UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” INSTITUTO DE QUÍMICA CAMPUS DE ARARAQUARA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA ESTUDO DA OXIDAÇÃO DE COVELITA (CuS) E MOLIBDENITA (MoS2) SINTÉTICAS POR Acidithiobacillus ferrooxidans WILMO ERNESTO FRANCISCO JUNIOR Araraquara 2006 WILMO ERNESTO FRANCISCO JUNIOR Estudo da oxidação de covelita (CuS) e molibdenita (MoS2) sintéticas por Acidithiobacillus ferrooxidans Dissertação de Mestrado apresentada ao Instituto de Química – Campus de Araraquara da Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Biotecnologia. Orientador: Prof. Dr. Oswaldo Garcia Júnior Co-Orientadora: Dra. Denise Bevilaqua Araraquara 2006 FICHA CATALOGRÁFICA Francisco Junior, Wilmo Ernesto F818e Estudo da oxidação de covelita (CuS) e molibdenita (MoS2) sintéticas por Acidithiobacillus ferrooxidans / Wilmo Ernesto Francisco Junior. – Araraquara : [s.n], 2006 67 f. : il. Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual Paulista, Instituto de Química Orientador: Oswaldo Garcia Júnior Co-orientador: Denise Bevilaqua 1. Processo biológico. 2. Biolixiviação. 3. Sulfetos metálicos. 4. Mecanismos de oxidação. I. Título. Elaboração: Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação do Instituto de Química de Araraquara Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação WILMO ERNESTO FRANCISCO JUNIOR Dissertação apresentada ao Instituto de Química, Campus de Araraquara da Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Biotecnologia. Araraquara, 27 de janeiro de 2006. BANCA EXAMINADORA Prof. Dr. Oswaldo Garcia Júnior (Orientador) Instituto de Química – UNESP, Araraquara. Prof. Dr. Assis Vicente Benedetti Instituto de Química – UNESP, Araraquara. Dra. Fernanda de Castro Reis Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética – UNICAMP, Campinas DADOS CURRICULARES 1. DADOS PESSOAIS Nome: Wilmo Ernesto Francisco Junior Nascimento: 25/03/1982 Nacionalidade: Brasileira Naturalidade: Cassilândia – MS Estado Civil: Solteiro Filiação: Pai: Wilmo Ernesto Francisco Mãe: Irene Aparecida Martins de Almeida Francisco Profissão: Químico Carteira de Identidade: 32.625.820-6 SSP/SP Cadastro de Pessoa Física: 224.080.588-99 Endereço profissional: Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, Instituto de Química de Araraquara. Rua Francisco Degni s/nº Departamento de Bioquímica e Tecnologia Química Quitandinha, 14801-970 Araraquara, SP - Brasil Telefone: (16) 33016600 Ramal: 6806 E-mail: wiljr@posgrad.iq.unesp.br Endereço residencial: Rua Princesa Izabel nº 1619-1, Vila Xavier, 14810090, Araraquara, SP - Brasil Telefone: (16) 33228657 E-mail: wilmojr@bol.com.br 2. FORMAÇÃO ACADÊMICA 2.1.Bacharel em Química: Curso de Bacharelado em Química concluído em dezembro de 2003 no Instituto de Química da Universidade Estadual Paulista, UNESP, Campus de Araraquara. 2.2 Licenciado em Química: Curso de Licenciatura em Química concluído em dezembro de 2005 no Instituto de Química da Universidade Estadual Paulista, UNESP, Campus de Araraquara. 2.3. Mestre em Biotecnologia: Curso de Pós-Graduação em Biotecnologia concluído em janeiro de 2006 no Instituto de Química da Universidade Estadual Paulista, UNESP, Campus de Araraquara. 3. PRODUÇÃO BIBLIOGRÁFICA 3.1. Trabalhos completos em anais de eventos 3.1.1. FRANCISCO JUNIOR, Wilmo Ernesto; et al. Uma análise sobre as idéias e a compreensão do fenômeno de condutividade elétrica pelos estudantes. In: V ENCONTRO NACIONAL DE PESQUISA EM EDUCAÇÃO EM CIÊNCIAS, 2005, Bauru. Atas do V ENPEC. 2005. 3.1.2. FRANCISCO JUNIOR, Wilmo Ernesto; et al. Avaliação da Eficiência de Tratamento de Esgotos por Monitoramento de Parâmetros Físico-Químicos. In: IV SIMPÓSIO INTERNACIONAL DE QUALIDADE AMBIENTAL, 2004, Porto Alegre-RS. Anais do IV Simpósio Internacional de Qualidade Ambiental. 2004. 3.2. Resumos simples em anais de eventos 3.2.1. FRANCISCO JUNIOR, Wilmo Ernesto; BEVILAQUA, Denise; GARCIA JÚNIOR, Oswaldo. Avaliação da cinética de oxidação da covelita e molibdenita por Acidithiobacillus ferrooxidans. In: XXIII CONGRESSO BRASILEIRO DE MICROBIOLOGIA, 2005, Santos. Livro de Resumos do XXIII CBM. 2005. 3.2.2. FRANCISCO JUNIOR, Wilmo Ernesto; BEVILAQUA, Denise; GARCIA JÚNIOR, Oswaldo. Oxidação de Uma Amostra Mineral Contendo Molibdenita, Pirita e Pirrotita por Acidithiobacillus ferrooxidans. In: XXIII CONGRESSO BRASILEIRO DE MICROBIOLOGIA, 2005, Santos. Livro de Resumos do XXIII CBM. 2005. 3.2.3. DOCHI, Roberto Seij i; FRANCISCO JUNIOR, Wilmo Ernesto. Um Experimento de óxido-redução com materiais do dia-a-dia: Uma Abordagem Multidisciplinar. In: III EVENTO DE EDUCAÇÃO EM QUÍMICA, 2005, Araraquara. Livro de Resumos do III EVEQ/ II EPPEQ. 2005. 3.2.4. FRANCISCO JUNIOR, Wilmo Ernesto; et al. Condutividade Elétrica: Uma prática Interdisciplinar entre Química e Física. In: XII ENCONTRO NACIONAL DE ENSINO DE QUÍMICA, 2004, Goiânia-GO. CD-Room de Resumos do XII ENEQ. 2004. 3.2.5. FRANCISCO JUNIOR, Wilmo Ernesto; et al. O Ensino de Química Frente os Parâmetros Curriculares Nacionais: Uma visão das Escolas Públicas de Araraquara-SP. In: XII ENCONTRO NACIONAL DE ENSINO DE QUÍMICA, 2004, Goiânia-GO. CD-Room de Resumos do XII ENEQ. 2004. 3.2.6. FRANCISCO JUNIOR, Wilmo Ernesto; BEVILAQUA, Denise; GARCIA JÚNIOR, Oswaldo. Oxidação Microbiológica de Molibdenita Contendo Pirita e Pirrotita Analisada por Difratometria de Raios-X. In: XLIV CONGRESSO BRASILEIRO DE QUÍMICA, 2004, Fortaleza-CE. CD de Resumos do XLIV CBQ. 2004. 3.2.7. FRANCISCO JUNIOR, Wilmo Ernesto; SOUZA, Rodrigo Alves de; DOCHI, Roberto Seiji. Uma Estratégia Alternativa nas Aulas de Química e Física em Cursinhos Populares. In: XLIV CONGRESSO BRASILEIRO DE QUÍMICA, 2004, Fortaleza-CE. CD de Resumos do XLIV CBQ. 2004. 3.2.8. FRANCISCO JUNIOR, Wilmo Ernesto; BEVILAQUA, Denise; GARCIA JÚNIOR, Oswaldo. Estudo Cinético da Oxidação da Molibdenita por Acidithiobacillus ferrooxidans. In: XIV ENCONTRO REGIONAL ARARAQUARA - SÃO CARLOS - RIBEIRÃO PRETO DA SOCIEDADE BRASILEIRA DE QUÍMICA, 2003, São Carlos-SP. Livro de Resumos do XIV SBQ-Regional. 2003. p. 14-14. 3.2.9. FRANCISCO JUNIOR, Wilmo Ernesto; GARCIA JÚNIOR, Oswaldo. Oxidação da Molibdenita por Acidithiobacillus ferrooxidans. In: 11º SIMPÓSIO INTERNACIONAL DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA DA UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO, 2003, São Carlos-SP. CD de Resumos do 11º SIICUSP. 2003. 3.2.10. FRANCISCO JUNIOR, Wilmo Ernesto; BEVILAQUA, Denise; GARCIA JÚNIOR, Oswaldo. Oxidação Direta da Molibdenita por Acidithiobacillus ferrooxidans. In: XLIII CONGRESSO BRASILEIRO DE QÍMICA, 2003, Ouro Preto-MG. Livro de Resumos do XLIII CBQ. 2003. p. 599-599. 3.3. Artigos completos publicados em periódicos 3.3.1. FRANCISCO JUNIOR, Wilmo Ernesto; DOCHI, Roberto Seiji. Um Experimento Simples Envolvendo Óxido-Redução e Diferença de Pressão com Materiais do Dia-a-Dia. Química Nova na Escola (no prelo), São Paulo, 2006. 3.3.2. FRANCISCO JUNIOR, Wilmo Ernesto; et al. Um Projeto de Extensão Universitária na Pesquisa do Ensino de Química. Enciclopédia Biosfera, 2005. 3.3.3. FRANCISCO JUNIOR, Wilmo Ernesto; et al. Monitoramento de Parâmetros Físico- Químicos Para Avaliação da Eficiência e dos Impactos Ambientais de uma Estação de Tratamento de Esgotos. Anais da Associação Brasileira de Química, São Paulo, v. 52, n. 3, p. 135-138, 2003. 3.4. Artigos resumidos publicados em periódicos 3.4.1. FRANCISCO JUNIOR, Wilmo Ernesto; et al. A Extensão Universitária Auxiliando a Formação dos Químicos. Rev. Ciênc. Ext., São Paulo, v. 1, n. 1 (supl.), p. 248-248, 2004. 3.4.2. AMBRÓSIO JÚNIOR, José Roberto; et al. Grupo PET-Química e Extensão Universitária: Ações Internas. Rev. Ciênc. Ext., São Paulo, v. 1, n. 1 (supl.), p. 115-115, 2004. Em memória de Geni de Oliveira Francisco e José Martins de Almeida. Nem sempre nossas vidas serão perfeitas ou todas nossas vontades serão satisfeitas, mas, nunca paremos de lutar pelo que ensejamos conquistar, pois quando estivermos mortos não poderemos mais. Wilmo Dedico Aos meus pais. Com zelo e amor possibilitaram minha formação como ser humano e profissional. A vocês minha eterna gratidão e meu muito obrigado. Dedico Ao meu irmão, pela convivência e união, principalmente neste último ano, o que nos tornou amigos antes de tudo. Paradisíaco Os momentos da vida dissipam-se como pássaros a voar Uma energia celeste envolve minh’alma Meus olhos lacrimejam quando me pego a pensar Perdido no espaço, que o tempo não pára, nunca pára de andar A energia reluz trazendo-me a calma Em mim, abre-se um precipício do tamanho do mar Verdes pastos passam num constante acelerar Os pastores montados em seus alazões m’envoltam o trauma Os céus mandam o aviso: A hora está pra chegar As linhas da vida vão se escurecendo em minha palma Uma escuridão!!! E pareço ferver numa sauna Quando os raios de luz me atingem Sinto-me levitar Uma grande sensação de leveza põe-me a decolar As saudades, os temores, as lembranças e as esperanças Somem todas quando chego neste lugar Wilmo. O sol do amanhã O sol do amanhã já está nascendo Toda esperança vem pra dilacerar A tristeza estonteante que nos estava remoendo O brilho chega para nos encher de alegria E para nos fazer esquecer todo mal, todo o sarcasmo Toda escuridão e todo aquele marasmo Que a cada dia nos sucumbia A partir de agora A única validade É erguermos as nossas cabeças triunfantes E nos esquecermos da vaidade Pois deveremos estar escaldantes Para vivermos a cada dia a nossa idade Derrotas e vitórias nos cercarão Haverá vezes que desejaremos nos enterrar nas entranhas O céu e o abismo para nós se abrirão É quando deveremos nocautear a solidão Lembrando que por toda eternidade O sol do amanhã estará nascendo E de algum modo estaremos vencendo Wilmo Ao meu orientador (Doze Estações) Pétalas amareladas se esvaem ao chão Fumaças dissipam-se do pulmão ao coração É outono, eis que surge uma fresta em festa; dedicação Liame de compreensão e autoridade Alvorecer de primavera, aurora de voracidade Girassóis e sóis, a cor do verão Vozes, risos, histórias Inverno, hibernação, Sarcasticamente espontâneo, subterrâneo, engenhoso Farejando e forjando pegadas; modestamente Entre espinhos e pomares; crucialmente Mares aos males aos pares; anteparo Em um e outro despreparo Já se foram quatro outras estações; inexoravelmente O arbusto, a folhagem caída Oito estações, dois verões Pétalas amareladas novamente se esvaem ao chão Fumaças continuam a dissiparem-se do pulmão ao coração Sinta o som O balançar das folhas de uma árvore campestre O balbuciar de um samba encantador Para sempre meu mestre Meu orientador. Agradecimentos Ao professor Oswaldo Garcia Junior, pela orientação segura e incontestável, pela competência, pelo aprendizado e pelo exemplo de pessoa e profissional do qual jamais me esquecerei. À Dra. Denise Bevilaqua, pela ajuda, apoio, aprendizagens e convivência durante estes anos. Ao CNPq pela auxílio financeiro concedido. Aos técnicos Waldenir Aparecido de Menezes e Juliana Pirola Garcia, pelo auxílio, amizade, conversas, conselhos e risos durante todos estes anos. Aos companheiros de grupo e laboratório, Ana Paula, Renata, Cebinho, E.T, Tueio, Teresa, Heloísa, Marina, pela convivência, paciência e amizade, os quais tornaram nosso convívio inesquecível. Aos companheiros do curso de Licenciatura em Química, em especial Daniel, Wolly, Weverton. Aos amigos sempre presentes, Quick, Juliana, Rodrigo, Marcelo, Fabrício, obrigado pelas conversas e cervejas. Aos professores Assis Vicente Benedetti e Dermeval Cararatti de Lima pelas sugestões no Exame Geral de Qualificação. À família “Garra de Águia-Araraquara” em nome do professor Emerson Lavelli Cinti,, pelo aprendizado, amizade, confiança e convivência traduzidos em exemplos de muita determinação e suor durante estes anos, o que contribuiu e contribui imensuravelmente em minha formação humana. Aos demais professores do Instituto de Química que de alguma forma contribuíram com a minha formação. À diretoria da Associação dos Ex-Alunos do IQ, gestão 2004-2005, que fizeram momentos de muito trabalho e suor se transformarem em prazerosos e inesquecíveis. À Ong-Fonte, por permitir-me desenvolver umas das mais prazerosas e nobres atividades humanas existentes, lecionar. Aos colegas do curso de Pós-Graduação, que me ajudaram durante estes anos. Aos colegas do Instituto de Química, em especial à turma 2005 do Bacharelado. Às funcionárias da biblioteca pelo atenção dispensada estes anos. Às funcionárias da Seção de Pós-Graduação por toda a ajuda. Aos demais funcionários do IQ pela ajuda e amizade durante estes anos. SUMÁRIO ÍNDICE DE TABELAS................................................................................................................ i ÍNDICE DE FIGURAS................................................................................................................. ii ÍNDICE DE ABREVIAÇÕES E SIGLAS................................................................................. vi RESUMO..................................................................................................................................... vii ABSTRACT.................................................................................................................................. ix I. INTRODUÇÃO........................................................................................................................ 