UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Universidade Estadual Paulista “Julio de Mesquita Filho” ANGELA MARIA ARENAS VELÁSQUEZ Do screening ao mecanismo de ação, uma contribuição para a descoberta de ciclopaladados bioativos: a atividade leishmanicida de CP2 e seu efeito inibitório frente à DNA topoisomerase 1B de Leishmania A R A R A Q U A R A - S P 2 0 1 7 http://br.geocities.com/coralunesp/logo_unesp_assinatura.jpg UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” ANGELA MARIA ARENAS VELÁSQUEZ Do screening ao mecanismo de ação, uma contribuição para a descoberta de ciclopaladados bioativos: a atividade leishmanicida de CP2 e seu efeito inibitório frente à DNA topoisomerase 1B de Leishmania A R A R A Q U A R A - S P 2 0 1 7 Tese apresentada ao Instituto de Química de Araraquara, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de Araraquara, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Biotecnologia. Orientadora: Profa. Dra. Marcia A. S. Graminha http://br.geocities.com/coralunesp/logo_unesp_assinatura.jpg UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” http://br.geocities.com/coralunesp/logo_unesp_assinatura.jpg UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” http://br.geocities.com/coralunesp/logo_unesp_assinatura.jpg UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Dados curriculares ANGELA MARIA ARENAS VELÁSQUEZ http://lattes.cnpq.br/6388632764860377 Formação acadêmica/titulação 2013 a atualidade Doutorado em Biotecnologia (Conceito CAPES 5). Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, Brasil. Bolsista: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, CAPES, Brasil. Orientadora: Marcia A. S. Graminha. 2011 - 2013 Mestrado em Biotecnologia. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, Brasil. Título: Avaliação do potencial tripanocida de benzil diaminas, diaminas de ferroceno e derivados de 1,4-naftoquinonas em cepas de Trypanosoma brucei brucei. Ano de Obtenção: 2013. Orientadora: Regina Maria Barretto Cicarelli. Bolsista: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, CAPES, Brasil. 2000 - 2005 Graduação em Química. Universidad del Valle, UNIVALLE, Cali, Colômbia. Título: Clonación y Localización de una Beta Anhidrasa Carbónica a Partir del Vector Africano de Malaria (Anophles gambiae) y del Vector Suramericano de Fiebre Amarilla (Stegomyia aegypti). Orientador: Maria del Pilar Corena; Co-orientador: Adalberto Sanchez. Formação Complementar 2014 - 2014 IX Curso de Inverno: Temas avançados de Bioquímica. (Carga horária: 80h). Universidade de São Paulo, USP, Brasil. Search for targets and drug discovery in trypanoso. (Carga horária: 40h). Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, Brasil. Pré-Módulo 2: A importância de primers bem desenha. (Carga horária: 8h). Life Tecnologies, LIFE TEC, Brasil. http://br.geocities.com/coralunesp/logo_unesp_assinatura.jpg http://lattes.cnpq.br/6388632764860377 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” 2013 - 2013 Medicinal Inorganic Chemistry with Emphasis on Zin. (Carga horária: 4h). 5th Symposium on Biological Chemistry, Health and Medicine, SBC, Brasil. Search for new drug targets in Trypanosomatides.... (Carga horária: 4h). Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, Brasil. Fundamentos da PCR Quantitativa em Tempo Real. (Carga horária: 20h). Life Tecnologies, LIFE TEC, Brasil. 2012 - 2012 Citometria de Fluxo. (Carga horária: 8h). Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, Brasil. Assistência Farmacêutica. (Carga horária: 2h). Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, Brasil. Treinamento da Linha Health Care. (Carga horária: 1h). Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, Brasil. Atuação do Farmacêutico na Indústria de Bens de Co. (Carga horária: 2h). Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, Brasil. Tópicos Avançados em Biofarmacia e Farmacocinética. (Carga horária: 40h). Red biofarma, REDBIOFARMA, Espanha. 2011 - 2011 AVANCES EN GENÉTICA FORENSE. (Carga horária: 16h). Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, Brasil. ANÁLISE FORENSE. (Carga horária: 12h). Universidade de São Paulo, USP, Brasil. Atuação Profissional 2015 – 2015 Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, Brasil. Vínculo: Bolsista, Enquadramento Funcional: Assistente de Docencia: Parasitologia Clinica aplicada a farmácia, Carga horária: 4 Vínculo: Bolsista, Enquadramento Funcional: Assistente de Docencia: Parasitologia Clinica, Carga horária: 4 Vínculo: Bolsista, Enquadramento Funcional: Assistência de Docência: Parasitologia, Carga horária: 4 2014 – 2014 Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, Brasil. http://br.geocities.com/coralunesp/logo_unesp_assinatura.jpg UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Vínculo: Bolsista, Enquadramento Funcional: Assistência de Docência: Biotecnologia Farmacêutica, Carga horária: 4 Vínculo: pesquisadora invitada, Enquadramento Funcional: Aula de PCR em tempo real para alunos do programa de pós-graduação em Biotecnología, Carga horária: 4 2008 – 2011 PLASTIC FILMS INTERNACIONAL, PLAFILM, Colômbia. Vínculo: Chefe de Produção e Qualidade, Carga horária: 50, Regime: Dedicação exclusiva. 2005 – 2006 LICEO JUAN PABLO II, JUAN PABLO II, Colômbia. Vínculo: PROFESOR, Enquadramento Funcional: PROFESSOR AREAS QUIMICA E BIOLOGIA, Carga horária: 48, Regime: Dedicação exclusiva. 2004 – 2004 Universidad Del Valle, UNIVALLE, Colômbia. Vínculo: Bolsista, Enquadramento Funcional: Assistência de Docência: Laboratório de Bioquímica, Carga horária: 4 Revisor de periódico 2014 - Atual Periódico: Revista de Ciências Farmacêuticas Básica e Aplicada 2015 - Atual Periódico: ACS Medicinal Chemistry Letters Idiomas Espanhol: Compreende Bem, Fala Bem, Lê Bem, Escreve Bem. Inglês: Compreende Razoavelmente, Fala Razoavelmente, Lê Razoavelmente, Escreve Razoavelmente. Português: Compreende Bem, Fala Bem, Lê Bem, Escreve Bem. Italiano: Compreende Pouco, Fala Pouco, Lê Pouco, Escreve Pouco. Produções 1. VELÁSQUEZ, ANGELA M. A.; SOUZA, RODRIGO A. DE; PASSALACQUA, THAÍS G.; RIBEIRO, ALINE R.; SCONTRI, MATEUS; CHIN, CHUNG M.; ALMEIDA, LETICIA DE; CISTIA, MAYARA L. DEL; ROSA, JOÃO A. DA; MAURO, ANTONIO E.; GRAMINHA, MARCIA A. S.. Antiprotozoal Activity of the Cyclopalladated Complexes Against Leishmania amazonensis and Trypanosoma cruzi. Journal of the Brazilian Chemical Society, v. 27, n. 6, p. 1032-1038, 2016. 2. PASSALACQUA, THAIS GABAN; DUTRA, LUIZ ANTONIO; DE ALMEIDA, LETÍCIA; VELÁSQUEZ, ANGELA MARIA ARENAS; TORRES, FABIO AURELIO http://br.geocities.com/coralunesp/logo_unesp_assinatura.jpg http://lattes.cnpq.br/6388632764860377 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” ESTEVES; YAMASAKI, PAULO RENATO; DOS SANTOS, MARIANA BASTOS; REGASINI, LUIS OCTAVIO; MICHELS, PAUL A.M.; BOLZANI, VANDERLAN DA SILVA; GRAMINHA, MARCIA A. S. Synthesis and evaluation of novel prenylated chalcone derivatives as anti-leishmanial and anti-trypanosomal compounds. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, v. 25, p. 3342-3345, 2015. 3. VELÁSQUEZ, ANGELA MARIA ARENAS; FRANCISCO, ACÁCIO IVO; KOHATSU, ANDRÉA AKIKO NAKAIMA; SILVA, FLAVIA ALVES DE JESUS; RODRIGUES, DANILO FERNANDO; TEIXEIRA, RAFAELA GOMES DA SILVA; CHIARI, BRUNA GALDORFINI ; ALMEIDA, MARIA GABRIELA JOSÉ DE; ISAAC, VERA LUCIA BORGES; VARGAS, MARIA D.; CICARELLI, REGINA MARIA BARRETTO. Synthesis and tripanocidal activity of ferrocenyl and benzyl diamines against Trypanosoma brucei and Trypanosoma cruzi. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, v. 24, p. 1707-1710, 2014. 4. TORRES, FÁBIO A.E.; PASSALACQUA, THAIS G.; VELÁSQUEZ, ANGELA M.A.; DE SOUZA, RODRIGO A.; COLEPICOLO, PIO; GRAMINHA, MÁRCIA A.S.. New drugs with antiprotozoal activity from marine algae: a review. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 24, p. 265-276, 2014. 5. RODRIGUES, DANILO FERNANDO; ARENAS VELÁSQUEZ, ANGELA MARÍA; CAVALEIRO, CARLOS; SALGUEIRO, LÍGIA; MARTINS, GILMÁRCIO ZIMMERMANN; MAGALHÃES, NATHÁLIA OLIVEIRA; MARTINS, MARIA BERNADETE GONÇALVES; CICARELLI, REGINA MARIA BARRETTO; MOREIRA, RAQUEL REGINA DUARTE. Chemical Composition and Trypanocidal Activity of the Essential Oils from Hedychium coronarium J. Koenig (Zingiberaceae). ISRN Infectious Diseases, v. 2013, p. 1-6, 2013. Apresentações de Trabalho 1. VELÁSQUEZ, A. M. A.; SOUZA, R. A.; RIMOLDI, A. R.; Da ROSA, J. A.; MAURO, A. E.; COLEPICOLO, P.; GRAMINHA, MÁRCIA A.S.. Antiprotozoal activity in vitro of cyclopalladated complex against Leishmania amazonensis and Trypanosoma cruzi. 2015. (Apresentação de Trabalho/Simpósio). 2. VELÁSQUEZ, A. M. A.; DE SOUZA, RODRIGO A.; RIMOLDI, A. R.; Da ROSA, J. A.; MAURO, A. E.; GRAMINHA, MÁRCIA A. S. In vitro and in vivo leishmanicidal activity of a cyclopalladated compound against Leishmania amazonensis. 2015. (Apresentação de Trabalho/Outra). 3. ARENAS VELÁSQUEZ, A. M.; RIBEIRO, W. C.; SANTORO, M.; PASSALACQUA, T. G. ; RIMOLDI, A. R.; DEL CISTIA, M. L.; MAURO, A. E. ; DESIDERI, A.; GRAMINHA, M. A. S.. Leishmanicidal activity of a binuclear cyclopalladated complex against Leishmania amazonensis: In vitro and In vivo analyses and potential Topoisomerase IB Inhibitor. 2015. (Apresentação de Trabalho/Outra). http://br.geocities.com/coralunesp/logo_unesp_assinatura.jpg http://lattes.cnpq.br/4484083685251673 http://lattes.cnpq.br/6388632764860377 http://lattes.cnpq.br/3127194798912939 http://lattes.cnpq.br/9393320329131576 http://lattes.cnpq.br/8082819976962560 http://lattes.cnpq.br/7579189327299923 http://lattes.cnpq.br/4842462513285606 http://lattes.cnpq.br/4842462513285606 http://lattes.cnpq.br/2689400605282903 http://lattes.cnpq.br/9703848266137282 http://lattes.cnpq.br/9703848266137282 http://lattes.cnpq.br/9346462712672265 http://lattes.cnpq.br/9393320329131576 http://lattes.cnpq.br/8893056879192566 http://lattes.cnpq.br/8893056879192566 http://lattes.cnpq.br/9703848266137282 http://lattes.cnpq.br/6388632764860377 http://lattes.cnpq.br/6388632764860377 http://lattes.cnpq.br/6388632764860377 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” 4. VELÁSQUEZ, ANGELA MARIA ARENAS; SOUZA, R. A.; RIMOLDI, A. R.; TORRES, F. A. E.; Da ROSA, J. A.; MAURO, A. E.; COLEPICOLO, P.; GRAMINHA, MÁRCIA A.S.. Evaluation of Leishmanicidal and Trypanocidal activity of cyclopalladated complex. 2014. (Apresentação de Trabalho/Congresso). 5. PASSALACQUA, T. G.; ALMEIDA, L.; ARENAS VELÁSQUEZ, ANGELA MARÍA; DE SOUZA, RODRIGO A.; TORRES, F. A. E.; GRAMINHA, M. Evaluation antileishmanical activity and inhibitory effect of palladium compounds on DNA topoisomerase (LiTOP1B) of Leishmania infantum. 2014. (Apresentação de Trabalho/Outra). 6. VELÁSQUEZ, ANGELA MARIA ARENAS; DE SOUZA, RODRIGO A.; MARTINEZ, I.; CICARELLI, R. M. B.; MAURO, A. E.; GRAMINHA, MÁRCIA A. S. Evaluation of Trypanocidal activity of Binuclear Cyclopalladated Based on N,N-dimethylbenzylamine. 2013. (Apresentação de Trabalho/Simpósio). 7. DE SOUZA, RODRIGO A.; VELÁSQUEZ, ANGELA MARIA ARENAS; MARTINEZ, I.; MAURO, A. E.; GRAMINHA, MÁRCIA A. S. Cyclopalladated Compounds Based on N,N-dimethylbenzylamine and isonicotinamide as Promising Leishmanicidal Drugs. 2013. (Apresentação de Trabalho/Simpósio). 8. SILVA, F.J.A.; RODRIGUES, D. F.; VELÁSQUEZ, A. M. A.; KOHATSU, A. A. N.; REGASINI, L. O.; SILVA, D. H. S.; CICARELLI, R. M. B. Evaluation of Trypanocidal activity of Distictella mansoana, Jacaranda puberula and Stizophyllum perforatum extracts on Trypanosoma cruzi Y strain. 2012. (Apresentação de Trabalho/Congresso). 9. ARENAS VELÁSQUEZ, A. M.; RODRIGUES, D. F.; SILVA, F. A. J.; CHIARI, B.; ALMEIDA, G.; ISSAC, V. L.; FRANCISCO, A. I.; VARGAS, M. D.; CICARELLI, R. M. B.. Evaluation of the Trypanocidal activity of diamines and ferrocenyl diamines against Trypanosoma brucei strains. 