, empregando-se regressão logística, após aplicação de iscas tóxicas em colônias de Atta sexdens rubropilosa ........................................................................ 23 Tabela 3. Fungos associados isolados de colônias de Atta sexdens rubropilosa após aplicação de ingredientes ativos ........................................................................ 24 Capítulo II Tabela 1. Valores de DL50 de ingredientes ativos aplicados por contato em operárias de Atta sexdens rubropilosa ....................................................................... 35 Tabela 2. Valores de TL50 de ingredientes ativos aplicados por contato em operárias de Atta sexdens rubropilosa ....................................................................... 36 Tabela 3. Eficiência de controle pela aplicação de ingredientes ativos em operárias de Atta sexdens rubropilosa após 21 dias de aplicação por contato .......................... 37 Capítulo III Tabela 1. Porcentagem da mortalidade acumulada de operárias de Atta sexdens rubropilosa após oferecimento de isca pastosa contendo sulfluramida (formicida padrão) e diafentiuron (diferentes níveis de exposição à luz UV) de acordo com o período de avaliação ................................................................................................... 51 Tabela 2. Porcentagem média da mortalidade acumulada de operárias de Atta sexdens rubropilosa após oferecimento de isca pastosa contendo sulfluramida (formicida padrão) e diafentiuron (diferentes níveis de exposição à luz UV) ........... 52 Tabela 3. Valores de TL50 de sulfluramida (formicida padrão) e diafentiuron (diferentes níveis de exposição à luz UV) aplicados por ingestão em operárias de Atta sexdens rubropilosa ............................................................................................ 54 X Capítulo IV Tabela 1. Notas atribuídas ao corte de folhas de Acalypha sp. por operárias de Atta sexdens rubropilosa após aplicação dos tratamentos ................................................. 67 Tabela 2. Evolução dos tratamentos de acordo com o período de avaliação após aplicação de iscas, utilizando a escala de nota de corte de folhas de Acalypha sp. (0 a 4) por operárias de Atta sexdens rubropilosa .......................................................... 68 Tabela 3. Massa da câmara de fungo de colônias jovens (8 meses) de Atta sexdens rubropilosa após 21 dias da aplicação de tratamentos ............................................... 69 Tabela 4. Estado geral das colônias de Atta sexdens rubropilosa após o tratamento com iscas .................................................................................................................... 70 XI RESUMO As formigas-cortadeiras são insetos sociais de grande importância agrícola devido ao seu ataque danoso aos diversos sistemas produtivos. Pertencem à tribo Attini e cultivam um fungo simbionte utilizado como alimento, a qual é considerada uma grande comunidade microbiana. Entretanto, estudos sobre o efeito da aplicação de ingredientes ativos em operárias isoladas e colônias de A. sexdens rubropilosa têm sido frequentes, mas não tem apresentado resultados satisfatórios para serem empregados no controle destes insetos. Sendo assim, o trabalho teve como objetivos: (1) avaliar o efeito de ingredientes ativos de formicidas comerciais sobre a micota de A. sexdens rubropilosa; (2) avaliar a toxicidade tópica de novos ingredientes ativos em operárias de A. sexdens rubropilosa; (3) avaliar a mortalidade de operárias de A. sexdens rubropilosa após o processo de fotólise de diafentiuron; (4) avaliar o efeito de diafentiuron adicionado em isca granulada após o processo de fotólise em colônias de A. sexdens rubropilosa. Foram utilizadas colônias de laboratório submetidas aos diferentes experimentos com aplicação de ingredientes ativos. Desta forma, obtiveram-se os seguintes resultados: (1) houve prevalência do fungo simbionte, demostrando que não ocorre o sinergismo quando se aplica isca formicida; (2) diafentiuron apresentou ação tópica retardada, mostrando-se um ingrediente ativo promissor para iscas tóxicas; (3) após o processo de fotólise, diafentiuron apresentou mortalidade de operárias acima de 80% entre o terceiro e quinto dia após a aplicação; (4) tratamentos contendo diafentiuron (2h e 6h) conseguiram reduzir o corte de folhas e a massa do jardim de fungo, mas não levaram as colônias de A. sexdens rubropilosa à morte. Palavras-chave: formigas-cortadeiras, inseticida, isca, controle. XII TOXIC ACTION OF ACTIVE INGREDIENTS ON Atta sexdens rubropilosa Forel, 1908 (HYMENOPTERA: FORMICIDAE) AIMING THE EMPLOYMENT IN FORMICIDE BAITS. Botucatu, 2012, 86p. Thesis (Ph.D. in Agronomy/Plant Protection) – Faculdade de Ciências Agronômicas, Universidade Estadual Paulista. Author: MARCÍLIO DE SOUZA SILVA Advisor: LUIZ CARLOS FORTI Co-Advisor: NILSON SATORU NAGAMOTO SUMMARY Leaf-cutting ants are social insects of agricultural importance due to its damaging attack to the various production systems. These insects Attini and cultivate a symbiotic fungus for food, which is considered a major microbial community. However, studies on the effect of active ingredients in isolated workers and colonies of A. sexdens rubropilosa have been frequent, but have not shown satisfactory results to be used to control these insects. Thus, the study aimed to: (1) evaluate the effect of active ingredients of formicides commercials on the mycota of A. sexdens rubropilosa, (2) evaluate the toxicity of new active topical ingredients on workers of A. sexdens rubropilosa, (3) evaluate the mortality of A. sexdens rubropilosa workers after the process of photolysis of diafenthiuron, (4) evaluate the effect of diafenthiuron added to granulated bait after the process of photolysis in A. sexdens rubropilosa colonies. We used laboratory colonies submitted to different experiments with application of active ingredients. Thus, the following results were obtained: (1) there was prevalence of symbiotic fungus, demonstrating that no synergism occurs when applying formicidal bait; (2) diafenthiuron showed topical delayed action , showing a promising active ingredient for toxic baits; (3) after the process of photolysis, diafenthiuron show mortality of workers above 80% between the third and fifth day after application; (4) treatments containing diafenthiuron (2 and 6h) managed to reduce the cutting leaves and mass of the fungus garden, but led the colonies of A. sexdens rubropilosa to death. Keywords: leaf-cutting ants, insecticide, bait, control. 1 1 INTRODUÇÃO Formigas dos gêneros Atta e Acromyrmex são reconhecidas por alimentarem-se de seu jardim de fungo e, principalmente, por cortarem e carregarem folhas, flores e sementes para incorporarem nesse jardim (HÖLLDOBLER; WILSON, 1990; ANDRADE et al., 2002). Dentre estas, a espécie Atta sexdens rubropilosa Forel, 1908, popularmente conhecida como saúva-limão, encontra-se bem distribuída em alguns estados brasileiros (DELLA LUCIA, 2011). Esta formiga ataca diversas culturas de relevante importância agrícola, extraindo partes de plantas e provocando redução significativa da produção, principalmente em plantios comerciais de espécies florestais (ZANETTI et al., 2003c, 2004). Por ser considerada uma praga em potencial e representar bem este grupo de insetos desfolhadores é que esta espécie tem sido frequentemente utilizada como modelo de estudo no desenvolvimento de novos formicidas, com a finalidade de serem usados para permitir seu controle, reduzindo assim as perdas causadas por sua atividade forrageira (NAGAMOTO et al., 2004, 2007). Estes formicidas têm sido desenvolvidos para serem empregados na forma de isca granulada, pois é a principal técnica de controle que tem demonstrado eficiência na redução de danos causados por estas formigas (FORTI et al., 2007). Entretanto, segundo Forti et al. (1998), seu desenvolvimento em escala industrial, com adição de ingredientes ativos conhecidos pode ser considerado relativamente recente, pois somente a partir de 1960 é que foram testadas com resultados satisfatórios. Desde então, diversos estudos foram 2 realizados não somente com a finalidade de tornar esta técnica cada vez mais eficiente, como também reduzir sua agressão aos agroecossistemas (BOARETTO; FORTI, 1997). A maior parte destes estudos se depara com a dificuldade de encontrar um bom formicida, pois além de eficiente contra as formigas, deve conter características físico-químicas que reduzam seu efeito tóxico ao meio ambiente como, por exemplo, o tempo necessário para que ocorra sua degradação após a aplicação no campo (BOARETTO; FORTI, 1997; FORTI et al., 1998). Um exemplo de ingrediente ativo cujo uso como formicida foi proibido são os clorados (dodecacloro, aldrin e heptacloro) (NAKANO, 1994), devido ao seu poder residual muito elevado, persistindo no ambiente por muitos anos, podendo contaminar o homem e animais, sendo substituído pela sulfluramida (LARANJEIRO; ZANUNCIO, 1995). Por isso, pesquisas que visem à descoberta ou que ao menos possam servir de subsídios científicos para o desenvolvimento de novos ingredientes ativos para serem empregados em iscas formicidas são de extrema importância, pois permitem o uso de produtos fitossanitários seguros e eficientes, tornando-se uma opção de controle economicamente viável para os produtores rurais. Sendo assim, o principal objetivo desta tese foi avaliar a toxicidade de ingredientes ativos sobre as colônias, suas operárias (isoladas) e seu consórcio microbiano em formigas-cortadeiras, utilizando a espécie A. sexdens rubropilosa como modelo de estudo devido à relativa facilidade de mantê-la em condições de laboratório, permitindo a execução de bioensaios. Para tanto, foram levantadas algumas hipóteses e analisadas de acordo com cada capítulo desta tese: i) ocorre prevalência de fungo associado (não simbionte) em colônias após aplicação de iscas tóxicas; ii) existe toxicidade tópica de ingredientes ativos em operárias; iii) ocorre mortalidade de operárias por ingestão de diafentiuron após fotólise e; iv) ocorre mortalidade de colônias por diafentiuron após fotólise quando adicionado em isca granulada. Com a avaliação destas hipóteses, pretende-se fornecer informações quanto à ação tóxica de ingredientes ativos empregados em iscas granuladas, contribuindo para o controle químico de formigas-cortadeiras na perspectiva de reduzir os danos às culturas agrícolas e ao ambiente. 