RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta tese será disponibilizado somente a partir de 01/01/2018. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP CÂMPUS DE JABOTICABAL MAPEAMENTO DE MICROSSATÉLITES FUNCIONAIS DE SORGO (EST-SSR) EM CANA-DE-AÇÚCAR Silvan Gomes de Brito Engenheiro Agrônomo 2016 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP CÂMPUS DE JABOTICABAL MAPEAMENTO DE MICROSSATÉLITES FUNCIONAIS DE SORGO (EST-SSR) EM CANA-DE-AÇÚCAR Silvan Gomes de Brito Orientadora: Profa. Dra. Luciana Rossini Pinto Co-orientador: Prof. Dr. Renato Vicentini dos Santos Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – Unesp, Câmpus de Jaboticabal, como parte das exigências para a obtenção do título de Doutor em Agronomia (Genética e Melhoramento Genético de Plantas) 2016 Brito, Silvan Gomes M499a Mapeamento de microssatélites funcionais de sorgo (EST-SSR) em cana-de-açúcar. / Silvan Gomes de Brito. – – Jaboticabal, 2016 xix, 110 p. ; 28 cm Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, 2016 Orientador: Luciana Rossini Pinto Banca examinadora: Dilermando Perecin, Fernanda Raquel Camilo dos Santos, Gustavo Vitti Moro, Michael dos Santos Brito Bibliografia 1. Colinearidade. 2. Genes ortólogos. 3. Microssatélites. 4. Mapeamento comparativo. 5. Marcador molecular. I. Título. II. Jaboticabal-Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias. CDU 619:616.728.3:636.92 Ficha catalográfica elaborada pela Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação – Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação - UNESP, Câmpus de Jaboticabal. DADOS CURRICULARES DO AUTOR SILVAN GOMES DE BRITO – Nasceu em 05 de maio de 1984, no município de Santa Rita- Paraíba. Em dezembro de 2005, concluiu o curso Técnico em agropecuária, no Centro de Formação Tecnólogos, Universidade Federal da Paraíba, Bananeiras-PB. Ingressou no curso de Engenharia Agronômica (Bacharel), no ano de 2004, no Centro de Ciências Agrárias, Universidade Federal da Paraíba, Areia-PB, onde na mesma, obteve o título de Engenheiro Agrônomo no ano de 2009. Em julho de 2012, obteve o título de Mestre em Agronomia, pela Universidade Federal Rural de Pernambuco, Recife-PE. Em agosto de 2012, ingressou no programa de Pós-graduação em Agronomia (Genética e Melhoramento de Plantas), pela Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal, São Paulo. Realizou estágio curricular para desenvolvimento da tese, no Centro Avançado da Pesquisa Tecnológica do Agronegócio de Cana, Instituo Agronômico de Campinas-IAC/RP. Tua caminhada ainda não terminou... A realidade te acolhe dizendo que pela frente o horizonte da vida necessita de tuas palavras e do teu silêncio. Se amanhã sentires saudades, lembra-te da fantasia e sonha com tua próxima vitória. Vitória que todas as armas do mundo jamais conseguirão obter, porque é uma vitória que surge da paz e não do ressentimento. É certo que irás encontrar situações tempestuosas novamente, mas haverá de ver sempre o lado bom da chuva que cai e não a faceta do raio que destrói. Tu és jovem. Atender a quem te chama é belo, lutar por quem te rejeita é quase chegar à perfeição. A juventude precisa de sonhos e se nutrir de lembranças, assim como o leito dos rios precisa da água que rola e o coração necessita de afeto. Não faças do amanhã o sinônimo de nunca, nem o ontem te seja o mesmo que nunca mais. Teus passos ficaram. Olhes para trás... mas vá em frente pois há muitos que precisam que chegues para poderem seguir-te. Charles Chaplin A Deus Ofereço Dedico Aos meus pais, Sebastião Gomes e Maria da Penha, a minha irmã, Silvana e aos amores de minha vida (minhas filhas), Janice, Samantha Gabrielle e Lavínia Fernanda. Agradecimentos A Deus em primeiro lugar, por ter me dado a oportunidade de viver e a capacidade para enfrentar e vencer as dificuldades proporcionadas ao longo da vida. À minha família, pelo apoio e confiança no meu trabalho. Aos meus queridos pais por terem proporcionado toda condição para concluir este meu objetivo. À minha irmã, pela força e carinho. Ao meu cunhado Eduardo, pelo apoio e grande amizade. À Paula Fernanda e seus pais, José Gomes e Anunciada Dutra e Berenice Eugênio, por acreditar em mim, dando crédito a minha escolha profissional e a minha inserção em sua família. A minha orientadora Profª. Dra. Luciana Rossini Pinto, pelo convívio, paciência, amizade e ensinamentos transmitidos, contribuindo para minha