LETÍCIA KAREN DOS SANTOS Tese apresentada ao Instituto de Química à Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de doutora em Química. Orientador: Prof. Dr. Danilo Luiz Flumignan Co-orientador: Profa. Dra. Ariela Veloso de Paula Avaliação de diferentes suportes para imobilização de lipases visando à síntese de biodiesel a partir da hidroesterificação de matérias-primas de baixa qualidade Araraquara 2022 S237a Santos, Letícia Karen dos Avaliação de diferentes suportes para imobilização de lipases visando à síntese de biodiesel a partir da hidroesterificação de matérias-primas de baixa qualidade / Letícia Karen dos Santos. -- Araraquara, 2022 126 f. : il. Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista (Unesp), Instituto de Química, Araraquara Orientador: Danilo Luiz Flumignan Coorientadora: Ariela Veloso de Paula Paula 1. Catalisadores. 2. Óleos vegetais. 3. Biocombustíveis. 4. Impressão 3D. 5. Polímeros impressos. I. Título. Sistema de geração automática de fichas catalográficas da Unesp. Biblioteca do Instituto de Química, Araraquara. Dados fornecidos pelo autor(a). Essa ficha não pode ser modificada. Instituto de Química - Câmpus de Araraquara - Rua Prof. Francisco Degni, 55, 14800060, Araraquara - São Paulo http://www.iq.unesp.br/#!/pos-graduacao/quimica-2/CNPJ: 48.031.918/0027-63. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA Câmpus de Araraquara CERTIFICADO DE APROVAÇÃO TÍTULO DA TESE: "Avaliação de diferentes suportes para imobilização de lipases visando à síntese de biodiesel a partir da hidroesterificação de matérias-primas de baixa qualidade" AUTORA: LETÍCIA KAREN DOS SANTOS ORIENTADOR: DANILO LUIZ FLUMIGNAN COORIENTADORA: ARIELA VELOSO DE PAULA Aprovada como parte das exigências para obtenção do Título de Doutora em QUÍMICA, pela Comissão Examinadora: Prof. Dr. DANILO LUIZ FLUMIGNAN (Participaçao Virtual) Departamento de Quimica / Instituto de Quimica - UNESP - Araraquara Prof. Dr. JÚLIO CÉSAR DOS SANTOS (Participaçao Virtual) Departamento de Biotecnologia / USP - Escola de Engenharia de Lorena - SP Prof. Dr MURILO DANIEL DE MELLO INNOCENTINI (Participaçao Virtual) Departamento de Engenharia Química / Universidade de Ribeirão Preto - UNAERP - Ribeirão Preto Profa. Dra. GRAZIELLE SANTOS SILVA ANDRADE (Participaçao Virtual) Instituto de Ciência e Tecnologia / Universidade Federal de Alfenas - UNIFAL - Poços de Caldas Prof. Dr. ALVARO DE BAPTISTA NETO (Participaçao Virtual) Departamento de Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia / Faculdade de Ciências Farmacêuticas - UNESP - Araraquara Araraquara, 03 de março de 2022 http://www.iq.unesp.br/%23!/pos-graduacao/quimica-2/CNPJ DADOS CURRICULARES Letícia Karen dos Santos Endereço para acessar curriculum lattes: http://lattes.cnpq.br/2129379201879042 Formação acadêmica/titulação 2016 – atual - Doutorado em Química. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, São Paulo, Brasil. 2014 – 2016 - Mestrado em Química. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, São Paulo, Brasil. 2010 – 2013 - Graduação em Tecnologia em Biocombustíveis. Instituto Federal de São Paulo, IFSP, São Paulo, Brasil. Atuação profissional 2021 – atual – Pesquisadora: Embrapa Agroenergia –Brasília – DF 2018 – 2020 – Pesquisadora: Cempeqc – UNESP – IQ Araraquara – SP Artigos completos publicados em periódicos 1. BARBOSA, SANDRO L.; ROCHA, ADELINE C. PEREIRA; NELSON, DAVID LEE; DE FREITAS, MILTON S.; MESTRE, ANTÔNIO A. P. FULGÊNCIO; KLEIN, STANLEI I.; CLOSOSKI, GIULIANO C.; CAIRES, FRANCO J.; FLUMIGNAN, DANILO L.; DOS SANTOS, LETÍCIA KAREN; WENTZ, ALEXANDRE P.; PASA, VÂNYA M. DUARTE; RIOS, REGIANE D. FERNANDES. Catalytic Transformation of Triglycerides to Biodiesel with SiO2-SO3H and Quaternary Ammonium Salts in Toluene or DMSO. MOLECULES. , v.27, , 2022 IF: 4.0 – doi: https://doi.org/10.3390/molecules27030953. 2. BOTTI, R.F.; INNOCENTINI, M.D.M.; FALEIROS, T.A.; MELLO, M.F.; FLUMIGNAN, D.L.; DOS SANTOS, Letícia KAREN.; FRANCHIN, G.; COLOMBO, P. Additively manufactured geopolymer structured heterogeneous catalysts for biodiesel production. Applied Materials Today., v.23, 2021. IF- 10.3 - doi: https://doi.org/10.1016/j.apmt.2021.101022 2. DOS SANTOS, LETÍCIA KAREN; FUSS BOTTI, RENATA; DE MELLO INNOCENTINI, MURILO DANIEL; FERNANDO COSTA MARQUES, RODRIGO; COLOMBO, PAOLO; DE PAULA, ARIELA VELOSO; LUIZ FLUMIGNAN, DANILO. 3D Printed Geopolymer: an efficient support for immobilization of Candida rugosa lipase. Chemical Engineering Journal., v.414, 2021. IF 10.6 – doi: https://doi.org/10.1016/j.cej.2021.128843 http://lattes.cnpq.br/2129379201879042 https://doi.org/10.3390/molecules27030953 https://doi.org/10.1016/j.apmt.2021.101022 https://doi.org/10.1016/j.cej.2021.128843 3. BOTTI, R. F.; INNOCENTINI, M. D.; FALEIROS, T. A.; MELLO, M. F.; FLUMIGNAN, D. L.; DOS SANTOS, LETÍCIA KAREN; FRANCHIN, G.; COLOMBO, P. Biodiesel Processing Using Sodium and Potassium Geopolymer Powders as Heterogeneous Catalysts. Molecules, v.25 , 2020. IF 3.0 - doi: https://doi.org/10.3390/molecules25122839 4. DOMINGUES, OTÁVIO; SANTOS, LETÍCIA KAREN DOS; HERCULANO, RONDINELLI DONIZETTI; FLUMIGNAN, DANILO LUIZ; PAULA, ARIELA VELOSO DE PAULA. Evaluation of magnetic carriers employed for immobilization of lipase from candida rugosa. The Journal of Engineering and Exact Sciences. , v.6, p.0498 - 0504, 2020. doi: https://doi.org/10.18540/jcecvl6iss4pp0498-0504 5. DOS SANTOS, LETÍCIA KAREN; HATANAKA, RAFAEL RODRIGUES; DE OLIVEIRA, JOSÉ EDUARDO; FLUMIGNAN, DANILO LUIZ. Production of Biodiesel from Crude Palm Oil by a Sequential Hydrolysis/Esterification Process using Subcritical Water. RENEWABLE ENERGY, v.130, p.633 - 640, 2018. IF:6.2 - doi: https://doi.org/10.1016/j.renene.2018.06.102 6. DOS SANTOS, LETÍCIA KAREN; HATANAKA, RAFAEL RODRIGUES; DE OLIVEIRA, JOSÉ EDUARDO; FLUMIGNAN, DANILO LUIZ. Experimental factorial design on hydroesterification of waste cooking oil by subcritical conditions for biodiesel production. RENEWABLE ENERGY, v.114, p.574 - 580, 2017. IF: 6.2. – doi: https://doi.org/10.1016/j.renene.2017.07.066 Patente 1. SANTOS, L. K.; OLIVEIRA, J. E; FLUMIGNAN, D. L. PROCESSO DE OBTENÇÃO DE BIODIESEL POR HIDROESTERIFICAÇÃO EM CONDIÇÃO SUBCRÍTICA, 2017. Categoria: Processo. Instituição onde foi depositada: INPI - Instituto Nacional da Propriedade Industrial. País: Brasil. Natureza: Patente de Invenção. Número do registro: BR10201701823. Data de depósito: 25/08/2017. Depositante/Titular: Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho. https://doi.org/10.3390/molecules25122839 https://doi.org/10.18540/jcecvl6iss4pp0498-0504 https://doi.org/10.1016/j.renene.2018.06.102 https://doi.org/10.1016/j.renene.2017.07.066 Aos meus pais, por todo amor, carinho e apoio ao longo de toda minha vida. Agradecimentos A Deus, por seu infinito amor; Ao meu orientador, o Prof. Dr. Danilo Luiz Flumignan, pela orientação, amizade, confiança, disponibilidade e paciência que teve comigo, durante todos esses anos; e que muito contribuí para o enriquecimento do meu conhecimento científico e de mundo; A minha co-orientadora, a Profa. Dra. Ariela Veloso de Paula, pela disponibilidade, amizade, apoio e incentivo, contribuindo para o meu amadurecimento profissional; E aos meus pais Carlos e Rosa, por todo amor, por toda a amizade, pelos exemplos ao longo de toda minha vida, incentivo, confiança, e apoio incondicional; Aos pesquisadores do Cempeqc, Antônio, Camila, Gabrielle, Larissa, Lídia, Maurílio, Rafael e Weslei pelas orientações, colaborações no trabalho e pela amizade; Ao Cempeqc, em especial a Isabela, Karol e Malu, pela convivência, pela paciência e por terem me ajudado sempre que precisei, também deixo uma lembrança especial a todos que fizeram parte da equipe Cempeqc entre o início de 2016 até início de 2022; Aos pesquisadores do EnziTag, que muito me ensinaram sobre enzimas, pelas partilhas e por deixarem os dias mais alegres no laboratório, em especial o Otávio que foi meu aluno de IC; Aos pesquisadores, Prof. Dr. Murilo Daniel de Mello Innocentini (UNAERP), Prof. Dr. Paolo Colombo e PhD Renata Fuss Botti (Universidade de Pádova) pela colaboração com as peças em 3D que muito enriqueceu este trabalho; Aos meus amigos; pelos momentos de descontração, por entender e aceitar a minha ausência e torcerem por mim; Aos meus avós, por sempre orarem por mim; A Thalyse Santana, por me mostrar que a vida mais leve se inicia com saúde mental; A banca, por contribuir para o enriquecimento deste trabalho; A CAPES, CNPq e a Fundunesp por apoiar o programa de pós-graduação da UNESP –IQ Enfim, a todos que compartilharam, compartilham e compartilharão do meu eterno aprendizado. A todos, muito obrigada! “Não há um centímetro quadrado deste mundo do qual Cristo não possa dizer: é meu''. Abraham Kuyper. Resumo Óleos e gorduras residuais (OGR) e óleos brutos são um desafio para a produção de biodiesel via transesterificação. Neste cenário, surge como alternativa, a hidroesterificação, processo que envolve duas etapas consecutivas, hidrólise seguida de esterificação e que permite o uso de qualquer matéria-prima graxa. Neste trabalho avaliou-se suportes como argila, grafite, partículas magnéticas e geopolímero impresso em 3D para a imobilização da lipase de Candida rugosa para a aplicação na reação de hidrólise, primeira etapa para a produção de biodiesel por hidroesterificação do OGR e óleo de palma bruto. As imobilizações foram testadas por meio de adsorção física e ligação. Os melhores resultados foram obtidos por ligação covalente no suporte de geopolímero impresso em 3D, obtendo um biocatalisador com atividade hidrolítica específica de 815 U/g. Caracterizou-se a atividade do biocatalisador obtendo a melhor ação no pH 3,98 e temperatura de 55 °C. Aplicando-se o biocatalisador na reação de hidrólise do OGR obteve-se conversão de 90,0 % de ácidos graxos com 3 reciclos de 24 horas; já na reação com óleo de palma bruto foi possível obter 94,5 % de conversão. A produção de biodiesel a partir da esterificação, forneceu conversão de ácidos graxos proveniente do OGR de 98,3 % de ésteres metílicos e para os ácidos graxos do óleo de palma bruto 97,1 %. O processo de imobilização da lipase Candida rugosa no suporte de geopolímero impresso em 3D traz tecnologia e inovação para os processos de produção de biodiesel e apresenta uma alternativa viável e sustentável, utilizando matérias- primas de baixo valor agregado, contribuindo para a produção de combustíveis renováveis. Abstract Waste cooking oils (OGR) and crude oils are a challenge for production of biodiesel via transesterification. In this scenario, hydroesterification appears as an alternative, a process that involves two consecutive steps, hydrolysis followed by esterification, and which allows the use of any fatty raw material. In this work, supports such as clay, graphite, magnetic particles, and 3D printed geopolymer were evaluated for the immobilization of Candida rugosa lipase for application in the hydrolysis reaction, the first step for the production of biodiesel by hydroesterification of OGR and crude palm oil. . The immobilizations were tested utilizing physical adsorption and covalent bond. The best results were obtained by covalently bonding the 3D printed geopolymer support, obtaining a biocatalyst with a specific hydrolytic activity of 815 U/g. The activity of the biocatalyst was characterized, obtaining the best action at pH 3.98 and a temperature of 55 °C. Applying the biocatalyst in the hydrolysis reaction of the OGR, a conversion of 90.0% of fatty acids was obtained with 3 recycles of 24 hours; in the reaction with crude palm oil, it was possible to obtain 94.5% of conversion. The production of biodiesel from esterification provided conversion of fatty acids from the OGR of 98.3% of methyl esters and to the fatty acids of crude palm oil of 97.1%. The process of immobilization of lipase Candida rugosa on the 3D-printed geopolymer support brings technology and innovation to biodiesel production processes and presents a viable and sustainable alternative, using raw materials of low added value, contributing to the production of renewable fuels. LISTA DE FIGURAS Figura 1. Reação de hidrólise para óleos e gorduras .................................................................... 