unesp UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS – RIO CLARO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS (BIOLOGIA VEGETAL) Fisioecologia de sementes de Miconia chartacea (MELASTOMATACEAE) ocorrente em uma reserva de Cerrado, no município de Corumbataí (SP). DIEGO FERNANDO ESCOBAR ESCOBAR Rio Claro-SP 2014 DIEGO FERNANDO ESCOBAR ESCOBAR Fisioecologia de sementes de Miconia chartacea (MELASTOMATACEAE) ocorrente em uma reserva de Cerrado, no município de Corumbataí (SP). Rio Claro-SP 2014 Trabalho de Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de Rio Claro, como requisito para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas (Biologia Vegetal). Orientador: Prof. Dr. Victor José Mendes Cardoso Escobar, Diego Fernando Fisioecologia de sementes de Miconia chartacea (MELASTOMATACEAE) ocorrente em uma reserva de cerrado, no município de Corumbataí (SP) / Diego Fernando Escobar. - Rio Claro, 2014 88 f. : il., figs., tabs. Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências de Rio Claro Orientador: Victor José Mendes Cardoso 1. Ecologia vegetal. 2. Ecofisiologia. 3. Germinação de espécies nativas. 4. Tamanho de sementes. 5. Pós-maturação. 6. Dormência fisiológica. 7. Banco de sementes. 8. Longevidade ecológica. I. Título. 581.5 E74f Ficha Catalográfica elaborada pela STATI - Biblioteca da UNESP Campus de Rio Claro/SP DIEGO FERNANDO ESCOBAR ESCOBAR Fisioecologia de sementes de Miconia chartacea (MELASTOMATACEAE) ocorrente em uma reserva de Cerrado, no município de Corumbataí (SP). Comissão Examinadora ______________________________________________ Prof. Dr. Victor José Mendes Cardoso (Orientador), UNESP ________________________________________________ Prof. Dr. Fernando Augusto de Oliveira e Silveira, UFMG _________________________________________________ Prof. Dr. Marcelo Polo, UNIFAL Rio Claro-SP, ___ de _______ de ____. Trabalho de Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de Rio Claro, como requisito para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas (Biologia Vegetal). AGRADECIMENTO Ao Prof. Dr. Victor por sua orientação neste caminho, ajuda em campo, laboratório,... A Marcela por sua ajuda em campo e laboratório, e seu apoio constante. Ao Prof. Dr. Massanori Takaki pela ajuda com os testes de germinação no gradiente de qualidade luminosa, e a medição da abertura de dossel. À Prof. Dra. Daniela G. Simão, pela ajuda com a morfologia das sementes. Ao Luís Felipe e Paulo por sua ajuda no laboratório. Ao Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas (Biologia Vegetal) da UNESP, campus de Rio Claro, particularmente aos professores do Departamento de Botânica. A CAPES pelo suporte financeiro. À colônia de hispanófonos que diminuíram a minha saudade, assim como a os amigos brasileiros que me acolheram, especialmente Fabio e Michelle. RESUMO Miconia chartacea é uma Melastomataceae de ampla distribuição no Brasil, ocorrendo no Nordeste, Centro-Oeste, Sudeste e Sul, nos domínios fitogeográficos Caatinga, Cerrado e Mata Atlântica. Além disso, é um recurso importante para as aves frugívoras já que frutifica durante a estação seca, na qual a abundância de frutos carnosos é menor. Embora M. chartacea seja uma espécie nativa de ampla distribuição no Brasil e um recurso importante para a avifauna frugívora, existe um grande vazio no conhecimento da ecofisiologia da germinação e morfologia das sementes da espécie. Nesse sentido, o objetivo geral desta pesquisa foi registrar características morfofisiológicas das sementes de Miconia chartacea ocorrente na reserva de Cerrado “Prof. Karl Arens”, no município de Corumbataí (SP), dados esses que poderão auxiliar na compreensão dos mecanismos de perpetuação de espécies vegetais no Cerrado, bem como agregar informações para bancos de dados sobre a biologia reprodutiva de espécies nativas desse bioma. A massa de matéria fresca das sementes apresentou coeficiente de variação relativamente elevado (33%), e a massa de matéria fresca diminuiu com o aumento da quantidade de sementes por fruto. A maioria dos frutos (60%) tinha duas sementes, seguida por frutos com três sementes (20%) e frutos com 1 e 4 sementes (8% cada). Foram raras as ocorrências de frutos com 5 sementes. As sementes apresentaram tegumento permeável à água, bem como elevado teor de umidade (40%, base massa fresca). Em relação ao armazenamento, as sementes toleraram baixos níveis de umidade e baixas temperaturas aumentam sua longevidade, apresentando, portanto comportamento característico de sementes ortodoxas. São potencialmente capazes de formar bancos de sementes transitórios no solo, já que sua longevidade não ultrapassou 9 meses quando enterradas no campo. Em laboratório, a longevidade de sementes armazenadas a 7°C foi de pelo menos 11 meses. As sementes exibem comportamento fotoblástico, germinando em altas porcentagens sob razões V/VE variando de 0,1 a 1,26. A germinação diminuiu sob irradiâncias inferiores a 17µmol.m-2.s-1. As sementes exibem capacidade de germinar na faixa térmica de 15 a 35 °C, com as temperaturas ótimas ocorrendo no intervalo de 20 a 25 °C. Nenhum regime de alternância térmica testado foi capaz de substituir o requerimento de luz por parte das sementes. As sementes de M. chartacea apresentaram dormência fisiológica não profunda, que foi quebrada com pós- maturação por 93 dias a 7°C e o etileno estimulou a germinação. Além disso, as sementes enterradas durante os primeiros meses de inverno apresentaram maior porcentagem de germinação do que as sementes recém-colhidas, sendo que a dessecação aumentou a porcentagem e taxa de germinação. O grau de dormência variou conforme a data de coleta, sugerindo que a mesma diminui à medida que as sementes são dispersas mais perto do verão. O requerimento de um período de frio para quebrar a dormência diminui a probabilidade de germinação acontecer no inverno, capacitando as sementes a germinarem no verão. A sensibilidade à temperatura, e talvez à umidade, devem ser responsáveis pela distribuição da germinação de M. chartacea ao longo do tempo, enquanto que a resposta à luz deve assegurar que apenas sementes não enterradas germinem. Vários aspectos da historia natural de M. chartarcea, como disseminação durante a estação seca e fria, requerimentos regenerativos, e ampla distribuição, são favorecidos pelas características morfofisiológicas das sementes. A sobrevivência das sementes dispersas durante a estação seca é favorecida pela capacidade de formar bancos de sementes transitórios, que dependem da tolerância à dessecação e baixas temperaturas, assim como do tamanho pequeno das sementes. Além disso, a dormência fisiológica evitaria a germinação no inverno, ao mesmo tempo que a sincronizaria com o verão. Os requerimentos luminosos relativamente amplos evitam a germinação das sementes enterradas, mas permitem a germinação sob condições luminosas tanto no interior da floresta como em locais abertos, embora a germinação seja favorecida por razões V/VE a partir de 0.4. A grande produção de frutos e sementes pequenos, dispersos ao longo da estação seca, a tolerância das sementes às condições estressantes da seca, e a capacidade de germinar sob ampla gama de razões V/VE explicam parcialmente a ampla distribuição da espécie a nível local (várias formações vegetais numa mesma área) e regional. PALAVRAS CHAVE: Tamanho de sementes, pós-maturação, luz, temperatura, dormência fisiológica, banco de sementes, longevidade ecológica, armazenamento. RESUMEN Miconia chartacea es una Melastomataceae de amplia distribución en Brasil, ocurriendo en las regiones Nordeste, Centro-Oeste, Sudeste y Sul, y en los dominios fitogeográficos Caatinga, Cerrado y Mata Atlántica. Además, es un recurso importante para la avifauna frugívora debido a que fructifica durante la estación seca, en la cual disminuye la abundância de frutos carnosos. A pesar que M. chartacea sea una especies nativa ampliamente distribuida en Brasil y un recurso importante para a avifauna frugívora, no hay informaciones sobre la ecofisiologia de la germinación y morfología de semillas para la especie. Por lo tanto, el objetivo general de esta investigación fue registrar características morfofisiológicas de las semillas de Miconia chartacea ocurrente en la reserva de Cerrado “Prof. Karl Arens”, municipio de Corumbataí (SP), esta información puede ayudar a comprender los mecanismos de perpetuación de especies vegetales en el Cerrado, así como alimentar bases de datos sobre la biología reproductiva de especies nativas de este bioma. El peso fresco de las semillas presento un coeficiente de variación relativamente elevado (33%), el peso fresco de las semillas disminuyo con el aumento del número de semillas por fruto. La mayoría de frutos (60%) tenían dos semillas, seguido por frutos con tres semillas (20%) y frutos con 1 e 4 semillas (8% cada uno). Raramente se registraron frutos con 5 semillas. Las semillas fueron permeables al agua, con elevado contenido de humedad (40%, base peso fresco). Con relación al almacenamiento, las semillas toleraran bajos niveles de humedad, e bajas temperaturas aumentan su longevidad, por lo tanto, se comportan como semillas ortodoxas. A especie puede formar bancos de semillas transitorios en el suelo, pues su longevidad ecológica es inferior a nueve meses. Las semillas almacenadas en laboratorio a 7°C se mantuvieron viables durante todo el experimento (11 meses). Las semillas exhiben comportamiento fotoblástico, germinando en altas porcentajes bajo razones R/RL variando de 0,1 a 1,26. Irradiaciones inferiores a 17µmol.m-2.s-1 disminuyen la germinación. Las semillas germinaron en el espectro térmico de 15 a 35°C, con temperaturas óptimas entre 20- 25 °C. El requerimiento de luz para germinar no fue substituido por ninguno de los regímenes de alternancia térmica experimentados. Las semillas de M. chartacea presentaron latencia fisiológica no profunda, que fue rota con almacenamiento seco y frio (7°C) por 93 días, la germinación fue estimulada con etileno. Además, semillas enterradas durante los primeros meses de invierno germinaron en mayor porcentaje que semillas frescas, por otro lado, la desecación aumento porcentaje y tasa de germinación. El nivel de latencia vario conforme la fecha de colecta, sugiriendo que la latencia disminuye a medida que las semillas son dispersadas más próximas del verano. El requerimiento de un período frio para romper latencia disminuye la probabilidad de que la germinación acontezca en el inverno, dejando las semillas susceptibles a germinar en el verano. Sensibilidad a temperatura, e tal vez a humedad, son responsables por la distribución temporal de la germinación de M. chartacea, mientras que la respuesta a la luz debe asegura que solo germinen las semillas que están en la superficie del suelo y no las que están enterradas. Varios aspectos de la historia natural de M. chartarcea, como diseminación durante la estación seca y fría, requerimientos regenerativos y amplia distribución son favorecidos por las características morfofisiológicas de las semillas. La sobrevivencia de las semillas dispersadas durante la estación seca es favorecida por la capacidad de formar bancos de semillas transitorios, que dependen de la tolerancia a desecación y baja temperatura, así como del pequeño tamaño de las semillas. Mientras que, la latencia fisiológica evitaría la germinación en el invierno, a la vez que la sincronizaría con el verano. Los requerimientos luminosos evitan que las semillas enterradas germinen, y al mismo tiempo permiten que las semillas germinen desde condiciones lumínicas típicas sotobosque hasta sitios abiertos, aunque la germinación es favorecida por razones R/RL a partir de 0.4. La gran producción de frutos y semillas pequeños, dispersos durante la estación seca, la tolerancia de las semillas a condiciones estresantes de la sequía, y la capacidad de germinar bajo una amplia gama de razones R/RL explican parcialmente la amplia distribución de M. chartacea local (varias fisionomías en una misma área) y regionalmente. PALABRAS CLAVES: Tamaño de semillas, pos-maduración, luz, temperatura, latencia fisiológica, banco de semillas, longevidad ecológica, almacenamiento. LISTA DE FIGURAS Figura 1. Distribuição de frequência relativa do peso fresco das sementes coletadas em 25/Abril/2012, 06/Junho/2012 e 15/Abril/2013. Figura 2. Distribuição de frequências do peso fresco das sementes segundo o número de sementes por fruto .................................................................................. 