i UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA – UNESP CÂMPUS DE JABOTICABAL NANOTECNOLOGIA APLICADA À ELABORAÇÃO DE CARRAPATICIDAS SINTÉTICOS ASSOCIADOS A COMPOSTOS VEGETAIS PARA O CONTROLE DE Rhipicephalus (Boophilus) microplus Amanda Figueiredo Médica Veterinária 2020 . ii UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA – UNESP CÂMPUS DE JABOTICABAL NANOTECNOLOGIA APLICADA À ELABORAÇÃO DE CARRAPATICIDAS SINTÉTICOS ASSOCIADOS A COMPOSTOS VEGETAIS PARA O CONTROLE DE Rhipicephalus (Boophilus) microplus Amanda Figueiredo Orientadora: Profa. Dra. Ana Carolina de Souza Chagas Coorientador: Prof. Dr. Leonardo Fernandes Fraceto Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – Unesp, Câmpus de Jaboticabal, como parte das exigências para a obtenção do título de Doutor em Medicina Veterinária (área de Medicina Veterinária Preventiva). 2020 . iii . iv . v DADOS CURRICULARES DO AUTOR AMANDA FIGUEIREDO – nascida em 09 de abril de 1989 em Londrina-PR. Médica Veterinária graduada pela Universidade Estadual do Norte do Paraná – UENP, Campus Luiz Meneghel, Bandeirantes-PR, em julho de 2014. Durante a graduação, foi aluna de Iniciação Científica pelo Programa Institucional de Bolsas de Iniciação Científica – PIBIC do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq (modalidades PIBIC e PIBIC voluntário), sob a orientação da Profa. Dra. Erika Cosendey Toledo de Mello Peixoto, com a monografia intitulada: “Aplicação de Cymbopogon winterianus Jowitt e Azadirachta indica A. Juss no controle de Rhipicephalus (Boophilus) microplus”. A titulação de Mestre foi obtida pelo Programa de Pós-Graduação (PPG) em Medicina Veterinária (área de Medicina Veterinária Preventiva) da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP, Jaboticabal-SP, em fevereiro de 2017, sob a orientação da Profa. Dra. Ana Carolina de Souza Chagas, mediante a dissertação: “Avaliação dos efeitos de princípios fitoterápicos e homeopáticos no controle de Rhipicephalus (Boophilus) microplus e comparação de técnicas para estimativa de eclosão de larvas in vitro”. Durante o mestrado foi bolsista CNPq e a partir dos estudos desenvolvidos, três artigos foram publicados: “In vivo study of a homeopathic medicine against Rhipicephalus (Boophilus) microplus in dairy cow”, “First report of the effect of Ocotea elegans essential oil on Rhipicephalus (Boophilus) microplus”; e “Comparative study of hatching estimation methods of Rhipicephalus (Boophilus) microplus eggs”. Em março de 2017 ingressou no curso Doutorado pelo mesmo PPG e sob a mesma orientação, recebeu auxílio da empresa Ipanema Ltda., posteriormente do CNPq, até a aprovação da bolsa FAPESP. A pesquisa desenvolvida durante esse período gerou a tese de doutorado aqui apresentada, a qual segue as linhas de pesquisa da graduação e do mestrado, buscando alternativas para o controle do carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus em bovinos. . vi EPÍGRAFE Há na vida momentos privilegiados nos quais parece que o Universo se ilumina, que a nossa vida nos revela sua significação, que nós queremos o destino mesmo que nos coube como se nós próprios o tivéssemos escolhido. Depois o Universo volta a fechar-se, tornamo-nos novamente solitários e miseráveis, já não caminhamos senão tateando por um caminho obscuro onde tudo se torna obstáculo a nossos passos. A sabedoria consiste em conservar a lembrança desses momentos fugitivos, em saber fazê-los reviver e fazer deles a trama da nossa existência cotidiana e, por assim dizer, a morada habitual do nosso espírito. Louis Lavelle . vii DEDICATÓRIA Ao Pai Celestial e aos meus pais, pelo eterno amor por mim, Dedico. . viii AGRADECIMENTOS Ao Pai Celestial, por me proporcionar força e coragem para ir à luta de cada dia, iluminar a minha inteligência e vontade de vencer. Sou grata por ter me permitido chegar até aqui. À Nossa Mãe Santíssima, por me conceder infinitas graças. À Sta. Teresinha do Menino Jesus e à Sto. Padre Pio que, além de serem minhas maiores fontes de inspiração de vida, já me deram sinais concretos de que intercedem por mim. Aos meus pais, Sidnei Figueiredo e Maria do Carmo Figueiredo, que sempre estiveram ao meu lado proporcionando crescimento, suporte espiritual e incentivo. Sou grata por todos os esforços, principalmente nesse último ano do doutorado. Aos meus irmãos (Lucas Figueiredo e Francisco Figueiredo Netto) e cunhadas (Evelin Paiva Figueiredo e Gisele Durigon Figueiredo), pelo carinho, torcida e apoio para a finalização desse curso; E aos meus sobrinhos (Vicente Durigon Figueiredo e Mário Durigon Figueiredo) que, a cada sorriso, trazem mais alegria para as nossas vidas. A todos os meus familiares, em especial à minha avó materna Maria Correia dos Santos que, aos seus 93 anos de idade, reza o terço todos os dias e sempre me inclui em suas orações. Às minhas tias Belinha dos Santos, Clarice dos Santos e Olga Watanabe (do coração) a quem devo gratidão, pelo carinho e por sempre terem me ajudado muito, e à minha prima Mirian dos Santos Calmezini, pelo companheirismo. Às minhas queridas amigas Kacieli Villa e Tauana Fernandes Francisco, pelo imenso carinho, pelas vibrações positivas e por terem compreendido os motivos da minha ausência nesses últimos anos de estudo. À minha querida amiga Nayara Ferraro Correa (in memoriam), que partiu há poucos dias, por ter me proporcionado momentos tão doces na infância, e a quem fiquei devendo uma visita. Espero reencontrá-la um dia com a mesma alegria de sempre. Aos meus queridos amigos Lucas Alves da Silva, Ana Cristina Santos Lopes, Caroline Barbosa Lima, Elka Machado Ferreira, com os quais sempre pude contar com palavras de apoio, orações, incentivo, conselhos e presença constante em minha vida, apesar da distância. . ix Aos meus amigos Claudiney Victor Bastos e sua esposa Sandra, pelo carinho, acolhida e, sobretudo, orações. Aos meus queridos amigos de faculdade Barbara Cristina Boelman Verburg, Tainá Rodrigues dos Santos e Angélica Laís Sarmento, pelo carinho, compreensão da minha distância e torcida pela conclusão desse curso. Em especial, ao Fausto de Almeida Marinho Neto que me acolheu e ajudou muito durante o período em que morei em Jaboticabal para a realização de etapas desse curso na Universidade. Às queridas amigas que conheci em Jaboticabal, Karina Kamachi Kobashigawa (que sempre me acolheu com muito carinho, pela disposição em me ajudar e fazer tudo o que estava ao seu alcance para me ver bem) e à Paloma do Espírito Santo Silva (que, apesar da distância, sempre me acolheu com o mesmo carinho, me ajudou muito e, inclusive, permitiu que eu adotasse a sua mãe). À Maria Teresa Moretti (mãe da Paloma), que se tornou uma grande amiga com quem sempre pude contar em São Carlos. Sou grata pelo carinho, pela disposição em me ajudar, por ter me proporcionado ótimos momentos em sua companhia e conversas construtivas, além de ter me incentivado muito na conclusão desse curso. Ao meu querido professor Mauro Pacífico, por sempre ter me motivado, principalmente quando eu mais precisei. Ao meu querido amigo Gilberto Teixeira Matado, com quem sempre pude contar em tudo. Sou muito grata. À minha orientadora da graduação e amiga Erika Cosendey Toledo de Mello Peixoto, por todo incentivo e apoio oferecido sempre. Sem ela eu não teria iniciado esta jornada. Ao meu querido professor e amigo Gilson Pereira de Oliveira, pelo carinho, disposição e prontidão em me ajudar em tudo. Ao meu querido amigo Tiago Maretti Gonçalves, com quem sempre pude contar, o qual esteve ao meu lado quando eu mais precisei, me motivando, me dando suporte, aconselhando, muitas vezes me fazendo acreditar em mim mesma e tornando minha vida mais leve com a sua alegria contagiante. Aos meus colegas e companheiros da Embrapa Rodrigo Giglioti, Isabella Barbosa dos Santos, Yousmel Alemán Gainza, Marei Borsch von Haehling, Naiana Barbosa Dinato, Louyse Gabrielli Lopes, Luciana Aparecida Giraldelo, João Henrique Barbosa Toscano, Alessandra da Silva Nucci, Leonardo Aparecido Lima dos Santos, . . . x Gustavo Avelar Sousa, Luís Adriano Anholeto e Rafaela Regina Fantatto, que muito me ajudaram no decorrer desse curso. À todos os servidores da Embrapa Pecuária Sudeste – CPPSE, em especial ao Gilberto César Agostinho, Verônica Schinaider do Amaral, Dra. Teresa Cristina Alves, Eduardo Luiz de Oliveira, Leni Rosendo Pinto, Benedito Aparecido da Silva, José Cosme Machado, Jose Carlos Didoné, Márcio Dias Rabelo, Ane Lisye Fiala Garcia Silvestre, Dra. Cíntia Hiromi Okino, Dr. Waldomiro Barioni Júnior, Natal Sylvestre, Dra. Márcia Cristina de Sena Oliveira, Silvia Helena Piccirillo Sanchez, Dr. Alexandre Berndt, Rafael Rosendo, Valdemir Rosendo, Dr. João Oiano Neto, Dr. Gilberto Batista de Souza, Juliana Gonçalves Costa, Dra. Flavia Aline Bressani Donatoni, Dr. Sérgio Novita Esteves, Dr. Wilson Malagó Júnior, Dr. Alessandro Pelegrine Minho, pela colaboração, disposição em me ajudar e por toda atenção à mim dispensada. Ao Diego Faria Cola e à Patrícia Luiza de Freitas Proença, pela parceria, colaboração, e por estarem sempre dispostos a me ensinar e ajudar. Em especial, à Dra. Ana Carolina de Souza Chagas, pela oportunidade concedida, por ter acreditado no meu potencial para a realização desse curso, pela orientação, conhecimento transmitido, pela consideração, carinho, paciência e, principalmente, por ter me proporcionado crescimento pessoal. Sem ela eu definitivamente não teria chegado até aqui. Ao Dr. Leonardo Fernandes Fraceto, pela coorientação e colaboração no projeto desenvolvido. Cabe aqui ressaltar que, diante da indisponibilidade de bolsas de estudo pela Universidade, o Dr. Leonardo e a Dra. Ana Carolina buscaram uma alternativa junto à Empresa Ipanema Ltda. que financiou parte desses estudos. Sou muito grata. À Embrapa Pecuária Sul – CPPSul e à Dra. Cláudia Cristina Gulias Gomes, pela gentileza em ceder larvas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus para parte da realização deste trabalho. À Embrapa Gado de Leite e, em especial, à Dra. Marcia Cristina de Azevedo Prata, pela gentileza de realizar Testes de Sensibilidade de Carrapatos a Carrapaticidas, colaborando com esse estudo. À Universidade Estadual “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP, Campus de Jaboticabal e Campus de Sorocaba, pela infraestrutura disponibilizada para a . xi realização das diversas etapas desse curso de doutorado, bem como aos seus servidores, pelo atendimento e serviços prestados. À Embrapa Pecuária Sudeste – CPPSE, por ter disponibilizado toda a infraestrutura necessária para a realização da parte experimental deste estudo. À Empresa Ipanema Ltda., pela concessão de dez meses de bolsa de estudos, o que foi um grande suporte até serem disponibilizadas por um órgão de fomento. Ao Conselho de Desenvolvimento Nacional Científico – CNPq, pela concessão de seis meses de bolsa de estudos (Processo n°: 