2012. (Apresentação de Trabalho/Congresso). 10. ARENAS VELÁSQUEZ, A. M.; SILVA, F. A. J.; RODRIGUES, D. F.; KOHATSU, A. A. N.; CHIARI, B.; ALMEIDA, G.; ISSAC, V. L.; FRANCISCO, A. I.; VARGAS, M. D.; CICARELLI, R. M. B. Evaluation of the trypanocidal activity of 1,4-naphthoquinones against Trypanosoma brucei strains. 2012. (Apresentação de Trabalho/Congresso). 11. KOHATSU, A. A. N.; SILVA, F. A. J.; ARENAS VELÁSQUEZ, A. M.; RODRIGUES, D. F.; CHIARI, B.; ALMEIDA, G.; FRANCISCO, A. I.; ANDREA, S.; ROSA, J.; VARGAS, M. D.; ISSAC, V. L.; CICARELLI, R. M. B. Evaluation of the susceptibility of epimastigote strains from T. cruzi to ferrocenyl diamines. 2012. (Apresentação de Trabalho/Congresso). 12. MARTINS, G.; MAGALHAES, N.; SILVA, F. A. J.; VELÁSQUEZ, A. M. A.; RODRIGUES, D. F.; KOHATSU, A. A. N.; PLANETA, C.; CICARELLI, R. M. B.; MOREIRA, R. Trypanocidal activity of fruits extracts of Solanum lycocarpum St. Hill. on Trypanosoma cruzi and Trypanosoma brucei strains. 2012. (Apresentação de Trabalho/Congresso). http://br.geocities.com/coralunesp/logo_unesp_assinatura.jpg http://lattes.cnpq.br/6388632764860377 http://lattes.cnpq.br/6388632764860377 http://lattes.cnpq.br/6388632764860377 http://lattes.cnpq.br/6388632764860377 http://lattes.cnpq.br/6388632764860377 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” 13. RODRIGUES, D. F.; ARENAS VELÁSQUEZ, A. M.; SALGUEIRO, L.; CAVALEIRO, C.; MARTINS, G.; MAGALHAES, N.; SANTOS, L.; MARTINS, M.; CICARELLI, R.M.B.; MOREIRA, R. Chemical composition and trypanocidal activity evaluation of essential oils from Hedychium coronarium against Trypanosoma brucei strains. 2012. (Apresentação de Trabalho/Simpósio). 14.MARTINS, G.; GUIMARAES, F.; SILVA, F. A. J.; VELÁSQUEZ, A. M. A.; RODRIGUES, D. F.; KOHATSU, A. A. N.; ALMEIDA, A. E.; PLANETA, C. S.; CICARELLI, R. M. B.; MOREIRA, R. Trypanocidal activity of fruits extracts of Solanum lycocarpum St. Hill. on Trypanosoma brucei strain. 2012. (Apresentação de Trabalho/Congresso). 15. SILVA, F. A. J.; RODRIGUES, D. F.; VELÁSQUEZ, A. M. A.; KOHATSU, A. A. N.; REGASINI, L. O.; SILVA, D. H. S.; CICARELLI, R. M. B. Evaluation of Trypanocidal activity of Distictella mansoana, Jacaranda puberula and Stizophyllum perforatum extracts on Trypanosoma cruzi Y strain. 2012. (Apresentação de Trabalho/Congresso). 16. VELÁSQUEZ, A. M. A.; Garcia, G.; CUENCA, C.; JIMENEZ, E.; CEBALLOS, C.; SANTORO, A.; SANCHEZ, A.; CORENA, M. P.; LINSER, P. J.. Clonación y Localización de una Beta Anhidrasa Carbónica a Partir del Vector Africano de Malaria (Anophles gambiae) y del Vector Suramericano de Fiebre Amarilla. 2005. (Apresentação de Trabalho/Simpósio). 17. VELÁSQUEZ, A. M. A.; Garcia, G.; CEBALLOS, C.; CUENCA, C.; JIMENEZ, E.; SANTORO, A.; SANCHEZ, A.; CORENA, M. P.; LINSER, P. J.. Clonación y Localización de una Beta Anhidrasa Carbónica a Partir del Vector Africano de Malaria (Anophles gambiae) y del Vector Suramericano de Fiebre Amarilla. 2005. (Apresentação de Trabalho/Congresso). 18. ARENAS VELÁSQUEZ, A. M.; Garcia, G.; JIMENEZ, E.; CEBALLOS, C.; CUENCA, C.; SANTORO, A.; SANCHEZ, A.; CORENA, M. P.; LINSER, P. J. Beta Anhidrasa Carbónica a Partir del Vector Africano de Malaria (Anophles gambiae) y del Vector Suramericano de Fiebre Amarilla (Stegomyia aegypti). 2005. (Apresentação de Trabalho/Congresso). 19. ARENAS VELÁSQUEZ, A. M.; Garcia, G.; JIMENEZ, E.; CEBALLOS, C.; SANTORO, A.; SANCHEZ, A.; CORENA, M. P. Clonación y Localización de una Beta Anhidrasa Carbónica a Partir del Vector Africano de Malaria (Anophles gambiae) y del Vector Suramericano de Fiebre Amarilla. Referências adicionais: Colômbia/Espanhol. 2005. (Apresentação de Trabalho/Outra). Outras produções bibliográficas 1. MARTINS, G.; MAGALHAES, N.; SILVA, F. A. J.; VELÁSQUEZ, A. M. A.; RODRIGUES, D. F.; KOHATSU, A. A. N.; PLANETA, C. S.; CICARELLI, R. M. B.; MOREIRA, R. Trypanocidal activity of fruits extracts of Solanum lycocarpum St. Hill. on Trypanosoma cruzi and Trypanosoma brucei strains. 333 Seventh Avenue New York, N: Thieme, 2012 (Resumo Planta Medica). http://br.geocities.com/coralunesp/logo_unesp_assinatura.jpg http://lattes.cnpq.br/6388632764860377 http://lattes.cnpq.br/6388632764860377 http://lattes.cnpq.br/6388632764860377 http://lattes.cnpq.br/6388632764860377 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” Patentes 1.Santo, R; Gonzalez, E. R. P.; GRAMINHA, M. A. S.; VELÁSQUEZ, A. M. A. Compostos guanidinicos como novos agentes leishmanicidas. 2016, Brasil. Patente: Privilégio de Inovação. Número do registro: 16CI080, título: "Compostos guanidinicos como novos agentes leishmanicidas". Instituição de registro: AUIN – Agência Unesp de Inovação. Depósito: 08/12/2016 Instituição financiadora: FAPESP. Bancas Participação em bancas de comissões julgadoras 1. ARENAS VELÁSQUEZ, ANGELA MARÍA. XXV Congresso de Iniciação Científica da Unesp. 2013. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho. Participação em eventos, congressos, exposições e feiras 1. "A IMPORTÂNCIA DO PLANENJAMENTO DIDÁTICOPEDAGÓGICO? III Ciclo de Seminários promovido pelo Subprojeto PIBID Química. Unesp. Araraquara. 2016. (Seminário). 2. IV International Symposium on Drug Discovery.Antiprotozoa activity in vitro of cyclopalladated complex against Leishmania amazonensis and Trypanosoma cruzi. 2015. (Simpósio). 3. Workshops Australia-UNESP. In vitro and in vivo leishmanicidal activity of a cyclopalladated compound against Leishmania amazonensis. 2015. (Outra). 4. XXXI Annual Meeting of the Brazilian Society of Protozoology / XLII Annual Meeting on Basic Research in Chagas Disease.Trypanosoma cruzi tci, tcii, tciii and tcv isolated from Triatoma lenti, Triatoma melanocephala, Triatoma rubrovaria and Triatoma sordida collected in Bahia and Rio grande do sul, Brazil. 2015. (Encontro). 5. XXXI Annual Meeting of the Brazilian Society of Protozoology / XLII Annual Meeting on Basic Research in Chagas Disease. Evaluation of rlc36 protein potential role in Leishmania infantum (syn. Leishmania chagasi) life cycle. 2015. (encontro). 6. XXXI Annual Meeting of the Brazilian Society of Protozoology / XLII Annual Meeting on Basic Research in Chagas Disease. Leishmanicidal activity of a binuclear cyclopalladated complex against Leishmania amazonensis: In vitro and In vivo analyses and potential Topoisomerase IB Inhibitor. 2015. (Encontro). 7. Workshop. Entrepreneurship for graduate in chemistry: a glance for brazilian competitiveness innovation & development. 2014. (Outra). 8. X Congreso de Protozoología y enfermedades parasitarias. Evaluation of Leishmanicidal and Tripanocidal activity of Cyclopalladated Complex. 2014. (Congresso). 9. XXX Anual Meeting of the Brazilian Society of Protozoology / XLI Annual Meeting on Basic Research in Chagas Disease i. Evaluation antileishmanial activity and inhibitory effect of palladium compounds on DNA topoisomerase (LiTOP1B) of Leishmania infantum. 2014. (Encontro). http://br.geocities.com/coralunesp/logo_unesp_assinatura.jpg UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” 10. 5th Symposium on Biological Chemistry, Health and Medicine. Frontier and New Perspectives. 2013. (Simpósio). 11. 5th Symposium on Biological Chemistry, Health and Medicine. Frontier and New Perspectives.Evaluation of Trypanocidal Activity of Binuclear Cyclopalladated Based on N,N-dimethylbenzylamine. 2013. (Simpósio). 12.Workshop on Drug Design and Neglected Tropical Diseases. 2013. (Oficina). 13. 13 International Congress of the Society for Ethnopharmacology. Trypanocidal activity of fruits extracts of Solanum lycocarpum St. Hill on Trypanosoma brucei strain. 2012. (Congresso). 14. 43 International Symposium on Essential Oils.Chemical composition and trypanocidal activity evaluation of essential oils from Hedychium coronarium against Trypanosoma brucei strains. 2012. (Simpósio). 15. Congresso Farmacêutico: Assistência Farmacêutica. 2012. (Seminário). 16. Congresso Farmacêutico: Atuação do Farmacêutico na Indústria de Bens de Consumo. 2012. (Seminário). 17. Congresso Farmacêutico: Treinamento da Linha Healt Care. 2012. (Congresso). 18. II Congresso Farmacêutico da UNESP. 2012. (Congresso). 19. International Congress on Natural Products Research. Trypanocidal activity of fruits extracts of Solanum lycocarpum St. Hill on Trypanosoma cruzi and Trypanosoma brucei strains. 2012. (Congresso). 20. I Semana Internacional de Fitoterapia - UNESP- Faculdade de Ciencias Farmacêuticas. 2012. (Outra). 21. SBPz. Evaluation of the trypanocidal activity of 1,4-naphthoquinones against Trypanosoma brucei strains. 2012. (Congresso). 22. SBPz. Evaluation of the susceptibility of epimastigote strains from T. cruzi to ferrocenyl diamines. 2012. (Congresso). 23. Search for new drug targets using molecular and cell biology approaches. 2012. (Simpósio). 24. Whorkshop 2012 Programas de Pós-Graduação em Química e Biotecnología - IQ- UNESP. 2012. (Outra). 25. XVIII International Congress for Tropical Medicine and Malaria and XLVIII Congress of the Brazilian Society of Tropical Medicine. Evaluation of the Trypanocidal activity of diamines and ferrocenyl diamines against Trypanosoma brucei strains. 2012. (Congresso). 26. XXVIII Brazilian Annual Meeting of Applied Research on Chagas Disease, XVI Brazilian Annual Meeting of Applied reserach on Leishmaniasis and III Latin American Congress on Travel Medicine. Evaluation of the trypanocidal activity of diamines and ferrocenyl diamines against Trypanosoma brucei strains. 2012. (Congresso). 27. 35a SEMANA DA QUÍMICA. 2011. (Outra). 28. IV Workshop All Pharma Junior - Oportunidades do Mundo Farmacêutico. 2011. (Outra). 29. Workshop: Uso de recursos da biodiversidade e sua transferência. 2011. (Outra). 30. II SIMPOSIO DE QUIMICA APLICADA. VII CONGRESO DE ESTUDIANTES DE QUIMICA. Clonación y Localización de una Beta Anhidrasa Carbónica a Partir del Vector Africano de Malaria (Anophles gambiae) y del Vector Suramericano de Fiebre Amarilla (Stegomyia aegypti). 2005. (Congresso). http://br.geocities.com/coralunesp/logo_unesp_assinatura.jpg UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” 31. V SIMPOSIO INVESTIGACION EN CIENCIAS BIOLOGICAS. BIOLOGIA, SALUD Y ETICA.Clonación y Localización de una Beta Anhidrasa Carbónica a Partir del Vector Africano de Malaria (Anopheles gambiae) y del Vector Suramericano de Fiebre Amarilla (Stegomyia aegypti). 2005. (Simpósio). 32. XL CONGRESO NACIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICAS. Clonación y Localización de una Beta Anhidrasa Carbónica a Partir del Vector Africano de Malaria (Anopheles gambiae) y del Vector Suramericano de Fiebre Amarilla (Stegomyia aegypti). 2005. (Congresso). 33. XXXII CONGRESO SOCIEDAD COLOMBIANA DE ENTOMOLOGIA. Clonación y Localización de una Beta Anhidrasa Carbónica a Partir del Vector Africano de Malaria (Anophles gambiae) y del Vector Suramericano de Fiebre Amarilla (Stegomyia aegypti). 2005. (Congresso). 34. X ENCUENTRO NACIONAL DE ESTUDIANTES DE QUIMICA. Clonación y Localización de una Beta Anhidrasa Carbónica a Partir del Vector Africano de Malaria (Anopheles gambiae) y del Vector Suramericano de Fiebre Amarilla (Stegomyia aegypti). 2004. (Encontro). 35. VI CONGRESO NACIONAL ESTUDIANTIL DE QUIMICA PURA Y APLICADA. 2003. (Congresso). Organização de eventos, congressos, exposições e feiras 1. VELÁSQUEZ, A. M. A.. I SEMANA INTERNACIONAL DE FITOTERAPIA DE ARARAQUARA - SP. 2012. (Outro). 2. ARENAS VELÁSQUEZ, A. M.. XL Congreso Nacional de Ciencias Biológicas. 2005. (Congresso). 3. ARENAS VELÁSQUEZ, A. M.. VI CONGRESO NACIONAL ESTUDIANTIL DE QUIMICA PURA Y APLICADA. 