formação profissional e acadêmica ao longo desses anos. Ao meu Co-orientador. Dr. Renato Vicentini dos Santos, pelas valiosas contribuições que melhoraram a qualidade deste trabalho. Aos Professores do Programa de Pós-Graduação em Agronomia (Genética e Melhoramento Genético de plantas) da UNESP/FCAV, pelos ensinamentos e dedicação. Ao professor Dr. Dilermando Perecin, pelos ensinamentos, paciência e a valiosa contribuição na análise de dados. A Dra. Karen Toledo, por doar as sementes dos híbridos de sorgo da empresa Dow AgroScienses utilizadas nesse estudo. Aos funcionários da seção técnica do Programa de Pós-Graduação da UNESP/FCAV, pela paciência e constantes ajudas fornecidas. Aos amigos Alisson Esdras, Alisson Jales, Guilherme, Gustavo Hugo, Hudson, Ivanildo, Jacqueline Ferraça, Lucas (o paulista), Marília, Miquéias. Aos companheiros GOU (Grupo de Oração Universitária), Andréa, Daniel, Denise, Liziane, Natalia Águila e Roberto pelos momentos de oração e amizade construída ao longo desses anos. Aos amigos do laboratório de Biotecnologia do Centro de Cana-IAC/RP, Alexandre, Carol Neuber, Cibele, Fernanda Raquel, Isadora (Izinha), Jéssica, Juliana, Larissa, Maria Natália, Maria Leticia, Marcel, Michael, Rafael e em especial ao Maycon (Maycão) e a Thaís, pela ajuda e por compartilharem seus conhecimentos. Aos funcionários do Centro de Cana-IAC/RP, pela paciência e constantes ajudas fornecidas, em especial a D. Marta, pelo carinho, atenção e amizade. Ao apoio institucional e financeiro da Universidade Estadual Paulista e Centro Avançado da Pesquisa Tecnológica do Agronegócio de Cana/Apta-IAC/RP. A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES, pela concessão à bolsa. Enfim, a todos e aqueles que não pude citar, mas que contribuíram para a conclusão desta minha etapa profissional. Muito obrigado! SUMÁRIO RESUMO...................................................................................................................... i ABSTRACT ................................................................................................................. ii CAPÍTULO I ................................................................................................................ 1 1 INTRODUÇÃO GERAL ........................................................................................ 2 2 REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................ 4 2.1 Aspectos gerais da cultura da cana-de-açúcar ......................................... 4 2.2 Marcadores microssatélites derivados das etiquetas de sequências expressas (EST-SSRs) e transferibilidade entre gêneros correlatos ................ 6 2.3 Mapeamento genético .................................................................................. 9 2.4 Construção de mapa genético .................................................................. 11 2.5 Mapeamento comparativo ......................................................................... 11 2.6 Mapeamento de QTL em cana-de-açúcar ................................................. 13 2.7 Desenvolvimento de marcadores microssatélites a partir de sequências ortólogas conservadas (COS) entre cana e sorgo ............................................ 15 2.8 Importância do sorgo para o mapeamento genético da cana-de- açúcar... ................................................................................................................ 18 3 REFERÊNCIAS .................................................................................................. 21 CAPÍTULO II ............................................................................................................. 34 DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE MARCADORES COS-EST-SSRS ENTRE CANA E SORGO ......................................................................................... 34 RESUMO................................................................................................................... 35 ABSTRACT ............................................................................................................... 36 1 INTRODUÇÃO ................................................................................................... 37 2 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................... 39 2.1 Material vegetal .......................................................................................... 