169777/2017-0). À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP, pela concessão de trinta e dois meses de bolsa de estudos (Processo n°: 2017/13249-8), além dos recursos da reserva técnica, o que viabilizou parte considerável dos experimentos e a minha ida aos Estados Unidos para a apresentação de um trabalho referente a estes estudos. Aos membros da banca, Dra. Darci Moraes Barros-Battesti, Dr. Willian Giquelin Maciel, Dr. Jhones Luiz de Oliveira e Dr. Alessandro Pelegrine Minho, que prontamente aceitaram o convite e se dispuseram a colaborar e contribuir para o resultado final desta tese de doutorado. Por último, mas não menos importante, agradeço a todos os brasileiros que pagam seus impostos, permitindo, dessa forma, o investimento em estudos como este. Muito obrigada! . i Sumário Certificado do Comitê de Ética ................................................................................... iv RESUMO..................................................................................................................... v Palavras-chave ........................................................................................................... vi ABSTRACT ............................................................................................................... vii Keywords...................................................................................................................viii Lista de Abreviaturas .................................................................................................. ix Lista de Tabelas ......................................................................................................... xi Lista de Figuras ......................................................................................................... xii CAPÍTULO 1 - Considerações gerais .......................................................................... 1 1. Introdução ............................................................................................................... 1 2. Revisão de literatura ............................................................................................... 2 2.1 Rhipicephalus (Boophilus) microplus e consequências de seu parasitismo ...... 2 2.2 Controle do carrapato Rhipicephalus microplus ................................................. 7 2.2.1 Cipermetrina ................................................................................................ 7 2.2.2 Clorpirifós ..................................................................................................... 9 2.2.3 Compostos vegetais (citral, mentol e limoneno)............................................ 10 2.3 Período de carência ......................................................................................... 12 2.4 Resíduos carrapaticidas ................................................................................... 14 2.5 Resistência de Rhipicephalus microplus frente aos carrapaticidas .................. 14 2.6 Associação de princípios ativos ....................................................................... 15 2.7 Nanotecnologia e nanocarreadores ................................................................. 17 2.7.1 Nanocarreadores lipídicos ......................................................................... 19 2.7.2 Nanopartículas de zeína ............................................................................ 23 REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 25 CAPÍTULO 2 - Uso de nanocarreadores lipídicos no desenvolvimento de nanoformulações para controle de larvas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus .. 41 Resumo .................................................................................................................. 41 Palavras-chave ...................................................................................................... 42 1. Introdução .......................................................................................................... 42 2. Material e Métodos ............................................................................................. 44 2.1 Local e condições experimentais ..................................................................... 44 2.2 Reagentes ........................................................................................................ 44 2.3 Preparo de Nanopartículas Lipídicas Sólidas (NLS) e de Carreadores Lipídicos Nanoestruturados (CLN) ........................................................................................ 44 2.4 Quantificação dos princípios ativos e Determinação da Eficiência de ii encapsulação ......................................................................................................... 46 2.5 Caracterização das nanopartículas .................................................................. 47 2.5.1 Medidas de Diâmetro, Polidispersão e Potencial Zeta por ........................ 47 2.5.2 Medidas de Distribuição de Tamanho e Concentração das partículas por 47 2.5.3 Estabilidade lipídica (pH) ........................................................................... 48 2.6 Diluições para o teste in vitro sobre Rhipicephalus microplus ...................... 48 2.6.1 Nanoformulações ....................................................................................... 48 2.6.2 Controle positivo ........................................................................................ 48 2.7 Teste de Pacote de larvas (TPL) ...................................................................... 49 2.8 Análises estatísticas ......................................................................................... 50 3. Resultados ............................................................................................................ 50 3.1 Caracterização e estabilidade das formulações de nanopartículas lipídicas ... 50 3.2 Teste de Pacote de Larvas (TPL) .................................................................... 57 4. Discussão .............................................................................................................. 58 Conclusões ............................................................................................................ 63 Agradecimentos ..................................................................................................... 64 Referências ............................................................................................................ 64 CAPÍTULO 3 - Nanopartículas de zeína em formulações carrapaticidas para controle de Rhipicephalus (Boophilus) microplus ................................................................... 72 Resumo .................................................................................................................. 72 Palavras-chave ...................................................................................................... 73 1. Introdução .......................................................................................................... 73 2. Material e Métodos ............................................................................................. 74 2.1 Local e condições experimentais ..................................................................... 74 2.2 Reagentes ........................................................................................................ 74 2.3 Preparo das Nanopartículas de Zeína (NZ) ..................................................... 75 2.4 Quantificação dos princípios ativos e Determinação da Eficiência de encapsulação ......................................................................................................... 76 2.5 Caracterização das nanopartículas .................................................................. 77 2.5.1 Medidas de Diâmetro, Polidispersão e Potencial Zeta por ........................ 77 2.5.2 Medidas de Distribuição de Tamanho e Concentração das partículas por 77 S ......................................................................................................................... 77 2.5.3 Estabilidade lipídica (pH) ........................................................................... 78 2.6 Diluições para os testes in vitro sobre Rhipicephalus microplus ................... 78 2.6.1 Nanoformulações de zeína ........................................................................ 78 2.6.2 Controle positivo ........................................................................................ 78 iii 2.7 Testes in vitro com as nanoformulações sobre Rhipicephalus microplus ........ 79 2.7.1 Teste de Pacote de Larvas (TPL) .............................................................. 79 2.7.2 Atividade residual verificada por TPL ......................................................... 79 2.7.3 Teste de Imersão de Adultos (TIA) ............................................................ 80 2.8 Análises estatísticas ......................................................................................... 80 3. Resultados ......................................................................................................... 81 3.1 Caracterização e estabilidade das formulações de nanopartículas de zeína ... 81 3.2 Teste de Pacote de Larvas (TPL) .................................................................... 85 3.3 Atividade residual verificada por Teste de Pacote de Larvas (TPL) ................. 87 3.4 Teste de Imersão de Adultos (TIA) .................................................................. 88 4. Discussão .......................................................................................................... 89 Conclusões ............................................................................................................ 93 Agradecimentos ..................................................................................................... 93 Referências ............................................................................................................ 93 CAPÍTULO 4 - Considerações finais ....................................................................... 