Felipe Azevedo Borges Desenvolvimento de uma membrana de látex natural e alginato para regeneração óssea Tese apresentada ao Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Biotecnologia. Orientador: Prof. Dr. Rondinelli Donizetti Herculano Coorientador: Prof. Dr. Guilherme José Pimentel Lopes de Oliveira Araraquara - SP 2019 DADOS CURRICULARES IDENTIFICAÇÃO Nome: Felipe Azevedo Borges Nome em citações bibliográficas: Borges, FA; Borges, F A; Borges, F. A.; BORGES, FA; BORGES, F A; BORGES, F. A. ENDEREÇO PROFISSIONAL Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara. Rodovia Araraquara Jaú, Km 01 - s/n Campos Ville 14800903 - Araraquara, SP – Brasil FORMAÇÃO ACADÊMICA/TITULAÇÃO 2008/2012 Graduação e Licenciatura em Ciências Biológicas. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP. Título: Análise da incorporação e liberação do extrato de Casearia sylvestris Swartz empregando biomembranas de látex natural como suporte. Orientador: Rondinelli Donizetti Herculano. Bolsista da: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, FAPESP, Brasil. 2012/2015 Mestrado em Biotecnologia (Conceito CAPES 6). Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, Brasil. Título: Aplicação da biomembrana de látex natural (NRL) para cultura de células osteogênicas Orientador: Rondinelli Donizetti Herculano. Coorientadora: Karina Alves de Toledo. Bolsista do: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, CAPES, Brasil. 2015/2019 Doutorado em Biotecnologia (Conceito CAPES 6). Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, Brasil. Orientador: Rondinelli Donizetti Herculano. Coorientador: Guilherme José Pimentel Lopes de Oliveira Bolsista do: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, CNPq, Brasil. PRODUÇÃO BIBLIOGRÁFICA Artigos completos publicados em periódicos ZANCANELA, D. C.; FUNARI, C. S.; HERCULANO, R. D.; MELLO, V. M.; RODRIGUES, C. M.; BORGES, F. A.; BARROS, N. R, MARCOR, M. C.; ALMEIDA, A. M. F.; GUASTALDI, A. C. (2019). Natural rubber latex membranes incorporated with three different types of propolis: Physical-chemistry and antimicrobial behaviours. Materials Science and Engineering: C, 97, 576-582. MARCELINO, M. Y.; BORGES, F. A.; COSTA, A. F. M.; SINGULANI, J. L.; RIBEIRO, N. V.; COSTA-ORLANDI, C. B.; GARMS, B. C.; MENDES-GIANNINI, M. J.; FUSCO- ALMEIDA, A. M. (2018). Antifungal activity of fluconazole-loaded natural rubber latex against Candida albicans. Future Microbiology, 13(3), 359-367. MIRANDA, M. C. R.; BORGES, F. A.; BARROS, N. R.; SANTOS FILHO, N. A.; MENDONÇA, R. J.; HERCULANO, R. D.; CILLI, E. M. (2018). Evaluation of peptides release using a natural rubber latex biomembrane as a carrier. Amino Acids, 50(5), 503- 511. CARVALHO, F. A.; UCHINA, H. 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R.; GARMS, B. C.; MIRANDA, M. C. R.; GEMEINDER, J. L. P.; RIBEIRO‐PAES, J. T.; SILVA, R. F.; TOLEDO, K. A.; HERCULANO, R. D. (2017). Application of natural rubber latex as scaffold for osteoblast to guided bone regeneration. Journal of Applied Polymer Science, 134(39), 45321. GARMS, B. C.; BORGES, F. A.; SANTOS, R. E.; NIGOGHOSSIAN, K.; MIRANDA, M. C. R.; MIRANDA, I. U.; DALTRO, P.; SCARPARI, S. L.; GIAGIO, R. J.; BARROS, N. R.; ALARCON, K. M.; DRAGO, B. C.; GEMEINDER, J. L. P.; OLIVEIRA, B. H.; NASCIMENTO, V. M. G.; LOFFREDO, A. V.; HERCULANO, R. D. (2017). Characterization and microbiological application of ciprofloxacin loaded in natural rubber latex membranes. British Journal of Pharmaceutical Research, 15, 1-10. FLORIANO, J. F.; DE BARROS, N. R.; CINMAN, J. L. F.; DA SILVA, R. G.; LOFFREDO, A. V.; BORGES, F. A.; NORBERTO, A. M. Q.; CHAGAR, A. L. D.; GARMS, B. C.; GRAEFF, A. F. O.; HERCULANO, R. D. (2018). Ketoprofen loaded in natural rubber latex transdermal patch for tendinitis treatment. Journal of Polymers and the Environment, 26(6), 2281-2289. Barros, N. R. D.; Miranda, M. C. R.; BORGES, F. A.; Gemeinder, J. L. P.; Mendonça, R. J. D.; Cilli, E. M.; Herculano, R. D. (2017). Natural rubber latex: development and in vitro characterization of a future transdermal patch for enuresis treatment. International Journal of Polymeric Materials and Polymeric Biomaterials, 66(17), 871-876. MIRANDA, M. C. R.; PREZOTTI, F. G.; BORGES, F. A.; BARROS, N. R.; CURY, B. S. F.; HERCULANO, R. D.; CILLI, E. M. (2017). Porosity effects of natural latex (Hevea brasiliensis) on release of compounds for biomedical applications. Journal of Biomaterials science, Polymer edition, 28(18), 2117-2130. ITO, S.; BARCHI, A. C.; ESCARAMBONI, B.; DE OLIVA NETO, P.; HERCULANO, R. D.; BORGES, F. A.; MIRANDA, M. C. R.; NÚÑEZ, E. G. F. (2017). 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Diclofenac potassium transdermal patches using natural rubber latex biomembranes as carrier. Journal of Materials, 2015. BOLOGNESI, L. F. C.; BORGES, F. A.; CINMAN, J. L. F.; SILVA, R. G. D.; SANTOS, A. G. D.; HERCULANO, R. D. (2015). Natural latex films as carrier for Casearia sylvestris Swartz extract associated with ciprofloxacin. American Chemical Science Journal, 17-25. BORGES, F. A.; FILHO, E. D. A.; MIRANDA, M. C. R.; DOS SANTOS, M. L.; HERCULANO, R. D.; GUASTALDI, A. C. (2015). Natural rubber latex coated with calcium phosphate for biomedical application. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition, 26(17), 1256-1268. BORGES, F. A.; Siguematsu, P. R.; Herculano, R. D.; Santos, C. (2016). Novel sustained-release of Stryphnodendron obovatum leaves extract using natural rubber latex as carrier. Journal of Basic and Applied Pharmaceutical Sciencies, 36(3). BORGES, F. A.; TRECCO, A.; BARROS, N. R.; MIRANDA, M. C. R.; PIERRI, E. G.; SANTOS, A. G.; HERCULANO, R. D. (2014). Casearia sylvestris Swartz extract release using natural rubber latex biomembranes as carrier. European Journal of Medicinal Plants, 4(12), 1420-1430. MURBACH, H. D.; JAQUES OGAWA, G.; BORGES, F. A.; MIRANDA, R.; CARLOS, M.; LOPES, R.; BARROS, N. R.; MAZALLI, A. V. G.; SILVA, R. G.; CINMAN, J. L. F.; DRAGO, B. C.; HERCULANO, R. D. (2014). Ciprofloxacin release using natural rubber latex membranes as carrier. International Journal of Biomaterials, 2014. AIELO, P. B.; BORGES, F. A.; ROMEIRA, K. M.; MIRANDA, M. C. R.; ARRUDA, L. B. D.; DRAGO, B. C.; HERCULANO, R. D. (2014). Evaluation of sodium diclofenac release using natural rubber latex as carrier. Materials Research, 17, 146-152. TRECCO, A.; TRECCO, A.; BORGES, F. A.; PIERRI, E. G.; SANTOS, A. G.; CHIN, C. M.; HERCULANO, R. D. (2014). Liberação de componentes do extrato de Casearia sylvestris Swartz empregando membranas de látex natural como suporte. Revista de Ciências Farmacêuticas Básica e Aplicada, 35(1), 89-95. BORGES, F. A.; BOLOGNESI, L. F. C.; TRECCO, A.; DRAGO, B. D. C.; ARRUDA, L. B. D.; LISBOA-FILHO, P. N.; PIERRI, E. G.; GRAEFF, C. F. O.; SANTOS, A. G.; MIRANDA, M. C. R.; HERCULANO, R. D. (2014). Natural rubber latex: study of a novel carrier for Casearia sylvestris Swartz delivery. ISRN Polymer Science. HERCULANO, R. D.; BRUNELLO, C. A.; MELO JUNIOR, J. P. D.; MARTINS, M.; BORGES, F. A.; CHIAVACCI, L.; GRAEFF, C. F. D. O. (2013). Novel solid state nitric oxide sensor using siloxane-poly (oxypropylene) (PPO). Materials Sciences and Applications, 683-688. Artigos aceitos para publicação BARROS, N. R.; SANTOS, R. S.; MIRANDA, M. A. R.; BORGES, F. A. SCHIAVON, J. C.; MARQUES, R. F. C., HERCULANO, R. D. NORBERTO, A. M. Q. Natural latex- glycerol dressing to reduce nipple pain and healing the skin in breastfeeding women. Skin Research And Technology, 2019. GARMS, B. C.; BORGES, F. A.; BARROS, N. R.; MARCELINO, M. Y.; ARCO, M. C.; SALVADOR, S. L. S.; FRADE, M. A. C.; HERCULANO, R. D. Novel polymeric dressing to the treatment of infected chronic wound. Applied Microbiology And Biotechnology, 2019. ORGANIZAÇÃO DE EVENTO BORGES, F. A. XXIV Congresso de Iniciação Científica da Unesp, 2012. ESTÁGIO DOCÊNCIA Nanotecnologia de Materiais (2017) (curso de graduação em Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara/UNESP). PRÊMIOS E TÍTULOS 2014 - Menção honrosa na área de Química de Produtos Naturais, XXIII Simpósio de Plantas Medicinais do Brasil 2014 - Prêmio de melhor painel da área (Biomateriais metálicos, materiais nanoestruturados, recobrimentos, biomemética e microencapsulamento), 8th COLAOB 2013 - Menção honrosa no XIII Prêmio Carlos Roberto de Iniciação Científica, 16º ENBM (Encontro Nacional de Biomedicina) 2012 - 1º Lugar em Apresentação de Painel, Biotec Júnior da UNESP Assis SUPERVISÃO ACADÊMICA Mariana Biondi Cesar. Desenvolvimento e caracterização de uma nova blenda polimérica (látex natural/ácido polilático) para aplicação biomédica. 2016/2018. Iniciação científica (Graduanda em Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia) Lucas Correa de Moraes. Materiais nanoestruturados: Aplicações na agricultura. Início: 2017. Iniciação científica (Graduando em Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia Rafael Brull Tuma. Avaliação da liberação sustentada de fosfato de cálcio bifásico (HAP e beta-TCP) empregando membranas de látex natural (Hevea Brasiliensis) como suporte. 2018. Iniciação científica (Graduanda em Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia). Beatriz Tiemi Morise. Desenvolvimento e caracterização físico, química e biológica das membranas de látex carreadas com escopolamina para tratamento da sialorréia. 2018. Iniciação científica (Graduanda em Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia). Letícia Crippa Asenha. Desenvolvimento de nanocompósitos magnéticos para tratamento oncológico. 2019. Iniciação científica (Graduanda em Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia). BANCA DE TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO DE GRADUAÇÃO: Larissa Traina. Development of EBC-46 loaded PLGA and MCM-41 nanoparticles. 2016. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Engenharia de Biotecnologia) - Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho. Nicola Carlucci Sato. Avaliação da liberação controlada do metronidazol incorporado em nanopartículas de prata para tratamento dérmico empregando membranas de látex natural como suporte. 2016. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Engenharia de Biotecnologia) - Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho. Marcelo Seiji Yamanaka. Avaliação da liberação sustentada de derivados do ácido protocatecúico empregando membranas de látex como carreador. 2016. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Engenharia de Biotecnologia) - Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho. Luis Felipe Cesar Bolognesi. Caracterização da liberação sustentada do extrato de Casearia sylvestris Swartz associado à ciprofloxacina empregando películas de látex natural como carreador. 2017. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Engenharia de Biotecnologia) - Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho – campus de Assis. Luis Otávio Baggio. Avaliação da liberação controlada nanopartículas de ouro empregando membranas de látex natural como carreador. 2017. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Engenharia de Biotecnologia) - Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho – campus de Assis. Beatriz Tiemi Morise. Desenvolvimento e caracterização de membranas de látex carreadas com escopolamina para tratamento da sialorréia. 2019. Trabalho de conclusão de Curso (Graduação em Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia) - Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho – campus de Araraquara. Mariana Biondi Cesar. Desenvolvimento e caracterização de uma nova blenda polimérica (látex natural/ácido polilático) para aplicação biomédica. 