2003. (Congresso). http://br.geocities.com/coralunesp/logo_unesp_assinatura.jpg http://lattes.cnpq.br/6388632764860377 http://lattes.cnpq.br/6388632764860377 http://lattes.cnpq.br/6388632764860377 AGRADECIMENTOS Agradeço a Deus, minha família, amigos e colegas pelo apoio, ajuda e incentivo, sem o qual o alcance de nossos objetivos se faz mais difícil e pesado. É muito importante contar com pessoas experientes e dispostas a nos guiar nas dificultades que os caminhos apresentam. Para meus pais, Mauro e Dora, “Gracias” por terem sido e serem sempre o pilar da minha vida, estou muito agradecida a vocês pelos valores e formação de caráter que me inculcaram, coisas importantes e fundamentais para terminar tudo o que na vida se começa e fazê-lo com amor e convicção. “Porque eu amo tudo por inteiro, não pela metade”. Para meus amigos, Elsa, Anayza, Kaleo e Klarck, obrigada de novo por todo o apoio. Vocês sempre estiveram presentes e atentos para me lembrar que na vida tudo tem um porquê, tudo tem uma solução e sempre existem pessoas dispostas a nos fazer rir, até mesmo nos piores momentos. Sem vocês estes seis anos de pós-graduação não teriam sido os mesmos. “Os amigos que tens por verdadeiros, agarra-os a tua alma em fios de aço, mas não procuréis distração ou festa com qualquer camarada sem critério”. Obrigada a todos os colegas do laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular de Tripanossomatídeos pela paciência, pelo intercambio científico/cultural e por todos os dias de bancada que fizeram de mim uma pesquisadora muito mais corajosa e determinada. Especial agradecimento ofereço à Kely e Alex, porque entre muitos colegas, sempre há de existir amigos que nos brindam coisas além do conhecimento. Em especial, muito obrigada à Profa. Dra. Marcia Graminha, que me ensinou o verdadeiro significado da palavra professora e orientadora. Obrigada pela oportunidade e confiança que me brindou, por abrir as portas de seu laboratório para mim e pela paciência e ajuda em muitos aspectos que foram além da pesquisa. Você é um exemplo a seguir. Desejo que este seja só o inicio de uma longa e sólida parceria, porque você é a pesquisadora, a colega e a amiga que quero ter por perto para a vida toda. Deus nos ouça aos pós-graduandos e que pessoas como você se multipliquem para que nossas pesquisas sejam mais produtivas e agradáveis. Estendo também meus agradecimentos aos colaboradores científicos que, além de propiciarem a geração de boa parte do conteúdo desta Tese, contribuíram de algum modo para ampliar meus conhecimentos: Prof. Dr. Pio Colepicolo Neto (IQ-USP, São Paulo), Profa. Dra. Amanda Martins Baviera (FCFAr-UNESP, Araraquara), Prof. Dr. Antonio Eduardo Mauro (IQ-UNESP, Araraquara), Prof. Dr. Alessandro Desideri (Università degli Studi di Roma "Tor Vergata", Italia), Prof. Dr. João Aristeu da Rosa (FCFAr-UNESP, Araraquara), Profa. Dra. Chung M. Chin (FCFAr-UNESP, Araraquara), Dr. Rodrigo Alves de Souza (IQ-UNESP, Araraquara), Dr. Vutey Venn (Università degli Studi di Roma "Tor Vergata", Italia), Dra. Silvia Castelli (Università degli Studi di Roma "Tor Vergata", Italia), Dra. Mariana Santoro (Università degli Studi di Roma "Tor Vergata", Italia), Dr. Willian Campos Ribeiro (IQ- UNESP, Araraquara), Dra. Renata Pires de Assis (FCFAr-UNESP, Araraquara), Dra. Aline Rimoldi Ribeiro (UNICAMP, Campinas), Dr. Elmo Eduardo Almeida – Amaral (FIOCRUZ, Rio de Janeiro), Msc. Mateus Scontri (FCFar-UNESP, Araraquara), Dra. Aline de Lima Leite (USP-Bauru) e Profa. Dra. Marilia Afonso Rabelo Buzalaf (USP-Bauru). Obrigada ao Instituto de Química e Faculdade de Ciencias Farmacêuticas do câmpus de Araraquara, UNESP, pela infraestrutura e ao pessoal destas instituições pela colaboração e suporte técnico, especialmente ao pessoal da pós-graduação por sempre serem tão prestativos. Agradeço também à CAPES, Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, e ao governo do Brasil pela bolsa concedida e à FAPESP pelo financiamento do projeto 2013/08248-1. Obrigada a todos mais uma vez por serem parte da construção desta Tese e por terem participado direita ou indireitamente do meu processo de formação como Doutora, pesquisadora e principalmente, por terem enriquecido minha vida com multiplex ensinanças. E finalmente, obrigada a todas as almas de camundongos que contribuíram com sua vida para a geração destes dados, seu sacrifício não foi em vão. Deus... como sempre, deixo você no comando! Obrigada “No te rindas, aún estás a tiempo De alcanzar y comenzar de nuevo, Aceptar tus sombras, Enterrar tus miedos, Liberar el lastre, ...Retomar el vuelo. No te rindas que la vida es eso, Continuar el viaje, Perseguir tus sueños, Destrabar el tiempo, Correr los escombros, Y destapar el cielo. No te rindas, por favor no cedas, Aunque el frío queme, Aunque el miedo muerda, Aunque el sol se esconda, Y se calle el viento, Aún hay fuego en tu alma, aún hay vida en tus sueños…” Mario Benedetti “…En el camino aprendí, que llegar alto no es crecer, que mirar no siempre es ver, ni escuchar es oír. Ni lamentarse es sentir, ni acostumbrarse es querer. En el camino aprendí, que andar solo no es soledad que cobardía no es paz, ni ser feliz sonreír. Y que peor que mentir, es silenciar la verdad. Y en el camino aprendí, que la humildad no es sumisión. La humildad es ese don que suele confundir, no es lo mismo ser servil que ser un buen servidor. Cuando vayan mal las cosas, como a veces suelen ir... Cuando tu camino sólo ofrezca cuestas que subir, Cuando tengas poco haber, pero mucho que pagar, Y precises sonreír aún teniendo que llorar... Cuando el dolor te agobie y no puedas ya sufrir, Descansar acaso debes, pero nunca desistir. Cuando todo esté peor... ¡más debemos insistir!” Anónimo /Rafael Amor “A imaginação é mais importante que o conhecimento” Albert Einstein RESUMO As leishmanioses são doenças mundialmente distribuídas, encontradas nas áreas tropicais e subtropicais do mundo e que são caudas por protozoários parasitos do gênero Leishmania spp. A pesar dos inúmeros problemas associados aos tratamentos disponíveis (como alta toxicidade dos fármacos, limitada eficácia e casos de resistência haverem surgido), ainda estás doenças são negligenciadas pelas industrias farmacêuticas e pelos governos. Na procura por novos fármacos com amplo espectro de ação e baixa toxicidade, há evidências que sugerem que complexos de metais de transição podem atuar em diversos compartimentos ou organelas dos protozoários, além de apresentar baixa toxicidade no hospedeiro mamífero. No presente trabalho, realizou-se a avaliação leishmanicida in vitro de seis compostos ciclopaladados, [Pd(dmba)(µ-Cl)]2 (CP1), [Pd(dmba)(µ-N3)]2 (CP2), [Pd(dmba)(µ-NCO)]2 (CP3), [Pd(dmba)Cl(isn)] (CP4), [Pd(dmba)(N3)(isn)] (CP5) e [Pd(dmba)(NCO)(isn)] (CP6) e seus correspondentes ligantes livres, Hdmba: N,N-dimetilbenzilamina e isn: isonicotinamida. O composto CP2 inibiou o crescimento das formas promastigotas de Leishmania amazonensis (IC50 = 13,2 ± 0,7 µM), reduz a proliferação das formas amastigotas intracelulares (IC50 = 10,2 ± 2,2 µM) e apresentou um baixo efeito citotóxico frente a macrófagos peritoneais (CC50 = 506,0 ± 10,7 µM). Dados in vitro da atividade anti-T. cruzi e anti-T. brucei, parasitos causadores das doenças de Chagas e do sono, respectivamente, também demonstraram que os compostos ciclopaladados apresentam amplo espectro de ação constituindo-se em excelentes candidatos para o tratamento das doenças negligenciadas em estudo. O composto CP2 apresentou-se para as formas amastigotas intracelulares de L. amazonensis pelo menos 50 vezes mais seletivo e 200 vezes mais seletivo para as amastigotas de T. cruzi vs. células de mamífero. Em estudos in vivo, utilizando o modelo BALB/c infectado com L. amazonensis, CP2 (0,35 mg/Kg/dia) não apresentou toxicidade, quando investigados marcadores bioquímicos de função renal e hepática, em estudos in silico mostrou uma permeabilidade de 100% para absorção intestinal, e reduziu em 80% a carga parasitária dos animais, resultado promissor e comparável à anfotericina B (2 mg/Kg em dias alternados), fármaco atualmente utilizado no tratamento das leishmanioses. Diante das potencialidades deste composto em estudos aprofundados do mecanismo de ação mostrou-se que CP2 é capaz de inibir a etapa de clivagem da DNA Topoisomerase 1B de Leishmania. Análise proteômica comparativa (eletroforese bidimensional, seguida por espectrometria de massas) foram realizadas para identificar proteínas diferencialmente expressas em L. amazonensis na ausência/ presença de CP2 e assim determinar os eventos moleculares gerados em cascata a partir da inibição da DNA Topoisomerase do parasito. Dentre as proteínas encontradas nos ensaios supracitados, destacam-se chaperoninas associadas à diferentes estresses (calreticulina, proteína de choque térmico 10KDa -HSP10-, HSP70, GRP78 e dissulfureto isomerase), proteínas que atuam no processo de detoxificação celular (tripanotiona reductase, peroxiredoxina, triparedoxina peroxidase) e outras proteínas associadas com diversos processos biológicos que podem estar relacionados com o processo de Morte Celular Programada em Leishmania. Palavras-chave: Leishmanioses. Doença de Chagas. Leishmania amazonensis. Trypanosoma cruzi. DNA topoisomerase 1B. Complexo ciclopaladado. ABSTRACT Leishmaniasis are diseases globally distributed in tropical and subtropical areas of the world and Leishmania spp. are the etiological agents of the diseases. Numerous problems associated with available treatments of the disease are still unsatisfactory because currently available drugs are highly toxic, little effectiveness and drug resistance cases have emerged. Furthermore, leishmaniasis are a neglected disease by pharmaceutical industries and governments. In the search for new drugs with a broad spectrum of action and low toxicity, there is evidence to suggest that transition metal complexes can act in several compartments or organelles of protozoa, as well as to present low toxicity in the mammalian host. In this work, we evaluated the leishmanicidal and trypanocidal in vitro activity of six cyclopalladated compounds: [Pd(dmba)(µ-Cl)]2 (CP1), [Pd(dmba)(µ-N3)]2 (CP2), [Pd(dmba)(µ-NCO)]2 (CP3), [Pd(dmba)Cl(isn)] (CP4), [Pd(dmba)(N3)(isn)] (CP5), [Pd(dmba)(NCO)(isn)] (CP6) and the free ligands, Hdmba: N,N- dimethylbenzylamine e isn: isonicotinamide. The cyclopalladated complexes CP2 inhibited the growth of the promastigote forms of Leishmania amazonensis (IC50 = 13,2 ± 0,7 µM), reduced the proliferation of intracellular amastigote forms (IC50 = 10,2 ± 2,2 µM) and showed a low cytotoxic effect against peritoneal macrophages (CC50 = 506,0 ± 10,7 µM). In vitro assays against T. cruzi and T. brucei, parasites that cause Chagas disease and sleeping sickness, respectively, demonstrated that cyclopaladate compounds have a wide spectrum of action and constitute an excellents candidates for the treatment of these neglected diseases. CP2 was at least fifty-times more selective for intracellular amastigote forms of L. amazonensis and two hundred-times more selective for intracellular amastigote forms of T. cruzi vs. mammaliam cells. For in vivo assays, CP2 (0.35 mg/Kg/day) was not toxic to BALB / c mouse infected with L. amazonensis, no changes were observed in biochemical markers of renal/hepatic function, in in silico studies showed a 100% of permeability for intestinal absorption and the parasite load of the animals was reduced to 80%, like amphotericin B (2 mg/Kg in alternate days), the drug currently used in the leishmaniasis treatment. In-depth studies of the mechanism of action have shown that CP2 can inhibit the cleavage step of Leishmania DNA Topoisomerase 1B. Comparative proteomic analysis (two-dimensional electrophoresis, followed by mass spectrometry) were performed to identify proteins differentially expressed in L. amazonensis in the absence / presence of CP2 and thus to determine molecular events generated from the inhibition of parasite DNA Topoisomerase. We found in the proteomic analysis chaperonins associated with different stresses (calreticulin, putative 10 kDa heat shock protein, putative heat-shock protein hsp70, putative glucose-regulated protein 78, protein disulfide-isomerase), proteins that act in the process of cellular detoxification (trypanothione reductase, peroxidoxin, tryparedoxin peroxidase) and other proteins associated with several biological processes associated with a possible programmed cell death in Leishmania. Key-words: Leishmaniasis. Chagas disease. Leishmania amazonensis. Trypanosoma cruzi. DNA topoisomerase 1B. Cyclopalladated compounds. LISTA DE FIGURAS Figura 1- Ciclo de vida do parasito Leishmania spp. ............................................................... 