100 iv Certificado do Comitê de Ética v NANOTECNOLOGIA APLICADA À ELABORAÇÃO DE CARRAPATICIDAS SINTÉTICOS ASSOCIADOS A COMPOSTOS VEGETAIS PARA O CONTROLE DE Rhipicephalus (Boophilus) microplus RESUMO – Rhipicephalus microplus causa quedas na produção e consequentes prejuízos econômicos à pecuária. A resistência aos acaricidas e o risco da presença de resíduos nos alimentos de origem animal têm impulsionado a busca por novas alternativas de controle. Vários compostos vegetais possuem potencial acaricida/repelente, porém, possuem limitações em sua aplicação. Nanocarreadores podem proteger esses compostos, aumentar sua solubilidade aquosa e biodisponibilidade, além de reduzir possíveis efeitos tóxicos. Dessa forma, o objetivo desse estudo foi desenvolver formulações carrapaticidas a partir de Nanopartículas Lipídicas Sólidas (NLS), Carreadores Lipídicos Nanoestruturados (CLN) e Nanopartículas de Zeína (NZ), associados à cipermetrina, clorpirifós e um composto vegetal (citral, mentol ou limoneno), caracterizar esses sistemas nanocarreadores e verificar sua atuação contra larvas e fêmeas ingurgitadas de R. microplus. Nove formulações foram desenvolvidas e caracterizadas por Dynamic Light Scattering (DLS) e Nanoparticle Tracking Analysis (NTA). As formulações 1 (NLS+cip+clo+citral), 2 (NLS+cip+clo+mentol), 3 (NLS+cip+clo+limoneno), 4 (CLN+cip+clo+citral), 5 (CLN+cip+clo+mentol) e 6 (CLN+cip+clo+limoneno) obtiveram médias de diâmetro de 286 a 304 nm; polidispersão de 0,16 a 0,18; potencial zeta de -15,8 a -20 mV, concentração de 3,37 ± 0,24 x 1013 a 5,44 ± 0,18 x 1013 partículas/mL; e Eficiência de Encapsulação (EE) > 98,01% para todos os princípios ativos, enquanto, para os mesmos parâmetros, as formulações de zeína NZ-1 (NZ+cip+clo+citral), NZ-2 (NZ+cip+clo+mentol) e NZ-3 (NZ+cip+clo+limoneno) obtiveram, respectivamente, valores médios de: 282,18 a 290,64 nm; 0,24 a 0,25; -3,35 a -6,10 mV; e concentração de 2,73 ± 2,67 x 1013 a 3,20 ± 3,03 x 1013 partículas/mL e EE > 96%. Todas as formulações foram avaliadas quanto ao seu potencial acaricida e comparadas com controles positivo (Colosso®) e negativos (água destilada; e nanopartículas sem princípio ativo). Na avaliação das formulações de nanocarreadores lipídicos, pelo Teste de Pacote de Larvas (TPL), os controles negativos não ocasionaram mortalidade das larvas, enquanto o controle positivo, avaliado na concentração de 0,512 mg.mL-1, causou 100% de mortalidade. As formulações de NLS 1, 2, 3 e de CLN 4, 5 e 6 foram avaliadas de 0,004 a 0,466 mg.mL-1. Na concentração de 0,007 mg.mL-1 atingiram 90,4, 75,9, 93,8, 100, 95,1, 72,7 % de mortalidade. Com excessão da 4, para a qual não foi possível determinar concentrações letais (CL), as formulações 1, 2, 3, 5 e 6 resultaram em CL50 e CL90 de: 0,0033 e 0,0072; 0,0054 e 0,0092; 0,0040 e 0,0081; 0,0023 e 0,0054; 0,0055 e 0,0094 mg.mL-1, respectivamente. Em relação às nanoformulações de zeína avaliadas pelo TPL, os controles negativos também não ocasionaram mortalidade das larvas, entretanto, o controle positivo (avaliado de 0,004 a 0,512 mg.mL-1), resultou em mortalidade de larvas > 71,9% na concentração de 0,064 mg.mL-1, enquanto as formulações de zeína (avaliadas de 0,004 a 0,466 mg.mL-1) ocasionaram mortalidade > 80 % na concentração de 0,029 mg.mL-1. Essas formulações NZ-1 (NZ+cip+clo+citral), NZ-2 (NZ+cip+clo+mentol) e NZ-3 (NZ+cip+clo+limoneno) ainda resultaram em altas taxas de mortalidade de larvas em menores concentrações, com CL50 e CL90 de: 0,0136 e 0,0352; 0,0115 e 0,0386; 0,0117 e 0,0301 mg.mL-1, respectivamente, e 0,0319 e 0,1028 mg.mL-1, vi respectivamente, para o controle positivo). As formulações de zeína foram também avaliadas pelo Teste de Imersão de Adultos (TIA) e as formulações NZ-1, NZ-2 e NZ-3 obtiveram, respectivamente: 50,2, 40,5 e 60,1% de eficácia sobre fêmeas ingurgitadas na concentração de 0,466 mg.mL-1, enquanto o controle positivo resultou em 39,4% de eficácia a 0,512 mg.mL-1. As formulações de zeína ainda apresentaram uma alta atividade residual, embora menor do que a do controle positivo. Esse estudo demonstrou que foi possível encapsular os princípios ativos priorizados e caracterizar os sistemas carreadores. Todas as nanoformulações foram capazes de proteger os princípios ativos contra a degradação em solução, o que é uma característica de estabilidade visada para produtos carrapaticidas comerciais. Dessa forma, nanoformulações podem ser uma alternativa para o desenvolvimento de novos biocarrapaticidas com menor quantidade de princípios ativos, visando-se promover um controle parasitário mais seguro, com menor risco de presença de resíduos nos alimentos de origem animal e no ambiente. Palavras-chave: carrapato bovino, resistência, cipermetrina, clorpirifós, fitoterapia, sistemas nanocarreadores, segurança alimentar vii NANOTECHNOLOGY APPLIED TO DEVELOPMENT OF SYNTHETIC ACARICIDES ASSOCIATED WITH PLANTS COMPOUNDS FOR THE Rhipicephalus (Boophilus) microplus CONTROL ABSTRACT – Rhipicephalus microplus causes declines in cattle production and consequent damage to livestock. The resistance of ticks and the risk of the presence of residues in food of animal origin have driven the search for new control alternatives. Several plant compounds have an acaricidal/repellent potential, however, they have limitations in their application. Nanocarriers can protect these compounds, increase their aqueous solubility and bioavailability, and reduce possible toxic effects. Thus, the objective of this study was to develop acaricide formulations from Solid Lipid Nanoparticles (NLS), Nanostructured Lipid Carriers (CLN) and Zein Nanoparticles (NZ), associated with cypermethrin (cip), chlorpyrifos (clo) and a plant compound (citral, menthol or limonene), characterize these nanocarrier systems and verify their performance against larvae and engorged females of R. microplus. Nine formulations were developed and characterized by Dynamic Light Scattering (DLS) and Nanoparticle Tracking Analysis (NTA). The formulations 1 (NLS+cip+clo+citral), 2 (NLS+cip+clo+menthol), 3 (NLS+cip+clo+limonene), 4 (CLN+cip+clo+citral), 5 (CLN+cip+clo+menthol) and 6 (CLN+cip+clo+limonene) obtained mean diameters from 286 to 304 nm; polydispersion from 0.16 to 0.18; zeta potential from -15.8 to -20 mV, concentration from 3.37 ± 0.24 x 1013 to 5.44 ± 0.18 x 1013 particles/mL; and Encapsulation Efficiency (EE) > 98.01% for all active ingredients, while, for the same parameters, zein formulations NZ-1 (NZ+cip+clo+citral), NZ-2 (NZ+cip+clo+menthol) and NZ-3 (NZ+cip+clo+limonene) obtained, respectively, mean values of: 282.18 to 290.64 nm; 0.24 to 0.25; -3.35 to -6.10 mV; concentration of 2.73 ± 2.67 x 1013 to 3.20 ± 3.03 x 1013 particles/mL and EE> 96%. All formulations were evaluated for their acaricidal potential and compared with positive (Colosso®) and negative (distilled water; and nanoparticles without active ingredient) controls. In the evaluation of lipid nanocarrier formulations, by the Larval Pack Test (TPL), the negative controls did not cause mortality of the larvae, while the positive control, evaluated at the concentration of 0.512 mg.mL-1, caused 100% mortality. The formulations of NLS 1, 2, 3 and CLN 4, 5 and 6 were evaluated from 0.004 to 0.466 mg.mL-1. At the concentration of 0.007 mg.mL-1 they reached 90.4, 75.9, 93.8, 100, 95.1, 72.7% of mortality. With the exception of 4, for which it was not possible to determine lethal concentrations (CL), formulations 1, 2, 3, 5 and 6 resulted in CL50 and CL90 of: 0.0033 and 0.0072; 0.0054 and 0.0092; 0.0040 and 0.0081; 0.0023 and 0.0054; 0.0055 and 0.0094 mg.mL-1, respectively. Regarding the zein nanoformulations evaluated by the TPL, the negative controls also did not cause mortality of the larvae, however, the positive control (evaluated from 0.004 to 0.512 mg.mL-1), resulted in larval mortality > 71.9% in the concentration 0.064 mg.mL-1, while zein formulations (evaluated from 0.004 to 0.466 mg.mL-1) caused mortality> 80% in the concentration of 0.029 mg.mL-1. These formulations NZ-1 (NZ + cip + clo + citral), NZ-2 (NZ + cip + clo + menthol) and NZ-3 (NZ + cip + clo + limonene) still resulted in high larval mortality rates in lower concentrations, with LC50 and LC90 of: 0.0136 and 0.0352; 0.0115 and 0.0386; 0.0117 and 0.0301 mg.mL-1, respectively, and 0.0319 and 0.1028 mg.mL-1, respectively, for the positive control). The zein formulations were also evaluated by the Adult Immersion viii Test (TIA) and the formulations NZ-1, NZ-2 and NZ-3 obtained, respectively: 50.2, 40.5 and 60.1% efficacy on engorged females at a concentration of 0.466 mg.mL-1, while the positive control resulted in 39.4% efficacy at 0.512 mg. mL-1. The zein formulations still showed a high residual activity, although less than that of the positive control. This study demonstrated that it was possible to encapsulate the prioritized active ingredients and characterize the carrier systems. All nanoformulations were able to protect the active ingredients against degradation in solution, which is a characteristic of stability aimed at commercial tick products. Thus, nanoformulations can be an alternative for the development of new biocarpathicides with less active ingredients, aiming to promote safer parasitic control, with less risk of the presence of residues in food of animal origin and in the environment. Keywords: bovine tick, resistance, cypermethrin, chlorpyrifos, phytotherapy, nanocarrier systems, food security ix Lista de Abreviaturas AChE: Acetilcolinesterase ACh: Acetilcolina ANVISA: Agência Nacional de Vigilância Sanitária ATPase: Adenosinatrifosfatases BHC: Benzeno hexaclorado CEPEA: Centro de Estudos Avançados em Economia Aplicada-Esalq/Usp CEUA: Comitê de Ética no Uso dos Animais Cip: Cipermetrina CL: Concentração Letal CLAE: Cromatografia líquida de alta eficiência CLN: Carreadores Lipídicos Nanoestruturados Clo: Clorpirifós CNA: Confederação da Agricultura e Pecuária do Brasil CPPSE: Centro de Pesquisa Pecuária Sudeste CT: concentração DDT: Dicloro difenil tricloroetano DL: Dose letal DLS: Dynamic Light Scattering (Espectroscopia de correlação de fótons) E: eclosão EE: Eficiência de encapsulação FAO: Food and Agriculture Organization of the United Nations (Organização das Nações Unidas para Alimentação e Agricultura) FDA: Food and Drug Administration Form.: formulação FS: Fator de sinergismo GABA: Ácido gama-aminobutírico IPD: índice de polidispersão LD: Limite de Detecção LMR: Limite Máximo de Resíduos Log P: logaritmo P (coeficiente de partição) x LQ: Limite de Quantificação MAPA: Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento MD: médias de diâmetro MET: Microscopia Eletrônica de Transmissão NLS: Nanopartículas Lipídicas Sólidas NTA: Nanoparticle Tracking Analysis (Análise de Rastreamento de Nanopartículas) NZ: Nanopartícula de Zeína OCDE: Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Econômico OECD: Organisation for Economic Co-operation and Development P: partição PF: peso das fêmeas ingurgitadas PIB: Produto Interno Bruto PO: peso dos ovos PVA: Poli álcool vinílico PZ: potencial zeta (r): Coeficiente de correlação de Pearson R. microplus: Rhipicephalus microplus Ref: Referência sCMOS: Scientific Complementary metal - oxide - semiconductor spp: Espécies TIA: Teste de imersão de adultos TPL: Teste de Pacote de Larvas UR: umidade relativa UV-vis: ultravioleta visível xi Lista de Tabelas CAPÍTULO 1 Tabela 1. Exemplos de carrapaticidas comerciais do tipo pulverização, sua composição e período de carência para leite, de uso comum sobre vacas em lactação no Brasil. ............................................................................................... 