24 Figura 3. Relação entre número de sementes por fruto e o peso fresco de cada semente..................................................................................................................... 25 Figura 4. Relação entre número de sementes por fruto e o peso fresco médio das sementes, segundo a data de coleta.. ....................................................................... 26 Figura 5. Relação entre o coeficiente de variação do peso fresco das sementes e o número de sementes por fruto.. ................................................................................ 26 Figura 6. Distribuição de frequência do número de sementes por fruto em quatro coletas, e o valor médio ponderado das coletas. ...................................................... 27 Figura 7. Porcentagem do peso do fruto alocado às sementes conforme o peso do fruto. .......................................................................................................................... 28 Figura 8. Relação entre o peso total e o número de sementes por fruto. .................. 29 Figura 9. Relação entre o amadurecimento dos frutos e a viabilidade, porcentagem e taxa de germinação das sementes.. .......................................................................... 29 Figura 10. Dinâmica de embebição de sementes de M. chartacea escarificadas e intatas. ....................................................................................................................... 30 Figura 11. Variação temporal na porcentagem de sementes com embrião e viáveis durante a época de dispersão nos anos 2012 e 2013. .............................................. 32 Figura 12. Distribuições dos tempos de germinação das sementes conforme a data de coleta em 2012 e 2013.. ....................................................................................... 33 Figura 13. Variação da viabilidade de sementes armazenadas por diferentes períodos no campo em ambientes abertos e fechados e no laboratório a 7°C e 25°C. .................................................................................................................................. 41 Figura 14. Resposta germinativa de sementes armazenadas por diferentes períodos no campo, em ambientes abertos e fechados, e no laboratório a 25 e 7°C (experimento 1).. ....................................................................................................... 42 Figura 15. Resposta germinativa de sementes armazenadas por diferentes períodos no campo, em ambientes abertos e fechados, e no laboratório a 25 e 7°C (Experimento 2). ........................................................................................................ 42 Figura 16. Variação da viabilidade em função do tempo de armazenamento de sementes de M. chartacea armazenadas em condições de campo, em ambientes abertos e fechados (%Vcampo), e em laboratório a 25 C (%V25°C), nos experimentos 1 e 2. ............................................................................................................................ 44 Figura 17. Número de sementes viáveis/m2 conforme as datas de amostragem.. ... 46 Figura 18. Distribuição de frequência do número de sementes viáveis estimadas/m2 nos ambientes aberto e fechado coletadas o 3/Outubro/2012. ................................. 47 Figura 19. Dinâmica germinativa das sementes de M. chartacea com diferentes teores de água sem armazenar. ................................................................................ 49 file:///C:/Users/diego/Desktop/Dissertacao/Disseratacao%20Diego%20Escobar.docx%23_Toc381174073 file:///C:/Users/diego/Desktop/Dissertacao/Disseratacao%20Diego%20Escobar.docx%23_Toc381174073 file:///C:/Users/diego/Desktop/Dissertacao/Disseratacao%20Diego%20Escobar.docx%23_Toc381174084 file:///C:/Users/diego/Desktop/Dissertacao/Disseratacao%20Diego%20Escobar.docx%23_Toc381174084 file:///C:/Users/diego/Desktop/Dissertacao/Disseratacao%20Diego%20Escobar.docx%23_Toc381174087 file:///C:/Users/diego/Desktop/Dissertacao/Disseratacao%20Diego%20Escobar.docx%23_Toc381174087 file:///C:/Users/diego/Desktop/Dissertacao/Disseratacao%20Diego%20Escobar.docx%23_Toc381174087 file:///C:/Users/diego/Desktop/Dissertacao/Disseratacao%20Diego%20Escobar.docx%23_Toc381174088 file:///C:/Users/diego/Desktop/Dissertacao/Disseratacao%20Diego%20Escobar.docx%23_Toc381174088 file:///C:/Users/diego/Desktop/Dissertacao/Disseratacao%20Diego%20Escobar.docx%23_Toc381174088 file:///C:/Users/diego/Desktop/Dissertacao/Disseratacao%20Diego%20Escobar.docx%23_Toc381174088 Figura 20. Viabilidade das sementes de M. chartacea armazenadas por hermeticamente a 25°C e 7°C conforme o tempo de armazenamento. .................... 51 Figura 21. Variação na porcentagem e taxa média de germinação das sementes de M. chartacea em função do tempo de armazenamento a 25°C e 7°C. ..................... 51 Figura 22Porcentagens e taxas médias de germinação de sementes armazenadas em seco a 7°C por 120 dias e recém-colhidas (controle) incubadas sob diferentes temperaturas. ............................................................................................................ 52 Figura 23. Curvas de germinação de sementes de M. chartacea incubadas a 25°C sob luz branca e sementes embebidas mantidas no escuro por 90 dias e depois transferidas a luz branca . ......................................................................................... 60 Figura 24. Variação na porcentagem de germinação das sementes de M. chartacea, incubadas a 25°C sob diferentes irradiâncias. .......................................................... 61 Figura 25. Distribuições dos tempos de germinação e germinação acumulada das sementes de M. chartacea conforme a irradiância. ................................................... 62 Figura 26. Variação no tempo médio de germinação das sementes de M. chartacea conforme a razão V/VE. ............................................................................................ 64 Figura 27. Distribuições dos tempos de germinação de sementes de M. chartacea incubadas a 20°C sob diferentes razões V/VE)......................................................... 65 Figura 28. Variação da porcentagem e taxa média de germinação de sementes de M. chartacea conforme a temperatura. Coleta 19/06/2012. ...................................... 66 Figura 29. Distribuições dos tempos de germinação de sementes de M. chartacea conforme a temperatura.. .......................................................................................... 67 Figura 30. Germinação corrigida das sementes de M. chartacea incubadas sob diferentes regimes térmicos, em duas condições luminosas (luz e escuro). ............. 68 Figura 31. Taxa média e porcentagem corrigida de germinação das sementes de M. chartacea incubadas com luz branca constante sob diferentes regimes térmicos. Barras. ....................................................................................................................... 69 Figura 32. Germinabilidade (% corrigida) de sementes de M. chartacea incubadas a 25°C e luz branca constante, submetidas a diferentes tratamentos com fitorreguladores, aplicados a cada quatro dias ou uma única vez por 6 dias diretos. 70 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Estatísticas descritivas do peso fresco de sementes de Miconia chatacea coletadas em 25/Abril/2012, 06/Junho/2012 e 15/Abril/2013, bem como o total. ...... 23 Tabela 2. Relações entre o estágio de maturação dos frutos e peso fresco do fruto, peso fresco de sementes e teor de umidade das sementes de Miconia chartacea. . 28 Tabela 3. Porcentagem, tempo médio e taxa média de germinação de sementes coletadas em diferentes datas em 2012 e 2013 e incubadas sob luz branca e 25ºC constantes. ................................................................................................................ 32 Tabela 4. Irradiância relativa em ambientes abertos e fechados na estação seca (06/Junho/2012), na transição da estação seca para chuvosa (03/Setembro/2012) e na estação chuvosa (30/Novembro/2012). ................................................................ 39 Tabela 5. Tempo médio de germinação das sementes de M. chartacea armazenadas em condições de campo (ambientes com dossel fechado e aberto) laboratório (7 e 25°C) por diferentes períodos (Experimento 1). ........................................................ 43 Tabela 6. Tempo médio de germinação das sementes de M. chartacea armazenadas em condições de campo (ambientes com dossel fechado e aberto) laboratório (7 e 25°C) por diferentes períodos (Experimento 2). ........................................................ 43 Tabela 7. Análises das taxas de perda de viabilidade (inclinações das regressões lineares) das sementes de M. chartacea conforme o método de armazenamento (Experimentos 1 e 2). ................................................................................................ 45 Tabela 8. Viabilidade e número de sementes viáveis estimadas/m2 de M. chartacea coletadas no começo (3/Outubro/2012) e no final da estação chuvosa (13/Março/2013) ........................................................................................................ 47 Tabela 9. Resposta germinativa à dessecação de sementes de M. chartacea ......... 48 Tabela 10. Resposta germinativa das sementes de M. chartacea com distintos teores de umidade e armazenadas por 93 dias sob baixas temperaturas. ............... 49 Tabela 11. ANOVA de dos fatores comparando a porcentagem de germinação corregidas sementes de M. chartacea conforme o teor de água, temperatura de armazenamento e sua interação. .............................................................................. 50 Tabela 12. ANOVA de dos fatores comparando o tempo médio de germinação corregida das sementes de M. chartacea conforme o teor de água, temperatura de armazenamento e sua interação. .............................................................................. 50 Tabela 13. ANOVA de dois fatores comparando as porcentagens corrigidas de germinação de sementes de M. chartacea conforme o tempo de armazenamento (recém-colhidas e armazenadas por 120 dias a 7°C) e a temperatura de incubação. .................................................................................................................................. 53 Tabela 14. Porcentagem de germinação corrigida no escuro de sementes de M. chartacea armazenadas por 120 dias a 7°C (Armazenadas) e sem armazenar (Controle) sob diferentes temperaturas de incubação. .............................................. 53 Tabela 15. Resposta germinativa das sementes de M. chartacea incubadas a 25°C sob diferentes condições luminosas. ......................................................................... 59 Tabela 16. Resposta germinativa das sementes de M. chartacea, incubadas a 25°C e luz branca com diferentes irradiâncias. .................................................................. 60 Tabela 17. Resposta germinativa das sementes de M. chartacea incubadas a 25°C sob fotoperíodos. ....................................................................................................... 62 Tabela 18. Resposta germinativa de sementes M. chartacea à irradiação com diferentes razões vermelho/vermelho extremo (V/VE) e escuro, incubadas a 20°C. 63 Tabela 19. Comparações ortogonais (teste de Scheffé) do tempo médio de germinação de sementes M. chartacea conforme as razões V/VE. .......................... 