29 Figura 2- Fármacos utilizados no tratamento das leishmanioses ............................................. 32 Figura 3- Ciclo de vida do Trypanosoma cruzi. ....................................................................... 34 Figura 4- Fármacos utilizados no tratamento da doença de Chagas......................................... 36 Figura 5- Ciclo de vida do Trypanosoma brucei. ..................................................................... 37 Figura 6- Fármacos utilizados no tratamento da doença do sono............................................. 38 Figura 7- Estrutura da DNA topo 1B humana (hTopoI) vs. a DNA topo 1B de L. donovani (LdTopo1B).. ............................................................................................................................ 43 Figura 8- Compostos com potencial inibidor de topoisomerases podem direcionar a célula a MCP. ......................................................................................................................................... 46 Figura 9- Mecanismo de formaçaõ do ciclopaladado CP1, Pd(dmba)(µ-Cl)]2. ....................... 50 Figura 10- Estruturas dos compostos ciclopaladados. .............................................................. 67 Figura 11- Eficácia do tratamento in vivo de CP2 e anfotericina B frente a camundongos BALB/c infectados com L. amazonensis. ................................................................................. 75 Figura 12- Medida do A) número de amastigotas intracelulares por 100 células nucleadas do hospedeiro e B) determinação do índice de LDU (número de amastigotas de Leishmania por 1000 células nucleadas por peso do órgão) nos diferentes grupos de animais BALB/c infectados com L. amazonensis e tratados com fármaco de referência (anfotericina B, 2 mg/Kg dias alternados), veículo (PBS) e composto ciclopaladado CP2 em diversas concentrações............................................................................................................................ 77 Figura 13- Quantificação da carga parasitária por PCR em tempo real das lesões de pele de camundongos BALB/c infectados com L. amazonensis nos diferentes grupos tratados com fármaco de referência (anfotericina B, 2 mg/Kg dias alternados), veículo (PBS) e composto ciclopaladado CP2 em diferentes concentrações. .................................................................... 78 Figura 14- Gráficos da PCR em tempo real dos diversos primers testados para a quantificação relativa da carga parasitária. ..................................................................................................... 80 Figura 15- Níveis plasmáticos de biomarcadores de função hepática e renal em camundongos BALB/c não infectados e infectados com L. amazonensis e tratados com 0,2; 0,35 e 0,70 mg/Kg/dia de CP2. ................................................................................................................... 82 Figura 16- Estruturas de ressonância (I) e (II) e hibrido de ressonância de CP2 utilizada para as analises in silico, ADMET. .................................................................................................. 85 Figura 17- Ensaio de inibição dose dependente da topoisomerase de L. donovani. ................ 88 Figura 18- Cinética de clivagem da LdTopo1B na presença do composto CP2. ..................... 89 Figura 19- Gel bidimensional SDS-PAGE 12,5% corado com coomasie blue dos extratos proteicos de promastigotas de L. amazonensis tratadas e não tratadas com composto ciclopaladado CP2. Faixa de pH 3 a 10. . ................................................................................ 91 Figura 20- Gel bidimensional SDS-PAGE 12,5% corado com coomasie blue dos extratos proteicos de promastigotas de L. amazonensis tratadas e não tratadas com composto ciclopaladado CP2. Faixa de pH 4 a 7. .................................................................................... 92 Figura 21- Categorização biológica das proteínas encontradas de L. amazonensis após o tratamento com CP2 de acordo com UNIPROT. ..................................................................... 93 Figura 22- Quantificação dos níveis relativos de expressão do cDNA dos genes da calreticulina, dissulfeto isomerase, citocromo C e citocromo C oxidase sub IV por PCR em tempo real de promastigotas de L. amazonensis na presença ou ausência do composto ciclopaladado CP2.. .................................................................................................................. 96 Figura 23- Análise da fragmentação do DNA na presença de CP2. ........................................ 97 Figura 24- Curva de crescimento de promastigotas de L. amazonensis na ausência (L.a -) e presencia de 13,2 (L.a +) e 131,5 µM (L.a 10X) de CP2; e curva de crescimento de promastigotas de L. amazonensis resistentes a CP2 (L.a R-) submetidas aos mesmos tratamentos ............................................................................................................................... 98 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Oligonucleotídeos iniciadores testados na quantificação relativa por PCR em tempo real. ........................................................................................................................................... 57 Tabela 2. Variação da concentração de oligonucleotídios utilizados para PCR em tempo real e sua eficiência. ........................................................................................................................... 58 Tabela 3. Valores da equação da reta e da eficiência para o alvo (G6PD Leishmania) e o controle endógeno (GAPDH BALB/c). ................................................................................... 58 Tabela 4. Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para a quantificação absoluta por PCR em tempo real dos genes que codificam para as proteínas diferencialmente expressas observadas na análise proteômica comparativa após o tratamento de formas promastigotas de L. amazonensis ao composto ciclopaladado CP2. ........................................................................ 65 Tabela 5. Atividade leishmanicida, tripanocida (IC50) e citotóxica (CC50) in vitro de compostos ciclopaladados (µmol. L-1) e seus índices de seletividade (IS). Em negrito ressaltam-se os índices de seletividade dos compostos ciclopaladados ≥ 10. Cada valor é a média de três experimentos realizados em triplicado ± desvio padrão. ................................... 69 Tabela 6. Comparação da atividade leishmanicida e tripanocida in vitro de compostos ciclopaladados diluídos em DMSO e DMF. Cada valor é a média de três experimentos realizados em triplicado ± desvio padrão. ................................................................................ 71 Tabela 7. Citotoxicidade in vitro de compostos ciclopaladados, em DMSO e DMF, contra macrófagos peritoneais de camundongo. Cada valor é a média de três experimentos realizados em triplicado ± desvio padrão. ................................................................................................. 73 Tabela 8. Propriedades ADMET prevista de CP2. .................................................................. 86 Tabela 9. Suceptibilidade de Leishmania amazonensis selvagem e resistente a CP2. ............ 99 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ADMET Absorção, Distribuição, Metabolismo, Excreção, Toxicidade CC50 Metade da concentração citotoxica - citotoxicidade CP1 [Pd(dmba)(µ-Cl)]2 CP2 [Pd(dmba)(µ-N3)]2 CP3 [Pd(dmba)(µ-NCO)]2 CP4 [Pd(dmba)Cl(isn)] CP5 [Pd(dmba)(N3)(isn)] CP6 [Pd(dmba)(NCO)(isn)] CPT Camptotecina DMF N,N-dimetilformamida DMSO Dimetilsulfóxido DNDi Drugs for Neglected Diseases Initiative DNs Doenças Negligenciadas DP Desvio Padrão DTT Ditiotreitol Ero1p Oxidoreductina EROs Espécies Reativas de Oxigênio G6PD glucose-6-fosfato desidrogenase GAPDH gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase GRP78 putative glucose-regulated protein 78 Hdmba N,N-dimetilbenzilamina HSP10 putative 10 kDa heat shock protein HSP70 heat-shock protein hsp70 hTopoI DNA topoisomerase I humana IC50 metade da concentração inibitoria IEF focalização isoeléctrica IS Índice de Seletividade isn Isonicotinamida LaR Leishmania amazonensis Resistente a CP2 LC Leishmaniose cutânea LdTopo1B DNA topoisomerase 1B de Leishmania donovani LDU Leishman-Donovan Units LMC Leishmaniose mucocutânea LPG fosfolipoglicano LV Leishmaniose visceral m7G 7-metilguanosina cap MCP Morte Celular Programada mRNA RNA mensagero MS espectrômetro de massas NTC Mix de reação sem amostra OMS Organização Mundial da Saúde OPS Organização Panamericana da Saúde PBS Tampão fosfato-salino ou Phosphate Buffered Saline PDI Dissulfeto Isomerase pkCSM Predicting Small-molecule Pharmacokinetic and toxicity properties using Graph-Based Signatures qPCR PCR em tempo real ou PCR quantitativa RE Retículo endoplasmático RMN Ressonância Magnética Nuclear rRNA RNA ribossômico SDS Dodecil sulfato de sódio SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis SL Spliced Leader SNC Sistema Nervoso Central TOPO I DNA topoisomerase tipo I TOPOII DNA topoisomerase tipo II Tpri Triparedoxina peroxidase Tryr Trypanotiona reductase UNIPROT Universal Protein Resource UPR/RPM Unfolded Protein Response / Resposta de Proteínas mal dobradas SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 26 1.1 Leishmania spp e tratamentos atualmente disponíveis para as leishmanioses ............. 27 1.2 T. cruzi e tratamento atualmente disponível para a doença de Chagas......................... 33 1.3 T. brucei e o tratamento atualmente disponível para a doença do sono ....................... 36 1.4 Compostos metálicos como opções terapêuticas para DNs .......................................... 39 1.4.1 Compostos de Paládio e seu potencial anti-protozoário ............................................... 41 1.5 As DNAs topoisomerases e seu potencial como alvo terapêutico ................................ 42 2 OBJETIVOS ............................................................................................................... 48 3 MATERIAIS E METODOS ...................................................................................... 50 3.1 Screening in vitro de Compostos Ciclopaladados frente a Tripanossomatídeos .......... 50 3.1.1 Compostos Ciclopaladados ........................................................................................... 50 3.1.2 Parasitos ........................................................................................................................ 51 3.1.3 Bioensaio para avaliar atividade leishmanicida e tripanocida in vitro ......................... 