20 Figura 2. Reação de Transesterificação de óleos e gorduras ........................................................ 21 Figura 3. Reações secundárias que podem ocorrer durante a transesterificações de óleos vegetais: (1) hidrólise, (2) saponificação e (3) neutralização de ácidos graxos livres .................................. 23 Figura 4. Hidrólise de triacilglicerídeos. ....................................................................................... 24 Figura 5. Esterificação de ácidos graxos....................................................................................... 25 Figura 6. Reações com triglicerídeos utilizando como biocatalisador lipases .............................. 28 Figura 7. Desenhos esquemáticos mostrando as estruturas (a) da folha tetraédrica, (b) da folha octaédrica, (c) mineral argiloso tipo 2:1 e (d) mineral argiloso tipo 1:1. ...................................... 35 Figura 8. Estrutura cristalina da Maghemita. ................................................................................ 36 Figura 9. Estrutura cristalina da Magnetita ................................................................................... 37 Figura 10. Fluxograma das etapas desenvolvidas. ........................................................................ 40 Figura 11. Esquema do teste de permeação de fluxo de ar. .......................................................... 47 Figura 12. Fotos das amostras de geopolímero testadas. .............................................................. 48 Figura 13. Esquema do sistema da reação de hidrólise utilizado quando utilizado o suporte de geopolímeor impresso em 3D. (1) recipiente de mistura de reação; (2) agitador magnético; (3) bomba peristáltica; (4) reator; (5) amostra; (6) camisa de água, (7) banho de água de recirculação ........................................................................................................................................................ 63 Figura 14. Sequência dos aminoácidos do flap da CRL, os resíduos em vermelho são hidrofóbicos. ........................................................................................................................................................ 70 Figura 15. Lipase Candida rugosa Lip1. ...................................................................................... 70 Figura 16. Estabilidade a temperatura e pH da lipase de Candida rugosa ................................... 71 Figura 17. pH ótimo da lipase de Candia rugosa pelo o método de atividade hidrólitica ........... 72 Figura 18. Espectroscopia de infravermelho (FTIR) da CRL. ...................................................... 73 Figura 19. Reação de hidrólise controle - Lipase de Candida rugosa livre em comparação com a Novozyme 453 tempo de reação 24 horas utilizando OGR. .......................................................... 74 Figura 20. Reação de hidrólise utilizando a enzima Novozyme 435. A – fase de ácidos graxos livres com a enzima Novozyme 435, B- Fase aquosa rica em glicerol. ........................................ 75 Figura 21. Processo de modificação da superfície e imobilização por ligação covalente. ........... 78 Figura 22.Espectro de Infravermelho do suporte argilomineral Caulim (azul), Caulim com APTES (verde) e APTES (preto). ............................................................................................................... 80 Figura 23. Grafite flakes mw 12,01 – 100 mesh .......................................................................... 81 Figura 24. Maghemita seca. .......................................................................................................... 83 file:///C:/Users/Win10/OneDrive/Área%20de%20Trabalho/Doutorado/Doutorado/TESE/Tese_Letícia_15_02%20correção.docx%23_Toc100084034 file:///C:/Users/Win10/OneDrive/Área%20de%20Trabalho/Doutorado/Doutorado/TESE/Tese_Letícia_15_02%20correção.docx%23_Toc100084036 file:///C:/Users/Win10/OneDrive/Área%20de%20Trabalho/Doutorado/Doutorado/TESE/Tese_Letícia_15_02%20correção.docx%23_Toc100084036 file:///C:/Users/Win10/OneDrive/Área%20de%20Trabalho/Doutorado/Doutorado/TESE/Tese_Letícia_15_02%20correção.docx%23_Toc100084044 file:///C:/Users/Win10/OneDrive/Área%20de%20Trabalho/Doutorado/Doutorado/TESE/Tese_Letícia_15_02%20correção.docx%23_Toc100084053 file:///C:/Users/Win10/OneDrive/Área%20de%20Trabalho/Doutorado/Doutorado/TESE/Tese_Letícia_15_02%20correção.docx%23_Toc100084053 file:///C:/Users/Win10/OneDrive/Área%20de%20Trabalho/Doutorado/Doutorado/TESE/Tese_Letícia_15_02%20correção.docx%23_Toc100084055 file:///C:/Users/Win10/OneDrive/Área%20de%20Trabalho/Doutorado/Doutorado/TESE/Tese_Letícia_15_02%20correção.docx%23_Toc100084055 Figura 25. MEV do biocatalisador estudado em distintas ampliações: (a) MGM pura; (b)MGM@RL – ligação covalentemente. ...................................................................................... 86 Figura 26.Gráfico de intensidade por graus obtidos para o estudo da Difração de Raio X (DRX) da maghemita pura e do derivado imobilizado covalentemente. ................................................... 88 Figura 27. FTIR da Maghenita sintetizada, ativada e imobilizada com CRL ............................... 89 Figura 28. Mapa de permeabilidade com classificação de materiais porosos e localização dos carregadores de enzimas ................................................................................................................ 91 Figura 29. Curvas de queda de pressão simuladas para três biocatalisadores enzimáticos porosos ........................................................................................................................................................ 92 Figura 30. Determinação de aminas em amostras geopolímero impressas com superfícies funcionalizadas (SF-Geo) usando ensaios colorimétricos de ninidrina. ........................................ 94 Figura 31. Espectros de FTIR do Na-Geo e das etapas de imobilização da CRL ........................ 95 Figura 32. Gráfico com valores de proteína no sobrenadante durante o tempo de estudo ........... 97 Figura 33. Imagens do MEV detalhes de superfície: (a) e (b) morfologia do geopolímero antes da imobilização da lipase (amostra Na-Geo); (c) e (d) morfologia do geopolímero após a imobilização da lipase (amostra CRL-Geo). ....................................................................................................... 98 Figura 34. RMN de 13C e 29Si das amostras Geo-Na; b) SF-Geo; c) CRL-Geo) .......................... 99 Figura 35. O gráfico de contorno da superfície de resposta obtida de acordo com o modelo predito para a atividade hidrolítica do CRL-Geo em função do pH e da temperatura. ............................ 102 Figura 36. Influência da concentração substrato para atuação do biocatalisador para os diferentes tipos de óleos – pH 3,98 e temperatura 55 °C .............................................................................. 104 Figura 37. Diferenças entre as emulsões para o estudo de concentração de substrato ............... 105 Figura 38. Sistema da reação de hidrólise .................................................................................. 106 Figura 39.Reator com o biocatalsiador CRL-Geo no 2° reuso matéria-prima Palma - A) Antes da reação, B) Durante as primeiras horas de reação, C) após 24 horas D)Vista superior ................ 108 Figura 40. Ésteres metílicos produzidos na 2° Etapa da hidroesterificação. .............................. 110 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Comparação entre os tipos de catalisadores usados para produção de biodiesel (14–17). ........................................................................................................................................................ 22 Tabela 2. Diferentes fontes de lipase microbiana (Christopher et al. 2014 (39)). ........................ 27 Tabela 3. Comparação entre lipase livre e imobilizada (46–48). .................................................. 30 Tabela 4. Fatores levado em consideração antes da imobilização de enzimas ............................. 33 Tabela 5 . Características físicas das amostras de geopolímero testadas. ..................................... 48 Tabela 6. Níveis do planejamento composto central .................................................................... 54 Tabela 7. Soluções tampões 0,1 M usados no preparo da emulsão. ............................................ 55 Tabela 8. Proporção de substrato e tampão no preparo da emulsão ............................................. 56 Tabela 9 - Condições da análise de perfil composicional ............................................................. 61 Tabela 10. Índice de acidez do óleo vegetal ................................................................................. 67 Tabela 11. Teor de água nas amostras .......................................................................................... 68 Tabela 12. Perfil composicional dos óleos obtido por CG-DIC ................................................... 69 Tabela 13. Atividade hidrolítica da lipase de Candida rugosa imobilizadas por adsorção em Cau- lim, Argila Montmorilonita, Vermiculita ....................................................................................... 76 Tabela 14. Atividade hidrolítica da lipase de Candida rugosa imobilizadas por adsorção em Cau- lim, Argila Montmorilonita, Vermiculita ....................................................................................... 78 Tabela 15. Reação de hidrólise com OGR em pH 5 utilizando os biocatalisadores de argilominerias imobilizados pelo processo de ligação covalente .................................................. 79 Tabela 16. Atividade hidrolítica do biocatalisadores de grafite com a lipase de Candida rugosa imobilizada. .................................................................................................................................... 81 Tabela 17. Atividade hidrolítica do biocatalisadores de grafite com a lipase de Candida rugosa imobilizada em diferentes pH e temperatura ................................................................................. 82 Tabela 18. Dados de atividade hidrolítica e rendimento de imobilização dos derivado imobilizados em nanoparticulas magnéticas imobilizados por adsorção física................................................... 84 Tabela 19. Dados de atividade hidrolítica e rendimento dos biocatalisadores em nanoparticulas magnéticas imobilização do derivado imobilizado por ligação covalente. .................................... 85 Tabela 20. Dados da Análise Elementar Superficial (EDS) da maghemita pura e do derivado imobilizado..................................................................................................................................... 87 Tabela 21. Atividade hidrolítica da lipase de Candida rugosa imobilizadas por adsorção no geopolímero impresso em 3D ........................................................................................................ 90 Tabela 22. .Composição química (% em peso) obtida por EDS / SEM no geopolímero impressos ao longo do processo de troca iônica (Na+ a NH4+). ..................................................................... 93 Tabela 23. Rendimento de imobilização e atividade hidrolítica para diferentes carregamentos em SF-GEO. ......................................................................................................................................... 96 Tabela 24. Matriz com valores utilizados para o planejamento fatorial, bem como as atividades hidrolíticas determinadas para o estudo da influência das variáveis pH e temperatura. .............. 