01 II. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA.............................................................................................. 05 II.1. Acidithiobacillus ferrooxidans................................................................................. 05 II.2. Sulfetos minerais – Covelita e Molibdenita........................................................... 07 II.3. Mecanismos envolvidos na biolixiviação............................................................... 11 II.3.1. Os mecanismos dos polissulfetos e do tiossulfato.................................. 15 II.3.2. As substâncias poliméricas extracelulares e as interações com os sulfetos metálicos........................................................................................................................ 18 III. OBJETIVOS......................................................................................................................... 21 IV. MATERIAIS E MÉTODOS................................................................................................ 22 IV.1. Linhagem bacteriana............................................................................................. 22 IV.2. Amostras minerais................................................................................................. 22 VI.3. Meios de cultura..................................................................................................... 22 VI.3.1. Meio T&K................................................................................................ 22 VI.3.2 Meio 9K..................................................................................................... 23 IV.4. Preparo da suspensão celular................................................................................ 24 VI.5. Dosagem de proteínas total................................................................................... 24 VI.6. Estudos de respirometria celular.......................................................................... 26 V. RESULTADOS E DISCUSSÃO........................................................................................... 31 V.1. Caracterização das amostras por difratometria de Raios-X............................... 31 V.2. Ensaios respirométricos com A. ferrooxidans LR crescido em íon ferroso........ 31 V.3. Estudos da cinética de oxidação da covelita e da molibdenita............................. 40 V. 4. Ensaios respirométricos com A. ferrooxidans LR deficientes em EPS.............. 46 V.5. Ensaios respirométricos com A. ferrooxidans LR crescido em enxofre............. 48 VI. CONCLUSÕES..................................................................................................................... 61 VII. PERSPECTIVAS FUTURAS............................................................................................. 62 VIII. REFERÊNCIAS................................................................................................................. 63 i ÍNDICE DE TABELAS Tabela 1. Plantas comerciais de lix iviação estática em pilhas para cobre................................... 04 Tabela 2. Plantas comerciais de biolixiviação de concentrados de ouro em tanques agitados.... 04 Tabela 3. Taxas de oxidação do A. ferrooxidans LR em covelita e molibdenita para os diferentes tratamentos realizados................... ............................................................................................... 59 ii ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Esquema de uma planta de biolixiviação conduzida sob a forma de pilhas................ 03 Figura 2. Imagem de Microscopia de Forças Atômicas do A. ferrooxidans aderido a superfície de um sulfeto de cobre (BEVILAQUA, 2003)............................................................................ 06 Figura 3. Esquema dos possíveis mecanismos de interação bactéria-substrato envolvidos na biolixiviação dos sulfetos minerais.............................................................................................. 12 Figura 4. Esquema comparativo do mecanismo de biolixiviação via tiossulfato (A) e polissulfetos (B) A.f – A. ferrooxidans; A.t – A. thiooxidans; L.f – Leptospirillum ferrooxidans. (*) passos que podem envolver tanto A.f quanto pelo A.t. (ROHWERDER et al., 2003)............................................................................................................................................ 14 Figura 5. Esquema básico do aparelho de Warburg................................................................... 28 Figura 6. Difratogramas de Raios-X obtidos para a amostra de molibdenita (A) utilizada nos estudos de respirometria com o respectivo do padrão de molibdenita PDF 37-1492 (B)........... 32 Figura 7. Difratogramas de Raios-X obtidos para a amostra de covelita (A) utilizada nos estudos de respirometria com o respectivo do padrão de covelita PDF 6-464 (B)................................... 33 iii Figura 8. Atividade de respiração do A. ferrooxidans LR (500 µg de proteína total) na presença de massas de 100 mg (A), 150 mg (B), 200 mg (C) e 300 mg (D) de covelita como substrato oxidável. Símbolos: (�) inoculado, (�) controle químico ........................................................ 34 Figura 9. Atividade de respiração do A. ferrooxidans-LR (420µg de proteína total) na presença de massas de 100 mg (A), 150 mg (B), 200 mg (C) e 300 mg (D) de molibdenita como substrato oxidável em solução ácida (pH 1.8). Símbolos: (�) inoculado, (�) controle químico........................................................................................................................................ 36 Figura 10. Atividade de respiração do A. ferrooxidans LR (420µg de proteína total) na presença de molibdenita (100 mg) como substrato oxidável em solução ácida (pH 1,8) com diferentes concentrações de Tween 80. A (0,1%), B (0,25%) e C (0,5%). Símbolos: (�) inoculado, (�) controle químico.......................................................................................................................... 38 Figura 11. Atividade de respiração do A. ferrooxidans LR (420 µg de proteína total) na presença de massas de 20 mg (A), 50 mg (B), 100 mg (C), e 200 mg (D) de molibdenita como substrato oxidável em solução ácida (pH 1,8) de Tween 80 (0,5%). Símbolos: (�) inoculado, (�) controle químico........................................................................................................................................ 39 Figura 12. Curva da velocidade inicial de oxidação em função da massa de covelita......................................................................................................................................... 43 iv Figura 13. Curva da equação de Hill linearizada para o sulfeto de cobre covelita......................................................................................................................................... 43 Figura 14. Curva de Michaelis-Menten (A) e o respectivo gráfico de duplo recíproco de Linewaver-Burk (B) para a molibdenita. .................................................................................... 45 Figura 15. Atividade de respiração do A. ferrooxidans-LR deficiente em EPS (525 µg de proteína total) na presença de massas de 100 mg (A) e 200 mg (B) de covelita como substrato oxidável. Símbolos: (�) inoculado, (�) controle químico.......................................................... 47 Figura 16. Atividade de respiração do A. ferrooxidans-LR deficiente em EPS (525 µg de proteína total) na presença de massas de 100 mg (A) e 200 mg (B) de molibdenita como substrato oxidável em solução ácida (pH 1.8) de tween 80 (0,5%). Símbolos: (�) inoculado, (�) controle químico........................................................................................................................................ 47 Figura 17. Variação do pH durante o crescimento do A. ferrooxidans LR em enxofre elementar...................................................................................................................................... 50 Figura 18. Atividade de respiração do A. ferrooxidans LR crescido em S0 (262 µg de proteína total) na presença de massas de 100 mg (A) e 200 mg (B) de molibdenita como substrato oxidável em soluça ácida (pH 1.8) de tween 80 (0,5%). Símbolos: (�) inoculado, (�) controle químico........................................................................................................................................ 51 v Figura 19. Atividade de respiração do A. ferrooxidans LR crescido em S0 (262 µg de proteína total) na presença de massas de 100 mg (A) e 200 mg (B) de covelita como substrato oxidável. Símbolos: (�) inoculado, (�) controle químico......................................................................... 51 Figura 20. Atividade de respiração do A. ferrooxidans LR crescido em S0 (262 µg de proteína total) na presença de molibdenita (100 mg) como substrato oxidável em solução ácida (pH 1.8) de tween 80 (0,5%) com suplementação de 120 mMol L-1 de Fe3+. Símbolos: (�) inoculado, (�) controle químico.......................................................................................................................... 52 Figura 21. Oxidação da covelita (100 mg) sob diferentes concentrações de ácido sulfúrico. Símbolos: (�) 10 Mol L-1, (�) 2 Mol L-1, (∇) 1 Mol L-1........................................................... 55 Figura 22. Atividade de respiração do A. ferrooxidans LR crescido em S0 (262 µg de proteína total) na presença do sobrenadante de lixiviação ácida da covelita............................................. 56 Figura 23. Difratograma de Raios-X obtido para o resíduo de lixiviação ácida da covelita após 48 horas........................................................................................................................................ 57 Figura 24. Atividade de respiração do A. ferrooxidans LR crescido em S0 (262 µg de proteína total) na presença de enxofre (32,6 mg) como substrato oxidável em solução ácida (pH 1.8)............................................................................................................................................... 