64 Tabela 20. Resposta germinativa das sementes de M. chartacea, incubadas a 25°C e luz branca constante, com choque térmico e sem ele (controle). ........................... 69 Tabela 21. Variação do tempo médio de germinação das sementes de M. chartacea incubadas a 25°C e luz branca constante com diferentes fitorreguladores aplicados a cada quatro dias ou uma única vez, por 6 dias corridos. .......................................... 70 SUMÁRIO 1 INTRODUÇAO GERAL.......................................................................................... 15 2 CAPÍTULO 1: ......................................................................................................... 18 MORFOMETRIA, VIABILIDADE E CARACTERIZAÇÃO GERAL DE FRUTOS E SEMENTES ............................................................................................................... 18 2.1 Introdução .......................................................................................................... 18 2.2 Material e métodos ............................................................................................ 19 2.2.1 Área de coleta e implantação de experimentos ................................................ 19 2.2.2 Biometria de Frutos e Sementes ...................................................................... 19 2.2.3 Conteúdo de água, embebição, germinação e inibidores no fruto .................... 20 2.3 Resultados ......................................................................................................... 22 2.3.1 Biometria de frutos e sementes ........................................................................ 22 Peso dos frutos e relação com peso e número de sementes .................................... 27 2.3.2 Conteúdo de água, embebição, germinação e inibidores................................. 29 Dinâmica de embebição e teor de água das sementes ............................................. 30 Inibidores da germinação no fruto ............................................................................. 30 Viabilidade, % embriões e germinação ao longo da época de dispersão ................. 31 3 CAPÍTULO 2: ......................................................................................................... 34 ARMAZENAMENTO, LONGEVIDADE ECOLÓGICA E BANCO DE SEMENTES NO SOLO ........................................................................................................................ 34 3.1 Introdução .......................................................................................................... 34 3.2 Material e métodos ............................................................................................ 35 3.2.1 Armazenamento, longevidade ecológica e banco de sementes no solo .......... 35 3.2.2 Banco de sementes do solo ............................................................................. 37 3.2.3 Comportamento no armazenamento. ............................................................... 38 3.2.4 Pós-maturação ................................................................................................. 38 3.3 Resultados ......................................................................................................... 39 3.3.1 Armazenamento, longevidade ecológica e banco de sementes no solo. ......... 39 3.3.2 Banco de sementes no solo ............................................................................. 45 3.3.3 Comportamento no armazenamento ................................................................ 47 3.3.4 Pós-maturação ................................................................................................. 50 4 CAPÍTULO 3: ......................................................................................................... 54 SENSIBILIDADE DAS SEMENTES DE M. CHARTACEA À LUZ, TEMPERATURA E FITORREGULADORES. ....................................................................................... 54 4.1 Introdução .......................................................................................................... 54 4.2 Material e métodos ............................................................................................ 55 4.2.1 Sensibilidade da semente à luz, temperatura e fitorreguladores. ..................... 55 4.2.2 Resposta germinativa da semente em gradiente térmica, interação luz- temperatura e choque térmico. .................................................................................. 57 4.2.3 Resposta germinativa da semente a fitorreguladores ....................................... 58 4.3 Resultados ......................................................................................................... 58 4.3.1 Sensibilidade da semente à luz. ....................................................................... 58 4.3.2 Resposta germinativa da semente a gradiente térmica, interação luz- temperatura e choque térmico. .................................................................................. 65 4.3.3 Resposta germinativa da semente a fitorreguladores. ..................................... 69 5 DISCUSSÃO GERAL ............................................................................................ 71 6 CONCLUSÕES ...................................................................................................... 82 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................... 83 15 1 INTRODUÇAO GERAL O Cerrado é uma das maiores formações vegetais do Brasil, ocupando cerca de 23% do território nacional. Este Domínio apresenta uma grande riqueza de espécies de plantas lenhosas (pelo menos 774 espécies) e um alto nível de endemismo (43% das espécies). Além disso, a diversidade local (alfa) é baixa, mas a diversidade regional (gama) é alta, apresentando uma alta rotatividade de espécies e uma alta heterogeneidade entre as áreas de Cerrado (Ratter et al., 1997), o que demonstra a importância de estudos em diferentes áreas com esse tipo de formação vegetal. Apesar da importância do Cerrado em extensão, riqueza de espécies e endemismo, mais de 35% da sua cobertura vegetal original foi modificada e isolada por atividades antrópicas (Ratter et al., 1997). Segundo Myers et al,. (2000) o alto nível de endemismo e a perda acelerada de cobertura vegetal original fazem do Cerrado uma zona prioritária de conservação. O clima do Cerrado é marcadamente sazonal, com uma forte estação seca e uma estação chuvosa. A precipitação média para 90% da área do Cerrado vai dos 800 até 2000 mm, e a temperatura média anual está entre 18 e 28°C. Os solos são distróficos, com baixos pH, baixa disponibilidade de cálcio e magnésio, e altos níveis de alumínio. A maioria são oxisois, sempre bem drenados o que favorece o déficit hídrico nas camadas mais superficiais do solo. A fisionomia do Cerrado pode variar desde campos densos com pequenas árvores e arbustos dispersos até arvoretas muito densas com dossel de 12 a 15m de altura e baixa cobertura de gramíneas (Ratter et al., 1997). Acreditava-se que o caráter fortemente sazonal do clima do Cerrado, com uma marcada estação seca, limitava o estabelecimento e a permanência das populações de plantas via plântulas, favorecendo-se a reprodução vegetativa. Mas assim como em outras fisionomias sazonalmente secas, por exemplo, Barro Colorado no Panamá (Garwood 1983), a reprodução sexuada e o estabelecimento de plântulas no Cerrado é comum e envolve mecanismos que permitem este tipo de reprodução nas condições do Cerrado (Laboriau et al., 1964). Garwood (1983) no Panamá encontrou três síndromes de germinação, as quais sincronizam a germinação das sementes com o começo da estação chuvosa permitindo que as plântulas aproveitem quase toda a época de crescimento. Na síndrome tardia chuvosa, as sementes são dispersas na época chuvosa, mas somente germinam na 16 próxima estação chuvosa, permanecendo dormentes no solo. Na síndrome intermediária seca, as sementes são dispersas na seca, permanecendo dormentes no solo até a estação chuvosa, que em geral é próxima. Por fim, a síndrome rápida chuvosa, na qual a frutificação está sincronizada com a época chuvosa, sendo que as sementes são liberadas da planta mãe no início da época chuvosa e germinam rapidamente. Portanto, a dormência primaria das sementes e a sincronização da frutificação com a época chuvosa são mecanismos alternativos que permitem que a reprodução sexuada seja comum e viável em ambientes sujeitos a secas sazonais. Os dados disponíveis do Cerrado indicam que as três síndromes poderiam acontecer, já que em geral as espécies anemocóricas são dispersas na estação seca, e a maioria das zoocóricas são dispersas no início da época chuvosa, mas cerca de 25% destas espécies frutificam na época seca (Oliveira, 1998). Além disso, algumas espécies zoocóricas dispersas na época chuvosa apresentam dormência, enquanto outras germinam rapidamente. Por enquanto ainda faltam trabalhos que permitam uma avaliação mais geral que indique a presença dessas síndromes e sua importância relativa (Oliveira, 1998). Embora trabalhos anteriores tenham mostrado que algumas espécies de Cerrado germinam relativamente bem em condições de laboratório (Felippe e Silva, 1984; Zaidan e Carreira, 2007), ainda se fazem necessários estudos que tratem a germinação de sementes de plantas do Cerrado dentro de uma perspectiva ecológica, valorizando-se a experimentação no ambiente natural. Estudos dessa natureza permitirão cada vez mais compreender o papel da germinação na reprodução de espécies do Cerrado no seu próprio ambiente, principalmente em áreas pequenas e relativamente isoladas. As informações obtidas poderão também vir a auxiliar na compreensão dos mecanismos que permitem a manutenção da diversidade de espécies no Cerrado. A família Melastomataceae encontra-se entre as mais abundantes dentro das fisionomias do Cerrado, particularmente na reserva “Prof. Dr. Karl Arens”, pertencente à Universidade Estadual Paulista Julio de Mesquita Filho, localizada no município de Corumbataí, Estado de São Paulo (Cesar et al., 1988). Dentro da família, o gênero Miconia é o que apresenta o maior número de espécies, sendo 250 17 delas representadas no Brasil (Martins et al., 1996), e pelo menos sete espécies encontradas na reserva Prof. Karl Arens. Miconia chartacea Triana, está entre as seis espécies lenhosas com maior índice de valor de importância (IVI) e apresenta o maior índice de importância para o gênero na reserva de Cerrado “Prof. Dr. Karl Arens” (Pinheiro 2006). Além disso, esta espécie apresenta uma alta abundância de indivíduos em fase reprodutiva na reserva (observação pessoal). Não obstante M. chartacea apresentar alto IVI na reserva e uma distribuição relativamente ampla no Brasil (Nordeste, Centro-Oeste, Sudeste e Sul), nos domínios fitogeográficos Caatinga, Cerrado e Mata Atlântica (Goldenberg 2010), existe um grande vazio no conhecimento da ecofisiologia da germinação e morfologia das sementes da espécie. Portanto, esta pesquisa tem como objetivo geral registrar características morfofisiológicas das sementes de Miconia chartacea (Melastomataceae) ocorrente na reserva de Cerrado “Prof. Karl Arens”, no município de Corumbataí (SP), que possam auxiliar na compreensão dos mecanismos que permitem a perpetuação de espécies vegetais no Cerrado. A dissertação está organizada em três capítulos. No capítulo 1 as sementes foram descritas em termos da distribuição de frequência do peso, número de sementes por fruto, conteúdo de umidade, capacidade de embebição, viabilidade ao longo da frutificação e presença de inibidores da germinação no fruto. No capítulo 2 foi estimada a longevidade ecológica e potencial das sementes, a formação de banco de sementes no solo, a resposta de germinação em função do armazenamento e a possível ocorrência de pós- maturação. No capítulo 3, foi avaliada a resposta das sementes à luz, temperatura e fitorregualdores. Por tratar-se de uma pesquisa de caráter eminentemente prospectivo e descritivo, a mesma não contempla em princípio uma “hipótese de trabalho”, mas algumas hipóteses de cunho ecofisiológicos poderão ser levantadas a partir dos resultados obtidos. Não obstante, espera-se encontrar sementes com forte comportamento fotoblástico – a exemplo de outras Melatomataceae – em condições de laboratório e, portanto, elevada sensibilidade à luz no ambiente natural, o que poderia afetar a distribuição das plântulas dessa espécie. 