3 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 As formigas-cortadeiras As formigas são organismos dominantes na maioria dos ecossistemas terrestres, apresentando importantes papéis no fluxo de energia e nutrientes. Estas participam da aeração do solo, polinização e dispersão de sementes. Representam o grupo de insetos mais amplamente distribuído e numericamente abundante (SILVESTRE, 2000). As formigas-cortadeiras pertencem à família Formicidae, subfamília Myrmicinae, tribo Attini e compreendem mais de 250 espécies catalogadas, incluídas em 16 gêneros, apesar da dúvida sobre o gênero Pseudoatta que é considerado como sinônimo de Acromyrmex (BRANDÃO et al., 2011). Elas ocorrem em muitos países do novo mundo, com exceção do Chile e das ilhas de Cuba e Trinidad e Tobago (MICHELS et al., 2001). Todas as Attini cultivam um fungo que é a principal fonte alimentar das larvas e que também constitui parte da alimentação dos adultos (MUELLER, 2002; SILVA et al., 2003). Entretanto, no Brasil as formigas dos gêneros Atta (saúvas) e Acromyrmex (quenquéns) têm maior importância agrícola. Ambos os gêneros têm sido descritos como os herbívoros dominantes da Região Neotropical, consumindo muito mais vegetação que qualquer outro grupo de animais de diversidade taxonômica comparável, com a inclusão também de mamíferos, hemípteros e lepidópteros (HÖLLDOBLER; WILSON, 1990). Encontram-se distribuídos por todo o território nacional e com intensa atividade durante o ano, atacando várias culturas agrícolas, pastagens e, em particular, os 4 reflorestamentos (HERNANDEZ; JAFFÉ, 1995), desde as plantas em viveiros até o campo definitivo (ZANETTI et al., 2003b). 2.1.1 Importância econômica As formigas-cortadeiras utilizam diversas plantas para cultivar o fungo do qual se alimentam. Elas podem cortar flores e folhas ou utilizar porções já desprendidas. São conhecidas pela complexidade de suas preferências, dependentes, em parte, das características físicas dos vegetais (REIS FILHO et al., 2007). Parâmetros químicos e físicos influenciam na aceitação desses materiais pelas formigas (FOWLER; STILES, 1980). De modo geral, as formigas-cortadeiras têm preferência pelas partes tenras das plantas (REIS FILHO et al., 2007). Segundo Amante (1967), dez sauveiros adultos ha-1 cortam aproximadamente 21 Kg de folhas dia-1, reduzindo em mais de 50% a capacidade de pastagem, além de proporcionar maior desenvolvimento de plantas daninhas. Os prejuízos causados pela atividade de Atta sexdens rubropilosa Forel, 1908 (Hymenoptera: Formicidae), numa densidade de 4 colônias ha-1 foram calculados em 14% para plantações de Eucalyptus spp. e 14,5% para a produção de Pinus spp. (AMANTE, 1972). A. sexdens rubropilosa é popularmente conhecida como “saúva-limão” e encontra-se distribuída pelos Estados de São Paulo, Minas Gerais, Espírito Santo, Rio de Janeiro, Mato Grosso, Goiás e Paraná (DELLA LUCIA et al., 1993). Anjos et al. (1998) descreveram que o desfolhamento provocado pelas formigas-cortadeiras em ecossistemas tropicais provoca o consumo de 15% da produção florestal. Segundo Zanetti et al. (2003b), as formigas-cortadeiras são consideradas as principais pragas de reflorestamentos no Brasil, podendo reduzir a produção de madeira de Eucalyptus spp. em até 0,87% por ha a cada incremento unitário do número de ninhos dessas formigas. Essas formigas, além de consumirem de 4 a 17% da produção de folhas de uma floresta como a Amazônica (ARAÚJO JR., 2004), criam clareiras de sub- bosque para a construção dos ninhos, aumentando a quantidade de luz que chega ao chão da floresta e modificando a composição de espécies e a estrutura das comunidades vegetais 5 (FARJI-BRENER; ILLES, 2000). As cortadeiras ocorrem durante o ano todo podendo não apresentar redução na sua população, além de atacarem plantas de todas as idades (DELLA LUCIA; ARAÚJO, 2000). 2.2 Formigas-cortadeiras e seu fungo simbionte versus fungos associados Os membros da tribo Attini são cultivadores de fungo da família Agaricaceae e Pterulaceae (Basidiomycota: Agaricales), que lhe serve como principal suplemento alimentar (REYNOLDS; CURRIE, 2004). Elas fornecem folhas frescas e flores como substratos de suporte ao crescimento do cultivo e promovem o crescimento de seu fungo simbionte por meio da poda e do movimento de enzimas no jardim (BASS; CHERRET, 1996). O jardim de fungo de formigas da tribo Attini é considerado uma comunidade microbiana, pois diversos microrganismos podem ser encontrados neste ambiente particular, além do fungo simbionte Leucoagaricus gongylophorus (Möller) Singer (Basidiomycota: Agaricales) (RODRIGUES et al., 2008). Estudos taxonômicos revelaram a presença de duas novas espécies de leveduras, a Cryptococcus haglerorum (Basidiomycota: Tremellales) (MIDDELHOVEN et al., 2003) e Sympodiomyces attinorum (Ascomycota: Saccharomycetales) (CARREIRO et al., 2004), sendo descritas em associação com A. sexdens rubropilosa. No entanto, sua relação com o fungo simbionte e com as formigas cultivadoras ainda é pouco conhecida. Além disso, existem fungos parasitas do gênero Escovopsis Muchovej & Della Lucia (Ascomycota: Hypocreales) que são conhecidos em jardins de fungo de formigas Attini (REYNOLDS; CURRIE, 2004). Fungos deste gênero parecem ser obrigatoriamente especializados na simbiose com microrganismos de formigas da tribo Attini; tendo sido encontrados naturalmente somente em jardins de fungo de formigas e associados às câmaras de lixo (BOT et al., 2001). Com relação aos mecanismos de patogenicidade, Currie (2001b) especula que Escovopsis sp. pode competir com o fungo simbionte pelo substrato presente nos ninhos, embora, acredita-se que o parasita retire seus nutrientes do próprio fungo, atuando como um micoparasita. Pode devastar ninhos que estão sem o controle das operárias em um 6 período de 12 a 24 horas e em alguns casos, ninhos que ainda estejam sob influência das operárias (CURRIE et al., 1999). Outro tipo de fungo que está associado à relação de formigas- cortadeiras e seu simbionte são os antagonistas não especializados como Syncephalastrum racemosum (Cohn) Schröter (Zygomycota: Mucorales), Cunninghamella elegans Lendn. (Zygomycota: Mucorales) e Trichoderma harzianum Rifai (Ascomycota: Hypocreales) que são saprófitas comumente encontrados em laboratório ou no campo em ninhos de formigas Attini, sendo importados pelas formigas com o material vegetal recolhido ou adquiridos a partir do solo (RODRIGUES et al., 2008) e que podem inibir o crescimento do fungo simbionte quando estudados em testes in vitro (SILVA et al., 2006). 2.3 Controle químico de formigas-cortadeiras Considerados insetos formidáveis pela eficiência no corte e transporte de folhas, as formigas-cortadeiras possuem várias características biológicas e comportamentais que lhes conferem tal posição. Contudo, tais características constituem uma barreira para a utilização de novas moléculas e técnicas de controle dessas pragas (MARINHO et al., 2006). Entretanto, o controle químico dessas formigas tem sido efetivamente utilizado desde a década de 50 do século passado, quando os inseticidas foram sintetizados, variando na formulação e modo de aplicação, sendo o único com tecnologia disponível para utilização prática no controle de formigas-cortadeiras, principalmente com o uso de iscas tóxicas (BOARETTO; FORTI, 1997). Outros métodos de controle vêm sendo testados para formigas-cortadeiras (biológico, por exemplo), no entanto, o controle químico é o único com tecnologia disponível para uso em grande escala, destacando-se a termonebulização e as iscas tóxicas como as técnicas mais eficientes (MOREIRA et al., 2004). Por outro lado, pesquisas relacionadas às condições ambientais como luz e temperatura já foram exploradas por alguns autores para explicar respostas comportamentais e formas de controle alternativo (PARRA et al., 1974; ROCES; KLEINEIDAM, 2000), bem como o uso de plantas com propriedades inseticidas, podendo 7 provocar efeitos diretos sobre as operárias de formigas-cortadeiras ou indiretos sobre o crescimento de seu fungo simbionte (BUENO; BUENO, 2011). Outro campo bem explorado é o uso de agentes entomopatogênicos como Beauveria bassiana (Bals.-Criv.) Vuill. (Ascomycota: Hypocreales) e Metarhizium anisopliae (Metschn.) Sorokin (Ascomycota: Hypocreales) para o controle de formigas (ALVES; SOSA GOMEZ, 1983; JACCOUD et al., 1999; LOUREIRO; MONTEIRO, 2005) ou combinados com inseticidas (SANTOS et al., 2007). Porém, apesar dos esforços envolvendo o conhecimento de áreas relacionadas a outros métodos, o controle químico de formigas-cortadeiras ainda se constitui no método mais amplamente utilizado, por ser considerado o mais eficiente dentre os métodos de controle disponíveis (OLIVEIRA et al., 2011). 2.4 Características desejadas de princípios ativos De modo geral, somente os ingredientes ativos que apresentam ação retardada são eficientes para formigas-cortadeiras quando formulados em iscas tóxicas (FORTI et al., 1998), pois é necessário que o inseticida preencha algumas exigências para que seja formulado em iscas tóxicas, tais como: (a) ser letal em baixa concentração e ao mesmo tempo não matar as formigas rapidamente quando em alta concentração; (b) ser um inseticida de ingestão, com ação lenta; (c) não ser repelente; (d) ser facilmente difundido por trofalaxia para a maioria das operárias e, (e) ser degradado rapidamente, com baixa toxicidade para os vertebrados e não causar muitos prejuízos ao ambiente. Durante muitos anos, o dodecacloro, um ingrediente ativo organoclorado utilizado no Brasil continha todas essas características associadas, porém, por ser persistente no solo e ser bioacumulativo foi proibido em 1992 (BOARETTO; FORTI, 1997). Sua proibição foi dada com a descoberta de outro princípio ativo substituto, a sulfluramida. A maioria das iscas tóxicas presentes no mercado é à base de sulfluramida (concentração de 0,3%), devido a sua eficiência de 90 a 100% de mortalidade no controle de várias espécies de formigas-cortadeiras como Atta laevigata (F. Smith, 1858) 8 (Hymenoptera: Formicidae) (ZANUNCIO et al., 1992), Acromyrmex subterraneus molestans Santschi, 1925 (Hymenoptera: Formicidae) (ZANETTI et al., 2003a) e A. sexdens rubropilosa (ZANETTI et al., 2003c). Apesar da descoberta da sulfluramida, a busca e o desenvolvimento de novos ingredientes ativos continuam, pois este é considerado um ingrediente ativo bioacumulativo e sua restrição no controle desta praga está em discussão. Em virtude disso, muitas pesquisas têm dado ênfase na busca de novos ingredientes ativos como, por exemplo, o diflubenzuron e fenoxicarbe, entre outros (JACOB, 2002). De acordo com Zanuncio et al. (1993), existem muitos produtos capazes de matar as formigas, mas poucos têm ação retardada nas concentrações adequadas, sendo portanto, ineficazes para serem usados como ingredientes ativos de iscas formicidas. 