13 CAPÍTULO 2 Tabela 1. Composição e concentração dos princípios ativos nas formulações de Nanopartículas Lipídicas Sólidas (NLS) e de Carreadores Lipídicos Nanoestruturados (CLN) ao final do preparo (para caracterização e avaliação de estabilidade), em comparação com o produto comercial. ................................... 45 Tabela 2. Condições analíticas utilizadas para quantificação dos princípios ativos por meio da técnica de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE). ............... 46 Tabela 3. Composição e concentração dos princípios ativos nas formulações de Nanopartículas Lipídicas Sólidas (NLS) e de Carreadores Lipídicos Nanoestruturados (CLN) após a diluição para o teste sobre larvas de Rhipicephalus microplus, em comparação com o produto comercial. ................ 49 Tabela 4. Médias de eficácia das formulações de Nanopartículas Lipídicas Sólidas (NLS) e de Carreadores Lipídicos Nanoestruturados (CLN) em relação à mortalidade (%) das larvas de Rhipicephalus microplus pelo Teste de Pacote de Larvas (TPL). ...................................................................................................... 57 CAPÍTULO 3 Tabela 1. Composição e concentração dos princípios ativos nas formulações de Nanopartículas de Zeína (NZ) ao final do preparo (para caracterização e avaliação de estabilidade), em comparação com o produto comercial. .............................. 75 Tabela 2. Condições analíticas utilizadas para quantificação dos princípios ativos por meio da técnica de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE). ............... 76 Tabela 3. Composição e concentração dos princípios ativos nas formulações de Nanopartículas de Zeína (NZ) após a diluição para os testes sobre Rhipicephalus microplus, em comparação com o produto comercial. ........................................ 79 Tabela 4. Médias de eficácia das formulações de Nanopartículas de Zeína (NZ) e do controle positivo em relação às mortalidades de larvas de Rhipicephalus microplus em 24 horas pelo Teste de Pacote de Larvas (TPL). .......................................... 86 Tabela 5. Médias de peso das fêmeas ingurgitadas (PF), peso dos ovos (PO), % de eclosão das larvas de Rhipicephalus microplus, Índice de Eficiência Reprodutiva (IER) e Eficácia das formulações de Nanopartículas de Zeína (NZ) e do controle positivo pelo Teste de Imersão de Adultos (TIA). ............................................... 88 xii Lista de Figuras CAPÍTULO 1 Figura 1. Rhipicephalus microplus parasitando região caudal (membros posteriores e inserção posterior do úbere) de um bovino, espécie pela qual tem predileção. Fonte: Autor. ......................................................................................................... 3 Figura 2. Fêmea e macho adultos (vista dorsal) de Rhipicephalus microplus. Fonte: Autor. .................................................................................................................... 4 Figura 3. Representação do ciclo de vida do carrapato Rhipicephalus microplus. Fonte: Autor. ......................................................................................................... 4 Figura 4. Fêmea de Rhipicephalus microplus realizando ovipostura. Nesse período, apresenta coloração amarelada. Fonte: Autor. ..................................................... 5 Figura 5. Larvas de Rhipicephalus microplus na vegetação. Fonte: Autor. ................. 6 Figura 6. Bovino infestado por Rhipicephalus microplus. A) Região de pescoço; B) pavilhão auricular. O local de inserção dos parasitas geralmente apresenta lesões de pele e alopecia. Fonte: Autor. .......................................................................... 6 Figura 7. Fórmula estrutural da cipermetrina. Fonte: Anvisa (2020). .......................... 8 Figura 8. Fórmula estrutural do clorpirifós. Fonte: Anvisa (2020). ............................... 9 Figura 9. Fórmula estrutural do citral. Fonte: Sigma Aldrich (2020). ......................... 10 Figura 10. Fórmula estrutural do mentol. Fonte: Sigma Aldrich (2020). .................... 11 Figura 11. Fórmula estrutural do limoneno. Fonte: Sigma Aldrich (2020). ................ 11 Figura 12. Micrografias de Nanopartículas Lipídicas Sólidas (NLS) com aumento de 27800 vezes, obtidas por Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET). A) NLS contendo ivermectina; B) NLS contendo metopreno. Fonte: Adaptado de Cola et al. (2016). ............................................................................................................ 20 Figura 13. Micrografias de Carreadores lipídicos nanoestruturados (CLN) com aumento de 27800 vezes, obtidas por MET. A) CLN contendo ivermectina; B) CLN contendo metopreno. Fonte: Adaptado de Cola et al. (2016). ............................ 21 Figura 14. Micrografias de Nanopartículas de zeína (NZ) obtidas por MET. A) Citral encapsulado em NZ com núcleo único; B) Citral encapsulado em NZ com múltiplos núcleos. Fonte: Adaptado de Su (2012). ............................................................ 24 CAPÍTULO 2 Figura 1. Médias de diâmetro das partículas. A) NLS, formulações 1 (NLS+cip+clo+citral), 2 (NLS+cip+clo+mentol) e 3 (NLS+cip+clo+limoneno); B) CLN, formulações 4 (CLN+cip+clo+citral), 5 (CLN+cip+clo+mentol) e 6 (CLN+cip+clo+limoneno). NLS = Nanopartículas Lipídicas Sólidas; CLN = Carreadores Lipídicos Nanoestruturados; cip = cipermetrina (1,875 mg.mL-1); clo = clorpirifós (3,125 mg.mL-1); citral, mentol, limoneno (0,125 mg.mL-1). ............. 51 Figura 2. Polidispersão média das partículas. A) NLS, formulações 1 (NLS+cip+clo+citral), 2 (NLS+cip+clo+mentol) e 3 (NLS+cip+clo+limoneno); B) CLN, formulações 4 (CLN+cip+clo+citral), 5 (CLN+cip+clo+mentol) e 6 (CLN+cip+clo+limoneno). NLS = Nanopartículas Lipídicas Sólidas; CLN = Carreadores Lipídicos Nanoestruturados; cip = cipermetrina (1,875 mg.mL-1); clo = clorpirifós (3,125 mg.mL-1); citral, mentol, limoneno (0,125 mg.mL-1). ............. 52 xiii Figura 3. Médias de Potencial Zeta das partículas. A) NLS, formulações 1 (NLS+cip+clo+citral), 2 (NLS+cip+clo+mentol) e 3 (NLS+cip+clo+limoneno); B) CLN, formulações 4 (CLN+cip+clo+citral), 5 (CLN+cip+clo+mentol) e 6 (CLN+cip+clo+limoneno). NLS = Nanopartículas Lipídicas Sólidas; CLN = Carreadores Lipídicos Nanoestruturados; cip = cipermetrina (1,875 mg.mL-1); clo = clorpirifós (3,125 mg.mL-1); citral, mentol, limoneno (0,125 mg.mL-1). ............. 53 Figura 4. Médias de distribuição de tamanho das partículas. A) NLS, formulações 1 (NLS+cip+clo+citral), 2 (NLS+cip+clo+mentol) e 3 (NLS+cip+clo+limoneno); B) CLN, formulações 4 (CLN+cip+clo+citral), 5 (CLN+cip+clo+mentol) e 6 (CLN+cip+clo+limoneno). NLS = Nanopartículas Lipídicas Sólidas; CLN = Carreadores Lipídicos Nanoestruturados; cip = cipermetrina (1,875 mg.mL-1); clo = clorpirifós (3,125 mg.mL-1); citral, mentol, limoneno (0,125 mg.mL-1). ............ 54 Figura 5. Concentração média das partículas. A) NLS, formulações 1 (NLS+cip+clo+citral), 2 (NLS+cip+clo+mentol) e 3 (NLS+cip+clo+limoneno); B) CLN, formulações 4 (CLN+cip+clo+citral), 5 (CLN+cip+clo+mentol) e 6 (CLN+cip+clo+limoneno). NLS = Nanopartículas Lipídicas Sólidas; CLN = Carreadores Lipídicos Nanoestruturados; cip = cipermetrina (1,875 mg.mL-1); clo = clorpirifós (3,125 mg.mL-1); citral, mentol, limoneno (0,125 mg.mL-1). ............. 55 Figura 6. Valores médios de pH. A) NLS, formulações 1 (NLS+cip+clo+citral), 2 (NLS+cip+clo+mentol) e 3 (NLS+cip+clo+limoneno); B) CLN, formulações 4 (CLN+cip+clo+citral), 5 (CLN+cip+clo+mentol) e 6 (CLN+cip+clo+limoneno). NLS = Nanopartículas Lipídicas Sólidas; CLN = Carreadores Lipídicos Nanoestruturados; cip = cipermetrina (1,875 mg.mL-1); clo = clorpirifós (3,125 mg.mL-1); citral, mentol, limoneno (0,125 mg.mL-1). ............................................ 56 CAPÍTULO 3 Figura 1. Diâmetro médio das NZ e das formulações NZ-1 (NZ+cip+clo+citral), NZ-2 (NZ+cip+clo+mentol) e NZ-3 (NZ+cip+clo+limoneno) obtido por DLS. NZ = Nanopartículas de zeína; cip = cipermetrina (1,875 mg.mL-1); clo = clorpirifós (3,125 mg.mL-1); citral, mentol, limoneno (0,125 mg.mL-1). ................................ 81 Figura 2. Polidispersão média das NZ e das formulações NZ-1 (NZ+cip+clo+citral), NZ-2 (NZ+cip+clo+mentol) e NZ-3 (NZ+cip+clo+limoneno). NZ = Nanopartículas de zeína; cip = cipermetrina (1,875 mg.mL-1); clo = clorpirifós (3,125 mg.mL-1); citral, mentol, limoneno (0,125 mg.mL-1). ............................................................ 82 Figura 3. Potencial Zeta médio das NZ e das formulações NZ-1 (NZ+cip+clo+citral), NZ-2 (NZ+cip+clo+mentol) e NZ-3 (NZ+cip+clo+limoneno). NZ = Nanopartículas de zeína; cip = cipermetrina (1,875 mg.mL-1); clo = clorpirifós (3,125 mg.mL-1); citral, mentol, limoneno (0,125 mg.mL-1). ............................................................ 83 Figura 4. Distribuição de tamanho médio das NZ e das formulações NZ-1 (NZ+cip+clo+citral), NZ-2 (NZ+cip+clo+mentol) e NZ-3 (NZ+cip+clo+limoneno). NZ = Nanopartículas de zeína; cip = cipermetrina (1,875 mg.mL-1); clo = clorpirifós (3,125 mg.mL-1); citral, mentol, limoneno (0,125 mg.mL-1). ................................ 83 Figura 5. Concentração média das NZ e das formulações NZ-1 (NZ+cip+clo+citral), NZ-2 (NZ+cip+clo+mentol) e NZ-3 (NZ+cip+clo+limoneno). NZ = Nanopartículas de zeína; cip = cipermetrina (1,875 mg.mL-1); clo = clorpirifós (3,125 mg.mL-1); citral, mentol, limoneno (0,125 mg.mL-1). ............................................................ 84 xiv Figura 6. Valores médios de pH das NZ e das formulações NZ-1 (NZ+cip+clo+citral), NZ-2 (NZ+cip+clo+mentol) e NZ-3 (NZ+cip+clo+limoneno). NZ = Nanopartículas de zeína; cip = cipermetrina (1,875 mg.mL-1); clo = clorpirifós (3,125 mg.mL-1); citral, mentol, limoneno (0,125 mg.mL-1). ............................................................ 85 Figura 7. Atividade residual das formulações e do controle positivo, a partir das médias de mortalidade de larvas de Rhipicephalus microplus, obtidas por TPL realizado em 1, 2, 3, 7, 14, 42 e 49 dias após o primeiro tratamento dos papéis filtro, indicando a persistência de atividade no decorrer do tempo. NZ = Nanopartículas de zeína; cip = cipermetrina; clo = clorpirifós. Formulações NZ-1 (NZ+cip+clo+citral), NZ-2 (NZ+cip+clo+mentol) e NZ-3 (NZ+cip+clo+limoneno) avaliadas a 0,466 mg.mL-1 (0,125, 1,875 e 3,125 mg.mL-1 de composto vegetal, cip e clo, respectivamente); Colosso® avaliado a 0,512 mg.mL-1 (0,012, 0,187 e 0,312 mg.mL-1 de citronelal, cip e clo, respectivamente). ................................... 