UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRONÔMICAS CAMPUS DE BOTUCATU MANUTENÇÃO DE DOIS SISTEMAS RADICULARES EM ASPECTOS BIOQUÍMICOS E FISIOLÓGICOS DURANTE O DESENVOLVIMENTO DE PLANTAS E DESEMPENHO AGRONÔMICO DE Passiflora edulis Sims ENXERTADAS WILLIAM HIROSHI SUEKANE TAKATA Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agronômicas da UNESP – Campus de Botucatu, para obtenção do título de Doutor em Agronomia (Horticultura) BOTUCATU – SP Julho 2015 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRONÔMICAS CAMPUS DE BOTUCATU MANUTENÇÃO DE DOIS SISTEMAS RADICULARES EM ASPECTOS BIOQUÍMICOS E FISIOLÓGICOS DURANTE O DESENVOLVIMENTO DE PLANTAS E DESEMPENHO AGRONÔMICO DE Passiflora edulis Sims ENXERTADAS WILLIAM HIROSHI SUEKANE TAKATA Orientador: Profa Dra Elizabeth Orika Ono Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agronômicas da UNESP – Campus de Botucatu, para obtenção do título de Doutor em Agronomia (Horticultura) BOTUCATU – SP Julho 2015 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRATAMENTO DA INFORMAÇÃO – SERVIÇO TÉCNICO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - UNESP – FCA – LAGEADO- BOTUCATU (SP) Takata, William Hiroshi Suekane, 1987- T136m Manutenção de dois sistemas radiculares em aspectos bioquímicos e fisiológicos durante o desenvolvimento de plantas e desempenho agronômico de Passiflora edulis Sims enxertadas/ William Hiroshi Suekane Takata. – Botucatu : [s.n.], 2015 xii, 88 f. : il., grafs., tabs. Tese(Doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Fa- culdade de Ciências Agronômicas, Botucatu, 2015 Orientador: Elizabeth Orika Ono Inclui bibliografia 1. Passiflora. 2. Maracujá. 3. Enxertia. 4. Fotossínte- se. 5. Enzimas antioxidantes. I. Ono, Elizabeth Orika. II. Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (Campus de Botucatu). Faculdade de Ciências Agronômicas de Botucatu. III. Título. IV DEDICO Aos meus pais, José Tadashi Takata e Mirian Miyuki Suekane Takata, por todo o amor, atenção, incentivo e educação ao longo de minha vida. À minha irmã Gabriele Takata Girotto e ao meu cunhado Neimar José Girotto por todo apoio fornecido. À Vanessa Hanayo Sakotani, pelo carinho, companheirismo e compreensão em todos os momentos. À toda minha família, por me ensinarem valores que nunca serão esquecidos. Aos meus amigos, por todo o incentivo e apoio durante todas as etapas deste trabalho. AGRADEÇO À Deus, Por me iluminar em todos os momentos e por sempre me mostrar o melhor caminho. V AGRADECIMENTOS À Faculdade de Ciências Agronômicas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”. À FAPESP – Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, pela concessão da bolsa de Doutorado referente ao processo 2012/16024-3. À Profa Dra Elizabeth Orika Ono, pela orientação, amizade, pelos preciosos ensinamentos, por toda a atenção e paciência ao longo do curso. A todos os funcionários da APTA – Agência Paulista de Tecnologia dos Agronegócios de Presidente Prudente pelo auxílio no desenvolvimento de parte do meu projeto. A todos os Professores da Faculdade de Ciências Agronômicas da UNESP, Câmpus de Botucatu que contribuíram para o meu crescimento pessoal e técnico. A todos os funcionários do Departamento de Horticultura da Faculdade de Ciências Agronômicas da UNESP, Câmpus de Botucatu. Aos amigos de república, que me acolheram e me ensinaram muitos valores de respeito, amizade e, principalmente, por todos os momentos de descontração. A todos os colegas e amigos que fiz na pós-graduação ao longo do curso. Aos funcionários da Biblioteca Prof. Paulo de Carvalho Mattos, pela colaboração e excelente atendimento. Às funcionárias da Seção de Pós-graduação da Faculdade de Ciências Agronômicas da UNESP, Câmpus de Botucatu pela dedicação nos serviços prestados. VI SUMÁRIO Página LISTA DE TABELAS ........................................................................................................... VIII 1 RESUMO ................................................................................................................................. 1 2. SUMMARY ............................................................................................................................ 2 3 INTRODUÇÃO ........................................................................................................................ 3 4 REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................................ 5 5 MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................................... 12 5.1 Experimento 1 ................................................................................................................ 12 5.1.1 Localização ................................................................................................................. 12 5.1.2 Preparo das mudas ...................................................................................................... 13 5.1.3 Delineamento experimental ........................................................................................ 14 5.1.4 Coleta do material para as análises enzimáticas ......................................................... 15 5.1.5 Avaliação enzimática .................................................................................................. 15 5.2 Experimento 2 ................................................................................................................ 17 5.2.1 Localização ................................................................................................................. 17 5.2.2 Preparo das mudas ...................................................................................................... 17 5.2.3 Avaliação do crescimento ........................................................................................... 17 5.2.4 Trocas gasosas e análise de fluorescência da clorofila ............................................... 18 5.3 Experimento 3 ................................................................................................................ 19 5.3.1 Localização ................................................................................................................. 19 5.3.2 Preparo das mudas ...................................................................................................... 20 5.3.3 Condução do experimento .......................................................................................... 20 5.3.4 Delineamento experimental ........................................................................................ 22 VII 5.3.5 Avaliação de produção ................................................................................................ 22 5.3.6 Qualidade dos frutos e potencial antioxidante ............................................................ 23 5.3.7 Trocas gasosas e análise de fluorescência da clorofila ............................................... 25 5.3.8 Análise estatística ....................................................................................................... 25 6 RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................................... 26 6.1 EXPERIMENTO 1 – Atividade bioquímica e fotossintética de mudas de maracujazeiro após enxertia .............................................................................................................................. 26 6.2 EXPERIMENTO 2.1 - Análise de crescimento, desenvolvimento e partição de biomassa em mudas de maracujazeiro enxertadas, com dois sistemas radiculares e não enxertadas .................................................................................................................................. 34 6.3 EXPERIMENTO 2.2 – Trocas gasosas e fluorescência da clorofila a em mudas de maracujazeiro enxertadas, com dois sistemas radiculares e não enxertadas ............................. 43 6.4 EXPERIMENTO 3.1 – Produtividade, qualidade e potencial antioxidante de frutos de maracujazeiro enxertado com dois sistemas radiculares e não enxertados ............................... 48 6.5 EXPERIMENTO 3.2 – Aspectos fisiológicos do uso da enxertia e da manutenção de duas raízes ao longo do período vegetativo e reprodutivo do maracujazeiro ............................ 66 7 CONSIDERAÇÕES FINAIS ................................................................................................. 72 8 CONCLUSÕES ...................................................................................................................... 73 9 REFERÊNCIAS ..................................................................................................................... 75 VIII LISTA DE TABELAS Tabela Página Tabela 1. Análise química do substrato utilizado para a produção de mudas de Passiflora edulis f. flavicarpa e Passiflora gibertii. ............................................................................ 13 Tabela 2. Análise química de solo antes da correção de pH e adubação de plantio nos dois anos agrícolas, APTA, Presidente Prudente/SP. ................................................................. 21 Tabela 3. Diâmetro (mm) da base do caule de mudas de Passiflora edulis enxertadas convencionalmente sobre P. gibertii (EC), P. edulis com adição do sistema radicular de P. gibertii (RD) e P. edulis não enxertados (PNE) ao longo do tempo de cicatrização. ..... 34 Tabela 4. Equações de ajustes de massa seca total (MST - g), área foliar (AF – cm2) e massa seca foliar (MSF – g) de plantas jovens de maracujazeiro (Passiflora edulis) não enxertada e enxertada em P. gibertii, em função do tempo. ............................................... 39 Tabela 5. Número total de frutos e número de frutos dentro de cada classe* (número de frutos planta-1), em maracujazeiros enxertados em Passiflora gibertii, com dois sistemas radiculares e não enxertados (P. edulis). .............................................................. 48 Tabela 6. Desdobramento da interação entre os tratamentos e o ano de cultivo para o número de frutos das classes 2, 4, 5 e número total de frutos. ............................................ 50 Tabela 7. Produtividade de frutos da classe 2* (ton de frutos ha-1), em maracujazeiros enxertados em Passiflora gibertii, com dois sistemas radiculares e não enxertados (P. edulis). ................................................................................................................................. 50 Tabela 8. Produtividade total e produtividade de frutos dentro de cada classe* (ton de frutos ha-1), em maracujazeiros enxertados em Passiflora gibertii, com dois sistemas radiculares e não enxertados (P. edulis). ............................................................................. 51 Tabela 9. Desdobramento da interação entre os tratamentos e o ano de cultivo para a produtividade total, e produtividade de frutos das classes 4 e 5 (ton de frutos ha-1). ......... 52 Tabela 10. Massa média de frutos dentro de cada classe* (g), em maracujazeiros enxertados em Passiflora gibertii, com dois sistemas radiculares e não enxertados (P. edulis). ................................................................................................................................. 54 Tabela 11. Desdobramento da interação entre os tratamentos e o ano de cultivo para a massa média de frutos, da classe 2 e a massa média da média ponderada (g). ................... 54 IX Tabela 12. Rendimento de polpa de frutos (%) dentro de cada classe*, em maracujazeiros enxertados em Passiflora gibertii, com dois sistemas radiculares e não enxertados (P. edulis). ................................................................................................................................. 56 Tabela 13. Espessura da casca de Passiflora edulis (mm) dentro de cada classe*, em maracujazeiros enxertados em P. gibertii, com dois sistemas radiculares e não enxertados. ........................................................................................................................... 