18 2 CAPÍTULO 1: MORFOMETRIA, VIABILIDADE E CARACTERIZAÇÃO GERAL DE FRUTOS E SEMENTES 2.1 Introdução As características morfológicas das sementes como peso, conteúdo de água, porcentagem de sementes com embrião e capacidade de embebição, afetam direta ou indiretamente a dinâmica da germinação, influenciando a capacidade de enterramento, dispersabilidade, predação, patogêneses, conteúdo de reservas e capacidade de se estabelecer em diferentes ambientes (Dalling 2002; Foster e Janson 1985; Mantilla 2004; Vázquez-Yánes e Orozco-Segovia 1993; Westoby et al. 1990). Segundo Dalling (2002); Foster e Janson (1985); Rockwood (1985), tanto em bosques tropicais como em bosques temperados, existe uma relação entre o tamanho das sementes e as condições de estabelecimento das plântulas. Assim, as espécies pioneiras (sensu Swaine e Whitemore 1988) teriam sementes mais leves que as espécies não pioneiras, embora Foster e Janson (1985) relatem que a distribuição dos pesos médios das sementes na floresta tropical úmida seja unimodal e não bimodal. Espécies pioneiras só podem se estabelecer em clareiras de bosque ou áreas abertas, as quais são muito efêmeras e imprevisíveis no tempo e espaço. Uma estratégia para assegurar uma dispersão bem sucedida e que perpetue a população é aumentar o número de sementes produzidas por individuo, o que implicaria em uma redução do tamanho da semente, aumentando-se assim a probabilidade de que alguma semente alcance uma clareira (Dalling 2002). Outra vantagem que oferecem as sementes pequenas às espécies pioneiras é a facilidade que têm para se enterrar, enquanto que as sementes grandes usualmente requerem agentes externos (Dalling 2002). Saraiva (1993) estudou a biologia reprodutiva de 28 espécies lenhosas na Reserva Karl Arens e encontrou que nove apresentam apomixia e todas elas pertencem a Miconia e Leandra. Segundo Renner (1989) a apomixia é comum em 19 Melastomataceae estando presente em 6 gêneros e 22 espécies no Brasil e na Venezuela. M. chartacea apresenta apomixia, já que 97% dos grãos de pólen são abortivos e a produção de frutos é muito alta (Saraiva 1993). Como consequência da apomixia é comum encontrar sementes maduras sem embrião, portanto, é importante conhecer a porcentagem de sementes com embrião em cada coleta para interpretar adequadamente os ensaios de germinação. O objetivo deste capítulo é descrever características morfofisiológicas das sementes de M. chartacea que podem auxiliar na compreensão da ecologia da germinação e estabelecimento de plântulas no Cerrado. Foi caracterizada a distribuição de peso fresco das sementes, peso dos frutos conforme sua maturidade, número de sementes por fruto, conteúdo de água, capacidade de embebição, viabilidade e frequência de sementes com embrião ao longo da época reprodutiva e presença de inibidores da germinação no fruto. 2.2 Material e métodos 2.2.1 Área de coleta e implantação de experimentos As coletas de frutos e os experimentos no campo foram realizados na reserva de Cerrado “Prof. Karl Arens”, no município de Corumbataí, Estado de São Paulo (22º 15´ S e 47º 00´W). Essa reserva é um remanescente de Cerrado com área de 38,7ha, que foi doado ao Instituto de Biociências da Unesp, campus de Rio Claro, em 1995. A área abriga cerrado stricto sensu (s.s.) e cerradão, e desde 1962 não foram registrados incêndios no local (Pinheiro 2006). O remanescente apresenta clima tropical úmido, com um período seco e frio desde abril até setembro e um período chuvoso e quente se estendendo de outubro a março. A temperatura e precipitação médias no município (anos 1941 a 1970) foram 22°C e 1342mm, respetivamente, segundo os dados do Núcleo de Monitoramento Macroclimático (NURMA), do Departamento de Física e Meteorologia da Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz – USP (Pinheiro 2006). 2.2.2 Biometria de Frutos e Sementes Foram avaliadas as seguintes características morfometricas das sementes: a) distribuição de frequência do peso fresco de sementes individuais, a partir de três 20 amostras de 272, 227 e 203 sementes, respectivamente, retiradas aleatoriamente das coletas realizadas em 25/Abril/2012, 06/Junho/2012 e 15/Abril/2013; b) distribuição de frequência do número de sementes por fruto, a partir de coletas feitas em 8/Maio/2012, 6/ Junho /2012, 19/ Junho /2012 e 15/ Abril /2013, totalizando 390 frutos; c) relação entre peso das sementes e número de sementes por fruto, feita com 524 sementes das quais 227 foram coletadas em 6/ Junho /2012, 94 em 19/ Junho /2012 e 203 em 15/ Abril /2013. Em todos os casos foram utilizadas sementes recém-extraídas dos frutos. O peso fresco dos frutos em diferentes estágios de maturidade (imaturo, intermediário e maduro) foi estimado a partir de três amostras de 120, 106 e 120 frutos, respetivamente. O peso fresco das sementes nos diferentes estágios de maturidade foi estimado por intermédio da pesagem individual de 94 sementes correspondentes a cada estágio. O teor de umidade das sementes foi calculado com base na massa de matéria fresca, utilizando-se três repetições de 1,5g cada, as sementes foram secas por 24h em forno a 103±2°C. Foram utilizados frutos armazenados por dois dias e sementes recém-extraídas a partir da coleta realizada em 19 de Junho de 2012. Para saber se o peso do fruto é afetado pelo peso e número de sementes por fruto, e se o investimento no peso total de sementes varia com o peso do fruto, foram feitas regressões do peso do fruto sobre o peso médio das sementes (n=41 frutos); peso do fruto sobre o número de sementes por fruto (n=90 frutos); e peso do fruto sobre a porcentagem do peso do fruto alocado a massa de sementes (n=70 frutos). A porcentagem do peso do fruto alocado à massa de sementes foi obtida dividindo-se o peso fresco de todas as sementes do fruto pelo peso fresco do fruto, e depois multiplicando-se por 100 . Foram utilizados frutos e sementes recém-colhidos da coleta feita em 19 de junho de 2012. 2.2.3 Conteúdo de água, embebição, germinação e inibidores no fruto. Foi registrada a porcentagem corrigida e taxa média de germinação das sementes em três estágios de maturidade (imaturo, intermediário e maduro), a porcentagem corrigida foi obtida dividindo a porcentagem de germinação bruta pela viabilidade máxima do lote e multiplicando por cem [%G corrigida=(%G bruta/%Viabilidade máxima do lote)*100]; a taxa média de germinação foi calculada 21 conforme Ranal e Santana (2006). Os ensaios foram realizados sob luz branca constante e 25ºC, sendo utilizadas quatro repetições de 25 sementes cada. As sementes que não germinaram foram submetidas a teste de tetrazólio a 1% para avaliar a porcentagem de viabilidade em cada estágio de maturidade. O teste de tetrazólio foi feito embebendo por 24-48h a 30°C em solução de tetrazólio a 1% no escuro sementes cortadas transversalmente, considerando-se viáveis as sementes coradas de rosa escuro a vermelho. A dinâmica de embebição foi descrita para sementes escarificadas mecanicamente com lixa e para semente intactas, sendo utilizadas quatro réplicas de 74 sementes por tratamento. As sementes foram mantidas a 25°C sob luz branca contínua, em caixas de germinação (gerbox), sobre duas folhas de papel filtro umedecido e cobertas com uma folha umedecida com água destilada. Foi registrado o aumento porcentual de peso fresco (P%) das sementes nos intervalos de tempo usando-se a fórmula: P% = [(P2-P1)/P1].100, onde P1 e P2 representam os pesos frescos nos tempos t1 e t2, respectivamente. O teor de umidade das sementes recém-extraídas, coletadas em 19/Junho/2012 e em 15/Abril/2013, foi calculado em base na massa fresca (como descrito anteriormente), utilizando três repetições de 1,5g cada. Para testar se os frutos de M. chartacea apresentam inibidores da germinação, foi realizado um bioensaio de germinação com sementes de alface (quatro placas de Petri com 30 sementes cada), usando-se como tratamento 2mL por placa de extrato aquoso dos frutos (50%) e tendo como controle água destilada. O extrato foi obtido esmagando manualmente os frutos (cerca de 60) através de tecido de algodão e diluindo o sumo com água destilada. O bioensaio foi mantido sob luz branca constante à temperatura de 25ºC. O experimento foi acompanhado por 36 dias registrando-se a porcentagem de germinação final e o número de plântulas normais (ISTA 1999). As porcentagens de viabilidade e de sementes com embrião foram registradas para cinco coletas realizadas em 2012 (08/Maio, 06/Junho, 19/Junho, 01/Agosto e 03/Setembro) e três em 2013 (15/Abril, 15/Maio e 21/Maio). Ditas coletas abrangeram a época de disseminação no local de estudo em cada ano. A porcentagem de viabilidade foi medida como o número de sementes com embriões 22 corados de vermelho pelo sal de tetrazólio (1%) dividido pelo número total de sementes na repetição. A porcentagem de sementes com embrião foi medida como o número de sementes com embrião, dividido pelo número total de sementes na repetição. Na coleta de 08/Maio/2012 foram feitas três repetições de 30 sementes cada, ao passo que nas outras coletas foram utilizadas quatro repetições de 30 sementes cada. As porcentagens de germinação bruta e corrigida, assim como a taxa e o tempo médios de germinação (calculados conforme Ranal e Santana, 2006) foram registrados para seis coletas em 2012 (24/Abril, 08/Maio, 06/Junho, 19/Junho, 01/Agosto e 03/Setembro) e duas em 2013 (15/Abril e 21/Maio). Considerou-se como germinação bruta o número de sementes germinadas dividido pelo número de sementes na repetição, e germinação corrigida como a porcentagem de germinação em relação à viabilidade máxima do lote. Nas coletas de 24/Abril/2012, 08/Maio/2012, 06/Junho/2012 e 19/Junho2012, foram feitas quatro repetições de 25 sementes cada, enquanto que nas coletas de 01/Agosto/2012, 03/Setembro/2012, 15/Abril/2013 e 21/Maio/2013 foram feitas cinco repetições de 30 sementes cada. Foram utilizadas sementes com até sete dias de armazenamento, exceto nas sementes coletadas em 08/Maio/2012, que foram armazenadas por 30 dias em sacolas de papel em laboratório, à temperatura de 25ºC. 2.3 Resultados 2.3.1 Biometria de frutos e sementes O peso fresco médio e médiano das sementes variou de 0,0157 a 0,0183g e a moda de 0,0149 a 0,0194g (Tabela 1). Nas coletas de abril e junho de 2012, as sementes com peso entre 0,0136 e 0,0192g apresentaram a maior frequência relativa (Figura 1). Já nas sementes coletadas em abril de 2013 os pesos frescos mais frequentes estiveram entre 0,015 e 0,0219g (Figura 1). Levando-se em consideração as três coletas, 50% das sementes pesaram entre 0,015 e 0,0205g (Figura 1). O peso fresco das sementes de cada coleta, assim como o total dos dados, seguiu uma distribuição contínua unimodal que diferiu da normalidade (Kolmogorov- Smirnov, P=0,045). As curtoses e assimetrias são levemente positivas nas coletas 23 de abril e junho de 2012 e nos dados agrupados. Portanto, os pesos frescos estão mais concentrados em torno da média do que na distribuição normal, além de apresentar uma cauda à direita (Fig.1 e Tabela 1). Entretanto, as sementes coletadas em abril de 2013 apresentaram a maior curtose e o coeficiente de assimetria mais perto de zero (o único negativo), assim em dita coleta o peso das sementes esteve mais concentrado entorno da média e com maior proporção de sementes