52 3.1.4 Determinação da citotoxicidade contra macrófagos peritoneais de camundongos Swiss de compostos ativos pela técnica colorimétrica do MTT ............................................. 54 3.1.5 Avaliação in vitro da atividade antiprotozoa de compostos ativos contra formas amastigotas intracelulares de L. amazonensis e T. cruzi .............................................. 54 3.1.6 Cálculo do Índice de seletividade (IS) .......................................................................... 55 3.2 Bioensaio para avaliar a eficácia de tratamento com CP2 frente a camundongos BALB/c infectados com L. amazonensis ...................................................................... 55 3.2.1 Ensaio in vivo ................................................................................................................ 55 3.2.2 Biomarcadores de Função hepática e renal................................................................... 56 3.2.3 Predições das propriedades farmacocinéticas e da toxicidade in silico de CP2 ........... 57 3.2.4 Determinação da Carga Parasitária ............................................................................... 57 3.2.4.1 LDU: Leishman-Donovan Units ................................................................................... 57 3.2.4.2 PCR em tempo real ....................................................................................................... 57 3.2.5 Análise Estatística ......................................................................................................... 60 3.3 Mecanismos de ação de CP2 frente a Leishmania amazonensis .................................. 60 3.3.1 Ensaio de Relaxamento do DNA .................................................................................. 60 3.3.2 Cinética de Clivagem .................................................................................................... 61 3.3.3 Análise Proteômica ....................................................................................................... 61 3.3.3.1 Obtenção do Extrato proteico ....................................................................................... 61 3.3.3.2 Eletroforese em Primeira Dimensão (IEF) ................................................................... 62 3.3.3.3 Equilibrio das tiras IPG ................................................................................................ 62 3.3.3.4 Eletroforeses em segunda dimensão (SDS-PAGE) ...................................................... 62 3.3.3.5 Análise dos spots por Espectrometria de Massas ......................................................... 63 3.3.3.6 Validação das proteínas diferencialmente expressas por qPCR: Extração de RNA, sínteses de cDNA e PCR em tempo real. ..................................................................... 64 3.3.4 Obtenção de uma cepa de L. amazonensis resistente ao ciclopaladado CP2 ................ 66 3.3.5 Obtenção de DNA genômico de L. amazonensis sensível e resistente a CP2 para análises da fragmentação do DNA ............................................................................... 66 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................ 67 4.1 Compostos Ciclopaladados Apresentam Atividade Biológica in vitro frente a Tripanossomatídeos ...................................................................................................... 67 4.2 CP2 é eficaz no tratamento da leishmaniose cutânea de camundongos BALB/c infectados com L. amazonensis .................................................................................... 74 4.3 CP2 não produziu alterações nos biomarcadores de função hepática/renal e se mostrou oralmente eficaz com base nas predições das propriedades farmacocinéticas e da toxicidade in silico ........................................................................................................ 81 4.3 Mecanismos de ação de CP2 frente a Leishmania amazonensis .................................. 87 4.4.1 CP2 apresenta um efeito inibidor sobre a DNA topoisomerase 1B de Leishmania ..... 87 4.4.2 CP2 interfere no ciclo Catalítico da DNA topoisomerase 1B de Leishmania .............. 88 4.4.3 DNA topoisomerase 1B de Leishmania pode ser único alvo de ação de CP2 ............. 98 5 CONCLUSÕES ......................................................................................................... 102 REFERÊNCIAS ........................................................................................................ 103 APÊNDICE I ............................................................................................................. 118 APÊNDICE II ............................................................................................................ 120 APÊNDICE III .......................................................................................................... 124 APÊNDICE IV .......................................................................................................... 125 ANEXO I ................................................................................................................... 130 ANEXO II .................................................................................................................. 131 26 1 INTRODUÇÃO As infecções causadas por organismos da família Trypanosomatidae, ordem Kinetoplastida, afetam predominantemente milhões de pessoas no mundo, principalmente, aquelas comunidades pobres e marginalizadas da América Latina, África e Ásia e que têm sido negligenciadas pela indústria farmacêutica e pelos governos (SÜLSEN et al., 2008). Dentre as 17 doenças classificadas como negligenciadas (DNs) pela Organização Mundial da Saúde (OMS), destacam-se as leishmanioses e tripanossomíases, carentes há várias décadas por novos fármacos para seu tratamento e que se encontram amplamente distribuídas nas áreas tropicais e subtropicais do mundo. As leishmanioses, a doença de Chagas e a doença do sono são causadas por protozoários parasitos taxonomicamente relacionados, que têm características estruturais e bioquímicas similares. Estes incluem um único DNA mitocondrial com um corpo estruturado, o cinetoplasto, organelas específicas para a glicólise; os glicossomos, e um metabolismo único de tiol. Uma análise recente das sequências genomicas tem identificado semelhanças e diferenças nas vias metabólicas entre eles, o que nos leva a compreender a patogênese das doenças e describir fármacos e alvos moleculares específicos para estas parasitoses (BARRETT; CROFT, 2012). Adicionalmente, o processamento do mRNA em tripanossomatídeos é diferente do processo ocorrido na maioria dos eucariotos, principalmente porque os genes codificadores de proteínas são transcritos em RNA policistrônico nestes organismos (LIANG et al., 2003). Outra caraterística importante em relação à expressão gênica foi a descoberta do Spliced Leader (SL), identificado inicialmente em Trypanosoma brucei, relacionado com o passo de maturação de todos os pré-mRNA nucleares em tripanossomatídeos (GÜNZL, 2010). A presença do SL tem duas finalidades, ele funciona em conjunto com a poliadenilação da transcripção policistrionica e fornece o capping 7-metilguanosina (m7G) dos mRNA. O processo de trans-splicing ocorre através de duas reações de transesterificação, análogos ao processo de cis-splicing, mas formando uma estrutura intermediaria Y em vez do intermediário de lariat (GÜNZL, 2010; LIANG et al., 2003). Estas caracateristicas únicas e marcantes em tripanossomatídeos fornecem ferramentas para o desenvolvimento e descoberta de novos fármacos, já que as terapias atualmente disponíveis apresentam muitos problemas como alta toxicidade dos fármacos, limitada eficácia e casos de resistência que têm surgido. Nesse sentido, nosso grupo de pesquisa está envolvido na busca de compostos leishmanicidas, mas que também apresentem efeito inibitório no crescimento de Trypanosoma cruzi e Trypanosoma brucei, agentes etiológicos 27 das doenças citadas. O anterior é importante não só do ponto de vista de procura de moléculas com amplo espectro de ação, mas também, porque diversos alvos terapêuticos específicos podem ser explorados. 1.1 Leishmania spp e tratamentos atualmente disponíveis para as leishmanioses A família Trypanosomatidae compreende um grande número de protozoários parasitos, incluindo importantes agentes etiológicos de doenças humanas, como, por exemplo, o gênero Leishmania spp. e Trypanosoma sp.. Em humanos, a Leishmania causa um amplo espectro de doenças, incluído as manifestações cutâneas (LC), mucocutâneas (LMC) e visceral (LV) (LOPEZ; CHERKASOV; NANDAN, 2007). As leishmanioses são doenças distribuídas mundialmente (países da América, Europa, África e Ásia que se encontram em áreas tropicais e subtropicais) e são causadas por pelo menos 20 diferentes espécies de Leishmania, sendo transmitidas por mais de 90 espécies de insetos dos gêneros Phleobotomus e Lutzomyia. De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), estimam-se 1,3 milhões de novos casos de leishmanioses e 20.000 a 30.000 mortes anualmente (WERNECK, 2010; WORD..., 2017a). As manifestações clínicas e a severidade da leishmaniose dependem da espécie de parasito que está infectando o hospedeiro, da constituição genética e do estado imunitário do indivíduo, como por exemplo no caso de pacientes imunossuprimidos coinfectados com o vírus da AIDS (CUNNINGHAM, 2002; ROGERS et al., 2002). A LC é a forma mais comum de leishmanioses e ocorre em 98 países de quatro continentes, sendo considerada pela OMS, como uma das seis mais importantes doenças infecciosas, devido à capacidade de produzir deformidades (BRASIL. MINISTÉRIO DE SAÚDE., 2010; PALUMBO, 2009). As principais espécies causadoras desta doença são: Leishmania tropica e Leishmaia major, no norte da África, Oriente Médio, Índia e na Europa Mediterrânea, Leishmania panamensis, Leishmania mexicana, Leishmania amazonensis, Leishmania guyanensis e Leishmania braziliensis nas Américas, sendo as três últimas as espécies epidemiologicamente mais importantes no Brasil. A L. braziliensis também é o agente etiológico da LMC no Brasil. A LV é causada pela Leishmania donovani, Leishmania infantum no Velho Mundo e pela Leishmania chagasi na América do Sul, particularmente no Brasil (AMATO et al., 2007; CUNNINGHAM, 2002; MELBY, 2002; PALUMBO, 2009). 