101 Tabela 25. Análise da Variância para a atividade hidrolítica do CRL-Geo ................................ 101 Tabela 26. Estabilidade a temperatura do biocatalisador CRL-Geo nos pontos 3 e 5 do planejamento de experimentos ..................................................................................................... 103 Tabela 27. Constantes cinéticas de Michaelis-Menten (km) e velocidade máxima de reação (Vmax) determinadas de acordo com o sistema gráfico de Lineweaver-Burk. ........................... 105 Tabela 28. Teor de ácidos graxos, mono-, di- e triglicerídeo após a reação de hidrólise de 24 horas utilizando como matéria-prima OGR ........................................................................................... 107 Tabela 29. Teor de ácidos graxos, mono-, di- e triglicerídeo após a reação de hidrólise de 24 horas utilizando como matéria-prima óleo de Palma ............................................................................ 107 Tabela 30. Teor de ésteres ........................................................................................................... 111 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS AG – Ácidos graxos ANOVA – Análise de Variância (do Inglês Analysis of Variance) ANP – Agência Nacional do Petróleo, Gás Natural e Biocombustíveis ANVISA – Agência Nacional da Vigilância Sanitária AOCS – American Oil Society APTES - 3-aminopropiltrietoxisilano ASTM – American Society For Testing and Materials CRL – Lipase Candida rugosa Cempeqc – Centro Multidisciplinar de Pesquisa em Combustíveis, Biocombustíveis, Petróleo e Derivados CG-DIC – Cromatógrafo a gás com detector por ionização de chama DIW - Escrita direta / Direct Ink Writing DG – Diacilglicerídeos EN – Norma Europeia (do inglês European Standard) MG – Monoacilgliceróis Magnetita (MGN) maghemita (MGM) MP – Material particulado Na-Geo - Geopolímeros a base de sódio OGR – Óleos e gorduras residuais TG – Triglicerídeos WCO – Waste cooking oil SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 17 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .......................................................................................... 19 2.1 Óleos e gorduras ................................................................................................................. 19 2.2 Biodiesel ............................................................................................................................... 20 2.3 Hidroesterificação ............................................................................................................... 23 2.4 Matérias – primas ............................................................................................................... 25 2.5 Produção de biodiesel por biocatalisadores .......................................................................... 26 2.5 A lipase - Candida rugosa .................................................................................................. 30 2.6 Imobilização ........................................................................................................................ 31 2.7 Suporte para a imobilização ................................................................................................. 33 2.8.1 Argilas................................................................................................................................. 34 2.8.2 Grafite................................................................................................................................... 35 2.8.3 Suportes Magnéticos.............................................................................................................36 2.8.4 Geopolímeros e impressão 3D..............................................................................................37 3 OBJETIVO ......................................................................................................................... 39 4 EXPERIMENTAL ............................................................................................................. 40 4.1 Coleta e armazenamento das amostras ............................................................................ 41 4.2 Suportes ............................................................................................................................... 41 4.2.1 Síntese das partículas magnéticas ......................................................................................... 41 4.2.2 Produção do suporte 3D de geopolímero..............................................................................43 4.2.3 Tratamento da superfície do suporte de gepolímero impresso em 3D................................. 44 4.2.3.1 Modificação de superfície do Geo –Na e Geo- K.................................................................44 4.2.3.2 Troca iônica........................................................................................................................ 44 4.2.3.3 Ativação com APTES.......................................................................................................... 45 4.2.3.4 Determinação de grupos funcionais de amina por colorimetria......................................... 45 4.2.4 Caracterização física do geopolímero......................................................................................46 4.2.4.1 Permeabilidade.................................................................................................................... 46 4.2.4.1.1 Amostras para o teste de permeabilidade........................................................................ 48 4.3 Imobilização ........................................................................................................................ 49 4.3.1 Imobilização da Lipase de Candida rugosa por adsorção....................................................49 4.3.2 Imobilização da Lipase de Candida rugosa por ligação covalente...................................... 49 4.4 Avaliação da eficiência da imobilização da lipase candida rugosa nos suportes hidrofílicos, hidrofílicos modificados e magnéticos ..................................................................... 51 4.4.1 Determinação de Proteína.....................................................................................................51 4.4.2 Determinação da Atividade Hidrolítica................................................................................ 51 4.4.3 Fluorimetria diferencial de varredura (ThermoFluor).......................................................... 52 4.4.4 Determinação do Teor de Umidade...................................................................................... 53 4.4.5 Rendimento de Imobilização................................................................................................ 53 4.4.6 REUSO .................................................................................................................................... 54 4.5 Caracterização do biocatalisador selecionado.................................................................. 54 4.5.1 Testes de Estabilidade do Biocatalisador 55 4.5.1.1 Temperatura e pH.................................................................................................................55 4.5.1.2 Concentração e tipo de substrato para avaliar parâmetros cinéticos................................. 56 4.5.3 Ressonância magnética nuclear protônica.............................................................................57 4.5.4 Teste de dessorção (Lixiviação)............................................................................................ 57 4.6 ANÁLISE DAS MATÉRIAS-PRIMAS PARA A HIDROESTERIFICAÇÃO ............ 57 4.6.1 Teor de ácidos graxos livres e índice de acidez....................................................................57 4.6.2 Determinação do teor de água por Karl Fischer................................................................... 59 4.6.3 Perfil composicional do óleo................................................................................................ 60 4.7 REAÇÕES DE HIDRÓLISE ............................................................................................. 62 4.7.1 Hidrólise – geração de ácidos graxos................................................................................... 62 4.8 Tratamento estatístico dos resultados...............................................................................63 4.9 Reações de esterificação - geração de ésteres metílicos de ácido graxos ....................... 63 4.9.1 Reação de Esterificação (adaptado de Hassan; Vinjamur,2014(99)).................................. 64 4.9.1.2 Estudo das conversões nas reações de esterificação.......................................................... 64 4.9.1.3 Separação dos ésteres metílicos (biodiesel)......................................................................... 64 4.9.1.4 Secagem dos ésteres metílicos (biodiesel)............................................................................ 65 4.9.2 Ensaio comparativo ............................................................................................................ 65 4.9.2.2 Reação de Transesterificação com geopolímero de sódio e potássio (adaptado de Garcia, 2007 (102))....................................................................................................................................... 65 4.9.2.3 Separação da mistura ésteres metílicos (biodiesel) e glicerol............................................. 65 4.9.2.4 Lavagem dos ésteres metílicos (biodiesel)........................................................................... 65 5 RESULTADOS E DISCUSSÕES ..................................................................................... 67 5.1 Matéria-prima para a reação de hidroesterificação ............................................................. 67 5.1.1 Teores de ácidos graxos livres, índices de acidez e teores de umidade................................ 67 5.3.2 Perfis composicionais dos óleos............................................................................................ 68 5.2 LIPASE DE CANDIDA RUGOSA (CRL) ............................................................................. 69 5.1.1 Determinação da estabilidade térmica – Thermofluor........................................................... 70 5.1.2 Espectroscopia de infravermelho (FTIR) – Lipase Candida rugosa.....................................72 5.1.3 Reação de hidrólise – controle................................................................................................73 5.2 Imobilização ........................................................................................................................ 75 5.2.1 Argilas..................................................................................................................................... 75 5.2.1.1 Argilas: Imobilização por adsorção física nos suportes...................................................... 75 5.2.1.2 Argilas: Imobilização por Ligação covalente...................................................................... 77 5.2.2 Grafite................................................................................................................................... 80 5.2.2.1 Imobilização em Grafite....................................................................................................... 81 5.2.3 Partículas magnéticas.......................................................................................................... 83 5.2.3.1 Imobilização nas partículas magnéticas........................................................................... 84 5.2.3.2 Microscopia eletrônica de varredura (MEV) e análise elementar superficial (EDS)..........85 5.2.3.3 Difração de Raio X (DRX).................................................................................................. 