2019. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia) - Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho – campus de Araraquara. dedico este trabalho de modo especial, à milha família AGRADECIMENTOS Em primeiro lugar agradeço ao meu orientador Professor Rondinelli Donizetti Herculano, por ter confiado em mim desde a graduação. Às agências de fomento CNPq, FAPESP e CAPES pelo auxílio financeiro. Ao professor Alvaro Antonio Alencar de Queiroz pela realização das análises térmicas no Laboratório de Alta Tensão Professor Manuel Luís Barreira Martinez (LAT- EFEI), Universidade Federal de Itajubá (UNIFEI). Ao professor Miguel Jafelicci Junior e ao Dr. Rodolfo Debone Piazza pela análise de ângulo de contato no Laboratório de Materiais Magnéticos e Coloides, do Instituto de Química de Araraquara, Universidade Estadual Paulista (UNESP). Aos que me auxiliaram com os experimentos in vivo, os professores Ana Maria Minarelli Gaspar, Guilherme José Pimentel Lopes de Oliveira, Suzane Cristina Pigossi, Joni Augusto Cirelli, à doutoranda Mariana Aline Cominotte e aos técnicos Claudia e Pedro. Ao Grupo de Bioengenharia e Biomateriais e ao Núcleo de Proteômica pela infraestrutura fornecida (Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara, UNESP). À Faculdade de Odontologia de Araraquara (UNESP) e à Ma. Luana Elis Sabino pelo Equipamento Scanner de Microtomografia Computadorizado In vivo – Sky Scan. Ao Laboratório de Ensaios Mecânicos da Faculdade de Odontologia de Araraquara (UNESP) pela disponibilidade de utilização da máquina universal de ensaios (EMIC DL2000). Ao laboratório Laboratório de Microscopia Avançada (LMA-IQ, Instituto de Química de Araraquara, UNESP) pela disponibilidade de utilização do Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV-FEG). Aos funcionários da Pós-Graduação em Biotecnologia do Instituto de Química (UNESP). Aos colegas de laboratório. Às repúblicas Balaio de Gato e Alambik por terem sido meu lar em Araraquara. À minha família, por todo apoio. “Quando a vida te decepciona, qual é a solução? Continue a nadar! Continue a nadar! Continue a nadar, nadar, nadar! Para achar a solução, nadar, nadar! ” PROCURANDO Nemo. Direção: Andrew Stanton, Produção: Graham Walters. Califórnia (EUA): Pixar Animation Studios, 2003.1 DVD. RESUMO O látex natural extraído da Hevea brasiliensis apresenta atividade angiogênica, sendo empregado como próteses vasculares, suporte para osteoblastos, nanopartículas síntese, liberação de compostos, regeneração tecidual. Além disso, também tem sido utilizada como uma barreira para regeneração óssea guiada, dificultando invasão por células não osteogenicas na lesão óssea. O alginato é biocompatível, biodegradável, hidrofílico, e possui a capacidade de ativar macrófagos, auxiliando no processo de cicatrização e reepitelização do tecido. O PDGF-BB é um fator de crescimento que apresenta atividade angiogênica, mitogênica e quimiotáxica. Desta forma, este trabalho visou produzir, caracterizar e empregar blendas de látex e alginato (em diferentes proporções, com e sem reticulação por cálcio) para uso na regeneração óssea guiada. Os resultados mostraram que as blendas foram homogêneas, sem separação de fase, com superfície densa e sem porosidade. A adição de alginato, melhorou a hidrofilicidade da membrana de látex, segundo o intumescimento, ângulo de contato e permeação ao vapor de água. O alginato aumentou as propriedades mecânicas de tração do látex proporcional à adição de alginato, aumentando a tenção de ruptura de 0,88 MPa para até 16,46 MPa, e reduzindo o alongamento de 10,8 mm/mm para 1,5 mm/mm, assim como também aumentou sua degradação in vitro (de aproximadamente 1% para o látex natural, para 10% para membrana com 16% de alginato). As blendas não apresentaram efeito hemolítico (valores abaixo de 5%) nem citotóxico, proporcionando aumento da viabilidade da linhagem MC3T3-E1 de até 140%, conforme a proporção utilizada. Porém, ao ser utilizada em modelo de defeito na calvária de ratos, não foi encontrada diferença na regeneração óssea entre o controle, a membrana ou a membrana acrescida do fator de crescimento PDGF- BB. PALAVRAS-CHAVE: Látex. Alginato. Blenda polimérica. PDGF-BB. Regeneração óssea. Biomaterial. Membrana. ABSTRACT The natural latex extracted from Hevea brasiliensis presents angiogenic activity, being used as vascular prostheses, support for osteoblasts, nanoparticles synthesis, release of compounds, tissue regeneration. In addition, it has also been used as a barrier to guided bone regeneration, difficult ting the invasion by non-osteogenic cells in the bone lesion. The alginate is biocompatible, biodegradable, hydrophilic, and has the ability to activate macrophages, aiding in the healing process and tissue re-epithelization. PDGF-BB is a growth factor that presents angiogenic, mitogenic and chemotactic activity. In this way, this work aimed to produce, characterize and apply latex and alginate blends (in different proportions, with and without calcium crosslinking) for use in guided bone regeneration. The results showed that the blends were homogeneous, without phase separation, with a dense surface and no porosity. The addition of alginate improved the hydrophilicity of the latex membrane, according to swelling, contact angle and permeation to water vapor. Alginate increased the mechanical properties of the latex proportional to the addition of alginate, increasing the tensile strength from 0.88 MPa to up to 16.46 MPa, and reducing the elongation from 10.8 mm/mm to 1.5 mm/mm, as well as increased in vitro degradation (from about 1% for natural rubber latex to 10% for membrane with 16% alginate). The blends did not present a hemolytic effect (values below 5%) or cytotoxic, increasing the viability of the MC3T3-E1 lineage up to 140%, according to the proportion used. However, when used in a model of defect in rat calvaria, no difference was found in bone regeneration between the control, the membrane or the membrane plus the PDGF-BB growth factor. KEYWORDS: Latex. Alginate. Polymer blend. PDGF-BB. Bone regeneration. Biomaterial. Membrane. LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1 – Estrutura química do cis-1,4-isopreno. 25 Figura 2 – Angiogênese observada na região delimitada em decorrência do uso do látex natural em modelo de membrana corialantóide. 26 Figura 3 – Estrutura química do alginato e sua reticulação com cálcio. 28 Figura 4 – Tipos celulares presentes no osso, e sua participação no evento de regeneração óssea. 30 Figura 5 – Representação da hierarquia de organização do osso. 31 Figura 6 – Evolução do reparo ósseo em defeito critico em calvária ao longo do tempo (da esquerda para direita) exemplificando a regeneração centrípeta (das margens para o centro). 32 Figura 7 – Regeneração óssea guiada: a) ilustração mostrando a separação dos tecidos, b) aplicação da membrana de látex na regeneração óssea guiada. 33 Figura 8 – Regeneração óssea pela aplicação do fator de crescimento: a) aplicação do PDGF-BB, b) controle. 34 Figura 9 – Imagem representativa do teste de hemólise por contato direto. As setas pretas indicam a localização das membranas (látex à esquerda e alginato reticulado à direita), os asteriscos amarelos mostram a presença das hemácias, retângulo indica o sobrenadante com hemólise. 45 Figura 10 – Cirurgia para criação do defeito na calvária: a) remoção da porção da calota cortada, b) recuperação pós-cirúrgica em decúbito lateral. 49 Figura 11 – Análise da regeneração óssea por MicroCT: a) suporte para imobilizar as amostras, b) equipamento de microCT Skyscan 1176. 51 Figura 12– Micrografia da morfologia superficial a partir do MEV sob ampliação 1000x das membranas: a)1, b) 1C, c) 2, d) 2C, e) 3, f) 3C, g) 4, h) 4C, i) A, j) AC e k) L. 53 Figura 13 – Análise por MEV-EDS sob ampliação de 300x: a) micrografia por MEV da membrana 4, b) micrografia por MEV da membrana 4C, c) micrografia por EDS da membrana 4, d) micrografia por EDS da membrana 4C, e) EDS da membrana 4, f) EDS da membrana 4C. 56 Figura 14 – Espectro de FTIR do polímero cis-isopreno (azul) e das membranas de alginato (vermelho), alginato reticulado com cálcio (verde) e látex natural (preto). 58 Figura 15 – Espectro de FTIR das blendas com diferentes proporções de alginato: a) sem reticulação, b) com reticulação. 59 Figura 16 – Gráfico da tensão versus deformação da resistência mecânica à tração das membranas em diferentes proporções. 61 Figura 17 – Curva termogravimétrica em atmosfera de nitrogênio das membranas dos polímeros puros e das blendas: a) não reticuladas, b) reticuladas com cloreto de cálcio. 63 Figura 18 – Curva termogravimétrica derivada das membranas dos polímeros puros e das blendas: a) não reticuladas, b) reticuladas com cloreto de cálcio. 65 Figura 19 – Curva de calorimetria exploratória diferencial em atmosfera de nitrogênio, exemplificando os ciclos de aquecimento e resfriamento da membrana de látex. Pico endotérmico para baixo. 66 Figura 20 – Curva de calorimetria em atmosfera de exploratória diferencial em atmosfera de nitrogênio dos polímeros puros e das blendas: a) não reticuladas, b) reticuladas com cloreto de cálcio. Pico endotérmico para baixo. 67 Figura 21 – Micrografias representativas do ângulo de contato da gota de água destilada (17 µL) na superfície dos materiais: a) L, b) A, c) AC, d) 1, e) 2, f) 3, g) 4, h), 1C, i) 2C, j) 3C e k) 4C. 70 Figura 22 – Cinética de intumescimento das membranas realizado em c-SBF por 5 dias. 72 Figura 23 – Gráfico apresentando o tempo em que as diferentes membranas apresentaram o intumescimento máximo. 72 Figura 24 – Variação da massa durante a degradação. 76 Figura 25 – Variação do módulo de Young nos durante a degradação. 77 Figura 26 – Variação do alongamento durante a degradação. 78 Figura 27 – Variação da tensão de ruptura durante a degradação. 79 Figura 28 – Espectro de FTIR da degradação em c-SBF nos tempos 0 e 30 dias. As amostras foram normalizadas em 835 cm-1. A seta indica a principal região alterada na degradação relacionada à oxidação. 81 Figura 29 – Micrografia por MEV sob diferentes ampliações das células aderidas na superfície das membranas: a) vidro, 300x, b) 2C, 1000x, c) 3, 1000x, d) 3C, 1000x, e) 4, 300x, f) 4C, 300x, g) A, 1000x, h) L, 1000x. 85 Figura 30 – Proliferação celular por resazurina. Placa controle sem a presença de célula, apenas com as membranas. 87 Figura 31 – Análise da adesão celular por MTT: a) visão geral das amostras, b) foco na membrana de látex, c) micrografia da membrana de látex por microscopia óptica (40x), d) micrografia por microscópio óptico (40x) da membrana de alginato com cálcio. A seta indica as células. 89 Figura 32 – Ensaio de citotoxicidade por contato direto: a) representação do teste, b) revelação por MTT, onde nota-se formação de halo de ausência celular. A seta indica o local da formação do halo de ausência celular. 90 Figura 33 – Gráfico da citotoxicidade por contato direto pela técnica de MTT em 24, 48 e 72 horas. 92 Figura 34 – Redução dos espécimes, parte superior do crânio onde foi realizada a cirurgia. Seta vermelha indica a área do defeito crítico, setas pretas indicam a presença da membrana. 94 Figura 35 – Reconstrução representativa da regeneração óssea por MicroCT: a) controle, 15 dias, b) controle, 60 dias, c) membrana, 15 dias, d) membrana, 60 dias, e) membrana+PDGF, 15 dias, f) membrana+PDGF, 60 dias. 95 Figura 36 – Parâmetros morfométricos obtidos pelo MicroCT: a) BV, b) BS, c) BV/TV, d) BS/BV, e) BS/TV. 96 LISTA DE TABELAS Tabela 1 – Abreviação dos materiais elaborados assim como as respectivas composições mássicas. 