i Maria Eduarda Camilo Fernandes Degradação Química e Fotoquímica do Organofosforado Paraoxona São José do Rio Preto 2014 C âm pus  d e  S ã o  J o s é  d o  R io  P re to ii Maria Eduarda Camilo Fernandes Degradação Química e Fotoquímica do Organofosforado Paraoxona Dissertação apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Química, junto ao Programa de Pós-Graduação em Química, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto. Orientador: Prof. Dr. Marcelo de Freitas Lima Co-orientadora: Profa. Dra. Lidia Maria de Almeida Plicas São José do Rio Preto 2014 iii Fernandes, Maria Eduarda Camilo Degradação Química e Fotoquímica do organofosforado paraoxona / Maria Eduarda Camilo Fernandes. -- São José do Rio Preto, 2014 56 f. : il., tabs. Orientador: Marcelo de Freitas Lima Coorientador: Lídia Maria de Almeida Plicas Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”,Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas 1. Química ambiental 2. Toxicologia ambiental 3. Pesticidas 4. Compostos organofosforados I. Lima, Marcelo de Freitas. II. Plicas, Lídia Maria de Almeida. III. Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas. IV. Titulo. CDU -54:577.4 Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca do IBILCE UNESP – Câmpus de São José do Rio Preto iv Maria Eduarda Camilo Fernandes Degradação Química e Fotoquímica do Organofosforado Paraoxona Dissertação apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Química, junto ao Programa de Pós-Graduação em Química, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto. Comissão Examinadora Prof.Dr. Marcelo de Freitas Lima UNESP – São José do Rio Preto Orientador Prof. Dr. Josefredo Rodriguez Pliego Junior UFSJ – São João Del-Rei Prof. Dr. Luis Octávio Regasini UNESP – São José do Rio Preto São José do Rio Preto v 07 de novembro de 2014 RESUMO Esse trabalho teve como objetivo o estudo da degradação de um organofosforado modelo, o 4-nitrofenil fosfato de dietila (paraoxona), por meio de reações fotoquímicas e químicas. O armazenamento ilegal, sua alta toxicidade e os métodos de degradação utilizados na eliminação de pesticidas levaram à necessidade de encontrar métodos de degradação alternativos para os mesmos. Com isso, no estudo fotoquímico as reações fotossensitizadas tipo II foram empregadas e a espécie reativa, oxigênio singlete, foi produzida a fim de degradar a paraoxona. Em paralelo aos experimentos, o estudo químico-computacional foi realizado a fim de fornecer subsídios para uma possível explicação sobre a reatividade das espécies analisadas. Por meio dos resultados dos cálculos realizados foi possível analisar os orbitais de fronteira, os quais forneceram informações preciosas sobre a inércia da paraoxona frente ao oxigênio singlete, sugerindo que efeitos indutivos e de ressonância no anel têm papel importante no mecanismo de reação. Já nos estudos químicos utilizou-se a hidroxilamina, um nucleófilo alfa, como meio de degradação. O método mostrou-se eficiente e com alta dependência do pH do meio reacional, onde os melhores resultados para a reatividade do nucleófilos foram encontrados na faixa de pH 6,27 a 11,49. Os estudos com diferentes concentrações de nucleófilo indicam que não há participação direta da água na etapa lenta do mecanismo de reação. A termodinâmica do processo reacional aponta com muita clareza para um mecanismo associativo, provavelmente do tipo SN2(P). Parâmetros de correlação entre pKa dos nucleófilos e velocidade mostram que a paraoxona é insensível à basicidade do nucleófilo, como atestado pelo valor de Brownsted igual a 0,02 para nucleófilos comuns. Contudo fica evidente o efeito alfa apresentado pela hidroxilamina e a metil hidroxilamina. Na presença de hidroxilamina a velocidade de degradação aumenta cerca de 840 vezes comparando-se com a sua hidrólise espontânea. Palavras-chave: Pesticidas. Paraoxona. Reações fotossensitizadas. Nucleófilos alfa. vi ABSTRACT This work aimed to study the degradation of an organophosphorus model, the 4- nitrophenyl diethyl phosphate (paraoxon) through photochemical and chemical reactions. The illegal storing, their high toxicity and degradation methods used in the elimination of pesticides have led to the need to find alternative methods for the degradation thereof. Thus, the study photochemical reactions photosensitized type II were employed and the reactive species, singlet oxygen was produced to degrade paraoxon. In parallel to the experiments, the chemical and computational study was conducted to provide information for a possible explanation of the reactivity of the species analyzed. Through the results of calculations performed was possible to analyze the orbital border, which provided valuable information on the inertia of paraoxon against singlet oxygen, suggesting that inductive and resonance effects in the ring have an important role in the reaction mechanism. Already in chemical studies we used hydroxylamine, a nucleophile alpha like through degradation. The method was efficient and high pH dependence of the reaction medium, where the best results for the reactivity of nucleophiles were found in the pH range from 6.27 to 11.49. Studies with different concentrations of nucleophile does not indicate the direct participation of water in the slow step of the reaction mechanism. The thermodynamics of the reaction process very clearly points to an associative mechanism, probably the type SN2 (P). Correlation parameters between pKa of nucleophiles and speed show that paraoxon is insensitive to basicity of the nucleophile, as attested by Brownsted value equal to 0.02 for common nucleophiles. However it is evident the alpha effect presented by hydroxylamine and hydroxylamine methyl. In the presence of hydroxylamine degradation rates increased about 840 times comparing with its spontaneous hydrolysis. Keywords: Pesticides. Paraoxon. Reactions photosensitized type II. Nucleophilic alpha vii Dedico esse trabalho aos amores da minha vida, Terezinha, Adilson, Maria Emilia e George. viii Agradecimentos Agradeço primeiramente a Deus, a quem devo meu existir e a essência do meu viver. Agradeço-o por ter me dado força e jamais ter me deixado desistir. A minha família por ter acreditado e investido em mim, por compreender a minha ausência e me incentivar sempre. Ao professor orientador e acima de tudo amigo, Dr. Marcelo de Freitas Lima, por toda paciência, orientações, dedicação, dicas e conhecimentos transmitidos. A professora Dr. Lídia Plicas pela co-orientação e amizade construída. Ao meu namorado George que tanto me auxiliou e me acalmou principalmente nos momentos mais difíceis. Aos alunos de iniciação científica do Laboratório de Química Bio-Orgânica Ambiental, Priscila Urbano, Carlos Polaquini, Rodolfo Rincão e Ana Laura Sian pelo grande auxilio nas atividades experimentais e pela amizade adquirida. Ao Laboratório de Bioquímica e Microbiologia Aplicada e ao Laboratório de Sucroquímica e Química Analítica pela atenção, disponibilidade e infraestrutura, em especial ao Diego, Pedro e Olavo. A FAPEMAT pelos reagentes e vidrarias especiais (Processo nº 453501-2009). Aos amigos conquistados durante a pós-graduação (que são muitos e que permanecerão em minha vida, com certeza) e que foram de fundamental importância nos meus dias. Agradeço em especial ao Junior Quilles e a Janaina Pires por me acolherem com entusiasmo, me auxiliarem sempre que necessário e me fazerem rir tantas e tantas vezes nos momentos mais oportunos. As amigas com quem convivi e muito aprendi durante esse período e a quem tenho um carinho imenso, Bruna, Fabíola e Brenda. Ao pessoal do Grupo de Oração da UNESP (GOU) que não me deixaram desanimar e desistir. As queridíssimas Mariana, Mirelle, Laís e Hortênsia que além de se tornarem amigas me auxiliaram tirando dúvidas e disponibilizando materiais para estudo. Aos professores e Funcionários do Departamento de Química e Ciências Ambientais. ix Lista de Figuras Figura 1. Estrutura fundamental de pesticidas organofosforados. .................................... 5   Figura 2. Reação de hidrólise da acetilcolina. .................................................................. 7   Figura 3. Dessulfurização oxidativa mediada pela enzima citocromo P450 para conversão de parationa em paraoxona em mamíferos. ..................................................... 7   Figura 4. Fórmula estrutural do 4-nitrofenilfosfato de dietila. Destaca-se nesse éster fosfórico o grupo lateral que é num grupo nitrofenila. ..................................................... 8   Figura 5. Esquema de representativo da ativação do sensitizador e do oxigênio singlete. Onde 1S0: sensitizador no estado singlete fundamental; 1S1*: sensitizador no estado singlete excitado; ISC: Intersecção entre Sistemas; 3S1*: sensitizador no estado triplete excitado; 3O2 : oxigênio no estado triplete; 1O2: oxigênio no estado singlete. ............... 10   Figura 6. Estrutura de um nucleófilo alfa. ...................................................................... 12   Figura 7. Espécies da hidroxilamina em função do pH. ................................................. 12   Figura 8. Sistema fotorreacional utilizado para realização da reação fotossensitizada tipo II. A lâmpada com potência de 150 Watts a uma distância (d) de 15 cm do reator acoplado a um banho termostatizado para a manutenção da temperatura. ..................... 15   Figura 9. Estrutura do corante azul de metileno, utilizado como sensitizador no sistema. ........................................................................................................................................ 15   Figura 10. Espectro de varredura UV Vis para a reação fotossensitizada tipo II da tirosina (1,30 × 10-4mol L-1) na presença de azul de metileno (5,50 × 10-5 mol L-1 ) e solução tampão ( 1,00 × 10-2 mol L-1); espectro no tempo zero da reação em vermelho e x após 24 horas em preto. Solução da tirosina em azul claro e solução de azul de metileno em verde, para fins de comparação. ............................................................................... 19   Figura 11. Reação fotossensitizada tipo II para degradação da tirosina 1,3 × 10-4mol L-1 em 24 horas. a) azul de metileno 1,0 ×10-6 mol L-1; b) azul de metileno 1,0 × 10-5 mol L- 1; c) azul de metileno 5,5 × 10-5 mol L-1. ........................................................................ 