88 5.2.3.4 FTIR - Espectroscopia de infravermelho da Maghemita (MGM)......................................88 5.2.5 Geopolímero.......................................................................................................................... 89 5.2.5.1 Caracterização física do geopolíemero impresso em 3D.................................................... 91 5.2.5.2 Troca iônica......................................................................................................................... 92 5.2.5.3 Funcionalização de superfície............................................................................................. 93 5.2.3.4 FTIR - Espectroscopia de infravermelho do geopolímero................................................ 94 5.2.5.5 Imobilização da CRL no SF-Geo...................................................................................... 95 5.2.5.7 Microscopia eletrônica de varredura (MEV) no geopolímero......................................... 97 5.2.5.8 Ressonância magnética nuclear 13C e 29Si........................................................................ 98 5.2.6 Planejamento composto central para a determinação das melhores condições operacionais100 5.2.7 Estabilidade a temperatura do CRL-Geo..............................................................................103 5.2.8 Determinação dos parâmetros cinéticos do biocatalisaor CRL-Geo..................................... 104 5.3 REAÇÃO DE HIDRÓLISE COM O BIOCATALISDOR CRL-GEO ....................... 106 5.4 PRODUÇÃO DE ÉSTERES METÍLICOS ................................................................... 109 5.5.1 Reação de esterificação – 2 etapa da hidroesterificação..................................................... 109 5.5.2 Reação de transesterificação................................................................................................ 110 5.5.3 Teor de ésteres..................................................................................................................... 111 6 CONCLUSÕES ................................................................................................................ 113 REFERÊNCIAS: .......................................................................................................................... 115 17 1 INTRODUÇÃO Em 2020, devido a pandemia causada pela COVID-19, diversos países acharam necessário que as pessoas reduzissem suas atividades fora de suas casas, muitas pessoas trabalharam em sistema home office, e em diversas metrópoles, ao redor do mundo, observaram a melhora na qualidade do ar nesse período e redução significativa de CO, CO2, NOx, e material particulado, um exemplo foi a cidade de São Paulo, que observou até uma redução em supertempestades devido a melhora da qualidade do ar (1). Essa experiência vivenciada mostra o quanto nós nos movemos e como consumimos intensivamente combustíveis fósseis e seus derivados. Os combustíveis fósseis são uma fonte finita na natureza, sendo que, a busca por fontes renováveis de energia principalmente para substituir os combustíveis fósseis de primeira geração como o diesel e a gasolina não é somente porque eles têm fim com data prevista, mas também devido a qualidade do ar. Amplamente considerado promissor no setor de transporte, os biocombustíveis como o biodiesel possuem propriedades e atributos vantajosos, pois promovem a redução das emissões de gases e de material particulado, possuem semelhança ao óleo diesel pode ser utilizado na maioria dos motores a diesel em sua forma pura B100 ou com misturas em qualquer porcentagem. Com a demanda crescente de combustíveis o biodiesel desempenhará um papel significativo no aumento da demanda por combustíveis nas próximas décadas. Entretanto mesmo havendo grande disponibilidade de matérias-primas, como óleos vegetais e gorduras, há uma limitação no processo convencional, via transesterificação, que é a aquisição de matérias-primas que devem ser de acidez e teor de umidade reduzido, o qual inviabiliza o uso de diversas matérias- primas e eleva o custo pois se adequa aos óleos vegetais refinados (2). No entanto, o processo de hidroesterificação (reação de hidrólise seguida de esterificação) é a mais moderna alternativa na produção de biodiesel, pois permite o uso de qualquer matéria- prima graxa, independente dos teores de acidez e umidade. A hidrólise consiste em uma reação química entre o óleo (ou gordura) com a água na presença de um catalisador, gerando glicerol (coproduto) e ácidos graxos que são esterificados com álcool, obtendo-se um éster com elevada pureza (biodiesel)(3). Dessa forma, a presente pesquisa teve como objetivo avaliar diferentes suportes: argilas; grafite; magnéticos e geopolímeros impressos em 3D para a imobilização da lipase Candida rugosa visando à utilização desta enzima como biocatalisador na reação de hidrólise de matérias-primas de baixa qualidade – primeira etapa na segunda etapa os ácidos graxos serão esterificados via catálise química, permitindo a obtenção de biodiesel de alta pureza. Trata-se, portanto, de uma tentativa de eliminar, através do processo de produção de biodiesel em duas etapas, os problemas 18 reacionais encontrados no processo de transesterificação convencional. Sendo assim, o estudo propõe uma estratégia inovadora na cadeia produtiva do biodiesel, visando à utilização sustentável da matéria-prima de baixa qualidade, e consequentemente, contribuindo para o aumento do biodiesel na matriz energética e o desenvolvimento econômico e social deste mercado. 19 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA A história do biodiesel não inicia na última década, quando o mundo se vê frente a grande demanda energética, e seus desafios ambientais. Rudolf Diesel em 1898 apresentou na Feira Mundial de Paris, um motor abastecido com óleo de amendoim mais eficiente que os motores a vapor usados na época, e fez a seguinte afirmativa: “O motor a diesel pode ser alimentado por óleos vegetais e ajudará no desenvolvimento agrário dos países que vierem a utilizá-lo (...). O uso de óleos vegetais como combustível pode parecer insignificante hoje em dia. Mas com o tempo (estes óleos) tornar-se-ão tão importantes quanto o petróleo e o carvão são atualmente. ” Rudolf Diesel,1912 (4). 2.1 Óleos e gorduras Os óleos e gorduras são ricos em triglicerídeos (TAG) muitas vezes obtidos a partir de oleaginosas ou fonte animal, são matérias-primas para a produção de biodiesel, que é uma alternativa biodegradável e mais limpa ao óleo diesel. Os triglicerídeos são consumidos a milhares de anos entretanto foi somente no século XIX que iniciou as primeiras pesquisas sobre a constituição de óleos e gorduras com o químico e físico Michel-Eugène Chevreul, que observou que os óleos e gorduras são misturas relativamente complexas, que a hidrólise de óleos e gorduras dava origem a ácidos graxos livres e glicerol (5) conforme demonstrado na Figura 1. 20 Fonte: Elaborada pela autora. A partir dessa observação, os óleos e gorduras passaram a ser chamados de ésteres de glicerol (glicerídeos, acilglicerídeos ou triacilglicerídeos). Desta forma, o triglicerídeo é um éster formado a partir de ácidos carboxílicos de cadeia longa (ácidos graxos) e glicerol. As unidades acila, correspondentes aos ácidos graxos, representam cerca de 95 % da massa molecular dos trigliceróis (6). As propriedades físicas, químicas e nutricionais de óleos e gorduras dependem, fundamentalmente, da natureza, do número de átomos de carbono e posição dos grupos acila presentes nas moléculas dos trigliceróis (7). Os ácidos graxos mais comuns encontrados nos óleos e gorduras que constituem os triglicerídeos apresentam 12, 14, 16 ou 18 átomos de carbono, embora ácidos com menor ou maior número de átomos de carbono possam ser encontrados (7). Devido à grande variedade de ácidos graxos é evidente que os óleos e gorduras são compostos de muitos tipos de triglicerídeos com diferentes graus de insaturações. Nos óleos e gorduras, além dos triglicerídeos, há em sua composição quantidades significativas de ácidos graxos livres, fosfolipídios, esteróis e tocoferóis. No entanto, as propriedades mais importantes do óleos vegetais e gorduras para uso como biocombustíveis incluem alto teor de energia; poder calorífico comparável ao dos hidrocarbonetos derivados do petróleo; baixo teor de enxofre e nitrogênio e carbono neutro (8,9). Biodiesel O biodiesel é composto por ésteres alquílicos de ácidos graxos, podendo ser sintetizado por catálise química, enzimática ou sob condições supercríticas, a partir de matérias-primas renováveis definidas como (10): Figura 1. Reação de hidrólise para óleos e gorduras 21 (i) Primeira geração: óleo vegetal comestíveis; (ii) Segunda geração: óleo vegetal não comestível; (iii) Terceira geração: óleo de algas, óleo residual de fritura/cozinha e gorduras animais; (iv) Quarta geração: óleo sintetizado. Historicamente, a tecnologia de produção no Brasil começou na década de 1980 com a primeira planta piloto de Expedito Parente no nordeste do Brasil (11). Desde então, no mundo, o biodiesel tem despertado a atenção por ser um combustível renovável, biodegradável e não tóxico, possibilitando o desenvolvimento de uma fonte de energia sustentável. O biodiesel é miscível e físico-quimicamente semelhante ao óleo diesel e utilizável em motores diesel sem a necessidade de adaptações significativas ou numerosas (12). A principal rota de produção de biodiesel é a reação de transesterificação por catálise de base homogênea. O termo transesterificação, em geral, é usado para descrever uma importante classe de reações orgânicas em que um éster é transformado em outro, através da troca de grupos alcóxido na presença de um catalisador produzindo uma mistura de ésteres monoalquílicos e glicerol (Figura 2). Figura 2. Reação de Transesterificação de óleos e gorduras Fonte: Elaborada pela autora. 22 A síntese do biodiesel é uma sequência de três reações consecutivas e reversíveis em que os triglicerídeos são gradualmente convertidos em diglicerídeos e monoglicerídeos como intermediários, um mol do éster é liberado em cada etapa. A reação de transesterificação pode ser acelerada por catalisadores químicos (homogêneos ou heterogêneos), biocatalisadores (livres ou imobilizados) ou não catalíticos (supercríticos), conforme apresentado na Tabela 1. As vantagens e desvantagens de cada processo também foram detalhadas. Além disso, o biodiesel pode ser produzido por outras vias, como esterificação, hidroesterificação ou processos não catalíticos (13). Tabela 1. Comparação entre os tipos de catalisadores usados para produção de biodiesel (14–17). Tipo de catalisador Vantagens Desvantagens Homogêneos Taxa de reação muito rápida O glicerol de baixa qualidade produzido requer, portanto, um longo processo de destilação para purificação Alta conversão (≥99%) Natureza higroscópica dos catalisadores (NaOH, KOH) A matéria-prima deve ser de alta qualidade para manter o rendimento do processo: livre de AGL (< 0,5%) e água (< 0,3%) Catalisador homogêneo básico - FFAs reagem com o catalisador e formam sabão Às vezes, esterificação e transesterificação ocorrem em processos conjugados Catalisadores homogêneos ácidos são muito prejudiciais, muito corrosivos para o reator e tubulação e requerem manuseio cuidadoso Catalisador básico de custo relativamente baixo e disponível (NaOH e KOH) A água promove a hidrólise dos ésteres alquílicos em AGL Método preferido para matéria-prima de alta qualidade A matéria-prima de alta qualidade representa 70- 95% do custo final do biodiesel 1% de catalisador com base na massa de óleo A etapa de purificação do processo de biodiesel é relativamente difícil e requer uma grande quantidade de água O catalisador não pode ser reutilizado Heterogêneos Alta estabilidade catalítica contra a lixiviação Converte triglicerídeos em uma taxa relativamente mais lenta que o processo homogêneo Fácil separação do catalisador do produto Procedimentos complexos de síntese