pesadas (peso maior ao peso médio) que nas outras coletas. Além disso, o peso fresco das sementes desta coleta é estatisticamente maior do que nas outras duas (Kruskal-Wallis, p<0,001). Tabela 1. Estatísticas descritivas do peso fresco de sementes de Miconia chatacea coletadas em 25/Abril/2012, 06/Junho/2012 e 15/Abril/2013, bem como o total. Peso sementes (g) Total 25/04/2012 06/06/2012 15/04/2013 Média 0.0165 0.0157 0.0157 0.0183 Erro padrão 0.0002 0.0003 0.0004 0.0003 Médiana 0.0165 0.0157a 0.0158a 0.0188b Moda 0.0149 0.0179 0.0161 0.0194 Desv. Padrão 0.0054 0.0050 0.0060 0.0049 Curtose 0.3156 0.3889 0.4152 0.6912 Assimetria 0.2352 0.2938 0.4749 -0.0404 Mínimo 0.0025 0.0025 0.0031 0.0048 Máximo 0.0358 0.0323 0.0358 0.0340 N 702 272 227 203 Coef. Var. % 33.07 31.56 38.37 27.02 Letras diferentes indicam diferenças altamente significativas (Kruskal-Wallis, p<0,001). A distribuição de frequência do peso fresco das sementes variou conforme o número de sementes por fruto (Fig. 2). Por exemplo, nos frutos que têm uma semente o peso delas variou de 0,018 até 0,036g, enquanto que frutos com quatro sementes apresentaram sementes cujo peso variou de 0,004 até 0,018g (Fig. 2). O pico de peso fresco variou com o número de sementes por fruto, ou seja, a moda foi 0,009g em frutos com quatro sementes; 0,012g em frutos com três; 0,021g em frutos com duas e 0,03g em frutos com uma única semente (Fig. 2). A distribuição de frequências de peso fresco das sementes (total de sementes) esteve muito influenciada pela abundância relativa dos frutos que apresentaram uma, duas, três ou quatro sementes, assim as sementes que provinham de frutos que têm duas sementes (a maioria dos casos, com cerca de 60%, Fig. 6) ditam a tendência geral da distribuição de frequências de peso fresco das sementes, entretanto a baixa 24 proporção de frutos com somente uma semente (Fig. 6) explicaria a cauda à direita da figura 2. Figura 2. Distribuição de frequências do peso fresco de sementes de Miconia chartacea segundo o número de sementes por fruto. N=524 0 10 20 30 40 50 60 0 .0 0 4 0 .0 0 5 0 .0 0 7 0 .0 0 8 0 .0 0 9 0 .0 1 1 0 .0 1 2 0 .0 1 4 0 .0 1 5 0 .0 1 6 0 .0 1 8 0 .0 1 9 0 .0 2 1 0 .0 2 2 0 .0 2 3 0 .0 2 5 0 .0 2 6 0 .0 2 7 0 .0 2 9 0 .0 3 0 0 .0 3 2 0 .0 3 3 0 .0 3 4 0 .0 3 6Fr e q u ê n ci a a b so lu ta ( n ° se m e n te s) Peso semente (g) 1 sem./fruto 2 sem./fruto 3 sem./fruto 4 sem./fruto total Fr eq uê nc ia 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Total 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 0 .0 0 2 5 0 .0 0 5 3 0 .0 0 8 1 0 .0 1 0 8 0 .0 1 3 6 0 .0 1 6 4 0 .0 1 9 2 0 .0 2 1 9 0 .0 2 4 7 0 .0 2 7 5 0 .0 3 0 3 0 .0 3 3 0 25/04/2012 0 .0 0 2 5 0 .0 0 5 3 0 .0 0 8 1 0 .0 1 0 8 0 .0 1 3 6 0 .0 1 6 4 0 .0 1 9 2 0 .0 2 1 9 0 .0 2 4 7 0 .0 2 7 5 0 .0 3 0 3 0 .0 3 3 0 0 .0 3 5 8 6/06/2012 15/04/2013 Peso fresco Figura 1. Distribuição de frequência relativa do peso fresco de sementes de Miconia chatacea coletadas em 25/Abril/2012, 06/Junho/2012 e 15/Abril/2013. N=702 25 Considerando-se que a distribuição de frequências do peso fresco das sementes variou conforme o número de sementes por fruto (Fig. 2), isso explicaria a diferença no peso fresco das sementes em relação ao número de sementes por fruto; ou seja, à medida que aumenta o número de sementes por fruto diminui o peso de cada semente (Figura 3). A correlação negativa entre peso das sementes e número de sementes por fruto foi estatisticamente significativa (p<0,001) e tal relação se apresentou nas três coletas (6/Junho/12, 19/Junho/12, e15/Abril/13; Figura 4). Além disso, o coeficiente de variação do peso fresco das sementes aumentou com o número de sementes por fruto (p<0,001; Figura 5), o que pressupõe que frutos com mais sementes apresentaram uma maior heterogeneidade no peso das sementes. A relação entre peso das sementes e número de sementes por fruto (Figura 3) e a distribuição heterogênea da frequência de frutos com diferente número de sementes (Fig. 6) ajuda a explicar o coeficiente de variação de peso de sementes relativamente alto (Tabela 1). Figura 3. Relação entre número de sementes por fruto e o peso fresco de cada semente de Miconia chartacea. N=524, p<0,001. y = -0.0048x + 0.0287 R² = 0.4017 0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.035 0.04 0 1 2 3 4 5 P e so f re sc o s e m e n te s (g ) sementes por fruto 26 Figura 4. Relação entre número de sementes por fruto e o peso fresco médio de sementes de Miconia chartacea, segundo a data de coleta. N=524, F<0,001. Figura 5. Relação entre o coeficiente de variação do peso fresco das sementes e o número de sementes de Miconia chartacea por fruto. N=524, F<0,001. Baseado em quatro coletas (8/Maio/2012, 6/Junho/2012, 12/Junho6/2012 e 15/Abril/2013), a distribuição de frequência do número de sementes por fruto não foi homogênea (2<0,001). Assim, os frutos com duas sementes foram os mais comuns, representando perto de 60% dos frutos, seguidos dos frutos com três sementes (20%) e frutos com uma e quatro sementes (ca. 8% cada) (Fig.6). Além disso, o 27 número de sementes por fruto não variou com o peso dos frutos (Anova, p=0,089), sendo os frutos com duas sementes os mais comuns, independentemente do peso. Frutos com cinco sementes ocorreram apenas na coleta de maio de 2012, representando menos de 2% dos frutos. As coletas não diferiram entre si quanto às distribuições de frequência de número de sementes por fruto. Figura 6. Distribuição de frequência do número de sementes por fruto de Miconia chartacea em quatro coletas (barras), e o valor médio ponderado das coletas (Total, linha). N=390 Peso dos frutos e relação com peso e número de sementes O peso dos frutos aumentou com o amadurecimento (Anova, P<0.001), enquanto que o conteúdo de umidade das sementes diminui (Anova, P=0.001) (Tab. 2). O aumento de peso dos frutos deve-se mais ao aumento da polpa (peso fresco da polpa) do que ao aumento do peso das sementes. De fato, nos frutos maduros o peso e quantidade das sementes não estão relacionados com o peso dos frutos (p>0.78), entretanto, frutos mais pesados apresentaram maior investimento relativo em polpa do que frutos mais leves (p=0.001, Fig.7), sendo que tal padrão foi mantido independentemente do número de sementes por fruto. 28 Tabela 2. Relações entre o estágio de maturação dos frutos e peso fresco do fruto, peso fresco de sementes e teor de umidade das sementes de Miconia chartacea. Estágio do fruto Peso frutos (g) Peso sementes (g) Teor umidade sementes % Verde 0.062a 0.0195a 43.63a Intermediário 0.083b 0.0187a 45.32a Maduro 0.144c 0.0172b 40.13b Letras diferentes indicam diferenças altamente significativas (Tukey) Figura 7. Porcentagem do peso do fruto alocado às sementes conforme o peso do fruto de Miconia chartacea. N=70 Como já foi dito, o peso de cada semente diminuiu conforme aumentou o número de sementes por fruto (Fig. 3), entretanto, o peso total das sementes por fruto (o investimento do fruto na massa total de sementes) aumentou com o número de sementes por fruto (P<0,001; Fig. 8). 29 Figura 8. Relação entre o peso total e o número de sementes por fruto de Miconia chartacea. N=70 2.3.2 Conteúdo de água, embebição, germinação e inibidores. O conteúdo de água das sementes diminui com o amadurecimento (Anova, P=0.001), sendo que sementes de frutos imaturos e intermediários apresentaram conteúdo de umidade entre 43 e 45% (não diferem entre si estatisticamente), enquanto que sementes de frutos maduros apresentaram conteúdo de umidade menor (entre 39 e 41%) do que o de outros estádios. Entretanto, a viabilidade, velocidade e porcentagem de germinação não apresentaram diferenças estatísticas (Kruskal-Wallis, P<0.1) com o amadurecimento (Fig. 9). Figura 9. Relação entre o amadurecimento dos frutos e a viabilidade (●), porcentagem (barras) e taxa de germinação (□) das sementes de Miconia chartacea. Os intervalos indicam o erro padrão. 0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 0.030 0.035 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 imaturo intermedio maduro Ta xa d e g e rm in aç ão ( d -1 ) □ G e rm in aç ão c o rr ig id a (% ) V ia b ili d ad e ( % ) ● Estágio de maturidade dos frutos 30 Dinâmica de embebição e teor de água das sementes As sementes escarificadas e intatas de M. chartacea não diferem em termos de dinâmica de embebição (Kruskal-Wallis, P=0.432). Nas primeiras 20 horas as sementes embeberam rapidamente (aumento de peso fresco entre 32 e 36%), mas entre 20 e 123 horas o aumento de peso foi da ordem de 6 a 8%, ou seja, numa taxa menor. Após 123 horas o peso das sementes se estabilizou (Figura 10). O teor de água das sementes recém-extraídas (coletadas em 19/Junho/2012 e em 15/Abril/2013) foi de 40,1±1,2 e 41,7±0,7, respetivamente. Figura 10. Dinâmica de embebição de sementes de M. chartacea escarificadas e intatas. Inibidores da germinação no fruto A porcentagem de germinação das sementes de alface incubadas com água destilada (88±5.8%) foi significativamente maior (t-student, p<0.001) do que a das sementes incubadas em extrato aquoso de frutos de M. chartacea (21.7±11%). Além da baixa porcentagem de germinação das sementes incubadas em extrato aquoso, tais sementes somente começaram a germinar após 22 dias do início do teste, enquanto que as sementes do controle germinaram em dois dias. As plântulas mantidas no extrato aquoso apodreceram após a germinação e nenhuma chegou ao estágio de plântula normal, ao passo que 80% das sementes incubadas em água destilada atingiram a estágio de plântula normal. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 A u m e n to d e p e so f re sc o ( % ) Tempo (h) Escarificadas Intatas 31 Viabilidade, % embriões e germinação ao longo da época de dispersão. As sementes coletadas em 2012 apresentaram uma viabilidade de 53,8±8.6%, enquanto que a viabilidade das sementes coletadas em 2013 foi de 42,8±13.8%. Das sementes coletadas em 2012, 62.9±12.3% possuíam embrião, enquanto que nas coletas realizadas em 2013, 43.3±13.1% apresentaram embrião. A porcentagem de sementes viáveis e com embrião foi significativamente maior em 2012 que em 2013 (t-student, p=0,014 e p<0,001, respetivamente). A porcentagem de sementes com embrião aumentou desde o começo (Abril) até o fim do período de frutificação (Setembro, em 2012, e Junho em 2013) (F, p<0.008; Fig. 11c, d). Entretanto, a viabilidade não diferiu entre as coletas realizadas em 2012 (F, p=0.135), mas diferiu entre as de 2013 (F, p<0.001; Fig. 11a, b), com as sementes liberadas no fim da época de dispersão apresentando maior viabilidade. A porcentagem de germinação (bruta e corrigida) não diferiu significativamente entre coletas em 2012 e 2013, e não apresentou nenhuma tendência clara. Entretanto, o tempo médio de germinação tende a diminuir à medida que a data de coleta se aproxima do verão, mas a correlação não foi significativa (Pearson -0.189; p=0.356; coletas de 2012), sendo que em nenhuma coleta o tempo médio de germinação foi menor do que 30 dias. As duas coletas de 2013 não diferiram quanto ao tempo médio de germinação (t; p=0.258; Tab. 3). 