2.5 Ingredientes ativos Grupos de pesquisa em mirmecologia como, por exemplo, o Laboratório de Insetos Sociais-Praga da Faculdade de Ciências Agronômicas, da Universidade Estadual Paulista, Botucatu-SP, vêm realizando diversos ensaios de laboratório e de campo na busca por ingredientes ativos promissores para serem empregados em iscas formicidas. Com base nos resultados preliminares destes ensaios de laboratório é que foram selecionados os ingredientes ativos utilizados nos experimentos desta tese. 2.5.1 Sulfluramida Pertence ao grupo químico sulfonamida fluoralifática, denominado de sulfluramida, mas com o nome químico IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry): N-etilperfluor-octano-1-sulfonamida, primeiramente estudado no combate das formigas lava-pés Solenopsis invicta Buren (Hymenoptera: Formicidae) nos EUA (FORTI et al., 1998). Esse composto, quando presente no organismo, é transformado no metabólito perfluoroctano sulfonamida que bloqueia o fluxo de elétrons da cadeia respiratória, 9 nas mitocôndrias, interrompendo a síntese de adenosina trifosfato (representado pela sigla ATP na língua inglesa). Desse modo, as operárias intoxicadas apresentam movimentos lentos e agressividade diminuída. Além disso, a contaminação por sulfluramida é dada pela ingestão com a contribuição da trofalaxia e possivelmente durante o grooming (BRUGGER et al., 2008) entre as operárias e após quatro dias de aplicação, os ninhos não apresentam corte de folhas, muitas operárias estão mortas e a cultura de fungo torna-se desorganizada. Além disso, é menos persistente do que o dodecacloro (JACOB, 2002). 2.5.2 Fipronil Além da sulfluramida, a maior descoberta de efetividade de ingrediente ativo contra formigas-cortadeiras foi o fipronil (GROSMAN et al., 2002), cujo nome químico IUPAC é [(RS)-5-amino-1-(2,6-dichloro-a,a,a-trifluoro-p-tolil)-4- trifluorometilsulfinilpirazole-3-carbonitrila]. Pertence ao grupo químico fenil pirazol, sendo comercializado como formicida e cupinicida. É um inseticida neurotóxico que bloqueia a transmissão de sinais das células nervosas pela inibição do neurotransmissor ácido gama-aminobutírico (representado pela sigla GABA na língua inglesa) (COLE et al., 1993). Iscas contendo este ingrediente ativo são produzidas em pequena escala comercial e são de baixa eficiência contra algumas espécies de formigas-cortadeiras como Atta capiguara Gonçalves, 1944 (Hymenoptera: Formicidae) (FORTI et al., 2003). 2.5.3 Indoxacarbe O indoxacarbe é um inseticida pertencente ao grupo químico oxadiazina, com o nome químico IUPAC: metil (S)-N-[7-cloro-2,3,4a,5-tetrahidro-4a- (metoxicarbonil) indeno[1,2-e][1,3,4]oxadiazina-2-ilcarbonil]-4'-(trifluorometoxi) carbanilato. Uma característica fundamental deste composto é sua forma de bioativação, em que bloqueia os canais de sódio pela mudança de voltagem a partir da produção de um metabólito chamado de N-decarbometoxilato. É um inseticida altamente ativo, de amplo espectro quando 10 administrado diretamente por via tópica ou via oral para insetos-praga, principalmente em Lepidoptera, mas também em Hemiptera e Coleoptera (WING et al., 2000). Indoxacarbe representa o primeiro inseticida comercializado que atua no bloqueio de canais de sódio no axônio da célula neural, um mecanismo de ação primeiramente identificado em pirazolina (outro composto químico bloqueador de canais de sódio). A descoberta de indoxacarbe foi devido ao esforço em aperfeiçoar o uso de pirazolina como inseticida eficiente e seguro para organismos não-alvos e ao ambiente (McCANN et al., 2001). 2.5.4 Imidaclopride Importante inseticida pertencente ao grupo químico neonicotinoide, com o nome químico IUPAC: 1-(6-cloro-3-piridilmetil)-N-nitroimidazolidina-2-ilideneamina, possuindo diversos modos de ação (sistêmico, contato e ingestão). Dentre os neonicotinoides com potencial de uso na agricultura estão o imidaclopride, acetamipride e tiametoxam (ISHAAYA et al., 2007). Os neonicotinoides atuam especificamente em pragas sugadoras e têm efeito leve sobre os inimigos naturais (predadores e parasitoides), ajustando-se aos programas de Manejo Integrado de Pragas (ISHAAYA et al., 2007). Nos insetos, agem como agonistas de receptores nicotínicos da acetilcolina (representado pela sigla nAChR na língua inglesa) na sinapse da célula neural, resultando em excitação e paralisia seguida de morte. É reportado como um dos inseticidas sistêmicos com maior potencial e de largo espectro (insetos sugadores) no controle de pragas (ISHAAYA et al., 2007; ELBERT et al., 2008). 2.5.5 Diafentiuron É um inseticida e acaricida que pertence ao grupo químico tiourea, com o nome químico IUPAC: 1-tert-butil-3-(2,6-di-isopropil-4-fenoxifenil) tiourea. Diafentiuron é relatado como um pró-inseticida que pode ser convertido para o correspondente carbodiimida (potente inseticida) por um processo de fotodegradação, principalmente em 11 condições de campo, tendo sua ação comprovada contra algumas espécies de insetos das ordens Lepidoptera, Diptera e Blattodea (RUDER; KAYSER, 1993). Supõe-se que o modo de ação de diafentiuron quando convertido em carbodiimida envolva a inibição da síntese de ATP (a porção de oligomicina que é sensitiva) ao nível de mitocôndria das células (PETROSKE; CASIDA, 1995). Essa inibição da enzima se torna irreversível e ocorre uma contínua diminuição na taxa de consumo por oxigênio, reduzindo a atividade de locomoção de insetos. Primeiramente, pela inibição do metabolismo de energia para o sistema nervoso e digestório devido a inibição da ATPase mitocondrial e, consequentemente, pela paralisia muscular (RUDER; KAYSER, 1993). 12 3 CAPÍTULOS Capítulo I PREVALÊNCIA DO FUNGO Leucoagaricus gongylophorus (BASIDIOMYCOTA: AGARICALES) E CONTAMINAÇÃO DE OPERÁRIAS APÓS APLICAÇÃO DE FIPRONIL E SULFLURAMIDA EM Atta sexdens rubropilosa (HYMENOPTERA: FORMICIDAE) 13 Resumo Jardins de fungos de formigas-cortadeiras (Formicidae: Attini) podem ser parasitados por outros fungos de crescimento rápido, principalmente quando se encontram em estado de estresse. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de ingredientes ativos de formicidas comerciais sobre a micota de A. sexdens rubropilosa. Foram utilizadas colônias de laboratório com 750 mL de fungo para aplicação de formicidas. Os tratamentos foram divididos em dois grupos de acordo com o tempo de ação tóxica: i) controle e fipronil [0,003%] (ação rápida); ii) controle e sulfluramida [0,3%] (ação retardada) aplicados na forma de isca granulada. Para cada grupo de tratamento avaliado foram retiradas 250 operárias das colônias para dissecação devido ao uso de corante lipossolúvel e 25 fragmentos de fungo que foram inoculados em meio BDA, sendo o fungo derivado do isolamento identificado por técnica molecular. Houve contaminação de diferentes castas de operárias, mas não foi observada a prevalência de nenhuma espécie de fungo filamentoso relatado na literatura como parasita de L. gongylophorus em ambos os grupos de ação tóxica, demostrando que nem sempre ocorre sinergismo de IA formicida e fungos parasitas do simbionte de A. sexdens rubropilosa e que provavelmente a ocorrência de fungos parasitas está relacionada com a micota do ambiente de cada colônia. Palavras-chave: jardim de fungo, formigas-cortadeiras, ingrediente ativo, parasitismo. 14 Chapter I PREVALENCE OF THE FUNGI Leucoagaricus gongylophorus (BASIDIOMYCOTA: AGARICALES) AND CONTAMINATION OF WORKER AFTER APPLICATION OF FIPRONIL AND SULFLURAMID IN Atta sexdens rubropilosa (HYMENOPTERA: FORMICIDAE) Summary Fungus gardens of leaf-cutting ants (Formicidae: Attini) can be parasitized by other fast-growing fungi, especially when they are in a state of stress. The aim of this study was to evaluate the effect of active ingredients of formicides commercials on the ant fungal mycota of A. sexdens rubropilosa. We used laboratory colonies with 750 mL of fungus for application of fomicidal. The treatments were divided into two groups according to the time of toxic action: i) control and fipronil [0.003%] (fast action), ii) control and sulfluramid [0.3%] (delayed action) applied as granulated bait. For each treatment group, 250 workers of the colonies were removed for dissection due to the use of fat-soluble dye and 25 fragments of fungus were inoculated on PDA and the isolate obtained were identified by molecular technique. There was contamination of different castes of workers, but was not observed prevalence of any species of filamentous fungi reported in the literature as a parasite of L. gongylophorus in both groups of toxic action, demonstrating that not always occurs synergism of formicidal active ingredient and parasites fungi of the symbiont of A. sexdens rubropilosa and probably the occurrence of parasitic fungal mycota is related to the environment of each colony. Keywords: garden of fungi, leaf-cutting ants, active ingredient, parasitism. 