38 Tabela 2 – Valores médios das propriedades mecânicas do teste de tração das membranas. 60 Tabela 3 – Medidas do ângulo de contato (média ± desvio padrão) a partir da técnica de gota séssil. 69 Tabela 4 – Permeabilidade ao vapor de água pela técnica de dessecante. 74 Tabela 5 – Hemólise (%) in vitro por contato direto. 84 LISTA DE QUADROS Quadro 1 – Especificações físico-químicas do látex natural utilizado fornecido pela empresa BDF. 37 LISTA DE EQUAÇÕES Equação 1 – Tensão 40 Equação 2 – Alongamento 40 Equação 3 – Módulo de Young 41 Equação 4 – Intumescimento 42 Equação 5 – Permeabilidade ao vapor de água 43 Equação 6 – Perda de massa 44 Equação 7 – Hemólise 45 Equação 8 – Viabilidade celular 47 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS A área ANOVA Análise de Variância ASTM American Society for Testing and Materials ATR Refletância Total Atenuada BMP proteína morfogenética óssea BS área de superfície óssea BV volume do tecido ósseo CAM membrana corialantóide CEUA Comissão de Ética no Uso de Animais CN controle negativo CP controle positivo c-SBF fluido corporal simulado DO densidade óptica DOa densidade óptica da amostra DOCN densidade óptica do controle negativo DOCP densidade óptica do controle positivo DPPH 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo DSC Calorimetria Exploratória Diferencial DTG termogravimetria derivada e espessura da membrana EDS Energia Dispersiva de Raio-X EDTA ácido etilenodiamino tetra-acético Endo endotérmico EUA Estados unidos da América F força FBS Soro Bovino Fetal FCFAr Faculdade de Ciências Farmacêuticas FEG Canhão de Emissão por Campo FOAr Faculdade de Odontologia de Araraquara FTIR Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier IGF fator de crescimento semelhantes à insulina ISO International Standard Organization L comprimento final L0 comprimento inicial LTDA limitada MAPK proteína quinase ativada por mitógenos MEV Microscopia Eletrônica de Varredura mf massa final hidratada mi massa inicial seca MicroCT Microtomografia Computadorizada de Raios X MTT 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil brometo de tetrazoilium PBS tampão fosfato PDGF fator de crescimento derivado de plaquetas PLGA poli ácido lático-co-ácido glicólico PTFE politetrafluoretileno PVA álcool polivinílico ROI região de interesse S pressão de saturação de vapor de água SP São Paulo t tempo TG Termogravimetria Tg transição vítrea TGF fator de crescimento transformador TV volume do tecido UNESP Universidade Estadual Paulista UV ultravioleta VEGF fator de crescimento do endotélio vascular VOI volume de interesse α-MEM Meio Mínimo Essencial Alfa Δm variação da massa ΔRU diferença de umidade relativa Outros significados: MC3T3-E1 linhagem celular pré-osteoblástica 1 blenda 4,76% de alginato sem reticulação 2 blenda 9,09% de alginato sem reticulação 3 blenda 13,04% de alginato sem reticulação 4 blenda 16,67% de alginato sem reticulação L membrana de látex natural A membrana de alginato sem reticulação 1C blenda 4,76% de alginato sem reticulação 2C blenda 9,09% de alginato sem reticulação 3C blenda 13,04% de alginato sem reticulação 4C blenda 16,67% de alginato sem reticulação AC membrana de alginato com reticulação SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO 24 1.1 LÁTEX NATURAL DA SERINGUEIRA 25 1.2 ALGINATO DE SÓDIO 27 1.3 TECIDO ÓSSEO 29 1.4 FATOR DE CRESCIMENTO (PDGF-BB) 33 2 OBJETIVOS 36 2.1 OBJETIVOS GERAIS 36 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 36 3 MATERIAIS E MÉTODOS 37 3.1 CONFECÇÃO DAS MEMBRANAS 37 3.2 CARACTERIZAÇÃO 39 3.2.1 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) 39 3.2.2 Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier em Modo de Refletância Total Atenuada (FTIR-ATR) 40 3.2.3 Resistência mecânica à tração 40 3.2.4 Termogravimetria (TG) 41 3.2.5 Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC) 41 3.2.6 Ângulo de contato (molhabilidade) 42 3.2.7 Intumescimento 42 3.2.8 Permeabilidade ao vapor de água 43 3.2.9 Degradação in vitro em fluído simulado 43 3.2.10 Caracterização in vitro em modelos celulares 44 3.2.10.1 Hemólise 44 3.2.10.2 Cultivo celular 45 3.2.10.2.1 Adesão e morfologia celular 46 3.2.10.2.2 Proliferação celular 46 3.2.10.2.3 Citotoxicidade 47 3.3 APLICAÇÃO IN VIVO EM MODELO DE DEFEITO DE CALVÁRIA 48 3.3.1 Cuidado animal 48 3.3.2 Cirurgia 48 3.3.3 MicroCT 50 3.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA 51 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 52 4.1 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA (MEV) 52 4.2 ESPECTROSCOPIA NO INFRAVERMELHO COM TRANSFORMADA DE FOURIER EM MODO DE REFLETÂNCIA TOTAL ATENUADA (FTIR-ATR) 57 4.3 RESISTÊNCIA MECÂNICA À TRAÇÃO 60 4.4 TERMOGRAVIMETRIA (TG) 62 4.5 CALORIMETRIA EXPLORATÓRIA DIFERENCIAL (DSC) 66 4.6 ÂNGULO DE CONTATO (MOLHABILIDADE) 68 4.7 INTUMESCIMENTO 71 4.8 PERMEABILIDADE AO VAPOR DE ÁGUA 73 4.9 DEGRADAÇÃO IN VITRO EM FLUÍDO SIMULADO 75 4.10 CARACTERIZAÇÃO IN VITRO 84 4.10.1 Hemólise 84 4.10.2 Adesão e morfologia celular 85 4.10.3 Proliferação celular 87 4.10.4 Citotoxicidade 90 4.11 APLICAÇÃO IN VIVO EM MODELO DE DEFEITO DE CALVÁRIA 93 5 CONCLUSÃO 100 6 PERSPECTIVAS 101 REFERÊNCIAS 102 APENDICE A – APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA 115 24 1 INTRODUÇÃO As falhas ósseas podem ter origem em diferentes etiologias, como acidente de trânsito, arma de fogo, esporte de risco, além de casos onde é necessária a reposição óssea ou estímulo de sua formação como em retiradas de tumores, revisão de artroplastia, cirurgia craniofacial, implantodontia, entre outras (ZABEU et al., 2008). Nos Estados Unidos da América (EUA), cerca de 7,9 milhões de pacientes apresentam fraturas anualmente, onde 10% exibem uma cicatrização comprometida. Em 2006, foram gastos 500 milhões de dólares somente em tratamentos para estímulo do crescimento ósseo (FELDSTEIN et al., 2012). Além disso, nos EUA ocorreram cerca de 2 milhões de fraturas relacionadas com osteoporose em 2005, com custo de 17 bilhões de dólares, com projeções de crescimento de 50% até 2025 (WU et al., 2013). No Brasil, as fraturas têm se mostrado um dos principais motivos de afastamento pelo Instituto Nacional de Seguridade Social, pois, 6 das 20 maiores causas de benefícios concedidos são relacionados às fraturas (com 99573 beneficiários). Já no estado de São Paulo, 7 são relacionados às fraturas (com 34940 beneficiários), enquanto na cidade de São Paulo são 9 (com 9568 beneficiários) (MOREIRA; GERCINA, 2014). Segundo alguns dados sintetizados por Pires, Bierhalz e Moraes (2015), o mercado de biomateriais movimentou cerca de 25,6 bilhões de dólares em 2008 (sendo 2% referentes ao Brasil), e o mercado global tem apresentado crescimento de 22,1% ao ano. Em 2010, o Brasil movimentou aproximadamente 690 milhões de dólares. Na área de biomateriais, o segmento com mais vendas é o setor de implantes ortopédicos, com movimentação de aproximadamente 1 a 2,5 milhões de unidades, destacando-se próteses de quadril, joelho e ombro. O crescimento desse mercado pode ser atribuído aos seguintes fatores: envelhecimento da população, aumento do poder aquisitivo e melhorias tecnológicas no tratamento de enfermidades. Com o 25 aumento da expectativa de vida, haverá a necessidade em se ampliar essa oferta (PIRES; BIERHALZ; MORAES, 2015). Dentre os materiais utilizados em ortopedia, pode-se citar os materiais metálicos (como o titânio e aço inoxidável), cerâmicos (como a hidroxiapatita e biovidro) e poliméricos (como o colágeno e fibroína de seda). Esta última categoria apresenta diversas formas (fibra, sólido, gel), com diferentes propriedades (elasticidade à rigidez) e com degradação controlável, motivos pelos quais despertou interesse para aplicação nesse trabalho (RODRIGUES, 2013). 1.1 Látex natural da seringueira O látex natural é um sistema coloidal extraído principalmente da seringueira (Hevea brasiliensis (Willd. Former Adr. de Juss.) Muell – Arg). É composto por aproximadamente 50% (m/v) de água, 4-5% de proteínas, lipídeos e carboidratos e 30-45% de borracha (o hidrocarboneto cis-1,4-poliisopreno) (Figura 1). As partículas de borracha estão circundadas por partículas (orgânicas e inorgânicas) carregadas negativamente por proteínas fosfolipídicas que lhe conferem estabilidade coloidal e que não são removidas por centrifugação (NAWAMAWAT et al., 2011). Figura 1 – Estrutura química do cis-1,4-isopreno. Fonte: Goodman; Schilder e Aldrich (1974). O látex apresenta 14 proteínas relacionadas à reação alérgica, dentre as principais, a Hev-b1 a Hev-b14 (YEANG et al., 2002). Porém, há vários métodos para torná-lo imune, sendo a centrifugação um modo prático, pois preserva as proteínas 26 relacionadas à angiogênese (MRUE et al., 2004; MENDONÇA et al., 2010) (Figura 2). As reações alérgicas relacionadas ao látex podem ser devidas aos agentes vulcanizantes, aceleradores de vulcanização e aos antioxidantes adicionados, que são desnecessários em engenharia de tecidos (HANSON; LOBNER, 2004). Figura 2 – Angiogênese observada na região delimitada em decorrência do uso do látex natural em modelo de membrana corialantóide. Fonte: Mendonça et al. (2010). A literatura apresenta resultados promissores devido a sua eficiência como barreira à invasão de tecido não ósseo e pela sua atividade angiogênica (Figura 2). Ciapetti et al. (1994) estudaram a biocompatibilidade in vivo de membranas de látex para regeneração tecidual guiada em regeneração periodontal. Balabanian et al. (2006) utilizaram grânulos de látex natural como implante em alvéolos de ratos observando redução da espessura da cápsula de tecido conectivo, aumento da área ocupada por osso maduro e aceleração da formação óssea. Herculano (2009) utilizou este material para regeneração óssea guiada de tíbias de coelho, apresentando neoformação óssea. Ereno et al. (2010) também a utilizaram como uma barreira oclusiva para regeneração óssea guiada em calvária de coelhos, comprovando a formação de hidroxiapatita por ressonância paramagnética eletrônica. Martins et al. (2010) obtiveram maior homogeneidade na formação óssea com membranas de látex ao comparar com o politetrafluoretileno (PTFE) em defeito crítico em calvária de coelhos. 27 Nesi et al. (2012) utilizaram este biomaterial como barreira na exodontia, concluindo ser eficiente na estabilização do coágulo sobre o alvéolo dental, culminando por sugerir diminuição da perda óssea. Kinoshita et al. (2014) utilizaram a membrana com nanopartículas de prata na regeneração óssea guiada de calvária de coelho observando maior atividade osteogênica. Oliveira (2008) observou uma maior formação do tecido ósseo empregando a membrana de látex natural como cobertura no auxílio da fusão intervertebral lombar. Floriano (2013) obteve melhores resultados ao utilizar látex sem amônia como estabilizante, além que os clones RRIM 600 e 873 IAN apresentaram melhor atividade na regeneração óssea. De acordo com a literatura pesquisada, nenhum trabalho in vivo apresentou degradação do látex durante o período experimental. Entretanto, Wang et al. (1997) mostraram que osteoclastos podem fagocitar partículas de látex, permanecendo totalmente funcionais e Neale et al. (2000) comprovaram que a fagocitose de partículas de látex não afetou na diferenciação em osteoclasto, sendo considerado inerte e não tóxica aos macrófagos. Suas aplicações na regeneração tecidual têm se mostrado promissoras, acelerando a cicatrização e proporcionando angiogênese (MRUE et al., 2004) (Figura 3). A vascularização é importante para a cicatrização, uma vez que fornece o aporte de nutrientes e oxigênio ao tecido que está se regenerando. Uma teoria para a aceleração da cicatrização é o estimulo da fase inflamatória natural por estresse oxidativo, aumentando o recrutamento de células inflamatórias (ANDRADE et al., 2011). 