58 Tabela 14. Potencial hidrogeniônico (pH) e firmeza (N) em frutos de maracujazeiros enxertados em Passiflora gibertii, com dois sistemas radiculares e não enxertados (P. edulis). ................................................................................................................................. 59 Tabela 15. Sólidos solúveis (SS - ºBrix), acidez titulável (AT – g de ácido cítrico 100 g-1 de amostra), nitrato (mg L-1) e relação acidez titulável/sólidos solúveis (SS/AT) em frutos de maracujazeiros enxertados em Passiflora gibertii, com dois sistemas radiculares e não enxertados (P. edulis). .................................................................................................. 59 Tabela 16. Teor de carboidratos solúveis totais (g 100g-1 de amostra) e porcentagem de açúcares redutores (%AR), açúcares totais (%ART) e sacarose (%SAC) em polpas de maracujá enxertados em Passiflora gibertii, não enxertados (P. edulis) e com dois sistemas radiculares. ............................................................................................................ 61 Tabela 17. Desdobramento da interação entre os tratamentos e o ano de cultivo sobre o teor de carboidratos, açúcares redutores (%) e açúcares redutores totais (%) em frutos de maracujazeiro. ..................................................................................................................... 61 Tabela 18. Teores de fenóis totais (g 100g-1 de amostra), carotenoides (µg 100g-1 de amostra) e atividade antioxidante (DPPH - µm g-1 de amostra) em frutos de maracujazeiro proveniente de plantas não enxertadas, enxertadas convencionalmente e com manutenção de dois sistemas radiculares em dois anos de cultivo. ............................ 63 Tabela 19. Desdobramento da interação entre os tratamentos e o ano de cultivo sobre teor de fenóis totais (g 100g-1 de amostra) e carotenoides (µg 100g-1 de amostra) em frutos de maracujazeiro proveniente de plantas não enxertadas, enxertadas convencionalmente e com manutenção de dois sistemas radiculares em dois anos de cultivo. ................................................................................................................................. 63 Tabela 20. Teores de flavonoides (mg 100g-1 de amostra), ácido ascórbico (AA – mg de ácido ascórbico 100 g-1 de amostra) em frutos de maracujazeiro proveniente de plantas não enxertadas, enxertadas convencionalmente e com manutenção de dois sistemas radiculares em dois anos de cultivo. .................................................................................... 65 X LISTA DE FIGURAS Figura Página Figura 1. Maracujazeiro sendo enxertado pelo método convencional (A) e maracujazeiro sendo enxertado com permanência de dois sistemas radiculares. ....................................... 14 Figura 2. Dados de temperatura e precipitação registrados no período de condução do experimento (setembro/1012 a junho/2014). Presidente Prudente – SP. ............................ 20 Figura 3. (A) Canavalia ensiformis na entre-fileira da cultura do maracujazeiro. (B) Raphanus sativus na entre-fileira da cultura do maracujazeiro. Presidente Prudente – SP. ........................................................................................................................................ 22 Figura 4. (A) Atividade da superóxido dismutase (U g-1 proteína) - SOD, (B) catalase (µmol H2O2 decomposto min-1 g-1 proteína) - CAT, (C) peroxidase (µmol H2O2 decomposto min-1 g-1 proteína) - POD e (D) polifenoloxidase (µmol catecol oxidado min-1 g-1 proteína) – PPO na região da enxertia em P. edulis enxertados convencionalmente sobre P. gibertii (EC), P. edulis com adição do sistema radicular de P. gibertii (RD) e P. edulis não enxertados (PNE) ao longo do tempo de cicatrização da enxertia. ............................................................................................................................... 28 Figura 5. (A) Atividade da superóxido dismutase (U g-1 proteína) – SOD, (B) catalase (µmol H2O2 decomposto min-1 g-1 proteína) – CAT, (C) peroxidase (µmol H2O2 decomposto min-1 g-1 proteína) – POD, (D) polifenoloxidase (µmol catecol oxidado min-1 g-1 proteína) – PPO, (E) ascorbato peroxidase – APX (µmol H2O2 decomposto min-1 g-1 proteína) e (F) conteúdo relativo de água na folha de P. edulis enxertados convencionalmente sobre P. gibertii (EC), P. edulis com adição do sistema radicular de P. gibertii (RD) e P. edulis não enxertados (PNE) ao longo do tempo de cicatrização da enxertia. ............................................................................................................................... 30 Figura 6. Teores de clorofila a (µg g-1 MF), clorofila b (µg g-1 MF), carotenoides totais (µg g-1 MF) e relação clorofila a/clorofila b em folhas de P. edulis enxertados convencionalmente sobre P. gibertii (EC), P. edulis com adição do sistema radicular de P. gibertii (RD) e P. edulis não enxertados (PNE) ao longo do tempo de cicatrização da enxertia. ............................................................................................................................... 31 XI Figura 7. (A) Taxa de assimilação de CO2 (A - µmol CO2 m-2 s-1), (B) condutância estomática (gs - mol m-2 s-1), (C) conteúdo interno de CO2 (Ci - µmol CO2 mol-1) e (D) taxa de transpiração (E - mmol H2O m-2 g-1) de mudas de P. edulis enxertados convencionalmente sobre P. gibertii (EC), P. edulis com adição do sistema radicular de P. gibertii (RD) e P. edulis não enxertados (PNE) ao longo do tempo de cicatrização da enxertia. ............................................................................................................................... 32 Figura 8. (A) Altura da planta de maracujazeiro (cm), (B) diâmetro do caule no local da enxertia (mm), (C) comprimento médio do entrenó (cm), (D) número de folhas e (E) diâmetro do caule acima da enxertia (mm) em plantas de maracujazeiro Passiflora edulis não enxertadas (PNE), enxertadas em P. gibertii (EC) e plantas enxertadas em P. gibertii com manutenção dos dois sistemas radiculares (RD). ........................................... 36 Figura 9. Massa seca foliar (MSF - g), massa seca de caule (MSC – g) e massa seca radicular (MSR – g) de plantas jovens de P. edulis enxertadas convencionalmente sobre P. gibertii (EC), P. edulis com adição do sistema radicular de P. gibertii (RD) e P. edulis não enxertadas (PNE) ao longo do tempo de cicatrização da enxertia. ............... 38 Figura 10. Ajustes de massa seca total (MST - g), massa seca foliar (MSF – g) e área foliar (AF – cm2) de mudas plantas de maracujazeiro Passiflora edulis não enxertadas (PNE), enxertadas em P. gibertii (EC) e plantas enxertadas em P. gibertii com manutenção dos dois sistemas radiculares (RD) ao longo do tempo após enxertia. ...................................... 40 Figura 11. Taxa de crescimento absoluto (TCA), taxa de crescimento relativo (TCR), taxa assimilatória líquido (TAL), razão de área foliar (RAF), massa específica de folha (MEF), razão de massa foliar (RPF), área foliar específica (AFE) e duração de área foliar (DAF) de plantas jovens de maracujazeiro Passiflora edulis não enxertadas (PNE), enxertadas em P. gibertii (EC) e plantas enxertadas em P. gibertii com manutenção dos dois sistemas radiculares (RD). ................................................................ 42 Figura 12. Taxa de assimilação de carbono (A - µmol CO2 m-2 s-1), conteúdo interno de CO2 (Ci - µmol CO2 mol-1), condutância estomática (gs - µmol m-2 s-1), taxa de transpiração (E - mmol H20 m-2 s-1), eficiência de carboxilação (A/Ci) e eficiência do uso de água (A/E) em mudas de maracujazeiro Passiflora edulis não enxertadas (PNE), enxertadas em P. gibertii (EC) e plantas enxertadas em P. gibertii com manutenção dos dois sistemas radiculares (RD) ao longo do tempo após a enxertia. ................................... 44 Figura 13. Fluorescência basal (Fo), eficiência quântica do fotossistema II (Fv/Fm), eficiência quântica efetiva do fotossistema II (ΦPSII), coeficiente de extinção XII fotoquímica da fluorescência (qP), quenching não fotoquímico (NPQ) e taxa de transporte de elétrons (ETR) em mudas de maracujazeiro Passiflora edulis não enxertadas (PNE), enxertadas em P. gibertii (EC) e plantas enxertadas em P. gibertii com manutenção dos dois sistemas radiculares (RD) ao longo do tempo. ......................... 47 Figura 14. Taxa de assimilação de carbono (A - µmol CO2 m-2 s-1), conteúdo interno de CO2 (Ci - µmol CO2 mol-1), condutância estomática (gs - µmol m-2 s-1), taxa de transpiração (E - mmol H20 m-2 s-1), eficiência de carboxilação (A/Ci) e eficiência do uso de água (A/E) em mudas de maracujazeiro Passiflora edulis não enxertadas (PNE), enxertadas em P. gibertii (EC) e plantas enxertadas em P. gibertii com manutenção dos dois sistemas radiculares (RD) após transplante no campo. ............................................... 68 1 MANUTENÇÃO DE DOIS SISTEMAS RADICULARES EM ASPECTOS BIOQUÍMICOS E FISIOLÓGICOS DURANTE O DESENVOLVIMENTO DE PLANTAS E DESEMPENHO AGRONÔMICO DE Passiflora edulis Sims ENXERTADAS. Botucatu, 2015. 88p. Tese (Doutorado em Agronomia/Horticultura) – Faculdade de Ciências Agronômicas. Universidade Estadual Paulista. Autor: WILLIAM HIROSHI SUEKANE TAKATA Orientadora: ELIZABETH ORIKA ONO 1 RESUMO Ao longo desse trabalho foram desenvolvidos três experimentos, onde objetivou-se estudar a atividade de enzimas antioxidantes e as trocas gasosas ao longo do processo de cicatrização em dois métodos de enxertia em mudas de maracujazeiro. Após esse período foi estudado o desenvolvimento e crescimento dessas mudas, assim como o comportamento do aparato fotossintético. Quando as mudas estavam adultas foi avaliado a campo o desempenho agronômico, assim como a qualidade dos frutos e o seu potencial antioxidante, assim como o desempenho do aparato fotossintético. Os tratamentos foram: plantas não enxertada de Passiflora edulis Sims, plantas enxertadas convencionalmente e plantas enxertadas com manutenção de dois sistemas radiculares, sendo o porta-enxerto utilizado a Passiflora gibertii. Com base nos resultados obtidos concluiu-se que a utilização de plantas enxertadas e com manutenção de dois sistemas radiculares proporcionou produtividade e qualidade de frutos semelhante ao das plantas não enxertadas. Essas plantas ao longo do processo de cicatrização apresentaram menor atividade de enzimas antioxidantes, assim como menor tempo para recuperação do aparato fotossintético, após o processo da enxertia. Após a cicatrização, todos os tratamentos apresentaram o mesmo comportamento fotossintético. Palavras Chave: Enxertia, maracujá, Passiflora gibertii, enzimas antioxidantes, fotossíntese. 2 TWO ROOT SYSTEMS MAINTENANCE IN BIOCHEMICAL AND PHYSIOLOGICAL ASPECTS DURING THE PLANT DEVELOPMENT AND AGRONOMIC PERFORMANCE OF GRAFTED Passiflora edulis Sims. Botucatu, 2015. 88p. Tese (Doutorado em Agronomia/Horticultura) – Faculdade de Ciências Agronômicas. Universidade Estadual Paulista. Author: WILLIAM HIROSHI SUEKANE TAKATA Adviser: ELIZABETH ORIKA ONO 2 SUMMARY Throughout this study, it was developed three experiments, which aimed to study the activity of antioxidant enzymes and gas exchange during the healing process in two grafting methods in passion fruit seedlings. After this period has been studied the development and growth of these seedlings, as well as the behavior of the photosynthetic apparatus. When the seedlings were grown, was rated the field agronomic performance, as well as fruit quality and their antioxidant potential, as well as the performance of the photosynthetic apparatus. The treatments were not grafted plants of Passiflora edulis Sims, conventionally grafted plants and grafted plants with maintaining two root systems, and the rootstock used to Passiflora gibertii. Based on the results obtained it was concluded that the use of grafted plants and maintaining two root systems provided yield and fruit quality equal to that of ungrafted plants. These plants throughout the healing process showed lower activity of antioxidant enzymes as well as shorter time for recovery of the photosynthetic apparatus. After healing, all treatments showed the same photosynthetic behavior. Keywords: Graft, passion fruit, Passiflora gibertii, antioxidant enzymes, photosynthesis. 