28 De acordo com a Organização Panamericana da Saúde (OPS), o Brasil e os países da região andina e América central concentram a maioria dos casos de LC e LMC na América Latina. No periodo de 2001 a 2014 foram reportados à OPS/OMS um total de 797.849 novos casos de LC e LMC distribuidos em 17 dos 18 países endêmicos das Américas. (OPS/OMS…, 2016). No Brasil, as leishmanioses apresentam grande magnitude e transcendência. Em 2009, foram registrados 3.693 casos de LV, a qual apresenta importante expansão geográfica em todas as regiões do país, sendo predominante no Nordeste. No período 2000-2009 ocorreram 260.573 casos de LC, com incidência anual de 26.057 casos novos (BRASIL. MINISTÉRIO DE SAÚDE., 2011). As Leishmania spp. apresentam-se em duas formas principais, as formas promastigotas (forma flagelada encontrada em flebotomíneos e cultura) e as formas amastigotas (forma não flagelada que apresenta-se em diversos tecidos e replica-se no fagolissosoma de macrófagos do hospedeiro mamífero) (HERWALDT, 1999). O ciclo de vida é iniciado quando fêmeas hematófagas da família Psychodidae, subfamília Phlebotominae picam e inoculam o protozoário na forma promastigota metacíclica durante o repasto sanguíneo, figura 1 (HORIKAWA; PENA, 2011). A internalização dos promastigotas ocorre pelo processo de fagocitose, mediado pelo reconhecimento receptor/ligante, no qual participam os receptores para complemento CR1 e CR3 dos macrófagos, entre outros, que promovem a fagocitose evitando a geração exacerbada de espécies reativas de oxigênio, permitindo o estabelecimento da infecção (WRIGHT; SILVERSTEIN, 1983). C3b e C3bi (moléculas do complemento) fixadas nas formas promastigotas ligam-se aos receptores CR1 e CR3, respectivamente (ROBLEDO et al., 1994). Para que CR3 reconheça C3b, a protease gp63, presente na superfície dos promastigotas, converte este em C3bi (BRITTINGHAM; MOSSER, 1996). Adicionalmente, o fosfolipoglicano, LPG, presente na superfície dos promastigotas procíclicos e metacíclicos, protege as formas metacíclicas da lise pelo complemento (HORIKAWA; PENA, 2011). Dentro dos vacúolos fagocíticos (fagolisossomo), os promastigotas se diferenciam a amastigotas, as quais se multiplicam por fissão binária até serem liberadas após rompimento das células parasitadas, sendo assim, fagocitadas por outros macrófagos (ALVAR et al., 2012; DESJEUX, 1996). Durante um novo repasto sanguíneo o flebotomíneo ingere os macrófagos infectados com a forma amastigota. No intestino do inseto vetor as formas amastigotas diferenciam-se em formas promastigotas procíclicas, que se multiplicam por fissão binária, 29 ocorrendo posteriormente o processo de metaciclogêneses (HORIKAWA; PENA, 2011; MUSKUS; MARÍN VILLA; VILLA, 2002). Figura 1- Ciclo de vida do parasito Leishmania spp. Fonte: adaptado de Centers...(2016b) No processo de metaciclogênese os promastigotas procíclicos ou não infectivos, transforman-se em promastigotas metacíclicos, ou infectivos. Neste processo moléculas como a LPG e gp63 são expressas abundantemente na superficie dos promastigotas. A LPG sofre uma série de modificações para proteger os promastigotas contra à ação de enzimas proteolíticas produzidas durante a digestão do sangue no interior do vetor e para a adesão dos promastigotas procíclicos no epitélio digestivo (MUSKUS; MARÍN VILLA; VILLA, 2002). Modificações nos açúcares terminais da LPG produzem a liberação dos promastigotas do epitélio digestivo que migram para a parte anterior do tracto digestivo se ubicando à altura da probóscide, a partir do qual podem ser transmitidos. Aumentos na infectividade dos promastigotas metacíclicos estão associados a um incremento na expressão da gp63 (MUSKUS; MARÍN VILLA; VILLA, 2002). 30 Na LC, as lesões são exclusivamente cutâneas, a maioria são ulcerativas e evoluem de pápulas para nódulos e dependendo da espécie podem cicatrizar espontaneamente mas reaparecer em outros lugares, também podem ser produzir lessões secundárias associadas à infecções bacterianas (HERWALDT, 1999; PALUMBO, 2009). As principais espécies associadas no Brasil são L. amazonensis e L. braziliensis (SILVEIRA; LAINSON; CORBETT, 2004). O tratamento atual para as leishmanioses requer a administração de fármacos tóxicos e pouco toleráveis (FREITAS-JUNIOR et al., 2012). Os fármacos de primeira escolha para seu tratamento são os antimoniais pentavalentes (Sb+5) disponíveis em duas formulações, antimoniato de metilglucamina (Glucantime®, administrado por via intramuscular) e estibogluconato de sódio (Pentostan®, administrado por via intravenosa) (GOTO; LAULETTA LINDOSO, 2012; PALUMBO, 2009) sendo este último não comercializado no Brasil (BRASIL. MINISTÉRIO DE SAÚDE., 2010; MELO; FORTALEZA, 2013). Apesar de terem sido desenvolvidos há décadas, ainda são utilizados no tratamento das leishmanioses, mesmo diante de inúmeros relatos de casos de resistência e efeitos colaterais (CROFT; OLLIARO, 2011; CROFT; SUNDAR; FAIRLAMB, 2006; TORRES et al., 2013). Em termos de mecanismo de ação, os antimoniais pentavalentes são pró-fármacos, sendo reduzidos a um composto trivalente bioativo (Sb+3) no interior do macrófago; este antimonial é capaz de causar inibição in vitro da DNA topoisomerase 1B de L. donovani, mas parece ter outros alvos de ação in vivo (CHAKRABORTY; MAJUMDER, 1988; ROBERTS; BERMAN; RAINEY, 1995; WALKER; SARAVIA, 2004), como por exemplo, interferir na bioenergética das formas amastigotas de Leishmania (glicólise e oxidação dos ácidos graxos), que desencadeia inibição da sínteses de ATP (PALUMBO, 2009). Parte do Sb+5 é reduzido a Sb+3 e o que foi retido fica concentrado no fígado e baço, responsável pelos efeitos tóxicos. Para os antimoniais pentavalentes, existem, no entanto, diversos obstáculos para sua administração, precisando da internação do paciente devido à aplicação parenteral. Além disso, a taxa de nefrotoxicidade pode ser superior a 50% (MELO; FORTALEZA, 2013; PALUMBO, 2009). O principal efeito adverso é decorrente de sua ação sobre o aparelho cardiovascular, além de apresentar-se pancreatitis, hepatites e depressão da medula óssea, se detectada arritmias o medicamento deve ser suspenso e indicado um fármaco de segunda escolha (PALUMBO, 2009). 31 Como fármacos de segunda escolha encontram-se a anfotericina B desoxicolato, junto à pentamidina (sulfato de pentamidina e mesilato de pentamidina) e mitelfosina, utilizadas para o tratamento sistêmico (MELO; FORTALEZA, 2013). O antifúngico anfotericina B é utilizado como fármaco de segunda escolha quando há falhas na terapêutica pelos antimoniais pentavalentes; no entanto apresenta elevada toxicidade e é contraindicada em cardiopatas, hepatopatas e, especialmente, nefropatas. Alguns dos efeitos adversos importantes são: anorexia, insuficiência renal, anemia, leucopenia e alterações cardíacas (GILL et al., 1999; PALUMBO, 2009). A fim de contornar os efeitos colaterais deste fármaco, foram desenvolvidas formulações lipídicas (Ambisome®, Amphocil™ e Abelcit®), as quais se mostram mais eficazes e menos tóxicas quando comparadas à anfotericina B (GANGNEUX et al., 1996; TORCHILIN, 2005; YARDLEY; CROFT, 1997), porém, apresentam alto-custo, difícil via de administração e baixa estabilidade a altas temperaturas (GOTO; LAULETTA LINDOSO, 2012; MELO; FORTALEZA, 2013). Em termos de mecanismo de ação, a anfotericina B interfere na via de síntese do ergosterol, causando danos à membrana plasmática do parasito (ROBERTS et al., 2003). As pentamidinas são diamidinas aromáticas utilizadas como fármacos de segunda escolha no tratamento da LC em áreas endêmicas dos continentes americano, asiático e africano. São comercializadas para uso em humanos nas seguintes formulações: Isotionato (Di-B-hidroxietano sulfonato) e Mesilato (Di-B-hidroximetil sulfonato). Devido ao medicamento ter ação no metabolismo da glicose, pode haver hipoglicemia seguida de hiperglicemia. Pode ocorrer indução de citólise das células beta do pâncreas e, consequentemente, diabetes insulino-dependente (JACOBS; NARE; PHILLIPS, 2011; PALUMBO, 2009). Outros efeitos associados a pentamidina são nefrotoxicidade, hipotensão, leucopenia, anemia, arritmias, náuseas, vomito, polineuropatia periférica, hepatites e alterações neurológicas (PALUMBO, 2009). Adicionalmente, a paromomicina (antibiótico aminoglicosídico) é utilizada por via tópica (10% em gel) ou parenteral na LC, e atualmente se encontra em fase de desenvolvimento avançado para o tratamento da LV (SANTOS et al., 2008; SCOTT et al., 1992). Este aminoglicosídeo interfere no potencial de membrana da mitocôndria, inibe a síntese proteica e altera a fluidez da membrana plasmática (CHAWLA et al., 2011). 32 Diferentemente dos antimoniais pentavalentes, a anfotericina B e a paromomicina são administrados por via parenteral e em ambiente hospitalar, a miltefosina é administrada por via oral e sua atividade leishmanicida foi revelada simultaneamente à atividade anticâncer deste medicamento (CROFT et al., 1987). Alteração na homeostase do Ca+2 e síntese de lipídeos são os alvos de ação sugeridos para a miltefosina em Leishmania (CROFT et al., 1987; SERRANO-MARTÍN et al., 2009). Uma limitação que ocorre para esse fármaco é sua contraindicação durante a gravidez, devido aos efeitos teratogênicos observados em estudos pré-clínicos (PALUMBO, 2009; SUNDAR; OLLIARO, 2007). Figura 2- Fármacos utilizados no tratamento das leishmanioses: A) anfotericina B, B) paramomicina, C) mitelfosina, D) estibogluconato de sódio. Fonte: Barrett e Croft (2012) Outra limitante para a utilização dos tratamentos atuais radica em que casos de resistência a estes fármacos tem sido reportados, como é o caso dos antimoniais no nordeste da Índia e de algumas cepas que já tem apresentado resistência à metilfosina, que é o único fármaco de uso oral disponível (COELHO et al., 2015). Devido ao tratamento das leishmanioses ser altamente tóxico e possuir níveis moderados de eficácia (LOPEZ; CHERKASOV; NANDAN, 2007), além dos casos de resitencia reportados, há uma necessidade urgente de desenvolver novos compostos, bem como estratégias leishmanicidas para proteger as terapias atuais e futuras da ameaça de resistência. 33 1.2 T. cruzi e tratamento atualmente disponível para a doença de Chagas Entre algumas das DNs que afetam predominantemente as populações mais pobres e vulneráveis encontramos a doença de Chagas (tripanossomíase americana, ou esquizotripanose), uma antropozoonose presente nas Américas, principalmente na América Latina. O protozoário flagelado T. cruzi é o agente etiológico da doença de Chagas e ambos foram descobertos e descritos por Carlos Ribeiro Justiniano das Chagas em 1909 (CHAGAS, 1909). A enfermidade é transmitida ao homem por fezes infectadas do triatomíneo (80-90% dos casos) ou transmitido por transfusão sanguínea (5-20% dos casos), via placentária e durante aleitamento materno (0,5-8% dos casos) ou através de transplantes e alimentos processados (CHAGAS, 1909; WORLD..., 2017b). De acordo com a OMS, entre 6 a 7 milhões de pessoas estão infectadas no mundo, principalmente na América Latina onde a doença de Chagas é endêmica (WORLD..., 2017b). Desde o ponto de vista morfológico, no hospedeiro mamífero, o T. cruzi encontra-se no sangue na forma tripomastigota sanguínea, já no sistema reticuloendotelial ou sistema mononuclear fagocitário e nos tecidos adapta-se à forma amastigota intracelular, enquanto que no inseto vetor, apresenta-se na forma epimastigota e tripomastigota metacíclicas (PEREIRA; PEREZ, 2003). Durante o repasto sanguíneo, o triatomíneo contaminado com T. cruzi defeca próximo ao local da picada e as formas tripomastigotas metacíclicas, presentes nas fezes, atingem a corrente sanguínea do hospedeiro vertebrado pelo orifício da picada (PEREIRA; PEREZ, 2003). O T. cruzi é capaz de invadir e multiplicar-se dentro de diferentes tipos de células, incluindo macrófagos, músculos lisos e estriados, fibroblastos e neurônios (COURA; CASTRO, 2002). Nas células os tripomastigotas metacíclicos se diferenciam em formas amastigotas, capazes de replicação. Essas formas diferenciam-se em formas tripomastigotas sanguíneas e se disseminam pelo organismo, invadindo outras células. O ciclo de vida do parasito se fecha quando um triatomíneo adquire as formas tripomastigotas ao picar um hospedeiro vertebrado contaminado. No intestino posterior do vetor essas formas se diferenciam em epimastigotas, capazes de multiplicação e na ampola retal, os parasitos se diferenciam em formas tripomastigotas metacíclicas, que são liberadas nas fezes, figura 3 (PEREIRA; PEREZ, 2003). 34 Figura 3- Ciclo de vida do Trypanosoma cruzi. Fonte: adaptado de Centers...