de catalisadores levam a um custo mais alto A separação do glicerol e catalisador do biodiesel é muito mais fácil Efetivamente ativo apenas em átomos de superfície Econômico por causa de sua natureza reutilizável Biocatalisador Os AGL são convertidos em biodiesel, sem perda de matéria-prima Longo tempo de processo devido à taxa de reação muito lenta (8 a 72 h), quando comparado ao processo homogêneo A matéria-prima de baixo preço pode ser empregada Sensível ao álcool, que pode desativar a enzima Alta possibilidade de reutilizar e regenerar o catalisador Alto custo do biocatalisador Apenas uma etapa de purificação simples é necessária Fácil separação de biodiesel e biocatalisador por filtração Fácil separação de biodiesel e glicerol por decantação O glicerol é de alta qualidade e tem um alto valor As enzimas são biodegradáveis Não- catalítico (supercrítico) Matéria-prima de baixa qualidade pode ser facilmente transformada em biodiesel Mais energia é necessária na etapa de reação, especialmente na etapa de aquecimento, pois envolve um alto consumo de energia Glicerina de alta qualidade é gerada como coproduto Possível geração de produtos de degradação térmica Etapas de separação e purificação mais simples envolvidas Alta temperatura e pressão necessária Alta conversão (98%) É necessária uma alta proporção de álcool para óleo Tempo de reação curto (7-15 min) Sem custo de catalisador 23 Fonte: Adaptada pela autora. No Brasil, e em grande parte do mundo, as indústrias optaram pelo uso da transesterificação via catálise alcalina utilizando principalmente o metóxido de sódio como catalisador para a produção de ésteres monoalquílicos, por apresentar baixo custo. No entanto, existem desvantagens neste método principalmente devido à ocorrência de reações secundárias (Figura 3), que reduzem o rendimento na produção de ésteres monoalquílicos. Além disso, é uma rota que requer grandes quantidades de energia, tratamento de efluentes e alta qualidade da matéria-prima (baixos teores de água e ácidos graxos livres), limitando o uso de diversas matérias-primas, aumentando assim o preço da produção de ésteres (18,19). Fonte: Elaborada pela autora. Nesse contexto, a procura por processos que não apresentam as dificuldades apresentadas a rota convencional (via transesterificação alcalina) tem aumentado, de maneira que seja possível trabalhar com matérias primas da 2° e da 3° geração, pois elas normalmente apresentam alto teor de água e de acidez. Uma rota que aceita essas matérias-primas sem nenhum pré-tratamento que pode utilizar biocatalisadores empregando tecnologia e produção mais sustentável é a hidroesterificação. 2.3 Hidroesterificação C ORR' H 2 O O + C OHR' O + ROHReação 1 C ORR' NaOH O + C O- Na+R' O + ROHReação 2 C OHR' NaOH O + C O- Na+R' O + H 2 O Reação 3 Figura 3. Reações secundárias que podem ocorrer durante a transesterificações de óleos vegetais: (1) hidrólise, (2) saponificação e (3) neutralização de ácidos graxos livres 24 O processo hidroesterificação, a mais recente alternativa para produção de biodiesel, pois permite o uso de qualquer matéria-prima graxa, independentemente do teor de ácidos graxos livres e de água (20–22). Trata-se de um processo integrado que envolve duas etapas consecutivas: a hidrólise seguida de esterificação (3,20,23). Este processo pode ser realizado através (i) hidroesterificação em processos não catalíticos (condição subcrítica ou supercrítica na hidrólise e esterificação) (24); (ii) hidroesterificação subcrítica/química (21,25); (iii) hidroesterificação enzimática/química (26) ou (iv) hidroesterificação enzimática (27). A primeira etapa – hidrólise (Figura 4) consiste numa reação química entre os acilgliceróis da gordura ou óleo vegetal (mono-, di-, e trigliceróis) com a água, produzindo ácidos graxos livres e glicerol, que são co-produtos intermediários com alto valor agregado e com ampla variedade de utilizações na indústria química. Nesta etapa inicial, podem ser empregadas matérias-primas com altos teores de acidez e de umidade, uma vez que o objetivo da hidrólise é obter altas conversões em ácidos graxos livres e a água é um dos reagentes (28). Figura 4. Hidrólise de triacilglicerídeos. Fonte: Elaborada pela autora. Na segunda etapa, os ácidos graxos gerados na etapa anterior, são esterificados com metanol ou etanol na presença de um catalisador (Figura 5). Não existe contato do glicerol (produzido e removido na hidrólise, etapa inicial) com o biodiesel (produzido na esterificação). Isso evita problemas de contaminação dos ésteres com resíduos de glicerol livre ou total (mono-, di- e triacilgliceróis), resultando em um biodiesel com pureza elevada (28). 25 Figura 5. Esterificação de ácidos graxos. Fonte: Elaborada pela autora. A hidroesterificação em condição subcrítica ou supercrítica produz uma taxa elevada de conversão dos triglicerídeos em ácidos graxos livres e posteriormente em biodiesel(25,29). No entanto, são empregadas altas temperaturas e pressões (200 a 400°C e 10 a 25 MPa, respectivamente), gerando um elevado custo operacional (22). Já quando se utiliza biocatalisadores como lipases principalmente na primeira etapa é possível diminuir significativamente a taxa de temperatura da reação, mesmo quando se utiliza matérias-primas de baixa qualidade (3). 2.4 Matérias – primas O biodiesel pode ser produzido a partir de diversas matérias-primas. O Brasil com sua imensa extensão territorial, associada às excelentes condições edafoclimáticas, apresenta um grande potencial de exploração de biomassa para fins alimentícios, químicos e energéticos. Entretanto, óleos brutos e gorduras residuais são considerados matérias primas de baixa qualidade pois apresenta elevada acidez devido a sua quantidade de ácidos graxos livres (maiores que 3 mg NaOH/g) e umidade (superior á 0,1% m/m), inviabilizando utilização do processo convencional (transesterificação por catálise alcalina) (30–32), pois há a necessidade de se realizar um pré-tratamento, no qual acarretam em custos adicionais, e inviabiliza diversas matérias-primas na qual destaca-se o óleo bruto de palma e o óleo residual. Os óleos e gorduras residuais (OGRs), classificado como 3° geração para produção de biodiesel apresentam uma disponibilidade e um potencial enorme, pois a quantidade de óleo 26 residual gerado por ano em qualquer país é elevada, são resíduos produzidos diariamente nas indústrias, residências e estabelecimentos comerciais (33). Durante o processo de fritura dos alimentos, os óleos vegetais ou gordura animal sofrem alterações físico-químicas devido à exposição ao calor (160 a 200 °C) e à luz durante períodos de tempo relativamente longos. Por razões econômicas, o mesmo óleo ou gordura é utilizado várias vezes. Geralmente, em restaurantes públicos, a fritura é conduzida no mesmo óleo por vários dias (34). Obviamente, as condições utilizadas no processo de fritura causam alterações físico-químicas no óleo, e a água presente nos alimentos acelera a decomposição dos óleos e gorduras (35). Apesar de serem expostos a agentes que provocam a degradação de sua estrutura química, os óleos e gorduras residuais provenientes de processos de fritura também são constituídos predominantemente por ácidos graxos e trigliceróis que podem ser convertidos em biodiesel (36). A reciclagem desse óleo como biocombustível proporcionaria a retirada de um resíduo que muitas vezes é descartado em lugares inapropriados, tais como pia/ralos e igarapés, agregando valor como matéria-prima, como fonte de energia. Em 2019, o Brasil atingiu o 10° maior produtor de óleo de palma (Elalis guineenses) (37), com uma produção cerca de 550 mil toneladas, é a oleaginosa de valor econômico mais produtiva que se conhece. A palma tem produtividade, em média 10 vezes mais que o óleo de soja. A Elalis guineenses vive em conjunto com espécies nativas, é ideal para ser cultivada em áreas degradadas. Entretanto o óleo bruto (1° geração para a produção de biodiesel) proveniente do fruto da palma possui elevado teor de água e índice de acidez, sendo inviável o seu uso in natura criando a necessidade de um processo de refino para se adequar na resolução de óleos vegetais da ANVISA e ser comercializado (38) esse óleo pode ser utilizado de forma bruta na produção de biodiesel por hidroesterificação ampliando a sua utilização e a agricultura. 2.5 Produção de biodiesel por biocatalisadores A utilização de enzimas para a produção de biodiesel tem apresentado muitas vantagens. Dentre os biocatalisadores, a aplicação de lipases é a classe de enzimas mais utilizada em síntese orgânica, pois possui excelente atividade catalítica, alta especificidade e pode catalisar diversas reações. As lipases (triglicerol acil hidrolases-EC 3.1.1.3) são enzimas geradas por microrganismos (Tabela 2), animais e plantas(39,40). Pertencem à classe das hidrolases, capazes de hidrolisar os trigliceróis insolúveis na interface entre o substrato e a água. Além da hidrólise, eles são capazes 27 de realizar vários tipos de reações, dependendo da composição do sistema reacional, como esterificação, transesterificação, interesterificação, alcoólise e acidólise (Figura 6). Todos esses processos irão gerar ésteres monoalquílicos (biodiesel). Além disso, todos os coprodutos gerados e obtidos em todo o processo, em especial o glicerol, são de alta pureza e qualidade. Tabela 2. Diferentes fontes de lipase microbiana (Christopher et al. 2014 (39)). Fungos Bacteria Leveduras Alternaria brassicicola Achromobacter lipolyticum Candida deformans Aspergillus niger Aeromonas hydrophila Candida parapsilosis Candida antarctica Bacillus subtilis Candida rugose Mucor miehei Burkholderia glumae Candida quercitrusa Rhizomucor miehei Chromobacterium viscosum Pichia burtonii Rhizopus chinensis Pseudomonas aeruginosa Pichia sivicola Rhizopus oryzae Pseudomonas cepacia Pichia xylosa Streptomyces exfoliates Staphylococcus aureus Saccharomyces lipolytica Thermomyces lanuginosus Staphylococcus carnosus Geotrichum candidum Fonte: Adaptada pela autora. 28 Figura 6. Reações com triglicerídeos utilizando como biocatalisador - lipase Fonte: Elaborada pela autora. As lipases são obtidas principalmente a partir da purificação de produtos vivos produzidos por microrganismos. Os principais microrganismos extracelulares são Mucor miehei, R. oryzae, C. antarctica e P. cepacia (17,41). As lipases intracelulares estão presentes dentro da célula ou na parede produtora de células. As lipases possuem diferentes regiosseletividade, especificidade e atividade catalítica. Em termos de regiosseletividade, as lipases podem ser divididas em quatro grupos (42,43): (i) Sn-1,3-específico: hidrolisa ligações éster na posição sn-1 e sn-3; (ii) Sn-2-específico: hidrolisa a ligação éster na posição sn-2; (iii) Ácido graxo específico: hidrolisa ligações éster de ácidos graxos de cadeia longa com duplas ligações entre C9 e C10; (iv) Não específico: hidrolisa ligações éster em qualquer posição. A transesterificação enzimática ganhou força em 1988, quando pesquisadores descobriram que as enzimas eram tolerantes a solventes orgânicos (44) O avanço no desenvolvimento da 29 biologia molecular da engenharia de proteínas em 1990, denominado “evolução dirigida”, proporcionou a produção de biodiesel a partir de biocatalisadores (45). Desde então, muitos pesquisadores têm sido realizados para aplicar reação de transesterificação, esterificação e processos combinados (hidroesterificação e duas etapas) visando aumentar a produção de biodiesel (3). Os principais biocatalisadores utilizados na reação de transesterificação são as lipases não específicas, como C. antarctica, C. rugosa, P. cepacia e P. fluorescens, que apresentam altos rendimentos acima de 99% de conversão utilizando uma temperatura de 30 a 50°C. Várias Sn-1,3 lipases também se mostraram eficientes com rendimentos superiores à eficiência teórica (66%, conversão máxima) devido à migração acila de posição devido ao sistema de reação. Isso ocorre porque cada lipase tem especificidade diferente sobre seus substratos (17). A transesterificação do catalisador lipase segue o mecanismo ping-pong bi-bi. O mecanismo ping-pong bi-bi pode ser descrito como dois substratos reagem para produzir dois produtos através da formação de intermediários enzima-substrato (42). A literatura propôs três vias cinéticas: (i) alcoólise direta de glicerídeos (triglicerídeos, diglicerídeos e monoglicerídeos) em ésteres alquílicos; (ii) duas etapas consecutivas que consistem em hidrólise (conversão de glicerídeos em ácidos graxos livres) e seguida de esterificação (conversão de ácidos graxos livres em ésteres alquílicos); (iii) reações simultâneas de alcoólise e hidrólise seguidas de esterificação. Além disso, é importante examinar a cinética enzimática, pois auxilia na determinação dos parâmetros ótimos de reação, em especial, estudos envolvendo tipo de lipase, imobilização de lipase, tipo de solvente, efeito da temperatura, concentrações de reagentes e fenômenos de transferência de massa; que são muito importantes para a ampliação do processo e para o projeto do reator. Há preferência no uso de lipase imobilizada que a lipase livre, pois reduz o alto custo do biocatalisador, que é o maior obstáculo ao uso de lipases. Além disso, a lipase imobilizada promove fácil recuperação e permite a reutilização da enzima. As vantagens e desvantagens de cada tipo de lipase estão ilustradas na Tabela 3 (46–48). 