1.2 Alginato de sódio O alginato de sódio (sal de sódio do ácido algínico) é um polissacarídeo aniônico natural presente nas paredes celulares e nos espaços intercelulares das algas pardas (Laminaria hyperborean e digitara, Ascophyllum nodosum, Macrocystis pyrifera, Sargassum e Turbinarias estão entre as com maior conteúdo), porém, também pode 28 ser produzido por algumas bactérias (Azotobacter vinelandii e algumas espécies de Pseudomonas) (NERY, 2014). É um copolímero linear, formado pela repetição de dois monômeros, o ácido (1,4)-α-L-gulurônico (unidade G) e o ácido (1,4)-β-D-manurônico (unidade M), com variações na proporção e distribuição ao longo da cadeia (Figura 3). As propriedades físicas e químicas deste material são influenciadas pela composição, massa molar, extensão e sequência dos monômeros (NERY, 2014). Figura 3 – Estrutura química do alginato e sua reticulação com cálcio. Fonte: Kashima e Imai (2012). O alginato é biocompatível, biodegradável, hidrofílico, tem baixo custo e possui diversas aplicações. Também possui a habilidade de ativar macrófagos, auxiliar no processo de cicatrização e reepitelização do tecido. Devido a sua capacidade de gelificação e a sua propriedade hemostática, os curativos confeccionados com alginato podem ser utilizados na recuperação de feridas, pois promovem a analgesia, auxiliam na construção do tecido de granulação e na coagulação (NERY, 2014). Este polissacarídeo apresenta a capacidade de gelificação de maneira reversível, na presença de cálcio ou outros cátions divalentes ou trivalentes, formando um hidrogel termoestável (NERY, 2014; BITTENCOURT, 2008). Esta reticulação promove a modificação de suas propriedades, como aumento da resistência mecânica, propriedades de barreira, tempo de degradação, morfologia, entre outros, podendo ser controlada conforme o tempo de reticulação, concentração do agente 29 reticulante, entre outros. Ele pode ser utilizado na concentração de 1-20% (m/v), no entanto a concentração ideal para proliferação dos condrócitos é 1,5% (m/v). Este polímero natural apresenta diversas aplicações na área de cosmético, alimentícia e farmacêutica. Dentre seus diversos usos, os mais relevantes à temática são na medicina e engenharia de tecidos, sendo utilizado em liberação sustentada (LU et al, 2008). Man et al. (2012) utilizaram microesferas de alginato preparados com plasma rico em plaqueta a fim de servir como arcabouço tridimensional para células tronco do tecido adiposo, obtendo significante aumento da angiogênese e mineralização. Bittencourt (2008) também utilizou como arcabouço de condrócitos, tanto para cultura in vitro quanto para aplicação in vivo, obtendo formação de tecido cartilaginoso. Lu et al. (2008) controlaram a liberação de fatores de crescimento presentes no plasma rico em plaquetas a partir de esferas e capsulas de alginato. Moraes et al. (2014) observaram redução da hidrofobicidade e aumento da dureza, ao adicionar alginato à fibroína de seda e Srisuwan et al. (2013) observaram aumento da dissolução do material com aumento da quantidade de alginato. Assim, a incorporação do alginato ao látex natural formaria blendas com propriedades intermediárias entre os dois materiais, para a criação de uma membrana que possa favorecer um microambiente favorável à regeneração óssea. 1.3 Tecido ósseo A matriz óssea apresenta aproximadamente 35% de material orgânico chamado de osteóide (formado por glicoproteínas, fibras de colágeno e proteoglicanos que fornecem a flexibilidade e resistência à tração) e 65% de material inorgânico (cristais de fosfato, o qual confere ao osso sua resistência à compressão) (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2013). As principais células ósseas são: osteoblastos (responsáveis pela formação matriz óssea não mineral), osteócitos (formam-se a partir do aprisionamento dos 30 osteoblastos na matriz, responsáveis pela manutenção da matriz óssea) e osteoclastos (que produzem um meio ácido para reabsorção da matriz). Os osteoclastos são células móveis e multinucleadas que estão presentes nas áreas de reabsorção do tecido ósseo (lacunas de Howship). Os osteoblastos se localizam nas superfícies ósseas, lado a lado, sintetizando a parte orgânica (colágeno, proteoglicanos e glicoproteínas) da matriz óssea. Uma vez aprisionado na matriz óssea, são chamados de osteócitos (PAJARINEN et al., 2019) (Figura 4). Figura 4 – Tipos celulares presentes no osso, e sua participação no evento de regeneração óssea. Fonte: Adaptado de Pajarinen et al. (2019). Histologicamente o osso pode ser primário (ou imaturo) ou secundário (maduro ou lamelar). No tecido ósseo primário, as fibras de colágeno se dispõe irregularmente, sendo mais radiolúcido (são atravessadas mais fácil pelo raio-X). No tecido ósseo maduro, a principal característica são as fibras de colágeno organizadas paralelamente. Elas podem se dispor em camadas concêntricas, que posteriormente sofrem mineralização (tornando-se radiopaco), circundando os canais de Havers (ou ósteons), e entre as lamelas encontram-se os osteócitos (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2013) (Figura 5). 31 Figura 5 – Representação da hierarquia de organização do osso. Fonte: Adaptado de VectorStock.com, image Id: 4102961, artista: MerlinPixi. A regeneração óssea pode ocorrer de duas formas, via ossificação intramembranosa ou endocondral. A regeneração intramembranosa ocorre em fraturas pequenas e rigidamente fixadas, onde as células tronco diferenciam para osteoblastos, os quais depositam a matriz extracelular mineralizada (PAJARINEN et al., 2019) A regeneração endocondral ocorre em defeitos grandes, como os defeitos críticos, e em locais com pouca estabilidade mecânica, seguindo quatro etapas (Figura 4). Inicialmente ocorre a formação do hematoma, onde os vasos sanguíneos extravasam sangue, formando um coágulo (que proporciona a presença de plaquetas que liberam fatores de crescimento, como PDGF) e um aporte inadequado aos osteócitos, de forma que o tecido ósseo adjacente morra. Posteriormente, forma-se o calo ósseo, em que se formam vasos sanguíneos no interior do coagulo à medida que se dissolve, os macrófagos removem os restos celulares, os osteoclastos reabsorvem o tecido ósseo morto, os fibroblastos constroem uma rede fibrosa de colágeno onde os condroblastos produzem cartilagem, a fim de manter o osso unido. A seguir, ocorre 32 a ossificação do calo, onde o calo externo é substituído por osso esponjoso por meio da ossificação endocondral. Por fim ocorre a remodelação óssea com a substituição do calo interno de osso esponjoso por osso compacto, ocorrendo das extremidades para o centro (LIU; KERNS, 2014; PAJARINEN et al, 2019). A calvária é biologicamente inerte devido ao menor aporte sanguíneo e ausência de músculo para estabilizar o local, ocorrendo a regeneração intramembranosa (RENTSCH et al., 2014). Em defeitos críticos, a regeneração é restrita às margens, sendo o restante preenchido com tecido fibroso (Figura 6). Esta falha óssea é comumente utilizada como modelo de cicatrização óssea por não regenerar espontaneamente e por minimizar as dificuldades devido a diferenças de idade, local e espécie. Em ratos, o tamanho do defeito crítico é a partir de 5 mm (GOMES; FERNANDES, 2011). Figura 6 – Evolução do reparo ósseo em defeito critico em calvária ao longo do tempo (da esquerda para direita) exemplificando a regeneração centrípeta (das margens para o centro). Fonte: Adaptado de Youngstrom et al. (2017). Uma forma em otimizar o reparo baseia-se na utilização da técnica de regeneração óssea guiada (Figura 7), onde se aplica uma barreira que impede a infiltração de células que dificultam a regeneração (como fibroblastos e células epiteliais), auxiliando na manutenção do espaço (LIU; KERNS, 2014). 33 Figura 7 – Regeneração óssea guiada: a) ilustração mostrando a separação dos tecidos, b) aplicação da membrana de látex na regeneração óssea guiada. Fonte: a) Elgali et al., 2017, b) Nesi; Oliveira e Molina (2012). Se uma membrana é empregada como barreira em contato direto com a superfície do osso e recobrindo o defeito, apenas células da região óssea migram para o defeito, sem a interferência das células do tecido mole circundante (LIU; KERNS, 2014). A membrana não deve apresentar porosidade que permita a infiltração de micro-organismos ou permitir migração das células indesejadas; e deve apresentar rigidez suficiente para promover manutenção do espaço suportando a pressão do tecido circundante sem colapsar e ao mesmo tempo apresentar plasticidade para ser facilmente moldado e ajustado à forma do defeito (ELGALI et al., 2017). As membranas podem ser classificadas como reabsorvíveis (alginato, quitosana, colágeno, entre outras) e não reabsorvíveis (por exemplo, o politetrafluoretileno). A maior limitação de barreiras não reabsorvíveis é a necessidade de um segundo procedimento para sua remoção, contudo, com a degradação das membranas reabsorvíveis pode ocorrer colapso e falha na manutenção do espaço (LIU; KERNS, 2014). 1.4 Fator de crescimento (PDGF-BB) Uma forma de reduzir o tempo de cicatrização é através do uso de substâncias bioativas que promovam, por exemplo, a quimiotaxia, mitose ou diferenciação celular, b) a) 34 como o PDGF (fator de crescimento derivado de plaquetas), BMP (proteína morfogenética óssea), VEGF (fator de crescimento do endotélio vascular), entre outros. O fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) está presente principalmente nos alfa-grânulos das plaquetas, somente sendo liberados no processo de coagulação e no mecanismo de adesão plaquetária na lesão a vasos sanguíneos (MASTROCINQUE et al., 2004). Também é produzido por macrófagos, células endoteliais, fibroblastos e células musculares e está relacionado à regeneração óssea (AL-ZUBE et al., 2009) (Figura 8). Figura 8 – Regeneração óssea pela aplicação do fator de crescimento: a) aplicação do PDGF-BB, b) controle. Fonte: Al-Zube et al. (2009). Estas proteínas apresentam atividades angiogênica, mitogênica para células mesenquimais, incluindo fibroblastos e osteoblastos, estimulam a expressão de TGF- β pelos macrófagos e quimiotáxica para macrófagos e fibroblastos (MASTROCINQUE et al., 2004; MILLIS, 1999). É uma glicoproteína de natureza catiônica, possui a capacidade de permanecer estável em temperaturas menores que 100°C e com ponto isoelétrico muito básico (pH 10). Ela pode ser separada em duas frações proteicas (que diferem no conteúdo de carboidratos unidos covalentemente), PDGF-A e PDGF-B, podendo existir como a) b) 35 heterodímero (AB) ou homodímero (AA, BB). A forma BB é mais mitogênica que a AB, que por sua vez é mais que a AA (MILLIS, 1999) Lynch et al. (1989) concluíram que PDGF e IGF-I têm se mostrado potentes agentes mitogênicos e quimiotáticos para osteoblastos e fibroblastos in vivo, podendo estimular a migração destas células na área e promover sua proliferação. Além disso, estes fatores de crescimento parecem ser capazes de estimular processos metabólicos de recrutamento de células, levando à formação de novo colágeno e osso (Figura 8). Uma simples aplicação mostrou-se efetiva e resultou em melhora do crescimento ósseo com preenchimento dos defeitos periodontais quando comparados à prática comum (HOWELL et al., 1997). Embora não esteja definida a dose ideal, sabe-se que a associação com outros fatores de crescimento (IGF-I e TGF- β) pode ser capaz de dobrar a aposição óssea em 48 horas (HOWELL et al., 1997; PFEILSCHIFTER et al., 1990). Howell et al. (1997) determinaram a segurança da aplicação em humanos, sendo que uma dose única de 150 µL/mL de PDGF-BB e IGF-I proporcionou significativo crescimento ósseo. Tal et al. (1996) utilizaram gel de colágeno e Marzouk et al. (2007) utilizaram microesferas de vinil estireno, baseando-se na capacidade de manutenção do espaço e a liberação dos fatores de crescimento. As regenerações dos grupos tratados não foram satisfatórias devido à lenta degradação e liberação dos materiais, o que dificultou repovoamento da área e ao longo tempo de exposição ao PDGF-BB. 36 2 OBJETIVOS 2.1 Objetivos gerais Obtenção e caracterização de membranas de látex natural com alginato para regeneração óssea. 