58 vi ÍNDICE DE ABREVIAÇÕES E SIGLAS A. ferrooxidans – Acidithiobacillus ferrooxidans A. ferrooxidans LR – linhagem bacteriana de Acidithiobacillus ferrooxidans isolada de Lagoa Real (BA) A. f. – Acidithiobacillus ferrooxidans A. thiooxidans – Acidithiobacillus thiooxidans ppm – Partes por milhão EPS – Substâncias poliméricas extracelulares Kps – Constante de produto de solubilidade Km – Constante de Michaelis-Menten Vmax – Velocidade máxima vii RESUMO A lixiviação bacteriana, ou biolixiviação é um processo biotecnológico que se fundamenta na utilização de microorganismos capazes de solubilizar metais pela oxidação de sulfetos metálicos, sendo nos dias atuais, uma das mais importantes alternativas para a extração de metais, sobretudo do ponto de vista ambiental e econômico. Uma das principais espécies utilizada neste processo é o Acidithiobacillus ferrooxidans, uma bactéria aeróbia, mesofílica e acidofílica, que obtém energia pela oxidação de substratos inorgânicos, basicamente o íon ferroso e compostos reduzidos de enxofre. Todavia, a interação dessa espécie com os sulfetos metálicos é um assunto ainda pouco entendido e de muita controvérsia na literatura. Com intuito de melhor entender estas diferenças, o presente trabalho estudou a oxidação da molibdenita (MoS2) e da covelita (CuS) pelo A. ferrooxidans linhagem LR em algumas condições fisiológicas, destacando-se a fonte energética de crescimento (íon ferroso e S0) e a remoção das substâncias exopoliméricas (EPS) para células crescidas em íon ferroso. A cinética de oxidação destes sulfetos também foi avaliada. Tais estudos foram realizados pela técnica de respirometria celular, que permite avaliar rapidamente a oxidação do substrato a partir de medidas de oxigênio consumido pela bactéria. Em todas as condições testadas a covelita apresentou significativa diferença de oxidação pelo A. ferroxidans LR em comparação com a molibdenita. A análise da cinética de oxidação dos sulfetos demonstrou que a molibdenita apresenta uma cinética que segue Michaelis-Menten, o mesmo não acontecendo para a covelita, provavelmente devido a forma com que estes sulfetos reagem ao ataque químico-bacteriano, fato determinado pelas estruturas eletrônicas dos sulfetos minerais. Quanto aos ensaios onde as células de A. ferrooxidans LR foram crescidas em meio viii contendo diferentes fontes energéticas de crescimento (íon ferroso e enxofre), e para aqueles nos quais as células tiveram a remoção dos EPS, os resultados obtidos para a oxidação da covelita não apresentaram significativas diferenças. Assim como para a covelita, a oxidação da molibdenita pelo A. ferrooxidans LR em diferentes condições fisiológicas mostrou resultados similares. Tendo em vista o conjunto de resultados, o papel das substâncias exopoliméricas na oxidação dos sulfetos, sobretudo a respeito da presença de íons férricos, parece não ser tão primordial quanto se acredita. Isto pode ser suportado pela oxidação de ambos sulfetos tanto para células crescidas em S0 quanto para células crescidas em íon ferroso as quais tiveram os EPS removidos. Provavelmente outros fatores, ainda não muito claros, podem estar determinando a interação entre a bactéria e os sulfetos metálicos. ix ABSTRACT Bacterial leaching or bioleaching is a biotechnological process that applies microorganisms able to solubilize metals by metallic sulfides oxidation. This process is nowadays one of the most important alternatives for recovering metals, mainly by environmental and economic aspects. One of the most important bacteria employed in this process is Acidithiobacillus ferrooxidans. It is a gram-negative, acidophilic, aerobic and chemoautotrophic bacteria that obtain energy by the oxidation of inorganic substrates like ferrous ion and reduced sulfur compounds, including metal sulfides. Nevertheless, the interaction of this specie with metallic sulfides remains unclear. With the aim to understand these interactions, the present work has studied the covellite (CuS) and molydenite (MoS2) oxidation by A. ferrooxidans strain LR under different physiological conditions such as the source energy for growth (S0 and ferrous ion) and the removal of extracellular polymeric substances (EPS). These studies were performed by respirometric technique tha t allow evaluating very quickly the substrate oxidation by oxygen uptake measures. For all essays realized it was observed that the efficiency of covellite oxidation by A. ferrooxidans LR is much better than molybdenite. On the kinetic oxidation analyses, molybdenite revealed to be according to Michaelis-Menten substrate saturate kinetic. On the other hand, covellite was not in agreement with Michalis-Menten kinetic. This finding is probably associated with the pathway which these minerals sulfide react to chemistry-bacterial attack, what is influenced by electronic structures of mineral sulfides. Regarding essays performed with cells of A. ferrooxidans strain LR grown with different substrates (ferrous ion and sulfur) and to essays x which EPS of bacterial cells were removed, the results obtained did not show differences in covellite oxidation. As to covellite, the molybdenite oxidation by A. ferrooxidans LR under different physiological conditions was very similar. According to the results obtained in this work, the role of EPS and ferric ion on the sulfide oxidation showed no great initial influence on the oxidation as defending by some authors. It can be supported by oxidation of both sulfides by cells grown in sulfur, in which there were not ferric ions. Probably, other factors which remains unclear have been determining the interaction between bacteria and metallic sulfides. 1 I. INTRODUÇÃO Apesar do grande avanço de materiais cerâmicos e poliméricos nos últimos tempos, torna-se inimaginável pensar no cotidiano do mundo moderno sem fazer alguma alusão aos metais, devido a vasta variabilidade de aplicações em que estes foram, são e serão utilizados. Um fato notável no desenvolvimento dos seres humanos, o qual é denominado historicamente de “Idade dos Metais” (5000 - 4000 a.C.), foi o início do uso dos metais. Desde então, o estudo e avanço de suas aplicações não mais pararam de crescer, chegando a patamares hoje que vão deste o tratamento de doenças como o câncer, até chips de microcomputadores. A exploração da crosta terrestre em busca de metais vem de longa data. Com isso, a indústria mineradora está atualmente deparando-se com sérios problemas, como o esgotamento das reservas minerais, a diminuição do teor de metais para a extração, além dos problemas ambientais originados do processo de extração de metais. Tradicionalmente, o processo ao qual os minerais são submetidos para a extração dos metais é denominado de Pirometalurgia. O mesmo consiste basicamente na oxidação do minério contendo o metal de interesse, pela queima em altas temperaturas. No caso de sulfetos metálicos, o processo pelo qual ocorre esta oxidação é denominado de ustulação. A reação [1] abaixo exemplifica este processo para a molibdenita: MoS2 + 3 O2 ? MoO3 + SO2 [1] Devido à necessidade de elevadas temperaturas para este tipo de tratamento, o processo pirometalúrgico requer alto gasto enérgico, atingindo assim elevado custo, sendo apenas economicamente viável em jazidas nas quais o metal de interesse encontra-se em alto teor. Outro aspecto negativo é referente ao problema ambiental, pois a queima de minérios sulfetados provoca a liberação de SO2 para a atmosfera, um dos gases responsáveis pela chuva ácida. Estes fatores têm induzido um crescimento no estudo de processos alternativos que ? 2 visem uma exploração de minérios com baixos teores do metal e que não acarretem significativos danos ambientais. Dentre estes processos alternativos, a Hidrometalurgia, um processo que utiliza soluções ácidas ou básicas para o tratamento de minérios e recuperação do metal de interesse, apresenta certas vantagens em relação à Pirometalurgia, sobretudo quanto ao custo energético. Dentre os processos hidrometalúrgicos, a Biolixiviação ou lixiviação bacteriana é um processo biotecnológico que vem ganhando especial atenção. Este processo fundamenta-se na utilização de microorganismos capazes de solubilizar metais pela oxidação de sulfetos metálicos. A biooxidação de minérios para a recuperação de cobre tem sido praticada por séculos na Espanha, Suécia, Alemanha e China (EHRLICH, 2001), sendo, o primeiro documento que relata a aplicação comercial do processo biohidrometalúrgico datado de 1958 (OLSON; BRIERLEY; BRIERLEY, 2003). A Biohidrometalurgia apresenta grandes vantagens em relação a hidrometalurgia: requer pequeno gasto com insumos (ácidos e agentes oxidantes) os quais são produzidos pela própria bactéria; reduzido gasto energético; baixo investimento de capital; baixo custo operacional; reduzida mão de obra especializada na operação em relação aos demais processos de beneficiamento de metais; aproveitamento de rejeitos de minérios com teores reduzidos de metais. Assim, a lixiviação bacteriana pode ainda ser uma alternativa para jazidas de pequeno porte, e/ou longe de centros com infra-estrutura. A operação de processos biohidrometalúrgicos é conduzida em geral sob a forma de lixiviação estática em pilhas, aproveitando-se da ação natural das bactérias presentes no minério, cujo metal de interesse já se apresente na forma de sulfeto insolúvel (CuS por exemplo) para ser transformado pela ação oxidante da bactéria no sulfato solúvel correspondente (CuSO4). A Figura 1 mostra um esquema representativo de uma planta de biolixiviação sob a forma de pilha. Também existem casos em que o metal de interesse não se 3 Drenagem Tanque para coleta e ajustes de soluções Solução ácida contendo o metal dissolvido e o A. ferrooxidans, além de outras espécies envolvidas Área impermeabilizada Pilha de minério Usina de extração do metal Reciclagem da soluçãoIrrigação apresenta sob a forma de sulfeto, logo deve existir no minério algum sulfeto, como a pirita (FeS2), para que pela atuação da bactéria, este se transforme em agentes lixiviantes (ácido sulfúrico e íon férrico), capazes de promover a solubilização do metal não sulfetado. Este tipo de processo ocorre na lixiviação bacteriana de urânio. Figura 1. Esquema de uma planta de biolixiviação conduzida sob a forma de pilhas. Além da lixiviação estática em pilhas, a biolixiviação também vem sendo aplicada em tanques agitados, especialmente para concentrados minerais contendo ouro. Atualmente este processo biotecnológico é aplicado, em escala industrial, para a recuperação de cobre, urânio e ouro, em países como EUA, Chile, Brasil, Austrália, Rússia, etc. As Tabelas 1 e 2 mostram respectivamente, algumas plantas de biolixiviação de cobre e concentrado de ouro, a quantidade de minério processada e os anos em operação. 4 Tabela 1. Plantas comerciais de lixiviação estática em pilhas para cobre (OLSON; BRIERLEY; BRIERLEY, 2003). Planta e localização Toneladas de minério/dia Anos em operação Lo Aguirre, Chile 16.000 1980-1986 Cerro Colorado, Chile 16.000 1993 até o presente Quebrada Blanca, Chile 17.300 1994 até o presente Cerro Verde, Peru 32.000 1996 até o presente Equatorial Tonopah, EUA 24.500 2000-2001 S&K Copper, Myanmar 18.000 1998 até o presente Tabela 2. Plantas comerciais de biolixiviação de concentrados de ouro em tanques agitados (OLSON; BRIERLEY; BRIERLEY, 2003). É inegável, nos dias atuais, a importância e potencialidade da lixiviação bacteriana para a extração de metais, sobretudo do ponto de vista ambiental e de consumo energético. Assim, quanto melhor se conhecer os processos de interação entre as espécies bacterianas e os sulfetos metálicos, melhores são as perspectivas de otimização deste processo. Planta e localização Toneladas de concentrado/dia tecnologia Anos em operação Fairview, África do Sul 10 expandido para 40 BIOX 1986 até o presente São Bento, Brasil 150 BIOX 1990 até o presente Wiluna, Austrália 115 expandido para 158 BIOX 1993 até o presente Sansu, Gana 720 expandido para 960 BIOX 1994 até o presente Youanmi, Austrália 120 BacTech 1994-1998 Tamboraque, Peru 60 BIOX 1990 até o presente Laizshou, China 100 BacTech 2001 até o presente 5 II. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA II.1. Acidithiobacillus ferrooxidans Na biolixiviação de metais tem sido demonstrada a participação de diferentes espécies bacterianas, dentre as quais destacam-se: Acidithiobacillus ferrooxidans, Leptospirilum ferrooxidans e Acidithiobacillus thiooxidans (JOHNSON, et al., 1995; RAWLINGS, 2002). Das espécies mencionadas, sem a menor dúvida, a mais estudada e utilizada nos processos de biolixiviação é o A. ferrooxidans. Essa bactéria é um microorganismo quimiolitotrófico, ou seja, obtém sua energia pela oxidação de substratos inorgânicos, basicamente o íon ferroso e compostos reduzidos de enxofre (equações [2], [3] e [4]), incluindo os sulfetos metálicos. 