21   Figura 12. Espectro de varredura UV-Vis para a reação de degradação fotossensitizada tipo II da paraoxona 1,30 × 10-4 mol L-1 na presença de azul de metileno 1,00 × 10-6 mol L-1 e solução tampão fosfato 1,00 × 10-2 mol L-1, em pH 7; espectro em tempo zero em vermelho e após 24 horas em preto. Solução padrão da paraoxona em verde. .............. 22   Figura 13. Espectro de varredura UV-Vis para a reação fotossensitizada tipo II da paraoxona (1,30 × 10-4 mol L-1) na presença de azul de metileno (5,50 × 10-5 mol L-1) e solução tampão ( 1,00 × 10-2 mol L-1), em pH 7,0; espectro em tempo zero em azul e após 24 horas em verde. ................................................................................................. 23   Figura 14. Cromatograma obtido por CLAE para a reação fotossensitizada em tempo zero e após 24 horas na presença de azul de metileno 1,00 × 10-6 mol L-1, em pH 7,0 (tampão fosfato). Tempo zero em vermelho, tempo 24 horas em verde e padrão de paraoxona (1,30 × 10-4 mol L-1) em preto. Fase móvel metanol água 8,5:1,5, e coluna C18 com 15 minutos de monitoramento em modo isocrático. ....................................... 23   Figura 15. Estrutura molecular do 4-nitrofenil fosfato de dietila (paraoxona) otimizada em nível RHF/6-31+G** e efeitos implícitos de solvatação incluídos pelo método C- PCM aplicado em modo iterativo. .................................................................................. 26   xi Figura 16. Estrutura molecular do ácido 2-amino-3-(4-hidroxifenil) propanóico (tirosina) otimizada em nível RHF/6-31+G** e efeitos implícitos de solvatação incluídos pelo método C-PCM aplicado em modo iterativo. ......................................... 27   Figura 17. Estrutura molecular do ácido 2-amino-3-(4-nitrofenil)-propanóico otimizada em nível RHF/6-31+G** e efeitos implícitos de solvatação incluídos pelo método C- PCM aplicado em modo iterativo. .................................................................................. 28   Figura 18. Estrutura molecular do 4-hidroxifenil fosfato de dietila otimizada em nível RHF/6-31+G** e efeitos implícitos de solvatação incluídos pelo método C-PCM aplicado em modo iterativo. ........................................................................................... 29   Figura 19. Gráfico kobs versus pH para a degradação da paraoxona pela hidroxilamina a 27 °C. Solução tampão específica para cada pH na concentração de 0,01 mol L-1. ....... 30   Figura 20. Gráfico kobs versus concentração de hidroxilamina a 27 °C e pH 8,70. ........ 33   Figura 21. Gráfico kobs versus pKa a 27 °C e pH 8,50. ................................................... 34   xii Lista de Tabelas Tabela 1. Soluções tampões utilizados para controle do pH no estudo da influência do pH na degradação química da paraoxona. ................................................................................ 17   Tabela 2. Parâmetros de ativação para a reação da paraoxona com diferentes nucleófilos. ............................................................................................................................... 35   xiii Sumário 1.   INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA ............................................................................................................ 1   2.   REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ....................................................................................................................... 3   2.1   AGROQUÍMICOS ............................................................................................................................ 3   2.1.1   Agroquímicos no Brasil ...................................................................................................................... 4   2.1.2   Organofosforados: principais mecanismos ........................................................................................ 4   2.2   DEGRADAÇÃO DE PESTICIDAS ORGANOFOSFORADOS ................................................................... 8   2.2.1   Métodos fotoquímicos ......................................................................................................................... 8   2.2.2   Métodos nucleofílicos ........................................................................................................................ 11   3.   OBJETIVOS .................................................................................................................................................. 13   3.1   OBJETIVO GERAL ........................................................................................................................ 13   3.2   OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................................................. 14   3.2.1   Reação fotossensitizada tipo II ......................................................................................................... 14   3.2.2   Reação com nucleófilos alfa ............................................................................................................. 14   4.   MATERIAIS E MÉTODOS ......................................................................................................................... 14   4.1   OTIMIZAÇÃO DE PARÂMETROS FOTOQUÍMICOS .......................................................................... 14   4.2   CÁLCULOS COMPUTACIONAIS DAS REAÇÕES FOTOQUÍMICAS ..................................................... 16   4.3   ESTUDOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS DAS REAÇÕES QUÍMICAS .................................................... 16   4.4   ESTUDO DA INFLUÊNCIA DO PH NA DEGRADAÇÃO QUÍMICA DA PARAOXONA ............................ 17   4.5   ESTUDO DA TEMPERATURA ........................................................................................................ 17   4.6   AVALIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE HIDROXILAMINA ............................................................... 17   4.7   ESTUDO COM OUTROS NUCLEÓFILOS .......................................................................................... 18   5.   RESULTADOS E DISCUSSÕES ................................................................................................................ 18   5.1   REAÇÃO FOTOSSENSITIZADA TIPO II .......................................................................................... 18   5.1.1   Estudo dos parâmetros fotoquímicos ................................................................................................ 18   5.1.2   Reação de degradação da paraoxona ............................................................................................... 22   xiv 5.1.3   Estudos computacionais .................................................................................................................... 24   5.2   DEGRADAÇÃO QUÍMICA DA PARAOXONA VIA NUCLEÓFILOS ALFAS ........................................... 29   5.2.1   Estudo da influência da acidez do meio: o perfil de pH ................................................................... 30   5.2.2   Estudo da influência da concentração de hidroxilamina: ................................................................ 32   5.2.3   Estudo da degradação frente a diferentes nucleófilos ...................................................................... 34   5.2.4   Parâmetros cinéticos de ativação: entalpia, entropia e energia livre .............................................. 35   6.   CONCLUSÃO ................................................................................................................................................ 37   7.   REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................................................ 38   ANEXO .................................................................................................................................................................... 42   1 1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA Pesticidas compõem uma classe de substâncias que são essenciais para o mundo contemporâneo, uma vez que tornam possível o manejo e a eliminação das pragas agropecuárias. Com o crescimento da população e um consequente aumento na demanda por alimentos o uso de insumos agrícolas torna-se cada vez mais indispensável para os seres humanos (REGINATO & BONFLEUR, 2011). A dependência, aliada à falta de educação ambiental têm levado ao uso equivocado dos defensivos agrícolas, tornando-os uma ameaça à saúde humana, já que a maioria desses agrotóxicos, quando usados em excesso ou descartados incorretamente, tornam-se potenciais armas químicas, podendo causar desde leve mal estar, até a morte quando em contato direto com os seres vivos, além de produzir impacto destrutivo no meio ambiente contaminando a atmosfera, solos e recursos hídricos (CARVALHO, 2006). Muitos casos de intoxicação pelo uso inadequado ou por ingestão de alimentos contaminados com agrotóxicos vem sendo registrados e noticiados pela mídia do mundo todo, além de vários problemas ambientais causados por essas substâncias. Um exemplo foi à matéria publicada pela revista Veja em dezembro de 2013 sobre mais de mil casos de intoxicação alimentar, ocorrido no Japão, devido ao consumo de produtos contaminados com um pesticida da classe dos organofosforados, a malationa. Segundo pesquisas realizadas pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) em 2011, um terço dos alimentos ingeridos diariamente pelos brasileiros está contaminado por algum tipo de agrotóxico. No Brasil, além de todos os problemas relacionados à saúde publica e meio ambiente, existe também a questão do uso de pesticidas ilegais, já que são utilizados mais de um milhão de toneladas de agrotóxicos por ano dentro do país (ANVISA). Com isso as apreensões feitas pela Polícia Federal crescem a cada dia. Em maio de 2014, por exemplo, foi apreendida em Colorado, Paraná, uma carreta com agrotóxicos de várias classes que estavam escondidos em uma carga de farelo. Em abril de 2014 a imprensa do Paraguai divulgou a apreensão de duas toneladas de pesticidas proibidos que teriam como destino o Brasil, segundo o Serviço Nacional de Qualidade e Saúde Vegetal e de Sementes (SENAVE). Baseando-se no consumo, na ilegalidade, nos danos que podem ser causados e com vistas à sustentabilidade na produção e uso dos agrotóxicos, percebe-se que a economia brasileira deve ser contrabalanceada com o desenvolvimento de métodos de controle visando 2 a sua degradação. O processo mais utilizado hoje na degradação de agrotóxicos é a incineração, que apesar de julgada como eficiente, pode