87 1 CAPÍTULO 1 - Considerações gerais 1. Introdução De acordo com OCDE‑FAO (2020), o Brasil está entre os países que continuarão dominando a produção pecuária nos próximos anos. Do ponto de vista global, há perspectivas de que as produções de leite e carne sejam intensificadas, resultando em forte crescimento para o setor da bovinocultura. A agroindústria tem demonstrado sinais de recuperação da economia desde o segundo semestre de 2017 e o PIB do agronegócio tem se expandido, incluindo o do setor pecuário (Cepea-CNA, 2018; 2020). Apesar de todos os esforços, entretanto, a pecuária enfrenta dificuldades que impedem um maior desenvolvimento. O parasitismo pelo carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Canestrini, 1888) é considerado um entrave, pois são inúmeros os prejuízos acarretados por esse parasita, incluindo a queda nos desempenhos de produção e a transmissão de hemoparasitas que podem causar Tristeza Parasitária Bovina, doença que ocasiona altas taxas de mortalidade nos rebanhos (Guglielmone et al., 2006; Raynal et al., 2013; Grisi et al., 2014). O principal método empregado no controle de carrapatos é a utilização de carrapaticidas comerciais, entretanto, devido ao seu uso indiscriminado e falta de orientação técnica, observou-se um aumento dos relatos científicos acerca da resistência de R. microplus (Furtado et al., 2013; Raynal et al., 2013; Cruz et al., 2015; Higa et al., 2016). O risco da presença de resíduos de medicamentos nos produtos de origem animal e no meio ambiente é também um fator preocupante, uma vez que pode comprometer a saúde humana e o equilíbrio ambiental (Schwarzenbach et al., 2010; Furtado et al., 2013). A população tem voltado sua preocupação para a segurança de alimentos, optando por aqueles livres de resíduos tóxicos, o que demonstra a necessidade da busca por alternativas eficientes que garantam o controle de R. microplus e sobretudo a segurança dos alimentos de origem animal. Nesse sentido, há décadas têm se pesquisado novas moléculas provenientes de plantas para o controle parasitário (Habeeb, 2010; Chagas et al., 2014; 2016; Figueiredo et al., 2018; Medeiros et al., 2 2019; Vinturelle et al., 2021). A nanotecnologia tende a contribuir para o desenvolvimento de novos sistemas, visando melhorar a estabilidade físico química de compostos vegetais e prevenir a rápida degradação desses compostos. Além disso, pode promover a liberação de um composto ativo para o organismo alvo, liberação controlada das moléculas no local de ação e minimizar efeitos tóxicos indesejáveis em organismos não-alvo (Ghormade et al., 2011; Gogos et al., 2012; Perlatti et al., 2013; Durán e Marcato, 2013). Nanoformulações a base de compostos com ação repelente podem ser uma opção para controlar R. microplus em propriedades leiteiras (Chagas e Rabelo, 2012; Nogueira et al., 2020), sobretudo se associadas a princípios ativos registrados para uso em vacas em lactação. Sistemas nanocarreadores são capazes de transportar moléculas bioativas de forma prolongada, aumentar a eficiência e garantir a liberação do princípio ativo por longo período de tempo, contribuindo para a redução de impactos ambientais (Mogul et al.,1996). Dessa forma, o objetivo desse estudo foi desenvolver nanoformulações carrapaticidas a partir de Nanopartículas Lipídicas Sólidas (NLS), Carreadores Lipídicos Nanoestruturados (CLN) e Nanopartículas de Zeína (NZ), associadas à cipermetrina, clorpirifós e um composto vegetal (citral, mentol ou limoneno), caracterizar e verificar a eficácia dessas nanoformulações contra larvas e fêmeas ingurgitadas de R. microplus. 2. Revisão de literatura 2.1 Rhipicephalus (Boophilus) microplus e consequências de seu parasitismo O carrapato Rhipicephalus microplus é originário da Ásia e apresenta ampla distribuição geográfica, sobretudo nos países do hemisfério sul, em regiões de clima tropical e subtropical (Nuñes et al., 1982). O subgênero Boophilus está representado por apenas duas espécies na América Latina: Rhipicephalus (Boophilus) microplus e Rhipicephalus (Boophilus) annulatus (Guglielmone et al., 2006). Segundo esses autores, a espécie R. annulatus está restrita ao nordeste do México, enquanto o R. microplus está distribuída do norte da Argentina até o México, incluindo as ilhas do Caribe. 3 Rhipicephalus microplus é considerado monoxeno, por completar seu ciclo evolutivo parasitando apenas um hospedeiro. Devido à sua predileção por bovinos de raças taurinas (Bos taurus) e seus cruzamentos, é conhecido como o carrapato-do- boi ou carrapato-bovino. Há uma grande preocupação decorrente do hematofagismo (hábito de se alimentar de sangue) (Figura 1), fazendo com que esse carrapato seja um importante vetor na transmissão dos agentes etiológicos causadores da Tristeza Parasitária Bovina (Babesia bigemina, Babesia bovis, Anaplasma marginale) e de Borrelia theileri, principalmente na América do Sul, Central e Austrália, levando a alto índice de mortalidade nos rebanhos (Veríssimo et al., 1997; Murrell et al., 2001; Estrada-Peña et al., 2006; Guglielmone et al., 2006; Taylor et al., 2007; Pereira et al., 2008; Catto et al., 2010). Figura 1. Rhipicephalus microplus parasitando região caudal (membros posteriores e inserção posterior do úbere) de um bovino, espécie pela qual tem predileção. Fonte: Autor. Rhipicephalus microplus (Figura 2) apresenta coloração cinza-escuro e escudo dorsal (parcial nas fêmeas, ninfas e larvas; e completo nos machos), com ausência de ornamentações. Seu ciclo evolutivo é dividido em duas fases, conforme ilustrado 4 na Figura 3 (Guimarães et al., 2001; Mans e Neitz, 2004; Pereira et al., 2008). Figura 2. Fêmea e macho adultos (vista dorsal) de Rhipicephalus microplus. Fonte: Autor. Figura 3. Representação do ciclo de vida do carrapato Rhipicephalus microplus. Fonte: Autor. 5 A fase parasitária inicia-se quando a “larva infestante” consegue subir e fixar- se no bovino, dessa forma permanecendo por aproximadamente 22 dias. Após sofrer diferentes mudas (estágios de metalarva, ninfa e metaninfa), ocorre a diferenciação sexual. O macho (neandro) atinge a fase adulta (gonandro) e começa a percorrer o corpo do bovino para fecundar as fêmeas. A fêmea (neógina) após ser fecundada (partenógina), recebe então a denominação “teleógina”, próximo ao momento de se desprender do animal e dar início à fase de vida livre, na qual ocorre a postura dos ovos (Figura 4) (Gonzales, 1995). Figura 4. Fêmea de Rhipicephalus microplus realizando ovipostura. Nesse período, apresenta coloração amarelada. Fonte: Autor. A fase de vida livre corresponde ao período no qual o carrapato permanece nas pastagens. Ao se desprender do animal, a teleógina procura um local para se imergir no solo em meio as pastagens. Após 3 a 9 dias, dependendo da temperatura, inicia a postura dos ovos, período que tem a duração de aproximadamente 15 a 18 dias. Após aproximadamente 7 dias ocorre o início da eclosão das larvas. As recém-eclodidas, imediatamente, não têm capacidade de subir no hospedeiro, porém, em 7 dias tornam- se infestantes (Figura 5), ou seja, com capacidade de subir, fixar-se e continuar seu desenvolvimento no bovino. Podem sobreviver até seis meses nas pastagens, sem alimentação (Gonzales, 1995). 6 Figura 5. Larvas de Rhipicephalus microplus na vegetação. Fonte: Autor. Elevadas infestações por R. microplus podem ocasionar anemia, perda de peso, diminuição da imunidade e da produtividade dos bovinos. Esse parasita é considerado um grave problema sanitário nos sistemas de produção devido às lesões que provoca nos locais de sua fixação (Figura 6), resultando em um atrativo para moscas e miíases (bicheiras) que, além de causarem desconforto aos animais, podem afetar a posterior comercialização do couro (Guglielmone et al., 1999; Lopes et al., 2013; Maza et al., 2013). Figura 6. Bovino infestado por Rhipicephalus microplus. A) Região de pescoço; B) pavilhão auricular. O local de inserção dos parasitas geralmente apresenta lesões de pele e alopecia. Fonte: Autor. A B 7 2.2 Controle do carrapato Rhipicephalus microplus Tentativas para promover o controle alternativo do carrapato bovino têm sido realizadas. Há estudos voltados ao emprego de biocontroladores fúngicos (Camargo et al., 2016; Fernández-Salas et al., 2017; Webster et al., 2017), tratamentos alternativos como homeopatia (Valente et al., 2017), extratos e óleos essenciais de plantas (Chagas, 2008; Figueiredo et al., 2018) e até mesmo ao desenvolvimento de vacinas para atuarem na imunização e diminuir as infestações do carrapato (Aguirre et al., 2016; Gomes et al., 2015; Maruyama et al., 2017; Trentelman et al., 2017). Uma das estratégias de controle de R. microplus consiste em reduzir suas populações a níveis economicamente aceitáveis nos bovinos (Martins et al., 2002). Carrapaticidas sintéticos têm sido a principal forma de controlar e reduzir infestações de carrapatos nos rebanhos há mais de um século. A aplicação desses acaricidas (geralmente disponíveis na forma de aspersão, pour on ou injetáveis) continua sendo o método de eleição para controle do carrapato R. microplus na bovinocultura (Furlong, 2005; Klafke et al., 2006; Furtado et al., 2013). Em 1896, os acaricidas passaram a ser empregados de forma sistemática no controle de carrapatos em bovinos, a partir da utilização do arsênico. Entretanto, seu uso foi liberado nos Estados Unidos somente em 1910, quando se criou uma ponte para a comercialização internacional e foi muito utilizado até ser detectada a resistência dos carrapatos. Assim, após 1937, as preocupações relacionadas à resistência e ao risco da presença de resíduos que poderiam comprometer a saúde humana impulsionaram o desenvolvimento dos novos produtos: organoclorados (1946), ciclodienos e toxafeno (1947), formamidinas (1975), piretroides (1977), e as lactonas macrocíclicas (1981) (George et al., 2008). 2.2.1 Cipermetrina A cipermetrina (fórmula molecular: C22H19Cl2NO3) (Figura 7) é uma substância da classe dos piretroides tipo 2, os quais apresentam agrupamento α-ciano (Classe II na classificação toxicológica). Sua aplicação foi estimulada extensivamente após o aparecimento de resistência aos carraparicidas da classe dos organofosforados, utilizados no país na década de 1980 (Andreotti, 2010). Os piretroides apresentam 8 propriedades lipofílicas que facilitam a sua penetração nos artrópodes através da sua cutícula rica em lipídios. Depois de absorvidos, os piretroides são levados para as células nervosas por meio da hemolinfa (Sartor e Santarém, 2018). Figura 7. Fórmula estrutural da cipermetrina. Fonte: Anvisa (2020). Os piretroides, incluindo a cipermetrina, têm seu sítio de ação no canal de sódio da membrana de axônios. Agem aumentando a condutância desse íon para o interior da célula. Também podem causar uma despolarização da membrana nervosa sem descargas repetitivas e reduzir a amplitude do potencial de ação. Além disso, a cipermetrina pode atuar promovendo inibição de Ca+2, Mg+2 - adenosina trifosfatase (ATPase) e sobre calmodulina, responsável pela ligação intracelular dos íons de cálcio. Podem ainda atuar como agonista em receptores colinérgicos nicotínicos e como antagonista nos receptores do ácido gama-aminobutírico (GABA) (Sartor e Santarém, 2018). Em relação aos mecanismos de resistência, dois padrões foram identificados. O primeiro é a forma de alteração do sítio de ação das esterases, tornando-os insensíveis por mutações do gene relacionados aos canais de sódio. A proteína codificada por esse gene tende a alterar sua estrutura, o que o torna resistente aos piretroides. O segundo mecanismo, menos elucidado, envolve detoxificação metabólica mediada pela ação de esterases e de citocromo P450. Entretanto, podem ser encontradas variações genéticas em diferentes populações para esses mecanismos (He et al., 1999; Miller et al., 1999; Guerrero et al., 2001; Andreotti, 2010). A cipermetrina não apresenta poder residual quando aplicada sob a forma de pulverização. Nesse caso, é recomendado um intervalo de tratamento de 21 dias. De 9 maneira geral, os piretroides apresentam baixa toxicidade aos mamíferos, quando comparados aos organofosforados (Andreotti, 2010). 