32 Figura 11. Variação temporal na porcentagem de sementes de Miconia chartacea com embrião e viáveis durante a época de dispersão nos anos 2012 (a,c) e 2013 (b,d). As regressões lineares (b, c, d) são altamente significativas. Tabela 3. Porcentagem, tempo médio e taxa média de germinação de sementes coletadas em diferentes datas em 2012 e 2013 e incubadas sob luz branca e 25ºC constantes. Data coleta Germinação bruta (%) Germinação corrigida (%) Tempo médio germinação (d) Taxa média germinação (d-1) 24/04/2012 41.0±13.2 a 64.1±20.7 a 53.1±6.6 a 0.019±0.003 a 08/05/2012 30.0±2.3 a 46.9±3.6 a 38.7±3.4 bc 0.026±0.002 bc 06/06/2012 39.0±7.6 a 57.4±11.1 a 39.9±5.5 bc 0.025±0.003 bc 19/06/2012 46.0±14.8 a 69.0±22.2 a 35.8±2.8 bc 0.028±0.002 bc 01/08/2012 45.3±13.0 a 71.5±20.6 a 33.3±2.1 c 0.030±0.002 c 03/09/2012 37.5 ± 5.27 a 62.5 ± 8.9 a 43.6 ± 9.5 ab 0.02 ± 0.005 ab 15/04/2013 26.7±8.5 a 72.7±23.2 a 36.6±5.7 b 0.028±0.004 b 21/05/2013 34.7±9.6 a 57.8±16.0 a 33.4±3.7 b 0.030±0.003 b Letras diferentes indicam diferenças altamente significativas (Tukey, p<0,05). A distribuição dos tempos de germinação das sementes coletadas em 2012 e 2013, incubadas sob luz constante e 25°C, exibiu um padrão multimodal (germinação intermitente), com uma elevada dispersão da germinação no tempo e, portanto uma alta assincronia (Fig. 12). a c d Vi ab ili da de (% ) Se m en te s co m e m br iã o (% ) (% )(% ) ( % ) Data de coleta b 33 Tempo (dias) Figura 12. Distribuições dos tempos de germinação das sementes de M. chartacea conforme a data de coleta em 2012 e 2013. Porcentagem corregida pela viabilidade máxima do lote, %G corrigida=(%G bruta/% Viabilidade máxima do lote)*100. G e rm in aç ão c o rr ig id a (% )/ d ia 0 5 10 15 20 08/05/2012 0 5 10 15 20 06/06/2012 19/06/2012 0 5 10 15 20 01/08/2012 0 5 10 15 20 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 14/04/2013 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 21/05/2013 03/09/2012 Tempo (dias) 34 3 CAPÍTULO 2: ARMAZENAMENTO, LONGEVIDADE ECOLÓGICA E BANCO DE SEMENTES NO SOLO 3.1 Introdução O comportamento das sementes no armazenamento está definido em termos do efeito da dessecação na viabilidade das sementes e o efeito do ambiente de armazenamento na sua longevidade (Hong e Ellis 1996). Segundo Hong e Ellis (1996), as espécies cujas sementes podem ser desidratadas a níveis baixos de umidade (2-6% de conteúdo de umidade) sem perder a viabilidade são denominadas ortodoxas. Estas sementes sobrevivem por mais tempo quando são conservadas em ambientes secos e frios (umidade relativa inferior a 30% e temperaturas entre -20 e 0°C) (Hong e Ellis 1996). Espécies cujas sementes sofrem danos quando são secas até conteúdos de água inferiores a 7-12%, e cuja longevidade aumenta quando são armazenadas a umidades relativas na faixa de 40-50%, podem ser classificadas como intermediárias. Em espécies tropicais a longevidade das sementes intermediárias diminui quando a temperatura de armazenamento é menor do que 10°C (Hong e Ellis 1996). Já as sementes de espécies classificadas como recalcitrantes não podem ser secas sem sofrer dano, sendo que em geral o conteúdo de água nas sementes maduras é relativamente alto (entre 35 e 90%). A longevidade das sementes recalcitrantes de espécies tropicais é muito curta, persistindo tipicamente por poucas semanas ou meses (Hong e Ellis 1996). Existe uma associação entre a ecologia vegetal e o comportamento das sementes no armazenamento, de tal forma que as espécies ortodoxas se originam em ambientes sujeitos a secas ocasionais ou estacionais, sendo que nesses casos a tolerância à dessecação permite a sobrevivência das sementes e a regeneração continuada das espécies. As espécies recalcitrantes, por sua vez, tendem a ocorrer em ecossistemas constantemente úmidos (Hong e Ellis, 1996). O comportamento das sementes no armazenamento dá indícios das condições microambientais (temperatura e umidade) nas quais a espécie vive e, indiretamente, do grupo ecológico (sensu Swaine e Whitemore 1988) a que ela 35 pertence. Assim, as espécies pioneiras, cujas sementes estão submetidas à dessecação e nas quais o banco de sementes desempenha um papel importante na sobrevivência da espécie, teriam predominantemente sementes ortodoxas. Por outro lado, as espécies não pioneiras, nas quais a germinação rápida é favorecida, teriam comumente sementes com um alto conteúdo de umidade e metabolismo continuo (padrão recalcitrante) (Baskin e Baskin 1998; Hong e Ellis 1996;Vázquez-Yánez e Orozco-Segovia 1993). O banco de sementes do solo está constituído por o estoque de sementes viáveis no solo. Existem dois tipos de bancos de sementes no solo: o banco transitório, no qual as sementes continuam viáveis somente até a estação de germinação seguinte á dispersão; e o banco persistente, no qual as sementes continuam viáveis depois da subsequente estação de germinação (Baskin & Baskin, 1998). Os bancos de sementes são importantes na sobrevivência a longo prazo das espécies e comunidades vegetais devido a constituírem uma fonte de propágulos para o recrutamento após perturbações e quando a produção de sementes diminui por longos períodos (Dalling and Hubbell, 2002; Baskin and Baskin, 1998), além disso, o banco de sementes permite a sobrevivência dos indivíduos sob condições desfavoráveis (p.ex., estação seca) e a sincronia da germinação com o momento no qual as condições ambientais são favoráveis para o estabelecimento das plântulas. Os objetivos deste capítulo são: (1) determinar a longevidade das sementes de M. chartacea artificialmente enterradas na reserva de Cerrado Karl Arens no município de Corumbataí e comparadas com longevidade das sementes armazenadas sob condições de laboratório. (2) Avaliar se as sementes de M. chartacea formam banco de sementes e de que tipo. (3) Definir o comportamento das sementes no armazenamento (ortodoxas, intermédiarias ou recalcitrantes) e (4) registrar possíveis efeitos do armazenamento a seco (pós-maturação) na quebra de possível dormência primaria. 3.2 Material e métodos 3.2.1 Armazenamento, longevidade ecológica e banco de sementes no solo. Com o fim de determinar a longevidade ecológica (manutenção da viabilidade das sementes no campo) e longevidade potencial (manutenção da viabilidade das sementes em condições de laboratório) foi delineado um experimento fatorial com 36 quatro condições e oito períodos de armazenamento. Duas condições de armazenamento foram utilizadas para a longevidade ecológica (ambientes fechados e abertos) e duas para longevidade potencial (7°C e 25°C). O experimento foi repetido duas vezes, pelo qual serão chamados experimento 1 e experimento 2. O experimento 1 foi feito com sementes coletadas em 08/Maio/2012 e armazenadas por 27 dias em sacos de papel a 25°C antes do ensaio de armazenamento propriamente dito, durante o qual as sementes foram mantidas em campo e laboratório pelos períodos de 0 (controle), 30, 56, 89, 119, 148, 231, 281 e 313 dias. No experimento 2 foram utilizadas sementes coletadas em 06/Junho/2012 e armazenadas previamente por seis dias em sacos de papel a 25°C, ao que se seguiu o armazenamento em campo e laboratório por 0 (controle), 43, 76, 106, 135, 218, 268, 300 e 330 dias. Para o armazenamento em campo, as sementes foram guardadas em envelopes confeccionados com tela de nylon colocadas no solo e cobertas com serapilheira do local. Os envelopes foram postos em dois tipos de ambiente (aberto e fechados), escolhidos conforme a altura e cobertura do dossel. Foram feitas quatro repetições por tipo de cobertura. Cada envelope é uma repetição contendo 25 sementes, tendo sido distribuídas um envelope por local, sendo quatro locais por tipo de cobertura. No caso das sementes armazenadas no laboratório, quatro sacos de papel (repetições) contendo 25 sementes cada foram guardadas, em potes de vidro tampados (tipo conserva), na geladeira (7°C) ou em sala climatizada (25°C). Os envelopes foram exumados nos períodos mencionados no parágrafo anterior, abrangendo a época seca na qual as sementes são dispersas e a época chuvosa na qual poderia ocorrer a germinação. A avaliação da porcentagem e taxa de germinação das sementes exumadas foi realizada sob luz branca a 25°C. As sementes que não germinaram foram submetidas a teste de tetrazólio (1%) para se determinar sua viabilidade. As dinâmicas de longevidade e germinação das sementes ao longo do tempo de armazenamento foram descritas por modelos que melhor descrevessem as curvas, sendo usadas regressões lineares ou quadráticas. Para comparar a taxa de perda de viabilidade (inclinação da reta) entre as quatro condições de armazenamento nos dois experimentos, foram feitas regressões lineares, seguindo o teste de comparação de retas descrito por Sokal e Rolf (1995). 37 Nos ambientes abertos e fechados foi medida a irradiância e a cobertura do dossel. A irradiância foi medida entre as 11h30min e 13h em dias ensolarados nas datas 06/Junho/2012, 03/Setembro/2012 e 30/Novembro/2012, utilizando-se um radiômetro Li-Cor LI-1000. Foram tomadas quatro medições, ao nível do solo, por ponto abarcando os quatro pontos cardeais e colaterais. A irradiância em cada ambiente (IR) foi expressa como porcentagem de irradiância que chega ao solo no respectivo ponto (Ia) em relação à irradiância medida a pleno sol (IT) no mesmo período: IR = (Ia/IT.100). Foi tomada uma foto hemisférica de 135° em cada um dos quatro locais de cada ambiente em 06/Junho/2012, a partir das quais foi estimada a cobertura do dossel utilizando o programa Gap Light Analyzer (GLA) version2.0. 3.2.2 Banco de sementes do solo Foram feitas duas coletas, uma no final da frutificação da população estudada (3/Outubro/2012), que coincide com o começo da estação chuvosa, e outra antes do amadurecimento dos frutos na temporada reprodutiva seguinte, o que corresponde ao fim da estação chuvosa (13/Março/2013). Cada coleta esteve composta de 20 amostras, sendo dez obtidas na parte do Cerrado onde o dossel é mais aberto, e dez numa parte mais fechada. Cada ponto de amostragem distava 30m um do outro, sendo que cada ponto correspondia a duas amostras: uma retirada de uma área de 0,0615m2 localizada a 1m da margem direita da trilha; e outra retirada de uma área equivalente situada a 1m da margem oposta. Após a retirada da serapilheira, foi coletada a camada de solo superficial (ca. 2cm) e as sementes eventualmente nela contidas. A área total registrada por coleta foi 2,46m2. Foram contadas o número de sementes intatas em cada amostra e a viabilidade foi medida por meio de teste de germinação (luz constante e 15/25°C) e validada por teste de tetrazólio (1%). O número de sementes submetidas aos testes foi, sempre que possível, de 30 (priorizando-se o teste de germinação), mas esse número variou dependendo da amostra (oito das 40 amostras tinha menos de 30 sementes intactas e em 12 amostras não foi feito teste de tetrazólio). 38 3.2.3 Comportamento no armazenamento. Para saber se as sementes de Miconia chartacea são tolerantes à dessecação (ortodoxas) ou intolerantes (intermédiarias ou recalcitrantes), foi testada a porcentagem e tempo médio de germinação de sementes coletadas em 15/Maio/2013 e armazenadas hermeticamente com diferentes teores de água. As sementes foram dessecadas em dessecador com sílica gel a temperatura ambiente e periodicamente foram pesadas e avaliado o conteúdo de água. Foram testados seis conteúdos de água em base fresca: 37,2%; 8,5%; 7,5%; 6,5%; 4,9% e 3,7%. O teste de germinação foi feito sob luz branca a 20°C, utilizaram-se cinco repetições de 30 sementes cada. Em outro ensaio, foi testado o efeito do armazenamento sob temperaturas baixas (7ºC e -18°C) e dessecação (6,5% e 4,9% de conteúdo de água em base fresca) em sementes armazenadas por 93 dias em cada combinação de temperatura e conteúdo de água, comparadas com um controle fresco (sementes recém- colhidas) e seco (sementes com 6,5% e 4,9% de conteúdo de água sem armazenar). As sementes dessecadas foram armazenadas em sacos de papel (cinco sacos com 30 sementes cada) dentro de dois frascos herméticos de vidro (um maior contendo um menor). As sementes foram coletadas em 15/Maio/2013. 3.2.4 Pós-maturação Para registrar possíveis efeitos do armazenamento a seco na quebra de possível dormência primaria, foi delineado um experimento fatorial com dois fatores (tempo e temperatura de armazenamento). As sementes foram armazenadas em frascos de vidro hermeticamente fechados por 60, 90 e 120 dias sob 25°C e 7°C, tendo como controle sementes recém-colhidas. O teste de germinação foi feito sob luz branca à temperatura de 25°C, com cinco repetições de 30 sementes cada. Além do teste de germinação, foi feito um teste de tetrazólio (1%) em cada combinação de tempo e temperatura de armazenamento, bem como no controle, com quatro réplicas de 30 sementes cada. A germinação das sementes armazenadas a 7°C por 120 dias foi testada às temperaturas de 15, 20, 25, 30, 35°C e 15/30°C, 15/35°C e 20/35°C sob luz branca e no escuro, e comparadas com sementes do mesmo lote 39 que não foram armazenadas. Esse ensaio foi realizado com sementes coletadas em 21/Maio/2013. 