emitir gases poluentes e de alto poder cancerígeno, como as dioxinas (TANGRI, 2003). Diante dessa situação, esse trabalho estuda processos de baixo impacto ambiental para a degradação de pesticidas, em especial os organofosforados, por meio de reações químicas e fotoquímicas, buscando-se dessa forma encontrar um método de degradação mais eficiente e mais viável que a incineração. Os pesticidas organofosforados são uma classe de agrotóxicos amplamente utilizados nos dias atuais, principalmente por serem menos bioacumulativos em organismos vivos do que os organoclorados. Seu uso na agricultura está concentrado em aplicações herbicidas e inseticidas, como exemplo o glifosato e a parationa respectivamente, sendo o primeiro o pesticida mais consumido mundialmente. Apesar da menor bioacumulação, possuem elevada toxicidade e geram muitas vítimas de intoxicação no mundo todo, devido a sua inalação, ingestão ou absorção pela pele (FERRI et. al., 2014). O pesticida organofosforado modelo utilizado nesse trabalho foi a paraoxona, um triéster fosfórico obtido a partir da dessulfurização oxidativa da parationa. É um agrotóxico de elevada toxicidade já que inibe a ação da enzima acetilcolinesterase nos organismos vivos, podendo levar a morte. Devido a essa toxicidade teve seu uso restringido em vários países (TANG, et al., 2014). A degradação química da paraoxona foi realizada por meio de reações com a hidroxilamina, um nucleófilo que possui o efeito alfa. Nesses estudos foram avaliados a eficiência do nucleófilo, a influência do pH do meio reacional e os parâmetros de ativação obtidos na reação. Já o estudo da degradação fotoquímica dessas substâncias foi feito por meio de reação fotossensitizada, especificamente do tipo II. Essa reação consiste na produção do oxigênio singlete como espécie reativa por meio de um sensitizador (FOOTE, 1987). 3 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1 Agroquímicos O aparecimento de formas de vidas indesejáveis na produção agrícola, nas pastagens e em ambientes urbanos e industriais, como ervas daninhas, fungos, bactérias, insetos, nematoides e ácaros causaram à humanidade prejuízos inacreditáveis, tornando necessária à utilização de agrotóxicos diversos (RIBAS & MATSUMURA, 2009). Os agrotóxicos têm como objetivo o controle dessas pragas e doenças na produção agropecuária. O termo pesticida pode ser empregado, nesse caso, para designar qualquer produto manufaturado utilizado neste setor e podem ser classificados em inseticidas, fungicidas, herbicidas, fumigantes, raticidas, nematicidas e acaricidas. Essas substâncias são de grande importância no setor agrário, já que garantem altos níveis de produtividade (RIBAS & MATSUMURA, 2009; SCORZA, 2006). O aumento populacional e o consequente crescimento na demanda de alimentos elevou a quantidade de agroquímicos utilizados na agropecuária, ultrapassando o número de 2.000 formulações, como organoclorados, organofosforados, carbamatos, piretróides e triazinas, dentre outros, diminuindo assim as perdas decorridas de pragas (LARA & BATISTA, 1992; REGITANO & BONFLEUR, 2011). Porém, o aumento na utilização desses produtos químicos tem causado, nas últimas décadas, vários problemas ambientais e de saúde pública, pois seus resíduos podem acumular- se em solos e alimentos, contaminando assim seres humanos e animais. Os efluentes gerados pelas indústrias de agrotóxicos também contribuem para contaminação ambiental (CARVALHO, 2006). Segundo o Protocolo de Atenção à Saúde dos Trabalhadores expostos a agrotóxicos, 2008, esses produtos podem causar diversos efeitos sobre a saúde humana, como intoxicação aguda e crônica. Dentre as intoxicações crônicas destacam-se problemas ligados à fertilidade, câncer e interações deletérias sobre o sistema nervoso, respiratório, cardiovascular, geniturinário, gastrointestinal, pele, olhos e alterações hematológicas. 4 2.1.1 Agroquímicos no Brasil As primeiras importações de pesticidas no Brasil ocorreram por volta de 1950 sendo empregados principalmente em culturas de alto valor comercial como café, milho, cana-de- açúcar e algodão (MORAGAS & SCHNEIDER, 2003). Com o crescimento da agricultura, a venda de agroquímicos cresceu 190%, na última década e, hoje, o Brasil é o maior consumidor de pesticidas do mundo, recebendo mais de um bilhão de litros de agrotóxicos por ano, segundo dados da Agência Nacional de Vigilância Sanitária em 2012 (ANVISA). Em 1970 o consumo de agrotóxicos no Brasil era de aproximadamente 27.728 toneladas, passando para 80.968 em 1980 e chegando a 158.737 em 2001 (ARAUJO, 2003). Com o avanço na produção agrícola o consumo de agrotóxicos tende a crescer ainda mais no ano de 2014. Com isso a introdução de pesticidas ilegais no país aumenta a cada dia. Esses produtos ilegais, quando apreendidos, são mantidos por um tempo em alfândegas para futuramente ser enviados à indústria para a incineração (SINDAG, 2013). Porém esse método de degradação de pesticidas não é muito sustentável no ponto de vista ambiental, pois a incineração libera gases tóxicos e poluentes ao meio ambiente e com isso se desperta o interesse em propor um método mais eficiente para a eliminação desses produtos, que não gerem substâncias nocivas ao ambiente. 2.1.2 Organofosforados: principais mecanismos Os organofosforados são ésteres fosfóricos que apresentam em sua estrutura um átomo central de fósforo pentavalente o qual está ligado por dupla ligação a um átomo de oxigênio ou a um átomo de enxofre (Figura 1). São classificados em três principais grupos, são eles: fosfatos, que possuem uma ligação P—O, fosfotionatos, em que o oxigênio é substituído pelo átomo de enxofre e a ligação P—S é formada, e os fosfonatos, frequentemente relacionados a agentes neurotóxicos e utilizados em armas de guerra, em que grupos arilas e alquilas estão diretamente ligados ao átomo de fósforo (FERRI, 2014). 5 Figura 1. Estrutura fundamental de pesticidas organofosforados. Os ésteres fosfóricos passaram a ser utilizados como uma alternativa aos organoclorados por serem substâncias eficazes no controle de pragas e menos bioacumulativas em tecidos. Apresentam três categorias de acordo com o número de grupos alquilas e arilas presentes. Podem ser monoésteres, diésteres ou triésteres, possuindo um, dois ou três substituintes respectivamente. A reatividade dessas substâncias geralmente segue a seguinte ordem: diésteres < monoésteres < triésteres (BAI et al., 2010; PRIEBE, 2009). As reações de hidrólise que ocorrem em ésteres fosfóricos são substituições nucleofílicas que seguem basicamente dois mecanismos. No primeiro, o átomo de carbono da ligação P—O—C do éster é atacado e todo o grupo fosfato é substituído pelo nucleófilo. No segundo, o nucleófilo ataca o átomo central de fósforo quebrando a ligação P—O, deslocando o álcool ou o alcóxido (Esquema 1) (PRIEBE, 2009; SILVA 2006; MANFREDI, 2009). Esquema 1 O primeiro mecanismo (i) ocorre, principalmente sob valores de pH abaixo de 1,5. Para valores mais altos, quando o grupo fosfato da substância possui pelo menos uma carga negativa, a reação ocorre pelo segundo mecanismo (ii) podendo, neste caso, seguir três caminhos distintos: o dissociativo, o associativo e o concertado. O mecanismo dissociativo é similar à substituição nucleofílica unimolecular (SN1) que ocorre no carbono tetraédrico e comum para monoésteres. Acontece em duas etapas, em que a primeira é a determinante da 6 velocidade de reação levando a formação de um íon metafosfato (PO3 -) e a segunda é o ataque do nucleófilo sobre o íon metafosfato (Esquema 2) (PRIEBE, 2009; LASSILA et al., 2011). Esquema 2 O mecanismo associativo é similar à substituição nucleofílica bimolecular (SN2) para o átomo de carbono e apresenta-se em duas etapas: adição e eliminação. Na adição o átomo de fósforo é atacado e um intermediário, pentacoordenado, é formado (Esquema 3). Já o mecanismo concertado ocorre sem a formação de um intermediário, com adição e eliminação em uma única etapa. O mecanismo associativo é mais comum para diésteres e triésteres fosfóricos (SILVA 2006). Esquema 3 Muitos desses organofosforados possuem efeitos tóxicos aos seres vivos e mamíferos devido ao fato de inibirem a ação de diversas enzimas do organismo, principalmente a enzima que catalisa a hidrólise da acetilcolina em ácido acético e colina, a acetilcolinesterase, provocando um colapso no sistema nervoso central (COUTINHO, 2005; CREMLYN, 1991). Essa inibição ocorre diante da facilidade que alguns organofosforados possuem em se ligar ao sítio ativo de enzimas, formando uma ligação estável e originando um novo éster fosfórico (OGA, 2008). A ligação pode ser explicada pela estrutura do pesticida ser similar estéreo e eletronicamente ao substrato acetilcolina (STENERSEN, 2004). Os efeitos causados por esses compostos em seres vivos são caracterizados principalmente por lacrimejamento, salivação, sudorese, tremores, diarréias e distúrbios cardiorrespiratórios (ECOBICHON & JOY, 1991). 7 Figura 2. Reação de hidrólise da acetilcolina. A parationa é um exemplo de inseticida organofosforado responsável por grande parte dos envenenamentos que ocorrem no mundo. Foi descoberto em 1944 por Schrader e em 1991 se tornou um pesticida de uso restrito. É uma substância lipossolúvel que normalmente é biotransformada em seu derivado oxigenado, um metabólito ativo conhecido como paraoxona (4-nitrofenilfosfato de dietila). A toxicidade da paraoxona (DL50 1,80mg kg-1 (oral - rato)) (SIGMA-ALDRICH®, 2013) é maior e mais efetiva que a da substância original (DL50 6,01 mg kg-1 (oral - rato)) (SIGMA-ALDRICH®, 2013). A reação de transformação pode ser realizada por meio biótico ou abiótico e é chamada de dessulfurização oxidativa, podendo acontecer em diversas partes do meio ambiente e no fígado de mamíferos na presença da enzima citocromo P450 (Figura 3) (DERELANCO & HOLLINGER, 2001; SILVA, 2010; GALICHET et al., 2004). Figura 3. Dessulfurização oxidativa mediada pela enzima citocromo P450 para conversão de parationa em paraoxona em mamíferos. Neste trabalho um possível método para a degradação da paraoxona foi proposto, já que por ser uma substâncias altamente tóxica é de extrema importância o conhecimento e o desenvolvimento de técnicas úteis para sua correta destinação. Devido à sua estrutura ser simples e representativa ao mesmo tempo, os estudos referentes à paraoxona poderá no futuro ser estendidos a outros triésteres de fosfato, além de que há um acervo considerável de dados na literatura para fins de comparação e validação da eficiência do método de degradação. O 4-nitrofenilfosfato de dietila, ou simplesmente paraoxona, é um triéster fosfórico (Figura 4), utilizados principalmente como pesticidas e armas de guerra. É caracterizada por 8 ser uma substâncias de alta toxicidade, e inibidora da acetilcolinesterase (TANG, et al., 2014; YANG et al., 1992). Figura 4. Fórmula estrutural do 4-nitrofenilfosfato de dietila. Destaca-se nesse éster fosfórico o grupo lateral que é num grupo nitrofenila. Estudos mostrados no trabalho publicado por Medeiros, et al., 2012, revelam que a reatividade de mono, di e triésteres são bem diferentes. No caso dos triésteres o grupo abandonador auxilia na reatividade desse composto. Esse auxílio é bem menor para diésteres e pouco expressivo para monoésteres. Com isso, as reações que ocorrem nos monoésteres são bem mais lentas quando comparadas a diésteres e triésteres de fosfato. A paraoxona por ser um triéster de fosfato é um bom modelo para estudo de degradação. 