2.2.2 Clorpirifós O clorpirifós (fórmula molecular: C9H11Cl3NO3PS) (Figura 8) é uma substância pertencente à classe dos organofosforados (Classe II na classificação toxicológica), amplamente empregados no controle de pragas agrícolas e pecuárias. Os organofosforados são derivados orgânicos do ácido fosfórico. Seu mecanismo de ação consiste em inibir a enzima acetilcolinesterase, gerando consequente aumento de acetilcolina em níveis tóxicos para os carrapatos, resultando em intensas contrações dos músculos até a paralisia. Os organofosforado, incluindo o clorpirifós, ligam-se “irreversivelmente” ao local esterásico da enzima colinesterase, que é responsável pela hidrólise da molécula de acetilcolina (Ach). Com isso, a Ach se acumula onde esse neurotransmissor é liberado, promovendo hiperexitabilidade e hiperatividade, posterior incoordenação muscular, convulsões e morte do parasita (Andreotti, 2010; Sartor e Santarém, 2018). Figura 8. Fórmula estrutural do clorpirifós. Fonte: Anvisa (2020). Dentre as classes de carrapaticidas disponíveis comercialmente para bovinos no Brasil, organofosforados é a mais antiga. Foram introduzidos em meados de 1955 com o objetivo de substituir os organoclorados como DDT e BHC, os quais já apresentavam resistência cruzada em diferentes espécies de carrapatos. Além disso, havia preocupação relacionada aos seus resíduos, ou seja, à sua capacidade de 10 persistir no ambiente e no organismo dos animais por meio de seu acúmulo na gordura corpórea (George et al., 2008; Higa et al., 2019). Os mecanismos da resistência dos carrapatos frente aos organofosforados ainda precisam ser melhor elucidados. No entanto, sabe-se que há relação com a insensibilidade da AChE, o aumento do metabolismo das esterases localizadas no tegumento de teleóginas resistentes e a superexpressão dessas enzimas em larvas (Villarino, 2001; Foil et al., 2004). Os organofosforados podem ser encontrados em associação com piretroides. Quando aplicados sob a forma de pulverização, não apresentam poder residual, sendo recomendado um intervalo de tratamento de 21 dias (Andreotti, 2010). 2.2.3 Compostos vegetais (citral, mentol e limoneno) Pesquisas por novas moléculas a base de substâncias vegetais para o controle parasitário têm sido realizadas há décadas, sobretudo para o controle do carrapato bovino (Habeeb, 2010; Chagas et al., 2014; 2016; Sousa et al., 2020). Citral (fórmula molecular: C10H16O) (Figura 9) é amplamente utilizado nas indústrias de perfumaria, alimentos e cosméticos (Bizzo et al., 2009). Possui baixa toxicidade, uma vez que doses inferiores a 1068 g/kg não apresentam toxicidade em ratos (Dieter et al., 1993). Foi relatado em espécies de Cymbopogon spp., Eucalyptus spp., tendo seu efeito tóxico demonstrado sobre fêmeas ingurgitadas de R. microplus (Chagas et al., 2002; Agnolin et al., 2014). Figura 9. Fórmula estrutural do citral. Fonte: Sigma Aldrich (2020). 11 Mentol (fórmula molecular: C10H20O) (Figura 10) também já demonstrou ter efeito sobre R. microplus. Mentha arvensis (86,7% de mentol) e Mentha piperita (30,5% de mentol) na forma de óleos essenciais obtiveram eficácia de 86 e 89%, respectivamente sobre larvas de R. microplus, alcançando CL50 e CL90 de 14,46 e 16,96 e de 14,81 e 24,99 mg.mL-1, respectivamente (Chagas et al., 2016). Figura 10. Fórmula estrutural do mentol. Fonte: Sigma Aldrich (2020). Alguns óleos essenciais ricos em limoneno (fórmula molecular: C10H16) (Figura 11) já demonstraram diversas ações inseticidas, repelentes e atividades fitotóxicas (Ibrahim et al., 2001), evidenciando potencial efeito aditivo contra R. microplus (Ferrarini et al., 2008; Peixoto et al., 2015). Figura 11. Fórmula estrutural do limoneno. Fonte: Sigma Aldrich (2020). Limoneno e citral são alguns dos componentes mais prevalentes em óleos essenciais da espécie Lippia alba. Ambos apresentam potente atividade acaricida contra larvas e fêmeas ingurgitadas de R. microplus, principalmente o citral, o que pode ser devido a sua capacidade de penetração cuticular no parasita (Peixoto et al., 12 2015). R-(+)-limoneno e S-(-)-limoneno (comerciais) foram avaliados sobre fêmeas ingurgitadas e larvas de R. microplus, determinando CL50 de 31,2 e 54,5 mg.mL-1, respectivamente. No mesmo estudo, os quimiotipos de carvonas (sintetizados a partir do limoneno) do óleo essencial de L. alba: LA-13 (26,95% de limoneno e 52,94% de carvona) e LA-57 (25,86% de limoneno e 63,47% de carvona) obtiveram CL50 de 16,8 e 27,0 mg.mL-1, respectivamente (Peixoto et al., 2015). Em outro estudo, o óleo essencial de L. alba (61,7% de carvona e 17,5% de limoneno) resultou em 100% de eficácia sobre as larvas de R. microplus, determinando as CL50 e CL90 de 5,84 e 11,14 mg.mL-1, respectivamente (Chagas et al., 2016). 2.3 Período de carência Um dos principais fatores que influenciam diretamente o controle estratégico dos carrapatos é a escolha da medicação a ser administrada nos animais. É preciso levar em consideração o período de retenção dos compostos carrapaticidas, os períodos de proteção residual contra o carrapato e, sobretudo, a eficiência desse produto em relação ao desafio da infestação, para que o tratamento seja bem- sucedido (Pereira, 2009; Corrêa et al., 2015). O número de grupos químicos comerciais disponíveis para aplicação em vacas lactantes é muito restrito devido ao “período de carência”. Ou seja, tempo de abstinência necessário, mensurado em dias ou horas, que o fabricante deve obrigatoriamente informar na bula, segundo Normas da Coordenação de Fiscalização de Produtos Veterinários do MAPA. Após a aplicação dos carrapaticidas, o descarte do leite no período recomendado garantirá que a concentração de resíduos resultante no leite destinado ao consumo esteja abaixo do Limite Máximo de Resíduos (LMR), de maneira a não se tornem tóxicos ao serem ingeridos diariamente (Langeloh, 2010). Atualmente, os carrapaticidas mais indicados para animais em lactação são aqueles que possuem princípios ativos com menor período de carência, conforme demonstrado na Tabela 1. 13 Tabela 1. Exemplos de carrapaticidas comerciais do tipo pulverização, sua composição e período de carência para leite, de uso comum sobre vacas em lactação no Brasil. Nome Comercial Composição (a cada 100 mL) Carência Alatox Diclorvós…................................................................45 g Cipermetrina................................................................5 g Não requer Barrage Alfaciano-3-fenoxibenzil-2,2-dimetil-3-(2,2-diclorovinil)- ciclopropano carboxilato (Cypermethrin)…………….15 g Butox P CE 25 Deltametrina base..........…………..………..........…..2,5 g Cyperbio Cipermetrina...........................................................15,0 g Sarcolin Cipermetrina técnica...............................................10,0 g Ciclorfós Pulverização Cipermetrina..............................................................20 g Clorpirifós..................................................................50 g 6 horas Neguvon + Asuntol Plus Triclorfone...........…………………………............…77,6 g Coumafós..........…………………………..….….........1,0 g Ciflutrina …..........…………………………….............1,0 g 10 horas Supokill Supona (2 cloro-1-(2,4 diclorofenil) vinil dietil fosfato)………………………………...…...……....…50,0 g 12 horas Carvet Amitraz ...................…………………..…............….12,5 g 24 horas Carrapatox Cipermetrina...........................................................10,0 g Combo Pulverização Cipermetrina ………………………………….....….15,00 g Clorpirifós …………………………………..…….…25,00 g Butóxido de piperonila ……………………..…......1,00 mL Cypermetril Pulverização e Banho Cipermetrina...........................................................15,0 g Máximo Pulverização Cipermetrina...........……………………..….…...….15,00 g Clorpirifós...........………………………….......…....25,00 g Butóxido de Piperonila….........……………......…...1,00 g Triatox pulverização Amitraz ......................…………………..….........….12,5 g Bovitraz Amitraz ......................…………………..….........….12,5 g Couro Limpo Pulverização Cipermetrina...........................................................15,0 g Clorpirifós..……………………….….........................25,0 g Citronelal......……………………….…..…..................1,0 g Ectobat 80 DDVP (Diclorvós).…………..…………..…..............60,0 g Clorpirifós…………………………...……..……........20,0 g Colosso FC30 Clorpirifós…………………………………………….....30 g Cipermetrina……………….........………….................15 g Fenthion......……………………………….....….....…..15 g 72 horas (3 dias) Colosso Pulverização Cipermetrina...........................................................15,0 g Clorpirifós..……………………….…........................25,0 g Citronelal......……………………….….......................1,0 g Cyperclor Plus Pulverização Cipermetrina..............…………………..….…...….15,00 g Clorpirifós...........………………………….......…....25,00 g Butóxido de Piperonila.............……………......….15,00 g Citronelal…………………………………..….…........1,00 g Flytion SP Clorpirifós...................................................................50 g Cipermetrina high-cis.................................................06 g Masterfly Cipermetrina............................................................15,0 g *Fonte: Bula dos referidos medicamentos. 