3 3 INTRODUÇÃO O cultivo do maracujazeiro-amarelo (Passiflora edulis Sims) tem diminuído constantemente devido ao ataque de doenças, sendo os patógenos de solo um dos principais responsáveis pela redução da produção no Estado de São Paulo através da morte prematura de plantas (MELETTI; BRUKNER, 2001; CHAVES et al., 2004). As doenças de solo que estão associadas a este problema são os fungos do solo, como Fusarium oxysporym f. passiflorae, Nectria haematococca e Phytophtora sp., sendo que as medidas de controle são preventivas, uma vez que quando afetadas por estes patógenos a planta morrerá por não haver medidas curativas, devido à ineficiência do uso de defensivos (SÃO JOSÉ et al., 1997; FISCHER et al., 2005). Uma alternativa no controle da morte prematura é a utilização de porta-enxertos que tem se mostrado promissora, pois, algumas espécies das 430 espécies de passifloráceas descritas, possuem resistência ou tolerância aos patógenos relacionados à morte prematura (MENEZES et al., 1994; RONCATTO et al., 2004; BRAGA et al., 2006; CAVICHIOLI et al., 2009). A técnica da enxertia consiste na união de estruturas (gemas, ramos, etc.) de uma planta em outra com o objetivo de propagar a planta (enxerto) para que esta possa se desenvolver, sendo que o sucesso da enxertia depende de vários fatores e um dos principais é o nível de compatibilidade entre os materiais (HARTMANN et al., 2010). 4 Porém, para uso como porta-enxerto é necessário que a espécie atenda há alguns requisitos mínimos, como a germinação de sementes que deve ser rápida e fácil de ocorrer, possuir vigor e rusticidade, resistência aos patógenos de solo, assim como boa adaptação às diferentes condições climáticas. Neste sentido, comparando seu desenvolvimento com o de outras espécies de Passifloráceas, Lima et al. (2006) constataram que o maior desenvolvimento vegetativo pode estar relacionado ao seu vigor. Com relação à resistência e tolerância aos patógenos de solo, Fusarium oxysporym f. passiflorae, Nectria haematococca e Phytphtora sp., a espécie P. giberti é resistente a esses patógenos, sendo muito promissora para ser utilizada como porta-enxerto (FISCHER et al., 2005). Entretanto, o uso da enxertia convencional (garfagem) de Passiflora edulis sobre P. gibertii proporcionou menor desenvolvimento e menor número de frutos por planta quando comparada com plantas sem enxertia (CAVICHIOLI et al., 2011a). O uso de dois sistemas radicular está sendo empregado, principalmente, para substituir os porta-enxertos convencionais por outros mais resistentes, sendo denominados de subenxertia, que no caso, enxerta-se outro porta-enxerto e a planta permanece com o outro sistema radicular que já possuía (MÜLLER et al., 2002). No Japão conseguiu-se aumentar a produção de pomeleiro utilizando-se dois sistemas radiculares (NAKAJIMA et al., 1992). Carvalho et al. (2009) constataram em seu trabalho que plantas com dois sistemas radiculares possuíam melhor eficiência fotossintética, assim como maior resistência ao déficit hídrico em laranjeiras. Neste sentido, este trabalho tem como objetivo estudar a enxertia de plantas de maracujazeiro com o uso de dois sistemas radiculares comparando-se ao método convencional e às plantas não enxertadas sobre o desenvolvimento e o estresse que ambos os métodos proporcionam às plantas, às alterações de trocas gasosas e de fluorometria, assim como, a produtividade e qualidade de frutos de Passiflora edulis Sims. 5 4 REVISÃO DE LITERATURA O maracujá (Passiflora edulis Sims) pertencente à família Passifloraceae apresenta cerca de 500 espécies descritas e, aproximadamente, 50% das espécies são nativas do Brasil (OLIVEIRA et al., 1994). O gênero Passiflora apresenta-se como ervas ou arbustos e, geralmente, possuem hábito de crescimento do tipo trepador, devido ao seu alto nível de exigência luminosa (COSTA et al, 2005). Dentre as diferentes espécies do gênero destacam-se a Passiflora edulis f. flavicarpa Deg e P. alata Curtis sendo denominadas popularmente de maracujá azedo e maracujá doce, respectivamente, e o que possui maior expressividade é o maracujá azedo, cuja área estimada de produção mundial comparado com outras espécies do gênero está em torno de 90% (JUNQUEIRA et al, 2005). O Brasil destaca-se como o maior produtor desta fruta, entretanto, também é o maior consumidor possuindo produção de aproximadamente 920 mil toneladas do fruto (MARACUJÁ, 2013). O Estado de São Paulo já foi o terceiro maior produtor de maracujá, tendo participação de aproximadamente, 11% da produção nacional (MARACUJÁ, 2012), entretanto, atualmente possui apenas cerca de 3% de participação na produção (MARACUJÁ, 2013). Os frutos podem ser consumidos in natura ou podem ser utilizados na indústria de sucos (ATAÍDE et al., 2006). 6 Cerca de um terço da área plantada localiza-se no oeste do Estado de São Paulo (IEA, 2008), porém, a cultura encontra-se comprometida, levando à migração da cultura para outras regiões devido ao alto nível de infestação por patógenos associados à morte prematura do maracujazeiro (CAVICHIOLI et al., 2011b). A morte prematura das plantas, segundo Chaves et al. (2004) é causada por patógenos do solo e entre eles destacam-se o Fusarium oxysporym f. passiflorae, Nectria haematococca e Phytophtora sp. (FISCHER et al., 2005) O controle químico desses patógenos não tem se mostrado eficiente e uma alternativa para contornar o problema dessa doença é o uso da técnica de enxertia, pois Fischer et al. (2005) constataram que algumas espécies do gênero Passiflora têm se mostrado resistentes e tolerantes à doença, como é o caso da Passiflora gibertii. O uso da Passiflora gibertii como porta-enxerto parece ser promissor pois, além de ser resistente aos patógenos, possui alto vigor com relação ao seu crescimento e desenvolvimento (LIMA et al., 2006) e a obtenção de plantas para a enxertia não apresenta problemas, uma vez que suas sementes germinam com rapidez e facilidade (FERREIRA et al., 2002). A incompatibilidade é um dos grandes problemas da enxertia. Em enxertias compatíveis, plantas de diferentes espécies, gêneros ou até mesmo família formam uniões com sucesso, baseadas nas conexões vasculares, unindo tecidos condutores do enxerto e porta-enxerto (TIEDEMANN, 1989). A não conexão vascular entre o porta- enxerto e o enxerto ocorre devido à incompatibilidade que pode ser demonstrada pela ruptura na região do enxerto e, também, nas diferenças de crescimento, tendo como consequência, a má condutância hidráulica, má absorção de nutrientes com sintomas de deficiência, apresentando folhas amareladas ou avermelhadas, ou mesmo, queda das mesmas, levando ao pouco crescimento da planta como um todo e pouca ou nenhuma produção (FACHINELLO et al., 1995; ODA et al., 2005). Cavichioli et al. (2011a) constataram que o método de enxertia do tipo garfagem de Passiflora edulis f. flavicarpa Deg sobre P. giberti apresenta certo grau de incompatibilidade, devido ao menor desenvolvimento das plantas, assim como, menor obtenção de frutos e, consequentemente, menor produção. 7 Além da compatibilidade, outros fatores estão envolvidos no sucesso da enxertia e, segundo Oliveira (2003), ao realizar o corte na planta, o menor desenvolvimento nas mudas pode estar relacionado ao estresse sofrido com a enxertia. Nota-se que a enxertia provoca algumas modificações fisiológicas na planta, tendo em vista que desenvolve certo grau de estresse à planta. No entanto, medidas de trocas gasosas e da fluorescência da clorofila pode ser uma técnica que poderá avaliar esse grau de estresse que deverá refletir-se na taxa fotossintética da planta (BAKER; ROSENQVISTM, 2004). Khan et al. (2006) caracterizaram a fluorescência das plantas com sete a oito folhas em diversas espécies olerícolas, concluindo que a leitura da fluorescência foi uma boa medida para caracterizar a fotossíntese e a atividade vegetal, sugerindo que esta metodologia auxiliará nos estudos e na melhor compreensão da fisiologia das plantas. Bacarin e Mosquin (2002) concluíram que há variação nos parâmetros de fluorescência lenta e rápida das clorofilas por causa do crescimento das plantas, sendo que o comportamento dos parâmetros de fluorescência tem correspondência com a variação na atividade fotossintética das plantas. A análise da cinética de emissão da fluorescência das clorofilas permite o estudo de características relacionadas à capacidade de absorção e transferência da energia luminosa na cadeia de transporte de elétrons, sendo possível, também, estudos de mudanças conformacionais dos tilacóides (KRAUSE; WEIS, 1991). A avaliação durante todo o ciclo de desenvolvimento das plantas pode revelar informações mais precisas, tais como variações nos parâmetros de fluorescência com as mudanças nos estádios de desenvolvimento das plantas (BACARIN; MOSQUIM, 2002). Entretanto, Paul e Planchon (1990) salientaram que os parâmetros determinados pela emissão de fluorescência rápida podem ser explorados para estudos de variabilidade e incompatibilidade genético-fisiológica. Dessa forma, estudos mais específicos, entre cálculos dos coeficientes de extinção por meio de fluorômetro modulado, podem caracterizar possíveis diferenças entre materiais genéticos de produções diferentes. Com base em resultados obtidos de fluorescência máxima das plantas em vários trabalhos, pode-se supor que a reoxidação das plastoquinonas é 8 semelhante. Este fato, pode ser um provável indicador de possíveis mecanismos de controle da fase fotoquímica e bioquímica da fotossíntese, que podem ser semelhantes ou variar no porta-enxerto e no enxerto. A medida fotossintética das folhas com o analisador infra-vermelho de gás, também tem demonstrado ser uma técnica adequada para avaliar a questão da compatibilidade ou incompatibilidade dos enxertos, pois com essas medidas pode-se ter ideia da produção de matéria seca nas plantas, podendo auxiliar na melhor compreensão da incompatibilidade entre enxerto e porta-enxerto e do estresse provocado pela enxertia e a influência da enxertia sobre a assimilação de carbono pelas plantas. É sabido que há influência da enxertia nas trocas gasosas e no transporte de água do sistema radicular até a parte aérea. Brandão Filho et al. (2003) estudaram a influência da enxertia nas trocas gasosas de dois híbridos de berinjela cultivados em ambiente protegido e observaram que a enxertia não alterou a capacidade fotossintética das plantas. Porém, as plantas enxertadas apresentaram maior eficiência no uso de água para os dois híbridos em questão, devido à redução da condutância estomática. Shishido et al. (1995) estudaram o efeito de variedades de porta- enxertos sobre o crescimento do enxerto e transporte de assimilados em berinjela e observaram que diferentes porta-enxertos resultaram na variação de respostas de crescimento. A massa seca e a área foliar foram extremamente maiores em algumas das variedades. As folhas do porta-enxerto translocaram cerca de 35-40% de carbono assimilado para o enxerto, enquanto a translocação de forma inversa foi de 50%. Os fotoassimilados foram translocados através da união da enxertia, sendo a quantidade, dependente do grau de estabelecimento das conexões vasculares. Brandão-Filho et al. (2003), trabalhando com enxertia em berinjela, concluíram que diferentes híbridos utilizados como enxerto interferiram na taxa de assimilação de CO2, podendo ser uma característica importante na determinação de seu potencial produtivo. Durante a enxertia, a formação de espécies reativas de oxigênio (EROs) é comum e atuam na degradação de componentes celulares com perda de suas funções e, consequentemente, à sua morte (BLOKHINA et al., 2003). Porém, as EROs 9 