2.2 Objetivos específicos -Desenvolvimento e caracterização de membranas de látex natural com diferentes proporções de alginato de sódio (com ou sem reticulação com cálcio); -Caracterização química e física das blendas, miscibilidade, morfologia, estabilidade térmica, resistência mecânica, propriedade de barreira, hidrofilicidade, degradação; -Avaliar a biocompatibilidade in vitro por hemólise e citotoxicidade; -Analisar a regeneração óssea in vivo. 37 3 MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 Confecção das membranas O látex natural foi obtido pela BDF Comércio de Produtos Agrícolas Ltda, Guarantã/SP (lote: 01703/13), a partir da mistura de diferentes clones (RRIM 600 e PB 235). O látex foi estabilizado com hidróxido de amônia 0,7% (m/m de borracha) para fornecer um pH 10 (para evitar a degradação e permitir sua estabilização) e centrifugado a 8000 rpm para fornecer uma solução de 60% (m/v) de borracha e reduzir as proteínas presentes no látex natural relacionadas à reação alérgica. O Quadro 1 mostra a caracterização do produto segundo o fornecedor. O alginato de sódio utilizado foi obtido pela empresa Êxodo Cientifica (código AS08563RA). Quadro 1 – Especificações físico-químicas do látex natural utilizado fornecido pela empresa BDF. Requisitos Valores Sólidos totais 61% Borracha seca 60% Diferença entre sólidos totais e borracha seca 1% Hidróxido de amônia 0,7% pH 10,2 Viscosidade 30 seg Estabilidade mecânica 515 seg Ácido Graxo Volátil 0,0136% Cor Normal Odor Normal Fonte: BDF Comércio de Produtos Agrícolas Ltda. 38 Foram produzidas membranas de látex natural, alginato e blendas com diferentes proporções mássicas, reticuladas ou não com cloreto de cálcio, por deposição das soluções da mistura dos polímeros em moldes e evaporação do solvente. Para confecção das membranas de látex, foi utilizada uma solução de látex natural 60% (m/v). Para a confecção das membranas de alginato, foi utilizada uma suspenção de alginato de sódio 3% (m/v, em água destilada). As blendas foram preparadas nas proporções de 1:1, 2:1, 3:1 e 4:1 (v/v, alginato:látex) e secas por 24 horas a 60°C. A reticulação foi realizada nas membranas secas, sob imersão em de solução de cloreto de cálcio 1% (m/v, em água destilada) por 10 minutos, e posteriormente secas por 24 horas a 60°C. As diferentes formulações das blendas foram citadas neste trabalho conforme suas proporções entre o látex e o alginato, e sua reticulação, segundo a Tabela 1; os valores são referentes a uma placa de Petri de 60 mm. Tabela 1 – Abreviação dos materiais elaborados assim como as respectivas composições mássicas. Látex Alginato Reticulação Nomenclatura Volume (mL) % (m/m) Volume (mL) % (m/m) (20 mL) L 2 100,00 0 0,00 Não 1 2 95,24 2 4,76 Não 2 2 90,91 4 9,09 Não 3 2 86,96 6 13,04 Não 4 2 83,33 8 16,67 Não A 0 0,00 10 100,00 Não 1C 2 95,24 2 4,76 Sim 2C 2 90,91 4 9,09 Sim 3C 2 86,96 6 13,04 Sim 4C 2 83,33 8 16,67 Sim AC 0 0,00 10 100,00 Sim Fonte: Autoria própria. 39 O PDGF-BB (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EUA, código P4056) foi utilizado apenas no teste in vivo. Para a incorporação do PDGF-BB, realizou-se triagem dentre as membranas para utilizar composição que apresentasse as características desejadas, tais como aumento da degradação sem prejuízo da sua segurança nos testes in vitro. A incorporação do PDGF-BB foi feita por adsorção, no momento da aplicação in vivo o PDGF-BB foi solubilizado com água destilada e foi depositado 20 µL na superfície da membrana, correspondendo a 200 ng de fator de crescimento por membrana (LEE et al., 2002; PARK et al., 1998; PARK et al., 2000). 3.2 Caracterização 3.2.1 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) Para as imagens de Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV), as amostras foram recobertas com ouro (modelo SCD 050, marca Bal-Tec, Balzers, Liechtenstein), e as micrografias foram obtidas em um MEV por Canhão de Emissão por Campo (MEV-FEG, marca JEOL, modelo JSM 7500F, com software de operação PC-SEM v 2.1.0.3, Tóquio, Japão) acoplado com um equipamento de Energia Dispersiva de Raio-X (EDS, marca Thermo Scientific, modelo Ultra Dry, com software de operação NSS 2.3, Massachusetts, EUA). As micrografias do MEV-FEG foram obtidas sob 2 kV e as análises de EDS sob 10 kV, da face superior, em áreas aleatórias da mesma amostra, no Laboratório de Microscopia Avançada, Instituto de Química de Araraquara, UNESP. 40 3.2.2 Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier em modo de Refletância Total Atenuada (FTIR-ATR) Os espectros de FTIR foram medidos usando o aparelho Bruker Tensor 27 (software OPUS), com o acessório de ATR (com cristal de diamante), no intervalo de 4000-380 cm-1, com 16 varreduras e resolução de 4 cm-1, fonte de tungstênio e mercúrio, laser de Hélio-Neônio e detector de KBr/DLaTGS. 3.2.3 Resistência mecânica à tração Para os testes, foi utilizada a máquina universal de ensaios (EMIC DL2000), com uma célula de carga de 50 kgf, a uma velocidade de 500 mm/min (ASTM D412), a temperatura ambiente, com tração até a ruptura. Foram utilizados corpos de prova retangulares com dimensões de aproximadamente 0,5 mm de espessura, 25 mm de largura e 80 mm de comprimento (REZENDE et al., 2010), as medidas de espessura foram obtidas com micrômetro analógico (precisão de 0,01 mm, marca STANDARD GAGE, modelo 0114010) e a largura e comprimento foram medidas com paquímetro digital (precisão de 0,01 mm, marca Homes). O cálculo de tensão (MPa) foi calculado segundo a Equação 1, o alongamento (mm/mm) segundo a Equação 2, e o módulo de Young (MPa) foi calculado segundo a Equação 3 (considerando a região linear até 5% de alongamento, deformação elástica), onde F é a força (N), A é a área da seção transversal da amostra (mm²), L é o comprimento final (mm) e L0 é o comprimento inicial da amostra (mm). O ensaio foi realizado em quintuplicata e expresso como média e desvio padrão. Tensão = F A (1) Alongamento = (L-L0) L0 (2) 41 Módulo de Young = Tensão Alongamento (3) 3.2.4 Termogravimetria (TG) As curvas termogravimétricas foram obtidas com o equipamento TGA-50 (Shimadzu), onde aproximadamente 5 mg de amostra foi acondicionada em cadinho de alumina, sob taxa de aquecimento de 10°C/min, de 25°C a 800°C, sob atmosfera de nitrogênio (25 mL/min). A termogravimetria derivada (DTG) foi obtida a partir da primeira derivada da variação da massa em relação à temperatura, utilizando programa OriginPro 2017, para auxílio na determinação das temperaturas de perda de massa. 3.2.5 Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC) Para a Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC), utilizou-se o equipamento DSC-60 (Shimadzu), onde aproximadamente 5 mg de amostra foi colocada em um cadinho de alumina. Todas as amostras foram submetidas a ciclos de resfriamento e aquecimento (-120°C a 200°C, sob taxa de 10°C/min) para eliminar a história térmica do material, sob atmosfera de nitrogênio (fluxo de 25 mL/min). Para a interpretação da temperatura de transição vítrea (Tg), considerou-se a segunda corrida térmica do experimento. 42 3.2.6 Ângulo de contato (molhabilidade) As medidas de ângulo de contato foram realizadas pelo método de gota séssil (17 µL de água destilada a 0,5 µL/segundo) no goniômetro DataPhysics modelo OCA20 em atmosfera ambiente a 21°C por 30 segundos. O ângulo de contato foi calculado automaticamente pelo programa SCA20, por meio da análise do perfil da gota utilizando a equação de Young-Laplace para ajustar seu contorno. O ensaio foi realizado em triplicata e expresso como média e desvio padrão. 3.2.7 Intumescimento Para análise da cinética do grau do intumescimento, as membranas (diâmetro de 37,4 mm) foram submersas em 30 mL c-SBF (fluido corporal simulado) a 37°C e pH 7,4 (OYANE et al., 2003). Em cada intervalo de tempo, o excesso de líquido foi removido da superfície e a absorção das membranas intumescidas foi apurada gravimetricamente em balança analítica com precisão 0,1 mg (marca Shimadzu, modelo AUY 220). O grau de intumescimento (%) foi determinado em função da massa inicial e final da amostra segundo a Equação 4, onde mf é a massa final hidratada (g), mi é a massa inicial seca (g). O ensaio foi realizado em quintuplicata e expresso como média e desvio padrão. Intumescimento = (mf-mi) mi X100 (4) 43 3.2.8 Permeabilidade ao vapor de água A permeabilidade ao vapor de água foi determinada gravimetricamente, pelo método dessecante, segundo as normas da ASTM E96. As membranas foram utilizadas para selar os recipientes (abertura de 1,2 cm²) contendo sílica-gel (umidade relativa 0%). Os frascos foram mantidos em dessecador com solução saturada de cloreto de sódio (40 g/100 mL de água), proporcionando uma atmosfera com 75% de umidade relativa, a 36,5°C. A variação da massa foi registrada em intervalos de tempos regulares de 24 horas durante 7 dias. A permeabilidade ao vapor de água (g.mm/h.cm².mmHg) foi calculada segundo a Equação 5, onde, Δm é a variação da massa (g), e é a espessura da membrana (mm), t é o tempo (horas, h), A é a área (cm²), S é pressão de saturação de vapor de água (47,1 mmHg a 37°C) e ΔRU é a diferença de umidade relativa. O ensaio foi realizado em triplicata e expresso como média e desvio padrão. Permeabilidade ao vapor de água = Δm.e t.A.S.ΔRU (5) 3.2.9 Degradação in vitro em fluído simulado Para o ensaio de degradação, as amostras foram feitas em placa de Petri de 60 mm, e submersas em c-SBF 1X (pH 7,4), 36,5°C, sem agitação, em 40 mL. Para evitar a degradação por microrganismos, o c-SBF foi esterilizado em autoclave (121°C, por 20 minutos) e as membranas foram submetidas a radiação ultravioleta (UV) por 20 minutos em cada superfície. Após o ensaio de degradação, as amostras foram secas em dessecador a temperatura ambiente até estabilização da massa. A análise gravimétrica de perda massa (%) foi obtida pela Equação 6, onde mi é a massa inicial seca (g) e mf é a massa final da amostra (g) nos tempos de 7, 15, 30, 60 e 120 dias. O ensaio foi realizado em quintuplicata e expresso como média e desvio padrão. 44 Perda de massa = (mi-mf) mi X100 (6) O ensaio de degradação também foi avaliado por resistência mecânica à tração nos tempos de 7, 15, 30, 60 e 120 dias conforme a seção 3.2.3. A análise por FTIR- ATR foi realizada conforme a seção 3.2.2 e comparado entre o 30° dia de degradação e o espectro original. As medidas foram normalizadas em 835 cm-¹, referente à deformação fora do plano (=CH), presente apenas no látex, uma vez que todas amostras apresentam a mesma quantidade de látex (JIANG et al., 2015). 