2.2 Degradação de pesticidas organofosforados Como já retratado anteriormente, existe uma preocupação com a utilização excessiva de pesticidas organofosforados e sua toxicidade, com a sua introdução ilegal no país e o método utilizado para eliminar esses estoques. Baseando-se em todos esses fatores e no fato do estudo mecanístico dessas substâncias estarem em constante desenvolvimento, buscam-se métodos mais eficientes para a sua degradação. Os métodos mais estudados e retratados na literatura são os fotoquímicos e os nucleofílicos. 2.2.1 Métodos fotoquímicos Muitos autores utilizaram a fotoquímica como uma alternativa na degradação de pesticidas. Uma possibilidade já investigada por alguns autores, como, Stulp et al. (2008), Teixeira & Canela (2007), Benítez et al. (1995), Ying & Williams (1999), Mansour et 9 al.(1993), Schwack et al. (1995), dentre outros, comprovam a eficiência na destruição desses agrotóxicos via reações fotoquímicas. Na literatura o processo de fotocatálise também é usado para degradar os pesticidas organofosforados. Bavcon Kralj et al., 2007, utilizaram lâmpada de xenônio para a fotocatálise dos organofosforados malaoxona, malationa, clorpirifós e azinfós em solução aquosa. A técnica de cromatografia gasosa acoplada a um espectrofotômetro de massas foi empregada para a análise da degradação das substâncias. Em todos os casos a cinética encontrada foi de primeira ordem e muitos ésteres fosfóricos foram obtidos como produtos das reações. Stullp et al., 2008, realizaram um estudo referente ao comportamento eletroquímico do organofosforado malationa em meio aquoso por meio da técnica de voltametria cíclica e potenciostática. Na sequência eles degradaram o pesticida via reação fotoquímica com o auxílio de uma lâmpada de mercúrio. Devido ao sucesso do estudo realizado, o autor sugere a técnica para o tratamento de corpos d’água contaminados com os pesticidas organofosforados e como tratamento de efluentes em empresas produtoras de pesticidas. Santos & Rezende, 2002, estudaram o comportamento do inseticida parationa sob radiações de 280 e 313 nm e na presença de ácidos húmicos. Verificou-se que a degradação do pesticida ocorreu somente por meio da reação fotoquímica e não por meio de hidrólise ou degradação biológica, ou seja, a adição de ácidos húmicos não aumentou a velocidade de fotodegradação da substância. Uma comparação entre os comprimentos de onda utilizados indicaram que a velocidade é maior quando a reação ocorre na presença de radiação de 280 nm. Em 2011, Oliveira fez a remoção de agrotóxicos organofosforado clorpirifós usando processos oxidativos avançados. Durante o estudo, o autor analisou parâmetros como pH, temperatura, concentração do agrotóxico e efeito inibitório dos íons. Em seus resultados foram obtidos dados que propiciaram a melhor remoção do organofosforado. Araujo, 2006, abordou a degradação da parationa em ambientes aquáticos naturais, visando identificar processos relevantes na degradação desse pesticida. Dentre esses processos estão a hidrólise e a fotólise. Com os resultados, Araujo observou também que a parationa é convertida em paraoxona, um produto mais tóxico que o composto original. No presente trabalho o processo fotoquímico utilizado na degradação do organofosforado paraoxona foi à reação de fotossensitização tipo II. A fotossensitização é uma reação que se inicia quando um sensitizador, que pode vir a ser um corante, uma cetona e 10 outros tipos de substâncias, é utilizado. É importante observar que os sensitizadores geralmente não são consumidos durante a reação. Os mecanismos das reações de fotossensitização são classificados em Tipo I e Tipo II (FOOTE, 1987; OLEINIK,2013). Nos mecanismos Tipo I ocorre à excitação do sensitizador (S), que passa do estado singlete (1S) para o estado triplete (3S) reagindo, na sequência, diretamente com o substrato gerando radicais por meio da transferência de elétrons. No mecanismo Tipo II, o sensitizador em seu estado excitado (triplete) reage primeiramente com o oxigênio presente no meio reacional para formar oxigênio singlete (1O2) e esse reage com o substrato para formar os produtos. Como esses mecanismos são competitivos, alguns fatores podem influenciar na ocorrência e na velocidade da reação, como por exemplo, a concentração do oxigênio, o poder de reatividade do substrato, a concentração do substrato e o tempo de vida do oxigênio singlete (FOOTE, 1987; TURRO 1978). Figura 5. Esquema de representativo da ativação do sensitizador e do oxigênio singlete. Onde 1S0: sensitizador no estado singlete fundamental; 1S1*: sensitizador no estado singlete excitado; ISC: Intersecção entre Sistemas; 3S1*: sensitizador no estado triplete excitado; 3O2 : oxigênio no estado triplete; 1O2: oxigênio no estado singlete. 1 S0 1 S1* 3 S1*hv ISC 3 S1* 3 O2+ 1 S0 + 1 O2 As reações fotossensitizadas tipo II são mais vantajosas que as reações tipo I principalmente pelo fato de serem mais seletivas, pois as reações tipo I podem produzir radicais livres que irão reagir diretamente com o oxigênio, geralmente vindo do sensitizador, formando íons peróxidos, que são altamente reativos e podem atacar toda a molécula (FOOTE, 1987). Segundo Rossein et al., 2006, o oxigênio singlete pode interagir com outras moléculas de duas maneiras, por reações químicas ou transferência de energia, sendo que, o segundo processo é conhecido como supressão física. Algumas reações químicas que podem ser destacadas são: adição a dienos conjugados, geralmente resultando na formação de endoperóxidos; adição 1,3 a uma dupla ligação, formando “ene” hidroperóxidos e, com alcenos substituídos por grupos contendo átomos de nitrogênio ou enxofre, formando 1,2- dioxetanos. 11 Neste trabalho, o corante azul de metileno foi utilizado como sensitizador, já que possui sua eficiência comprovada na produção de 1O2 (HALLLIWELL & GUTTERIDGE, 1999). 2.2.2 Métodos nucleofílicos São muitos os estudos referentes aos métodos nucleofílicos para degradar os triésteres fosfóricos utilizados como pesticidas, principalmente no que diz respeito ao mecanismo envolvido no ataque nucleofílico. Tondo, 2006, estudou as reações de substituição nucleofílica para triéster fosfórico 8-(dimetilamino)-1-naftilfosfato de dietila. Como nucleófilos o grupo utilizou a hidroxilamina e seus derivados, N-metilhidroxilamina e N,N-dimetilhidroxilamina. As reações realizadas foram controladas cineticamente e diferentes condições de temperatura e acidez foram estabelecidas. O estudo mostrou a eficiência dos nucleófilos, que possuem o efeito alfa, na degradação da molécula do organofosforado. Entre os nucleófilos testados a N- metilhidroxilamina mostrou-se mais reativa apresentando um valor de constante 153 vezes mais alto do que outros oxiânions de mesmo pKa. Shin et al., 2013, estudaram a reação nucleofílica entre o íon peróxido de hidrogênio e os organofosforados paraoxona e parationa em diferentes concentrações de surfactante. A reação foi monitorada cineticamente com a temperatura constante. Os resultados mostraram que a adição do surfactante é positiva, até certa concentração, na degradação dos pesticidas, aumentando os valores da constante cinética, sendo que a parationa mostrou-se mais sensível a essa concentração. O íon peróxido apresentou um efeito alfa na reação com ambos os organofosforados. Simanenko et al., 2002, fizeram uma análise comparativa da nucleofilicidade de diferentes substâncias inorgânicas na degradação de acetatos, sulfatos, carbamatos, diésteres e triésteres de fosfato. Dentre os compostos analisados estavam cloratos, boratos, peróxido de hidrogênio e hidroxilamina. As reações foram realizadas em 25ºC. Dentre os nucleófilos testados a hidroxilamina em sua forma iônica foi a que apresentou a maior nucleofilicidade. Para o caso dos diésteres e triésteres fosfóricos o íon peróxido também apresentou uma reatividade elevada. Com base no que trás a literatura sobre as reações de substituição nucleofílica em triésteres fosfóricos e na reatividade de diversos nucleófilos, nosso grupo de pesquisa vem 12 utilizando frequentemente a hidroxilamina, uma substância que pertence à classe dos agentes redutores e é empregado como reagente em algumas sínteses orgânicas, como nucleófilo (ZHANG & ZHENG, 2012; CHEN et al., 2013). A hidroxilamina (NH2OH) é um nucleófilo que possui uma maior reatividade quando comparada a nucleófilos comuns de mesmo valor de pKa, por possuir o efeito alfa (SIMANENKO et al., 2002). Segundo pesquisadores este efeito é possível em nucleófilos que possuem em sua estrutura química pares de elétrons livres sobre o átomo ligado ao centro nucleofílico e com densidade negativa de carga. Não deve ter substituintes ligados ao centro nucleofílico e o seu estado de transição deve ser estabilizado por elétrons de átomos vizinhos (Figura 6) (SIMANENKO et al., 2002; EDWARDS et al., 1962;GERSTEIN et al., 1964). O estudo do grupo de Simanenko merece destaque, mas apesar de explorarem muito bem as possíveis causas do efeito alfa, eles não conseguem explicar o motivo da hidroxilamina se destacar dentre esses nucleófilos em termos de reatividade. Figura 6. Estrutura de um nucleófilo alfa. Já Kirby et al., 2010, propõe uma nova explicação para o excesso de reatividade da hidroxilamina. Em seu trabalho são discutidos os estados de protonação da hidroxilamina e as possíveis estruturas formadas em diferentes pHs (Figura 7). Figura 7. Espécies da hidroxilamina em função do pH. Com isso, sugere que o ataque nucleofílico da substância ocorre somente entre os valores de pH de 6 a 12 , pois