30 Tabela 3. Comparação entre lipase livre e imobilizada (46–48). Catalisador Vantagem Desvantagem Lipase livre Atividade catalítica mais eficiente Inativação da lipase pelo álcool Lipase instável com pequena mudança no meio de reação Altamente seletivo Alto custo Não é possível recuperar Lipase imobilizada Melhor estabilidade, especialmente em relação a solventes orgânicos e temperaturas mais altas Alta resistência à transferência de massa Alta estabilidade operacional Menor taxa de reação A co-imobilização com outras enzimas é possível Centrifugação e filtração necessárias para a separação Uso de reatores de leito fixo ou batelada sem necessidade de membrana para isolar a enzima do produto A atividade enzimática diminuiu durante o processo de imobilização Reciclo Fonte: Adaptada pela autora. Por outro lado, a imobilização da enzima pode afetar a atividade enzimática, a especificidade e a seletividade da enzima e também alterar sua forma estrutural. Essas mudanças nem sempre são benéficas. Alguns podem causar possíveis efeitos na estabilidade de temperatura, e solventes (álcool) da forma hiperativada da enzima, dispersão da enzima na superfície de suporte, enquanto outros podem levar a efeitos negativos como a e desnaturação e a inibição da lipase. 2.5 A lipase - Candida rugosa A lipase Candida rugosa (CRL) é uma glicoproteína hidrofóbica globular possui peso molecular de 45 – 62 kDa 4,2 % de açucares neutros e volume molecular de 5 nm × 4.2 nm × 3.3 nm(49,50). A proporção de resíduos de aminoácidos polares para apolar da enzima é de 1.08 (50). A Candida rugosa é uma lipase caracterizada como inespecífica, apresenta propriedades interessantes como estabilidade térmica (40 a 60 °C) e de pH (4 a 10) tornando-a atraente para a aplicação uma vasta gama de reações biocatalíticas em ambientes aquosos e não aquosos, que incluem reações de hidrólise inespecífica e estereoespecífica, esterificação e transesterificação (51). Segundo pesquisadores, até o momento nenhuma lipase está disponível com uma gama tão ampla de especificidade (substrato, posição do ácido graxo e estereopreferência) como a CRL, ela tem a capacidade de acomodar ésteres relativamente volumosos em seu sítio ativo (51,52). A literatura relata que a lipase de Candida rugosa é uma enzima que pode ser aplicada na síntese de produção de biodiesel pela rota de transesterificação e esterificação, entretanto até o 31 momento não se há trabalho aplicando ela na rota de hidroesterificação, mas há pesquisas utilizando ela em reação de hidrólise de óleos vegetais (53–55). Nestes trabalhos, ou autores utilizaram a lipase de Candida rugosa imobilizada em diferentes suportes: zircônia, líquido iônico e nanopartículas de sílica, no entanto os resultados tem demonstrado baixas conversões em ácidos graxos, e as que aplicam na reação de transesterificação quando imobilizada apresenta baixa conversões e poucos reusos da enzima devido à dificuldade de separação do meio reacional. Além disso, a Novozym 435, lipase imobilizada comercialmente da Candida antarctica lipase B (CALB), tem sido empregada com sucesso na reação de síntese de biodiesel por transesterificação (56–58). Novozym 435 é imobilizada pelo método de adsorção em uma resina macroporosa chamada Lewatit VP OC 1600. De acordo com informações disponibilizadas pela Novozymes Co. a lipase produz biodiesel com mais de 97% (m/m) de ésteres monoalquílicos (56). Atualmente, a Novozym 435 é a lipase comercial que supera o alto custo do biocatalisador, pois apresenta o melhor rendimento de produção de biodiesel quando comparada a outras lipases imobilizadas. No entanto, ela não é tolerante a altas concentrações de metanol e água, o que promove sua desnaturação, a indústria de biodiesel opera observando os níveis de água e aplicando álcool de forma fracionada. E não é possível produzir biodiesel utilizando matérias-primas de baixa qualidade ou óleo bruto o que promove desvantagem ao processo comercial. 2.6 Imobilização O processo de imobilização de lipases é uma técnica que consiste no confinamento das enzimas no interior de poros ou na sua retenção na superfície de um material (59). A utilização de derivados imobilizados ganhou espaço na indústria nos últimos anos por apresentar vantagens no uso dos biocatalisadores, como retenção da atividade biológica por mais tempo; facilidade de separação do catalisador e do produto; redução do volume de reação, pois, a imobilização permite uma maior concentração de enzimas em menor volume de reator; maior estabilidade ao pH e a temperatura; facilita a interrupção da reação após atingir-se determinado grau de conversão de interesse e possibilidade de reaproveitamento da enzima em processos contínuos (59). Outro fator importante é a viabilidade econômica ao se utilizar a imobilização de enzimas. É necessário considerar que o tipo de suporte utilizado e o método selecionado influenciam na atividade e reutilização da enzima em processos biocatalíticos (60). Na literatura há muitas 32 maneiras que possibilitam a imobilização de enzimas, com o objetivo de prolongar a atividade enzimática em diversos ciclos, principalmente em processos industriais. Os métodos de imobilização mais empregados com sucesso são: (61,62). (i) Adsorção física: É uma das técnicas de imobilização mais simples. Baseia-se nas interações físicas do carreador e da enzima, como dipolo-dipolo, forças iônicas, hidrofóbicas/hidrofílicas, forças de Van der Waals, ligações de hidrogênio e forças eletrostáticas. (ii) Ligação covalente A ligação covalente fornece uma interação mais fortes entre a enzima e o suporte. A ligação é um processo de várias etapas: promoção de grupos reativos na superfície inorgânica; funcionalização; ativação e, finalmente, reação com a enzima. (iii) Encapsulação Aprisionamento via inclusão de uma enzima em um polímero rede, tipicamente matrizes poliméricas orgânicas ou inorgânicas. (iv) Cross-linking Reticulação de agregados enzimáticos ou cristais, se utilizada de um reagente bifuncional, para preparar macropartículas sem transportador, ou seja, liga uma enzima a outra. Podendo haver um suporte, entretanto leva a diluição da atividade. Além do tipo de imobilização outros fatores como meio de imobilização (solvente ou tampão); temperatura; ponto isoelétrico e meio de imobilização são importantes ser avaliados para uma boa imobilização. Na Tabela 4 são apresentados alguns fatores a ser levados em consideração ao se planejar imobilizar. 33 Tabela 4. Fatores levado em consideração antes da imobilização de enzimas Técnica de imobilização Fatores em consideração Geral Aditivos na preparação enzimática que podem interferir Estabilidade da enzima sob condições de imobilização Estabilidade do suporte em condições operacionais Lixiviação de proteínas em condições operatórias Interações não específicas do substrato com o suporte Custo e disponibilidade do suporte Adsorção Presença de regiões hidrofóbicas na enzima (Suporte hidrofílico) Presença de regiões hidrofílicas na enzima/glicosilação (Suporte hidrofóbico) Força iônica do tampão de imobilização para favorecer a adsorção de proteínas Interações iônicas pI da enzima Ligação covalente / Crosslinking Localização dos resíduos necessários para a ligação pH de imobilização adequado para ataque nucleofílico Flexibilidade conformacional exigida pelo mecanismo catalítico Encapsulação Tamanho da enzima Condições de síntese para o polímero Fonte: Hanefeld, U; Gardossi, L; Magner, E et al 2009 (47) – modificada pela autora 2.7 Suporte para a imobilização O avanço das técnicas de imobilização tem permitido o uso e o desenvolvimento de uma variedade de suportes sólidos orgânicos, ou inorgânicos, esses materiais apresentam propriedades físico-químicas e biológicas distintas e tamanho e formas diferentes. Para a seleção de um suporte para a imobilização de enzimas é importante escolher um suporte que: (i) Possua arquitetura que mantenha a estrutura 3D da enzima; (ii) Promova a estabilidade da enzima (pH e temperatura); (iii) Promova a atividade enzimática; (iv) Proteja a enzima contra lixiviação; (v) Possuir carga superficial; (vi) Possua grupos funcionais; (vii) Forneça estabilidade química e térmica; (viii) Possua resistência mecânica; (ix) Tenha ausência de toxicidade (x) Seja aplicável em larga escala 34 Os suportes orgânicos podem ser divididos em duas classes: (i) biopolímeros e (ii) polímeros sintéticos, e podem apresentar diferentes formatos: partículas, membranas, nanofibras, etc. Eles são frequentemente utilizados e promovem alto desempenho, eficiência e estabilidade para as enzimas quando imobilizadas (63–65). Os suportes inorgânicos, geralmente empregados em processos de imobilização de enzimas, apresentam alta estabilidade química e física; mas tem baixa resistência mecânica sob forte agitação (63–65). 2.8.1 Argilas Nas últimas décadas as argilas tem demonstrado um papel importante em diversos processos industriais. Argila é uma rocha constituída essencialmente por um grupo de minerais que recebem o nome de argilominerais. Argilominerais são utilizadas como matéria-prima na indústria de cerâmica, materiais de construção, revestimentos de papel e etc. Entretanto, nos últimos anos tem sido aplicadas como adsorventes, catalisadores ou suportes de catalisadores (66). Argilominerais são constituídos de silicatos de Al, Fe e Mg hidratados, dispostos em camadas de estruturas cristalinas, constituídos por folhas contínuas de tetraedros SiO4, ordenados de forma hexagonal, condensados com folhas octaédricas de hidróxidos de metais tri e divalentes. Os diferentes argilominerais são classificados em grupos com base nas semelhanças em composição química e na estrutura cristalina. As estruturas cristalinas são classificadas em 2 tipos: estruturas 1:1 e estruturas 2:1, Figura 7. 35 Figura 7. Desenhos esquemáticos mostrando as estruturas (a) da folha tetraédrica, (b) da folha octaédrica, (c) mineral argiloso tipo 2:1 e (d) mineral argiloso tipo 1:1. Fonte: N. An et al. traduzido pela autora Além disso, argilominerais fornece alta área superficial e grupos funcionais como Si-O-Si, Si-O-OH e Al ou Mg (M)-OH. Os grupos na superfície podem interagir com as enzimas. Grupos hidroxila nas bordas quebradas de folhas tetraédricas e octaédricas são adequados para formar ligações de hidrogênio com moléculas de enzimas. O Caulim, conhecido também como caulinita é um argilomineral que apresenta estrutura laminar tipo 1:1 (uma folha tetraédrica de sílica ligada a uma folha octaédrica de alumina), já os argilominerais Vermiculita e Montimorilonitta apresentam a estrutura 2:1, diferença estrutural e tamanho das partículas. 