3.2.10 Caracterização in vitro em modelos celulares 3.2.10.1 Hemólise O efeito hemolítico in vitro dos filmes foi realizado em conformidade com a norma da International Standard Organization 10993 parte 4 (ISO), por contato direto (Figura 9). O sangue de carneiro desfibrinado (Newprov) foi lavado 2x com solução salina 0,9%, a 1000 rpm por 10 minutos, descartando-se o sobrenadante. Membranas de 6 mm de diâmetro foram incubadas em contato direto com 1 mL solução de 5% de eritrócitos (v/v, em solução salina 0,9% m/v) por 1h a 37°C. No controle negativo (CN) não foi adicionado material e como controle positivo (CP) foi utilizado água destilada. Em seguida, as amostras foram centrifugadas 1000 rpm por 10 minutos, 100 µL do sobrenadante foi transferido para placa de 96 poços e a densidade óptica (DO, em absorbância) foi medida em leitora de microplaca sob 540 nm. O experimento foi realizado em quintuplicata e expresso como média e desvio padrão. A hemólise (%) foi estimada conforme a Equação 7, onde DOa, DOCN e DOCP se referem à DO da amostra, CN e CP, respectivamente, onde até 5% de hemólise foi considerado como não hemolítico (ANDIAPPAN et al., 2013). 45 Hemólise = (DOa−DOCN) (DOCP−DOCN) x100 (7) Figura 9 – Imagem representativa do teste de hemólise por contato direto. As setas pretas indicam a localização das membranas (látex à esquerda e alginato reticulado à direita), os asteriscos amarelos mostram a presença das hemácias, retângulo indica o sobrenadante com hemólise. Fonte: Autoria própria. 3.2.10.2 Cultivo celular A linhagem celular de pré-osteoblasto MC3T3-E1 subclone 14 foi obtida do Banco de Células do Rio de Janeiro. As células foram mantidas em garrafas de cultura (75 cm²) com meio de cultura completo composto por Meio Mínimo Essencial Alfa (α- MEM, suplementado com ribonucleosídeos e desoxirribonucleosídeos da Sigma- Aldrich, St. Louis, Missouri, EUA, código M0644) suplementado com 10% de FBS (Soro Bovino Fetal, Gibco®, New York, EUA), 2 mM de L-glutamina e 1% de antibiótico/antimicótico (100 U/mL de penicilina, 100 µg/mL estreptomicina e 0,25 µg/mL de fungizona, Gibco®, New York, EUA), a 37°C, em atmosfera umidificada, a 5% de CO2. As trocas de meio ocorreram três vezes por semana. Ao atingirem 46 confluência de 80-90%, as células foram dissociadas com TrypLe TM (Gibco®, New York, EUA) e subcultivadas na proporção de 1:6 a 1:8. 3.2.10.2.1 Adesão e morfologia celular Esta análise foi utilizada para avaliar se os materiais servem de suporte para a adesão e crescimento celular, possibilitando sua utilização não só como barreira mecânica, mas também como fonte de células, o que poderia acelerar a regeneração. Para esta análise, as membranas foram preparadas dispersando a solução da mistura dos polímeros em lamínula circular de 13 mm, secas a 60°C, esterilizadas por luz ultravioleta por 20 minutos de cada lado, e por fim foram depositados em placa de 24 poços. As células MC3T3-E1 foram adicionados na concentração de 2x104 células/poço e cultivadas por 7 dias. Após este período, o meio de cultura foi removido, lavadas com tampão fosfato (PBS 1X, pH 7,4), fixadas em solução de glutaraldeído 2,5% (v/v, em PBS 1X) por uma hora a temperatura ambiente, desidratadas em série crescente de etanol (50%, 60%, 70%, 80%, 90% e duas vezes em 100%, 10 minutos cada), secas a temperatura ambiente e armazenadas em dessecador (sob vácuo e sílica a temperatura ambiente) até a análise por MEV-FEG segundo seção 3.2.1. 3.2.10.2.2 Proliferação celular As células foram plaqueadas na densidade de 2x104 células/poço sobre as amostras segundo a seção 3.2.10.2.3. A proliferação celular foi aferida pelos métodos colorimétricos de metabolização e redução de MTT e resazurina, em triplicata. A análise por MTT foi realizada conforme a seção 3.2.10.2.1. Para o método da resazurina, foram adicionados 40 µL de resazurina (0,15 mg/mL, em PBS 1x pH 7,4), incubados por 4 horas a 37°C e 5% de CO2. Em seguida, o sobrenadante foi substituído por meio de cultura completo, e a DO da fluorescência foi mensurada em espectrofluorímetro (LS 45, Perkin Elmer, EUA, programa FL Winlab) sob 47 comprimento de onda de 570 nm para excitação e de 585 nm para emissão (AHMED et al., 1994). 3.2.10.2.3 Citotoxicidade O teste de citotoxicidade celular foi realizado conforme as recomendações da norma técnica ISO 10993 partes 5 e 12, por contato direto com a linhagem MC3T3- E1. As células foram plaqueadas na densidade de 2x104 células/poço em placa de 24 poços (2 cm²), permanecendo 24 horas para adesão. As membranas de 6 mm de diâmetro foram esterilizadas por luz ultravioleta por 20 minutos de cada lado e colocadas sobre a cultura por 24, 48 e 72 horas de contato com 1 mL de meio de cultura completo. Após cada intervalo de tempo, as membranas e o meio de cultura completo foram removidos, adicionou- se 400 µL de meio de cultura novo (sem soro nem vermelho fenol) com 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil brometo de tetrazoilium (MTT) (0,5 mg/mL) e incubado por 4 horas a 37°C e 5% de CO2. Em seguida, o meio foi descartado, adicionou-se 400 µL de dimetilsulfóxido, incubando por 10 minutos no escuro para dissolver os cristais de formazan. Por fim a DO foi medida em leitor de microplaca (PowerWave Epoch 2, BioTeK Instruments, EUA, com programa versão 2.09.1) no comprimento de onda de 570 nm (MOSMANN, 1983). O experimento foi realizado em quadruplicata com 2 experimentos independentes, e a viabilidade celular (%) foi calculada em relação ao controle negativo (CN, poliestireno), conforme Equação 8 e expressa como média e desvio padrão. Viabilidade celular = DOa DOCN X100 (8) 48 3.3 Aplicação in vivo em modelo de defeito de calvária Para o experimento in vivo, a membrana selecionada foi a membrana 4 (16,6% m/m de alginato) por apresentar melhor desempenho no teste de degradação e citotoxicidade in vitro e adesão celular. A membrana foi esterilizada por óxido de etileno pela empresa OXETIL Ltda, e o PDGF-BB foi adsorvido na superfície da membrana em contato com o defeito da calvária conforme seção 3.1. O experimento foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais da Faculdade de Ciências Farmacêuticas sob o protocolo CEUA/FCF/CAr nº 25/2015 (parecer nº 81/2015) (Anexo A). 3.3.1 Cuidado animal Neste trabalho, foram utilizados ratos Rattus norvegicus, variação albinus, Holtzman, machos, adultos, com massa corporal entre 300-400 g, provenientes do biotério da Faculdade de Odontologia de Araraquara, FOAr-UNESP. Os animais foram mantidos no biotério da Faculdade de Ciências Farmacêuticas FCFAr-UNESP em gaiolas plásticas forradas com maravalha (troca três vezes por semana), em gabinetes microprocessador com ventilação e ambiente com temperatura (22±1°C) e umidade (65-75%) controlados, ciclo claro/escuro de 12:12 horas, alimentados com água e ração ad libitum. 3.3.2 Cirurgia Conforme o protocolo CEUA/FCF/CAr nº 25/2015 (parecer nº 81/2015), foram utilizados 42 animais os quais foram divididos em 3 grupos (controle/coágulo, membrana 4 e membrana 4 com 200 ng de PDGF-BB, denominados de C, 4 e 4P, respectivamente), contendo 7 animais por grupo nos seguintes períodos de análise 49 de 15 e 60 dias. Os animais foram anestesiados (injeção intramuscular de cloridrato de ketamina 25 mg/kg e de cloridrato de xilazina 5 mg/Kg), tricotomizados na região parietal, foi realizada antissepsia com riodeine (polivinil pirrolidona iodo em solução aquosa, contendo 1% de iodo ativo), seguido de descolamento e rebatimento dos tecidos contendo epiderme, tecido muscular e periósteo, até a exposição do osso parietal. Os defeitos ósseos críticos na calvária foram realizados com o auxílio de uma trefina de 5 mm de diâmetro sob irrigação constante de soro fisiológico 0,9% (m/v, em água destilada), mantendo-se a integridade da dura-máter evitando-se a região das suturas ósseas. O defeito foi preenchido com coagulo (controle), membrana ou membrana com fator de crescimento, e posteriormente suturados com por meio de pontos simples com Vicryl 4-0. No pós-operatório os animais receberam cetoprofeno, pentabiótico (Fort-Dodge, Brasil, 0,02 mL/100g) e foram mantidos em decúbito lateral sob temperatura de aproximadamente 32°C até se moverem (Figura 10). Figura 10 – Cirurgia para criação do defeito na calvária: a) remoção da porção da calota cortada, b) recuperação pós-cirúrgica em decúbito lateral. Fonte: Autoria própria. O grupo de 60 dias recebeu doses de corantes intravitais fluorescentes para avaliação da cronologia da mineralização durante crescimento ósseo, segundo o cronograma: a) b) 50 - vermelho de alizarina S 30 mg/Kg 7 dias antes da cirurgia - vermelho de alizarina S 30 mg/Kg 1 dia antes da cirurgia - calceína azul 30 mg/Kg 10 dias após cirurgia - tetraciclina 20 mg/Kg 20 dias após cirurgia - calceína verde 20 mg/Kg 30 dias após cirurgia - alaranjado de xilenol 100 mg/Kg 40 dias após cirurgia - vermelho de alizarina S 30 mg/Kg 50 dias após cirurgia - Eutanásia 60 dias após cirurgia Após cada período, os animais foram submetidos à eutanásia por overdose de anestesia. Os crânios foram separados por guilhotina, imediatamente mantidos 48 horas em paraformaldeído 4% (em PBS pH 7,4), posteriormente lavados por 4 horas em água corrente e por fim, armazenados em etanol 70% até as análises (MicroCT). 3.3.3 MicroCT A análise microtomográfica foi obtida a partir equipamento Skyscan 1176 (Astselaar, Bélgica, 2003) (Figura 11). As amostras foram obtidas com um filtro de alumínio de 1,0 mm, cortes de 17,48 µm, por 360° (passo de rotação de 0,5°), voltagem de 70 kV, corrente de 357 µA e exposição de 400 ms. A amostras foram reconstruídas pelo programa NRecon (versão 1.7.3.1) e NReconServer (versão 1.7.3.2) sob os parâmetros de bean-hardening correction (40%), ring artifacts reduction (20), smoothing (1), dinamic image range (0,0045-0,065). Posteriormente, foram orientadas por meio do programa Data Viewer (versão 1.5.6.2) e salvas no eixo coronal x-z). Em seguida, as micrografias foram analisadas pelo programa 51 CTAnalyser (versão 1.17.7.2), onde a região de interesse (ROI) foi delimitada (região circular de 5 mm de diâmetros equivalente ao defeito criado) utilizando uma imagem 2D de referência do defeito, com limites equivalentes a 1 mm de espessura (58 cortes, para abranger toda a profundidade da regeneração, de forma a obter o volume de interesse (VOI), com binarização (escolha de um valor limiar para os pixels, “threshold”) cujos valores situados entre 70-255 foram convertidos em um valor denominado saturado, em uma imagem de 8 bits, obtendo uma imagem em preto e branco. A análise foi realizada em quintuplicata e os resultados expressos como média e desvio padrão. Figura 11 – Análise da regeneração óssea por MicroCT: a) suporte para imobilizar as amostras, b) equipamento de microCT Skyscan 1176. Fonte: Autoria própria. 