nessa faixa a hidroxilamina apresenta-se em equilíbrio tautomérico das estruturas NH2OH e +NH3O- e encontra-se nas melhores condições para a sua estabilidade. A presença de óxido de amônio (+NH3O-) no equilíbrio é calculada e prediz- se ser de 25%, uma possível explicação para o excesso de reatividade observada para a 13 hidroxilamina frente a outros nucleófilos alfa. A forma +NH3O- apresenta um par de elétrons livres no átomo de oxigênio permitindo o ataque ao substrato e o grupo amônio facilita a aproximação do ânion em centros carregados eletronegativamente como os fosfatos, devido a sua alta densidade de carga positiva. Já em condições ácidas a hidroxilamina encontra-se em sua forma catiônica +NH3OH, o que diminui sua reatividade, pois o ataque é inibido pela baixa densidade de carga negativa. Em condições alcalinas a hidroxilamina apresenta-se em sua forma desprotonada aniônica NH2O-, que mesmo possuindo o efeito alfa acaba sofrendo repulsão pelos oxigênios diretamente ligados ao fósforo, ou seja, a reação não é tão eficiente já que as cargas negativas dificultam a aproximação do nucleófilo ao substrato. A literatura sugere também que o ataque da hidroxilamina no átomo de fósforo ocorre pelo átomo de oxigênio, diferentemente do que aconteceria se o ataque fosse ao átomo de carbono em ésteres. Nesse caso o melhor centro nucleofílico seria o nitrogênio da molécula de hidroxilamina, por ser uma base de Lewis mais polarizável (ou mole). Essa afirmação é confirmada quando se utiliza a O-metilhidroxilamina como nucleófilo ou identificam-se os intermediários obtidos na reação. Medeiros, 2009, por exemplo, aborda em seu trabalho o estudo mecanístico da reação entre hidroxilamina e o 2,4-dinitrofenilfosfato de dietila. Uma análise dos intermediários e produtos formados na reação indicou que o ataque nucleofílico da hidroxilamina ocorre via átomo de oxigênio. 3. OBJETIVOS 3.1 Objetivo geral Esse trabalho estuda a degradação da paraoxona, um organofosforado de alta toxicidade, por reação fotossensitizada tipo II e também por meio de reações químicas com nucleófilos que apresentem o efeito alfa dando especial atenção às reações com hidroxilamina. 14 3.2 Objetivos específicos 3.2.1 Reação fotossensitizada tipo II A princípio estudou-se a eficiência do sistema elaborado na produção de oxigênio singlete, avaliando-se principalmente a efetividade do sistema e desenvolveram-se cálculos computacionais para um estudo teórico da reação. 3.2.2 Reação com nucleófilos alfa Nas reações com nucleófilos alfa pretendeu-se confirmar o perfil cinético de degradação da paraoxona pela hidroxilamina dependente do valor de pH, analisou-se a influência da temperatura na reação, os parâmetros de ativação, comparou-se o valor da constante de velocidade obtida pela reação do organofosforado como nucleófilo alfa e outras espécies nucleofílicas e analisou-se a influência da água no mecanismo. 4. MATERIAIS E MÉTODOS 4.1 Otimização de parâmetros fotoquímicos Para a realização da reação fotossensitizada tipo II foi montado um sistema (Figura 8) constituído por um reator acoplado a um banho termostatizado e sob agitação constante. 15 Figura 8. Sistema fotorreacional utilizado para realização da reação fotossensitizada tipo II. A lâmpada com potência de 150 Watts a uma distância (d) de 15 cm do reator acoplado a um banho termostatizado para a manutenção da temperatura. A fonte luminosa, com filtro na região de 650 nm, com potência de 150 Watts foi colocada a uma distância de 15 cm do reator. A solução foi mantida em pH 7,0 sob efeito tampão, com auxílio dihidrogeno/hidrogenofosfato de potássio 0,01 mol L-1. O sensitizador utilizado foi o corante azul de metileno (Figura 9). Figura 9. Estrutura do corante azul de metileno, utilizado como sensitizador no sistema. A calibração do sistema reacional para a produção de oxigênio singlete foi testada mediante ensaios de foto-oxidação da tirosina, um dos 22 aminoácidos que são usados pelas células para a síntese de proteínas, e que segundo Ronsein et al., 2006, é sensível a espécie reativa do sistema. A justificativa para sua escolha foi a literatura disponível sobre seu mecanismo de foto-oxidação sob ação do oxigênio singlete, o que tem atraído um grande interesse devido aos estudos sobre a fotooxidação de proteínas em estudos sobre desenvolvimento de tumores e outras enfermidades, além de que o grupo lateral desse aminoácido lembra o grupo lateral da paraoxona, com anel aromático sob efeitos indutivos na posição para. A técnica de espectroscopia no UV-Vis foi utilizada para acompanhar as modificações estruturais ocorridas no início e final da reação (normalmente 24 horas de reação). O equipamento utilizado para essa e demais análises espectroscópicas foi um espectrofotômetro UV-Vis Perkin-Elmer, modelo Lambda 25 com duplo feixe em temperatura ambiente. Os testes foram repetidos alterando-se a concentração do sensitizador, a fim de se encontrar a melhor concentração, ao mesmo tempo maximizando a eficiência reacional e 16 minimizando a interferência causada devido ao alto coeficiente de extinção molar do azul de metileno. Um estudo final para constatar a formação ou não de novas espécies no meio reacional foi desenvolvido através de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) de acordo com o seguinte método: fase estacionária coluna C18, fase móvel metanol (85%) e água (15%) isocrático e duração de 15 minutos. 4.2 Cálculos computacionais das reações fotoquímicas Visando a busca de mais detalhes que pudessem auxiliar na interpretação dos resultados obtidos experimentalmente, o estudo dos orbitais moleculares das moléculas alvo, tirosina e paraoxona, e de seus derivados nitros e hidroxi, respectivamente, foi realizado utilizando-se o pacote computacional GAMESS (SCHMIDT et al., 1993). Para esta tarefa, primeiramente foram construídas as estruturas das moléculas utilizando-se o programa Ghemical (HASSINEN & PERAKYLA, 2001), que em seguida passaram por uma busca conformacional aleatória com 1000 passos, utilizando uma implementação do campo de força Tripos-5.2. A melhor estrutura foi exportada como arquivo de entrada para o pacote GAMESS, onde sua geometria foi otimizada em nível RHF/6-31+G**, sob adição de efeitos de solvatação (água) a cada iteração por meio do modelo do contínuo polarizável (PCM), mais especificamente em sua implementação C-PCM (COSSI et al., 2002). As estruturas otimizadas nesse nível de cálculo foram analisadas em termos de seus orbitais de fronteira HOMO. A análise dos orbitais foi facilitada pela utilização do programa MacMolPlt (BODE & GORDON, 1998). 4.3 Estudos espectrofotométricos das reações químicas Todas as cinéticas reacionais foram monitoradas por um período de 48 horas, no comprimento de onda de 400 nm, característico do p-nitrofenolato, um dos produtos da reação. Para isso utilizou-se um espectrofotômetro UV/Vis Perkin-Elmer Lambda 25 com duplo feixe e termoestabilizador para manutenção da temperatura de trabalho de 27 ºC. As concentrações da paraoxona etílica (Sigma) e da hidroxilamina (Vetec) utilizadas na reação foram fixadas respectivamente em 1,3 × 10-4 mol L-1 e 0,5 mol L-1. Em todos os 17 experimentos a força iônica foi mantida em excesso (1,0 mol L-1), sendo utilizado KCl (cloreto de potássio) para o ajuste. 4.4 Estudo da influência do pH na degradação química da paraoxona Para tal estudo soluções tampão igual a 1,0 ×10-2 mol L-1 foram utilizadas a fim de manter o pH da solução constante durante toda a reação. Na tabela 1 segue a fórmula ácido/base dos tampões utilizados nos respectivos pHs. As concentrações de hidroxilamina e de paraoxona foram às mesmas citadas anteriormente (seção 4.3). A temperatura foi mantida constante a 27 ºC. Tabela 1. Soluções tampões utilizados para controle do pH no estudo da influência do pH na degradação química da paraoxona. Ácido/base conjugada PH HCOOH/HCOO- 3,0 < pH < 4,5 H3CCOOH/H3CCOO- 4,5 < pH < 5,5 H2PO4 -/HPO4 2- 6,5 < pH < 8,0 H3BO3/H4BO4 - 8,0 < pH < 9,5 HCO3 -/CO3 2- 9,5 < pH < 11,0 4.5 Estudo da temperatura Para a determinação dos parâmetros de ativação termodinâmicos, as reações foram monitoradas em diferentes temperaturas, 33, 36, 39, e 42 °C, mantidas fixas durante todo o experimento. Os nucleófilos utilizados foram a hidroxilamina, o acetato e o formiato na concentração de 0,5 mol L-1. O valor do pH da solução sob análise foi mantido constante em 8,7 por efeito tampão ácido bórico/borato. 4.6 Avaliação da concentração de hidroxilamina Para o estudo do efeito da concentração de hidroxilamina, foram preparadas soluções nas seguintes concentrações de hidroxilamina: 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 e 0,5 mol L-1. As reações foram monitoradas em pH 8,70, e temperatura constante de 27,0 °C. 18 4.7 Estudo com outros nucleófilos Reações com outros nucleófilos como acetato, formiato, bifosfato, borato, N- metilhidroxilamina e tricloroacetato foram avaliadas, a fim de estudar a degradação da paraoxona por esses nucleófilos. Todas as reações foram conduzidas a temperatura de 27 °C e em valor de pH igual a 8,50. 5. RESULTADOS E DISCUSSÕES 5.1 Reação fotossensitizada tipo II 5.1.1 Estudo dos parâmetros fotoquímicos A eficiência do sistema fotorreacional foi avaliada por meio do estudo de uma reação fotossensitizada modelo, realizada com o aminoácido tirosina como substrato, o qual reage com o oxigênio singlete gerado in situ (Ronsein et al., 2006). Os espectros da tirosina pura, do azul de metileno na concentração estudada e o tempo inicial e final da reação são mostrados na figura 10. 19 Figura 10. Espectro de varredura UV Vis para a reação fotossensitizada tipo II da tirosina (1,30 × 10- 4mol L-1) na presença de azul de metileno (5,50 × 10-5 mol L-1 ) e solução tampão ( 1,00 × 10-2 mol L- 1); espectro no tempo zero da reação em vermelho e após 24 horas em preto. Solução da tirosina em azul claro e solução de azul de metileno em verde, para fins de comparação. A análise dos espectros mostrados na figura 10 demonstra a interferência das bandas características do azul de metileno sobre o espectro da tirosina, principalmente na região de 200 a 300 nm, fazendo da banda em 225 nm a única forma de monitoramento da tirosina na presença de azul de metileno na concentração de 5,5 x 10-5 mol L-1. Embora haja sobreposição por quase toda a faixa monitorada é possível analisar a modificação da banda em 225nm na reação, após 24 horas, indicando que a reação fotossensitizada afetou a estrutura do aminoácido. Essa foi uma evidência que atestou a eficiência do sistema reacional utilizado, principalmente quanto à potência da lâmpada, à sua distância em relação à parede do reator e à concentração de azul de metileno. Constata-se, ainda na figura 10, uma redução significativa da concentração de azul de metileno, quando se comparam os espectros das reações em tempo zero e vinte e quatro horas. Há duas evidências que podem ser apontadas: uma relacionada à adsorção de azul de metileno pelas paredes de vidro do reator, verificado visualmente após a reação, e outra relacionada à possível redução do azul de metileno (MB+) para sua forma leuco (LMB) (Esquema 4). 