também atuam de forma benéfica participando do sistema de defesa da planta (RESENDE et al., 2003). Como o sistema de defesa é ativado apenas na presença das EROs, é possível verificar o nível de estresse sofrido pela planta avaliando-se algumas substâncias anti-oxidantes como é o caso do sistema de defesa não enzimático, como por exemplo a vitamina C, β-caroteno, compostos fenólicos e poliaminas (SCANDALIOS, 1993). Com relação ao grupo do sistema de defesa enzimático podem ser citadas as enzimas anti- oxidativas, superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), ascorbato peroxidase (APX), glutationa peroxidase (GPX), glutationa redutase (GR) e glutationa S-transferase (GSTs) (MITTLER, 2002). A atividade da peroxidase e a concentração de fenóis apresentam uma grande importância na união entre o enxerto e porta-enxerto, podendo, desta forma, influenciar nas respostas do estresse ao processo de enxertia (RODRIGUES et al., 2002). Para se obter o funcionamento do sistema vascular na união enxerto/porta-enxerto, é necessária à similaridade das peroxidases, tanto no enxerto como no porta-enxerto, para que ocorra a produção de ligninas correlatas. Nas plantas que possuem semelhanças de peroxidases, raramente se encontram problemas de incompatibilidade (SANTAMOUR, 1992). As peroxidases atuam também, na biossíntese de etileno, na lignificação, além da destruição das auxinas, devido ao fato destas se apresentarem em muitas formas moleculares participando de diferentes reações bioquímicas (DENCHEVA; KLISURKA, 1982). Estas enzimas utilizam o H2O2 para oxidar um grande número de doadores de hidrogênio, nos compostos fenólicos; esses participam de vários processos fisiológicos e desenvolvem seu papel na síntese da lignina e na incompatibilidade do enxerto. Na formação da lignina, as peroxidases fornecem H2O2 necessário para a oxidação do ácido cinâmico e convertem o ácido ferúlico em diferúlico, o qual age na ponte de hemicelulose unindo o ácido cinâmico às proteínas e aos carboidratos da parede celular, favorecendo a consolidação (GASPAR et al., 1982). Harkim e Obst (1973) 10 demonstraram a presença de peroxidases nas células lignificadas, sugerindo que estas sejam as únicas enzimas que polimerizam os álcoois em lignina. O uso de dois sistemas radiculares está sendo utilizado, principalmente, para substituir os porta-enxertos convencionais por outros mais resistentes, sendo denominados de subenxertia (MÜLLER et al., 2002). No Japão conseguiu-se aumentar a produção de pomeleiro utilizando-se dois sistemas radiculares (NAKAJIMA et al., 1992). O maior vigor da planta com dois sistemas radiculares também foi encontrado por Girardi (2005) que constatou rejuvenescimento da planta, assim como, maior produtividade. Carvalho et al. (2009) constataram em seu trabalho que plantas com o uso de dois sistemas radiculares possuíam melhor eficiência fotossintética, assim como, maior resistência ao déficit hídrico. A técnica de enxertia que mantém os dois sistemas radiculares é semelhante à encostia, porém, neste caso, elimina-se apenas a parte superior do porta- enxerto desejado, mantendo o sistema radicular do genótipo de interesse (MATIELLO et al., 2004). Matiello et al. (2004) também relataram que esta técnica tem proporcionado melhor desenvolvimento das plantas de café do que aquelas que são enxertadas convencionalmente por garfagem e que esta técnica, pode estar relacionada ao menor estresse sofrido pelas plantas pelo fato de não ocorrer interrupção do transporte de seiva ao longo da planta desejada. Um dos problemas de manter os dois sistemas radiculares pode estar relacionado ao hábito de colonização do patógeno que no caso de colonizar os tecidos vasculares inviabilizaria a técnica. Na cultura do maracujazeiro há relato de três principais patógenos ligados à morte prematura, sendo o Fusarium oxysporym f. passiflorae o único colonizador vascular. Porém, Fischer et al. (2005) constataram que apesar de ter sido relatada a existência do Fusarium oxysporym f. passiflorae, o principal patógeno que tem causado danos à cultura é o Nectria haematococca e este fungo afeta apenas o sistema radicular causando o seu apodrecimento. Desta forma, o uso de dois sistemas radiculares funcionaria como uma segurança ao produtor, pois caso haja a doença no pomar o sistema radicular original da planta morreria e o sistema radicular dito resistente sustentaria a planta. 11 Com relação à qualidade do fruto, esta é resultado do conjunto de atributos físicos e químicos, sendo que as principais características estão relacionadas à aparência, aroma, sabor e textura (CHITARRA; CHITARRA. 1990). Em hortaliças de frutos, Pogonyi et al. (2005) encontraram alterações na qualidade dos frutos e a variedade ou espécie utilizada como porta-enxerto melhorou alguns atributos, ou não, como no caso do tomate quando se comparou frutos provenientes de plantas enxertadas e não enxertadas. Estudando berinjela, Curuk et al. (2009) encontraram valores diferentes também para as características de frutos. Segundo Lee et al. (1999), geralmente, os porta-enxertos são conhecidos por influenciar o crescimento das plantas e produtividade de frutos, porém foi reconhecido que a qualidade dos frutos, assim como o sabor, firmeza da polpa, vida de prateleira, coloração da casca, etc., podem também ser influenciadas pelos porta-enxertos. Uma forma de verificar a qualidade é pelas análises bioquímicas de carboidratos, proteínas e lipídios, porém algumas análises mais específicas, como carotenoides totais, compostos fenólicos (incluindo os flavonoides), poliaminas e vitamina C podem indicar a capacidade antioxidante de um sistema, diferenciando os alimentos. Segundo Lee (1994), dependendo da combinação de enxerto/porta- enxerto, a incompatibilidade e redução da qualidade de frutos podem aparecer. Trata- Mavrona et al. (2000) observaram que as características descritivas e qualitativas dos frutos de melão de plantas enxertadas foram similares às plantas intactas, exceto no sabor e textura, no qual mostrou notável deterioração em algumas combinações de enxerto/porta- enxerto testados. 12 5 MATERIAL E MÉTODOS O trabalho foi elaborado à partir de 3 experimentos: O primeiro consistiu na realização de análises bioquímicas da atividade de enzimas antioxidantes, bem como o estudo de trocas gasosas ao longo do processo de cicatrização da enxertia, o segundo consistiu na comparação da manutenção de dois sistemas radiculares de Passiflora edulis f. flavicarpa Deg. enxertada sobre Passiflora giberti e o método convencional de enxertia, avaliando-se o desenvolvimento inicial das plantas, bem como, os parâmetros de trocas gasosas e fluorescência da clorofila a ao longo da produção das mudas e o terceiro experimento foi conduzido para o estudo da influência dos métodos de enxertia sobre a produtividade e qualidade dos frutos de maracujazeiro, bem como, os parâmetros de trocas gasosas e fluorescência da clorofila a. 5.1 Experimento 1 5.1.1 Localização O experimento foi conduzido em casa de vegetação do Departamento de Horticultura da Faculdade de Ciências Agronômicas do Campus de Botucatu, da Universidade Estadual Paulista – UNESP, Botucatu, SP entre fevereiro e abril de 2012. 13 A análise bioquímica das plantas foi realizada no Laboratório de Bioquímica Vegetal do Departamento de Química e Bioquímica do Instituto de Biociências/UNESP, no distrito de Rubião Júnior – Botucatu, SP. 5.1.2 Preparo das mudas As sementes de Passiflora edulis f. flavicarpa Deg. e P. giberti foram retiradas de frutos maduros coletados em janeiro de 2012 da coleção de germoplasma da APTA – Alta Sorocabana, sendo a semeadura dos dois materiais realizadas em fevereiro de 2012 em bandejas de poliestireno de 200 células preenchidas com substrato comercial a base de casca de Pinus e com características químicas, conforme a Tabela 1. Após 30 dias, as plântulas foram transplantadas em sacolas plásticas com dimensões de 18 x 28 cm e preenchidas com substrato comercial à base de Pinus e enriquecidas com fertilizante de liberação lenta de seis meses, sendo plantado apenas um indivíduo por sacola, com exceção das plantas que foram mantidas os dois sistemas radiculares. Tabela 1. Análise química do substrato utilizado para a produção de mudas de Passiflora edulis f. flavicarpa e Passiflora gibertii. N P2O5 K2O Ca Mg S U-65ºC MO-total C-Total --------------- ** porcentagem ao natural ---------------- 0,6 0,1 0,1 1,0 2,0 0,2 3,0 37,0 20,0 Na B Cu Fe Mn Zn C/N pH -------- mg/Kg ao natural -------- ao natural 272 -- 4 16587 417 66 33/1 6,9 Fonte: Laboratório de análise de solos do Departamento de Recursos Naturais – Unesp, Botucatu-SP. Os dois tipos de enxertia (garfagem e enxertia com manutenção de dois sistemas radiculares) de P. edulis sobre P. giberti foram realizados 30 dias após o transplante, ou seja, em abril de 2012, utilizando-se bisturi e fita de enxertia (parafilme), sendo realizadas 15 cm acima da base da planta, conforme Figura 1. 14 Figura 1. Maracujazeiro sendo enxertado pelo método convencional (A) e maracujazeiro sendo enxertado com permanência de dois sistemas radiculares. 5.1.3 Delineamento experimental O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado em esquema fatorial 3 x 6, três tipos de plantas (plantas não enxertadas (PNE), enxertadas por garfagem convencional (EC) e enxertia com manutenção de dois sistemas radiculares (RD)) e seis épocas de avaliação iniciando um dia após a enxertia em intervalos de três dias (1, 4, 7, 10, 13 e 16 dias após a enxertia), contendo cinco repetições, sendo que cada parcela foi constituída por cinco indivíduos. 15 5.1.4 Coleta do material para as análises enzimáticas As análises de atividades enzimáticas foram realizadas em amostras retiradas na região da enxertia cortando-se 1 cm acima e 1 cm abaixo do local da enxertia e nas plantas não enxertadas as amostras foram retiradas da mesma região, também foram coletadas folhas de cada planta para análise. O material foi congelado em nitrogênio líquido e armazenado em ultrafreezer à -80°C até o momento das análises. 5.1.5 Avaliação enzimática A atividade da superóxido dismutase (SOD) foi determinada, conforme Beauchamp e Fridovich (1971). O sistema de reação foi composto de 50 µL de extrato enzimático, com 2 mL de 50 mmol L-1 de tampão fosfato de sódio, pH 7,8, 450 µmol L-1 da mistura de azul de tetrazólio (NBT) + EDTA 0,66 mmol L-1 (5:4) e mistura de 0,5 mL de 10 mmol L-1 de L-metionina + riboflavina 3,3 mol L-1 (1:1), totalizando um volume de 3,0 mL. Após iluminação dos tubos por dez minutos a 25°C, a redução do NBT foi medida por leituras de absorbância em espectrofotômetro (UV-visível) a 560 nm. A atividade da SOD foi expressa em U g-1 de proteína, sendo que a unidade (U) representa a quantidade de enzima necessária para inibir em 50% a razão de redução do NBT. A análise da atividade da enzima catalase (CAT) foi determinada conforme Kar e Mishra (1976). O sistema de reação foi mantido a 20°C por 120 segundos e foi composto de 150 µL de extrato enzimático contendo 0,1 mol L-1 de tampão fostato de potássio, pH 7,5 contendo 1 mmol L-1 de EDTA e H2O2 20 mmol L-1, num volume final de 3 mL. Após leituras de absorbância a 240 nm, o coeficiente de extinção molar do H2O2 foi utilizado para o cálculo da atividade específica que foi expressa em µmol de H2O2 consumido min-1 g-1 de proteína. A atividade da peroxidase (POD) foi determinada conforme Lima et al. (1999). O sistema de reação foi composto de 1 mL de extrato enzimático com 0,5 mL de 30% de peróxido de hidrogênio em tampão fosfato de potássio 0,2 M (pH 6,7) e 0,5 mL de solução de fenol e aminoantipirina. Em seguida, o sistema de reação foi colocado em 16 banho-maria a 30°C durante 5 minutos, em seguida, colocados em água fervente para paralisar a reação e centrifugados novamente durante 5 minutos a 10.000 rpm sendo o sobrenadante analisado e a leitura de absorbância realizada a 505 nm. A atividade específica da peroxidase foi expressa em µmol de H2O2 decomposto por min-1 