15 1.1 Introdução A sobrevivência da formiga cortadeira Atta sexdens rubropilosa Forel, 1908 (Formicidae: Myrmicinae: Attini) está associada ao sucesso no cultivo de seu fungo simbionte Leucoagaricus gongylophorus (Möller) Singer (Basidiomycota: Agaricales), o qual lhe serve como principal suplemento alimentar durante milhões de anos de coevolução, sendo necessário o corte de partes de plantas para ser incorporado como substrato no seu jardim (MUELLER, 2002). Porém, além da estreita relação desta espécie com seu fungo simbionte, também pode ocorrer uma associação negativa (não simbionte) com outros fungos como, por exemplo, Escovopsis (Ascomycota) que é um parasita especializado do fungo L. gongylophorus com origem conhecida nos jardins de Attini, podendo ser horizontalmente transmitido entre as colônias (CURRIE et al., 1999) ou por espécies de invertebrados que vivem em associação com o cultivo do fungo de formigas e que ocasionalmente se movem entre as colônias transportando-o (CURRIE, 2001a). A comunidade microbiana dentro das colônias é considerada bastante extensa, pois vem sendo reportada por Rodrigues et al. (2008) e Mendes et al. (2012), os quais relatam a existência de associações com diferentes espécies de fungos. Entretanto, alguns estudos têm relatado o comportamento da comunidade microbiana após o uso de ingredientes ativos (IA`s) em iscas formicidas (RODRIGUES, 2004; CARLOS et al., 2011), principalmente Escovopsis spp., Syncephalastrum racemosum (Cohn) Schröter (Zygomycota), Trichoderma harzianum Rifai 16 (Ascomycota) e Fusarium oxysporum Schlechtendal (Ascomycota) fungos que prevaleceram após serem tratados com iscas tóxicas, sendo o rápido crescimento de fungos filamentosos devido, provavelmente, ao estresse causado na associação entre formiga e fungo simbionte (RODRIGUES et al., 2005). As iscas contendo ingrediente ativo com ação rápida, dependendo da idade da colônia, podem não matá-la, mas afetá-la drasticamente com a morte de operárias. Com essas infecções persistentes, o fungo parasita ocasiona um impacto significativo na sanidade e sobrevivência dos ninhos, diminuindo a taxa de crescimento, esta traduzida na redução da biomassa tanto de formigas como do fungo simbionte (CURRIE, 2001b). Contudo, o uso de iscas que promovam sinergismo com fungos parasitas pode provocar um impacto inicial muito grande na colônia, pois além da grande mortalidade de operárias e desorganização da divisão de trabalho, pode ainda, favorecer o estabelecimento do fungo parasita dentro do ninho, potencializando o controle de formigas- cortadeiras. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de ingredientes ativos de formicidas comerciais, de acordo com seu tempo de ação tóxica sobre a micota de A. sexdens rubropilosa. 1.2 Material e Métodos O experimento foi conduzido no Laboratório de Insetos Sociais-Praga, localizado na FCA/UNESP, Botucatu, SP. Foram utilizadas colônias de A. sexdens rubropilosa com um ano de criação em ambiente controlado (24ºC ± 2 e umidade relativa do ar de 70% ± 5), com fornecimento de substrato vegetal das espécies Ligustrum sp. (Oleaceae) e Acalypha sp. (Euphorbiaceae). As colônias foram mantidas em recipientes plásticos com volume de 1L (câmara do fungo simbionte), em cuja base havia uma camada de 1,5 cm de gesso (manutenção da umidade), além das câmaras de forrageamento e de lixo (cada um com 390 mL de capacidade), sendo periodicamente umedecido com água destilada. Os tratamentos foram divididos em dois grupos, conforme o tempo de toxicidade dos IA`s testados para A. sexdens rubropilosa, baseados em estudos realizados por Nagamoto et al. (2004) e Nagamoto et al. (2007), onde ocorreu 90% de mortalidade de 17 operárias. Assim, um grupo foi denominado de ação rápida (mortalidade total em até dois dias), representado pelos tratamentos: 1- controle e 2- fipronil [0,003%]. O outro grupo foi chamado de ação retardada (mortalidade total em até sete dias), com os tratamentos: 1- controle e 2- sulfluramida [0,3%]. Todos foram aplicados na forma de isca granulada. As iscas foram compostas dos seguintes ingredientes: pó de polpa cítrica, óleo de soja, carboxi-metil-celulose, ingrediente ativo, acetona e água destilada. Além destes componentes, foi adicionado o corante lipossolúvel Sudan Black (Sigma-Aldrich) devido à solubilidade dos IA`s testados que pode ser direcionada para a glândula pós-faríngea (GPF) (FORTI et al., 2012), o que possibilitou a sua observação após a dissecação das operárias em estereoscópio (ANDRADE et al., 2002), e consequentemente, a dispersão do IA entre as operárias das colônias tratadas. A proporção de castas de operárias dissecadas seguiu a metodologia de Wilson (1980). Foram aplicadas 0,1g de isca granulada para cada 100 mL de volume de fungo das colônias. Após aguardar o efeito tóxico de cada grupo de tratamento (rápido e retardado), iniciou-se a coleta do material fúngico das colônias para inoculação. Para cada grupo avaliado foram retiradas ao acaso 500 operárias, sendo então armazenadas em baixa temperatura para posterior dissecação. Em seguida, foram extraídos com pinça esterilizada 25 fragmentos de aproximadamente 30 mm3 de fungo de forma aleatória (parte jovem, mediana e antiga da esponja) de cinco diferentes colônias (repetições dos tratamentos), sendo a mesma descartada logo em seguida. Estes fragmentos foram inoculados em placas de Petri esterilizadas (90 mm x 15 mm), contendo meio BDA (Batata Dextrose Ágar) com adição de antibiótico (Estreptomicina e Penicilina G) para repicagem e posterior identificação do fungo, sendo mantidas a 25º C durante o período de crescimento. As placas foram observadas diariamente e as repicagens de fungos realizadas em dois momentos, de acordo com a necessidade: o primeiro quando o crescimento fúngico apresentava 15 mm de expansão máxima radial em relação ao ponto central de inoculação e; o segundo, quando atingia o 30º dia de inoculação na placa de Petri. Após esta etapa foram montadas lâminas para identificação microscópica dos fungos para triagem de fungos simbiontes e associados. Posteriormente, os fungos foram identificados utilizando a técnica do código de barras de DNA (DNA barcoding). A extração do DNA total dos isolados foi feito a partir do micélio utilizando-se o método CTAB (hexadecyltrimethylammonium 18 bromide) proposto por Doyle e Doyle (1990). Cerca de 100 a 150 mg de micélio foram macerados em nitrogênio líquido e transferidos para microtubos de 1,5 mL contendo 650 µL de solução tampão de extração (100 mM Tris-HCl pH 8,0; 20 mM EDTA pH 8,0; 1,4 M NaCl; 2% CTAB; 1% PVP; 0,2% Mercaptoetanol; 50 g mL-1 Proteinase K). Os tubos foram misturados por inversão e incubados a 55º C por 1 h, agitando-se a cada 15 min. Após as amostras serem resfriadas à temperatura ambiente, um volume 650 µL de clorofórmio/álcool isoamílico (24:1) foi adicionado. A mistura foi agitada manualmente por 2 min e em seguida centrifugada a 12.000 G por 5 min. A fase aquosa foi transferida para um novo microtubo, e um volume igual de isopropanol gelado (cerca de 600 µL) foi acrescentado. A solução foi incubada a -20º C por 4 h. Posteriormente procedeu-se a centrifugação a 12.000 G por 5 min, descartando-se em seguida a fase líquida. O DNA foi lavado duas vezes com 1 mL de etanol 70% e ressuspenso em 50 mL de TE (10 mM Tris HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA), contendo 10 g mL-1 RNase. Para amplificação por PCR, foi usado um volume final de 50 µL, contendo: 60 ng de DNA genômico, 10X enzima tampão, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP, 1U Taq DNA polimerase, 30 pmol para cada primer. Condições para amplificação de ciclos térmicos foram realizadas em um termociclador (PTC-100, MJ Research, Inc.) com 35 ciclos de 94º C por 1 min, 60º C por 1 min e 72º C por 1 min e a extensão final de 72º C por 10 min. O primer universal ITS5 e ITS4 (WHITE et al., 1990) (região ITS1-5,8S-ITS2) foi utilizado e o sequenciamento Sanger desenvolvido pela Macrogen®. O acesso inicial de identificação da sequência foi desenvolvido via BLASTN pesquisando em BOLD e NCBI. O experimento foi conduzido em delineamento inteiramente casualizado, com 2 grupos de tratamentos (controle e IA para cada grupo) e 125 repetições (25 inoculações X 5 colônias). A análise estatística de prevalência de fungos foi realizada utilizando o teste de Qui-quadrado (P<0,05), com o uso da proporção (frequência absoluta) de fungo simbionte e de fungos associados de A. sexdens rubropilosa pelo programa BioEstat 5.0 e gráficos pelo SigmaPlot 10.0. Também foi realizada uma análise em fatorial (2x3) com a variável porcentagem de GPF corada, onde o primeiro fator foram os IA`s (fipronil e sulfluramida) e o segundo as castas de operárias (jardineiras, generalistas e forrageiras), 19 fazendo-se comparações de médias com o teste de Tukey (P<0,05), após verificar distribuição normal dos dados pelo programa Sisvar 5.1. Uma terceira análise foi realizada para estimar os valores da porcentagem de GPF corada, conforme o IA aplicado e a casta de operária, aplicando-se regressão logística múltipla pelo programa BioEstat 5.0 (AYRES et al., 2007). Nesta análise foi possível avaliar duas variáveis independentes: largura da cabeça de operárias (mm) de acordo com Wilson (1980) (variável contínua) e a presença (assume-se valor 1) ou ausência (assume-se valor 0) de GPF corada, de acordo com a dissecação de operárias (variável binária), resultando em uma resposta dependente y que é a porcentagem de GPF corada de acordo com as condições das variáveis da equação para avaliar a dispersão do IA entre as operárias. 1.3 Resultados As frequências absolutas resultantes da identificação dos fungos (simbionte e associado) em colônias de A. sexdens rubropilosa, após aplicação de iscas contendo ingrediente ativo de ação rápida e retardada são apresentadas na Figura 1. No grupo de ação rápida, quando se compara o tratamento controle com o tratamento fipronil, tanto a proporção de fungo simbionte (χ2=0,180; P=0,6714), quanto à de fungos associados (χ2=0,720; P=0,3961) não foi significativa. Porém, quando se fez comparações das proporções (simbionte e associado) dentro destes tratamentos, nota-se diferença significativa, sendo o controle com valor de χ2=38,088 (P=0,0001) e fipronil com valor de χ2=52,488 (P=0,0001). Esta diferença foi devido à alta frequência que a proporção do fungo simbionte obteve em ambos os tratamentos deste grupo (Figura 1). Na análise do grupo de ação retardada o resultado pode ser considerado semelhante ao de ação rápida, pois ao se comparar a proporção de fungo simbionte é possível verificar diferença não significativa entre o tratamento controle e o tratamento sulfluramida (χ2=0,006; P=0,9372), ocorrendo o mesmo com a proporção de fungos associados (χ2=0,011; P=0,9156). Também ocorre diferença significativa dentro de 20 cada tratamento quando se comparam as proporções de fungos devido às altas frequências do fungo simbionte (Figura 1), sendo o controle com valor de χ2=10,952 (P=0,0009) e sulfluramida com valor de χ2=9,800 (P=0,0017). Frequência absoluta 0 20 40 60 80 100 Fu ng os a ss oc ia do s 0 20 40 60 80 100 Fu ng o si m bi on te Controle Fipronil Controle Sulfluramida A B Figura 1. Frequência absoluta de fungos após aplicação de ingredientes ativos em colônias de Atta sexdens rubropilosa. A: grupo de ação rápida; B: grupo de ação retardada. Entretanto, quando se faz uma análise apenas dos tratamentos com IA (fipronil e sulfluramida), verifica-se diferença significativa somente na proporção de fungos associados entre estes (χ2=7,896; P=0,0050), pois a quantidade de fungos encontrada nas colônias após aplicar iscas contendo o IA sulfluramida foi duas vezes maior do que o valor obtido quando se aplicou o IA fipronil (Figura 1). Isto pode ter ocorrido devido ao tempo de ação tóxica do IA e do tempo para extração do fragmento do jardim de fungo. As porcentagens da GPF corada em função dos IA`s e castas de operárias constam na Tabela 1. Verificou-se que o resultado do primeiro fator (IA`s) foi não 21 significativo (F=0,312; P=0,5818). Os IA`s testados coram a GPF de operárias de A. sexdens rubropilosa de forma semelhante. Por outro lado, as castas de operárias apresentaram médias da GPF corada estatisticamente diferentes (F=9,487; P=0,0009), demostrando que as forrageiras foram menos contaminadas que as jardineiras, estando a casta das generalistas em posição intermediária. Na mesma análise não houve diferença significativa quando a causa de variação foi a interação entre IA e casta de operária (F=1,430; P=0,2591), indicando que as castas podem ficar com a GPF corada com a aplicação de ambos IA`s. Tabela 1. Avaliação da porcentagem de glândula pós-faríngea (GPF) corada de acordo com o ingrediente ativo e casta de operárias de Atta sexdens rubropilosa. Ingrediente ativo GPF corada (%) (média ± EP)ns Sulfluramida 51,46 ± 6,62 Fipronil 47,53 ± 6,10 Casta GPF corada (%) (média ± EP)1 Jardineiras 62,8 ± 5,25 a Generalistas 57,7 ± 6,88 b Forrageiras 28,0 ± 6,10 c CV(%) 38,98 Média Geral 49,50 NsNão significativo pelo teste exato de Fisher (P<0,05). EP: erro padrão. 