20 Esquema 4 Lee & Mills, 2003, registraram os espectros da solução de azul de metileno e de sua forma leuco, após submeter a solução sob radiação UV. Esses indicaram que as bandas do azul de metileno e da sua forma leuco (após os processos de radiação UV) estão especificamente em 256 nm, 294 nm e 665 nm. Diante dessas informações pode-se afirmar que o azul de metileno não interfere na análise dos espectros da tirosina, já que a banda monitorada é em 225 nm. Após esses ensaios, a variável sujeita ao estudo foi à concentração de azul de metileno, uma vez que em mais baixas concentrações, se ainda efetivo para produção de 1O2, poder-se- ia analisar com mais detalhes os espectros obtidos dos substratos de interesse. Com isso, um estudo referente à escolha da concentração do corante foi realizado para se determinar uma concentração em que o corante atue como sensitizador e não interfira nas análises espectrofotométricas (Figura 11). 21 Figura 11. Reação fotossensitizada tipo II para degradação da tirosina 1,3 × 10-4mol L-1 em 24 horas. a) azul de metileno 1,0 ×10-6 mol L-1; b) azul de metileno 1,0 × 10-5 mol L-1; c) azul de metileno 5,5 × 10-5 mol L-1. Os dados espectrofotométricos da figura 11 mostraram que as diferentes concentrações de azul de metileno utilizadas na reação não interferem em sua ação como fotossensitizador para estudos de 24 horas, visto que em todos os casos pode ser observada a modificação das bandas características da tirosina. Após a análise desses resultados pode-se concluir que o azul de metileno foi eficiente como sensitizador em todas as concentrações avaliadas, e apresentou menor interferência na concentração de 1,0 × 10-6 mol L-1, esta foi selecionada como concentração ótima. 200 300 400 500 600 700 800 0,0 0,5 1,0 A bs or vâ nc ia Comprimento de onda (nm) Reação inicial Reação final 24 horas a) 200 300 400 500 600 700 800 0,0 0,5 1,0 Ab so rv ân ci a Comprimento de onda (nm) Reação inicial Reação final 24 horas b) 200 300 400 500 600 700 800 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 A bs or vâ nc ia Comprimento de onda (nm) Reação inicial Reação final 24 horas c) 22 5.1.2 Reação de degradação da paraoxona Após a escolha dos parâmetros iniciais e comprovação da eficiência do sistema na produção de oxigênio singlete, a reação fotossensitizada foi realizada na presença da paraoxona (Figura 12). Figura 12. Espectro de varredura UV-Vis para a reação de degradação fotossensitizada tipo II da paraoxona 1,30 × 10-4 mol L-1 na presença de azul de metileno 1,00 × 10-6 mol L-1 e solução tampão fosfato 1,00 × 10-2 mol L-1, em pH 7; espectro em tempo zero em vermelho e após 24 horas em preto. Solução padrão da paraoxona em verde. Os espectros construídos apontam que as bandas características do organofosforado, em 212 nm e 276 nm, dentro do erro experimental esperado (principalmente quanto ao material volumétrico), não sofreram alteração, o que indicou a não degradação do composto. Estudos com maior concentração do fotossensitizador também foram realizados (Figura 13). 23 Figura 13. Espectro de varredura UV-Vis para a reação fotossensitizada tipo II da paraoxona (1,30 × 10-4 mol L-1) na presença de azul de metileno (5,50 × 10-5 mol L-1) e solução tampão ( 1,00 × 10-2 mol L-1), em pH 7,0; espectro em tempo zero em azul e após 24 horas em verde. De acordo com a figura 13, os espectros novamente, não apontam nenhum sinal de degradação da paraoxona, já que os espectros iniciais e finais não revelam alteração nos seus comprimentos de onda característicos em 212 nm e 276 nm. A fim de corroborar os indícios de que a reação não ocorreu, optou-se por utilizar a técnica de cromatografia líquida de alta eficiência (Figura 14). A intenção foi a de verificar se estava sendo formada alguma espécie nova ou algum reagente consumido. Foi então realizada a comparação dos cromatogramas em tempo zero e após 24 horas. Figura 14. Cromatograma obtido por CLAE para a reação fotossensitizada em tempo zero e após 24 horas na presença de azul de metileno 1,00 × 10-6 mol L-1, em pH 7,0 (tampão fosfato). Tempo zero em vermelho, tempo 24 horas em verde e padrão de paraoxona (1,30 × 10-4 mol L-1) em preto. Fase móvel metanol água 8,5:1,5, e coluna C18 com 15 minutos de monitoramento em modo isocrático. 24 Os dados cromatográficos comprovaram aqueles obtidos por espectrofotometria, já que os cromatogramas nas condições estabelecidas, não sofrem alterações relevantes, qualitativa ou quantitativamente. 5.1.3 Estudos computacionais A química computacional vem auxiliando em diversas frentes da pesquisa em química, em física e em biologia. No entanto, uma de suas principais vantagens é a de oferecer subsídios para a proposição de hipóteses, onde a limitação experimental é um problema. Assim, como todas as evidências experimentais indicam a inatividade do oxigênio singlete sobre a paraoxona, mas o contrário para a tirosina procurou-se encontrar, através de cálculos computacionais, possíveis explicações que pudessem justificar os fenômenos observados. Segundo Ronsein et al., 2006, o oxigênio singlete pode interagir com outros compostos através de rotas químicas ou supressão física. Dentre o mecanismo por rotas químicas pode-se destacar a adição a dienos conjugados e a adição 1,3 a uma dupla ligação, formando respectivamente endoperóxidos e ene hidroperóxidos. Em estruturas benzênicas substituídas a adição do oxigênio singlete se dá nas posições 1,4 do anel (Esquema 5). 25 Esquema 5 Ronsein et al., 2006, relata ainda que na reação do oxigênio singlete com resíduos do aminoácido tirosina, a substância 3α- hidroxi-6-oxo-2,3,3α,6,7,7α-hexaidro-1H-indol-2-ácido carbo- xilíco (HOHICA) é formada. Os autores acreditam que essa substância seja gerada a partir de um intermediário endoperóxido instável, por meio de uma cicloadição [4+2] do oxigênio singlete. Com base nesses fatos, cálculos de energias de orbitais moleculares foram realizados a fim de se localizar com precisão os orbitais HOMO (highest occupied molecular orbital) dos substratos estudados, a fim de procurar subsídios que explicassem a inércia das ligações π do anel frente aos orbitais disponíveis do oxigênio singlete. O primeiro cálculo realizado e analisado foi o da molécula de paraoxona. As análises não indicaram nenhum indício de reatividade no anel para as posições 1 e 4, já que o orbital HOMO não apresenta elétrons disponíveis nessas localidades, possuindo ali uma região denominada de nó, onde a probabilidade de haver elétrons é nula, o que não favorece o ataque da espécie reativa no sistema (Figura 15), nem pela posição 1, nem pela posição 4 do anel. A energia encontrada para o orbital HOMO foi de -0,372 Hartree. 26 Figura 15. Estrutura molecular do 4-nitrofenil fosfato de dietila (paraoxona) otimizada em nível RHF/6-31+G** e efeitos implícitos de solvatação incluídos pelo método C-PCM aplicado em modo iterativo. Já os cálculos para a molécula de tirosina mostraram um orbital HOMO de energia - 0,316 Hartree, indicando a possibilidade do ataque ao oxigênio singlete é pelo anel aromático nas posições 1 e 4, e conforme a reação indicada no esquema 5. A figura 16 mostra o HOMO, e nela é possível ver que as posições 1 e 4 do anel se destacam em termos de nucleofilicidade. 27 Figura 16. Estrutura molecular do ácido 2-amino-3-(4-hidroxifenil) propanóico (tirosina) otimizada em nível RHF/6-31+G** e efeitos implícitos de solvatação incluídos pelo método C-PCM aplicado em modo iterativo. A partir desse raciocínio, foram criadas virtualmente as estruturas dos derivados p- nitro e p-hidroxi, da tirosina e da paraoxona, respectivamente. A finalidade foi a de avaliar o efeito do substituinte sobre a distribuição dos orbitais HOMO pelas moléculas. A Figura 17 mostra a troca de um grupo doador de elétrons (OH na figura 16) por um grupo retirador (NO2) na posição para, gerando uma nova configuração de orbitais para o derivado nitro da tirosina. A energia do orbital HOMO encontrada para a molécula foi equivalente a -0,364 Hartree e que comparada com a da estrutura da figura 16 (-0,316 Hartree com grupo hidroxi), há um de ΔE de 30,121 kcal mol-1 (equação 1) mostrando claramente o efeito retirador de elétrons, pois diminui a energia do orbital HOMO, o que consequentemente inibiria sua reatividade. )NO()OH( 2HOMOHOMO EEE −=Δ Equação 1 Pode-se observar ainda na figura 17 a mesma região nodal apresentada pela estrutura da paraoxona, onde não há a presença de sítios nucleofílicos nas posições 1 e 4 do derivado nitro. Portanto, é possível supor, baseados unicamente nesses cálculos, que o derivado nitro da tirosina não deveria reagir com o oxigênio singlete. 28 Figura 17. Estrutura molecular do ácido 2-amino-3-(4-nitrofenil)-propanóico otimizada em nível RHF/6-31+G** e efeitos implícitos de solvatação incluídos pelo método C-PCM aplicado em modo iterativo. A substituição do grupo nitro, ligado ao anel, pelo grupo hidroxi (Figura 18) na estrutura da paraoxona indicou a existência de orbitais HOMO de energia -0,324 Hartree, capazes de reagir com o oxigênio singlete de acordo com o mecanismo proposto através de um ataque nucleofílico pelas posições 1 e/ou 4 do anel. Veja que a diferença de energia ΔE do derivado hidroxi para a estrutura original da paraoxona (-0,372 Hartree com o grupo nitro) é a mesma que para os derivados da tirosina, ou seja, 30,121 kcal mol-1, dessa vez tornando o orbital HOMO menos estável, ou seja, mais reativo. 29 Figura 18. Estrutura molecular do 4-hidroxifenil fosfato de dietila otimizada em nível RHF/6- 31+G** e efeitos implícitos de solvatação incluídos pelo método C-PCM aplicado em modo iterativo. A análise dos orbitais HOMO derivada dos cálculos computacionais realizados para as diferentes moléculas indicam que o oxigênio singlete interagiria preferencialmente com estruturas que tivessem grupos hidroxila na posição 4 do anel substituído, em detrimento aquelas que têm grupos retiradores de elétrons. As coordenadas cartesianas x, y e z das moléculas construídas estão descritas na sessão ANEXO no final deste trabalho. 