39 2.2 Obtenção de sequências de etiquetas expressas ortólogas conservadas entre cana e sorgo (COS-EST) contendo microssatélites ................................ 40 2.3 Desenho dos pares de primers (COS-EST-SSRs) ................................... 40 2.4 Anotação funcional dos COS-EST-SSR ................................................... 41 2.5 Extração do DNA genômico ...................................................................... 41 2.6 Amplificação dos COS-EST-SSR .............................................................. 42 2.7 Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante .............................. 42 2.8 Análise de polimorfismo dos COS-EST-SSR ........................................... 46 3 RESULTADOS ................................................................................................... 46 3.1 Identificação dos COS-EST-SSRs............................................................. 46 3.2 Anotação funcional dos COS-EST-SSR ................................................... 48 3.3 Análise de polimorfismo dos COS-EST-SSRs em cana e sorgo ............ 48 4 DISCUSSÃO ...................................................................................................... 53 5 CONCLUSÃO ..................................................................................................... 56 6 REFERÊNCIAS .................................................................................................. 57 CAPÍTULO III ............................................................................................................ 62 MAPEAMENTO DE MARCADORES MOLECULARES DE SORGO EM CANA-DE- AÇÚCAR ................................................................................................................... 62 RESUMO................................................................................................................... 63 ABSTRACT ............................................................................................................... 64 1 INTRODUÇÃO ................................................................................................... 65 2 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................... 66 2.1 Material vegetal .......................................................................................... 66 2.2 Genotipagem da população de mapeamento .......................................... 67 2.2.1 Extração e quantificação do DNA genômico..................................... 67 2.2.2 Marcadores microssatélites genômicos (gSSRs) e derivados de sequências expressas (EST-SSRs) de sorgo ................................................. 67 2.2.3 Amplificação dos COS-EST-SSR ........................................................ 67 2.3 Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante .............................. 68 2.4 Fenotipagem da população de mapeamento ........................................... 68 2.4.1 Delineamento experimental ................................................................ 68 2.4.2 Análise fenotípica ................................................................................ 68 2.5 Análise segregação de marcadores em dose única ............................... 71 2.6 Construção do mapa genético .................................................................. 72 2.7 Análise de associação ............................................................................... 72 3 RESULTADOS ................................................................................................... 73 3.1 Marcadores em dose única gSSRs, EST-SSRs de sorgo e COS-EST- SSRs. ..................................................................................................................... 73 3.2 Mapa de ligação ......................................................................................... 75 3.3 Comparação entre os grupos de ligação de cana-de-açúcar e o mapa consenso de sorgo .............................................................................................. 75 3.4 Associação dos marcadores de sorgo com os caracteres fenotípicos 79 3.4.1 Pol%Cana ................................................................................................. 81 3.4.2 Fibra% ....................................................................................................... 82 4 DISCUSSÃO ...................................................................................................... 