g-1 de proteína A atividade da polifenoloxidase (PPO) foi determinada segundo protocolo descrito por Kar e Mishra (1976). O sistema de reação foi composto de 1 mL de extrato enzimático adicionando-se 0,1 mol L-1 de tampão acetato (pH 5,0) e catecol 0,1mol L-1 e colocando-os em banho-maria durante 30 minutos acrescentando ácido perclórico, após este período, para paralisar a reação. A leitura foi realizada em absorbância no espectrofotômetro a 395 nm e a atividade expressa em µmol de catecol oxidado min-1 g-1 de proteína Para as folhas também foi realizada a análise da atividade da ascorbato peroxidase (APX), sendo determinada segundo protocolo descrito por Nakano e Asada (1981). O sistema de reação foi composto de 75 µL de extrato enzimático adicionando-se 100 mM de tampão fosfato de sódio com 1 mM de EDTA, 3 mM de DDT e 4% de PVPP com pH da solução de 7,5. Foi acrescido ao sistema de reação água destilada, ascorbato de sódio 50 mM, e peróxido de hidrogênio 1 mM. A absorbância foi lida à cada 5 segundo, durante o período de 120 segundos à 290 nm, sendo a atividade da APX expressa em µmol de H2O2 decomposto min-1 g-1 de proteína. Foi avaliado o teor de clorofila a, clorofila b, e carotenoides totais nas folhas segundo a metodologia proposta por Sims e Gamon (2002), Para a análise utilizou-se 50 mg de amostra moída e congelada, sendo estas homogeneizadas com 3mL de solução de acetona/Tris-HCl (80:20, 0,2M v:v. pH 7,8), durante 60 segundos. A solução foi centrifugada à 12000 rpm durante cinco minutos e o sobrenadante utilizado para leitura em espectrofotômetro à 663 nm, 647nm 537 nm e 470 nm, sendo os valores obtidos, utilizados nos cálculos para obtenção dos teores de pigmentos conforme as equações abaixo: Clorofila a (µmol ml-1)= 0,01373 A663 - 0.000897 A537 – 0,003046 A647 Clorofila b (µmol ml-1)= 0,02405 A647 - 0.004305 A537 – 0,005507 A663 17 Carotenoides (µmol ml-1)= (A470 - (17.1 x (Clorofila a + Clorofila b) – 9,479 x antocianinas))/119,26. 5.2 Experimento 2 5.2.1 Localização O experimento foi conduzido em casa de vegetação do Departamento de Horticultura da Faculdade de Ciências Agronômicas do Campus de Botucatu, da Universidade Estadual Paulista – UNESP, Botucatu, SP entre o período de fevereiro e julho de 2012. 5.2.2 Preparo das mudas As mudas foram preparadas como descrito no item 5.1.2 5.2.3 Avaliação do crescimento A análise do desenvolvimento das plantas foi realizada avaliando- se as seguintes características: altura da planta, número de folhas, área foliar, massa seca da parte aérea e raízes, comprimento dos entrenós, diâmetro do caule 5 cm abaixo e acima da enxertia e na altura da enxertia. A altura da planta foi avaliada utilizando-se régua graduada medindo-se da base da planta até o ápice caulinar. O comprimento do entrenó foi obtido através da razão entre o número de folhas e a altura da planta e ambos foram expressos em centímetros. 18 Os três diâmetros foram avaliados com utilização de paquímetro digital, sendo expressos em milímetros. A área foliar foi obtida em integralizador de área, Area Meter modelo Li-3100 da Li-Cor e foi expressa em cm2. A massa seca da parte aérea e radicular foi medida separando-se os materiais em sacos de papel identificados e colocados para secar em estufa de circulação forçada de ar a 60°C, até obtenção de massa constante, aferida em balança de precisão com resultados expressos em gramas. Os resultados de área foliar, massa seca total e massa seca foliar foram ajustados simultaneamente em relação ao tempo, através da combinação de equações exponenciais quadráticas e os índices fisiológicos estimados com o aplicativo Anacres (PORTES; CASTRO JÚNIOR, 1991), sendo calculadas a taxa de crescimento absoluto (TCA) em g dia-1, taxa de crescimento relativo (TCR) em g g-1 dia-1, taxa assimilatória líquida (TAL) em g dm-2 dia-1, razão de área foliar (RAF) em dm2 g-1, área foliar específica (AFE) em dm2 g-1 e duração de área foliar (DAF) em dias, razão de massa foliar (RMF) em g g-1 e massa específica foliar (MEF) em g dm2 (BENICASA, 2003). 5.2.4 Trocas gasosas e análise de fluorescência da clorofila As avaliações de trocas gasosas foram realizadas utilizando-se equipamento com sistema aberto de fotossíntese com analisador de CO2 e vapor d’água por radiação infravermelha (IRGA, modelo Li-6400, Li-Cor). Utilizou-se a última folha expandida e as avaliações ocorreram sempre entre as 9 e 11 horas do período matutino em dias com ausência de nuvens. Para o estudo da fluorescência da clorofila a as folhas utilizadas para as medidas de trocas gasosas foram cobertas com folhas de papel alumínio, mantendo-se lacradas durante o período de 30 minutos. As medidas foram calculadas a partir da diferença entre a concentração de CO2 e vapor d’água do ar de referência (valor presente na câmara sem a folha) e da amostra (valor com a folha presente na câmara), obtendo-se as concentrações 19 de vapor d’água e CO2 que serão liberados (transpiração – vapor d’água) e assimilados (assimilação de CO2) pelos estômatos das folhas. As características avaliadas foram: taxa de assimilação de CO2 (A), expressa em µmol de CO2 m-2 s-1, taxa de transpiração (E), expressa em mmol vapor d’água m-2 s-1, condutância estomática (gs), expressa em mol m-2 s-1 e concentração interna de CO2 na folha (Ci), sendo expressa em µmol CO2 mol-1 ar. Os dados coletados foram submetidos ao software de análise de dados do equipamento medidor de fotossíntese através da equação geral de trocas gasosas, descrita por Von Caemmerer e Farquhar (1981). A atividade fotoquímica foi analisada por meio da fluorescência da clorofila a, sendo os dados coletados simultaneamente com os dados de trocas gasosas utilizando-se fluorômetro de luz modulada (Li-6400-40) acoplado ao Li-6400. As características determinadas foram: eficiência quântica potencial (Fv/Fm) e efetiva (ΔF/Fm’) do fotossistema II (FSII), sendo os valores de Fm e Fv representados pela fluorescência máxima e variável determinadas após 30 minutos de adaptação ao escuro e os valores de Fm’ e Fs representados pela fluorescência máxima e no estado de equilíbrio dinâmico na presença de luz e F0’ representando a fluorescência basal, após a excitação do fotossistema I (FSI), coeficiente de extinção fotoquímico (qP) e não-fotoquímico [NPQ = (Fm-Fm’)/Fm’] da fluorescência e a taxa de transporte de elétrons (ETR = DFFF * ΔF/Fm’*0,5*0,84) (BILGER; BJÖRKMAN, 1990). 5.3 Experimento 3 5.3.1 Localização O experimento 3 foi conduzido na fazenda experimental da APTA – Agência Paulista de Tecnologia dos Agronegócios, Polo Alta Sorocabana no município de Presidente Prudente (SP) e as análises de qualidade dos frutos foram realizadas no Laboratório de Pós-Colheita do Departamento de Gestão Agroindustrial da Faculdade de 20 Ciências Agronômicas do Campus de Botucatu, da Universidade Estadual Paulista – UNESP, Botucatu, SP. 5.3.2 Preparo das mudas As mudas foram preparadas como descrito no item 5.1.2. 5.3.3 Condução do experimento O sistema de condução foi o de espaldeira com um fio de arame liso, fixo em mourões de 2,8 m de altura (mais 0,5 m enterrado) espaçados de 5 metros, dessa forma o fio de arame ficou suspenso à 2 m de altura. O espaçamento da cultura foi de 2,5 m entre as plantas por 3,5 metros entre linhas. No primeiro ano de cultivo, o plantio das mudas foi realizado no mês de setembro de 2012 e foram cortadas em julho de 2013 para que em setembro de 2013 novas mudas pudessem ser transplantadas e conduzidas até junho de 2014. O plantio neste período ocorreu em função das condições climáticas, pois, foi o mês em que houve quantidades significativas de precipitação, viabilizando o plantio das mudas sem que houvessem perdas ou necessidade de irrigação (Figura 2) Figura 2. Dados de temperatura e precipitação registrados no período de condução do experimento (setembro/1012 a junho/2014). Presidente Prudente – SP. 21 Antes do plantio foi realizada a análise de solo para verificar a necessidade de calagem e adubação de produção. De acordo com os resultados da análise de solo (Tabela 2) foram efetuadas as recomendações de adubação e calagem para a cultura, segundo Raij et al. (1996). Tabela 2. Análise química de solo antes da correção de pH e adubação de plantio nos dois anos agrícolas, APTA, Presidente Prudente/SP. Ano pH M.O. Presina S Al3+ H+Al K Ca Mg SB CTC V% CaCl2 g dm-3 mg dm-3 _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ mmolc dm-3 _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 2012 4,9 12,3 9,9 5,2 1 26,9 5,3 23,2 6,1 34,5 56,7 61,6 2013 5,2 11,4 6,9 5,2 0 19,1 4,5 19,0 7,2 61,6 49,9 61,5 Fonte: Laboratório de Análise de Solos e Tecido Vegetal. Faculdade de Agronomia – UNOESTE- Universidade do Oeste Paulista, Presidente Prudente/SP. A adubação de formação iniciou após o estabelecimento das mudas obedecendo a recomendação de Piza Junior et al. (1996) utilizando-se sulfato de amônio durante o desenvolvimento inicial até atingir o período produtivo, quando foi realizada adubação com adubo formulado 20-05-20. As mudas foram transplantadas e conduzidas com um único ramo vegetativo (ramo primário) até atingir o fio de arame, sendo as brotações laterais eliminadas. Ao atingir o fio, todos os ramos foram conduzidos para o mesmo lado, deixando-o crescer sobre o fio de arame, sendo que nesta fase, os ramos secundários emitidos não foram eliminados. Para o controle de doenças fúngicas foram efetuados tratamentos preventivos, utilizando-se a mistura de oxicloreto de cobre e mancozeb. As pulverizações foram realizadas sempre no período da manhã para não afetar os insetos polinizadores e a polinização artificial foi realizada entre 14 e 17 horas, sempre que houve a abertura de flores. Para o controle de plantas invasoras foi realizada capina manual na linha e nas entrelinhas foram plantadas Canavalia ensiformis (feijão-de-porco), durante a época de primavera/verão (Figura 3A) e Raphanus sativus (nabo forrageiro), durante as épocas de 22 outono/inverno (Figura 3B), sendo roçadas sempre que necessário, como forma de auxiliar no controle de virose. Figura 3. (A) Canavalia ensiformis na entre linhas da cultura do maracujazeiro. (B) Raphanus sativus na entre linhas da cultura do maracujazeiro. Presidente Prudente – SP. 5.3.4 Delineamento experimental O delineamento experimental adotado foi em blocos ao acaso com três tratamentos (plantas não enxertadas, enxertia por garfagem e plantas com dois sistemas radiculares) com oito repetições, sendo cada parcela constituída por cinco plantas. Para comparação entre os dois anos agrícolas, foi realizada análise conjunta. 5.3.5 Avaliação de produção As avaliações de produção foram realizadas duas vezes por semana, no período da manhã a partir do mês de novembro, quando se iniciou o período de 23 florescimento e frutificação até o mês de junho quando terminou a produção de frutos. Durante esta etapa foram avaliadas as seguintes características: número de frutos, comprimento e diâmetro dos frutos, massa média dos frutos e produção total de frutos por hectare Para a análise do número de frutos foi realizada a contagem de todos os frutos colhidos e para a análise do diâmetro e comprimento dos frutos foi utilizado paquímetro digital e suas medidas utilizadas para classificar os frutos, segundo CEAGESP (2001), sendo os frutos que apresentaram diâmetro equatorial igual ou inferior à 55 mm pertencentes à classe 1, frutos que apresentaram diâmetro equatorial entre 55 e 65 mm foram classificados como pertencentes à classe 2, frutos que apresentaram diâmetro equatorial entre 65 e 75 mm foram classificados como pertencentes à classe 3, frutos com diâmetro equatorial entre 75 e 85 mm foram classificados como pertencentes à classe 4 e frutos com diâmetro equatorial superior à 85 mm foram classificados como pertencentes à classe 5. Já para a avaliação da produção total de frutos, estes foram pesados em balança analítica sendo sua massa expressa em quilogramas. Com relação a massa média dos frutos foi utilizada a razão entre a massa total de frutos por planta e o número total de frutos por planta. 