4FeSO4 + O2 + 2H2 SO4 ? 2Fe2 (SO4)3 + 2H2O [2] 2S0 + 3O2 + 2H2O ? 2H2SO4 [3] Na2S2O3 + 2O2 + H2O ? Na2SO4 + H2SO4 [4] A energia obtida pela oxidação dos substratos inorgânicos é utilizada pela espécie para a fixação do CO2 atmosférico, sua fonte de carbono (LEDUC; FERRONI, 1994). Além disso, o A. ferrooxidans é uma espécie aeróbia, não patogênica, a qual apresenta-se como bastonetes Gram-negativos, não esporulantes, com dimensões médias de 0,5 a 0,6 µm de diâmetro por 1,0 a 2,0 µm de comprimento. São móveis pois apresentam flagelo polar (HOLT, 1994) e sua reprodução é por divisão binária simples (PIVOVAROVA; GOLOVACHEVA, 1985). O A. ferrooxidans é considerado um microrganismo mesofílico e acidofílico, sendo 30ºC a temperatura ótima de crescimento, e o pH ótimo de crescimento situado em torno de 2,0, ocorrendo no entanto, crescimento numa faixa 1,5 a 4,5; acima de pH 6,5 ou abaixo de pH 1,0 não é capaz de crescer (SMITH; LUTHY; MIDDLETON, 1988). bactéria bactéria bactéria 6 A capacidade em oxidar diferentes tipos de compostos inorgânicos, produzindo íons férricos e ácido sulfúrico (eficientes agentes da lixiviação ácida de metais), é o que torna o papel do A. ferrooxidans fundamental na lixiviação bacteriana. A capacidade de oxidação deste microrganismo já foi demonstrada para diferentes sulfetos metálicos como calcopirita (CuFeS2), covelita (CuS), galena (PbS), pirita (FeS2), esfarelita (ZnS) entre outros (BEVILAQUA et al., 2001; MONTEIRO; GARCIA; TUOVINEN, 1999; GARCIA; BIGHAM; TUOVINEN, 1995a, GARCIA; BIGHAM; TUOVINEN, 1995b). A Figura 2 mostra uma imagem de microscopia de forças de atômicas na qual o A. ferrooxidans está aderido a superfície de um sulfeto de cobre. Figura 2. Imagem de Microscopia de Forças Atômicas do A. ferrooxidans aderido a superfície de um sulfeto de cobre (BEVILAQUA, 2003). Uma característica fisiológica marcante, a qual permite o emprego do A. ferrooxidans na solubilização de metais, é a sua resistência a altas concentrações de íons metálicos (LEDUC; FERRONI, 1994), característica esta que pode ser atribuída à presença constante de metais em seu habitat, fator que provavelmente determinou a seleção de espécies 7 mais resistentes. Segundo revisões de Lundgren e Silver (1980), Hutchins et al. (1986) e Leduc e Ferroni (1994), o A. ferrooxidans é resistente à concentrações em mMol L-1 de: 370 Al, 150 Zn, 170 Co, 180 Mn, 160 Cu, 100 Cr, 1,5 As, 10 Cd, 0,1 Hg, 170 Ni e 8 U. Por todos estes fatores, este microorganismo vem sendo muito estudado e aplicado na biolixiviação de minerais nas ultimas décadas. A espécie utiliza, além do Fe2+ ou formas reduzidas de enxofre como fonte energética, suprimentos de nitrogênio, fósforo e magnésio (TUOVINEN; PANDA; TSUSHUJA, 1979; RAWLINGS, 1981). O mecanismo de oxidação do Fe2+ por A. ferrooxidans têm sido muito estudado (YAMANAKA; FUKUMORI, 1995); entretanto, em relação ao enxofre, o mecanismo molecular é ainda pouco conhecido (PRONK; JOHNSON, 1992). Vários componentes da cadeia de transferência de elétrons durante a oxidação do íon Fe2+ já foram identificados e purificados. Com base nas interações entre os componentes isolados, Yamanaka e Fukumori (1995) propuseram o seguinte sistema para a transferência de elétron acompanhada pela oxidação do Fe2+: Fe2+ → Fe (II)- citocromo c oxidoredutase → citocromo c-552(s) → citocromo c oxidase O2 rusticianina Entretanto, a interação dessa espécie (além de outras) com os sulfetos metálicos durante o processo de biolixiviação, tem se tornado o foco de muitas discussões e intensivas pesquisas, sendo um assunto ainda muito controverso, sobretudo a respeito dos mecanismos envolvidos na dissolução dos sulfetos metálicos. II.2. Sulfetos minerais – Covelita e Molibdenita 8 Covelita e molibdenita, objetos de estudo do presente trabalho, são importantes sulfetos minerais presentes na natureza. A covelita apresenta uma geometria hexagonal. Sua composição química (m/m) apresenta 66,6% de Cu e 33,6% de S. Este sulfeto apresenta uma complexa estrutura cristalina, onde os átomos de cobre se coordenam aos átomos de enxofre de duas formas diferentes. Um tipo de átomo de cobre é coordenado tetraedricamente com o enxofre, enquanto o outro tipo está em uma coordenação trigonal com o enxofre, formando camadas planares (KLEIN; HURLBUT, 1999). A covelita não é um mineral de grande abundância, porém é encontrada na maioria dos depósitos de cobre associada a outros minerais. A molibdenita apresenta em sua composição química (m/m) 59,9% de Mo e 40,1% de S. Em sua estrutura os átomos de Mo estão ligados entre dois planos de átomos de enxofre. Os três planos juntos formam uma só camada, onde as ligações são mais fortes do que entre uma e outra camada (KLEIN; HURLBUT, 1999). O dissulfeto de molibdênio pertence a classe de compostos lamelares e ocorre em três modificações polimórficas. A fase mais comum (2H) existe na natureza na forma de molibdenita. Esta fase é diamagnética e semicondutora n,p. Este sulfeto possui aplicações tecnológicas as quais incluem baterias no estado sólido; utilizando meio não aquoso e íons lítio intercaláveis; células solares, lubrificantes sólidos, catalisadores, além de inúmeras outras (WYPYCH, 2000). A reação de oxidação da molibdenita não foi completamente elucidada, porém, uma forma simplificada pode ser representada pela seguinte equação (LYALIKOVA; LEBEDEVA, 1984): 2MoS2 + 9O2 + 2H2O ? 2MoO2.SO4 + 2H2SO4 [5] Estudos de biolixiviação de molibdenita não são muito comuns, principalmente no que concerne a utilização de sulfetos sintéticos. Pistaccio et al. (1994) estudaram a biolixiviação de molibdenita sintética em meio ausente de ferro, e observaram que em ausência de um 9 agente surfactante, a dissolução deste mineral é ínfima. Os mesmos estudos revelaram que em ensaios nos quais utilizou-se uma concentração de 5000 ppm do surfactante Tween 80, houve um aumento de cerca de 8 vezes no molibdênio solubilizado. Do mesmo modo, a adesão bacteriana apresentou um acréscimo de 17,9 para 87%. Por outro lado, estudos também com MoS2 sintético em ausência de ferro (TRIBUTSCH; BENNETT,\ 1981) não mostraram dissolução deste sulfeto e nem crescimento bacteriano no mesmo. Entretanto, estes autores não relatam o uso de qualquer agente surfactante para diminuir o alto caráter hidrofóbico da molibdenita, o que, como demonstraram Pistaccio et al. (1994), é fator decisivo para a biolixiviação deste sulfeto. Esta alta hidrofobicidade, aliada a alta toxicidade do molibdênio à microorganismos (PIRAVOVA; DZHANSUGUROVA; KARAVAIKO, 1991) pode ter determinado o não crescimento do A. ferrooxidans neste sulfeto relatado por Tributsch e Bennet (1981). Estudos tanto de lixiviação química quanto bacteriana de concentrados de molibdênio revelaram também uma natureza altamente refratária deste sulfeto (ROMANO et al., 2001a, 2001b). Em nenhum dos casos a solubilização de molibdênio por lixiviação bacteriana ultrapassou 0,5%. No caso da lixiviação química, os melhores resultados (dissolução > 90%) foram obtidos com o uso de HNO3 50%. Nasernejad et al. (1999) demonstraram, também utilizando concentrado de molibdênio, extração de 93% do metal. Contudo, os precipitados destes ensaios de biolixiviação foram lavados, a cada semana, com ácido clorídrico 2 M e solvente orgânico, sendo então reutilizados nos ensaios os quais tiveram duração de 41 dias. Este procedimento experimental provavelmente determinou a alta solubilização de molibdênio, fato incomum em estudos relatados na literatura (TRIBUTSCH; BENNETT, 1981, ROMANO et al., 2001a, 2001b). A covelita é um dos principais minerais de cobre presente na natureza e, sob o ponto de vista de extração de cobre por processos biohidrometalúrgicos, também é um dos mais 10 importantes. A covelita pode ser oxidada quimicamente levando à formação de enxofre elementar (MONTEIRO; GARCIA; TUOVINEN, 1999), o qual pode dificultar a difusão de agentes oxidantes e, por conseguinte, diminuir a velocidade de oxidação do sulfeto. Logo, o A. ferrooxidans é capaz de acelerar a reação de oxidação da covelita pela remoção da camada de enxofre a qual reduz o ataque químico ao sulfeto, bem como pela geração de agentes lixiviantes. A reação simplificada da oxidação da covelita em meio ácido é representada pela equação abaixo: CuS + ½O2 + 2H+ ? Cu2+ + H2O + S0 [6] Muitos estudos relatam a dissolução da covelita pelo ataque químico-bacteriano (POGLIANI et al., 1990, MONTEIRO; GARCIA; TUOVINEN, 1999; SAKAKUCHI; TORMA; SILVER, 1976). Donati et al. (1996) obtiveram bons resultados na extração de cobre da covelita com a utilização de culturas mistas de A. ferrooxidans e A. thiooxidans. Em ensaios utilizando-se o A. thiooxidans com a adição de S0 e ferro II, a solubilização de cobre foi superior a 80%. Esta solubilização provavelmente está associada à capacidade do A. thiooxidans em oxidar o enxofre com a conseqüente geração de ácido. Todavia, os melhores resultados foram obtidos com culturas puras de A. ferrooxidans. Ensaios de lixiviação em frascos na presença de A. ferrooxidans crescido em enxofre mostraram solubilização de cobre muito similar a obtida com células crescidas em ferro II como fonte de energia (CURUTCHET; DONATI, 2000), indicando que a biolixiviação da covelita independe da fonte energética. Alguns trabalhos demonstraram que a velocidade de oxidação da covelita pode ser acelerada pela adição de íons férricos ao meio (SAKAKUCHI; TORMA; SILVER, 1976; DONATI; PORRO; TEDESCO, 1988). Todavia, após algum tempo pode haver a precipitação de sais de ferro, como as jarositas, os quais recobrem a superfície da covelita e dificultam o ataque bacteriano (DONATI; PORRO; TEDESCO, 1988). 11 II.3. Mecanismos envolvidos na oxidação dos sulfetos metálicos Silverman e Ehrlich (1964) foram os primeiros a tentar explicar o mecanismo da biolixiviação, baseados em duas possibilidades: o mecanismo direto e o mecanismo indireto. O mecanismo direto caracteriza-se pela adesão obrigatória da bactéria à superfície do sulfeto durante a dissolução oxidativa do mineral. Segundo este mecanismo, a solubilização do metal é promovida pelo ataque de um sistema enzimático presente na bactéria, diretamente sobre a superfície do mineral, promovendo a oxidação do S2- e a conseqüente solubilização do metal de interesse. Abaixo pode ser vista a equação que representa a reação de oxidação direta da pirita, o sulfeto mais estudado no processo de biolixiviação: 2FeS2 + 7O2 + 2H2O ? 