1Médias seguidas por letras distintas na coluna diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey (P<0,05). Com estes resultados, fica evidente que as operárias se contaminaram com ambos os IA`s. Entretanto, após a dissecação das mesmas é possível realizar uma estimativa da GPF corada ou não corada, aplicando-se uma regressão logística múltipla. Apesar de depender de outros fatores, como a atratividade de iscas e a capacidade do corante ser absorvido pela GPF. Esta estimativa torna-se muito importante, pois permite conhecer a dispersão do inseticida entre as operárias e assim, relacionar a contaminação com a GPF 22 corada, além de suas consequências para a sanidade do jardim de fungo de A. sexdens rubropilosa. Na Tabela 2 são apresentadas as porcentagens estimadas da GPF corada, após a aplicação de fipronil e sulfuramida. O tratamento controle foi fundamental na estimativa, pois permitiu criar uma variável binária para cada grupo de ação tóxica testado neste trabalho. As regressões foram estimadas para cada grupo de ação tóxica e a chance da GPF estar corada e com IA após a aplicação das iscas foi 2,2 para fipronil e 1,41 vezes para sulfluramida. Assim, as equações de regressão foram definidas da seguinte forma: a) ação rápida: Logit y=-0,9447+(0,4730x1)+(0,7897x2). b) ação retardada: Logit y=-0,6294+(0,3561x1)+(0,3444x2). Sendo: y=porcentagem de GPF corada; x1=largura da cabeça de operárias (WILSON, 1980); x2=presença (valor 1) ou ausência (valor 0). Com base nestas equações foi possível estimar a porcentagem de GPF corada (Tabela 2), permitindo prever qual casta de operária tem maior probabilidade de se contaminar. Em geral, as porcentagens ficaram entre 40 a 70% de GPF corada, sendo o controle com valores mais baixos em ambos os grupos testados devido à ausência dos IA lipossolúveis estudados como componente das iscas aplicadas. 23 Tabela 2. Porcentagem estimada da glândula pós-faríngea (GPF) corada de operárias, empregando-se regressão logística, após aplicação de iscas tóxicas em colônias de Atta sexdens rubropilosa. Ação tóxica Tratamento Largura de cabeça (mm)1 GPF (%) Controle 1,0 38,42 1,4 42,98 Rápida 2,2 52,40 Fipronil 1,0 57,88 1,4 62,41 2,2 70,80 Controle 1,0 43,21 1,4 46,76 Retardada 2,2 53,84 Sulfluramida 1,0 51,78 1,4 55,32 2,2 62,21 1Valores de largura de cabeça definidos de acordo com Wilson (1980). Mesmo comprovando a contaminação das operárias utilizadas neste trabalho pelos IA`s aplicados, não foi observado a prevalência de nenhuma espécie de fungo filamentoso que tenha relato na literatura de parasitismo em L. gongylophorus, pois na identificação por uso de técnica molecular dos fungos inoculados não foi constatada a ocorrência destas espécies em nenhum grupo estudado em todas as colônias tratadas (Tabela 3). 24 Ta be la 3 . F un go s a ss oc ia do s iso la do s d e co lô ni as d e A tt a se xd en s ru br op il os a ap ós a pl ic aç ão d e in gr ed ie nt es a tiv os . Es pé ci es d e fu ng os R áp id o R et ar da do To ta l Si m ila ri da de (% ) A ce ss o ao G en B an k C on tr ol e Fi pr on il C on tr ol e Su lfl ur am id a C yp ho m yr m ex m ue ll er i 10 0 JQ 61 76 21 .1 0 0 0 1 1 F us ar iu m s ol ar i 10 0 JN 23 52 24 .1 1 0 0 0 1 M ey er oz ym a gu il li er m on di i 10 0 JQ 42 53 56 .1 0 2 0 1 3 P re us si a po ly m or ph a 98 JX 07 69 84 .1 1 0 0 1 2 P en ic il li um c it ri nu m 10 0 H M 48 64 21 .1 1 0 0 1 2 T ri ch os po ro n ch ia re ll ii 96 G Q 33 80 74 .1 0 1 0 1 2 To ta l 3 3 0 5 11 25 1.4 Discussão A ocorrência de L. gongylophorus e de fungos associados em ambos os grupos de ação tóxica foram semelhantes, demonstrando que diferentes tempos de ação de IA não interferiram diretamente na composição da comunidade de fungos em A. sexdens rubropilosa nem tão pouco ocorreu sinergismo com fungos parasitas de seu simbionte (Figura 1). Entretanto, a presença de uma única espécie destes fungos parasitas de crescimento rápido pode ser suficiente para contaminar todo o jardim de fungo (RODRIGUES et al., 2005, 2008), pois foi possível observar esta situação no experimento prévio deste trabalho, onde identificou-se o crescimento de Escovopsis sp. em algumas placas de Petri com BDA. Apesar de não ter sido verificada esta situação neste trabalho, vale lembrar que já ocorreram observações de outros autores sobre a dominância de Escovopsis sp. em colônias de formigas-cortadeiras (CURRIE et al., 1999; NAGAMOTO et al., 2003; REYNOLDS; CURRIE, 2004). Currie et al. (2003) sugerem que esta espécie possui coevolução especializada com ninhos de formigas-cortadeiras e seu simbionte. Contudo, se a ocorrência deste fungo parasita fosse considerada como certa após a aplicação de sulfluramida (estresse químico), poderia haver alta probabilidade de ocorrer neste experimento, pois foram reproduzidas as mesmas condições de experimentação (mesma origem, idade e sistema de criação) em relação ao experimento de prévia, mas com maior número de colônias. Todavia, várias espécies de fungos filamentosos foram identificadas, exceto Escovopsis sp.. Rodrigues et al. (2008) ao escavarem colônias de Acromyrmex spp. adultas de campo relataram que outras espécies de fungos também podem surgir com maior frequência do que Escovopsis sp. e que podem causar doenças e parasitismo no fungo simbionte de formigas-cortadeiras. Carlos et al. (2011), por exemplo, identificaram maior prevalência do gênero Penicillium nos tratamentos controle (carbonato de cálcio) e IA (sulfluramida) em colônias de A. sexdens rubropilosa em laboratório. Desta forma, acredita-se que cada colônia possui uma comunidade microbiana específica de acordo com seu histórico de vida e com o ambiente que habitam (por exemplo, campo e laboratório), mas que se encontram sob controle. Esta sugestão também foi mencionada por Nagamoto (2003) e assemelha-se com a proposta de Rodrigues et al. (2005), 26 cujos autores verificaram que muitos fungos filamentosos podem co-existir em estado dormente dentro de ninhos de A. sexdens rubropilosa e que alguns deles parecem estar firmemente associados com este ambiente, mas que nem sempre são parasitas, podendo se alimentarem até do substrato vegetal da colônia (fungos fitopatogênicos). Assim, se dentro desta comunidade existir a presença de fungos parasitas de L. gongylophorus, provavelmente haverá um sinergismo com o IA aplicado, eliminando a possibilidade de recomposição da sanidade da cultura do fungo e, com isto, diminuir a chance de sobrevivência da colônia, apesar da contribuição do IA quando este causa alta mortalidade de diferentes castas de operárias, causando a desorganização da colônia. De acordo com Forti et al. (1998), após 3 a 4 dias de aplicação de sulfluramida, as formigas cessam as atividades de forrageamento e observa-se alta mortalidade de operárias menores, apresentando sinais de desorganização. Desta forma, Escovopsis seria capaz de rapidamente sobrepor o jardim de fungo simbionte devido à ausência de cuidados das operárias (CURRIE et al., 1999). Por outro lado, a prevalência do fungo simbionte nas placas inoculadas não significa sucesso da cultura de fungo, pois além de uma única espécie não simbionte parasítica ser capaz de reduzir as chances de sobrevivência, também existe o efeito inibitório dos cuidados das operárias com o jardim devido ao IA, reduzindo a probabilidade de a colônia sobreviver. Esta situação é semelhante à encontrada por Rodrigues et al. (2005), onde a presença de fungos filamentosos é muito comum após a redução de operárias; porém, estes autores encontraram algumas espécies parasitas do simbionte de A. sexdens rubropilosa em colônias de campo e de laboratório após aplicação de iscas com sulfluramida. Ao usar o corante lipossolúvel como traçador é possível afirmar que uma significativa quantidade de indivíduos da colônia foi contaminada (GPF corada), pois o corante lipossolúvel é rapidamente absorvido por estas glândulas, possibilitando a contaminação (FORTI et al., 2012) (Tabela 2), por isso os IA`s, que são lipossolúveis, apresentaram semelhanças na porcentagem de GPF corada. No entanto, ao matar as operárias não se garante a prevalência destas espécies parasitas, então quais condições são necessárias para que isto ocorra? São possíveis de serem empregadas em iscas formicidas? É uma condição difícil de prever porque não se 27 tem a certeza da composição do consócio microbiano como, por exemplo, os resultados deste trabalho, onde foi aplicado um estado de estresse em colônias de laboratório e não houve prevalência de espécies de fungos parasitas, apesar de já ter sido relatada por outros autores (RODRIGUES et al., 2005, 2008; CARLOS et al., 2011). Além disso, não é possível prever se as iscas formicidas com o uso da formulação atual conseguirão obter esta característica, pois seu enfoque tem se destinado a eliminar diretamente as operárias (inseticida) e, como suposta consequência a prevalência de fungos filamentosos parasitas, reduzindo as chances de recomposição, matando a colônia. Diferentemente dos relatos de Currie et al. (1999), que identificou o fungo Escovopsis sp. em Atta spp., não foi verificado a presença deste fungo, mesmo quando aplicado IA formicida nas colônias, mas corroboram com os trabalhos de RODRIGUES et al. (2005) e CARLOS et al. (2011), que encontraram prevalência de outros gêneros de fungos filamentosos em colônias de A. sexdens rubropilosa apesar das condições similares de estresse, indicando que as espécies de formigas-cortadeiras podem conter comunidades microbianas diferenciadas, contribuindo ou não com o controle após aplicação de iscas formicidas, mas sem considerá-la como ação sinérgica garantida. Em virtude do exposto, o que poderia ser investigado por pesquisadores que buscam descobrir formas eficientes de controle de formigas-cortadeiras, seria o desenvolvimento de um IA que possua não somente a característica química desejável para se tornar um bom formicida (FORTI et al., 1998), mas também para se tornar um bom fungicida de fungos fitopatogênicos para provocar a morte de parte do simbionte ao ser incorporado pelas operárias no jardim de fungo. Assim, ao manipular a isca as formigas se contaminam (ação formicida) e ao incorporá-la em seu jardim, contaminam o fungo simbionte (ação fungicida), reduzindo as chances de sobrevivência, independente da presença ou ausência de fungos parasitas. 