(2016a) A sintomatologia da doença de Chagas é variada, igual as lesões que produz, apresentando-se duas fases, a fase aguda e a crônica (PEREIRA; PEREZ, 2003). A fase aguda geralmente apresenta dois meses após a infeção e caracteriza-se por febre, dor de cabeça, edema (sinal de Romaña), gânglios linfáticos aumentados, palidez, dor muscular, dificuldade em respirar, inchaço e dor abdominal ou torácica (PEREIRA; PEREZ, 2003; WORLD..., 2016b), na ausência específica de tratamento os sintomas persistem com uma mortalidade de 2 a 8%, especialmente em crianças (COURA; CASTRO, 2002). A fase crônica da doença se manifesta depois de um longo período assintomático após a recuperação da fase aguda (PEREIRA; PEREZ, 2003). Na fase crônica, os parasitos estão principalmente nos músculos cardíaco e digestivo. Até 30% dos pacientes sofrem de doenças cardíacas (miocardite) e até 10% sofrem de doenças digestivas (normalmente alargamento do esôfago ou do cólon, hiperplasia de intestino), doenças neurológicas ou alterações mistas. Nos anos posteriores, a infecção pode levar à morte súbita ou insuficiência cardíaca causada pela 35 destruição progressiva do músculo cardíaco e seu sistema nervoso (BARRETT; CROFT, 2012; WORLD..., 2017b). Assim como no caso da co-infeção de leishmanioses em pacientes com AIDS, existe uma elevada porcentagem de associação entre AIDS e doença de Chagas, o que leva a um aumento da mortalidade (PEREIRA; PEREZ, 2003). Portanto, é preciso tecer alguns comentários sobre a terapêutica atualmente disponível para o tratamento da doença de Chagas, pois do ponto de vista de descoberta de novos fármacos, esta doença, assim como as leishmanioses, também é considerada negligenciada. Programas de screening para novos agentes bioativos podem levar em consideração moléculas com amplo espectro de ação para potencial uso dos mesmos no controle de várias doenças, levando a um ganho de tempo e investimento financeiro. Deste modo, resumidamente, descrevemos como a terapêutica da doença de Chagas ainda é problemática. A terapêutica da doença de Chagas limita-se, até o momento, aos medicamentos nifurtimox (Lampit®, Bayer) e benzonidazol (Rochagan®, Roche). O primeiro, depois de amplamente utilizado no Brasil e países latino-americanos, foi retirado do mercado farmacêutico brasileiro, e depois em Argentina, Chile e Uruguay, restando apenas o benzonidazol (COURA; CASTRO, 2002). Os resultados obtidos com os dois fármacos variam de acordo com a fase da doença, o período de tratamento e da dose, da idade e da origem geográfica dos pacientes. Bons resultados foram alcançados na fase aguda, em infecção crónica recentes (crianças menores de 12 anos de idade), infecção congenita e acidentes laboratoriais (COURA; CASTRO, 2002), no entanto, quanto mais tempo de infecção tem a pessoa, a eficácia de ambos os medicamentos diminui (WORLD..., 2017b). Benzonidazol e nifurtimox não devem ser administrados a mulheres grávidas ou pessoas com insuficiência renal ou hepática. Também o nifurtimox é contra-indicado para pessoas com histórico de distúrbios neurológicos ou psiquiátricos. Além disso, o tratamento específico de manifestações cardíacas ou digestivas pode ser necessário (PEREIRA; PEREZ, 2003; WORLD...,2017b). 36 Figura 4- Fármacos utilizados no tratamento da doença de Chagas: A) benzonidazol, B) nifurtimox. Fonte: Barrett e Croft (2012) Apesar da sua atividade tripanocida, o benzonidazol pode causar várias reações colaterais, caracterizadas por dermatites, depressões da medula óssea e polineuropatia periférica (COURA; CASTRO, 2002), além de ter uma administração prolongada (entre 60 a 90 dias) (BARRETT; CROFT, 2012; PEREIRA; PEREZ, 2003). Para observar o potencial tripanocida do nifurtimox doses prolongadas (90 dias em adultos em forma de comprimidos) devem ser proporcionadas (BARRETT; CROFT, 2012). Estas terapias prolongadas levam muitas vezes a interrupção do tratamento por parte do paciente, propiciando o surgimento de cepas resistentes que aumentam a ineficácia da terapêutica, o que indica a necessidade de desenvolvimento de novos fármacos. Adicionalmente, a descoberta de novos fármacos para a doença de Chagas está cheio de dificuldades, principalmente porque os pacientes que entram no estágio indeterminado são assintomáticos e entonces surge a dificuldade de detectar os parasitos, portanto, se faz difícil avaliar a eficácia em infecções crônicas precoces (BARRETT; CROFT, 2012). 1.3 T. brucei e o tratamento atualmente disponível para a doença do sono A doença do sono ou tripanossomíase africana é transmitida por dípteros do gênero Glossina conhecidos como moscas tsé-tsé. Descoberta por David Bruce na África em 1894, a doença é causada no homem pelas subespécies T. brucei gambiense e T. brucei rhodesiense, sendo os parasitos T. brucei brucei, associados à doença em animais, a qual é denominada Nagana (COX, 2004). A OMS relata que 95% dos casos da doença do sono são causadas pelo T. b. gambiense. No homem a doença apresenta dois estágios distintos. No estágio I os parasitos se multiplicam no sangue e linfa e os sintomas principais são febre e dores nas articulações. No estágio II, os parasitos atravessam a barreira hemato-encefálica causando perturbações neurológicas. De acordo com o reporte da OMS, para 2015, se apresentaram 37 menos de 3.000 casos da doença, sendo que 61 milhões de pessoas vivem em áreas de risco em 36 paises da África (WORLD..., 2017c). Após a picada do hospedeiro pela mosca, os tripanossomos metacíclicos são inoculados na corrente sanguínea e se diferenciam na forma tripomastigota sanguínea, multiplicando-se por fissão binária e se espalhando pela corrente sanguínea, podendo atingir o sistema nervoso central (SNC). Na fase crônica da doença, os tripomastigotas presentes no SNC multiplicam- se e passam ao cérebro (PEREIRA; PEREZ, 2003). Outra mosca pode picar o hospedeiro ingerindo formas tripomastigotas sanguíneas e então se contaminando. As formas tripomastigotas diferenciam-se em formas procíclicas dentro da mosca e logo em epimastigotas, que se multiplicam na glândula salivar do inseto. Em seguida, essas formas diferenciam-se em tripomastigotas metacíclicas e o ciclo se inicia novamente (figura 5). Figura 5- Ciclo de vida do Trypanosoma brucei. Fonte: adaptado de Centers... (2016c) 38 Para o tratamento no primeiro estágio da doença, utiliza-se a pentamidina contra T. b. gambiense e a suramina que possui atividade preferencialmente sobre T. b. rhodesiense. A pentamidina provoca toxicidade significativa em pelo menos metade dos pacientes e tornam- os insulino-dependentes, e a suramina produz uma diversidade de efeitos colaterais entre os quais se destacam complicações neurológicas e toxicidade renal (JACOBS; NARE; PHILLIPS, 2011). Figura 6- Fármacos utilizados no tratamento da doença do sono: A) eflornitina, B) melarsoprol, C) suramina e D) pentamidina. Fonte: Barrett e Croft (2012) O principal problema com o tratamento da doença do sono está no estágio II, em que os tripanossomos residem no fluido cérebro-espinhal. Neste estágio, os fármacos para o tratamento da doença precisam cruzar a barreira hematoencefálica, sendo só o melarsoprol (composto altamente tóxico baseado em arsênio) que possui esta característica (NOK, 2003), ainda, o melarsoprol é a única opção terapêutica para a doença devido a infeção por T. b. rhodesiense, embora para a maioria dos casos (>95% dos casos são pelo T. b. gambiense) a eflornitina tornou-se o tratamento de primeira escolha (BARRETT; CROFT, 2012). A nova combinação terapêutica da droga oral nifurtimox com o uso intravenoso da eflornitina é mais efetiva quando comparada com as monoterapias convencionais, contudo muitos efeitos adversos têm sido relatados (BABOKHOV et al., 2013). Além do alto custo, 39 estes fármacos são altamente tóxicos e escassos; o tratamento é potencialmente perigoso e limitado, devido a que precisa da internação do paciente para sua aplicação, e os parasitos apresentam resistência generalizada aos medicamentos (BARRETT; CROFT, 2012; FIDALGO; GILLE, 2011; NOK, 2003; STICH; ABEL; KRISHMA, 2002). 1.4 Compostos metálicos como opções terapêuticas para DNs O problema com relação as DNs é agravado em relação à disponibilidade de medicamentos, já que as atividades de pesquisa e desenvolvimento das indústrias farmacêuticas são principalmente orientadas pelo lucro, e o retorno financeiro exigido dificilmente pode ser alcançado no caso de doenças que atingem populações marginalizadas, pobres, sem influência política e localizadas, majoritariamente, nos países em desenvolvimento (TROUILLER et al., 2002). A descoberta da atividade antineoplásica da cisplatina e seu consequente desenvolvimento clínico, chamou a atenção para as propriedades quimioterápicas de complexos contendo metais de transição coordenados a diferentes ligantes. Muitos destes complexos metalicos com conhecida ação antitumoral tem sido testados para tratamento de diversas DNs. Especificamente, há muito são explorados para a descoberta de novos agentes anti-Trypanosomatidae, incluindo complexos de metais de ouro, platina, irídio, ródio, ósmio, ferro, platina e paládio (CROFT et al., 1992; FRANCO et al., 2013; FRICKER et al., 2008; MATSUO et al., 2010; NAVARRO et al., 2010; NAVARRO; BETANCOURT, 2008; PALADI et al., 2012; SÁNCHEZ-DELGADO; ANZELLOTTI, 2004; SANTOS et al., 2012; VELÁSQUEZ et al., 2016, 2014; ZINSSTAG et al., 1991). Complexos baseados em ródio(I), ródio(III) e ródio(IV), assim como antimônio(III) e ósmio(III) mostraram ação leishmanicida frente a L. donovani. Outra classe de complexos organometálicos derivados da platina também tem apresentado atividade leishmanicida frente a formas promastigotas e amastigotas deste parasito, assim como combinações platina-pentamidina, que se tem mostrado extremamente potentes. Na maioria dos casos, estes compostos mostram-se como intercalantes da dupla fita do DNA no parasito (SHARMA; PIWNICA-WORMS, 1999). Devido a importância de desenvolver fármacos que inibam alvos moleculares que sejam absolutamente necessários para a sobrevivência do parasito, muitos compostos anticancer e complexos metálicos tem sido utilizados para avaliar seu potencial bioativo contra protozoarios, bem como seus possíveis mecanismos de ação. 40 A inserção de centros metálicos nas estruturas de fármacos antiparasitários são utilizados para aumentar a suas acções farmacológicas, como é o caso da ferroquina (NAVARRO et al., 2010). Para a atividade tripanocida, destaca-se o trabalho (FARRELL; WILLIAMSON; McLAREN, 1984) que relacionou uma ação anti-T. cruzi tão boa quanto a antitumoral de compostos quimioterápicos de platina, como a cisplatina e a carboplatina. A elevada analogia entre a química de coordenação dos compostos de platina(II) e paládio(II) abriu o caminho para a utilização de complexos de paládio(II) como fármacos antitumorais (ANILANMERT, 2012). Um fator importante que pode explicar a razão pela qual a platina é mais utilizada, vem da cinética de troca de ligante. A hidrólise dos ligantes de partida em complexos de paládio é demasiado rápida: 105 vezes mais rápida em comparação com seus correspondentes análogos de platina. Eles se dissociam prontamente em solução levando a espécies muito reativas que são incapazes de alcançar seus alvos farmacológicos. Isto implica que, se um fármaco antitumoral de paládio for desenvolvido, deve de alguma forma ser estabilizado por um ligante de nitrogênio fortemente coordenado e um grupo de saída adequado. Se este grupo for razoavelmente não lábil, o fármaco pode manter a sua integridade estrutural in vivo por tempo suficiente. Como alternativa para aumentar a estabilidade dos complexos de paládio(II), dois quelatos formando dois anéis em torno do átomo central são utilizados (ANILANMERT, 2012). O uso de compostos ciclopaladados foi postulado como alternativa a fármacos contendo platina (ALBERT et al., 2014); além disso, eles são mais estáveis e menos tóxicos que outros derivados de Pd(II) (MATSUO et al., 2010), devido a que eles formam quelatos estáveis, que do ponto de vista de desenvolvimento de fármacos é interessante, devido à elevada estabilidade termodinâmica e cinética (CAIRES et al., 1999). 