3.4 Análise estatística Para criação dos gráficos e análise estatística, utilizou-se o programa OriginPro 2017 e os dados foram registrados como média e desvio padrão. Para seleção dos métodos estatísticos, os dados foram submetidos aos testes de normalidade (Shapiro- Wilk) e homocedasticidade (Levene). Os dados foram comparados pelo teste de t- Student ou o teste ANOVA (one way) seguido do pós-teste de Tukey. Para todas as análises foi adotado o nível de significância de 95% (p < 0,05). b) a) 52 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) A Figura 12 é uma micrografia sob ampliação de 1000x mostrando a morfologia da superfície das membranas produzidas. Nas membranas sem reticulação, não foi possível observar porosidade nas superfícies nem separação de fase entre o látex e o alginato, apresentando um aspecto denso e contínuo. Porém, nas membranas reticuladas com cálcio notam-se mais irregularidades na superfície, sendo que na membrana de alginato reticulada observam-se detalhes mais claros (protuberâncias), provavelmente ao sal reticulado com o alginato e depositado na superfície. Bierhalz et al. (2014) também observaram a presença de bário na superfície do alginato depois de sua reticulação com esse cátion. Esse aumento na irregularidade da superfície das blendas reticuladas pode ser devido à imersão na solução de cloreto de cálcio. Ho e Khew (2000) notaram que durante a formação do filme de látex formam-se exsudatos em sua superfície, e quando eles foram lixiviados, aumentou a rugosidade da superfície do filme. Além disso, uma vez que o alginato é hidrofílico e solúvel em água, também pode ocorrer a solubilização da camada mais superficial, antes de sua reticulação (RHIM, 2004). Assim como também pode ter ocorrido contração devido à tensão criada pela reticulação, uma vez que as membranas de alginato reticuladas se mostraram deformadas e extremamente rígidas e quebradiças após secagem. Na fabricação de membranas com fibroína de seda e alginato, Moraes et al. (2014) observaram separação de fase entre os dois polímeros em todas as proporções utilizadas, notando estruturas globulares, mesmo a partir de soluções homogêneas. O solvente é um fator importante para a miscibilidade, deposição e formação das membranas. Um e Park (2007) observaram a separação de fase na mistura de fibroína de seda com álcool polivinílico (PVA) em solução aquosa, entretanto, quando produziram as membranas a partir do ácido fórmico como solvente, observaram a formação de blendas miscíveis por MEV. A solução de látex 53 é estabilizada em um pH alcalino, o que pode favorecer a miscibilidade com o alginato, uma vez que sua viscosidade diminui com o aumento do pH (LEE; MOONEY, 2012). A presença de protuberâncias na superfície também pode ser devido a ambos os polímeros apresentarem cargas negativas (WONGTHEP et al., 2012; LEE; MOONEY, 2012). Daemi, Barikani e Barmar (2013) justificou a formação de irregularidades na superfície de membranas de alginato com poliuretano devido a ambos polímeros apresentarem carga negativa do grupo carboxilato (COO-), o que poderia levar a repulsão entre os polímeros. Figura 12– Micrografia da morfologia superficial a partir do MEV sob ampliação 1000x das membranas: a)1, b) 1C, c) 2, d) 2C, e) 3, f) 3C, g) 4, h) 4C, i) A, j) AC e k) L. a) 1 b) 1C c) 2 d) 2C 54 e) 3 f) 3C g) 4C h) 4C i) A j) AC 55 Fonte: Autoria própria. A Figura 13 é uma micrografia da membrana 4. Para a formação da imagem, o MEV utiliza uma tensão de aceleração dos elétrons de 2 kV (Figura 13.a,b), gerando informação da camada mais superficial do material, originando assim uma imagem com aspecto tridimensional bem definida (elevada profundidade de campo), sendo útil para avaliar a estrutura topográfica. O EDS é um espectrômetro de Raio-X que utiliza uma tensão de aceleração maior (10 kV) (Figura 13.c,d) para análise, de forma que os elétrons apresentam uma penetração maior na amostra, ocorrendo sobreposição entre os sinais de diferentes profundidades, gerando uma imagem de nitidez inferior, mas que permite a avaliação da composição química (DEDAVID; GOMES; MACHADO, 2007). A análise de EDS foi escolhida para demonstrar a presença do cálcio utilizado na reticulação. O sinal do ouro no EDS é devido ao recobrimento da amostra. É possível notar a presença de sódio em ambas as amostras, pois antes da reticulação, o alginato estava ligado com o cátion monovalente para permitir sua solubilização. A presença de cálcio é observada apenas na membrana reticulada (Figura 13.e,f).. k) L 56 Figura 13 – Análise por MEV-EDS sob ampliação de 300x: a) micrografia por MEV da membrana 4, b) micrografia por MEV da membrana 4C, c) micrografia por EDS da membrana 4, d) micrografia por EDS da membrana 4C, e) EDS da membrana 4, f) EDS da membrana 4C. 0 1 2 3 4 0 20 40 60 80 100 120 keV 4 C O Na Au e) 0 1 2 3 4 0 10 20 30 40 50 60 70 keV 4C C O Ca Au Na f ) Fonte: Autoria própria. a) 4 b) 4C c) 4 d) 4 57 4.2 Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier em modo de Refletância Total Atenuada (FTIR-ATR) A Figura 14 resume o espectro de FTIR-ATR das membranas puras. Na membrana de látex, composto principalmente pelo polímero cis-1,4-isopreno, destacam-se principalmente as bandas em 2956 cm-1, 2904 cm-1 e 2840 cm-1, relacionadas com estiramento assimétrico CH3, simétrico de CH3 e simétrico de CH2, 1661 cm-1 relacionado com estiramento de C=C, 1441 cm-1 com deformação de CH2, 1376 cm-1 com deformação assimétrica de CH3, 839 cm-1 com deformação angular fora do plano de =CH, 576 cm-1 e 476 cm-1 deformação de C-C-C (NALLASAMY; MOHAN, 2004). No espectro do látex, observa-se também uma banda larga em 3500- 3000 cm-1 de ligação de hidrogênio, 1700-1620 cm-1 e 1580-1520 cm-1 de amida I e II, respectivamente. Estas bandas estão relacionadas às proteínas presentes no látex natural, e estão ausentes no espectro do isopreno sintético (FERREIRA et al., 2009). No espectro da membrana de alginato (Figura 14), observa-se uma banda de absorção larga entre 3600-300 de ligação de OH, entre 2980-2800 cm-1 de CH alifático, 1595 cm-1 e 1401 cm-1 devido ao estiramento assimétrico e simétrico da carboxila (COO-), 1129 cm-1 estiramento de C-O, 805 cm-1 e 778 cm-1 aos resíduos de ácido manurônico e gulurônico que compõe o alginato (DAEMI; BARIKANI, 2012; PAPAGEORGIOU et al., 2010). 58 Figura 14 – Espectro de FTIR do polímero cis-isopreno (azul) e das membranas de alginato (vermelho), alginato reticulado com cálcio (verde) e látex natural (preto). 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 50 60 70 80 90 100 T ra n s m it â n c ia ( % ) Número de onda (cm -1 ) cis-isopreno L A AC Fonte: Autoria própria. A reticulação é comprovada principalmente com o deslocamento da banda de estiramento assimétrico da carboxila de 1595 cm-1 para 1592 cm-1, além da redução das intensidades das bandas. Essa mudança ocorre na hidroxila e carbonila ao quelar os íons de cálcio, e é ocasionada pela mudança de densidade de carga, raio e massa atômica (DAEMI; BARIKANI, 2012). As blendas apresentam espectro misto, exibindo as bandas de ambos os polímeros, sendo que é possível distinguir a banda de alginato em aproximadamente 1595 cm-1 e em 1592 cm-1, para a membrana sem e com reticulação (Figura 15.a,b). Porém, a maioria das bandas são características do espectro do látex natural, componente em maior proporção. 59 Figura 15 – Espectro de FTIR das blendas com diferentes proporções de alginato: a) sem reticulação, b) com reticulação. 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 70 75 80 85 90 95 100 T ra n s m it â n c ia ( % ) Número de onda (cm -1 ) 1 2 3 4 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 Número de onda (cm -1 ) 1C 2C 3C 4C 70 75 80 85 90 95 100 T ra n s m it â n c ia ( % ) Fonte: Autoria própria. a) b) 60 4.3 Resistência mecânica à tração Com o acréscimo de alginato, ocorreu uma redução do alongamento acompanhado por um aumento da tensão de ruptura e do módulo de Young, além disso, esses parâmetros foram intensificados com a reticulação, com diferença estatística apenas para as maiores proporções de alginato, conforme a Tabela 2. Não foi possível mensurar a membrana com alginato de cálcio reticulada, pois ela se apresentou extremamente quebradiça ao prender na máquina de ensaio mecânico. Tabela 2 – Valores médios das propriedades mecânicas do teste de tração das membranas. Amostra Alongamento (mm/mm) Tensão (MPa) Módulo de Young (MPa) 1 4,88 ± 0,69a 1,13 ± 0,17a 1,71 ± 0,10a 2 3,13 ± 0,72b 1,62 ± 0,30b 4,57 ± 0,34b 3 3,29 ± 0,40c 2,41 ± 0,27c 8,26 ± 0,88c 4 2,21 ± 0,38d 2,41 ± 0,13d 10,88 ± 1,18d L 10,84 ± 1,78 0,88 ± 0,21 0,73 ± 0,03 1C 4,79 ± 0,53A 1,13 ± 0,20a 1,67 ± 0,15a 2C 3,42 ± 0,32B 1,56 ± 0,15b 4,01 ± 0,76b 3C 3,16 ± 1,08C 2,64 ± 0,49C 10,09 ± 1,10C 4C 1,15 ± 0,44D 2,47 ± 0,35D 13,66 ± 1,28D A 0,08 ± 0,004 16,46 ± 9,14 129,90 ± 55,37 *Médias seguidas de pelo menos uma letra igual indica diferenças não significativas (p > 0,05). A estatística foi realizada comparativamente entre os materiais com e sem reticulação. Fonte: Autoria própria. O látex é um elastômero, podendo ser observado pelo seu baixo valor do módulo de Young e alto estiramento. Neves‐Junior et al. (2006) e Rezende et al. (2010) observaram valores semelhantes aos obtidos, com módulo de Young abaixo de 1 MPa, uma vez que também utilizou o látex natural sem agentes reticulantes. A Figura 16 mostra uma curva de tensão-deformação típica de um elastômero como o látex natural, apresentando um formato sigmoide, com três regiões: inicialmente uma região 61 elástica, com tensão e deformação crescentes linearmente onde a deformação pode ser recuperada ao seu valor inicial; seguida da região plástica onde ocorre pouca variação de tensão com bastante alongamento, gerando uma deformação permanente; por fim ocorre uma região de aumento da tensão, devido ao alinhamento das cadeias poliméricas na direção da tensão (cristalização induzida pela deformação), até ocorrer o rompimento da amostra (NEVES‐JUNIOR et al., 2006). Figura 16 – Gráfico da tensão versus deformação da resistência mecânica à tração das membranas em diferentes proporções. 0 3 6 9 12 15 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 24 26 28 30 T e n s ã o ( M P a ) Alongamento (mm/mm) 1 2 3 4 L 1C 2C 3C 4C A Fonte: Autoria própria. O alginato apresenta pouca deformação e maior tensão de ruptura, assim como as blendas formadas com sua adição. Daemi, Barikani e Barmar (2013) observaram o mesmo comportamento com a adição de alginato em elastômeros de poliuretano, devido à natureza quebradiça dos grupos dos ácidos urônicos e as ligações de 62 hidrogênio formadas. Segundo Trovatti et al. (2013), o incremento das propriedades mecânicas seria devido ao fenômeno de percolação mecânica, onde os grupos hidroxila da celulose bacteriana, e neste trabalho do alginato, exerceriam um papel de reforço ao formar ligações de hidrogênio intra e intermolecular. 4.4 Termogravimetria (TG) As análises térmicas permitiram caracterizar os materiais com respeito à sua estabilidade térmica, água livre ou ligada, pureza ou interação entre os polímeros das blendas. A Figura 17 e Figura 18 apresentam as curvas termogravimétricas de perda de massa das membranas em função da temperatura. Alguns eventos de degradação térmica ocorrem sobrepostos para ambos polímeros. O látex, por ser hidrofóbico, apresenta pouca variação de massa no início, ao contrário do alginato. Esta perda inicial (considerada até 200°C) deve-se a desidratação das amostras (SOARES et al., 2004). Os principais intervalos de perda de massa atribuídos ao alginato (BEKIN et al., 2013; SOARES et al., 2004) estão entre 200-290°C e 478-616°C; para o látex está entre 290-478°C e 616-800°C (RAO; JOHNS, 2008; RIPPEL, 2005). Pode-se observar que há sobreposição de perda entre os dois polímeros. Porém, com o aumento da proporção de alginato, observa-se um aumento de perda relativa à umidade (até 200°C), em que o látex apresenta apenas aproximadamente 0,5% de perda de massa e o alginato e alginato de cálcio 25,2 e 22,8%, respectivamente. Segundo Bekin et al. (2013), isso é devido aos grupos hidrofílicos do alginato (carboxila e hidroxila), enquanto que com a reticulação, há a ligação de cálcio na carboxila, adsorvendo menos umidade. O látex apresenta maior estabilidade térmica, até aproximadamente 300°C. A perda de massa entre 200-290°C aumentou com a proporção de alginato, e é associado a quebra das ligações glicosídicas (BEKIN et al., 2013), assim como entre 290-370°C (porém, apresentou menor contribuição proporcionalmente a contribuição da degradação do látex). A maior perda de massa do látex ocorre em uma única etapa, associada com a formação de produtos voláteis, entre 290-478°C. Entre 400-450°C é 63 associado com a decomposição mais lenta das cadeias poliméricas, provavelmente de regiões reticuladas formadas durante a degradação térmica, uma vez que não foram utilizados agentes reticulantes para o látex (RIPPEL, 2005). A degradação nas temperaturas acima de 500°C está relacionada à formação de óxidos e carbonatos intermediários, em ambos os materiais (BEKIN et al., 2013; PATEL et al.2016; RAO; JOHNS, 2008; RIPPEL, 2005; SOARES et al., 2004). Figura 17 – Curva termogravimétrica em atmosfera de nitrogênio das membranas dos polímeros puros e das blendas: a) não reticuladas, b) reticuladas com cloreto de cálcio. 