5.3.6 Qualidade dos frutos e potencial antioxidante Durante o mês de março foi realizada a avaliação da qualidade de frutos, pois neste período, há um pico na produção dos frutos. As características avaliadas nesta etapa foram: teor de sólidos solúveis, acidez titulável, relação sólidos solúveis/acidez titulável, potencial hidrogeniônico, firmeza, carboidratos totais e teor de açúcares redutores. Foram avaliados também o rendimento de polpa, assim como a espessura da casca dos frutos. O potencial antioxidante da polpa dos frutos foi realizado através da análise dos seguintes parâmetros: fenóis totais, flavonoides totais, teor de ácido ascórbico, carotenoides totais e determinação da atividade antioxidantes DPPH. A textura foi medida nos frutos inteiros utilizando-se texturômetro Stevens LFRA Texture Analyser, com ponta de prova A 9/1000. A velocidade de 24 penetração foi de 2,0 mm seg-1 a uma profundidade de 5 mm. Os resultados foram expressos em Newton (N). O pH e a acidez titulável (AT) foram determinados conforme as normas do Instituto Adolfo Lutz, publicadas em Brasil (2005). A acidez titulável foi expressa em gramas de ácido cítrico por 100 gramas de polpa, na qual foi medida 10 g de polpa homogeneizados em 100 mL de água destilada e a titulação realizada com hidróxido de sódio 0,1 M. O teor de nitrato foi determinado utilizando-se “medidor compacto de íon”, modelo c-141 da Horiba® e os resultados expressos em ppm. O teor de sólidos solúveis (SS) foi determinado conforme recomendação feita pela A.O.A.C. (1992) com refratômetro digital e os resultados expressos em ºBrix. A determinação de carboidratos totais foi realizada segundo Dubois et al. (1956), extraindo-se em solução aquosa e incubadas em banho-maria durante 40 minutos à 40 °C, sendo as leituras comparadas com a curva padrão de glicose e os resultados expressos em g de glicose 100g-1 de amostra. Os açúcares redutores foram determinados pelo método descrito por Somogyi e adaptado por Nelson (1944), sendo os resultados expressos em porcentagem. O rendimento de polpa foi avaliado retirando-se a polpa com a semente e posterior separação das sementes, sendo determinado pela razão entre a massa da polpa e do fruto multiplicado por 100, sendo o resultado expresso em porcentagem. A espessura da casca foi obtida com auxílio de paquímetro digital e seu resultado expresso em milímetro. A determinação do teor de fenóis totais na polpa de maracujá foi realizada conforme método de Folin-Ciocalteau (SINGLENTON; ROSSI, 1965) e os resultados expressos em g 100g-1 de amostra de acordo com a curva de calibração de ácido gálico. O teor de vitamina C foi determinado pelo teor de ácido ascórbico, no qual 20 g de polpa foram homogeneizados com 20 mL de ácido oxálico a 1% e titulados com solução de 2,6-diclorofenol-indofenol (CARVALHO et al., 1990) e os resultados expressos em mg 100g-1 de amostra. Os flavonoides totais foram determinados conforme método de Awad et al. (2000) e os resultados foram expressos em mg 100g-1 de amostra. Os carotenos totais foram determinados pelo método de Sims e Gamon (2002), sendo os resultados expressos 25 em µg g-1 de amostra. A determinação da atividade antioxidante (DPPH) foi realizada segundo método de Brand-Williams et al. (1995) e os resultados expressos em µg g-1 de amostra. 5.3.7 Trocas gasosas e análise de fluorescência da clorofila As avaliações ocorreram conforme descrito no item 5.2.4. 5.3.8 Análise estatística Os resultados obtidos foram submetidos ao teste de normalidade pelo teste de Shapiro-Wilk e ao teste de homogeneidade das variâncias pelo teste Levene para verificar a necessidade de transformação dos dados e, posteriormente, submetidos à análise de variância (teste F) e as médias comparadas pelo teste Tukey a 5% de probabilidade com auxílio do software S.A.S. para Windows, versão 9.2. 26 6 RESULTADOS E DISCUSSÃO 6.1 EXPERIMENTO 1 – Atividade bioquímica e fotossintética de mudas de maracujazeiro após enxertia No local da enxertia, a atividade da enzima superóxido dismutase (SOD) apresentou comportamento polinomial de terceiro grau para todos os tratamentos, segundo análise de regressão. As mudas de maracujazeiro enxertadas convencionalmente (EC) foram as que apresentaram a maior atividade no local da enxertia, ocorrendo por volta dos 12 dias após a enxertia. As mudas de maracujazeiro com manutenção de dois sistemas radiculares (RD) apresentaram aumento em sua atividade até o sexto dia após a enxertia (DAE), entretanto, com pouca intensidade e decrescendo gradativamente até o décimo quinto dia após a enxertia (Figura 4A). A SOD é a primeira enzima na linha de defesa contra as espécies reativas de oxigênio, dismutando o O2 •- em H2O2 (ALSCHER et al., 2002), sendo encontrada tanto no estroma do cloroplasto como na matriz mitocondrial (MALLICK; MOHN, 2000). A provável origem da alta atividade da SOD em nossos resultados foram as mitocôndrias, devido ao processo de cicatrização, onde a atividade mitótica é elevada e consequentemente a demanda por energia aumenta. A mitocôndria é a principal organela responsável pela geração dessa energia, o que pode sobrecarregá-la e a mesma acaba por produzir grandes quantidades de radicais superóxido sendo necessária a superóxido, sendo necessária a sua degradação que é promovida pela SOD. 27 A atividade da catalase (CAT) apresentou comportamento polinomial de segundo grau para ECs e de terceiro grau para as RDs conforme equação gerada pela análise de regressão. Em ambos tratamentos o aumento de atividade ocorreu aos 16 dias após a enxertia para as ECs e para as RDs, já para as PNEs a atividade permaneceu constante (Figura 4B). A resposta da catalase (CAT) foi posterior ao da SOD em função da CAT ser responsável pela degradação de H2O2 em H2O e O2 (IGAMBERDIEV; LEA, 2002), sendo o H2O2 o produto da reação da SOD com o O2 •-. A atividade da peroxidase em ECs e RDs apresentou comportamento quadrático com o pico de atividade por volta dos 8 e dos 10 dias após a enxertia respectivamente. As PNEs apresentaram comportamento linear crescente, com atividade máxima aos 16 dias após enxertia (Figura 4C). A PPO e a POD são as únicas enzimas em que se observa aumento nas plantas não enxertadas, fato este que pode ser atribuído à participação destas duas enzimas no processo de lignificação que ocorre ao longo do desenvolvimento vegetal (HIRAGA et al., 2001; MAYER; STAPLES, 2002). As polifenoloxidases (PPO) são responsáveis pela oxidação de compostos fenólicos que são substâncias presentes no interior da célula e que participam da defesa da planta. Com o ferimento causado no momento da enxertia há liberação de compostos fenólicos e, consequentemente, ativação das PPOs (ANGELO; JORGE, 2007). Na Figura 4D observa-se que a atividade da PPO nas ECs apresenta resposta já no primeiro dia após a enxertia atingindo o pico aos quatro dias e reduzindo sua atividade ao longo do tempo. As RDs também apresentam atividade máxima aos quatro dias após a enxertia e (Figura 4D). Como a enxertia pelo método convencional (garfagem) é mais invasiva, provavelmente, ocorre maior liberação de compostos fenólicos no início e que são degradados ao longo do tempo. Dessa forma, com a redução da quantidade de fenóis, há redução da atividade das PPOs. A técnica de enxertia utilizada nas RDs é menos invasiva, dessa forma, sua atividade é aumentada de forma menos expressiva comparando-se aos das ECs. 28 Figura 4. (A) Atividade da superóxido dismutase (U g-1 proteína) - SOD, (B) catalase (µmol H2O2 decomposto min-1 g-1 proteína) - CAT, (C) peroxidase (µmol H2O2 decomposto min-1 g-1 proteína) - POD e (D) polifenoloxidase (µmol catecol oxidado min-1 g-1 proteína) – PPO na região da enxertia em P. edulis enxertados convencionalmente sobre P. gibertii (EC), P. edulis com adição do sistema radicular de P. gibertii (RD) e P. edulis não enxertados (PNE) ao longo do tempo de cicatrização da enxertia. A atividade da SOD em folhas das ECs aumentou a partir do sétimo dia após enxertia, atingindo 14 dias conforme equação gerada pela análise de regressão polinomial de terceiro grau. O aumento da atividade da SOD para as folhas de RDs também se iniciam aos sete dias após enxertia e atinge o pico no décimo sexto dia, contudo, de forma menos expressiva (Figura 5A). Como foi observado para a região da enxertia, nas folhas a CAT também apresenta atividade mais tardia com pico aos 16 dias após enxertia, conforme equação gerada pela análise de regressão cúbica (Figura 5B). Nas folhas de maracujazeiros submetidos aos dois métodos de enxertia, houve aumento da atividade da POD logo após a enxertia, apresentando comportamento linear crescente, sendo o pico de sua atividade aos 16 dias após enxertia, já para a atividade da PPO nas folhas de maracujazeiros enxertados convencionalmente, o aumento da atividade ocorreu aos oito dias, entretanto, decresce rapidamente atingindo valor menor que das plantas não enxertadas 16 dias após a enxertia. O aumento e pico de 29 atividade das plantas com dois sistemas radiculares ocorre sete dias após a enxertia e, assim, como ocorre com as plantas enxertadas convencionalmente, as plantas com dois sistemas radiculares diminuem rapidamente sua atividade segundo equação gerada pela análise de regressão quadrática (Figura 5C e Figura 5D). Outra enzima que participa da desintoxicação da célula por H2O2 é a ascorbato peroxidase (APX), que atua convertendo o peróxido de hidrogênio em água utilizando como doador de elétrons o ascorbato (ácido ascórbico ionizado) (SHARMA et al., 2012). A APX, geralmente, atua quando os níveis de H2O2 são relativamente baixos, ou seja, são as primeiras na linha de defesa contra o H2O2, assim como são as mais efetivas (MADHUSHUDHAN et al., 2003). Conforme a Figura 5E, é possível observar que quando se inicia o aumento da atividade da SOD, a atividade da APX também aumenta apresentando, apresentando atividade máxima para os dois tratamentos aos 16 dias após a enxertia. A maior atividade das enzimas estudadas pode estar relacionada ao conteúdo relativo de água (CRA) nas folhas, uma vez que, a técnica da enxertia ocasiona o total desligamento da parte aérea com a parte radicular cessando totalmente o fluxo de água até as folhas até que ocorra a cicatrização e o ligamento dos vasos condutores, novamente, entre as duas partes da planta, dessa forma, as folhas perdem água. Já no primeiro dia após a enxertia há redução do CRA nas folhas de ECs e aos quatro dias após a enxertia observa-se o menor valor de CRA comparando-se às plantas não enxertadas e aquelas com dois sistemas radiculares. Aos dez dias após a enxertia ocorre aumento do CRA, entretanto, ainda apresenta CRA inferior ao dos demais tratamentos. A recuperação total acontece apenas a partir do décimo terceiro dia, conforme a Figura 5F. 30 Figura 5. (A) Atividade da superóxido dismutase (U g-1 proteína) – SOD, (B) catalase (µmol H2O2 decomposto min-1 g-1 proteína) – CAT, (C) peroxidase (µmol H2O2 decomposto min-1 g-1 proteína) – POD, (D) polifenoloxidase (µmol catecol oxidado min-1 g-1 proteína) – PPO, (E) ascorbato peroxidase – APX (µmol H2O2 decomposto min-1 g-1 proteína) e (F) conteúdo relativo de água na folha de P. edulis enxertados convencionalmente sobre P. gibertii (EC), P. edulis com adição do sistema radicular de P. gibertii (RD) e P. edulis não enxertados (PNE) ao longo do tempo de cicatrização da enxertia. A redução no CRA ocasiona o fechamento estomático e, consequentemente, menor entrada de CO2 para ser incorporado, dessa forma, ocorre excesso de energia acarretando em maior produção de espécies reativas do oxigênio (EROs). Um dos primeiros efeitos da produção excessiva de EROs é a degradação dos pigmentos fotossintéticos (LOGGINI et al., 1999). A degradação das clorofilas é um mecanismo que impede a excitação do aparelho fotossintético e, consequentemente, pode 31 prevenir danos pelo fato de haverem poucos aceptores de elétrons entre os fotossistemas em condições de restrição hídrica (FARRANT; KRUGER, 2001). Observa-se que tanto as clorofilas a e clorofilas b apresentam redução em seu teor durante o período em que suas folhas apresentam baixo CRA (Figura 6). Figura 6. Teores de clorofila a (µg g-1 MF), clorofila b (µg g-1 MF), carotenoides totais (µg g-1 MF) e relação clorofila a/clorofila b em folhas de P. edulis enxertados convencionalmente sobre P. gibertii (EC), P. edulis com adição do sistema radicular de P. gibertii (RD) e P. edulis não enxertados (PNE) ao longo do tempo de cicatrização da enxertia. *Colunas indicadas por letras minúsculas iguais não diferem entre si pelo teste Tukey à 5% de probabilidade. A relação clorofila a/clorofila b, geralmente, apresenta valores próximos à 3 em condições normais (STREIT et al., 2005), entretanto, este valor pode variar conforme a espécie estudada. Para este estudo, observa-se que os valores foram próximos à 2, variando apenas aos sete e aos dez dias após a enxertia, onde aos sete, as plantas enxertadas convencionalmente apresentaram valores abaixo dos demais tratamentos e aos dez dias, apresentou valores acima dos demais tratamentos (Figura 6). 