1.4.1 Compostos de Paládio e seu potencial anti-protozoário Dentre estas opções, foi demonstrada a bioatividade de ciclopaladados contra formas promastigotas e amastigotas de L. amazonensis em concentrações que não são tóxicas para o hospedeiro (PALADI et al., 2012) bem como a atividade tripanocida (FRICKER et al., 2008; MATSUO et al., 2010), apontando estas moléculas como promissoras para o tratamento de leishmanioses e doença de Chagas. Entre os efeitos antitumorais reportados pelos compostos de paládio destaca-se sua capacidade de se intercalar ao DNA, também, mostram interessante inibição enzimática, a 41 qual é um dos principais modos de ação de compostos inorgânicos (NAVARRO et al., 2010; NAVARRO; BETANCOURT, 2008). Dados da literatura mostram que complexos ciclopaladados em células tumorais interagem com grupos tióis de proteínas da membrana mitocondrial, causando dissipação do potencial da membrana, induzindo incremento na concentração do cálcio citosólico, principalmente de compartimentos intracelulares o que levaria a célula tumoral a ativação de caspases efetoras, condensação da cromatina e degradação do DNA, sugerindo que esta classe de compostos ativam a via apoptótica intrínseca (SERRANO et al., 2011). Em fungos tem-se mostrado como indutores de morte celular programada (MCP), produzindo uma série de efeitos como condensação da cromatina, degradação do DNA, produção de ânion superóxido e incremento da atividade de metacaspases associados com o processo de apoptose, adicionalmente mecanismos de morte associados com autofagia como aparecimento de vacúolos autofágicos e acidificação (ARRUDA et al., 2015). Em tripanossomatídeos, a cruzipaina, a principal cisteino protease encontrada em T. cruzi, é um alvo validado para o desenvolvimento de quimioterápicos contra a doença de Chagas, sendo que neste caso complexos ciclometalados de Pd(II) mostraram interessante ação inibitória frente a esta enzima (FRICKER et al., 2008). Reporta-se também que o mecanismo de ação destes compostos em estes parasitos pode ser devido a produção de estresse oxidativo como resultado de sua bioredução e extensivo ciclo redox (ELGAZWY et al., 2012; OTERO et al., 2006), no entanto, seus alvos moleculares não foram definidos. Alguns relatos na literatura indicam que diferentes complexos metálicos possam inibir DNAs topoisomerases do tipo I ou II (CASINI et al., 2009; CASTELLI et al., 2012; NEVES; VARGAS, 2011; WU; YALOWICH; HASINOFF, 2011). 1.5 As DNAs topoisomerases e seu potencial como alvo terapêutico Um passo importante para a descoberta de um novo fármaco especifico em Leishmania é identificar o alvo molecular adequado. Alvos em potencial podem ser proteínas codificadas por genes presentes apenas no genoma do parasito, que sejam absolutamente necessários para a sobrevivência do mesmo ou que sejam consideravelmente diferentes de seus homólogos humanos (CHAWLA; MADHUBALA, 2010). Dentro desta perspectiva, os tripanossomatídeos apresentam uma série de novidades biológicas atrativas para o desenvolvimento de fármacos. Leishmanias e tripanossomas compartilham muitos genes ortólogos que divergem do hospedeiro mamífero (EL-SAYED et al., 2005), característica 42 importante para o desenvolvimento de fármacos com amplo espectro de ação, evitando-se efeitos colaterais indesejáveis. Nesse sentido as DNAs topoisomerases (DNATopo) tem sido exploradas como alvos para desenvolvimento de fármacos contra doenças parasitárias (CHAWLA; MADHUBALA, 2010). DNATopos estão envolvidas em vários processos vitais em cinetoplastídeos tais como replicação, transcrição, recombinação e reparo do DNA (CHAWLA; MADHUBALA, 2010; D’ANNESSA; CASTELLI; DESIDERI, 2015; DAS et al., 2004). De acordo com Bratta Das et al. 2004, esta enzima está localizada tanto no núcleo quanto no cinetoplasto (DAS et al., 2004). Devido à importância destas enzimas na viabilidade do parasito e sua diferença com sua homóloga humana, são consideradas como alvo terapêutico importante (D’ANNESSA; CASTELLI; DESIDERI, 2015). Devido à natureza superespiralada do DNA e seu empacotamento, precisa-se de formas mais relaxadas para que aconteçam processos como a replicação, recombinação ou reparo, em vista que formas mais relaxadas do DNA permitem o acesso de polimerases, fatores de transcrição ou proteínas de reparo, sendo então as DNAs topoisomerases, as enzimas responsáveis pelo relaxamento do DNA super-enovelado, produzindo a quebra de uma ou ambas as fitas da dupla hélice. As DNATopos estão classificadas em dois tipos, as DNATopo I (TopoI, subtipos 1A e 1B) são enzimas independentes de ATP que produzem a quebra de uma das fitas do DNA e as DNATopo II (TopoII) são proteínas multiméricas que produzem a quebra de ambas as fitas do DNA precisando de ATP (BALAÑA-FOUCE et al., 2014). As TopoI foram isoladas de L. donovani (CHAKRABORTY; GUPTA; MAJUMDER, 1993), T. cruzi (RIOU et al., 1983) e T. brucei (BODLEY et al., 2003), e caracterizadas em L. donovani e T. cruzi (BROCCOLI et al., 1999; CHAKRABORTY; GUPTA; MAJUMDER, 1993; D’ANNESSA; CASTELLI; DESIDERI, 2015; RIOU et al., 1983). A DNA Topo1B de Leishmania possui uma estrutura/função diferente da Topo1B humana (hTopoI), sendo única em eucariotos (D’ANNESSA; CASTELLI; DESIDERI, 2015). A hTopoI é uma enzima monomérica composta de 765 resíduos de aminoácidos, enquanto que a DNA Topo 1B de L. donovani (LdTopo1B) é expressa por dois genes diferentes, produzindo um heterodímero, onde a primeira subunidade consta de 635 aminoácidos, denominada de subunidade maior, e a segunda, 262 resíduos de aminoácidos, denominada de subunidade menor, figura 7, o qual contem o resíduo catalítico de Tyr (BALAÑA-FOUCE et 43 al., 2014; DAVIES et al., 2006). Os genes que codificam para estas proteínas estão localizados em cromossomos diferentes no genoma da Leishmania (BALAÑA-FOUCE et al., 2014). Figura 7- Estrutura da DNA topo 1B humana (hTopoI) vs. a DNA topo 1B de L. donovani (LdTopo1B). LdTopo1B está composta por duas subunidades a LdTOP1L o maior e LdTOP1S ou menor. Fonte: Davies et al. (2006) Tanto as TopoI quanto as TopoII são alvos moleculares importantes para fármacos antineoplásicos em humanos. Inibidores da Topo1B como o topotecan (derivado da camptotecina - CPT) e o irinotecan, são normalmente utilizadas para o tratamento de carcinoma de ovário e câncer colorectal, respectivamente (BALAÑA-FOUCE et al., 2014). Os primeiros inibidores da DNA Topo1B de tripanossomatídeos pertencem à família das CPT (DAS et al., 2004). A CPT é um fármaco antitumoral, capaz de aumentar os níveis de EROs (Espécies Reativas de Oxigênio) e, como consequência, promover o processo de peroxidação lipídica das membranas causando vazamento das membranas com consequente influxo de Ca2+ ao citosol (TAGLIARINO, 2001), em Leishmania o mesmo mecanismo é observado como consequência da liberação do Ca2+ a partir do retículo endoplasmático (RE) e a mitocôndria (SEN et al., 2004a, 2004b). Outros inibidores da atividade da Topo1B incluem compostos leishmanicidas como o antimonial pentavalente, estibogluconato de sódio e a ureia estibamina (DAS et al., 2004; DAVIES et al., 2006). CPTs promovem a morte de tripanossomos e Leishmanias (BODLEY; SHAPIRO, 1995) enquanto derivados de CPT, incluindo topotecan ou irinotecan, apresentam uma eficácia reduzida em T. brucei, provavelmente devido ao baixo grau de permeação destes dois 44 derivativos hidrofílicos no parasito (DETERDING et al., 2005). O efeito do derivado gimatecan foi avaliado em L. infantum mostrando que o composto é eficaz, promovendo a morte do parasito e a Topo1B foi identificada como alvo de ação dessa molécula (PRADA et al., 2013). Resumidamente, gimatecan provocou diminuição na atividade de religação da enzima recombinante e alterou o equilíbrio favorável à clivagem do DNA. Este efeito é persistente e interfere no crescimento de promastigotas de L. infantum (PRADA et al., 2013). Os flavonóides baicaleina, luteolina e quercetina também foram capazes de bloquear a atividade de religação da LdTopo1B (DAS et al., 2006). Betulina é um triterpeno natural isolado de Betula spp., uma planta que apresenta uma série de atividades farmacológicas. Três derivados betulínicos, betulina disuccinil, diidrobetulina diglutarl e diidrobetulina disuccinil, foram testadas e mostraram atividade inibitória do processo de relaxamento do DNA, sendo o efeito mais forte quando os compostos são pré-incubados com a LdTopo1B. De fato, diferentemente de CPT, os três derivados betulínicos parecem agir impedindo a formação do complexo proteína-DNA através de uma interação direta com a enzima (CHOWDHURY et al., 2011). Indenoisoquinolinas correspondem a uma classe de moléculas sintéticas desenvolvidas contra DNA Top1B humana (CASTELLI et al., 2012). Dois destes compostos, indotecan (LMP400) e AM13-55 foram testados contra a enzima de L. infantum, apresentando resultados positivos. Ensaio de relaxamento e clivagem, utilizando DNA superenrolado como substrato, foi realizado in vitro na presença dos dois compostos, mostrando que eles são capazes de promover a formação do complexo de clivagem comparável a CPT e que ambos são mais efetivos contra a enzima parasitária em detrimento da correspondente humana. Experimentos realizados com macrófagos murinos infectados com L. infantum e tratados com indotecan ou AM13-55 mostraram atividade anti-amastigota (BALAÑA-FOUCE et al., 2012). Entre outros inibidores conhecidos das Topo1B de tripanossomatídeos, destacam-se os antimoniais pentavalentes (CHAKRABORTY; MAJUMDER, 1988), utilizados no tratamento das leishmanioses. Outros compostos baseados em metais e com atividade inibitória frente a estas enzimas são compostos ciclometalados de Au(III) que foram reportados por apresentar propriedades anticancerígenas devido à redução da atividade catalítica da hTopo1B pela inibição direita da enzima, isto é, evita a interação da enzima com o DNA, diferente da ação produzida pela CPT (CASTELLI et al., 2011). Adicionalmente, complexos de platina(II) se 45 mostraram como inibidores de TopoI em células tumorais (NEVES et al., 2013) e o cádmio como inibidor catalítico da TopoII (WU; YALOWICH; HASINOFF, 2011). Os inibidores de topoisomerases são classificados como (a) inibidores classe I ou “venenos enzimáticos” que são os compostos que estabilizam o complexo transitório de clivagem com o DNA, e (b) inibidores de classe II ou "inibidores verdadeiros" que são aqueles compostos que interferem nas funções catalíticas da enzima sem reter o complexo covalente da enzima com a cadeia clivada do DNA (BALAÑA-FOUCE et al., 2014). Se são desenhados compostos que se apresentem como inibidores específicos destas enzimas, podería-se interferir com os processos de replicação, transcrição, recombinação e/ou reparo do DNA, que são vitais para tripanossomatídeos, e está inibição poderia levar a morte celular dos parasitas causadores das doenças citadas neste trabalho, figura 8. Em vista da importância deste alvo terapêutico e vislumbrando o potencial leishmanicida de alguns dos compostos ciclopaladados testados neste trabalho, se estabeleceu uma colaboração com o professor Dr. Alessandro Desideri do laboratório de Biologia Estrutural da Universidade de Roma “Tor Vergata”, para o acompanhamento do ensaio de relaxamento de DNA. Avaliando-se o potencial da atividade biológica frente a ensaios de inibição da topoisomerase de L. donovani (LdTopo1B). Estes ensaios são fundamentais para definir a classe de inibidor que os compostos ciclopalados em estudo são, o que em futuros estudos de docking podería contribuir para o melhoramento da estrutura da molécula aumentan