2Fe2+ + 4H+ + 4SO4 2- [7] Por outro lado, no mecanismo indireto, não há a adesão da bactéria sobre a superfície do mineral. Neste caso, a bactéria produz agentes lixiviantes pela oxidação de substratos solúveis, os quais oxidam quimicamente o sulfeto mineral. O principal produto dessa atividade bacteriana é o íon férrico, um poderoso oxidante que promove a solubilização do metal, como descrito na seguinte equação geral: MeS + Fe2(SO4)3 ? MeSO4 + 2FeSO4 + S0 [8] O sulfato ferroso (íon Fe2+) e o enxofre elementar produzidos segundo a equação [8] serão constantemente oxidados pela bactéria num processo cíclico, conforme as equações [2] e [3], produzindo o sulfato férrico e o ácido sulfúrico, os quais terão uma ação lixiviante sobre os sulfetos metálicos em geral, promovendo a solubilização dos metais. De tal modo, no mecanismo indireto, a bactéria participa somente com uma função catalítica, uma vez que as reações [2] e [3] são muito lentas na sua ausência. Em meio ácido, a bactéria chega a aumentar cerca de 500 000 vezes a velocidade de oxidação do íon ferroso (KARAVAIKO; GROUDEV, 1988). bactéria 12 Contudo, esta categorização quanto aos mecanismos envolvidos na biolixiviação de sulfetos metálicos foi redefinida com a inclusão de uma terceira categoria: o mecanismo indireto de contato (SILVERMAN, 1967), como mostra a Figura 3. A principal característica deste modelo é a hipótese de que íons férricos ou prótons são os únicos agentes lixiviantes dos sulfetos metálicos. Por conseguinte, o mecanismo direto proposto originalmente para a dissolução bacteriana está sendo revisto e, sua existência é questionada por vários autores (SAND et al., 1995, CRUNDWELL, 2001, KINZLER et al. 2003). Figura 3. Esquema dos possíveis mecanismos de interação bactéria-substrato envolvidos na biolixiviação dos sulfetos minerais. MS – sulfeto metálico. Um outro mecanismo ainda importante na dissolução dos sulfetos metálicos é a formação de um par galvânico (NATARAJAN, 1990). Sabe-se que muitos sulfetos metálicos mecanismo indireto de contato bactéria Fe3+ Fe2+ EPS MS mecanismo indireto de contato bactéria Fe3+ Fe2+ EPS MS mecanismo indireto de contato bactéria Fe3+ Fe2+ EPS MSbactéria Fe3+ Fe2+ EPS MS Fe3+ Fe2+ EPS MS Fe3+ Fe2+ EPS Fe3+ Fe2+ EPS Fe3+ Fe2+ EPS Fe3+ Fe2+ EPS Fe3+ Fe2+ EPS Fe3+ Fe2+ EPS Fe3+ Fe2+ EPS Fe3+ Fe2+ Fe3+ Fe2+ Fe3+ Fe2+Fe2+ EPS MS M2+ + SO4 2-bactéria MS mecanismo direto M2+ + SO4 2-bactéria MS mecanismo direto M2+ + SO4 2-bactéria MS M2+ + SO4 2-bactéria MSbactéria MSbactériabactéria MSMS mecanismo direto Fe2+ + M2+ + SO4 2-Fe3+Fe2+ bactéria MS mecanismo indireto Fe2+ + M2+ + SO4 2-Fe3+Fe2+ bactéria MS mecanismo indireto Fe2+ + M2+ + SO4 2-Fe3+Fe2+ bactéria MS Fe2+ + M2+ + SO4 2-Fe3+Fe2+ bactéria MSFe3+Fe2+ bactéria MSFe3+Fe2+ bactéria Fe3+Fe2+ bactéria Fe3+Fe2+ bactéria Fe2+ bactériabactéria MSMS mecanismo indireto 13 são condutores ou semi-condutores. Portanto, em um sistema de biolixiviação, estes diferentes sulfetos se comportam como eletrodos, possuindo cada qual um determinado potencial de óxido-redução. De tal modo, quando mais de um sulfeto mineral encontra-se em um mesmo sistema de biolixiviação, um deles se comporta como catodo enquanto o outro se comportará como anodo. Desta forma ocorrerá a dissolução preferencial de um sulfeto em detrimento do outro. No entanto, este mecanismo não tem grande importância dentro do contexto deste trabalho, uma vez que os sulfetos metálicos utilizados são sintéticos e apresentam elevado grau de pureza. Neste contexto, os fundamentos bioquímicos da lixiviação bacteriana assim como a função do enxofre durante o processo são objetos de intensas investigações. Recentemente, alguns autores propuseram que apenas dois principais mecanismos de reação controlam a dissolução dos sulfetos metálicos, o mecanismo dos polissulfetos e o mecanismo do tiossulfato, sendo a configuração eletrônica dos sulfetos aspecto determinante no caminho a ser seguido (SAND et al., 2001; ROHWERDER et al., 2003). A Figura 4 mostra um esquema de ambos os mecanismos com seus principais produtos intermediários e finais. 14 M2+ + S2O3 2- SO4 2- + H+ SO4 2- S8 M2 + Sn 2- H+ Fe3 Fe2 Fe3 Fe2 MS (*) (* A.f., A. A.f.,L.f Mecanismo via polissulfeto Mecanismo via tiossulfato M2+ + S2O3 2- SO4 2- + H+ SO4 2- S8 M2 + Sn 2- H+ Fe3 Fe2 Fe3 Fe2 MS (*) (* A.f., . . M2+ + S2O3 2- SO4 2- + H+ SO4 2- S8 M2 + Sn 2- H+ Fe3 Fe2 Fe3 Fe2 MS (* (* A.f., A.t. A.f., L.f M2+ + S2O3 2- SO4 2- + H+ SO4 2 S8 M2 + Sn 2- H+ Fe3 Fe2 Fe3 Fe2+ Fe3 Fe2+ MS (* (*) A.f., A.t. MS Figura 4. Esquema comparativo do mecanismo de biolixiviação via tiossulfato (A) e polissulfetos (B). A.f – A. ferrooxidans; A.t – A. thiooxidans; L.f – Leptospirillum ferrooxidans. (*) passos que podem envolver tanto A.f quanto pelo A.t. (ROHWERDER et al., 2003) 15 II.3.1 Os mecanismos dos polissulfetos e do tiossulfato De acordo com a Teoria do Orbital Molecular (TOM) e a Teoria da Ligação de Valência (TLV), os orbitais dos átomos ou moléculas constituem bandas com diferentes níveis energéticos, sendo a banda de mais alto nível de energia ainda preenchida com elétrons, designada banda de valência. No caso dos sulfetos metálicos, quando esta banda de valência é derivada tanto do átomo metálico quanto do átomo de enxofre, a ligação metal-enxofre tem seu rompimento facilitado pelo ataque de prótons H+. Assim, sulfetos como covelita (CuS), calcocita (CuS2) e esfarelita (ZnS), os quais possuem a banda de valência preenchida com elétrons do átomo metálico e do enxofre, são denominados solúveis em ácido. Como conseqüência, a solubilização destes sulfetos pode ocorrer tanto pela ação oxidante dos íons férricos, quanto pelo ataque de prótons. Nesta classe de sulfetos, as reações de oxidação ocorrem via mecanismo dos polissulfetos, e acontecem somente após a clivagem da ligação metal-enxofre (SCHIPPERS; JOZSA; SAND, 1996, SCHIPPERS; SAND, 1999; SAND et al., 2001). No caso do ataque por prótons, o primeiro passo na oxidação dos sulfetos ditos solúveis em ácido é descrito pela formação de H2S e solubilização do metal correspondente (TRIBUTSCH; BENNET, 1981; TRIBUTSCH, 2000; SAND et al., 2000), como mostra a equação geral abaixo: MeS + 2H+ ? M2+ + H2S [9] Um importante e crítico fator desta solubilização dos sulfetos em ácido são as constantes dos produtos de solubilidade (Kps) destes sulfetos metálicos (TRIBUTSCH; BENNET, 1981). Quanto maior for o valor de Kps de um determinado sulfeto maior será sua susceptibilidade ao ataque ácido e, por conseguinte, ao ataque bacteriano (TRIBUTSCH; BENNET, 1981; TRIBUTSCH, 2000). Assim, a solubilidade do sulfeto em ácido é proporcional ao seu valor de Kps e a concentração de prótons em solução. 16 De acordo com Tributsch e Bennet (1981), o ataque de prótons aos sulfetos gera grupos SH- em sua superfície pela protonação de átomos de enxofre. Estes grupos SH- são caracterizados por estados eletronicamente diferentes dos átomos de enxofre não protonados, e por sua vez enfraquecem a ligação com a estrutura cristalina. A formação desta ligação enfraquecida permite que um posterior ataque de prótons remova uma molécula de H2S. Na ausência de bactérias oxidantes de enxofre, bem como de outros oxidantes químicos, como por exemplo, o íon férrico, o H2S formado pode ser oxidado a enxofre de acordo com as equações [10] ou [11]. Na presença de bactérias como o A. ferrooxidans, este H2S gerado pode ser oxidado tanto quimicamente quanto microbiologicamente a enxofre, o qual é posteriormente oxidado a sulfato. H2S + H2SO4 ? H2SO3 + S + H2O [10] H2S + ½O2 ? H2O + S0 [11] No caso do ataque pelos íons férricos, o rompimento das ligações químicas entre o metal e o enxofre pode ser provocado pela remoção de um elétron do átomo de enxofre. Este passo acontece concomitantemente ao ataque de prótons (SAND et al., 2001, ROHWERDER et al., 2003), pelo qual é formado o radical H2S*+, como mostra a reação [12]: MS + Fe3+ + 2H+ ? Me2+ + H2S*+ + Fe2+ [12] Posteriormente, como demonstraram Steudel (1996) e Sand et al. (2001), uma série de reações envolvendo a formação de polissulfetos radicais ocorrem até a formação de enxofre elementar. Por isso este mecanismo foi denominado de “polissulfetos”. Por este processo, mais de 90% do sulfeto é transformado em enxofre elementar, sendo formados também, embora minoritariamente, tiossulfato, politionatos e sulfato (STEUDEL, 1996; SCHIPPERS & SAND, 1999). As equações [13], [14] e [15] sumarizam estas etapas para o caso da covelita, sulfeto utilizado no presente trabalho. Apenas na presença do A. ferrooxidans o S0 17 formado pode ser oxidado a sulfato, o que além de regenerar os prótons H+ remove a camada de enxofre elementar da superfície do sulfeto metálico. 8CuS + 8Fe3+ + 8H+ ? 8Cu2+ + 4H2Sn + Fe2+ [13] 4H2Sn + 8Fe3+ ? S8 + 8Fe2+ + 8H+ [14] S8 + 12O2 + 8H2O ? 8SO4 2- + 16H+ [15] Em contrapartida, este mecanismo de reação via ataque de prótons não é válido quando a banda de valência do sulfeto não é derivada dos orbitais 3p do átomo de enxofre, mas sim dos orbitais ‘d’ do átomo metálico, fato que dificulta a quebra da ligação metal- enxofre. Importantes exemplos são o MoS2, WS2 e FeS2, os quais são classificados como sulfetos insolúveis em ácido. Logo, sulfetos como MoS2, WS2 e FeS2, os quais exibem altos valores de Kps devido suas peculiares estruturas eletrônicas, não são solubilizados pelo ataque de prótons, sendo também mais resistentes ao ataque bacteriano e à oxidação química (SAND et al., 2001). Estudos realizados (SCHIPPERS; JOZSA; SAND, 1996; SAND et al., 2001, ROHWERDER et al., 2003) com estes sulfetos, classificados como insolúveis em ácido, indicaram que os mesmos são oxidados apenas pelo ataque do íon férrico, via mecanismo do tiosulfato. Neste sentido, estes autores (SCHIPPERS; JOZSA; SAND, 1996; SAND et al., 2001, ROHWERDER et al., 2003) argumentam que na ausência de íons férricos o A. ferrooxidans não é capaz de oxidar os referidos sulfetos. Nesta classe de sulfetos, o rompimento da ligação química metal-enxofre ocorre após seis passos sucessivos de extração de elétrons por íons férricos, com a conseqüente formação de tiossulfato (SCHIPPERS; JOZSA; SAND, 1996; SAND et al., 2001, ROHWERDER et al., 2003). Anteriormente a oxidação do tiossulfato a sulfato, alguns produtos intermediários como tetrationatos e politionatos são formados. Na ausência de bactérias oxidantes de enxofre, pode ser formada 18 uma quantidade significante de enxofre (entre 10 e 20%). As equações [16] e [17] sumarizam o mecanismo do tiosulfato, mostrando os principais produtos intermediários e finais. MoS2 + 6Fe3+ + 3H2O ? S2O3 2- + 6Fe2+ + Mo4+ + 6H+ [16] S2O3 2- + 8Fe3+ + 5H2O ? 2SO4 2- + 8Fe2+ + 10H+ [17] Na equação [17], a oxidação do tiossulfato pode ocorrer tanto quimicamente, por ação do íon férrico, quanto biologicamente, pela ação do A. ferrooxidans ou A. thiooxidans, com conseqüente consumo de oxigênio (equação [4]). A função da bactéria, neste modelo, é regenerar os íons férricos responsáveis pela oxidação. Um fator determinante nos modelos descritos acima; em detrimento do mecanismo direto; é que, quando aderida a superfície do mineral, o ataque da bactéria aos sulfetos ocorre por mediação das substâncias poliméricas extracelulares (EPS), as quais circundam as células bacterianas. Estas substâncias, por sua vez, complexam íons férricos presentes no meio, os quais serão os responsáveis pelo processo de biolixiviação. A bactéria, nestes modelos, tem apenas a função catalítica de regenerar os íons Fe3+ e/ou H+, tal qual no mecanismo indireto, bem como de concentrá-los na interface mineral-solução ou mineral-célula bacteriana através dos EPS, de forma a elevar a degradação do sulfeto mineral. Desta forma, o papel preponderante da oxidação dos sulfetos insolúveis em ácido é dos íons férricos complexados aos EPS. Ao mesmo tempo, nos sulfetos solúveis em ácido, além dos íons férricos os prótons H+ também podem contribuir com a solubilização dos sulfetos. II.3.2 As substâncias poliméricas extracelulares e as interações com os sulfetos metálicos Pelo fato dos sulfetos metálicos serem substratos sólidos, grande parte das células bacterianas se encontra aderida à superfície mineral. Embora já se tenha demonstrado que os EPS não são um pré-requisito para que ocorra a adesão bacteriana (BEVILAQUA et al., 19 2004), também é conhecido que as células bacterianas aderidas ao sulfeto têm sua produção de EPS estimulada (VANDEVIRE; KIRCHMAN, 1993; GERHKE et al. 1998), o que colabora com o fato dos exopolímeros possuírem importante papel no processo de adesão. Gerhke et al. (1998) demonstraram que células de A. ferrooxidans quando crescidas em pirita produzem cerca de 13 vezes mais EPS do que quando crescidas em meio contendo íon ferroso. A hidrofobicidade e as interações eletrostáticas são os mais importantes fatores na adesão bacteriana. De acordo com Rohwerder et al. (2003), fundamentalmente interações eletrostáticas entre as células bacterianas carregadas positivamente (causado pela complexação de íons Fe3+), e a superfície da pirita carregada negativamente, são responsáveis pela adesão bacteriana neste sulfeto. Neste caso, interações hidrofóbicas não contribuem significativamente para a adesão bacteriana. Sendo assim, células crescidas em meio contendo enxofre como fonte energética, por possuírem uma considerável mudança na composição do EPS em relação às células crescidas em pirita, têm a adesão sobre este sulfeto desfavorecida. Em relação a covelita, a adesão bacteriana é mediada por interações hidrofóbicas (CURUTCHET; DONATI, 2000; POGLIANI; DONATI, 1999), embora, assim como na pirita, interações eletrostáticas possam mediar tal processo. Curutchet e Donati (2000) mostraram que quanto maior a concentração de íons H+ na superfície das células bacterianas, maior foi a adesão em covelita. Isto porque o CuS, em valores baixos de pH, possui a superfície carregada negativamente e, por sua vez, a elevada concentração de prótons nas células bacterianas deixam as mesmas carregadas positivamente, favorecendo a interação eletrostática. Ao mesmo tempo, células crescidas em S0 têm sua adesão na covelita favorecida devido a maior hidrofobicidade, a qual supera a contribuição eletrostática (POGLIANI; DONATI, 1999). No que concerne a adesão bacteriana na molibdenita, o fator preponderante é o caráter hidrofóbico (PISTACCIO et al., 1994). 