83 5 CONCLUSÃO ..................................................................................................... 87 6 REFERÊNCIAS .................................................................................................. 88 i Mapeamento genético de microssatélites funcionais de sorgo (EST-SSRs) em cana-de-açúcar RESUMO - O genoma do sorgo tem sido utilizado como referência em estudos de genômica funcional e comparativa em cana-de-açúcar. A utilização do genoma do sorgo, em estudos de mapeamento comparativo, tem contribuído para auxiliar a detecção de QTL (locus de caracteres quantitativos) em cana-de-açúcar. Marcadores microssatélites de sorgo podem ser empregados no mapeamento comparativo com a cana-de-açúcar, assim como, o desenvolvimento de marcadores microssatélites a partir de sequências ortólogas conservadas (COS - Conserved Orthologous Sequences) podem servir de “marcadores âncoras” entre estas duas espécies. No presente trabalho, marcadores microssatélites de sorgo foram incorporados em um mapa prévio de ligação derivado do cruzamento entre o clone IACSP95-3018 e a cultivar IACSP93-3046, ambos do Programa de Melhoramento Genético de Cana-de- Açúcar do Instituto Agronômico de Campinas (IAC). Paralelamente, um conjunto de marcadores microssatélites obtidos a partir da identificação de sequências expressas ortólogas conservadas (COS) entre cana-de-açúcar e sorgo foram desenvolvidos e avaliados quanto ao seu potencial de polimorfismo e mapeamento em cana-de- açúcar. Os marcadores obtidos também foram utilizados para identificar associações putativas aos parâmetros de qualidade (Fibra% e Pol%Cana). Um total de 41 pares de microssatélites COS-EST-SSRs foi desenhado, dos quais 34 produziram amplicons em um grupo de 24 genótipos de Saccharum e Sorghum. O número de alelos variou de 2 a 15 com valor médio de PIC (conteúdo de informação de polimorfismo) de 0,71. Os 29 pares de primers de microssatélites de sorgo, juntamente com os 41 pares de primers COS-EST-SSRs genotipados na população de mapeamento produziram um total de 120 marcadores polimórficos, dos quais 92 segregaram em dose única. Destes 92, 52 (56,5%) foram incorporados ao mapa prévio originando 138 grupos de ligação agrupados em 12 grupos de homologia. A maioria das associações entre marcadores e o caractere Pol%Cana detectadas por meio da análise de marcas simples foram de efeito positivo contribuindo para o aumento deste caractere sendo apenas duas com contribuição negativa. De forma geral, os marcadores derivados de sorgo foram promissores no mapeamento da população aqui apresentada. Palavra-chave: colinearidade, genes ortólogos, mapeamento comparativo, marcador molecular, microssatélites ii Genetic mapping of sorghum functional microsatellites (EST-SSRs) markers in sugarcane ABSTRACT- Sorghum genome has been used as a reference in functional and comparative genomics studies of sugarcane. The sorghum genome has aided to colocalize QTL (quantitative trait locus) in sugarcane through comparative mapping approach. Sorghum microsatellite markers, as well as, the development of microsatellite markers derived from orthologous conserved sequences (COS) can serve as "anchors markers" in comparative mapping between these two species. In the present study, sorghum microsatellite markers were included in a previous map derived from a bi-parental cross between a clone (IACSP95-3018) and a sugarcane cultivar (IACSP93-3046) from the Instituto Agronômico de Campinas (IAC) sugarcane breeding program. A set of microsatellite markers derived from conserved orthologous (COS-EST-SSRs) sequences between sugarcane and sorghum was developed and evaluated for their polymorphism and mapping potential in sugarcane. These markers were also used to identify putative associations for sugarcane quality parameters (fiber% and Pol% Cane). A total of 41 COS-EST-SSRs primer pairs was designed, of which 34 produced amplicons in a group of 24 genotypes of Saccharum and Sorghum. The number of alleles ranged from 2 to 15 with an PIC (polymorphism information content) average value of 0.71. The 29 sorghum SSR primer pairs along with the 41 COS-EST-SSR primer pairs was genotyped in the mapping population and produced a total of 120 polymorphic markers, of which 92 were single dose markers. Of these, 52 (56.5%) were added to the previous map generating 138 linkage groups grouped