5.2 Degradação química da paraoxona via nucleófilos alfas Uma das vantagens de se estudar a paraoxona é a quantidade de referências disponíveis, justificada em grande parte por ser uma estrutura muito acessível do ponto de vista experimental, em grande parte devido a um de seus produtos de degradação, o grupo p- nitrofenolato, detectável na região visível do espectro de radiação (404 nm, coeficiente de extinção de 18.000 mol-1L cm-1 em solução aquosa), (SANTOS et al., 2002; SHIN et al., 2013). 30 5.2.1 Estudo da influência da acidez do meio: o perfil de pH A Figura 19, mostra a avaliação do perfil cinético em função do pH, onde a curva obtida indicou a mais alta reatividade num patamar entre os valores de pH 7 e 11, com uma constante de velocidade (kobs de pseudo-primeira ordem) próxima de 8,0 × 10-5 s-1. É importante salientar que fora da região do patamar, as medidas tornam-se relativamente difíceis de serem obtidas com precisão, devido à baixa velocidade da reação. Figura 19. Gráfico kobs versus pH para a degradação da paraoxona pela hidroxilamina a 27 °C. Solução tampão específica para cada pH na concentração de 0,01 mol L-1. A equação que a ajusta os dados obtidos pode ser obtida através de uma aproximação do tipo bell-shaped (forma de sino), onde o valor máximo obtido para o kobs é dado no numerador e os valores do pKas das espécies envolvidas no equilíbrio dependente das condições de acidez são parâmetros importantes e utilizados como expoentes no denominador da equação 2. 𝑘𝑜𝑏𝑠 =   𝑘𝑜𝑏𝑠    (𝑚á𝑥) 1+  10(𝑝𝐾𝑎 1−𝑝𝐻)  +10(𝑝𝐻−𝑝𝐾𝑎 2)   Equação (2)   Na equação 2 o pKa 1 é o que remete ao valor da constante de equilíbrio entre as formas catiônicas e neutra da hidroxilamina e pKa 2 ao do equilíbrio entre a espécie neutra e a espécie aniônica. O coeficiente de correlação encontrado no ajuste da curva foi de 0,73555, um valor baixo, principalmente devido à dificuldade encontrada na obtenção dos valores fora do patamar de reatividade entre os valores de pH 7 e 11. Na curva os valores encontrados para 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 0,0 2,0x10-5 4,0x10-5 6,0x10-5 8,0x10-5 1,0x10-4 k ob s /s -1 pH 31 pKa 1e pKa 2 foram respectivamente, 6,27 e 11,49 com um erro aproximado de 27% para pKa 1 e 65% para pKa2 novamente atribuídos às regiões do perfil de pH onde a reação se processa mais lentamente. O valor de pKa 1 corresponde ao valor estimado por Kirby et al., 2010 (6,07 e 6,73, para pKa N e pKa O, respectivamente) Simanenko et al., 2002, estimou o valor de pKa 2 como 13,8, muito próximo do valor determinado por Kirby et al., 2010 (13,4) usando correlações lineares de energia livre. Com base nessas informações fica evidente a necessidade de se repetir os experimentos na região alcalina, a fim de se completar o perfil. Pelo valor elevado dos erros associados aos valores de pKa, encontrados a partir da equação 2, é possível que a região acima de pH 10, não tenha o comportamento descrito. Esses resultados necessitam ser comprovados, contudo ainda não há condições experimentais suficientes no LQBoA para se executar esse experimento que exige cuidado com a alcalinidade do meio a qual compromete a integridade das cubetas ou recipientes de vidro devido à longa duração do experimento. Uma evidência de que o ajuste na região alcalina não corresponde ao ajuste bell-shaped são os dados de Simanenko et al., 2002 para a degradação via íon -OH 9,6×10-3 L mol-1 s-1 a 25 oC. Com isso fica ainda a incerteza sobre a possibilidade da catálise básica provocada pelo excesso de íons hidróxido nessas condições. A região de maior reatividade observada, nesse experimento, deve-se principalmente à forma neutra da hidroxilamina. De acordo com os trabalhos de Kirby et al.,2006, uma espécie, o óxido de amônia, +NH3O-, contribui significantemente para a alta reatividade da hidroxilamina, sobretudo em ataques a organofosforados, já que sua baixa densidade de carga no nitrogênio facilitaria sua aproximação ao átomo de fósforo central do organofosforado (Esquema 6). 32 Esquema 6 De acordo com o esquema 6, a aproximação do nucleófilo é facilitada pela carga total da molécula que é zero. Uma vez próxima ao sítio eletrofílico, o equilíbrio tautomérico permitiria que a parte positiva da molécula desestabilizasse a alta densidade de carga negativa nos oxigênios circunvizinhos ao átomo de fósforo. Uma vez o ataque sendo concluído, o grupo abandonador, p-nitrofenolato, poderia ser liberado e o fosfato de amônia poderia ser novamente atacado por uma molécula de hidroxilamina, formando hidrazina e fosfato de dietila. 5.2.2 Estudo da influência da concentração de hidroxilamina: determinação da constante de velocidade dependente do nucleófilo e determinação da influência da constante de hidrólise na degradação da paraoxona A fim de estudar a influência da hidrólise na degradação da paraoxona, e para se obter a constante cinética verdadeira para a hidroxilamina, realizou-se a reação em diferentes concentrações desse nucleófilo. Na figura 20 o gráfico mostra as diferentes concentrações utilizadas e a constante de velocidade obtida em cada caso. Através de uma extrapolação da curva é possível obter a constante de hidrólise (khidro) para a reação por meio do seu 33 coeficiente linear. Para obtenção desses dados a temperatura e o pH foram mantidos constantes. Figura 20. Gráfico kobs versus concentração de hidroxilamina a 27 °C e pH 8,70. O gráfico mostra que a contribuição da água, o solvente da reação, sobre a velocidade é pequena, kw = 1,05 × 10-7 s-1. Esse valor é aproximadamente 840 vezes menor do que a observada para a reação com hidroxilamina a 0,5 mol L-1 que possui knuc= 1,62 × 10-4 s-1 valor próximo ao encontrado por Simanenko et al., 2002, em que a knuc= 1,90 × 10-4 s-1 . A influência do tampão foi desconsiderada já que possui uma concentração irrelevante diante das espécies em estudo. A correlação obtida na figura 20 é linear indicando que a reação é de primeira ordem em relação à hidroxilamina. Para o cálculo da constante da água utilizou-se a seguinte equação: 𝑘!"#   =  𝑘!!"#$   á𝑔𝑢𝑎 +  𝑘!"[𝑁𝑢] Equação (3) Na equação 3 a concentração da água [água], a concentração da hidroxilamina [Nu], e a constante observável (k!"#) são relacionadas entre si e por isso foi possível obter as constantes referentes à hidrólise (coeficiente linear da reta descontando-se a concentração da água) e do nucleófilo em estudo (coeficiente angular). A Figura 20 é uma primeira evidência de que o ataque a paraoxona pela hidroxilamina ocorra por mecanismo de substituição nucleofílica bimolecular, pois a curva retilínea obtida indica a não formação de intermediários na reação. 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 2,0x10-5 4,0x10-5 6,0x10-5 8,0x10-5 1,0x10-4 k o bs /s -1 Hidroxilamina /mol dm-3 34 5.2.3 Estudo da degradação frente a diferentes nucleófilos Foram investigadas as reações de paraoxona com diferentes nucleófilos, dentre eles, nucleófilos com efeito alfa e nucleófilos que não apresentam tal efeito. A figura 21 mostra a constante observada para diferentes nucleófilos em função do seu pKa. Uma análise dos dados obtidos comprova a alta reatividade da hidroxilamina em comparação aos outros nucleófilos. Figura 21. Gráfico kobs versus pKa a 27 °C e pH 8,50. A comparação entre os dados obtidos mostram que a metilhidroxilamina (CH3NHOH) é menos reativa que a hidroxilamina (NH2OH), o impedimento estérico causado pelo grupo metila pode ser uma das causas na diminuição da reatividade, porém um estudo mais aprofundado precisa ser elaborado e as outras possíveis causas devem ser levantadas. Os outros nucleófilos, que não possuem o efeito alfa, com diferentes valores de pKa apresentaram constantes de velocidade próximas entre si e baixas, quando comparadas com a hidroxilamina. A constante de Bronsted encontrada para os nucleófilos alfa foi -0,80 e para nucleófilos comuns - 0,02 com um erro aproximado de 0,04458. Assim como nesse trabalho, Ramakrishna & Ramachandran, 1976, chegaram às mesmas conclusões quanto à pronunciada reatividade da hidroxilamina. Eles estudaram a degradação da paraoxona diante de nucleófilos comuns, como hidróxido de sódio e soluções de hidroxilamina e o tempo de meia vida encontrado para o pesticida foi muito menor quando a hidroxilamina foi utilizada. Os autores também observaram que a cinética variou de acordo com a temperatura do sistema, sendo que quanto maior a temperatura, menor o tempo de meia vida encontrado. Um dos produtos finais encontrados foi o p-nitrofenolato. 35 Em 2002, Simanenko et al., também se surpreenderam com a hidroxilamina quando a compararam com outros nucleófilos que também apresentavam o efeito alfa. Naquele momento não havia uma explicação para o excesso de reatividade observada. De acordo com Kirby et al., 2006, a presença do óxido de amônio na reação contribui com 25% sobre a reatividade da hidroxilamina neutra nessa região de acidez/basicidade. 5.2.4 Parâmetros cinéticos de ativação: entalpia, entropia e energia livre Para obter os parâmetros de ativação, as reações foram realizadas em diferentes temperaturas e com nucleófilos distintos como acetato, formiato e hidroxilamina. Os três nucleófilos estudados possuem valores de pKa próximos o que possibilita uma comparação entre a reatividade e o parâmetro dos mesmos em pH 8,7. Os dados foram tratados pela equação de Eyring (Equação 4) que fornece os valores da entalpia e entropia de ativação. ln!!"#   ! = ln !! ! + !!‡ !   −  !! ‡ !   . (  ! ! ) Equação (4) Na equação 4, a temperatura em Kelvin, a entropia de ativação ΔS‡ e a entalpia de ativação ΔH‡ foram relacionados. Os valores utilizados para as constantes de Boltzman (kB), Planck (h) e Universal dos Gases (R) foram 1,38 × 1 0-23J K-1, 6,63 × 10-34 J s e 8,314 J mol-1 K-1, respectivamente. As energias de ativação (Ea) e os fatores pré-exponenciais (A) da reação com cada nucleófilo foram obtidas utilizando-se a equação de Arrhenius, equação 5. 𝑙𝑛𝑘!"