32 Os carotenoides são pigmentos acessórios e responsáveis pela coloração amarela, laranjada e o vermelho em frutos, vegetais e flores nas plantas (SILVA et al., 2010). A estrutura básica dos carotenoides confere à esta molécula a propriedade antioxidante, devido à grande quantidade de ligações duplas na cadeia polieno e desta forma, protege as células vegetais contra o ataque, principalmente, do oxigênio singlet, entretanto, podem atuar na proteção contra outros radicais livres (SIKORA et al., 2008). No presente estudo, observa-se que durante o período onde a planta estava sob restrição hídrica os teores de carotenoides totais diminuíram, elevando-se novamente apenas aos 10 dias após a enxertia (Figura 6). Figura 7. (A) Taxa de assimilação de CO2 (A - µmol CO2 m-2 s-1), (B) condutância estomática (gs - mol m-2 s-1), (C) conteúdo interno de CO2 (Ci - µmol CO2 mol-1) e (D) taxa de transpiração (E - mmol H2O m-2 g-1) de mudas de P. edulis enxertados convencionalmente sobre P. gibertii (EC), P. edulis com adição do sistema radicular de P. gibertii (RD) e P. edulis não enxertados (PNE) ao longo do tempo de cicatrização da enxertia. 33 A atividade mais elevada da PPO e da POD nas ECs e nas RDs nos períodos iniciais, provavelmente, está relacionado com o processo de cicatrização entre as duas plantas do que com o estresse sofrido pelo processo de enxertia. Nogueira-Filho et al. (2010), estudando a cicatrização na enxertia entre Passiflora edulis e P. alata, relatam que aos seis dias após a enxertia já havia ocorrido soldadura entre os dois materiais, fato este que coincide com a redução da atividade da PPO no local da enxertia (Figura 4), assim como, é o momento em que as ECs apresentam elevação na taxa de assimilação de CO2 (Figura 7A), condutância estomática (Figura 7B) e na taxa de transpiração (Figura 7D) e redução do conteúdo interno de CO2 (Figura 7C). Segundo os mesmos autores, o espaço entre o enxerto e o porta-enxerto apresenta-se completamente preenchido aos 9 dias após a enxertia, entretanto, de acordo com a Figura 7A, 7B e 7D as ECs passam a ter comportamento semelhante aos da PNEs e RDs apenas aos 13 dias. As RDs apresentam desempenho muito semelhante aos da PNEs, em todos os parâmetros avaliados, a partir do terceiro dia após a enxertia, devido ao fato deste método ser menos invasivo, pois não há desligamento da parte aérea com a parte radicular da planta. Dessa forma, não há interrupção da condução de água, apenas redução em seu fornecimento (Figura 7). Este fato também pode explicar a baixa atividade da SOD para este tratamento (Figura 4). A baixa atividade da SOD, CAT e APX na folha até o décimo dia pode estar relacionado à degradação dos pigmentos (clorofilas a e b e carotenoides totais), sendo que a redução das clorofilas está relacionada à redução na captação de energia. Dessa forma, diminui a geração de EROs e protege todas as estruturas ligadas à fotossíntese (FARRANT; KRUGER, 2001). Já os carotenoides atuam na eliminação das EROs pelo fato de serem oxidadas facilmente por elas (SIKORA et al., 2008), o que explica a sua diminuição até os sete dias após a enxertia e o aumento em seu teor após esse período. Fato que também ocorre aumento na atividade das enzimas estudadas e estas serem o principal meio de neutralização das EROs na planta. Dessa forma, de acordo com os resultados obtidos e nas condições em que o experimento foi conduzido, conclui-se que as ECs sofrem grande estresse no momento da enxertia, sendo necessário cerca de 13 dias para que se recupere. Já as RDs 34 conseguem metabolicamente se ajustar de forma a garantir a integridade, assim como, o funcionamento normal de seu aparato fotossintético. 6.2 EXPERIMENTO 2.1 - Análise de crescimento, desenvolvimento e partição de biomassa em mudas de maracujazeiro enxertadas, com dois sistemas radiculares e não enxertadas Não foi obtida interação significativa para o diâmetro da base caulinar de P. edulis, onde constata-se que há aumento significativo do diâmetro ao longo do tempo, sendo a maior média apresentada pelas plantas não enxertadas (PNE). Em contrapartida, para o diâmetro da base de P. gibertti houve interação, onde observa-se que ao longo do desenvolvimento há incremento no diâmetro, sobretudo para as plantas enxertadas pelo método convencional (Tabela 3). Tabela 3. Diâmetro (mm) da base do caule de mudas de Passiflora edulis enxertadas convencionalmente sobre P. gibertii (EC), P. edulis com adição do sistema radicular de P. gibertii (RD) e P. edulis não enxertados (PNE) ao longo do tempo de cicatrização. Época Diâmetro Base P. edulis Diâmetro Base P. gibertii PNE EC RD Média PNE EC RD Média 15 5,32 - 3,86 4,09 e - 3,41 dA 3,81 cA 3,61 e 30 6,06 - 4,94 5,50 d - 4,07 dB 4,39 bcA 4,23 d 45 6,80 - 5,55 6,17 c - 5,14 cdA 4,40 bcB 4,76 cd 60 7,09 - 6,01 6,55 bc - 5,71 bcA 4,93 abB 5,32 bc 75 7,33 - 6,44 6,88 ab - 6,21 abA 5,46 aB 5,83 ab 90 7,75 - 6,72 7,23 a - 6,59 aA 5,78 aB 6,18 a Média 6,55 A - 5,86 B - 5,18 A 4,79 B F Trat 92,56** 42,64** F Epoc 100,71** 10,36** F Int 1,36ns 3,86** C.V. (%) 8,73 13,41 **Significativo à 1% de probabilidade; ns não significativo. médias seguidas de mesma letra, minúscula na coluna e maiúscula na linha, não diferem significativamente entre si teste Tukey a 5% de probabilidade. 35 Observa-se que o diâmetro da base dos caules das mudas com dois sistemas radiculares apresentaram desenvolvimento reduzido, possivelmente, este fato se deve à necessidade de divisão dos fotoassimilados entre os dois caules e sistemas radiculares. Cavichioli et al. (2011a) também observaram redução do diâmetro do caule na base da planta em P. edulis enxertadas sobre P. gibertii. Já, comparando P. edulis enxertadas sobre P. gibertii não houve alteração. Dessa forma, a redução do diâmetro de P. edulis quando houve sua manutenção após a enxertia, observado neste experimento, demonstra que, possivelmente, não é resultado da enxertia. A altura sofreu interação significativa entre os fatores, onde os dados comportaram-se de forma linear (Figura 8A). O cultivo moderno do maracujazeiro preconiza mudas com altura em torno de 1,8 m (NARITA et al., 2012). Dessa forma, aos 45 dias as plantas não enxertadas e as plantas com dois sistemas radiculares apresentam altura para serem plantadas no campo. Já as plantas enxertadas pelo método convencional atingem altura apenas aos 90 dias, o que causa aumento nos custos de produção pelo tempo de permanência que as mudas necessitam ficar em ambiente protegido (NATALE et al., 2004). 36 Figura 8. (A) Altura da planta de maracujazeiro (cm), (B) diâmetro do caule no local da enxertia (mm), (C) comprimento médio do entrenó (cm), (D) número de folhas e (E) diâmetro do caule acima da enxertia (mm) em plantas de maracujazeiro Passiflora edulis não enxertadas (PNE), enxertadas em P. gibertii (EC) e plantas enxertadas em P. gibertii com manutenção dos dois sistemas radiculares (RD). O diâmetro no local da enxertia aumentou de forma linear para todos os tratamentos, sendo as plantas com dois sistemas radiculares aquelas que apresentaram maior diâmetro e as plantas não enxertadas, apresentaram aumento mais acentuado. Já as plantas enxertadas convencionalmente apresentaram desempenho inferior aos demais tratamentos (Figura 8B), assim como, o diâmetro do caule acima da enxertia (Figura 8E). 37 Um bom indicativo de qualidade de mudas pode ser atribuído ao comprimento médio de entrenó, uma vez que comprimentos muito elevados podem indicar plantas estioladas que compromete o vigor das mudas (CHAGAS et al., 2006). Dessa forma, os maracujazeiros enxertados convencionalmente, inicialmente apresentavam-se estiolados, o que possivelmente pode ser atribuído à retirada total das folhas no momento da enxertia, entretanto, com o tempo houve recuperação e equiparação do comprimento médio do entrenó com os demais tratamentos (Figura 8C). Houve aumento linear para o número de folhas para todos os tratamentos, sendo o comportamento das plantas com dois sistemas radiculares muito semelhante ao das plantas não enxertadas. Já as plantas enxertadas pelo método convencional apresentaram número de folhas reduzido o que provavelmente foi causado pela retirada total das folhas no momento da enxertia, mas o aumento no número de folhas também foi linear, semelhante aos demais tratamentos (Figura 8D). A partição de biomassa observada em plantas não enxertadas (PNE) e com dois sistemas radiculares (RD) apresentam comportamento semelhante, onde no início as folhas eram o órgão com maior massa seca, mas, a partir dos 60 dias, a planta passou a investir mais no crescimento caulinar. As raízes não sofreram alteração ao longo do tempo permanecendo com aproximadamente 20% da massa seca da planta. As plantas enxertadas convencionalmente em função da retirada das folhas no momento da enxertia necessitaram 45 dias para recuperar as folhas e a partir dos 60 dias passou a apresentar o mesmo comportamento dos outros tratamentos, investindo mais no caule (Figura 9). 38 Figura 9. Massa seca foliar (MSF - g), massa seca de caule (MSC – g) e massa seca radicular (MSR – g) de plantas jovens de P. edulis enxertadas convencionalmente sobre P. gibertii (EC), P. edulis com adição do sistema radicular de P. gibertii (RD) e P. edulis não enxertadas (PNE) ao longo do tempo de cicatrização da enxertia. Em condições de fornecimento adequado de água as mudas de maracujazeiro, Suassuna et al. (2010) encontraram, aproximadamente, 60% da biomassa alocada nas folhas, sendo semelhante às plantas não enxertadas e plantas com manutenção de dois sistemas radiculares, entretanto, a raiz foi o órgão com a segunda maior alocação de biomassa apresentando cerca de 32% e apenas 10% da biomassa foi alocada ao caule, diferindo dos resultados encontrados neste experimento, no qual, inicialmente, o caule é o órgão com a segunda maior alocação de biomassa passando a ser o primeiro ao longo do tempo. Durand et al. (1991) destacam que o investimento na formação de sistema radicular ocorre em plantas que apresentam alguma condição limitante. Dessa forma, observa-se que as plantas jovens de maracujazeiro de todos os tratamentos apresentavam condições adequadas de desenvolvimento. As equações ajustadas da massa seca total (MST), área foliar (AF) e massa seca foliar (MSF) e seus respectivos coeficientes de correlação encontram-se na Tabela 4. 