20 Para o caso de linhagens bacterianas de A. ferrooxidans crescidas em pirita e meio contendo íon ferroso, os EPS consistem basicamente de açúcares (principalmente glicose, ramnose, fucose, xilose e manose), ácidos graxos com cadeias de 12 a 20 carbonos, ácido glicurônico e Fe3+ (KINZLER et al., 2003; GERHKE et al., 1998). Quando crescidas tendo o S0 como fonte energética, além de não conter íons férricos (GERHKE et al. 1998), a composição dos exopolímeros das células de A. ferrooxidans, no que se refere aos açúcares, é drasticamente modificada. Os açúcares presentes nos EPS passam a ser constituídos quase exclusivamente de glicose (em torno de 40%), contendo uma pequena fração de ácido glicurônico (0,6%). Em relação aos ácidos graxos, a relação percentual aumenta de 42% para 60%, o que confere um caráter mais hidrofóbico às células crescidas neste substrato, como discutido por diversos autores (POGLIANI; DONATI, 1999; NATARAJAN; DAS, 2003). Apesar de haver uma aceitação sobre o papel dos EPS no processo de oxidação dos sulfetos metálicos, mediando os processos de adesão e ataque por meio dos íons férricos, nada pode ser ainda considerado definitivo a respeito destes fatos. Deste modo, a elucidação destes mecanismos poderá contribuir para um melhor entendimento de tal processo visando a otimização do processo de biolixiviação. Além disso, a maior parte dos estudos pelos quais são descritos os mecanismos de ação bacteriana foram conduzidos com pirita, cujo metal presente é o ferro, o que possibilita a ocorrência dos três mecanismos possíveis de ação bacteriana. 21 III. OBJETIVOS O presente estudo teve como objetivo avaliar a atividade de oxidação do A. ferrooxidans sobre os sulfetos sintéticos molibdenita e covelita (classificados diferentemente quanto suas suscetibilidades ao ataque bacteriano), no contexto dos mecanismos do polissulfeto e do tiossulfato, destacando-se os seguintes aspectos: • Avaliar o efeito da concentração de ambos sulfetos na atividade bacteriana • Estudar a cinética de oxidação bacteriana da covelita e molibdenita • Verificar a influência das diferentes fontes energéticas de crescimento na capacidade de oxidação dos sulfetos pela bactéria • Analisar a importância dos EPS e do íons férricos na atividade bacteriana • Verificar a possível existência de uma ação direta da bactéria sobre os sulfetos metálicos 22 IV. MATERIAIS E MÉTODOS IV.1. Linhagem bacteriana Para a realização dos estudos foi utilizada a linhagem bacteriana Acidithiobacillus ferrooxidans LR, isolada de licor de lixiviação estática de minério de urânio proveniente da mina de Lagoa Real-Bahia (GARCIA, 1991). IV.2. Amostras minerais Foram utilizados dois sulfetos metálicos sintéticos, covelita (CuS) e molibenita (MoS2), fornecidos pela Aldrich Chemical Company Incorporation (Milwaukee, EUA). A granulometria das amostras foi 100% < 0,2 mm e a pureza > 99,0%. As amostras também foram caracterizadas por difratometria de Raios-X em equipamento X D5000 – Siemens. IV.3. Meios de cultura Para a manutenção periódica da linhagem bacteriana assim como para a obtenção de células para a realização dos estudos de oxidação dos sulfetos utilizou-se o meio de cultura “T&K” (TUOVINEN; KELLY, 1973), bem como o meio 9K (SILVERMAN; LUNDGREN, 1959). Abaixo pode ser vista a composição e o modo de preparo dos meios de cultura citados: IV.3.1 Meio T&K A. Reagentes Solução A: (NH4)2SO4 .......................................................................0,5 g 23 K2HPO4 ...........................................................................0,5 g MgSO4.7H20 ....................................................................0,5 g pH (H2SO4 concentrado).................................................1,8 água destilada ......................................................q.s.p 800 mL Solução B: FeSO4.7H2O ..................................................................33,3 g pH (H2SO4 concentrado).....................................................1,8 água destilada .....................................................q.s.p. 200 mL B. Procedimento As soluções A e B foram preparadas separadamente, sendo a solução A esterilizada em autoclave a 120ºC por 20 minutos, e a solução B por filtração em membrana (0,45 µm de diâmetro de poro). No momento do uso as soluções A e B foram misturadas respectivamente na proporção de 4:1. IV.3.2. Meio 9K A. Reagentes (NH4)2SO4 .......................................................................3,0 g K2HPO4 ...........................................................................0,5 g MgSO4.7H20 ....................................................................0,5 g pH (H2SO4 concentrado).................................................2,8 água destilada ......................................................q.s.p 700 mL S0 ....................................................................................1% B. Procedimento 24 A solução e o enxofre foram preparados separadamente, sendo a solução esterilizada em autoclave a 120ºC por 20 minutos, e o enxofre a 110 ºC por uma hora. O enxofre foi adicionado a solução no momento do uso. IV.4. Preparo da suspensão celular Para a realização dos ensaios de oxidação dos sulfetos metálicos utilizou-se suspensões concentradas do A. ferrooxidans LR. As suspensões do A. ferrooxidans LR foram obtidas de culturas crescidas em um volume de 1,5 L do meio de cultura“T&K” por 48 horas. Este crescimento foi acompanhado pela oxidação do íon ferroso a íon férrico, caracterizado pela mudança da coloração do meio, do verde característico do íon Fe2+ ao vermelho característico do íon Fe3+. Para as suspensões crescidas em meio 9K, o crescimento foi acompanhado por medidas de pH, o qual diminui com a oxidação bacteriana do enxofre. O crescimento em meio 9K foi realizado por três gerações em um volume de 0,5 L do meio 9K, por um período de cerca de 15 dias, tempo hábil para a obtenção de considerável massa celular sem que a diminuição do pH (em torno de 1,5) cause inibição na linhagem bacteriana. Todas as culturas foram crescidas à temperatura de 30 ºC em mesa agitadora com rotação de 150 rpm. Após o crescimento, filtrou-se as culturas em papel de filtro Watman nº 1 para a retirada de precipitados do meio. A seguir centrifugou-se a solução (rotor JA-10, centrífuga Beckman Avanti J-25) à temperatura de 4 ºC e 10.000 g durante 30 minutos. O precipitado contendo a suspensão celular coletada foi então lavado em água acidificada (pH 1,8) com H2SO4 por três vezes e novamente centrifugada. Em seguida o precipitado de células foi ressuspendido em um volume de 10 mL de água acidificada a pH 1,8 com H2SO4. Para a realização dos testes onde foi retirada a camada exopolimérica das células bacterianas, a suspensão celular foi centrifugada por três vezes a 13.000 g, de acordo com procedimento descrito por Sand et al. (1995). 25 IV.5. Dosagem de proteínas totais (HARTREE, 1972) Para quantificação de proteína total da biomassa celular utilizou-se 1mL da suspensão de células, a qual foi centrifugada a 4000 g por 20 minutos. Em seguida o sobrenadante foi descartado, as células ressuspendidas em 1mL de NaOH 1 mol L-1 e mantidas em ebulição por 30 minutos para a completa hidrólise das células. Para a dosagem de proteína total retirou-se alíquotas dessa solução e utilizou-se o método de Lowry modificado por Hartree (1972) como descrito abaixo: A. Reagentes Solução A: KNaC4H4O6.4H2O .............................................................0,5 g Na2CO3...............................................................................25 g NaOH 1 Mol L-1.............................................................125 mL água destilada........................................................q.s.p. 250 mL Solução B: KNaC4H4O6.4H2O ..............................................................0,2 g CuSO4.5H20........................................................................0,1 g NaOH 1Mol L-1................................................................1,0 mL água destilada...................................................................9,0 mL Solução C: reagente de Folin-Ciocalteu...........................................10,0 mL água destilada................................................................30,0 mL 26 B. Procedimento A suspensão de células hidrolisadas foi diluída (1:10, 1:20) e colocada em tubos de ensaio (1 mL de cada diluição), aos quais adicionou-se 0,9 mL da solução A incubando-se em banho-maria por 10 minutos à uma temperatura de 50 ºC, e resfriando em temperatura ambiente. Em seguida foi adicionado 0,1 mL da solução B a cada tubo. Por último adicionou- se 3 mL da solução C incubando-se os tubos por 30 minutos a 50 ºC e resfriando a temperatura ambiente. Para a quantificação da proteína total, medidas da absorbância das soluções foram feitas em espectrofotômetro, no comprimento de onda de 650 nm, utilizando a soroalbumina bovina para a obtenção da curva padrão. As “proteínas totais” foram escolhidas como unidade biológica de rotina para expressar os resultados dos estudos de respirometria, pois o método utilizado é simples de ser realizado, preciso e muito sensível (15 -110 µg). Além disso, a contagem de unidades formadoras de colônia (UFC) de A. ferrooxidans como método de rotina é demorado (10 dias) e de custo muito elevado devido à utilização de agarose. IV.6. Estudos de respirometria celular A técnica de respirometria celular permite uma avaliação rápida e bastante sensível (ordem de µmol de oxigênio consumido) da oxidação do substrato. Esta técnica utiliza suspensões lavadas de células do A. ferrooxidans LR desacoplada de crescimento, ou seja, por ausência de CO2 não estão em processo de divisão celular. Para executar estes ensaios as células foram incubadas na presença de massas variáveis de CuS e MoS2 (20-300 mg para os estudos cinéticos; 100 e 200 mg para os demais ensaios). Metodologia experimental 27 A. Reagentes: - água acidificada com H2SO4 concentrado até pH 1,8 H2SO4 0,5 Mol L-1..........................................................14 mL água destilada .....................................................q.s.p. 100 mL - KOH, 20%. - solução de Brodie: NaCl ..................................................................................23 g cloreto de sódio ..................................................................5 g azul de Evans ...................................................................0,1 g água destilada .....................................................q.s.p. 500 mL B. Procedimento O respirômetro de Warburg (UMBREIT; BURRIS; STAUFFER, 1972) consiste basicamente de um frasco de reação, um reservatório lateral para adição de células e um poço central. Em cada um dos frascos de reação foram colocados 2,0 mL de água acidificada (pH 1,8), 0,5 mL de suspensão celular e uma massa dos sulfetos que variou de 20 a 300 mg. Em paralelo aos ensaios inoculados foram realizados ensaios como controles químicos, nos quais não houve adição da suspensão celular. Todos os ensaios respirométricos foram realizados em triplicatas. No poço central do frasco de reação foi colocada uma tira de papel de filtro pregueada, a qual foi embebida com 0,1 mL de KOH 20% com o intuito da absorção do CO2. Este procedimento teve como objetivo a eliminação desse gás do sistema para evitar o crescimento da bactéria pela fixação do mesmo, pois esta é uma espécie autotrófica, e também para que não houvesse interferência nas leituras da variação de pressão. Logo, qualquer modificação na pressão foi decorrente do consumo de oxigênio durante a oxidação do substrato. No compartimento principal do frasco ocorrem as reações a serem investigadas. Para execução do 28 ensaio foi acoplado a esses frascos manômetros graduados, os quais contém um líquido de densidade conhecida (solução de Brodie). Um esquema deste sistema é mostrado na Figura 5. Figura 5. Esquema básico do aparelho de Warburg. 