2.8.2 Grafite Grafite (C6) é bastante abundante e de estrutura estável, é naturalmente encontrado em, rochas ígneas, sedimentares, metamórficas e ainda em alguns meteoritos de forma de cristais hexagonais com estrutura laminado em camadas, formado por milhares de folhas de grafeno, constituído de uma estrutura nas quais átomos de carbono com arranjo hexagonal interagem através 36 de ligações covalentes com outros carbonos no mesmo plano e somente forças de Van der Waals atuam entre as lamelas sucessivas. O grafite é hidrofóbico, bom condutor de corrente elétrica e de calor, resistente a altas temperaturas e oxidação, tem apresentado como versáteis para imobilização de enzimas devido à sua grande área de superfície (67) As propriedades e abundancia do grafite, tem feito com que ele seja largamente utilizado para a produção de nanocompostos (68) com a ascensão do grafeno em 2007 (69) imobilizações utilizando nanocompostos de carbono e grafeno se iniciou na última década, e tem apresentado bons resultados em escala de bancada. Devido suas propriedades químicas, e o avanço do grafeno, o grafite apresentar ser um potencial suporte para a imobilização de enzimas. 2.8.3 Suportes Magnéticos Os suportes magnéticos tem ganhado amplitude nos últimos anos e tem sido amplamente utilizados para finalidades biológicas, médicas, tecnológicas e na indústria (70). Além disso, vantagens como resistência a temperaturas elevadas pouca transferência de massa, ademais apresenta considerável área superficial disponível para a imobilização, promovendo uma reação que seja favorável e com menor perda de derivado durante o processo (71,72). Os suportes magnéticos maghemita (γFe2O3) e magnetita (Fe3O4), são óxidos de ferro formados por uma estrutura composta por íons de oxigênio, cujos espaços intersticiais estão preenchidos com por íons de ferro ferroso (Fe2+), íons de ferro férrico (Fe3+), se diferenciando pela ausência de ferro ferroso para a síntese de maghemita (73). As estruturas cristalinas da maghemita e magnetita são mostradas a seguir nas Figuras 8 e 9, respectivamente. Figura 8. Estrutura cristalina da Maghemita. Fonte: Oliveira et al. (2013) (74). 37 Figura 9. Estrutura cristalina da Magnetita Fonte: Oliveira et al. (2013)(74). Ademais, a utilização de suportes magnéticos para a imobilização de lipases para a aplicação na reação de biocombustíveis tem se mostrado eficaz (75–77). Portanto, na busca por materiais alternativos para imobilização de enzimas em bioprocessos, os suportes magnéticos surgem como uma possibilidade devido à sua característica magnética, facilitando a separação que pode ocorrer pela aplicação de um campo magnético externo, assim recuperando o derivado imobilizado ao final de cada reação. 2.8.4 Geopolímeros e impressão 3D O geopolímero é um polímero inorgânico semicristalino formado pele a poli condensação de alumínio (-Si-O-Al-O-), nano estruturados com misturas de minerais ou compostos que consistem em unidades repetidas, como óxido de silício (-Si-O-Si-O-), ferro-silício-alumínio (-Fe- O-Si-O-Al-O-), ou alumínio fosfato (Al-O-P-O), pode ser fabricado a partir de minerais de alumino silicato naturais/sintéticos ou subprodutos/resíduos de alumino silicatos industriais (como: metacaulim, cinzas volantes, escórias , lama vermelha, vidro, perlita, areia, cinza de casca de arroz, argila ou uma combinação deles) misturado com uma solução aquosa contendo ingredientes reativos (hidróxido de potássio/sódio, ácido fosfórico, silicato de potássio/sódio, etc...) são polimerizados à temperatura ambiente ou mesmo a uma temperatura próxima de 100°C (78–80). Sua composição química é semelhante da zeólita - uma microestrutura variável (amorfa a semicristalina) que é muito utilizada para a imobilização de lipases (79,81). Os geopolímeros surgiram como um dos materiais inorgânicos não metálicos mais promissores nos últimos anos, devido às suas notáveis vantagens, como na produção há baixo custo, baixo teor de emissão de CO2 e baixo consumo de energia; síntese fácil; disponibilidade de matérias-primas; estabilidade térmica e química; estrutura leve e porosa, alta área de superfície; 38 endurecimento rápido a baixa temperatura com excelente resistência resultante (82). Além da aplicação mais comum em cimentos e na construção civil, os geopolímeros tem sido testado em uma variedade de aplicações incluindo suportes de membrana; adsorventes e filtros, catalisadores, biocatalisadores, encapsulamentos, novos precursores para zeólita , cerâmica e outas aplicações (80). Os geopolímeros podem ser produzidos de diversas formas, o meio de produção do geopolímero tradicional é conhecido como espuma direta, em uma pasta homogênea é incorporado gás para a produção de espuma geopolímerica úmida que fica em suspenção ou líquida, que posteriormente é endurecida por cura a determinada temperatura para se obter o geopolímero de interesse. Mas recentemente com o avanço da indústria de manufatura aditiva conhecida também com impressão tridimensional (3D), foi possível produzir matérias impressos em 3D produzido de a partir de geopolímero. A nomenclatura de impressão tridimensional (3D) ou manufatura aditiva foi iniciada no final do século passado para narrar uma maneira de misturar diferentes materiais (polímeros, metais e cerâmicas) por ligação, fusão ou endurecimento em líquido ou resina para a criação de peças 3D através da criação de camadas usando desenho 3D assistido por computador (83,84). A manufatura aditiva é uma ferramenta versátil para resolver inúmeros desafios para a produção de suportes para a imobilização de enzimas. Franchin et al (2017) (85) inovaram a produção de geopolímeros, conseguindo imprimir a partir da técnica de escrita de tinta direta produzindo geopolímeros porosos à base de Na, sem rachaduras ou defeitos de superfície com alta porosidade, variando de 50 a 71% vol., e alta resistência à compressão (2–12 MPa) e uma área superficial de 14,3 m2/g e quando avaliado somente os filamentos internos também apresenta uma área de14,8 m2/g. Utilizando essa tecnologia inovadora é possível imprimir em geopolímeros estruturas com a forma desejada para serem imobilizadas e utilizadas dentro de diversos tipos de reatores, trazendo inovação para a produção de suportes para biocatalisadores e para a produção de biodiesel, uma vez que é possível imprimir suportes de diversas formas. https://www.sciencedirect.com/topics/engineering/liquid-resin https://www.sciencedirect.com/topics/materials-science/surface-defect 39 3 OBJETIVO Objetivo Geral O objetivo da presente pesquisa foi avaliar diferentes suportes para a imobilização da lipase Candida rugosa empregando-se diferentes métodos (adsorção física e ligação covalente) e selecionar os derivados imobilizados que possam ser aplicados como biocatalisador na reação de hidrólise a partir de matérias-primas de baixa qualidade (neste caso, OGR e óleo bruto de palma). Objetivos Específicos • Caracterização química dos óleos e gorduras residuais; • Imobilização da lipase Candida rugosa em diferentes suportes; • Avaliação do rendimento e das atividades hidrolíticas dos derivados imobilizados da lipase Candida rugosa nos suportes empregando-se diferentes métodos (adsorção física e ligação covalente); • Seleção dos melhores biocatalisadores para aplicação na reação de hidrólise de óleos e gorduras; • Otimização das condições reacionais da hidrólise em reator de bancada; • Avaliação do rendimento reacional da hidrólise através da determinação do teor de ácidos graxos livres e da esterificação através da determinação do teor de ésteres no biodiesel produzido; 40 4 EXPERIMENTAL Na Figura 10 é apresentado um fluxograma das principais atividades desenvolvidas nesta pesquisa. Figura 10. Fluxograma das etapas desenvolvidas. Fonte: Elaborado pela a autora 41 4.1 Coleta e armazenamento das amostras Foram avaliadas matérias-primas de baixa qualidade, tais como, óleo bruto de palma e OGR oriundos de atividades industriais, urbanas ou domésticas. As amostras de óleo de palma bruto foram fornecidas pela empresa Agropalma (Belém – PA), e a de OGR cedido pelo Instituto Federal de São Paulo – Campus Matão que possui, em seu campus, um ponto de coleta de óleo residual (OGR). As amostras foram armazenadas em frascos de polietileno com tampa de 5L, devidamente identificadas e acondicionadas em ambiente sob temperatura de 21°C ± 2°C sem exposição à luz. 4.2 Suportes Os suportes Caulim, Argila Vermiculita e Argila Montmorilonita, foram cedidos pelo grupo de pesquisa da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN). O geopolímero em 3D foi fornecido pela a Universidade de Padova (Itália). O grupo de Grafeno da Universidade Presbiteriana Mackenzie cedeu Grafite flakes mw 12,01 – 100 mesh e as partículas magnéticas de Fe3O4 foram sintetizadas em laboratório. 4.2.1 Síntese das partículas magnéticas Equipamentos e materiais utilizados  Erlenmyer de 250 mL;  Balança Analítica Ohaus, série Adventure com capacidade de carga de 210 g e precisão de 0,0001 g;  Papel de Filtro;  Bomba de vácuo  Reator de vidro encapsulados 50 mL  Banho termostatisado  Chapa magnética de agitação  Estufa  Mufla Reagentes e soluções 42  Cloreto de Ferro III 99,9% - Sigma-Aldrich, St. Louis, USA.  Cloreto de Ferro II 99,5% - Química Moderna Industrial e Comércio LTDA.  Acetato de etila 99,0% - NEON Reagentes Analíticos LTDA.  Hidróxido de Sódio 99,0% - Química Moderna Industrial e Comércio LTDA.  Hidróxido de Amônio 99,9%- Química Moderna Industrial e Comércio LTDA.  Ácido clorídrico 37,5,%- NEON Reagentes Analíticos LTDA.  Sulfito de Sódio 89 %  Água ultrapura. Procedimento do ensaio – Magnetita As partículas de magnetita foram sintetizadas por meio de co-precipitação de Fe2+e Fe3+ com hidróxido como agente precipitante. Em um béquer contendo 300 mL de água ultrapura (UP), 30 mL da solução de FeCl2 (0,6 M) foram adicionadas sob forte agitação mecânica e após, sob vagarosa agitação, adicionados 30 mL da solução de FeCl3.6H2O (1,1 M). Após a adição das soluções, a temperatura foi ajustada em 80ºC e, por meio da adição de NaOH (4 M), o pH foi mantido em 11, permanecendo em agitação por 30 minutos. Além do NaOH, foram sintetizadas partículas utilizando NH4OH (4 M) como agente precipitante. Assim, após os 30 minutos, o béquer foi mantido em repouso sob um ímã favorecendo a separação das partículas magnéticas, depositadas na forma de uma massa escura na parte inferior no béquer. Tirado o sobrenadante, a massa depositada foi lavada com água UP e acetato de etila (1:1), sendo deixadas em estufa por 24 horas à 100ºC 1, sendo armazenadas em temperatura ambiente até a imobilização. Procedimento do ensaio – Maghemita Para a síntese da maghemita, em um béquer, foram adicionados 30 mL da solução de FeCl3.6H2O (2 M), preparada em solução de HCl (2 M). Em seguida, 30 mL de água UP e 20 mL da solução de Na2SO3 (1 M), nesta ordem, foram adicionados ao béquer. A mistura foi deixada sob agitação até que a solução ficasse amarela. Em um béquer de 2 litros, 51 mL de hidróxido de amônio foram adicionados em 870 mL de água UP. A mistura amarela foi então vertida lentamente no béquer com água e hidróxido, deixado sob agitação por 1 hora à 300 rpm. Decorrido o tempo, o béquer foi deixado sob um ímã e a massa escura lavada com água UP, sendo levado a estufa para secagem por 24 horas à 100ºC. Por fim, para a formação da maghemita, a massa escura já seca foi levada a mufla à 250ºC, pelo período de 1 hora. Após, o suporte foi armazenado em dessecador até sua utilização (87). 