1.5 Conclusão Os grupos de ação tóxica (IA rápido e retardado) apresentam o mesmo comportamento em relação às proporções de fungos, tanto para o simbionte como para os 28 associados. Houve prevalência do fungo L. gongylophorus entre os fungos isolados em placas após aplicação dos formicidas, demostrando que nem sempre se pode afirmar que ocorre sinergismo de IA formicida e fungos parasitas do simbionte de A. sexdens rubropilosa, pois fungos como Escovopsis sp., que se apresentam como parasitas especializados e envolvidos na comunidade microbiana de formigas-cortadeiras, não foram identificados nas colônias tratadas, sugerindo que sua ocorrência está relacionada com a micota do ambiente de cada colônia individualmente. 29 Capítulo II TOXICIDADE TÓPICA DE INGREDIENTES ATIVOS EM Atta sexdens rubropilosa (HYMENOPTERA: FORMICIDAE) 30 Resumo Formigas-cortadeiras são pragas quando prejudicam culturas cortando folhas, ramos e flores para oferecerem de substrato para seu fungo simbionte, provocando perdas significativas na produção. O principal ingrediente ativo para o controle dessas formigas é a sulfluramida, mas a restrição de seu uso já se encontra em discussão. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a toxicidade tópica de novos ingredientes ativos (IA`s) em operárias de A. sexdens rubropilosa na busca de promissores formicidas. Aplicaram-se quatro IA`s por ação tópica em diferentes doses: sulfluramida (125, 250, 375 e 500µg mL-1), indoxacarbe (12,5, 25, 37,5 e 50µg mL-1), diafentiuron (137,5, 275, 412,5 e 550µg mL-1) e imidaclopride (30, 60, 90 e 120µg mL-1). Determinou-se a DL50 e o TL50 pelo método de probit, a eficiência de controle pela fórmula de Abbott (1925) e o modelo de regressão pela análise de variância. A DL50 foi de 245,33µg mL-1 para sulfluramida, 7,29µg mL-1 para indoxacarbe, 42,53µg mL-1 para diafentiuron e 6,27µg mL-1 para imidaclopride. O TL50 foi maior nas doses de sulfluramida seguido do IA diafentiuron. A eficiência de controle foi maior no IA imidaclopride e, todos os IA`s apresentaram significância para o modelo linear de regressão. Os IA`s sulfluramida e diafentiuron apresentaram ação tópica retardada, mostrando-se promissores formicidas de ação retardada para iscas tóxicas potencializando o controle pela ação de contato, além da ingestão. Já os IA`s indoxacarbe e imidaclopride apresentaram ação tópica rápida, podendo ser empregados em formicidas que sejam formulados para atuarem especificamente por contato. Palavras-chave: formigas-cortadeiras, contato, isca, controle. 31 Chapter II TOPICAL TOXICITY OF ACTIVE INGREDIENTS IN Atta sexdens rubropilosa (HYMENOPTERA: FORMICIDAE) Summary Leaf-cutting ants are pests damage crops when cutting leaves, branches and flowers to provide a substrate for its symbiotic fungus, causing significant losses in production. The main active ingredient to control these ants is sulfluramid, but the restriction of its use is already in discussion. Therefore, we evaluated the topical toxicity of new active ingredients (AI's) in A. sexdens rubropilosa workers in search of promising formicidal. We applied four active ingredients for topical action in different doses: sulfluramid (125, 250, 375 and 500μg mL-1), indoxacarb (12.5, 25, 37.5 and 50μg mL-1), diafenthiuron (137, 5, 275, 412.5 and 550μg mL-1) and imidacloprid (30, 60, 90 and 120μg mL-1). We determined the LT50 and LD50 by the method of probit, the control efficiency using Abbott formula (1925) and regression model by analysis of variance. The LD50 was 245.33μg mL-1 to sulfluramid, 7.29μg mL-1 to indoxacarb, 42.53μg mL-1 for diafenthiuron and 6.27μg mL-1 to imidacloprid. The LT50 was higher in sulfluramid doses followed by AI diafenthiuron. The control efficiency was higher in AI imidacloprid and all AI`s showed significance for the linear regression model. The AI´s sulfluramid and diafenthiuron showed topical delayed action, showing up promising delayed action formicidals for toxic baits enhancing control by contact action, beyond ingestion. Since the AI`s indoxacarb and imidacloprid showed topical action fast and can be used in formicidal that are specifically formulated to work by contact. Keywords: leaf-cutting ants, contact, bait, control. 32 2.1 Introdução As formigas-cortadeiras são consideradas insetos-pragas de grande importância agrícola. Essas formigas utilizam diversas plantas para cultivar o fungo do qual se alimentam (MUELLER; GERARDO, 2002). Elas forrageiam flores e folhas frescas como substrato para o crescimento fúngico e transportam o material vegetal para câmaras de jardins de fungo, onde processam o material para incorporação nestes jardins (RODRIGUES et al., 2009). O método químico representa a principal forma de controle destas formigas, principalmente pelo uso de iscas tóxicas com o ingrediente ativo (IA) sulfluramida. Este inseticida pertence ao grupo químico das sulfonas fluoralifáticas (N-etil perfluoroctano sulfonamida), primeiramente descoberto em estudo no controle das formigas lava-pés Solenopsis invicta Buren (Hymenoptera: Formicidae) (VANDER MEER et al., 1985). Atualmente, a maioria das iscas tóxicas presentes no mercado é à base de sulfluramida (concentração de 0,3%), devido a sua eficiência de 90 a 100% no controle de várias espécies de formigas-cortadeiras como Atta laevigata (F. Smith, 1858) (Hymenoptera: Formicidae) (ZANUNCIO et al., 1992) e Atta sexdens rubropilosa Forel, 1908 (Hymenoptera: Formicidae) (ZANETTI et al., 2003c). Apesar da descoberta da sulfluramida como formicida, a busca e o desenvolvimento de novos IA`s continuam, pois este inseticida é considerado bioacumulativo e sua restrição no controle de pragas já está em discussão devido sua degradação em sulfonato perfluorooctano (PFOS em inglês) (WANG et al., 2009). Em virtude disto, a busca de novos 33 IA`s tóxicos para o controle de formigas-cortadeiras é intensa. Assim, alguns IA`s como diafentiuron, indoxacarbe e imidaclopride são inseticidas com ação tópica comprovada contra uma grande quantidade de insetos (WING et al., 2000; SUCHAIL et al., 2003; STANLEY et al., 2010), podendo se tornar promissores formicidas. A velocidade de ação do inseticida (tempo letal) para provocar toxicidade se torna um fator determinante na eficiência de controle, pois substratos oriundos do forrageamento podem ser rejeitados por operárias devido à percepção de inseticidas (CAMARGO et al., 2003). Porém, a contaminação de operárias pode ocorrer durante o processo de manipulação desses substratos para o crescimento fúngico, o que requer muitas horas (ANDRADE et al., 2002), favorecendo o IA que atue por contato e/ou ingestão. Assim, o objetivo deste estudo foi analisar a toxicidade tópica de IA`s após sua aplicação em operárias de A. sexdens rubropilosa, determinando a dose média letal, o tempo médio letal e a eficiência de controle, com a perspectiva de identificar IA`s como promissores formicidas. 2.2 Material e Métodos Coletaram-se operárias de colônias com 5 anos de idade da criação do Laboratório de Insetos Sociais-Praga (Lisp), localizado na FCA/UNESP, Botucatu, SP. Estas colônias são criadas em recipientes plásticos com volume de 5L, com camada de 1,5 cm de gesso na base para manutenção da umidade e com o fornecimento de substrato vegetal das espécies Ligustrum sp. (Oleaceae) e Acalypha sp. (Euphorbiaceae). Foram selecionadas 680 operárias com largura de cabeça maior do que 2 mm em duas colônias de A. sexdens rubropilosa para serem utilizadas no experimento. Foram aplicados quatro IA`s nas operárias em quatro diferentes doses, totalizando 16 tratamentos, além do tratamento controle em que foi aplicado somente o solvente a base de acetona. Nos tratamentos formulados com IA também foi adicionado acetona para facilitar a solubilização e a penetração do mesmo no corpo dos insetos após a aplicação. Para a determinação das diferentes doses foi realizado um experimento prévio baseado em informações de aplicação destes IA`s por ingestão, os quais já tinham sido 34 anteriormente realizados pelo Lisp. Os tratamentos foram assim delineados: sulfluramida nas doses de 125, 250, 375 e 500µg mL-1, indoxacarbe nas doses de 12,5, 25, 37,5 e 50µg mL-1, diafentiuron nas doses de 137,5, 275, 412,5 e 550µg mL-1 e imidaclopride nas doses de 30, 60, 90 e 120µg mL-1. A aplicação dos tratamentos foi realizada por contato no tegumento do inseto (pronoto) com o uso de uma micropipeta de volume variável e com o uso de ponteiras descartáveis, sendo aplicado o volume de 0,5µL por operária em cada tratamento. A aplicação no pronoto impede a possibilidade de ingestão do tratamento devido ao comportamento de limpeza em A. sexdens rubropilosa. Em seguida, cada operária foi acondicionada isoladamente em uma placa de Petri estéril (60 mm de diâmetro x 15 mm de altura) com fina camada de gesso umedecido de 3 mm na base da placa, onde permaneceu após aplicação do tratamento até a morte. Nestas placas também foi colocado um pequeno volume de fungo da colônia de origem das operárias de aproximadamente 30 mm3 para que pudessem se alimentar até o final do período de avaliação do experimento e, sempre que necessário, foram substituídas por outra de melhor qualidade. Antes de colocar as pelotas de fungo era feita uma retirada das operárias jardineiras que estivessem sobre estas pelotas, evitando a possibilidade de contaminação por ingestão do tratamento por parte da operária em estudo. As avaliações foram realizadas a cada 24 horas até os 21 dias após a aplicação. Dados da contagem diária de operárias mortas e da duração de dias para que ocorresse a mortalidade pela ação tóxica dos tratamentos foram submetidos à análise de probit (FINNEY, 1971) para determinação da dose média letal (DL50) e tempo médio letal (TL50) pelo programa SAS 9.2 (SAS INSTITUTE, 2002). Fez-se a correção de mortalidade de indivíduos que foram submetidos às doses pela fórmula de Abbott (1925), e o delineamento experimental foi inteiramente casualizado com 17 tratamentos e 40 repetições, sendo as parcelas constituídas de uma operária. Também foi realizada uma análise de regressão (teste F; P<0,05) entre a porcentagem de mortalidade e as diferentes doses/tratamento com IA (SAS INSTITUTE, 2002). Os gráficos de regressão foram elaborados com o auxílio do programa SigmaPlot 10.0. 