100 200 300 400 500 600 700 800 0 20 40 60 80 100 P e rd a d e m a s s a ( % ) Temperatura (°C) 1 2 3 4 A L a) 64 100 200 300 400 500 600 700 800 0 20 40 60 80 100 P e rd a d e m a s s a ( % ) Temperatura (°C) 1C 2C 3C 4C AC L Fonte: Autoria própria. b) 65 Figura 18 – Curva termogravimétrica derivada das membranas dos polímeros puros e das blendas: a) não reticuladas, b) reticuladas com cloreto de cálcio. 0 100 200 300 400 500 600 700 800 0,00 -0,05 -0,10 -0,15 -0,20 -0,25 -0,30 -0,35 -0,40 D T G ( d m /d T ) Temperatura (°C) 1 2 3 4 A L 100 200 300 400 500 600 700 800 0,0 -0,2 -0,4 -0,6 -0,8 -1,0 -1,2 D T G ( d m /d T ) Temperatura (°C) 1C 2C 3C 4C AC L Fonte: Autoria própria. a) b) 66 4.5 Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC) As curvas DSC foram interpretadas a partir do segundo aquecimento, a fim de eliminar a influência da história térmica do material (por exemplo, uma relaxação de tensão, comum em elastômeros). A Figura 19 mostra a curva DSC do látex, com todos os ciclos de aquecimento e resfriamento. Tanto na primeira, quanto na segunda varredura é obtido o mesmo valor de temperatura de transição vítrea (Tg, valor de temperatura onde acima dele o polímero passa de um estado rígido para um estado onde as cadeias poliméricas apresentam mais mobilidade) de -61°C (RIEGEL; FREITAS; SAMIOS, 1999). Figura 19 – Curva de calorimetria exploratória diferencial em atmosfera de nitrogênio, exemplificando os ciclos de aquecimento e resfriamento da membrana de látex. Pico endotérmico para baixo. -100 -50 0 50 100 150 200 -0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 F lu x o d e c a lo r (m W /m g ) Temperatura (°C) Ciclos 1° (resfriamento) 2° (aquecimento) 3° (resfriamento) 4° (aquecimento) endo Fonte: Autoria própria. 67 A partir da curva DSC é possível inferir sobre a interação entre os dois polímeros, a partir da Tg. Blendas são misturas entre pelo menos dois polímeros, os quais não são necessariamente miscíveis e homogêneos, podendo ocorrer separação de fase, onde seria esperado o aparecimento de duas temperaturas de Tg ou a mudança da Tg dos materiais (RIAZ; ASHRAF, 2014). Não foi possível observar a Tg do alginato, e sua incorporação não causou alteração da Tg do látex em nenhuma das blendas, conforme apresentado na Figura 20 (a,b). Estes resultados sugerem que há boa miscibilidade e compatibilidade entre os materiais, entretanto, Moraes (2010) encontrou interação na mistura de alginato com o fibrina de seda, observando alteração dos picos de Tg. Pichayakorn et al. (2012) não observaram mudança na Tg na blenda entre o látex natural desproteinizado e o PVA, porém, observou uma redução Tg quando utilizado glicerina, considerando ambas as blendas compatíveis. Figura 20 – Curva de calorimetria exploratória diferencial em atmosfera de nitrogênio dos polímeros puros e das blendas: a) não reticuladas, b) reticuladas com cloreto de cálcio. Pico endotérmico para baixo. -100 -50 0 50 100 150 200 -0,6 -0,5 -0,4 -0,3 -0,2 -0,1 0,0 0,1 0,2 endo F lu x o d e c a lo r (m W /m g ) Temperatura (°C) 1 2 3 4 A L Tg: -61°C a) 68 -100 -50 0 50 100 150 200 -0,6 -0,5 -0,4 -0,3 -0,2 -0,1 0,0 0,1 0,2 F lu x o d e c a lo r (m W /m g ) Temperatura (°C) 1C 2C 3C 4C AC L endo Tg: -61°C Fonte: Autoria própria. Na mistura entre o látex com a quitosana, Rao e Johns (2008) observaram a presença de duas Tg, demonstrando que os polímeros são incompatíveis, inclusive observando a variação da Tg de ambos materiais, sendo que para o látex a Tg variou de -65°C (para o látex puro) até -71°C (para a blenda com 70% de quitosana). Daemi, Barikani e Barmar (2013) também observaram a incompatibilidade entre alginato e poliuretano por alteração da Tg devido a possível interação de ligação de hidrogênio entre o segmento mais flexível do poliuretano com o segmento mais rígido do alginato. 4.6 Ângulo de contato O ângulo de contato se refere ao ângulo que forma entre a superfície de um líquido ao entrar em contato com um sólido, e avalia a molhabilidade de um material. É considerado molhável pelo líquido (hidrofílico quando usada a água), ângulos abaixo de 90° (COUTINHO, 2007). b) 69 A membrana AC apresentou a maior molhabilidade, seguida pela de A, 2C e pelas membranas 1 e 2 (sendo que estas não apresentaram diferença estatística entre elas (Tabela 3). As membranas de látex, 3, 4, 1C, 3C e 4C não apresentaram diferença significativa, apresentando os maiores ângulos de contato, ou seja, menor hidrofilicidade (Figura 21.a-k). Pode-se observar que as membranas de alginato apresentaram maior molhabilidade e a de látex natural apresentou a menor molhabilidade. O acréscimo de alginato aumentou a molhabilidade das membranas, para as membranas 1 e 2 e 2C, porém, para as demais não houve diferença significativa. Tabela 3 – Medidas do ângulo de contato (média ± desvio padrão) a partir da técnica de gota séssil. Amostra Média Desvio Padrão L 86 ± 2,4a 1 58 ± 3,2b 2 52 ± 2,9b 3 84 ± 6,0a 4 88 ± 2,6a A 42 ± 0,8c 1C 84 ± 5,7a 2C 70 ± 8,0d 3C 89 ± 1,3a 4C 90 ± 1,5a AC 24 ± 6,2e *Médias seguidas de pelo menos uma letra igual indica diferenças não significativas (p > 0,05). Fonte: Autoria própria. 70 Figura 21 – Micrografias representativas do ângulo de contato da gota de água destilada (17 µL) na superfície dos materiais: a) L, b) A, c) AC, d) 1, e) 2, f) 3, g) 4, h), 1C, i) 2C, j) 3C e k) 4C. Fonte: Autoria própria. A hidrofobicidade do látex está de acordo com a literatura, uma vez que é composto principalmente pelo polímero de isopreno. Trovatti et al. (2015) observaram valores de 100° para a membrana de látex, e 90° com a adição de porosidade (devido à penetração na matriz), com uma redução do ângulo para 80° quando adicionado 20% de massa de celulose bacteriana. O aumento da hidrofilicidade com o acréscimo de alginato também foi observado por Moraes (2010), onde a fibroína de seda apresentou 81°, e após a incorporação de alginato reduziu para 72°. Dentre a literatura apresentada, o presente trabalho obteve o maior aumento da hidrofilicidade em relação à massa de alginato adicionada, obtendo ângulo de 58±3° com adição de 4,75% (m/m) de alginato no látex, sendo um resultado semelhante ao de Daemi, Barikani e Barmar (2013), o qual reduziu a hidrofobicidade do poliuretano de 75±2 para 60±2° com a adição de 4% de alginato.A hidrofilicidade da superfície é importante na interação célula e biomaterial, uma vez que as células preferem aderir em superfícies hidrofílicas (MORAES, 2010). b) A a) L c) AC d) 1 e) 2 f) 3 g) 4 h) 1C i) 2C j) 3C k) 4C 71 4.7 Intumescimento O intumescimento foi realizado em solução c-SBF durante 7 dias, e a absorção de água foi comparada proporcionalmente à massa inicial da amostra. Não foi possível analisar a membrana de alginato sem reticulação, uma vez que dissolvera completamente. A membrana de alginato reticulada apresentou o maior intumescimento e a de látex apresentou o menor, as demais apresentaram valores intermediários (Figura 22 e Figura 23). Foi possível observar que com o aumento da quantidade de alginato houve aumento do intumescimento e do tempo para atingir a massa máxima, porém, quando realizada a reticulação com cloreto de cálcio (1%), houve redução no grau de intumescimento quando comparado com a amostra não reticulada. Isso é devido à reticulação com o cálcio, que se liga à carboxila deixando-a indisponível para absorver umidade, além de que a reticulação reduz a mobilidade das cadeias, impedindo que a membrana expanda (BEKIN et al., 2013). A Figura 22 mostra o maior valor de absorção de água e o tempo em que ocorreu, podendo-se observar que também houve um maior tempo para o equilíbrio com o aumento do alginato, o qual também foi menor com a reticulação. Porém, as membranas não reticuladas apresentaram uma redução no grau de intumescimento nos tempos finais do experimento, provavelmente devido à dissolução de alginato e com isso à menor capacidade de retenção de líquido ao longo do tempo, indicando o início de sua degradação. Esses resultados complementam os resultados de ângulo de contato, os quais embora não tenha sido observado melhora na molhabilidade da superfície para as maiores concentrações de alginato como era esperado, foi observado maior intumescimento. Uma possibilidade para o resultado inesperado do ângulo de contato, seria que com o acréscimo de alginato, haveria uma modificação da superfície da membrana, assim como a reticulação, modificando sua interação com a gota de água, uma vez que a rugosidade pode influenciar na análise de ângulo de contato (COUTINHO, 2007). 72 Figura 22 – Cinética de intumescimento das membranas realizado em c-SBF por 5 dias. 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 0 100 200 300 400 500 In tu m e s c im e n to ( % ) Tempo (minutos) AC 4 4C 3 3C 2 2C 1 C 1 L Fonte: Autoria própria. Figura 23 – Gráfico apresentando o tempo em que as diferentes membranas apresentaram o intumescimento máximo. L 1 2 3 4 1C 2C 3C 4C AC 0 100 200 300 400 500 600 In tu m es ci m en to (% ) f e a b c aa 7200 min 300 min 1440 min 1440 min 5760 min 180 min 300 min 2880 min 5760 min 5760 min a b,c c,d b,d *Médias seguidas de pelo menos uma letra igual indica diferenças não significativas (p > 0,05). Fonte: Autoria própria. 73 Segundo a literatura, uma ferida pode produzir entre 0,17-0,86 g/cm²/dia de exsudato (DEALEY; CAMERON; ARROWSMITH, 2006). As membranas elaboradas para o ensaio de intumescimento apresentaram média das massas de aproximadamente 0,64±0,19 g e área de aproximadamente 11 cm², ou seja, cada membrana precisaria absorver entre 4,4-13,2 g de água por dia, equivalente a absorção de 292-1478% da massa das membranas. Com esses valores, apenas a membrana de alginato reticulada com cloreto de cálcio seria passível de utilização, ou as membranas 4 e 4C, porém com trocas mais constantes. 4.8 Permeabilidade ao vapor de água A Tabela 4 mostra a permeabilidade de vapor de água em gramas de água por dia, onde é possível observar que a membrana de alginato apresenta a maior taxa de permeabilidade (por ser hidrofílico), e o látex, por ser um material hidrofóbico, apresenta uma das menores taxas, devido à sua hidrofobicidade. As blendas apresentam taxas intermediárias de permeabilidade. Outro ponto é que a reticulação com cálcio reduz a taxa em relação às membranas não reticuladas, devido ao seu efeito de reforço, aumentando a propriedade de barreira, dificultando a passagem do vapor. Os valores de permeabilidade ao vapor de água, padronizados pela área (m²) e diferença da umidade relativa (entre o interior do frasco com umidade 0% e o ambiente do dessecador com umidade 75%) estão apresentados na Tabela 4. 74 Tabela 4 – Permeabilidade ao vapor de água pela técnica de dessecante. Amostras Permeabilidade ao vapor de água (g.mm/h.cm².mmHg) (g/dia.m²) L 2,80E-08 ± 1,92E-09a 45,78 ± 5,05 1 2,40E-08 ± 7,01E-10a 40,01 ± 1,52 1C 2,19E-08 ± 5,21E-10a 39,30 ± 1,91 2 3,04E-08 ± 3,63E-09a 48,63 ± 5,80 2C 3,20E-08 ± 4,99E-09a 52,16 ± 8,15 3 3,44E-08 ± 4,29E-10a 60,84 ± 1,78 3C 3,23E-08 ± 3,58E-09a 51,47 ± 7,25 4 3,53E-08 ± 3,05E-09a 76,69 ± 15,28 4C 3,76E-08 ± 1,83E-09a 64,60 ± 2,87 A 1,35E-07 ± 2,08E-08b 905,14 ± 12,04 *Médias seguidas de pelo menos uma letra igual indica diferenças não significativas (p > 0,05). Fonte: Autori