14 2.4 Resíduos carrapaticidas O período de carência é um critério que deve ser rigorosamente respeitado. Entretanto, por vezes, os profissionais do campo não se atentam às recomendações de uso dos acaricidas e não respeitam o tempo de descarte do leite dos animais recém tratados. Isso aumenta a possibilidade de resíduos carrapaticidas serem encontrados nos produtos de origem animal. Esse risco da presença de fármacos na carne, leite e até mesmo no ambiente é um grande fator de preocupação, uma vez que podem comprometer a saúde humana e prejudicar o equilíbrio ambiental (Schwarzenbach et al., 2010; Furtado et al., 2013; Jin et al., 2015). A contaminação do leite pode ocorrer por meio da aplicação de carrapaticidas no corpo dos bovinos lactantes, tanto no estábulo quanto nas áreas de processamento do leite. A constatação da presença de resíduos demonstra a falta de qualidade do alimento destinado ao consumidor e é um fator preocupante, pois o leite é um alimento amplamente consumido nas fases iniciais da vida e efetivo sobretudo na dieta de crianças e idosos (Goulart et al., 2008). A ocorrência do contato de pesticidas em organismos não-alvo (nesse caso, os humanos) precisa ser avaliada criteriosamente (Altun et al., 2017), uma vez que podem causar efeitos adversos. Sabe-se que a exposição prolongada à pesticidas pode resultar em problemas hepáticos, renais (Peres et al., 2006), distúrbios dos sistemas neurológico, imunológico (Karmaus et al., 2003) e endócrino (Colborn et al., 1993), além do risco de câncer de mama, pulmão, colo do útero e de próstata (Ahmed et al., 2002). Dessa forma, urge a necessidade de tentar reverter esse quadro. 2.5 Resistência de Rhipicephalus microplus frente aos carrapaticidas Relatos de resistência do carrapato R. microplus frente aos carrapaticidas a base de piretróides sintéticos e organofosforados têm sido registrados (Nolan et al., 1977; Raynal et al., 2013; Cruz et al., 2015; Higa et al., 2016). Em 2014 foi documentado o primeiro caso de resistência ao Fluazuron, mais recente carrapaticida lançado no mercado e único princípio ativo até então sem relatos anteriores de resistência. Além disso, foi identificada a primeira população de carrapatos resistentes a seis classes de acaricidas, por meio dos estudos de Reck et al. (2014). 15 Levantamentos da resistência do carrapato bovino no estado de São Paulo, por exemplo, indicaram que em propriedades do Noroeste do estado, os piretroides foram os menos eficazes (17% e 27% para cipermetrina e deltametrina, respectivamente), indicando resistência em todas as propriedades averiguadas. Amitraz, clorpirifós+cipermetrina e clorpirifós+diclorvós demonstraram as maiores médias de eficácia: 73%, 79% e 76%, respectivamente (Ueno et al., 2012). Em um novo estudo realizado em diferentes propriedades da mesma região, Oliveira et al. (2013) observaram que as médias de eficácia para amitraz, cipermetrina, deltametrina, fipronil, organofosforado e cipermetrina+clorpirofós+citronela foram de: 66%, 70%, 85%, 87%, 78% e 98%, respectivamente, demonstrando que associações tenderam a aumentar a eficácia sobre o controle de populações de carrapatos resistentes. Um problema que merece destaque em relação à resitência adquirida por R. microplus frente aos carrapaticidas está ligado à mosca-dos-chifres (Haematobia irritans), ectoparasita de bovinos. A aplicação de piretroides e organoforados para o controle dessa mosca, porém, em dosagens insuficientes para controlar os carrapatos, contribuiu e continua a contribuir, indiretamente, para o aumento da resistência do carrapato a esses dois grupos químicos (Martins, 2004). 2.6 Associação de princípios ativos A associação de princípios ativos de diferentes grupos químicos, incluindo substâncias de origem vegetal, tem sido bastante difundida na agropecuária e surgiram com a finalidade de promover um controle mais eficaz dos ectoparasitas que comprometem o agronegócio, como é o caso do parasitismo pelo carrapato R. microplus (Roel et al., 2001). A associação de piretroides e organofosforados, por exemplo, é realizada com o intuito de aumentar a eficiência dos piretróides (Andreotti, 2010). De acordo com Vargas et al. (2003), combinações de diferentes classes de compostos químicos geralmente são mais eficazes do que formulações com único princípio ativo. Isso ocorre devido à possibilidade de os antiparasitários associados diminuirem a indução de mecanismos de resistência por meio das diferentes formas 16 de ação sobre os parasitas (Chagas, 2015). Shalaby et al. (2012) compararam os efeitos morfológicos, in vitro, de compostos químicos sintéticos e vegetais sobre formas adultas de Haemonchus contortus, Moniezia expansa e Fasciola gigantica. Após 24 horas de incubação nos princípios ativos, os autores evidenciaram que a associação do óleo de sementes secas de Nigella sativa (0,5 mg.mL-1) + ivermectina (25 ng.mL-1) foi significativamente mais eficaz na destruição das superfícies cuticulares e tegumentais dos helmintos, em relação aos efeitos produzidos pelos mesmos compostos, de maneira isolada, contendo o dobro da dosagem (ou seja: 1 mg.mL-1 de extrato de óleo de N. sativa e 50 ng.mL-1 de ivermectina). Associações de inseticidas e o óleo essencial de Piper aduncum L. foram testadas sobre larvas da “lagarta do cartucho” (Spodoptera frugiperda), praga de culturas de milho, e por meio da relação das doses e concentrações letais, os fatores de sinergismo (FS) foram determinados. A partir da associação com o éleo essencial, verificaram potencializações significativas dos inseticidas formulados com cipermetrina (FS= 73,03), zeta-cipermetrina (FS= 16,51) e permetrina (FS= 8,46- 17,22), por contato residual, e dos inseticidas a base de zeta-cipermetrina (FS= 0,40- 4,26), permetrina (FS= 2,10-4,79) e esfenvarelato (FS= 3,80), por contato tópico, demonstrando que P. aduncum pode ser uma boa alternativa frente ao butóxido de piperonila, sinergista sintético (Fazolin et al., 2016). Butóxido de piperonila é o sinérgico de maior utilização industrial. Sua principal função é potencializar os princípios ativos piretroides, reforçando e aperfeiçoando sua ação inseticida. Isso ocorre por meio da ação inibidora sobre o complexo enzimático do citocromo P450. Ao inibir essas enzimas que atuam nos mecanismos de desintoxicação dos piretroides, permitem que a concentração dos princípios ativos dentro do corpo do parasita seja maior. Sinergistas agem como uma substância alternativa, competindo com o pesticida e reduzindo a detoxificação. Agem também inibindo alostericamente outros sítios enzimáticos em esterases e oxidases multifuncionais, minimizando a quantidade de princípios ativos necessária para o controle dos parasitas (Gunning et al., 1999; Rocha e Ming, 1999). Citronelal tem sido amplamente utilizado em carrapaticidas comerciais. Vários óleos essenciais têm esse composto como majoritário ou em porcentagens 17 significativas em sua composição, e alguns estudos já evidenciaram sua ação repelente e acaricida contra R. microplus (Olivo et al., 2008; Chagas et al., 2002; 2014; Mello et al., 2014). Além da influência exclusiva do composto majoritário, a interação com os demais metabólitos presentes nos óleos essenciais (especialmente a interação sinérgica) tem sido avaliada e sugerida como a responsável pela atividade biológica desempenhada pelos óleos essenciais. A interação sinérgica acontece quando o efeito da associação de duas ou mais substâncias ocorrem na mesma direção, podendo ser por adição (quando o efeito da associação é igual a soma dos efeitos das substâncias isoladas) ou por potencialização (quando o efeito da associação supera o efeito da soma das substâncias isoladas) (Bakkali et al., 2008; Florio, 2011). Essas evidências reforçam a idéia de que associações de drogas sintéticas e compostos vegetais podem ser uma alternativa para tentar conter o atual quadro de acelerada resistência de R. microplus aos fármacos disponíveis comercialmente. Pesquisas com enfoque na área de medicina etnoveterinária devem ser priorizadas devido a esse aumento de resistência (Avinash et al., 2017) e ainda devido a esse motivo, há uma urgente necessidade de buscar medidas que possam controlar, de maneira segura, as infestações por carrapatos nos animais. Assim como citronelal, os terpenos citral, mentol e limoneno (presentes em óleos essenciais de diferentes espécies vegetais, os quais já demonstraram ação contra R. microplus, segundo Cruz et al. (2013) e Chagas et al., 2016), também podem ser uma alternativa para potencializar a ação de acaricidas sintéticos. 2.7 Nanotecnologia e nanocarreadores Nanotecnologia é o termo utilizado para a ciência que descreve processos de manipulação, geração e uso de nanomateriais. Desde o início do surgimento da nanotecnologia seu potencial promissor sempre foi evidente, principalmente devido a sua ampla possibilidade de atuação. Estudos recentes evidenciaram que o emprego dos nanomateriais podem contribuir até mesmo em problemas relacionados ao uso e aplicação de pesticidas (Chen e Yada, 2011; Kah e Hofmann, 2014; Campos et al., 2014; Pascoli et al., 2020). 18 Nanomateriais, na forma de nanopartículas, podem ser utilizados como carreadores de princípios ativos em fármacos para uso na agropecuária. Sistemas nanocarreadores são capazes de transportar uma molécula bioativa de forma contínua e prolongada, possuem características desejáveis como o aumento da eficiência, minimização de impactos ambientais e garantia de liberação prolongada. Esses sistemas ainda podem proporcionar maior eficiência às formulações, permitindo a redução da quantidade necessária de princípios ativos para se obter eficácia, contribuindo, dessa forma, para o desenvolvimento sustentável (Mogul et al., 1996; Campos et al., 2014; Oliveira et al., 2015). Martin-Ortigosa et al. (2012), por exemplo, proposeram um novo sistema de entrega de DNA/proteína para a área de genômica vegetal, por meio de nanopartículas de sílica mesoporosa (NSM). Esses autores demonstraram que NSM com poros de 10 nm funcionalizadas com ouro (Au) podem ser utilizadas para carrear proteínas com grandes diâmetros hidrodinâmicos (4,5 nm) e liberá-las em condições fisiológicas. Essa associação Au-NSM englobando a proteína ainda pode ser revestida com DNA de plasmídeo e introduzida em tecidos vegetais por meio de bombardeio de partículas, de modo que a entrega e liberação de dois tipos de biomoléculas, proteínas e DNA plasmidial podem ser detectadas nas mesmas células vegetais. Avinash et al. (2017) demonstraram que os compostos 2,3-desidroalanol (DHS) e quercetina di-hidratada (QDH), sintetizados a partir de extrato das folhas de nim (EN), Azadirachta indica, apresentaram maior atividade sobre R. microplus quando associados a nanopartículas de prata (NPs-Ag) em comparação com deltametrina (DN) e não-associações. As CL50 determinadas sobre larvas pelo EN, 2,3-DHS, QDH e DN foram de: 1449,35, 26,37, 183,78 e 49,71 ppm, respectivamente, enquanto para as associações NPs-Ag-mediadas por EN, 2,3- DHS-NPs-Ag, QDH-NPs-Ag e DN-NPs-Ag foram de: 35,40, 14,42, 22,6, e 3,87 ppm, respectivamente. Estudos envolvendo a aplicação de carreadores têm sido cada vez mais difundidos, almejando avanços na medicina humana e veterinária. Na área da parasitologia, entretanto, nanocarreadores ainda têm poucas aplicações. Contudo, o desenvolvimento de novos sistemas de liberação, que possibilitem intervalos de 19 dosagem mais prolongados e o aumento da atividade dos fármacos contra parasitas de importância de saúde pública e animal são alguns dos temas mais estudados em nanoparasitologia (Cruz e Molento, 2015). 