39 Tabela 4. Equações de ajustes de massa seca total (MST - g), área foliar (AF – cm2) e massa seca foliar (MSF – g) de plantas jovens de maracujazeiro Passiflora edulis não enxertada e enxertada em P. gibertii, em função do tempo. Tratamentos Medida Equações r Planta não enxertada MST y = (2,22) [(-2,15 10-4)x2 + (5,60 10-2)x] 0,97 AF y = (3,53) [(-2,33 10-4)x2 + (4,70 10-2)x] 0,98 MSF y = (1,37) [(-1,03 10-4)x2 + (4,05 10-2)x) 0,98 Enxertia Convencional MST y = (0,19) [(-1,48 10-4)x2 + (7,15 10-2)x ) 0,97 AF y = (2,05 10-2) [(-8,97 10-4)x2 + (0,16)x] 0,99 MSF y = (8,50 10-3) [(-672 10-4)x2 + (0,14)x] 0,98 Enxertia com dois sitemas radiculares MST y = (0,80) [(-5,07 10-4)x2 + (9,26 10-2)x] 0,99 AF y = (2,54) [(-3,37 10-4)x2 + (6,04 10-2)x] 0,99 MSF y = (0,44) [(-4,24 10-4)x2 + (0,08)x] 0,99 As curvas ajustadas em relação ao tempo estão representadas na Figura 10, pela qual pode-se observar aumento de massa seca total e massa seca foliar lento até os 30 dias após a enxertia, mesmo para plantas não enxertadas e aumento rápido até os 75 dias e após este período, tendência de estabilização para ECs. Já as PNEs e RDs continuam acumulando massa seca até os 90 dias após enxerta. Os maracujazeiros enxertados convencionalmente (EC) apresentam desempenho inferior aos outros dois tratamentos, fato este que pode ser atribuído à necessidade de recuperação, após a desfolha das plantas. No momento da enxertia, entretanto, mesmo não atingindo acúmulo de massa e área foliar semelhante aos outros tratamentos, aos 75 dias, também apresenta estabilização com tendência de redução. A estabilidade no aumento da massa seca e na área foliar pode ter ocorrido em função da maturidade da planta que altera seu metabolismo e passa a investir em sua reprodução (PORTES; CARVALHO, 2009), uma alteração que caracteriza essa transição em maracujazeiro é relacionada à morfologia da folha, sendo as plantas jovens caracterizadas por apresentaram folha simples e as maduras folhas trilobadas, como foi observado neste experimento. Outro aspecto que poderia estar limitando o acumulo de matéria seca seria a limitação do espaço físico que as raízes estavam submetidas causadas pelo tamanho do recipiente. 40 Figura 10. Ajustes de massa seca total (MST - g), massa seca foliar (MSF – g) e área foliar (AF – cm2) de mudas plantas de maracujazeiro Passiflora edulis não enxertadas (PNE), enxertadas em P. gibertii (EC) e plantas enxertadas em P. gibertii com manutenção dos dois sistemas radiculares (RD) ao longo do tempo após enxertia. A taxa de crescimento absoluto (TCA) representa a produtividade primária da cultura (BENICASA, 2003) e a paralização no acúmulo de massa seca e área foliar é resultado de sua redução, sobretudo para as PNEs e RDs a partir dos 60 dias (Figura 11), que é um indicativo da maturação da planta e alteração do estádio vegetativo para o reprodutivo (ZUCARELI et al., 2010). A taxa de crescimento relativo (TCR) indica o aumento de massa seca a partir da pré-existente na planta, havendo redução linear para todos os tratamentos, sobretudo para as RDs que demonstraram declínio mais acentuado (Figura 11). Os valores altos de TCR indicam crescimento rápido, principalmente, o investimento na formação de folhas. Ao longo do tempo, as plantas passaram a investir em outros órgãos não fotossintetizantes, assim como há aumento na atividade respiratória nas folhas com a idade mais avançada, sendo este processo comum em diversas culturas (ALVARES et al., 2005; OLIVEIRA et al., 2005). A taxa assimilatória líquida (TAL) reduziu ao longo do tempo para as RDs. Já para as plantas não enxertadas não foi observada alteração e as ECs apresentaram os valores mais altos no início, decrescendo rapidamente até os 60 dias e após esse período, passou a aumentar novamente (Figura 11). A TAL representa o ganho 41 de massa seca por área foliar ao longo do tempo e a sua redução está ligada, principalmente, com o crescimento da planta e sombreamento das folhas mais basais causadas pelas folhas mais jovens como observado por Povh e Ono (2008) e David e Boaro (2009) estudando sálvia e menta, respectivamente. Mesmo aumentando o número de folhas (Figura 8D) e a área foliar (Figura 10) esperava-se que a TAL de ECs continuassem a reduzir, entretanto, houve aumento após os 60 dias, fato este que pode ser atribuído à maturação das folhas e, consequentemente, ao melhor aproveitamento da energia luminosa por área foliar como observado em bertalha (CAMPOS et al., 2012). Em todos os tratamentos as mudas de maracujazeiro apresentaram redução em sua área foliar específica (AFE) ao longo do tempo (Figura 11). Fato este, normal, pois no início de seu desenvolvimento as mudas apresentam folhas menos espessas e ao longo de sua maturação tornam-se mais espessas em função do acúmulo de fotoassimilados. A massa específica da folha (MEF) também demonstra este acúmulo de fotoassimilados que ocorreu na folha através do aumento nos valores em todos os tratamentos, entretanto, demonstrando maior variação ao longo do tempo (Figura 11). O investimento em folhas também pode ser representado pela razão de massa foliar (RMF) que é um índice fisiológico que indica o acúmulo de massa seca nas folhas. Conforme visto na Figura 9, no início do seu crescimento, as mudas apresentavam grande parte da massa seca acumulada nas folhas e ao longo do tempo, passou a investir em outros órgãos. Dessa forma, observa-se redução de RMF para as PNEs e RDs, já as ECs apresentam aumento acentuado até os 45 dias, quando passa a decrescer novamente. Fato este que ocorre em função da necessidade de formação de folhas, uma vez que, sofreram desfolha no momento da enxertia. A razão de área foliar diminuiu para as PNEs e RDs, fato este atribuído, principalmente, ao sombreamento das folhas mais basais e ao investimento na formação de outros órgãos, sobretudo no caule, conforme a Figura 9. Já as ECs apresentam aumento acentuado até os 60 dias que decai após esse período, chegando a atingir valores semelhantes ao dos demais tratamentos aos 90 dias. 42 Figura 11. Taxa de crescimento absoluto (TCA), taxa de crescimento relativo (TCR), taxa assimilatória líquido (TAL), razão de área foliar (RAF), massa específica de folha (MEF), razão de massa foliar (RPF), área foliar específica (AFE) e duração de área foliar (DAF) de plantas jovens de maracujazeiro Passiflora edulis não enxertadas (PNE), enxertadas em P. gibertii (EC) e plantas enxertadas em P. gibertii com manutenção dos dois sistemas radiculares (RD). 43 O comportamento das PNEs e RDs quanto à duração de área foliar (DAF) foi semelhante, aumentando lentamente até atingir o pico aos 60 dias. Já as ECs apresentaram aumento rápido atingindo o pico aos 30 dias e após este período, passou a apresentar queda até os 60 dias que apresentou aumento na DAF. Segundo Campos et al. (2012), a área foliar depende do número e do tamanho das folhas, assim como o tempo de permanência na planta, sendo a área foliar e a produtividade biológica diretamente proporcional (MONTEIRO et al., 2005). Conforme os resultados obtidos e nas condições em que o experimento foi realizado, as plantas enxertadas convencionalmente necessitam de um tempo maior até se recuperarem, estando cerca de 30 dias atrasadas em relação às demais plantas. Já a enxertia com manutenção de dois sistemas radiculares (RD) parece ser um método promissor devido ao seu comportamento superior às plantas não enxertadas e enxertadas pelo método convencional em muitos aspectos. 6.3 EXPERIMENTO 2.2 – Trocas gasosas e fluorescência da clorofila a em mudas de maracujazeiro enxertadas, com dois sistemas radiculares e não enxertadas A assimilação de CO2 nas mudas de maracujazeiro apresentaram diferença apenas aos 15 dias após a enxertia, sendo as RDs aquelas que apresentaram maiores valores, em contrapartida, as PNEs foram aquelas que apresentaram o pior desempenho e as ECs comportamento intermediário, entretanto, nas demais épocas de avaliação não foi observada diferença significativa (Figura 12). A concentração interna de CO2 e a condutância estomática não sofreram influência da enxertia em nenhuma das épocas de avaliação, apesar da condutância estomática apresentar valores absolutos maiores nos períodos finais de avaliação (Figura 12). Apesar de não ter apresentado diferença significativa, aos 45 e 60 dias após a enxertia, a condutância estomática parece ter influenciado na 44 evapotranspiração, onde as RDs apresentaram os maiores valores aos 45 dias, contudo aos 60 dias as PNEs foram aquelas que apresentaram maior transpiração (Figura 12). Figura 12. Taxa de assimilação de carbono (A - µmol CO2 m-2 s-1), conteúdo interno de CO2 (Ci - µmol CO2 mol-1), condutância estomática (gs - µmol m-2 s-1), taxa de transpiração (E - mmol H2O m-2 s-1), eficiência de carboxilação (A/Ci) e eficiência do uso de água (A/E) em mudas de maracujazeiro Passiflora edulis não enxertadas (PNE), enxertadas em P. gibertii (EC) e plantas enxertadas em P. gibertii com manutenção dos dois sistemas radiculares (RD) ao longo do tempo após a enxertia. A relação entre a quantidade de CO2 assimilado pela quantidade de CO2 presente no interior da folha é responsável por fornecer dados da eficiência de carboxilação (A/Ci) que apresentou alteração entre os tratamentos apenas aos 15 dias após 45 a enxertia, sendo que as RDs apresentaram os maiores valores. Fato este que, provavelmente, ocorreu em função da assimilação de CO2 que apresentou comportamento semelhante (Figura 12). A eficiência do uso da água é a relação entre a quantidade de CO2 assimilado pela quantidade de H2O perdida por transpiração. Neste estudo, ao longo da formação das mudas de maracujazeiro a EUA apresentou diferença entre os tratamentos apenas aos 15 dias após a enxertia e 60 dias, sendo aos 15 dias as PNEs e RDs as plantas que apresentaram melhor desempenho, apesar de que as RDs não diferiram estatisticamente das ECs. Já aos 60 dias, as PNEs foram aquelas que apresentaram pior desempenho, em contrapartida as RDs mantiveram alta eficiência no uso da água (Figura 12). Aos 15 dias as RDs apresentaram alta taxa de assimilação de carbono, entretanto, apresentou também alta taxa de transpiração, o que pode ter sido ocasionado pela alta condutância estomática. Dessa forma, as RDs apresentaram baixa eficiência do uso da água nesse momento, mas melhorando após este período. Segundo Morgado (2011), o P. gibertii apresenta sistema radicular vigoroso, somando ao da P. edulis as mudas apresentam alta capacidade de captação de água, fato este que pode ser observado através das ECs que possuem apenas o sistema radicular do P. gibertii, entretanto, apresentou comportamento semelhante às RDs. Em condições ótimas, as plantas tendem a permanecer o maior tempo possível com os estômatos abertos para que possa captar CO2, dessa forma, ocorre grande perda de água por transpiração e a eficiência do uso de água diminui, entretanto, em condições limitantes as plantas apresentam comportamento contrário (LARCHER, 2005). O fato da maior parte das diferenças ocorrerem apenas 15 dias após a enxertia, provavelmente, pode ser atribuído ao sistema radicular que nas PNEs, provavelmente, apresentavam menor desenvolvimento e, após esse período, igualou de forma que não foram encontradas mais diferenças. Hurtado-Salazar (2013) não encontrou diferença entre os maracujazeiros enxertados sobre P. gibertii e não enxertados para a assimilação de CO2, condutância estomática, transpiração e concentração interna de CO2, entretanto, as avaliações ocorreram a partir dos 128 dias após o transplante. A fluorescência basal, eficiência quântica do FSII (Fv/Fm), eficiência quântica efetiva do FSII (ΦPSII) e taxa aparente de transporte de elétrons não apresentaram alteração entre os tratamentos (Figura 13). 46 O coeficiente de extinção fotoquímica da fluorescência (qP) quantifica a capacidade fotoquímica do PSII indicando a fração de centros de reação do PSII que podem ser reduzidos (MAXWELL; JOHNSON, 2000). Aos 30 dias após a enxertia as ECs apresentaram os maiores valores de qP. Já aos 60 dias, as PNEs passam a apresentar os maiores valores sendo o comportamento do qP muito semelhante aos de assimilação de CO2, sugerindo que a energia absorvida pelos centros de reação está de fato sendo aproveitados na fotossíntese. O quenching não fotoquímico é uma resposta ao excesso de energia luminosa, cuja energia luminosa é convertida em energia térmica e dissipada ao meio diminuindo então a produção de O2*- no fotossistema II (MÜLLER et al., 2001). Para as mudas de maracujazeiro,