into 12 homology groups. The majority of the single marker-trait associations detected for Pol% Cane showed positive effects contributing to increase this trait (only two showed negative contribution to Pol% Cane). In general, the sorghum derived markers were promising in the genetic mapping of the bi-parental population evaluated. Keyword: collinearity, orthologous genes, comparative mapping, molecular markers, microsatellites iii LISTA DE TABELAS CAPÍTULO II - IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE MARCADORES COS- EST-SSRS ENTRE CANA E SORGO Tabela 1 - Genótipos utilizados na avaliação dos pares de primers flanqueadores de microssatélites derivados de sequências de etiquetas expressas ortólogas conservadas (COS-EST-SSRs) entre cana e sorgo......................................................................................... 39 Tabela 2 - Identificação das sequências ortólogas conservadas na base de dados SUCEST, iniciadores COS-EST-SSRs com suas respectivas sequências (forward/reverse), temperatura de anelamento (Tm), tamanho do produto esperado (TPes) e similaridade esperada.............................................................................................. 43 Tabela 3 - Classes de motivos de COS-EST-SSR e respectiva porcentagem de amplificação nos gêneros de Saccharum e Sorghum........................... 50 Tabela 4 - Identificação dos COS-EST-SSRs, número de alelos (NA), variação do tamanho (pb), conteúdo de informação polimórfica (PIC) e heterozigosidade esperada (He) dos marcadores COS-EST-SSRs avaliados em 24 genótipos de cana e sorgo.................................................................................................... 51 CAPÍTULO III - MAPEAMENTO E ASSOCIAÇÃO DE MARCADORES COS-EST- SSRs, gSSR e EST-SSR DE SORGO EM CANA-DE-AÇÚCAR Tabela 1 - Relação dos pares de primers sequências forward e reverse, temperatura de anelamento (Ta) e tamanho do produto amplificado para os gSSRs e EST-SSRs avaliados............................................................................................... 69 Tabela 2 - Número de marcadores em dose única obtidos por EST-SSR e gSSR de sorgo e COS-EST-SSRs em cruzamento bi-parental....................... 74 Tabela 3 - Análise descritiva dos dados fenotípicos da população de mapeamento derivada de um cruzamento bi-parental entre o clone IACSP95-3018 e a cultivar IACSP93- 3046........................................................................................................ 79 Tabela 4 - Efeito de marcadores COS-EST-SSRs, gSSR e EST-SSRs associados a variável Pol%Cana avaliados na população derivada do cruzamento bi-parental............................................................................................... 81 iv Tabela 5 - Percentagem da variação fenotípica explicada pelas associações (R2%) parciais e múltiplas (R2 total) para o caráter Pol%Cana para marcadores do tipo COS-EST-SSRs, gSSR e EST-SSRs via procedimento stepwise do SAS.............................................................. 82 Tabela 6 - Efeito de associações (R2%) parciais e múltiplas (R2 total) para o caráter Fibra% para marcadores do tipo COS-EST-SSRs, gSSR e EST-SSRs via procedimento Stepwise do SAS......................................................................................................... 83 v LISTA DE FIGURAS CAPÍTULO I – INTRODUÇÃO GERAL Figura 1 - Duplicação do gene. A e A’ são ortólogos porque são relacionados por ascendência. Adaptada de Neale e Krutovsky (2005)................................................................................................... 16 CAPÍTULO II - IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE MARCADORES COS- EST-SSRS ENTRE CANA E SORGO Figura 1 - Identificação de sequências EST-SSR ortólogos conservados (COS- EST-SSR) entre os genomas de cana e sorgo. Fonte: Adaptado de Vicentini et al. (2012)............................................................................ 