35 2.3 Resultados Na análise de dose-resposta feita de acordo com o método de probit, os tratamentos aplicados apresentaram ajuste de qualidade entre os dados estimados e os dados observados pelo teste de Qui-quadrado de Pearson, mostrando que as mortalidades observadas pelo efeito dos tratamentos corresponderam dentro dos limites estimados pelo teste, evitando a exclusão de qualquer dose dentro dos tratamentos. Portanto, o modelo verificado foi considerado adequado para descrever as relações de dose-resposta em todos os tratamentos devido à ausência de significância nos valores obtidos pelo teste de qualidade de ajuste (Tabelas 1 e 2). A partir da mortalidade observada submetida à análise de probit é que se obtiveram os valores de DL50 (dose letal que afeta 50% da população) para os IAs aplicados nas operárias com suas diferentes doses (Tabela 1). Assim, a sulfluramida obteve maior valor de DL50, seguido do IA diafentiuron, do indoxacarbe e, por fim, do imidaclopride que obteve uma DL50 cerca de 40 vezes menor do que a sulfluramida. Tabela 1. Valores de DL50 de ingredientes ativos aplicados por contato em operárias de Atta sexdens rubropilosa. Ingrediente Ativo Inclinação ± 1EP 1DL50 (µg mL-1) 1IC95% χ2* P Sulfluramida 2,1704 ± 1,08 245,33 7,07 – 594,69 0,0845 0,9586 Indoxacarbe 1,7539 ± 0,77 7,29 1,77 – 11,61 0,0989 0,9518 Diafentiuron 1,6000 ± 1,21 42,53 1,06 – 117,29 0,1221 0,9408 Imidaclopride 1,2289 ± 1,21 6,27 2,31 – 18,11 2,1062 0,3489 1EP: erro padrão; DL50: dose média letal; IC95%: intervalo de confiança com 95% de probabilidade. *Teste de Qui-quadrado de Pearson (P<0,05). Para determinar os valores de TL50 (tempo letal que afeta 50% da população) foi utilizada a mortalidade acumulada diária, sendo submetida à análise de probit (Tabela 2), onde o tratamento controle ficou com 36,70 dias, representando maior TL50. Em 36 seguida, o IA sulfluramida na dose mais baixa ou inferior (125µg mL-1) foi o tratamento que apresentou o maior valor de TL50 com 29,43 dias e na dose mais alta ou superior (500µg mL-1) o menor valor: 17,36 dias. Depois, o diafentiuron com 17,45 dias na dose inferior (137,5µg mL-1) e 10,67 dias na dose superior (550µg mL-1). Logo após, o indoxacarbe com 17,06 dias na dose inferior (12,5µg mL-1) e 8,58 dias na dose superior (50µg mL-1). Por fim, o imidaclopride com os menores valores de TL50, onde na dose inferior (30µg mL-1) obteve-se o valor de 10,60 dias e na dose superior (120µg mL-1), 5,07 dias. Tabela 2. Valores de TL50 de ingredientes ativos aplicados por contato em operárias de Atta sexdens rubropilosa. Ingrediente Ativo Dose (µg mL-1) Inclinação ± EP TL50 (dias) IC95% χ2* P Controle 0 4,9970 ± 0,64 36,47 28,75 – 57,59 2,78 1,0000 Sulfluramida 125 3,0817 ± 0,34 29,43 22,99 – 45,36 29,54 0,0579 250 4,2813 ± 0,48 25,82 21,70 – 34,58 27,57 0,0920 375 2,9662 ± 0,31 25,31 20,57 – 35,39 27,74 0,0884 500 3,3166 ± 0,27 17,36 15,75 – 19,62 11,21 0,9165 Indoxacarbe 12,5 5,3247 ± 0,43 17,06 16,02 – 18,39 3,87 0,9999 25 3,7719 ± 0,27 9,86 9,23 – 10,49 6,23 0,9973 37,5 3,0010 ± 0,31 9,11 8,12 – 10,02 19,71 0,1026 50 3,6558 ± 0,25 8,58 8,01 – 9,13 16,92 0,5947 Diafentiuron 137,5 6,4665 ± 0,54 17,45 16,52 – 18,63 3,56 1,0000 275 5,8948 ± 0,48 17,10 16,14 – 18,32 9,05 0,9725 412,5 6,4820 ± 0,47 14,10 13,48 – 14,77 6,23 0,9973 550 3,1400 ± 0,23 10,67 9,91 – 11,49 16,20 0,6437 Imidaclopride 30 2,7567 ± 0,21 10,60 9,76 – 11,51 21,82 0,2929 60 2,5072 ± 0,24 10,58 9,40 – 11,91 28,76 0,0698 90 2,5626 ± 0,24 8,58 7,57 – 9,50 30,09 0,0506 120 2,4534 ± 0,19 5,07 4,61 – 5,52 22,44 0,2624 EP: erro padrão; TL50: tempo médio letal; IC95%: intervalo de confiança com 95% de probabilidade. *Teste de Qui-quadrado de Pearson (P<0,05). 37 Após 21 dias de aplicação os dados de porcentagem de mortalidade foram submetidos para análise da eficiência de tratamentos com IA pela fórmula de Abbott (1925) (Tabela 3). Apenas os tratamentos com o IA indoxacarbe na dose de 50µg mL-1 e imidaclopride nas doses de 90 e 120µg mL-1 obtiveram eficiência de controle de operárias acima de 90% após o período de avaliação. Vale ressaltar que estes valores de eficiência são baseados na porcentagem de mortalidade do tratamento controle que foi de 12,50%, sendo dependente da mortalidade deste tratamento. Tabela 3. Eficiência de controle pela aplicação de ingredientes ativos em operárias de Atta sexdens rubropilosa após 21 dias de aplicação por contato. Ingrediente Ativo Dose (µg mL-1) Mortalidade (%)* Sulfluramida 125 27,58 250 31,03 375 37,93 500 48,27 Indoxacarbe 12,5 55,17 25 82,75 37,5 89,65 50 93,10 Diafentiuron 137,5 58,62 275 68,96 412,5 75,82 550 82,75 Imidaclopride 30 82,75 60 86,20 90 93,10 120 100,00 *Valores obtidos pela fórmula de Abbott (1925). 38 Pela análise de variância de regressão, o modelo linear apresentou-se significativo para todos os IAs estudados, de acordo com o teste F (P<0,05), sendo o IA diafentiuron com maior valor de F (F=176,33; P=0,0056), seguido do imidaclopride (F=96,33; P=0,0102), da sulfluramida (F=40,00; P=0,0241) e do indoxacarbe (F=21,73; P=0,0431). As equações de regressão e a medição de proporção de variabilidade (R2) para o modelo linear encontram-se na Figura 1. M or ta lid ad e (% ) 0 20 40 60 80 100 Dose (μg mL-1) 50 100 0 20 40 60 80 100 y = 61,25+0,74000x R2 = 0,9157 y = 82,50+0,14167x R2 = 0,9797 y = 41,25+0,04000x R2 = 0,9524 150 300 450 y = 65,00+0,04182x R2 = 0,9888 Indoxacarbe Imidaclopride Sulfluramida Diafentiuron Figura 1. Estimativas de mortalidade (%) de operárias de Atta sexdens rubropilosa em função de ingredientes ativos e diferentes níveis de doses estudadas. 39 2.4 Discussão A toxicidade tópica avaliada pela DL50 apresenta a sulfluramida com o valor mais alto, indicando que este IA pode ter de baixa a média toxicidade por esta via de aplicação em operárias de A. sexdens rubropilosa. Este indicativo pode ser reforçado pela observação da Tabela 3, onde a eficiência de controle de sulfluramida foi abaixo de 50% da mortalidade de operárias. Apesar dessa baixa eficiência de controle por contato com o intervalo de doses em que as operárias foram submetidas, a sulfluramida ainda é o IA mais utilizado em iscas tóxicas para formigas-cortadeiras, com eficiência de controle satisfatória quando utilizado por ingestão (GROSMAN et al., 2002; FORTI et al., 2007). Além disso, de acordo com estudo realizado por Su et al. (1994) a proporção de toxicidade oral de sulfluramida é aproximadamente 1,5 vezes maior do que a toxicidade tópica quando testado em cupins da família Rhinotermitidae, o que poderia ocorrer em espécies de Formicidae. Isto acontece porque a sulfluramida é considerada um inseticida que age na porção de absorção do aparelho digestório (mesêntero), sendo absorvido mais eficazmente por ingestão do que pela penetração no tegumento (VANDER MEER et al., 1985). Também pode ser possível que algumas espécies da mesma família de insetos apresentem maior suscetibilidade à sulfluramida do que outras, pois Su e Scheffrahn (1991) estimaram a toxicidade tópica com valores distintos de DL50 para duas espécies de cupins da família Rhinotermitidae. Os valores de TL50 de sulfluramida também podem ser considerados elevados nas três primeiras doses, superando o período de avaliação de 21 dias que é considerado suficiente para provocar valores de mortalidade de operárias maiores que 90% pelo efeito de IA`s. Entretanto, na análise de regressão o IA apresentou significância para o modelo linear, ou seja, na medida em que aumentamos a variável independente (neste caso, a dose) aumenta-se a resposta de y (variável dependente). Isto possibilitaria fazer avaliações com o aumento da dosagem e assim, alcançar altas mortalidades pela aplicação de sulfluramida, no entanto, devem ser avaliados o custo-benefício e fatores ambientais como a bioacumulação. Analisando-se a resposta do diafentiuron quando aplicado topicamente, pode-se dizer que o mesmo se apresentou como o IA tóxico mais promissor entre os que foram 40 estudados visando o controle de A. sexdens rubropilosa. De acordo com estudo realizado por Nagamoto et al. (2004) com operárias desta espécie e diferentes IA`s aplicados por ingestão, o diafentiuron se apresentou com características inseticidas mais promissoras para se tornar um bom formicida do que os demais testados, pois se apresentou mais tóxico (baixa dose letal) quando aplicado por via oral do que o inseticida padrão (sulfluramida) (DL50 de diafentiuron foi 5,76 vezes menor), o qual já é recomendado para o controle de algumas espécies de formigas-cortadeiras. O diafentiuron vem sendo reportado como inseticida e acaricida para uma série de grupos de insetos (KEUM et al., 2002; DEKEYSER, 2005; STANLEY et al., 2010), atuando principalmente como inibidor da respiração mitocondrial pela produção de carbodiimida (RUDER et al., 1991). O modo de ação de carbodiimida é semelhante ao produzido pela sulfluramida por atuarem na respiração celular, tornando-os inseticidas de ação retardada, sendo esta semelhança uma característica interessante para planejar o seu emprego no controle de formigas-cortadeiras. Contudo, somente no nível superior de dose aplicada de diafentiuron (550µg mL-1), é que se obteve eficiência de controle de operárias de 82,75%. O tempo letal da aplicação de 550µg mL-1 de diafentiuron foi de aproximadamente 11 dias, os quais podem ser suficientes para provocar a contaminação pelo comportamento de limpeza (self-grooming e allogrooming) pelas operárias de A. sexdens rubropilosa. Além disso, o diafentiuron necessita ser convertido para o correspondente carbodiimida, que é o provável responsável por esta atividade bioquímica sobre insetos, sendo esta conversão dependente principalmente de um processo fotoquímico (KAYSER; EILINGER, 2001; KEUM et al., 2002). Neste experimento o diafentiuron não foi submetido a nenhum processo que favorecesse tal conversão, o que poderia aumentar a sua eficiência de controle. Por outro lado estão os IA`s testados que obtiveram valores de DL50 inferiores aos da sulfluramida e diafentiuron. Dentre estes, estão o indoxacarbe e o imidaclopride, onde o primeiro apresentou valor de DL50 acima do estimado para o imidaclopride. Ambos atingiram os menores valores de TL50 demonstrando serem formicidas muito tóxicos por ação tópica e com eficiência de controle acima de 90% nas últimas dosagens estudadas, além da significância para o modelo linear de regressão. 