3.3 Resultados 3.3.1 Armazenamento, longevidade ecológica e banco de sementes no solo. A irradiância relativa nos ambientes aberto e fechado diferiu significativamente (t-student, p<0.01) nas três amostragens, sendo maior a irradiância nos locais abertos (Tab. 4). A irradiância aumentou no período de Junho a Novembro, que abrange o inverno e verão, em ambos os ambientes. Já com relação à porcentagem de abertura do dossel, os dois ambientes não diferem entre si (t-student, p=0,14), apresentado aberturas de 39,3±8% (ambiente “aberto”) e 33,1±5% (ambiente “fechado”). Tabela 4. Irradiância relativa em ambientes abertos e fechados na estação seca (06/Junho/2012), na transição da estação seca para chuvosa (03/Setembro/2012) e na estação chuvosa (30/Novembro/2012). Data de medição Ambiente 06/Junho/2012 03/Setembro/2012 30/Novembro/2012 Aberto 3.51±0.57%** 10.26±1.65%** 41.05±2.5%** Fechado 1.98±0.59%** 2.08±0.46%** 11.97±4.24%** * Indicam diferenças estatísticas (t-student, p<0.01). A manutenção ou perda da viabilidade das sementes dependeu do tempo e do método de armazenamento das mesmas e tais fatores interagiram de forma altamente significativa (Anova; p<0,001, experimentos 1 e 2). Assim, o tempo de armazenamento afetou a viabilidade das sementes de forma diferencial conforme o método de armazenamento, nos dois experimentos (Fig. 13). No experimento 1, a viabilidade das sementes armazenadas em campo (ambientes abertos e fechados) seguiu uma regressão quadrática, mantendo-se constante até os dias 119 e 148, respectivamente, sendo que após este período a viabilidade foi perdida rapidamente chegando a zero no dia 281. Já nas sementes armazenadas a 25°C, a viabilidade diminui linearmente com o armazenamento, chegando a 4% de viabilidade no dia 313 (Fig. 13a). Por sua vez, as sementes armazenadas a 7°C mantiveram constante sua viabilidade durante os 313 dias de armazenamento. 40 O padrão de perda da viabilidade no experimento 2 foi similar ao do experimento 1. No experimento 2, as sementes armazenadas em campo (ambientes aberto e fechado) mantiveram a viabilidade (não diferem do controle) até o dia 135 de armazenamento, sendo que após este dia a viabilidade é perdida rapidamente. Já as sementes armazenadas no laboratório a 25°C começaram a perder a viabilidade após 43 dias, chegando a mesma a 1% aos 135 dias (Fig. 13b). Assim como no experimento 1, o armazenamento das sementes sob 7°C não diminui a viabilidade ao longo dos 330 dias de experimento. Portanto, a viabilidade das sementes armazenadas no campo, em ambientes fechados e abertos, foi mantida por quatro a cinco meses, após deste período as sementes começaram a perder a viabilidade chegando a zero depois do nono mês de armazenamento. Já as sementes armazenadas no laboratório a 25°C perdem a viabilidade de forma linear, sendo maior a taxa de perda de viabilidade no experimento 2, ao passo que o armazenamento sob baixa temperatura (7°C) impede a perda de viabilidade durante os 330 dias do ensaio (Figura 13). No experimento 1 a porcentagem de germinação de sementes tendeu a aumentar com o armazenamento no campo durante 119 (ambiente aberto) e 148 dias (ambiente fechado) respeito ao controle (tempo zero), encontrando-se diferenças significativas entre o controle e as sementes armazenadas por um mês em ambientes abertos e, o controle e as sementes armazenadas por três meses em ambientes fechados, após 231 dias de armazenamento em ambos os ambientes a porcentagem de germinação das sementes foi significativamente menor que no controle (Anova, p<0,001, Dunnett; Fig. 14) chegando a zero após 281 dias de armazenadas em ambos os ambientes. Já nas sementes armazenadas a 25°C a porcentagem de germinação diminuiu significativamente desde os 56 dias de armazenamento (Anova, p<0,001, Dunnett), chegando a menos de 7% de germinação após 313 dias armazenadas (Figura 14). Nas sementes armazenadas a 7°C a porcentagem de germinação tendeu a aumentar com o tempo de armazenamento, sendo significativamente maior (Anova, p<0,001, Dunnett) nas sementes armazenadas por 313 dias do que no controle. Entretanto, as sementes armazenadas por dois meses apresentaram uma porcentagem de germinação menor do que o controle (Anova, p<0,001; Dunnett) (Figura 14). 41 Figura 13. Variação da viabilidade de sementes de M. chartacea armazenadas por diferentes períodos no campo em ambientes abertos, fechados e no laboratório a 7°C e 25°C. A experimento 1; B experimento 2. O padrão da germinação das sementes no experimento 2 foi similar ao padrão no experimento 1. A germinação de sementes armazenadas no campo durante 43 e 76 dias (ambientes abertos e fechados, respectivamente) foi significativamente maior que no controle. Após estes períodos a porcentagem de germinação começa a diminuir, diferindo significativamente do controle (Anova, p<0,001, Dunnett) nas sementes armazenadas por 218 dias, quando a porcentagem de germinação é zero em ambientes abertos e 8% em ambientes fechados (Figura 15). Nas sementes armazenadas a 25°C, todos os períodos de armazenamento diminuíram significativamente a porcentagem de germinação (Anova, p<0,001; Dunnett), chegando a zero no dia 106 (Figura 15). Nas sementes armazenadas a 7°C a porcentagem de germinação tendeu a aumentar com o tempo de armazenamento, embora as diferenças não sejam estatisticamente significativas (Dunnett). A B 42 Figura 14. Resposta germinativa de sementes de M. chartacea armazenadas por diferentes períodos no campo, em ambientes abertos e fechados, e no laboratório a 25 e 7°C (experimento 1). Germinação corrigida pela viabilidade máxima do lote. * Diferenças significativas (p<0,001; Dunnett) do controle. G er m in aç ão ( % c o rr ig id a) G e rm in aç ão ( % C o rr ig id o ) Figura 15. Resposta germinativa de sementes de M. chartacea armazenadas por diferentes períodos no campo, em ambientes abertos e fechados, e no laboratório a 25 e 7°C (Experimento 2). Germinação corregida pela viabilidade máxima do lote. * Diferenças significativas (p<0,001; Dunnett) do controle. * * * * * * * * * * * * * * * * 43 O tempo médio de germinação em todas as combinações de tempo e método de armazenamento (ambos os experimentos), cujas germinabilidades não diferiram em relação ao controle (tempo zero), variaram em torno de 34±10 dias e não difere do controle (Dunnett). Já no caso das sementes que apresentaram germinabilidade menor do que o controle, o tempo médio de germinação também foi menor (Anova, p<0,001; Dunnett), mas tal diferença foi mais devida à perda da viabilidade do que ao aumento na taxa de germinação (Tabelas 5 e 6). Tabela 5. Tempo médio de germinação das sementes de M. chartacea armazenadas em condições de campo (ambientes com dossel fechado e aberto) laboratório (7 e 25°C) por diferentes períodos (Experimento 1). Tempo de Tempo médio de germinação (d) Armazenamento (d) Aberto Fechado 25°C 7°C Controle 38.66±3.38 38.66±3.38 38.66±3.38 38.66±3.38 30 33.93±2.93 36.95±5.73 56 34.22±7.16 38.20±4.00 26.73±4.97 40.12±9.98 89 32.18±3.91 32.71±3.46 119 32.68±2.44 32.24±1.54 58.50±10.37** 41.14±4.37 148 22.44±14.2** 28.35±9.68 231 25.25** 29±21.21** 30.90±13.46 35.92±5.73 313 N.v. N.v. 24.67±2.89** 33.20±2.89 ** diferenças significativas (p<0,001; Dunnett) do controle (tempo zero) por coluna. N.v. sementes não viáveis, tempos de germinação em cursiva correspondem a sementes com porcentagem de germinação menor que o controle. Tabela 6. Tempo médio de germinação das sementes de M. chartacea armazenadas em condições de campo (ambientes com dossel fechado e aberto) laboratório (7 e 25°C) por diferentes períodos (Experimento 2). Tempo de armazenamento(d) Tempo médio de germinação (d) Aberto Fechado 7°C 25°C Controle 39.91±5.54 39.91±5.54 39.91±5.54 39.91±5.54 43 40.99±6.79 52.53±8.97 39.28±5.79 29.55±5.13** 76 30.38±1.36 36.49±3.72 32.93±4.02 21.50±1** 106 28.93±19.41 36.46±1.59 42.54±8.14 n.v. 135 19.86±13.67 54.39±15.68 36.51±9.57 218 n.v 12.25±24.5** 33.49±5.14 268 6.06±12.1** 35.48±10.96 300 11.17±22.3** 34.45±2.01 330 4.25±8.5** 28.13±2.68 ** diferenças significativas (p<0,001; Dunnett) do controle (tempo zero) por coluna. N.v. sementes não viáveis, tempos de germinação em cursiva correspondem a sementes com porcentagem de germinação menor que o controle. 44 A taxa de perda de viabilidade, representada pela inclinação da reta de regressão, das sementes diferiu significativamente (p<0,01) conforme as condições de armazenamento, sendo os padrões similares nos experimentos 1 e 2 (Tab.7, Fig. 16). Em ambos os experimentos, as sementes armazenadas em campo sob ambientes aberto e fechado não diferiram entre si exibindo a mesma equação. No experimento 1, sementes armazenadas a 25°C perderam a viabilidade mais lentamente do que sementes armazenadas no campo, embora nos primeiros meses a viabilidade foi maior em condições de campo. Entretanto, no experimento 2, as sementes mantidas a 25°C perderam a viabilidade mais rapidamente do que as armazenadas no campo em ambientes fechados, não diferindo em relação às sementes armazenadas em ambientes abertos. Em ambos os experimentos, sementes armazenadas a 7°C não perderam a viabilidade após 313 (experimento 1) e 330 dias (experimento 2) de armazenamento (Tab.7, Fig. 16). a V ia b ili d ad e ( % ) %Vcampo = -0.165d + 51 R2=0.66 %V25°C = -0.0981d + 36.511 R2= 0.87 %Vcampo = -0.1789d + 50.493 R2=0.61 %V25°C = -0.2427d + 44.051 R2= 0.65 Figura 16. Variação da viabilidade em função do tempo de armazenamento de sementes de M. chartacea armazenadas em condições de campo, em ambientes abertos e fechados (%Vcampo), e em laboratório a 25 C (%V25°C), nos experimentos 1 (a) e 2 (b). Sementes armazenadas a 7°C não perderam viabilidade e a regressão linear não foi significativa. 45 Tabela 7. Análises das taxas de perda de viabilidade (inclinações das regressões lineares) das sementes de M. chartacea conforme o método de armazenamento (Experimentos 1 e 2). Método de Armazenamento Experimento um 7°C 25°C Aberto Fechado 7°C -------- 25°C 0.162** -------- Aberto 0.253** 0.092** -------- Fechado 0.219** 0.057* 0.034ns -------- Experimento dois 7°C -------- 25°C 0.265** -------- Aberto 0.226** 0.039ns -------- Fechado 0.177** 0.089** 0.05ns -------- ** diferenças altamente significativas entre as inclinações (p<0,01), *diferenças significativas (p<0,05), ns não foi encontrada diferenças significativas. 3.3.2 Banco de sementes no solo. A viabilidade das sementes no solo foi significativamente maior (Mann- Whitney, p<0.001) no começo (3/Outubro/2012) do que no fim (13/Março/2013) da estação chuvosa, de modo que, o número estimado de sementes viáveis/m2 também foi significativamente maior no começo da estação chuvosa (Mann-Whitney, p=0.0001) (Figura 17 e Tabela 8). Além disso, no final da estação chuvosa, somente 7 das 20 amostras tinham sementes viáveis, enquanto que no começo dessa estação18 das 20 amostras continham sementes viáveis. Portanto, as sementes desta população apresentariam no máximo um banco de sementes transitório e o recrutamento de plântulas dependeria principalmente da chuva de sementes. 