47 Figura 2 - Alinhamento realizado utilizando a ferramenta Clustal W: sequências ortólogas de cana em sorgo (SCAGLB1070D03.g-Sb04g000230.1, SCCCLR1069H09.g-Sb02g041350.1, SCCCCL3005C02.g- Sb01g030835.1, SCCCRZ2C04A03.g-Sb01g019290.1 e SCJLFL4187G07.g-Sb01g011810.1, respectivamente). Alinhamento utilizado na obtenção de primers COS-EST-SSRs: (A) alinhamento perfeito na região complementar ao primer forward (retângulo verde), na região do COS-EST-SSR (retângulo vermelho) e na região complementar ao primer reverse (retângulo azul). Alinhamentos não utilizados na obtenção de primers COS-EST-SSRs: (B) Gaps e incompatibilidade de nucleotídeos na região complementar ao primer (retângulo verde); região do COS-EST-SSR (retângulo vermelho); (C) COS-EST-SSR localizados no início de uma sequência alinhada; (D) Alinhamento com tamanho inferior a 150 pb e (E) COS-EST-SSR localizados no final de uma sequência alinhada................................................................................................ 49 Figura 3 - Análise eletroforética dos produtos amplificados com primers COS- EST-SRR separados em gel de poliacrilamida desnaturante 6% e visualizados por meio de coloração com prata. M: marcador 10-pb; híbridos de sorgo (1: 1G100; 2: 1G220; 3: 1G233; 4: 1G244; 5: 1G282; 6: SS318; 7: 50A40); cultivares comerciais de cana (8: IACSP95-5000; 9: RB867517; 10: SP801842; 11: SP803250; 12: RB835054; 13: RB855453); clones de S. officinarum (14: Ajax; 15: Badila; 16: Badila de java; 17: Bourbon sur; 18: Creola; 19: Sabura); clones de S. spontaneum (20: Dacca; 21: Djantoerll; 22: Formosa; 23: Gehrabon e 24: Holes1)........................................................................ 50 vi Figura 4 - Dendrograma (UPGMA) baseado na dissimilaridade estimada pelo complemento do coeficiente de similaridade de Jaccard para 24 genótipos.............................................................................................. 52 CAPÍTULO III - MAPEAMENTO E ASSOCIAÇÃO DE MARCADORES COS-EST- SSRs, gSSR e EST-SSR DE SORGO EM CANA-DE-AÇÚCAR Figura 1 - Padrão de amplificação obtido para o locus COS-EST-SSR2, por eletroforese em gel de poliacrilamida. M-marcador de peso molecular (10pb); LS-linhagem de sorgo; P1-genitor feminino (IACSP95-3018); P2-genitor masculino (IACSP93-3046) e 54 indivíduos da população de mapeamento.......................................... 74 Figura 2 - Mapa de ligação de cana-de-açúcar integrado para a população derivada do cruzamento bi-parental entre os genitores IACSP95- 3018 e IACSP93-3046. Os números superiores referem-se ao grupo de ligação (GL). Os números à esquerda são as distâncias em centiMorgans (cM) entre os marcadores. Os nomes dos marcadores estão à direita, seguidos pela sigla D1 (presente no IACSP95-3018), D2 (presente no IACSP93-3046) e C (presente em ambos os genitores). Os GL foram reagrupados com base na presença de marcadores derivados de um mesmo loco de microssatélite (loco definido pelo par de primers que flanqueia o microssatélite) formando os grupos de homologia (GH)............................................. 76 Figura 3 - Alinhamento dos grupos de ligação obtido a partir do cruzamento entre IACSP95-3018 e IACSP93-3046 com o mapa consenso do sorgo (http://sorgblast3.tamu.edu/linkage_groups.htm), MACE et al. (2009). A identificação do locus da cana e do sorgo encontra-se a direita do grupo de ligação de cada espécie. As linhas na diagonal entre os grupos de ligação da cana e do sorgo indicam a posição correspondente do locus.................................................................... 80 http://sorgblast3.tamu.edu/linkage_groups.htm CAPÍTULO I INTRODUÇÃO GERAL 2 1 INTRODUÇÃO GERAL Dentre os diferentes tipos de marcadores moleculares disponíveis para a análise em plantas, marcadores do tipo microssatélites tem-se mostrado úteis em diversas aplicações, tanto na genética quanto no melhoramento, principalmente devido a sua reprodutibilidade e abundância no genoma. Estes marcadores representam sequências repetitivas compostas por motivos (1 a 6 pares de bases) repetidos lado a lado, e cujas sequências que o flanqueiam apresentam-se conservadas a ponto de permitir o desenho de um par de iniciadores de síntese específica (primers) para a sua amplificação via reação em cadeia da polimerase (Polimerase Chain Reaction). Os Projetos de Sequenciamento das Etiquetas de Sequências Expressas (ESTs) de culturas de importância, tais como a cana-de-açúcar (http://sucest.lad.dcc.unicamp.br/en/) e o sorgo (http://www.phytozome.net) têm permitido o desenvolvimento de microssatélites de forma rápida e econômica pela simples mineração de sequências repetitivas nos bancos de dados. Tais microssatélites por derivarem de ESTs são chamados de microssatélites funcionais (EST-SSRs) e são considerados de grande utilidade para acessar a diversidade a nível de genes expressos em coleções de