41 Indoxacarbe tem demonstrado ser um potente inseticida bloqueador de canais de sódio para larvas (Lepidoptera), insetos raspadores e sugadores em baixa DL50 por ação tópica e oral, sendo altamente ativo e de largo espectro (WING et al., 2000). Barr (2003) aplicou iscas com indoxacarbe em trilhas de campo para o controle de S. invicta e relatou a ação rápida deste IA quando adicionado em formulações para isca, sugerindo-o como um inseticida alternativo de contato. Já Chong e Lee (2009) obtiveram mortalidade acima de 96% quando utilizada isca líquida de cana-de-açúcar com 0,05% de indoxacarbe contra populações de campo de Anoplolepis gracilipes (Fr. Smith) (Hymenoptera: Formicidae). O imidaclopride é um inseticida pertencente ao grupo dos neonicotinoides atuando em receptores pós-sinápticos nicotínicos de acetilcolina, podendo reduzir a sobrevivência de insetos em poucas horas por contato devido à aplicação direta ou pelo contato com algum resíduo desse inseticida (CLOYD; BETHKE, 2011). Por exemplo, em abelhas, imidaclopride exibe alta toxicidade, sendo que em até 48 horas, a DL50 oral e de contato pode ser de 5 e 25ng por abelha, respectivamente (SUCHAIL et al., 2003). As características apresentadas neste estudo sobre o indoxacarbe e o imidaclopride os tornam potenciais formicidas de ação rápida, permitindo sua utilização em algumas formulações para formicidas de contato (por exemplo, pó seco), mas que ofereceriam dificuldades de controle se estes IA`s fossem empregados em iscas tóxicas, pois não apresentaram as características desejáveis para tal. Estudos que apresentem avaliações mais rigorosas e mais específicas, principalmente quanto a formulações de formicidas com estes IA`s devem ser realizados antes de serem recomendados, pois dependendo do resultado destas avaliações, os IA`s podem apresentar de forma mais nítida o seu potencial como formicida para o controle de formigas-cortadeiras. 2.5 Conclusão A toxicidade da sulfluramida pode ser considerada baixa quando comparada com os demais IA testados, pois apresentou alta DL50 e alto TL50, produzindo um efeito muito retardado para o controle por ação de contato. Entretanto, o ingrediente diafentiuron se apresentou promissor diante dos dados de dose média letal e tempo médio 42 letal, podendo ser mais eficiente se permitido algum processo de bioativação de seu metabólito carbodiimida (inseticida eficaz) e assim, ser planejado para uso em iscas formicidas. Já os IA`s indoxacarbe e imidaclopride apresentaram baixa DL50 e baixo TL50, principalmente nas doses mais elevadas, mas apresentaram eficiência de controle acima de 90%, tornando-os promissores formicidas por ação de contato para operárias de A. sexdens rubropilosa. 43 Capítulo III MORTALIDADE DE OPERÁRIAS DE Atta sexdens rubropilosa (HYMENOPTERA: FORMICIDAE) APÓS PROCESSO DE FOTÓLISE DE DIAFENTIURON 44 Resumo Diafentiuron é um pré-inseticida/acaricida que pode ser transformado em carbodiimida pelo processo de fotólise em luz ultravioleta, catalisando-se com água. Com a fotólise, diafentiuron pode se tornar um potente formicida, podendo ser oferecido em isca pastosa. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a mortalidade de operárias de Atta sexdens rubropilosa após a fotólise de diafentiuron. Operárias oriundas de colônias de laboratório foram utilizadas para oferecimento dos tratamentos (iscas) contendo os ingredientes ativos. Os tratamentos foram: 1- controle; 2- sulfluramida [0,3%]; 3- diafentiuron (sem exposição à luz UV); 4- diafentiuron (2h de luz UV); 5- diafentiuron (4h de luz UV) e 6- diafentiuron (6h de luz UV). O experimento foi conduzido em delineamento inteiramente casualizado com 6 tratamentos e 4 repetições. Aplicou-se o teste de Kruskal-Wallis (P<0,05), com comparações de postos médios pelo teste de Student-Newman-Keuls (P<0,05), além da estimativa de TL50 (método probit). Sulfluramida e diafentiuron (sem luz UV) ficaram na classe III (compostos de ação retardada). Tratamentos com diafentiuron que receberam luz UV se enquadraram na classe II (compostos de ação rápida). Houve semelhança entre os tratamentos com ingrediente ativo na porcentagem de mortalidade de operária. Somente operárias do tratamento controle não apresentaram sintomas de intoxicação. A estimativa dos valores de TL50 mostra que diafentiuron após fotólise em luz UV apresenta toxidez para operárias de A. sexdens rubropilosa. Palavras-chave: formigas-cortadeiras, ingestão, mortalidade, controle. 45 Chapter III MORTALITY OF Atta sexdens rubropilosa WORKERS (HYMENOPTERA: FORMICIDAE) AFTER PHOTOLYSIS PROCESS OF DIAFENTHIURON Summary Diafenthiuron is a pre-insecticide/acaricide which can be transformed in carbodiimide by photolysis in UV light, catalyzing with water. With photolysis, diafenthiuron can become a potent formicidal and can be offered in pasty bait. The objective of this study was to evaluate the mortality of Atta sexdens rubropilosa workers after photolysis of diafenthiuron. Workers from the laboratory colonies were used for offering treatments (baits) containing the active ingredients. The treatments were: 1 - control, 2 - sulfluramid [0.3%]; 3 - diafenthiuron (without exposure to UV light) 4 - diafenthiuron (2h UV light) 5 - diafenthiuron (4h UV light) and 6 - diafenthiuron (6h UV light). The experiment was conducted in a completely randomized design with 6 treatments and 4 replications. We applied the Kruskal-Wallis test (P<0.05), with comparisons of means made by the Student-Newman- Keuls test (P<0.05), besides the estimate of LT50 (probit method). Sulfluramid and diafenthiuron (without UV light) were in class III (delayed action compounds). Treatments with diafenthiuron receiving UV light fell into class II (fast acting compounds). There were similar between treatments with the active ingredient in the mortality of workers. Only workers of the control treatment showed no symptoms of intoxication. The estimation of LT50 shows that diafenthiuron after photolysis in UV light shows toxicity to workers of A. sexdens rubropilosa. Keywords: leaf-cutting ants, ingestion, mortality, control. 46 3.1 Introdução As formigas-cortadeiras (Formicidae: Myrmicinae: Attini) são importantes pragas agrícolas da região Neotropical. Entre estas, encontra-se a espécie Atta sexdens rubropilosa Forel, 1908 que é popularmente conhecida como saúva-limão (BOARETTO; FORTI, 1997). Os danos que esta espécie causa as plantações podem ser reduzidos com o uso de iscas contendo um ingrediente ativo (IA), conferindo-lhe ação tóxica (ZANETTI et al., 2004). Entretanto, a busca por novos IA`s que atuem por ingestão e que possuam ação retardada para permitir uma boa dispersão do formicida sobre a colônia é considerada de difícil sucesso, devido ao comportamento destes insetos (FORTI et al., 1998; CAMARGO et al., 2003). Por outro lado, diafentiuron pode ser relativamente considerado um dos mais recentes IA`s devido a sua reconhecida performance em produtos com função inseticida e acaricida (RAJABASKAR; REGUPATHY, 2008). É ativo contra várias espécies de insetos sugadores e alguns lepidópteros-praga, além de alguns ácaros de importância agrícola (PETROSKE; CASIDA, 1995). Por ser do grupo químico tiourea, apresenta-se com um único mecanismo de ação, que é a inibição da respiração celular mitocondrial em insetos, podendo ser ou não seletivo para algumas espécies, provocando toxicidade tópica ou por via oral (RUDER et al., 1991). Diafentiuron é um pré-inseticida que precisa ser submetido ao processo de fotólise para ser metabolizado. O principal metabólito resultante deste 47 processo é a carbodiimida (59% é transformado em até 24 horas) que pode se degradar mais lentamente que seu precursor, tornando-se um potente inseticida. A fotólise pode ser direta ou indireta, podendo ocorrer naturalmente em condições de campo. A maior absorção de luz pelo inseticida ocorre próximo do ultravioleta ou da faixa de luz visível, podendo ser decomposto diretamente por luz solar. Este processo ainda pode ser catalisado com adição de água (KEUM et al., 2002). As condições em que diafentiuron precisa ser submetido podem ser relevantes no emprego de IA`s em formicidas granulados, pois seu uso está ligado às atividades de campo, onde as iscas são expostas às diversas condições do tempo, podendo ou não favorecer a formulação e com isto permitir que sua ação como inseticida seja efetiva no controle de formigas-cortadeiras. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a mortalidade de operárias de A. sexdens rubropilosa após o diafentiuron ser submetido ao processo de fotólise e oferecido na forma de isca pastosa. 3.2 Material e Métodos Colônias da criação do Laboratório de Insetos Sociais-Praga (Lisp), localizado na FCA/UNESP, Botucatu, SP, foram mantidas em recipientes plásticos com volume de 5L e com camada de 1,5 cm de gesso na parte inferior para manter a umidade, fornecendo-se substrato vegetal fresco das espécies Ligustrum sp. (Oleaceae) e Acalypha sp. (Euphorbiaceae). Destas, foram retirados os fragmentos fúngicos contendo operárias menores (jardineiras), como também as operárias com largura de cabeça maior que 2 mm. O experimento foi conduzido nas condições climáticas do laboratório (24º C ± 2 e umidade relativa de 70% ± 5). Formularam-se iscas de consistência pastosa, con