43 4.2.2 Produção do suporte 3D de geopolímero Equipamentos e materiais utilizados  Impressora Delta (Delta Wasp 2040 Turbo, Wasproject,Massa Lombarda, Italy)  Escrita direta com tinta (DIW) através de um bico com diâmetro de 840 μm (Nordson Italia S.p.a., Segrate, Itália)  Seringa de 30 mm3  Balança analítica 0,0001 g;  Bomba de vácuo  Chapa magnética de agitação  Estufa Reagentes e soluções  Água Milliq  Óxido de Alumínio Al2O3 - Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany)  Dióxido de Silício SiO2 - Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany)  Óxido de sódio Na2O - SS2942, Ingessil S.r.l., Montorio,Italy  Metacaolin Al2O3.2SiO2 - Argical 1200S, Imerys S.A., Paris, France  Polietileno glicol (PEG) 1000, Sigma-Aldrich, St.Louis, USA. Procedimento do ensaio O processo de preparo das pastas para a formação das estruturas de geopolímero impresso em 3D à base de Na e K neste trabalho tiveram as seguintes razões molares: H2O / Al2O3 = 18,5, SiO2 / Al2O3 = 4, Na2O / Al2O3 = 1,3, para K Al2O3 = 4, KOH . O procedimento completo para preparar a pasta de geopolímero é descrito com mais precisão pelos pesquisadores Franchin e Innocentini (88,89). Para obter uma tinta imprimível com propriedades reológicas adequadas, foi utilizado geopolímero em pó e PEG como agente reológico (tinta). O sistema de impressão consistia de uma impressora (Delta Wasp) equipada com uma câmara pressurizada com um parafuso de rosca infinita para extrusão da pasta; a tinta foi transferida para uma seringa de 30 mm3 e acoplada na impressora. A tinta foi extrusada por escrita direta (DIW) através de um bico com diâmetro de 840 μm com ar e à temperatura ambiente, com 44 velocidade de impressão e fluxo de extrusão pré-determinados. Após a impressão da primeira camada composta por filamentos paralelos, o bico foi levantado na direção z para imprimir a segunda camada composta por filamentos paralelos girados em 90 °; esse processo foi repetido até atingir a altura máxima desejada. Seguindo este padrão, amostras de rede (Na-Geo e K-Geo) com 20 mm de diâmetro e 9,6 mm de altura foram impressas. Após o processo de impressão, as amostras foram colocadas em uma caixa fechada em uma estufa a 75 ° C por 2 dias para completar as reações de geopolimerização, e secas a 100 ° C durante a noite antes da caracterização (Esse procedimento foi realizado na Universidade de Padova – Itália) e após seguiu para a modificação da superfície. 4.2.3 Tratamento da superfície do suporte de geopolímero impresso em 3D 4.2.3.1 Modificação de superfície do Geo –Na e Geo- K Para estabelecer o carregamento eficiente de lipase por ligação covalente em superfícies inorgânicas, grupos amino NH2 foram enxertados usando APTES (3-aminopropiltrietoxisilano) e funcionalizados com reagente glutaraldeído para aumentar a hidrofobicidade. O método para modificar a superfície é descrito a seguir. 4.2.3.2 Troca iônica Equipamentos e materiais utilizados  Chapa magnética de agitação  Estufa Reagentes e soluções  Nitrato de amônio Química Moderna, São Paulo, Brasil;  Solução de Nitrato de amônio 0,1 M Procedimento do ensaio As redes geopoliméricas impressas (Na-Geo e K-Geo) foram submetidas a troca de íons para remover íons de Na móveis do material e evitar um forte aumento no valor de pH das soluções aquosas em contato com ele. Uma solução NH4NO3 foi preparada e a troca iônica realizada na 45 relação geopolímero : 1 g / 100 mL (NH4NO3). As amostras de Na-Geo foram imersas na solução sob agitação mecânica; a cada 24h a solução foi trocada até a estabilização do pH em 7 por um total de 4 dias. As amostras resultantes, denominadas IE-Geo-Na e IE-Geo-K após o processo de troca iônica, foram secas a 110 ° C durante a noite (Esse procedimento foi realizado na Universidade de Padova – Itália) e após as peças foram funcionalizadas. 4.2.3.3 Ativação com APTES Para a imobilização por ligação covalente o suporte IE-Geo-Na e IE-Geo-K foram ativado com uma solução de APTES 5% v/v em hexano - 80 mL desta solução para cada grama (g) do suporte, que permaneceu sob agitação em atmosfera de nitrogênio por 2 horas á 80 °C. Após a ativação o suporte foi denominado SF-Geo-Na (Geopolímero de Na revestido com NH2) e SF- Geo-K (Geopolímero de K revestido com NH2), e guardadas até a imobilização por ligação covalente. 4.2.3.4 Determinação de grupos funcionais de amina por colorimetria Para avaliar a ativação com APTES no suporte de geopolímero impresso em 3D, foi realizado um teste colorimétrico com ninidrina. As amostras que foram realizados os testes foram: Geo-Na, Geo-K; IE-Geo-Na; IE-Geo-K; SF-Geo-Na e SF-Geo – K. Equipamentos e materiais utilizados  Chapa magnética de agitação  Estufa  Vortex  Reagentes e soluções  Ninidrina (2,2-diidroxi-hidrindeno-1,3-diona);  Solução aquosa de Ninidrina 0,1 % (m/m)  Água destilada Procedimento do ensaio 46 No tudo de ensaio foi adicionado 500 mg de amostra com 1 mL de água, e agitada no vortex por 1 min. Após 1 mL de solução de Ninidrina (0,1% m/m) foi adicionada no tubo. Os tubos foram colocados no banho maria a 40°C e permaneceu por 20 min. Passado o período de tempo os tubos foram retirados secos por fora e comparada visualmente (90,91). 4.2.4 Caracterização física do geopolímero Foi realizada microanálise química por espectroscopia de energia dispersiva de raios-X (EDX) em conjunto com microscopia eletrônica de varredura (MEV): FEI Quanta 200 pressão variável ambiental / ESEM, equipado com: filamento de tungstênio; Detector de elétrons secundários SED Everhart-Thornley, em HV; LFD (detector de elétrons secundários de grande campo em LV); BSED / GAD (detector de elétrons retroespalhados / detector analítico gasoso) em HV / LV; detector de energia dispersiva de raios-X (EDX) Elemento EDAX - C2B (Chip de 30 mm2 - resolução 129 eV em Mn K); Vácuo de 0,53 Torr; a resolução máxima do instrumento é de 3 nm a 30 kV e foi usado para (semi) quantificar a troca de íons de sódio por nitrogênio no geopolímero. A análise foi realizada em várias regiões da amostra para obter um valor mais confiável (Essa análise foi realiza na Universidade de Páduva – Itália). 4.2.4.1 Permeabilidade Os coeficientes de permeabilidade k1 e k2 podem ser obtidos por meio de experimentos de fluxo de gás em laboratório, ajustando a Equação 1 aos dados experimentais de queda de pressão (ΔP) e velocidade do fluido (vs). A grande vantagem é que esses parâmetros de permeabilidade são dependentes apenas da macroestrutura média (tamanho dos poros, porosidade, morfologia dos poros, interconectividade dos poros, etc.) e, portanto, podem ser usados para estimar as relações reais ΔP- vs para outras condições de fluido e fluxo, desde que ρ e µ sejam corrigidos de acordo com a temperatura e pressão de teste. A avaliação experimental da permeabilidade foi realizada em aparelho fabricado no laboratório da UNAERP (Universidade de Ribeirão Preto – SP), com ensaios realizados em regime de regime permanente com fluxo de ar seco em condições ambientais (T = 29 ° C e Po = Patm = 712 mmHg). O gradiente de pressão na amostra (Pi - Po) foi medido por um manômetro digital (Sper Scientific, modelo 840083, Scottsdale-AZ, EUA) em resposta às 47 variações na taxa de fluxo volumétrico de ar Q, controlado por uma válvula de agulha e medido com um rotâmetro (Conaut, São Paulo-SP, Brasil) aberto à atmosfera. A vazão (Q) foi corrigida para o valor na saída da amostra (Qo) e finalmente convertida para velocidade superficial por vs = Qo / Aflow. Mais detalhes da configuração são descritas pelo pesquisador Innocentini et al (92,93). ∆𝑃 𝐿 = 𝜇 𝐾1 𝑉𝑆 + 𝜌 𝐾2 𝑉𝑆 2 Equação 1 O conjunto de dados coletados (P1, Po e vs) para cada teste foi ajustado e tratado de acordo com o método dos mínimos quadrados usando um modelo parabólico do tipo: y = ax + bx2, onde y é ΔP (da Equação 2) e x é a velocidade do fluido vs. Os parâmetros de permeabilidade foram então calculados a partir das constantes ajustadas a (k1 = µ/a) e b (k2 = ρ/b) da Equação 1. O aparelho usado para testes de permeação é esquematizado na Figura 11. ∆𝑃 = 𝑃1 2−𝑃𝑂 2 2𝑃 Equação 2 Fonte: Murilo Daniel de Mello Innocentini, traduzida pela autora Manômetro Digital Manômetro Digital atmosfera Manômetro Digital atmosfera Compressor de Ar Secador Válvula Amostra Medidor de vazão Figura 11. Esquema do teste de permeação de fluxo de ar. 48 4.2.4.1.1 Amostras para o teste de permeabilidade Três amostras de geopolímero em 3D foram usadas para testes de permeação com fluxo de ar. As imagens das amostras são fornecidas na Figura 12. As características físicas e as dimensões são fornecidas na Tabela 5. Figura 12. Fotos das amostras de geopolímero testadas. Fonte: Murilo Daniel de Mello Innocentini Tabela 5 . Características físicas das amostras de geopolímero testadas. Amostra Diâmetro D (mm) Largura L (mm) Massa M (g) Volume V (cm3) Densidade aparente D (ρa g/cm3 ) Na – Geo - 1 18,60 19,50 4,303 11,39 0,378 Na – Geo - 2 18,95 19,45 4,564 11,58 0,394 Na – Geo - 3 19,50 19,25 4,419 11,79 0,375 Média 19,02 19,40 4,429 11,59 0,382 Desvio 0,45 0,13 0,131 0,20 0,010 CV (%) 2,39 0,68 2,95 2,72 2,74 49 4.3 Imobilização 4.3.1 Imobilização da Lipase de Candida rugosa por adsorção Equipamentos e materiais utilizados  Erlenmyer de 250mL;  Balança Analítica Ohaus, série Adventure com capacidade de carga de 210 g e precisão de0,0001 g;  Papel de Filtro;  Bomba de vácuo Reagentes e soluções  Lipase de Candida rugosa tipo VII sólida - Sigma-Aldrich, St. Louis, USA.  Hexano, pureza min. 99,5%: Química Moderna Industrial e Comércio LTDA.  Polietilenoglicol (PEG) 1500 - Sigma-Aldrich, St. Louis, USA.  Solução tampão pH 4.0; 5.0 e 7.0.  Suportes: Caulim, Argila Vermiculita, Argila Montmorilonita, Maghemita, Magnetita, Grafite e Geopolímero 3D. Procedimento do ensaio Na imobilização da lipase por adsorção física em meio orgânico, o suporte foi embebido em hexano, em proporção 1:10 (m/v), e mantido sob agitação, em temperatura ambiente, por 2 horas conforme proposto por Paula (2012)(94). Após, foram adicionados ao suporte 200 μL de solução de PEG 0,5 mg/mL e 0,250g de enzima/ g de suporte. A lipase e o suporte foram mantidos em agitação á 4°C, por 24 horas, e posteriormente foi filtrada à vácuo e lavada com hexano. A imobilização em meio aquoso seguiu o mesmo procedimento utilizando como solvente solução tampão pH 4,0; 5,0 e 7,0. 4.3.2 Imobilização da Lipase de Candida rugosa por ligação covalente Equipamentos e materiais utilizados  Erlenmyer de 250mL; 50  Balança Analítica Ohaus, série Adventure com capacidade de carga de 210 g e precisão de 0,0001 g;  Papel de Filtro;  Bomba de vácuo;  Bomba peristáltica  Reator de vidro encapsulados 50 mL;  Banho termostatisado;  Chapa magnética de agitação. Reagentes e soluções  Lipase de Candida rugosa tipo VII sólida - Sigma-Aldrich, St. Louis, USA.  APTES (3-aminopropiltrietoxisilano) – Sigma Aldrich, St. Louis, USA.  Hexano, pureza min. 99,5%: Química Moderna Industrial e Comércio LTDA.  Solução tampão fosfato pH 7,5.  Solução de Glutaraldeido 25 % (v/v) – Sigma Aldrich, St. Louis, USA.  Suportes: Caulim, Argila Vermiculita, Argila Montmorilonita, Maghemita, Magnetita Grafite e Geopolímero 3D. Procedimento do ensaio Na imobilização por ligação covalente o suporte foi funcionalizado com uma solução de APTS 5% v/v em hexano - 80 mL desta solução para cada grama (g) do suporte, que permaneceu sob agitação em atmosfera de nitrogênio por 2 horas á 80 °C. Após esse período, o suporte foi filtrado e seco em estufa á 110°C por 12 horas. Em seguida, o suporte foi funcionalizado com glutaraldeído. Para cada grama (g) de suporte 20 mL da solução de glutaraldeido 2,5% (v/v) em tampão fosfato pH 7,5 foi adicionada. Manteve-se em agitação a temperatura ambiente por 2 horas. Após, o suporte foi filtrado e lavado com álcool, água e solução tampão para garantir a retirada do excesso de glutaraldeído. O suporte ativado e funcionalizado foi utilizado para a imobilização da lipase de Candida rugosa por ligação covalente. O procedimento constitui do contato da solução enzimática de 20 mg de lipase/ g de suporte solubilizada em pH 5 sob temperatura de 4 °C por 24 horas sob agitação a 200 rpm. Para o suporte geopolímero em 3D utilizou reator de coluna encamisado de 50 mL, 20 cm de altura e diâmetro interno de 2 cm, mantendo-se uma vazão de 6 mL/min com a bomba peristáltica. 51 4.4 Avaliação da eficiência da imobilização da lipase candida rugosa nos suportes hidrofílicos, hidrofílicos m