29 O manômetro é constituído de dois ramos que se comunicam entre si em suas bases através de um tubo de borracha, obturado na extremidade inferior. Um dos ramos (esquerdo), permanece constantemente aberto durante o experimento enquanto o da direita termina no frasco de reação. Quando ocorre o consumo de oxigênio há uma diminuição da pressão e o menisco da solução de Brodie no ramo da direita se eleva. Essa diferença é indicada em milímetros na escala graduada e deve ser transformada em microlitros. Para tanto, multiplica- se a variação da altura em milímetros por uma constante (Κ), cujo cálculo é o que se segue: ( ) K = V - V 273 T V . a P T f f 0 + onde: VT - volume do conjunto frasco-manômetro. Vf - volume final do sistema experimental. T - 273 + t (temperatura de trabalho). a - coeficiente de solubilidade do oxigênio na água (0,02608). P0 - pressão do fluído manométrico (10,032 mm). Frascos de reação contendo o mesmo volume, porém sem células, foram utilizados como controles para avaliar a oxidação química natural dos substratos. Junto com o experimento também foi colocado um conjunto chamado de termobarômetro, contendo o mesmo volume do sistema experimental, porém só com água, o qual indicou variações de pressão causadas por mudanças de temperatura do ambiente. Essa variação foi registrada no mesmo instante da leitura dos manômetros dos ensaios e descontada das medidas destes, pois tal variação não foi causada pelo sistema experimental. Todo o conjunto frasco-manômetro foi mantido em um banho de água a 30ºC e sob agitação constante. As leituras da variação de pressão no manômetro, realizadas a cada 15 minutos na primeira hora e a cada 30 minutos 30 após a primeira hora de ensaio, foram então convertidas em volume de oxigênio consumido, como mostrado abaixo: Consumo de oxigênio (µL) = L. Κ onde: L - representa a leitura do manômetro. Κ - constante do sistema frasco-manômetro. 31 V. RESULTADOS E DISCUSSÃO V.1. Caracterização das amostras por difratometria de raios-X As Figuras 6 e 7 mostram os difratogramas de raios-X obtidos para as amostras sintéticas de molibdenita e covelita respectivamente. A análise dos difratogramas revela, como esperado, apenas a presença destes sulfetos, uma vez que ambos possuem elevado grau de pureza. V.2 Ensaios respirométricos com A. ferrooxidans LR crescido em íon ferroso De acordo com as equações simplificadas [5] (pg. 8) e [6] (pg. 10), de oxidação da molibdenita e da covelita respectivamente, pode-se notar que as mesmas ocorrem concomitante ao consumo de oxigênio e formação de sulfato e dos metais molibdênio IV e cobre II. Logo, as medidas do consumo de oxigênio obtidas a partir dos ensaios respirométricos estão diretamente relacionadas a oxidação dos referidos sulfetos metálicos. A Figura 8 mostra o consumo de oxigênio de covelita na presença e ausência do A. ferrooxidans LR. Para todas as massas utilizadas pode ser observado um maior consumo de oxigênio nos ensaios realizados na presença de bactéria, quando comparado aos respectivos ensaios realizados como controles químicos. Este fato evidencia a capacidade do A. ferrooxidans LR em aumentar a velocidade de oxidação da covelita (CuS), como já demonstrado por diversos trabalhos (POGLIANI et al., 1990; MONTEIRO; GARCIA; TUOVINEN, 1999). Outro aspecto que merece ser ressaltado é o aumento do consumo de oxigênio pela bactéria, à medida em que se aumenta a massa de sulfeto utilizada no ensaio, o que sugere uma cinética de saturação pelo substrato. 32 10 20 30 40 50 60 70 10 20 30 40 50 60 70 In te n si d a d e ( cp s) 2θ Cukα Figura 6. Difratogramas de Raios-X obtidos para a amostra de molibdenita (A) utilizada nos estudos de respirometria com o respectivo do padrão de molibdenita PDF 37-1492 (B). A B 2θ Cukα 33 20 30 40 50 60 70 20 30 40 50 60 70 In te n si d a d e ( cp s) 2θ Cukα Figura 7. Difratogramas de Raios-X obtidos para a amostra de covelita (A) utilizada nos estudos de respirometria com o respectivo do padrão de covelita PDF 6-464 (B). A B 2θ Cukα 34 0 50 100 150 200 0 50 100 150 200 250 300 0 150 300 450 600 0 50 100 150 200 250 300 A B Tempo (minutos) O xi gê ni o C on su m id o (µ L) C D Figura 8. Atividade de respiração do A. ferrooxidans LR (500µg de proteína total) na presença de massas de 100 mg (A), 150 mg (B), 200 mg (C) e 300 mg (D) de covelita como substrato oxidável. Símbolos: (�) inoculado, (�) controle químico. 35 Já em relação aos ensaios realizados com o sulfeto de molibdênio, não se observou atividade de oxidação no mesmo, caracterizado pelo não consumo de oxigênio pela bactéria durante os experimentos, como mostra a Figura 9. Tal fato deve estar associado a alta hidrofobicidade apresentada pela molibdenita (PISTACCIO et al., 1994), não permitindo, portanto, o ataque da bactéria ao sulfeto metálico. Para contornar tal problema testou-se a utilização do agente surfactante Tween 80 nos ensaios respirométricos. Foram testadas as concentrações de 0,1%, 0,25% e 0,5%. A concentração de 1% não foi testada pois a mesma provoca a inibição da atividade bacteriana (PISTACCIO et al., 1994). Como demonstra a Figura 10, o melhor comportamento foi observado para a concentração de 0,5% de Tween 80. Pistaccio et al., (1994) demonstraram que esta concentração também foi a que apresentou os melhores resultados tanto na solubilização de molibdênio, quanto na adesão bacteriana. Como mostra a Figura 11, a atividade de respiração do A. ferrooxidans LR em molibdenita realmente foi observada na presença do agente surfactante, devido a diminuição da hidrofobicidade do sulfeto. Entretanto, em nenhum dos experimentos, o O2 consumido atinge valores elevados, permanecendo sempre abaixo dos 100 µL. Alguns estudos (ROMANO et al. 2001a, 2001b) já haviam revelado a natureza refratária da molibdenita em ensaios de lixiviação bacteriana, nos quais a solubilização de molibdênio foi menor do que 1%. Em relação à concentração do substrato, o comportamento foi similar ao observado para a covelita, ou seja, o aumento da massa de sulfeto ocasionou também um aumento do consumo de oxigênio. Outro aspecto importante e que deve ser salientado foi o maior consumo de oxigênio nos ensaios com covelita em relação aos ensaios com molibdenita (em torno de 10 vezes), o que pode ser facilmente notado quando se compara as Figuras 8 e 11. 36 -15 0 15 30 45 0 50 100 150 200 250 0 15 30 45 0 50 100 150 200 250 O xi gê ni o co ns um id o (µ L) A B Tempo (minutos) C D Figura 9. Atividade de respiração do A. ferrooxidans LR (420µg de proteína total) na presença de massas de 100 mg (A), 150 mg (B), 200 mg (C) e 300 mg (D) de molibdenita como substrato oxidável em solução ácida (pH 1,8). Símbolos: (�) inoculado, (�) controle químico. 37 A maior susceptibilidade da covelita em relação a molibdenita frente ao ataque químico-bacteriano já foi demonstrado anteriormente (TRIBUTSCH e BENNET, 1981). Possivelmente, tal comportamento decorre das estruturas eletrônicas destes sulfetos metálicos. Desta maneira, a covelita, cujo valor de Kps é da ordem 10-35, possui maior solubilidade em ácido, diferentemente da molibdenita, cujo valor de Kps é mais baixo, da ordem 10-48. Assim, a covelita é denominada um sulfeto solúvel em ácido, o que facilita sua oxidação. Por outro lado, a molibdenita pertence a classe dos sulfetos insolúveis em ácido, podendo ser atacada apenas por íons Fe3+ (SCHIPPERS; SAND, 1996; SAND et al., 2001). Este fator parece ser preponderante na eficiência da oxidação de um e outro sulfeto metálico, e mostra ser a principal razão para as diferentes susceptibilidades dos sulfetos ao ataque químico-bacteriano. 38 0 10 20 30 40 0 10 20 30 40 50 0 50 100 150 200 250 0 10 20 30 40 A B O xi gê ni o co ns um id o (µ L) C Tempo (minutos) Figura 10. Atividade de respiração do A. ferrooxidans LR (420µg de proteína total) na presença de molibdenita (100 mg) como substrato oxidável em solução ácida (pH 1,8) com diferentes concentrações de Tween 80. A (0,1%), B (0,25%) e C (0,5%). Símbolos: (�) inoculado, (�) controle químico. 39 Figura 11. Atividade de respiração do A. ferrooxidans LR (420µg de proteína total) na presença de massas de 20 mg (A), 50 mg (B), 100 mg (C), e 200 mg(D) de molibdenita como substrato oxidável em solução ácida (pH 1,8) de Tween 80 (0,5%). Símbolos: (�) inoculado, (�) controle químico. 0 20 40 60 80 0 50 100 150 200 250 300 -10 0 10 20 30 40 0 50 100 150 200 250 300 A C O xi gê ni o C on su m id o (µ L) Tempo (minutos) B D 40 V.3. Estudos da cinética de oxidação da covelita e da molibdenita Nenhum estudo preliminar a respeito da cinética de oxidação da covelita e da molibdenita pelo A. ferrooxidans foi encontrado na literatura, portanto, os resultados obtidos neste trabalho parecem ser pioneiros. Para o estudo da cinética de oxidação dos sulfetos metálicos, foram calculadas as velocidades iniciais de oxidação em cada massa de sulfeto utilizada, e a partir destas, construída uma curva das velocidades de oxidação em relação à massa de substrato. As velocidades iniciais de oxidação foram obtidas a partir do coeficiente angular da parte linear das curvas de consumo de oxigênio de ambos os sulfetos. Como observado pela Figura 12, a covelita apresenta um típico comportamento de saturação pelo substrato, embora sua oxidação não siga a clássica cinética de Michaelis- Menten, como pode ser visto pelo aspecto sigmoidal da curva em oposição à hipérbole retangular característica de Michaelis-Menten. Como também pode-se notar, a velocidade de oxidação da covelita pelo A. ferrooxidans LR não tende a se alterar significativamente para massas acima de 300 mg, indicando a saturação pelo substrato. Uma curva sigmoidal deste tipo indica que o inicio da oxidação da covelita facilita sua subseqüente oxidação. A relação sigmoidal entre a velocidade de oxidação e a concentração do substrato pode ser avaliada pela equação de Hill (WHITAKER, 1972). Esta equação foi derivada da interação entre a hemoglobina e o oxigênio, a qual mostra um clássico comportamento sigmoidal. Equação de Hill: Vmax[S]n V0 = K½ + [S]n 41 onde V0 é a velocidade inicial de oxidação, n é a constante de Hill cujo valor é igual ao número de sítios ativos de uma enzima e K½ representa a concentração de substrato na qual a velocidade é a metade da velocidade máxima da reação. Esta equação pode ser rearranjada para: a qual apresentará uma relação linear com os dados experimentais caso exista um grau de cooperatividade envolvido. Como revela a Figura 13, no caso da covelita, a curva da equação logarítmica de Hill é linear, sugerindo, portanto, que existe uma cooperatividade para a oxidação deste sulfeto. Esta cooperatividade pode ser medida pela razão entre a concentração de substrato necessária para alcançar 90% da velocidade máxima de reação (0,9Vmax), e a concentração de substrato necessária para atingir 10% da velocidade máxima (0,1Vmax) (WHITAKER, 1972). Esta razão é denominada Rs. Para cinéticas de reação com comportamentos sigmoidais, este valor de Rs pode distinguir cooperatividades positivas e negativas. Quando o valor de Rs for menor do que 81, isto indica que o sistema mostra uma cooperatividade positiva, ou seja, após o início da reação a velocidade tende a aumentar. Em contraste, quando o valor de Rs for maior do que 81, a cooperatividade será negativa, indicando que após o início da reação a velocidade desta tende a diminuir. O valor de Rs obtido para a reação de oxidação da covelita foi de aproximadamente 5, o que sugere uma cooperatividade positiva, evidenciado pelo aumento exponencial da velocidade de oxidação do CuS. A partir da Figura 13 foram obtidos os valores da constante de Hill e do k½. Os resultados mostraram um valor de 2,55 para a constante de Hill, sugerindo que podem haver dois tipos de “sítios ativos” na bactéria. O valor de k½ foi igual a 104 mg de Vmax – V0 V0 log = nlog[S] – log k½ 42 CuS, o que indica a massa de covelita na qual a velocidade de oxidação tem metade de seu valor máximo. Por sua vez, o Vmax para a covelita foi de 0,37 µmol O2 min-1 mg-1 proteína. Provavelmente, este comportamento sigmoidal ocorre porque a dissolução da covelita é governada tanto pelo ataque das células bacterianas aderidas à superfície do mineral, quanto pelas células bacterianas em suspensão, fato condizente com o valor obtido para a constante de Hill (n = 2,55). Assim, quando as bactérias aderidas ao sulfeto mineral iniciam a oxidação do mesmo, são liberados substratos intermediários para a solução (H2S, HS-, etc), como mostram as equações [13] e [14], os quais passam a ser utilizados pelas células livres originando o aumento do consumo de oxigênio. Neste caso se estabelece uma cooperação entre as células bacterianas aderidas no sulfeto e as células em suspensão. 