46 13/Março/20133/Outubro/2012 900 800 700 600 500 400 300 200 100 30 0 Data amostragem S e m e n te s v ia v e is / m 2 ( n ° e s ti m a d o ) fff f ff f fffaa a a a aaa aa f f f f f f f f aa a a a a Figura 17. Número de sementes viáveis/m2 de M. chartacea conforme as datas de amostragem. Triangulo vermelho é a média e o ponto laranja é a médiana, as letras a e f fazem referencia á localização dos pontos, a=aberto e f=fechado. Existe uma alta variação entre pontos amostrados nas duas coletas, com relação à viabilidade e ao número de sementes viáveis estimadas/m2. Na coleta feita no começo da estação chuvosa (3/Outubro/2012), a viabilidade e o número de sementes viáveis estimadas/m2 apresentaram coeficientes de variação (CV) de 54% e 117%, respectivamente, indicando uma chuva de sementes muito heterogênea. O mesmo ocorreu na coleta feita no final da estação chuvosa (13/Março/2013), cujos CV de ambas as variáveis foram maiores ainda (173 e 249% respectivamente), provavelmente devido a que somente 7 dos 20 pontos apresentaram sementes viáveis. O número de sementes intactas, na coleta feita no começo da estação chuvosa, foi significativamente (T-Student, p=0.025) maior nos ambientes mais fechados, mas a viabilidade e o número de sementes viáveis /m2 não diferiu significativamente entre os ambientes abertos e fechados (T-Student, p>0.9 e 0.07, respectivamente) (Fig. 18). 47 Tabela 8. Viabilidade e número de sementes viáveis estimadas/m2 de M. chartacea coletadas no começo (3/Outubro/2012) e no final da estação chuvosa (13/Março/2013) Começo da estação chuvosa Fim da estação chuvosa Estimador Viabilidade (%) Sementes viáveis estimadas/m2 Viabilidade (%) Sementes viáveis estimadas/m2 Média 19.80 204.54 1.27 8.40 Erro típico 2.96 63.77 0.49 4.69 Médiana 20 a 100.9 a 0 b 0 b Desv. padrão 10.69 238.61 2.21 20.96 Mínimo 0.00 0.00 0.00 0.00 Máximo 38.71 811.96 6.70 90.51 Letras diferentes indicam diferenças significativas (Mann-Whitney, p<0.001). 8006004003002001000 4 3 2 1 0 8006004003002001000 aberto Sementes viaveis estimadas/m2 F re q u ê n ci a fechado Figura 18. Distribuição de frequência do número de sementes viáveis estimadas/m2 de M. chartacea nos ambientes aberto e fechado coletadas em 3/Outubro/2012. 3.3.3 Comportamento no armazenamento. A dessecação das sementes aumentou de forma altamente significativa (Anova, p=0.004) a porcentagem e taxa média de germinação (Tab. 9). As sementes com 8.5% de água apresentaram a maior porcentagem de germinação, diferindo significativamente (Tukey, p=0.004) das sementes frescas (37.2% de água) e dessecadas a 3.7%, as quais apresentaram a menor porcentagem de germinação. O tempo médio de germinação (tm) diminui conforme as sementes perdem água, de modo que sementes frescas (recém-colhidas) apresentam tm maior do que 40 dias, 48 enquanto que em sementes secas (no caso sementes com conteúdo de água igual ou menor a 8.5% em base fresca) o tm variou entre 30 e 33 dias (Tab. 9). Tabela 9. Resposta germinativa à dessecação de sementes de M. chartacea Teor de umidade % Germinação corrigida (%) Tempo média germinação (d) Taxa média germinação (d-1) 37.2 48.04 ± 12.31 b 42.71 ± 2.74 a 0.023 ± 0.001 a 8.5 78.66 ± 13.66 a 33.77 ± 3.27 b 0.030 ± 0.003 b 7.5 68.49 ± 13.81ab 31.85 ± 3.69 b 0.032 ± 0.004 b 6.5 62.35 ± 11.65ab 33.06 ± 3.57 b 0.031 ± 0.004 b 4.9 50.09 ± 17.48ab 31.29 ± 5.83 b 0.033 ± 0.005 b 3.7 40.89 ± 18.07 b 30.53 ±7.09 b 0.034 ± 0.008 b Letras diferentes indicam diferenças significativas(Tukey, p=0.004) Conforme a figura 19 é possível separar as sementes frescas das secas segundo suas dinâmicas de germinação, com as sementes frescas começando a germinar depois das secas, sendo que tal diferença aumenta com o grau de dessecação das sementes. Deste modo, sementes com 3.7% de água são as primeiras a germinar, seguidas por sementes com 4.9% de água, e assim sucessivamente. A germinabilidade de sementes secas (6.5% e 4.9%) armazenadas por 93 dias sob baixas temperaturas (7ºC e -18ºC) não difere significativamente (Anova, p=0.198 e p=0.816) das sementes recém-colhidas, bem como das sementes secas não armazenadas (tempo zero), mantendo sua viabilidade inicial (Tab. 10). Portanto, a resposta à dessecação indica que as sementes de M. chartacea apresentam um comportamento ortodoxo em relação ao armazenamento, confirmado pela manutenção da viabilidade de sementes secas armazenadas sob baixas temperaturas. Em relação ao tempo médio de germinação, o armazenamento sob baixas temperaturas (tanto a 7ºC, como a -18ºC) atrasou significativamente (Anova, p=0.001) a germinação em relação ao tempo zero, mas não em relação às sementes recém-colhidas (Tab. 10). 49 Figura 19. Dinâmica germinativa das sementes de M. chartacea com diferentes teores de água sem armazenar. Germinação corregida pela viabilidade máxima do lote. Tabela 10. Resposta germinativa das sementes de M. chartacea com distintos teores de umidade e armazenadas por 93 dias sob baixas temperaturas. Temperatura armazenamento (ºC) Teor de umidade % Germinação corrigida (%) Tempo média germinação (d) Taxa média germinação (d) Controle fresco 37.2 48.04±12.31a 42.71±2.74a 0.023±0.001a Controle seco 6.5 62.35±11.65a 33.06±3.57b 0.031±0.004b Controle seco 4.9 50.09±17.48a 31.29±5.83b 0.033±0.005b -18 6.5 53.15±7.75a 42.28±6.50a 0.024±0.004a 7 6.5 53.15±7.75a 52.55±5.38c 0.019±0.002c -18 4.9 55.20±7.75a 42.65±6.10a 0.024±0.003a 7 4.9 47.02±18.21a 45.72±3.63a 0.022±0.002a Letras diferentes indicam diferenças altamente significativas (Anova, p<0.01) dentro de cada coluna. Controle fresco (sementes recém-colhidas), controle seco (sementes secas sem armazenar). Germinação corregida pela viabilidade máxima do lote. A Anova de dois fatores indica que a porcentagem de germinação das sementes secas armazenadas por 93 dias sob temperaturas baixas não difere significativamente quanto ao conteúdo de água das sementes (6.5 contra 4.9% em base fresca) nem quanto à temperatura de armazenamento (7 contra -18ºC). Além disso, não há interação entre teor de umidade e temperatura de armazenamento (Tab. 11). Já o tempo médio de germinação difere em resposta à temperatura de armazenamento, com as sementes armazenadas a -18 °C demorando menos tempo para germinar do que as mantidas a 7ºC (Tabela 12). O tempo médio de germinação 50 não é afetado significativamente pelo conteúdo de umidade das sementes, nem por qualquer interação entre os fatores (Tab. 12). Tabela 11. ANOVA de dois fatores comparando a porcentagem de germinação corrigida das sementes de M. chartacea conforme o teor de água, temperatura de armazenamento e sua interação. Fonte GL SQ QM F P Teor água % 1 20.9 20.897 0.16 0.691 Armazenamento 1 83.59 83.588 0.66 0.430 Interação 1 83.59 83.588 0.66 0.430 Erro 16 2037.47 127.342 Total 19 2225.54 Tabela 12. ANOVA de dois fatores comparando o tempo médio de germinação corrigida das sementes de M. chartacea conforme o teor de água, temperatura de armazenamento e sua interação. Fonte GL SQ QM F P Teor água % 1 52.016 52.016 1.71 0.209 Armazenamento 1 222.244 222.244 7.31 0.016 Interação 1 64.949 64.949 2.14 0.163 Erro 16 486.456 30.404 Total 19 825.665 S = 5.514R-cuad. = 41.08%R-cuad.(ajustado) = 30.04% 3.3.4 Pós-maturação Assim como nos experimentos anteriores de armazenamento, no experimento de pós-maturação a viabilidade das sementes armazenadas a 25°C diminuiu significativamente com o tempo armazenamento (Regressão linear das médias repetidas, p<0.01), enquanto que as sementes armazenadas a 7°C não perderam a viabilidade (Regressão linear com medidas repetidas, p=0.563) (Fig. 20). O armazenamento das sementes a 7°C não afetou a porcentagem nem a taxa média de germinação (Regressão linear com medidas repetidas, p>0.28), quando as sementes foram incubadas a 25°C, enquanto que as sementes armazenadas a 25°C apresentaram uma redução da porcentagem e taxa média de germinação com o aumento do tempo de armazenamento (Regressão linear médias repetidas, p<0.01) (Fig. 21). 51 Figura 20. Viabilidade das sementes de M. chartacea armazenadas por hermeticamente a 25°C e 7°C conforme o tempo de armazenamento. Linhas indicam o desvio padrão. Figura 21. Variação na porcentagem de germinação corrigida (barras) e taxa média de germinação (quadrados) das sementes de M. chartacea em função do tempo de armazenamento a 25°C e 7°C. Linhas indicam erro padrão. Conforme a figura 22, as sementes de M. chartacea apresentam dormência primaria a qual pode ser quebrada com armazenamento a seco a 7°C por 120 dias, já que a gama de temperaturas na qual as sementes germinam é maior após a pós- maturação do que em sementes recém-colhidas. A porcentagem de germinação 52 variou conforme o armazenamento, a temperatura de incubação e a interação destes fatores (Tab. 13). Assim, de modo geral a porcentagem de germinação aumentou com o armazenamento a seco a 7°C, e a maior porcentagem de germinação aconteceu quando as sementes foram incubadas a 20°C, independentemente do armazenamento (Figura 22). A principal mudança na porcentagem de germinação ocorreu nas sementes incubadas a 15°C, cuja germinação corrigida aumentou de 1.1%, em sementes recém-colhidas, para 61.1% nas sementes pós-maturadas. Nas outras temperaturas de incubação as diferenças nas porcentagens de germinação foram mínimas entre sementes recém-colhidas e armazenadas. Figura 22. Porcentagens (A) e taxas médias de germinação (B) de sementes de M. chartacea armazenadas em seco a 7°C por 120 dias e recém-colhidas (controle) incubadas sob diferentes temperaturas. Germinação corregida pela viabilidade máxima do lote. Letras diferentes indicam diferenças significativas (Tukey, p<0.01) B A a a a a a b c c a b b b b b 53 A taxa média de germinação tende a ser maior nas sementes armazenadas do que nas sementes recém-colhidas (Fig. 22), não ocorrendo diferenças significativas entre sementes incubadas a 20 e 25°C. A taxa de germinação diferiu conforme a temperatura de incubação, sendo menor a 15°C do que nas outras temperaturas, tanto nas sementes armazenadas quanto nas recém-colhidas (Anova, p<0.01; Tukey) (Fig. 22). Tabela 13. ANOVA de dois fatores comparando as porcentagens corrigidas de germinação de sementes de M. chartacea conforme o tempo de armazenamento (recém-colhidas e armazenadas por 120 dias a 7°C) e a temperatura de incubação. Fonte GL SQ QM F P Armazenagem 1 3703.7 3703.7 23.08 0.000 Temperatura 3 11952.7 5976.34 37.24 0.000 Interação 23 5450.6 2725.31 19.98 0.000 Erro 32 3851.9 160.49 Total 93 24958.8 S = 10.97 R-quad.= 92.25% R-quad.(ajustado) = 90.55% A porcentagem de germinação no escuro das sementes armazenadas em seco a 7°C por 120 dias foi muito baixa, em todas as temperaturas de incubação, e não diferiu significativamente das sementes controle (sem armazenar) no escuro. Portanto o armazenamento em seco a 7°C não alterou o requerimento luminoso das sementes para germinar (Tab. 14). Tabela 14. Porcentagem de germinação corrigida no escuro de sementes de M. chartacea armazenadas por 120 dias a 7°C (Armazenadas) e sem armazenar (Controle) sob diferentes temperaturas de incubação. Temperatura (°C) incubação Germinação corrigida (%) Controle Armazenadas 15 0 0 20 2.2 ± 3.04 0 25 1.1 ± 2.48 3.3 ± 5 35 0 1.1 ± 2.48 20/35 4.4 ± 2.48 4.4 ± 7.2 15/35 0 0 15/30 1.1 ± 2.48 1.1 ± 2.48 54 4 CAPÍTULO 3: SENSIBILIDADE DAS SEMENTES DE Miconia chartacea À LUZ, TEMPERATURA E FITORREGULADORES. 4.1 Introdução A seleção natural deve favorecer mecanismos que permitam às sementes perceber condições ambientais favoráveis para a germinação e o estabelecimento das plântulas, e consequentemente diminuam a probabilidade de encontrar condições desfavoráveis logo após da germinação. A resposta das sementes à temperatura é a mais importante no controle do momento no qual as sementes germinam no campo, sincronizando germinação com condições adequadas para o estabelecimento das plântulas. A temperatura afeta vários processos fisiológicos nas sementes como a taxa de perda de viabilidade, a perda de dormência e taxa de germinação em sementes não dormentes (Probert, 2000). Além da temperatura a resposta da semente à luz pode controlar o momento no qual as sementes germinam no campo, o efeito da luz na germinação depende do genótipo e das condições ambientais experimentadas durante a maturação das sementes, a fase de dormência (se tiver) e a própria germinação (Pons, 2000). Luz e temperatura podem interatuar no controle da germinação, de tal forma que os requerimentos germinativos das sementes podem mudar conforme a qualidade luminosa (V/VE), a extensã