germoplasma e também no mapeamento genético, visto que o polimorfismo gerado permite o mapeamento direto de genes expressos, os quais podem proporcionar a identificação de marcadores funcionais associados a características de interesse. Os microssatélites derivados de sequências expressas (EST-SSRs) apresentam uma maior transferibilidade entre espécies correlacionadas podendo ser utilizados como marcadores âncoras no mapeamento comparativo (CABRERA et al., 2009). Os bancos de dados de sequências expressas também têm permitido o desenvolvimento de marcadores microssatélites a partir de sequências ortólogas conservadas (Conserved Orthologous Sequences-COS) entre espécies correlacionadas. Os COS são definidos como uma coleção de genes de cópia única que são ortólogos entre espécies (JEONG et al., 2014). Genes de cópias únicas possibilitam o desenvolvimento de marcadores universais (âncoras) ou os chamados http://sucest.lad.dcc.unicamp.br/en/ http://www.phytozome.net/ 3 Conserved Orthologous Markers. De acordo com esses autores, esses marcadores provenientes de sequências ortólogas conservadas podem ser utilizados em estudos de filogenia e mapeamento comparativo. A cana-de-açúcar pertence à tribo Andropogoneae, família das gramíneas, cuja respectiva tribo, inclui também as gramíneas tropicais e subtropicais, tais como os cereais do gênero Sorghum e Zea. As cultivares atuais são híbridos interespecíficos complexos de elevado nível de ploidia (2n = 100 a 120 cromossomos) apresentando, em alguns casos, aneuplodia com segregação irregular (D’HONT et al., 1996; PIPERIDIS et al., 2010; SOBHAKUMARI, 2013). A complexidade e o conteúdo cromossomo variável do genoma da cana são as maiores preocupações no procedimento de sequenciamento do genoma (DILLON et al., 2007). A complexidade genômica da cana-de-açúcar dificulta os trabalhos de mapeamento genético e a detecção de características de interesse agronômico aos programas de melhoramento, especialmente quando os mapas desenvolvidos são construídos utilizando-se cultivares comerciais como genitores. Segundo Le Cunff et al. (2008) a otimização de sistemas de marcadores moleculares contribui para aumentar a eficiência no desenvolvimento de mapas genéticos de cana-de-açúcar e sua utilização no mapeamento de QTL, o que pode proporcionar avanços em estudos genéticos, genômicos e aplicações nos programas de melhoramento genético (JAMES et al., 2011). Por outro lado, o sorgo é uma espécie diplóide (2n=20), com um genoma relativamente pequeno e com uma vasta adaptação a ambientes severos e tolerância às condições de estresse bióticos e abióticos, o que contribui para que seja apontada como uma importante cultura modelo (SINGH et al., 2013b). A utilização do genoma pequeno do sorgo como referência em estudos de mapeamento comparativo tem contribuído para acelerar a análise do genoma da cana-de-açúcar, principalmente em relação à detecção de QTL relacionados à resistência a doenças (MCINTYRE et al., 2005b) e parâmetros agroindustriais (JORDAN et al., 2004) obtidos através de marcadores provenientes de sondas heterólogas em ensaios de RFLP (Restriction fragment lenght polymorphism). Nesse contexto, esse estudo apresenta o desenvolvimento de marcadores microssatélites ortólogos conservados (COS-EST-SSRs) entre cana e sorgo bem 4 como o mapeamento destes COS-EST-SSRs e de EST-SSRs de sorgo em uma população de mapeamento genético de cana-de-açúcar do Programa Cana IAC. Para o nosso conhecimento, até o presente momento, não foram desenvolvidos marcadores microssatélites ortólogos conservados derivados de sequências expressas (COS-EST-SSRs) entre cana-de-açúcar e sorgo. 87 5 CONCLUSÃO A quantidade de grupos de ligação com baixo número de marcadores reforça a necessidade de uma maior cobertura do mapa de ligação do cruzamento bi-parental aqui apresentado. Os marcadores ortólogos conservados (COS-EST-SSRs) entre cana-de-açúcar e sorgo aqui desenvolvidos podem ser utilizados no mapeamento genético da cana- de-açúcar visando estudos de mapeamento comparativo com o sorgo. Os marcadores COS-EST-SSRs poderão ser integrados a mapas genéticos de referência, contribuindo para aumentar a quantidade de informações disponíveis para cana-de-açúcar e outras espécies relacionadas. 88 6 REFERÊNCIAS AITKEN, K. S.; MCNEIL, M. D.; BERKMAN, P. J.; HERMANN, S.; KILIAN, A.; BUNDOCK, P. C.; LI, J. C. 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