2.7.1 Nanocarreadores lipídicos Nanocarreadores lipídicos possuem a capacidade de aumentar o perfil de segurança e reduzir efeitos colaterais de medicamentos. São sistemas utilizados para direcionar fármacos para seu sítio de ação específico. Nanocarreadores lipídicos contendo fármacos antineoplásicos tendem a aumentar a segurança da terapia medicamentosa ao favorecerem o acúmulo desses no local de tratamento (Oliveira et al., 2012; Bruni et al., 2017). Esses sistemas têm atraído a atenção da comunidade científica, pois além de serem biocompatíveis e biodegradáveis, não possuem toxicidade e contêm grande potencial para transportar fármacos citotóxicos (Wong et al., 2007). Nanopartículas Lipídicas Sólidas (NLS) (Figura 12) são sistemas constituídos por lipídeos sólidos sob temperatura ambiente e corporal, apresentam boa estabilidade física, química e biológica, além de boa tolerabilidade, biodegradação e alta disponibilidade. Permitem a prevenção da degradação química e oxidativa do composto encapsulado (Müller et al., 2000; Souto et al., 2011). Em um estudo com formulações contendo NLS, foi verificado que essas podem permanecer estáveis por um período de dois meses, reduzindo significativamente a perda de princípios ativos por evaporação, quando comparado a emulsões clássicas (Lai et al., 2006). 20 Figura 12. Micrografias de Nanopartículas Lipídicas Sólidas (NLS) com aumento de 27800 vezes, obtidas por Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET). A) NLS contendo ivermectina; B) NLS contendo metopreno. Fonte: Adaptado de Cola et al. (2016). Nanopartículas Lipídicas Sólidas podem ser utilizadas por várias vias de administração e são bastante empregadas em fármacos de uso dermatológico e cosméticos. Suas vantagens incluem ótima biocompatibilidade, baixa toxicidade e citotoxicidade, sistema de entrega transdérmico eficiente (isso devido ao pequeno tamanho, o que garante maior área de contato com o estrato córneo aumentando a quantidade de fármaco que penetra através da pele), além de alta hidratação da pele (Dimer et al., 2013). Formulações contendo NLS, entretanto, contêm desvantagens como alto teor de água, o que pode resultar em problemas de estabilidade dos produtos finais em que foram inseridas (Pardeike et al., 2009). Carreadores lipídicos nanoestruturados (CLN) (Figura 13) foram desenvolvidos como uma segunda geração das NLS. São compostos por uma matriz lipídica sólida encapsulando compartimentos de lipídios líquidos, contêm menor temperatura de fusão, pois devido a adição de lipídeos líquidos resultam em um maior teor lipídico (40–50%), o que reduz o teor de água necessário na formulação. Apresentam vantagens em relação às NLS, como: maior eficiência de encapsulação e menor liberação do fármaco da matriz lipídica durante o período de armazenamento. Além A B 200 nm 200 nm 21 disso, o princípio ativo não é expulso do interior das nanopartículas, como geralmente ocorre nas NLS (Wissing et al., 2004; Pardeike et al., 2009; Attama et al., 2012; Cola et al., 2016). Figura 13. Micrografias de Carreadores lipídicos nanoestruturados (CLN) com aumento de 27800 vezes, obtidas por MET. A) CLN contendo ivermectina; B) CLN contendo metopreno. Fonte: Adaptado de Cola et al. (2016). Carreadores lipídicos nanoestruturados possuem, ainda, alta capacidade para entrega de fármacos por diferentes vias (oral, parenteral, tópica, oftálmica e pulmonar) e ao mesmo tempo aumentam a estabilidade física e química dos medicamentos, fornecendo controle sobre sua liberação, protegendo-os contra a degradação e melhorando seus parâmetros farmacocinéticos fracos. Favorecem a aplicação de quimioterápicos tóxicos e têm capacidade de direcioná-los aos locais de tumor, reduzindo efeitos colaterais indesejados (Haider et al., 2020). Carreadores a partir de nanopartículas lipídicas melhoraram a biodisponibilidade e a seletividade de um fármaco, mesmo em tratamentos complexos. A administração de uma nanoformulação com lipossomas contendo hemissuccinato de β-metasona (BMS) (fármaco utilizado para casos de malária cerebral pela infecção por Plasmodium falciparum) resultou no acúmulo de BMS no 200 nm A B 200 nm 22 cérebro de camundongos que continham a afecção, enquanto o mesmo não foi observado nos camundongos saudáveis que receberam a formulação. Mesmo em estágios avançados da doença, quando ocorreu a ruptura da barreira hematoencefálica e os ratos já mostravam sinais claros de comprometimento neurológico, a nanoformulação demonstrou-se eficaz. O tratamento com BMS gera níveis mais baixos de inflamação cerebral e os lipossomas estabilizados nanoestericamente melhoraram substancialmente a eficácia do BMS, além de terem eliminado a alta toxicidade observada na sua administração livre (Waknine-Grinberg et al., 2013). Alta eficácia e diminuição na toxicidade de um fármaco mediante ao encapsulamento por nanopartículas lipídicas também foram observadas por Oliveira et al. (2015). Nanoformulações herbicidas de NLS contendo atrazina+simazina foram mais eficazes (0,3 kg.ha-1) sobre a espécie alvo (Raphanus raphanistrum) em relação ao produto comercial (3 kg.ha-1), não causando toxicidade nos organismos não-alvo. Ambos (nanoformulação e produto comercial) foram eficazes nas concentrações recomendadas (3 kg.ha-1) e em concentrações 10 vezes menores, porém, enquanto o efeito do produto comercial diminuía, as nanoformulações permaneceram eficazes. No ensaio de toxicidade sobre fibroblastos de camundongo (Balb-c 3T3), a viabilidade celular permaneceu em torno de 100, 80 e 64% para NLS, NLS+herbicidas e formulação comercial, respectivamente, confirmando que o encapsulamento dos herbicidas nas NLS resultou em diminuição da citotoxicidade. Em um estudo visando o controle de parasitas com sistemas de NLS e CLN, formulações contendo ivermectina e metopreno encapsulados demonstraram boa estabilidade e eficiência de encapsulação. Não foram realizados testes in vitro sobre parasitas, porém, os resultados do ensaio de cito e genotoxicidade demonstraram que os referidos princípios ativos, quando encapsulados, ocasionaram alteração na viabilidade celular das células da linhagem 3T3 (fibroblastos de camundongos Balb-c 3T3) e V79 (fibroblastos pulmonares de Hamster), causando menor toxidade e demonstrando a possibilidade de aplicações dessas formulações nanocarreadoras nos animais (Cola et al., 2016). 23 2.7.2 Nanopartículas de zeína A proteína é um dos recursos renováveis mais importantes e pode ser usada como material biodegradável (Cuq et al., 1998). Zeína, principal proteína do endosperma do milho, representa aproximadamente 50% das proteínas totais encontradas nesse grão, conferindo sua dureza (Shukla e Cheryan, 2001). Apresenta, ainda, propriedades para o desenvolvimento de sistemas coloidais em diferentes formas e estruturas, incluindo filmes, nanopartículas, micelas, géis e fibras (Paliwal e Palakurthi, 2014). A zeína tem ganhado destaque como material de embalagem de biopolímero seguro. Possui capacidade de atuar como barreira para a água e por esse motivo é muito utilizada em revestimento para doces, nozes, frutas e embalagem para alimentos. Na área médica, há estudos para aplicação de zeína como carreador de biocompostos para liberação em sítios específicos no corpo humano (Lawton, 2002; Picklesimer, 2005). Devido à sua biocompatibilidade, biodegradabilidade e baixa toxicidade, a zeína é considerada segura inclusive pela FDA (Agência Federal do Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos Estados Unidos), responsável por promover a saúde pública. Há grande interesse científico para a aplicação dessa proteína em diversas áreas, e principalmente no maior desenvolvimento de seus sistemas de entrega tanto de nutrientes quanto de fármacos (Shukla e Cheryan, 2001; Kim e Xu, 2008; Luo e Wang, 2014). Segundo Pascoli et al. (2020), devido à sua resistência, a zeína tem um grande potencial para atuar como nanocarreador. Nanopartículas de Zeína (NZ) (Figura 14) têm sido amplamente avaliadas em pesquisas científicas de diferentes espectros, desde estudos que visam a encapsulação de óleos essenciais e ingredientes de importância para a indústria de alimentos (Parris et al., 2005; Chen e Zong, 2015), encapsulamento, liberação controlada, direcionamento e entrega de fármacos ou suplementos terapêuticos (Liu et al., 2005; Zhong et al., 2009; Lai e Guo, 2011; Luo et al., 2012; Donsì et al., 2017; Dai et al., 2018; Mahalakshmi et al., 2020; Afonso et al., 2020), até sua aplicação na área de genética e imunogenicidade (Hadavi et al., 2018; Li et al., 2019). 24 Figura 14. Micrografias de Nanopartículas de zeína (NZ) obtidas por MET. A) Citral encapsulado em NZ com núcleo único; B) Citral encapsulado em NZ com múltiplos núcleos. Fonte: Adaptado de Su (2012). Estudos empregando NZ como carreador, com enfoque em saúde humana e animal, têm aumentado. O encapsulamento de princípios ativos com potencial repelente visando o controle de Aedes aegypti, assim como novos herbicidas, pesticidas e até mesmo carrapaticidas para o controle de R. microplus têm sido avaliados, com o intuito de serem uma alternativa para a promoção de novos fármacos eficazes e seguros, que contenham menores possibilidades de ocasionar danos aos humanos, animais e ambiente (Proença, 2018; Oliveira et al., 2018; 2019; Miranda, 2019; Pascoli et al., 2020). Um dos principais entraves nas pesquisas na área de parasitologia veterinária é o desenvolvimento de resistência dos parasitas aos fármacos. Nanopartículas podem contribuir impedindo o desenvolvimento de alguns dos mecanismos de resistência dos parasitas, e dessa forma auxiliar na redução de resistência aos fármacos atualmente disponíveis, podem, ainda, aumentar a biodisponibilidade dos medicamentos e potencializar o alvo do tratamento. Novos antiparasitários podem ser desenvolvidos empregando-se a nanotecnologia, de maneira a ser um produto biodegradável para uso na medicina veterinária (Molento, 2009; Cruz e Molento, 2015). A B 25 REFERÊNCIAS Afonso BS, Azevedo AG, Gonçalves C, Amado IR, Ferreira EC, Pastrana LM, Cerqueira MA (2020). Bio-Based nanoparticles as a carrier of β-carotene: production, characterisation and in vitro gastrointestinal digestion. Molecules 25:4497-4514. Agnolin CA, Olivo CJ, Parra CLC (2014) Efeito do óleo de capim limão (Cymbopogon flexuosus Stapf) no controle do carrapato dos bovinos. Revista Brasileira de Plantas Medicinais 16:77-82. Aguirre AAR, Lobo FP, Cunha RC, Garcia MV, Andreotti R (2016) Design of the ATAQ peptide and its evaluation as an immunogen to develop a Rhipicephalus vaccine. Veterinary Parasitology 221:30-38. Ahmed MT, Loutfy N, El Shieke E (2002) Residue levels of DDE and PCBs in blood serum of women in Port Said in Egypt. Journal of Hazardous Materials 89:41-48. 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