# = ln𝐴 −   !! !" Equação (5) Os parâmetros determinados são mostrados na tabela 2. Tabela 2. Parâmetros de ativação para a reação da paraoxona com diferentes nucleófilos. Nucleófilos Ea /J mol-1 ∆H‡ /kJ mol-1 ∆S‡ /J K-1 mol-1 Formiato 23,6 21,0 -205,9 Acetato 20,1 17,5 -207,1 Hidroxilamina 17,9 15,3 -205,7 36 Uma análise da tabela 2 revela que a hidroxilamina possui uma velocidade maior que outros nucleófilos, já que sua energia de ativação é menor, o que contribui para uma constante cinética aproximadamente 10 vezes maior. Os valores da entropia de ativação são muito próximos entre as espécies utilizadas o que indica que a as três reações ocorrem por mecanismos parecidos, muito provavelmente associativos, pois o fato do ΔS‡ ser negativo sugere que os complexos ativados das reações são mais organizados do que os reagentes. Os valores baixos de energia de ativação também corroboram esse mecanismo. Valores baixos de entalpia de ativação também corroboram para o mecanismo associativo, nesse caso SN2(P) por ser bimolecular e envolver um átomo de fósforo como centro eletrofílico. Além da formação do p-nitrofenolato, Kirby et al., 2008, detectaram a hidrazina como um produto da reação, já que, segundo seus estudos após a reação principal (esquema 7) a hidroxilamina continua reagindo no sistema dando origem a hidrazina, que pode ser facilmente convertida em amônia e assim ser utilizada como um precursor nitrogenado para fertilizantes. O esquema 7 apresentado a seguir mostra o mecanismo sugerido para a decomposição da paraoxona em meio aquoso por ação da hidroxilamina. Esquema 7 Basendo-se nesse esquema e na suposição existente na literatura, Medeiros, 2009, que estudou o mecanismo da reação entre hidroxilamina e um triéster de fosfato, o mecanismo de reação para triésteres fosfóricos provavelmente ocorra pelo tipo SN2 (P), similar ao mecanismo de substituição nucleofílica bimolecular do carbono. Acredita-se que a reação de ataque a paraoxona pela hidroxilamina ocorra de forma concertada, sem a formação de intermediários e com um produto final de configuração invertida ao substrato inicial. Partindo 37 desse princípio, o trabalho realizado buscou evidências para comprovar as suposições esquematizadas. 6. CONCLUSÃO Os estudos fotoquímicos realizados neste trabalho mostraram que oxigênio singlete, produzido na reação fotossensitizada, reage com o aminoácido tirosina, porém não reage com o organofosforado paraoxona. A análise dos orbitais HOMO derivada dos cálculos computacionais realizados para as diferentes moléculas indicam que o oxigênio singlete interagiria preferencialmente com estruturas que possuem grupos hidroxila na posição 4 do anel substituído, em detrimento aquelas que têm grupos retiradores de elétrons. Na parte química o trabalho deixou claro a alta efetividade da hidroxilamina na degradação da paraoxona e que a mudança do pH no meio reacional causa alterações na constante observável da reação, sendo que, no patamar de 6,27 a 11,49 a velocidade da reação é considerável tendo uma constante aproximadamente 840 vezes maior que a hidrólise do pesticida. Nos pHs citados a alta reatividade da hidroxilamina, além do seu efeito alfa, deve- se ao equilíbrio tautomérico existente na sua estrutura. Esse equilíbrio aumenta em aproximadamente 25% sua reatividade. De acordo com os dados obtidos sugere-se que a degradação pela hidroxilamina ocorra por meio de substituição nucleofílica bimolecular para o átomo de fósforo em um mecanismo associativo. A presença da hidrazina como produto da reação é algo que favorece o método, já que fertilizantes podem ser obtidos a partir desses produtos. 38 7. REFERÊNCIAS  BIBLIOGRÁFICAS   ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Disponível em: . Acessado em 20/12/2013. ARAUJO, T. M. R. Degradação da parationa metílica em ambientes aquáticos naturais. 2006. 119f. Dissertação (mestrado em Ciências Naturais). – Universidade Estadual do Norte Fluminense, Campos dos Goytacazes. BAI, Y.; CHEN, J.; YANG, Y.; GUO, L.; ZHANG, C. Degradation of organophosphorus pesticide induced by oxygen plasma: effects of operating parameters and reaction mechanisms. Chemosphere, v. 81, n. 3, p. 408–14, 2010. BAVCON KRALJ, M.; FRANKO, M.; TREBSE, P. 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Sensitive detection of hydroxylamine at a simple baicalin carbon nanotubes modified electrode. Talanta, v. 93, p. 67–71, 2012. 42 ANEXO COORDENADAS CARTESIANAS - Cálculo Computacional Coordenadas cartesianas da estrutura molecular do 4-nitrofenil fosfato de dietila (paraoxona) otimizada em nível RHF/6-31+G** e efeitos implícitos de solvatação incluídos pelo método C-PCM aplicado em modo iterativo. ELEMENTO   X   Y   Z   C   333.060.288   -­‐241.037.726   -­‐0.29035926   C   184.276.950   -­‐227.618.885   -­‐0.04920559   O   137.485.194   -­‐0.97072965   -­‐0.45774588   P   123.118.401   0.27270970   0.47738951   O   113.970.399   -­‐0.02987458   190.081.096   O   -­‐0.03051049   102.599.144   -­‐0.13902846   O   237.966.847   126.828.039   0.14007038   C   270.042.324   174.561.489   -­‐118.524.384   C   393.694.639   260.765.839   -­‐108.096.981   C   -­‐131.695.366   0.55561852   -­‐0.11507567   C   -­‐176.108.253   -­‐0.25494474   -­‐114.701.903   C   -­‐307.510.567   -­‐0.68394744   -­‐114.694.428   C   -­‐390.771.794   -­‐0.28258237   -­‐0.11522429   C   -­‐346.965.003   0.53484839   0.91416121   C   -­‐215.457.082   0.95942038   0.91175658   H   364.459.705   -­‐341.500.711   -­‐0.02493247   H   389.437.342   -­‐170.907.998   0.31580880   H   356.991.386   -­‐224.117.589   -­‐133.425.701   H   158.771.944   -­‐242.338.967   0.98994589   H   127.921.093   -­‐297.061.324   -­‐0.65337151   H   286.554.384   0.88943797   -­‐182.505.310   H   185.320.306   230.753.875   -­‐155.211.687   H   477.595.663   203.520.775   -­‐0.70171100   H   376.261.473   345.216.107   -­‐0.42386714   H   419.325.972   298.440.576   -­‐206.585.383   H   -­‐108.900.809   -­‐0.53883302   -­‐193.333.888   H   -­‐344.468.546   -­‐131.061.316   -­‐193.341.708   H   -­‐413.802.862   0.83087552   169.740.772   H   -­‐177.880.931   159.593.391   168.955.922   N   -­‐529.083.681   -­‐0.73194569   -­‐0.11446217   O   -­‐564.289.331   -­‐148.149.192   -­‐0.97938639   O   -­‐601.531.982   -­‐0.33253828   0.75120318   43 Coordenadas cartesianas da estrutura molecular do ácido 2-amino-3-(4-hidroxifenil) propanóico (tirosina) otimizada em nível RHF/6-31+G** e efeitos implícitos de solvatação incluídos pelo método C-PCM aplicado em modo iterativo. ELEMENTO   X   Y   Z   C   201.189.947   -­‐0.72384381   -­‐0.38932300   C   233.070.850   0.76667029   -­‐0.66289556   N   331.399.512   -­‐138.254.046   -­‐0.03422409   C   103.174.460   -­‐0.92896205   0.78036922   C   -­‐0.39762864   -­‐0.52746266   0.48452926   C   -­‐119.887.972   -­‐130.936.849   -­‐0.33968297   C   -­‐251.765.943   -­‐0.96986473   -­‐0.60281855   C   -­‐306.057.096   0.16859367   -­‐0.02414970   C   -­‐0.96425498   0.60685295   105.528.581   C   -­‐228.258.705   0.95779651   0.80971247   O   155.046.463   136.862.028   -­‐139.411.676   O   334.265.637   119.834.900   -­‐0.08847341   H   164.237.511   -­‐119.964.814   -­‐128.393.638   H   322.400.713   -­‐214.078.712   0.62319094   H   390.837.336   -­‐0.66445851   0.36446667   H   139.585.948   -­‐0.38545415   164.629.948   H   104.766.357   -­‐198.374.712   103.948.665   H   -­‐0.79994529   -­‐220.426.583   -­‐0.78649986   H   -­‐311.766.243   -­‐159.095.359   -­‐124.550.259   H   -­‐0.37463957   123.043.823   170.485.854   O   -­‐434.237.099   0.54936594   -­‐0.23956722   H   -­‐271.112.037   183.533.478   125.907.457   H   -­‐479.639.482   -­‐0.06080517   -­‐0.80195314   H   378.616.214   -­‐174.050.820   -­‐0.84956664   44 Coordenadas cartesianas da estrutura molecular do ácido 2-amino-3-(4-nitrofenil)-propanóico otimizada em nível RHF/6-31+G** e efeitos implícitos de solvatação incluídos pelo método C-PCM aplicado em modo iterativo. ELEMENTO   X   Y   Z   C   273.741.150   -­‐0.62449586   -­‐0.35127503   C   285.656.166   0.89121705   -­‐0.62311804   N   411.518.240   -­‐112.876.129   -­‐0.05167423   C   183.639.693   -­‐0.93158919   0.85991532   C   0.37691757   -­‐0.62531215   0.60120553   C   -­‐0.40013793   -­‐151.301.205   -­‐0.14086556   C   -­‐173.263.788   -­‐124.944.687   -­‐0.39374644   C   -­‐228.235.149   -­‐0.08320740   0.11351010   C   -­‐0.20897944   0.53091210   110.550.869   C   -­‐154.219.258   0.81286597   0.86432463   O   210.367.131   135.762.870   -­‐147.469.354   O   369.322.634   148.172.522   0.07518055   H   239.400.387   -­‐114.399.660   -­‐123.209.155   H   410.173.893   -­‐203.374.958   0.39339259   H   458.087.826   -­‐0.46681109   0.55382937   H   218.785.167   -­‐0.36835581   171.658.516   H   193.220.329   -­‐198.489.249   110.303.640   H   0.03349074   -­‐241.986.060   -­‐0.52264833   H   -­‐232.898.092   -­‐193.319.750   -­‐0.96411633   H   0.37368056   122.180.605   168.676.674   H   -­‐199.235.690   170.556.593   124.958.587   H   466.276.789   -­‐122.264.504   -­‐0.89201921   N   -­‐368.314.457   0.20855802   -­‐0.15042961   O   -­‐414.345.884   122.384.131   0.28714830   O   -­‐431.399.870   -­‐0.57831895   -­‐0.79629099   45 Coordenadas cartesianas da estrutura molecular do 4-hidroxifenil fosfato de dietila otimizada em nível RHF/6-31+G** e efeitos implícitos de solvatação incluídos pelo método C-PCM aplicado em modo iterativo. ELEMENTO   X   Y   Z   C   335.961.080   -­‐239.782.238   -­‐0.29844841   C   186.803.770   -­‐228.064.370   -­‐0.06909221   O   138.573.503   -­‐0.98465955   -­‐0.48089471   P   122.700.810   0.26015198   0.45567432   O   113.755.846   -­‐0.05404172   187.868.214   O   -­‐0.01673846   101.795.733   -­‐0.16685286   O   239.246.941   124.815.917   0.13600183   C   271.906.972   173.649.096   -­‐118.113.756   C   393.882.370   262.037.587   -­‐105.952.680   C   -­‐131.858.408   0.54163730   -­‐0.12151406   C   -­‐178.277.099   -­‐0.28634790   -­‐112.289.333   C   -­‐310.391.307   -­‐0.71312290   -­‐110.096.788   C   -­‐394.666.338   -­‐0.30231318   -­‐0.07929612   C   -­‐347.232.890   0.53797966   0.92010742   C   -­‐215.531.063   0.96276152   0.89686507   H   368.396.807   -­‐339.883.852   -­‐0.03146107   H   391.040.802   -­‐169.003.391   0.31202281   H   360.512.257   -­‐222.477.603   -­‐134.034.729   H   160.789.764   -­‐243.255.281   0.96827126   H   131.942.308   -­‐298.476.648   -­‐0.67634112   H   290.797.663   0.88672769   -­‐182.311.416   H   186.754.811   228.504.539   -­‐155.827.963   H   478.419.352   206.103.992   -­‐0.67436868   H   374.242.759   345.757.794   -­‐0.39911413   H   419.940.567   300.810.862   -­‐203.914.976   H   -­‐112.466.216   -­‐0.59450465   -­‐191.357.076   H   -­‐347.155.285   -­‐135.579.741   -­‐188.176.560   H   -­‐413.562.059   0.85436666   170.414.722   H   -­‐177.914.882   161.792.839   166.058.075   O   -­‐524.242.687   -­‐0.68681312   -­‐0.00972822   H   -­‐547.222.567   -­‐127.588.975   -­‐0.71327710