43 Figura 12. Curva da velocidade inicial de oxidação em função da massa de covelita. Figura 13. Curva da equação de Hill linearizada para o sulfeto de cobre covelita. 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 -2.0 -1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 lo g V 0/( V m ax - V 0) log (massa CuS ) 0 50 100 150 200 250 300 350 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 V 0 ( µm ol m in -1 m g -1 p ro te ín a) massa de sulfeto (mg) 44 Em relação a molibdenita, como mostra a Figura 14A, a mesma também apresentou um comportamento de saturação pelo substrato. Contudo, diferentemente da covelita, o MoS2 segue a clássica cinética de Michaelis-Menten na faixa de concentração testada, pois o gráfico de suas taxas de oxidação em função das massas de sulfeto é melhor ajustado por uma hipérbole retangular. Como a oxidação do MoS2 só poderia acontecer com a aderência das células bacterianas sobre a superfície do mineral, uma vez que não há outro oxidante no meio e este sulfeto não apresenta susceptibilidade ao ataque ácido, esta adesão governa a velocidade de oxidação. Por sua vez, a velocidade de oxidação aumenta quase proporcionalmente com o aumento da concentração de substrato, até a saturação. Com base nisto, foi construído o gráfico de duplo-recíproco de Lineweaver-Burk (Figura 14B) para a obtenção de importantes parâmetros cinéticos, como a velocidade máxima de oxidação (Vmax) e a constante de Michaelis-Menten (Km), respectivamente 5,7x10-2 µmol O2 min-1 mg-1 proteína e 28,0 mg de MoS2. Estudos cinéticos da oxidação da pirita e do íon ferroso revelaram que ambos também seguem uma cinética de Michaelis-Menten. O valor de Km obtido para a pirita foi de 2,5% de densidade de polpa (LIZAMA; SUZUKI, 1989), o qual corresponderia a 62,5 mg MoS2 no presente estudo, e para o íon ferroso foi 0.37 mmol L-1 (NEMATI et al., 1998). Quando compara-se os valores de Km obtidos para os sulfetos metálicos e para o íon ferroso, evidencia-se a diferença de afinidade do A. ferrooxidans LR, associada a complexidade do fenômeno de oxidação dos sulfetos. Por envolver substratos sólidos, uma série de fatores e complicações estão envolvidos na oxidação dos sulfetos, como interações superficiais hidrofóbicas e eletrostáticas, processos corrosivos, etc. 45 Figura 14. Curva de Michaelis-Menten (A) e o respectivo gráfico de duplo recíproco de Lineweaver-Burk (B) para a molibdenita. 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 20 25 30 35 40 1 /A ( µm o l-1 m in m g pr ot eí na ) 1/massa de sulfeto (mg-1) 0 50 100 150 200 250 300 0.020 0.025 0.030 0.035 0.040 0.045 0.050 0.055 0.060 V max A tiv id ad e ( µ m o l m in -1 m g -1 p ro te ín a) massa do sulfeto (mg) A B 46 V. 4. Ensaios respirométricos com A. ferrooxidans LR deficientes em EPS Nos ensaios realizados com a bactéria após centrifugação para retirada dos exopolímeros, se observou que tanto em covelita (Figura 15) como em molibdenita (Figura 16) a atividade de respiração não foi significativamente afetada. Como demonstrado também por Pogliani e Donati (1999), células de A. ferrooxidans deficientes em EPS foram capazes de oxidar a covelita, o que pode ter ocorrido devido ao ataque ácido. Outro fato que talvez também possa acontecer é a permanência dos exopolímeros (EPS) nas células bacterianas. Entretanto, embora tenha permanecido EPS suficientes para iniciar a oxidação da molibdenita, se esperaria ao menos uma diminuição na velocidade de oxidação como demonstrado por Pogliani e Donati (1999). Estes autores mostraram que a extensão da adesão do A. ferrooxidans em covelita é diminuída quando os EPS são removidos. Ao mesmo tempo, a velocidade de solubilização de cobre decresce quando células deficientes em EPS são utilizadas. Um fator que pode ter influído nos resultados apresentados pelos ensaios respirométricos foi a elevada concentração de células utilizadas nos experimentos. Logo, um elevado número de células pode ter aderido à superfície do sulfeto, fazendo com que a deficiência nos EPS não tivesse significativa influência, embora, como será discutido posteriormente, acreditamos que não há a necessidade dos EPS para a biolixiviação dos sulfetos metálicos. 47 Figura 15. Atividade de respiração do A. ferrooxidans LR deficiente em EPS (525 µg de proteína total) na presença de massas de 100 mg (A) e 200 mg (B) de covelita como substrato oxidável. Símbolos: (�) inoculado, (�) controle químico. Figura 16. Atividade de respiração do A. ferrooxidans LR deficiente em EPS (525 µg de proteína total) na presença de massas de 100 mg (A) e 200 mg (B) de molibdenita como substrato oxidável em solução ácida (pH 1,8) de Tween 80 (0,5%). Símbolos: (�) inoculado, (�) controle químico. 0 50 100 150 200 250 0 10 20 30 40 50 60 0 50 100 150 200 250 Tempo (minutos) O xi gê ni o C on su m id o (µ L) A B 0 50 100 150 200 250 300 0 100 200 300 0 50 100 150 200 250 300 A O xi gê ni o co ns um id o (µ L) Tempo (minutos) B 48 V.5. Ensaios respirométricos com A. ferrooxidans LR crescido em enxofre O acompanhamento do crescimento do A. ferrooxidans LR em enxofre foi feito por medidas periódicas de pH. Como demonstra a Figura 17, o crescimento do A. ferrooxidans LR em enxofre é evidenciado pelo decréscimo do pH, devido a oxidação do enxofre elementar com a conseqüente produção de ácido. Como já demonstrado, o A. ferrooxidans LR quando crescido normalmente em meio de cultura contendo íon ferroso como fonte energética é capaz de utilizar os sulfetos molibdenita e covelita como substratos oxidáveis. Não obstante, resultados muito semelhantes a estes foram obtidos nos estudos realizados com o A. ferrooxidans LR crescido por três gerações em S0. Pelas Figuras 18 e 19 observa-se que, tal como para a bactéria crescida em ferro (II), o volume de oxigênio consumido é significativamente diferente entre CuS e MoS2. Enquanto o consumo de O2 atinge valores de aproximadamente 250 e 400 µL para a covelita (100 mg e 200 mg respectivamente), no caso da molibdenita estes valores não superam os 50 µL. De tal forma, os dados obtidos sugerem que não há diferenças expressivas na atividade de oxidação do A. ferrooxidans LR frente os sulfetos estudados, no que concerne a fonte energética de crescimento. Se por um lado a presença de íons férricos não é condição para a oxidação da covelita, pois isto também pode ocorrer pelo ataque ácido, para os ensaios realizados com a molibdenita se esperaria resultados negativos quanto sua oxidação na presença de células crescidas em S0, pois de acordo com o mecanismo do tiossulfato, os íons férricos são mediadores dos primeiros passos na degradação desta classe de sulfetos metálicos (SAND et al., 1995; SCHIPPERS; SAND, 1999). Como discutido anteriormente, o A. ferrooxidans quando crescido em S0 como fonte energética tem a composição dos EPS modificada, não apresentando mais íons férricos (GERHKE et al., 1998). Logo, a oxidação dos sulfetos 49 metálicos não pode ser atribuída a presença de íons férricos nas substâncias exopoliméricas das células bacterianas. Estas informações são fortes evidências de que, o papel dos íons férricos na mediação do processo de oxidação microbiológica dos sulfetos insolúveis em ácido, sobretudo a respeito da complexação com os EPS, é muito questionável. Ensaios de respirometria celular da molibdenita também foram conduzidos com suplementação de íons férricos (120 mMol L-1), uma vez que a adição dos mesmos pode aumentar a velocidade de oxidação do referido sulfeto (TRIBUTSCH; BENNET, 1981). Teoricamente, os íons férricos, como agentes oxidantes, são capazes de iniciar a oxidação do sulfeto metálico, e os íons ferrosos resultantes são posteriormente oxidados pela bactéria num processo cíclico, o qual resulta em uma elevação do consumo de oxigênio e da velocidade de oxidação. Lizama e Suzuki (1989) obtiveram um considerável aumento no consumo de O2 da pirita após adição de íons férricos. Entretanto, os resultados aqui obtidos, como mostra a Figura 20, não apresentaram nenhum acréscimo seja no consumo de oxigênio seja na velocidade de oxidação. Isto sugere a não oxidação do sulfeto pelos íons férricos devido a um processo de cinética lenta e, como conseqüência, a não regeneração dos íons férricos pela bactéria. Provavelmente, devido a rapidez do ensaio (cerca de 300 minutos), o tempo pode não ter sido suficiente para a oxidação do MoS2 pelos íons férricos. De qualquer modo, os resultados obtidos contrariam a teoria na qual os íons férricos complexados aos EPS desempenham papel fundamental na dissolução dos sulfetos denominados insolúveis em ácido. 50 0 2 4 6 8 10 12 14 16 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 pH Tempo (dias) Figura 17. Variação do pH durante o crescimento do A. ferrooxidans LR em enxofre elementar. 51 Figura 18. Atividade de respiração do A. ferrooxidans LR crescido em S0 (262 µg de proteína total) na presença de massas de 100 mg (A) e 200 mg (B) de molibdenita como substrato oxidável em soluça ácida (pH 1,8) de Tween 80 (0,5%). Símbolos: (�) inoculado, (�) controle químico. Figura 19. Atividade de respiração do A. ferrooxidans LR crescido em S0 (262 µg de proteína total) na presença de massas de 100 mg (A) e 200 mg (B) de covelita como substrato oxidável. Símbolos: (�) inoculado, (�) controle químico. 0 50 100 150 200 250 3000 50 100 150 200 250 300 0 10 20 30 40 50 B Tempo (minutos) A O xi gê ni o C on su m id o (µ L) 0 50 100 150 200 250 300 0 100 200 300 400 0 50 100 150 200 250 300 O xi gê ni o C on su m id o (µ L) A B Tempo (minutos) 52 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 0 10 20 30 40 50 O xi gê ni o co ns um id o (µ L) Tempo (minutos) Figura 20. Atividade de respiração do A. ferrooxidans LR crescido em S0 (262 µg de proteína total) na presença de molibdenita (100 mg) como substrato oxidável em solução ácida (pH 1,8) de Tween 80 (0,5%) com suplementação de 120 mMol L-1 de Fe3+. Símbolos: (�) inoculado, (�) controle químico. 53 No que se refere à covelita, os resultados obtidos com as células crescidas em enxofre podem ser explicados pela solubilização em ácido, como apresentam alguns autores (PORRO et al., 1997; POGLIANI; DONATI, 1999.) Contudo, a Figura 21 mostra ensaios de respirometria da covelita conduzidos na presença de diferentes concentrações de ácido sulfúrico. Como pode ser observado, o oxigênio consumido, em nenhuma das concentrações de ácido testadas, superou os 40 µL, indicando uma lenta oxidação química comparada com a microbiológica. De acordo com o mecanismo dos polissulfetos, o primeiro passo na oxidação da covelita é a solubilização de Cu2+ e a formação de H2S, como mostra a equação [9]. Crundwel (2001) propôs que este H2S gerado, uma vez saturado em sol