RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta tese será disponibilizado somente a partir de 22/02/2021. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DO VÍRUS DA ANEMIA INFECCIOSA EQUINA NO PANTANAL E PADRONIZAÇÃO DE qPCR PARA DIAGNÓSTICO CAMILA DANTAS MALOSSI BOTUCATU - SP Fevereiro 2019 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DO VÍRUS DA ANEMIA INFECCIOSA EQUINA NO PANTANAL E PADRONIZAÇÃO DE qPCR PARA DIAGNÓSTICO CAMILA DANTAS MALOSSI Tese apresentada ao Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de Botucatu, para obtenção do título de Doutora em Biotecnologia. Orientador: Prof. Dr. João Pessoa Araujo Júnior Coorientadora: Dra. Leila Sabrina Ullmann BOTUCATU - SP Fevereiro 2019 AUTOR: Camila Dantas Malossi. TÍTULO DO TRABALHO: Caracterização molecular do Vírus da Anemia Infecciosa Equina no Pantanal e padronização de qPCR para diagnóstico LOCAL: IBTEC/UNESP – Campus de Botucatu/SP. COMISSÃO EXAMINADORA Prof. Dr. João Pessoa Araujo Júnior Presidente e Orientador Departamento de Microbiologia e Imunologia Instituto de Biociências – UNESP – Botucatu – São Paulo Prof. Dr. Ricardo Luiz Moro de Sousa Membro Titular Departamento de Medicina Veterinária Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos – USP – São Paulo Dra. Flavia Hebeler Barbosa Trovão Membro Titular Hemocentro de Botucatu Faculdade de Medicina de Botucatu – UNESP – Botucatu – São Paulo Prof. Dra. Maria Inês de Moura Campos Pardini Membro Titular Departamento de Clínica Médica Faculdade de Medicina de Botucatu – UNESP – Botucatu – São Paulo Prof. Dr. José Paes de Oliveira Filho Membro Titular Departamento de Clínica Veterinária Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – UNESP – Botucatu – São Paulo ______________________________________________________________________ Prof. Dra. Rejane Maria Tommasini Grotto Membro Suplente Departamento de Bioprocessos e Biotecnologia Faculdade de Ciências Agronômicas – UNESP – Botucatu – São Paulo Prof. Dr. Angelo Jose Magro Membro Suplente Departamento de Bioprocessos e Biotecnologia Faculdade de Ciências Agronômicas – UNESP – Botucatu – São Paulo Prof. Dr. Marcos Bryan Heinemann Membro Suplente Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – USP – São Paulo Botucatu, 22 de fevereiro de 2019. Agradecimentos Ao Prof. João Pessoa Araujo Junior, pela oportunidade, confiança, orientação e paciência. Obrigada por sempre me dar a oportunidade de dizer o que penso, e mesmo tentar um experimento que você sabe que não dará certo. Todos nós do laboratório crescemos muito no Laboratório de Diagnóstico Molecular. Aos professores e pesquisadores que me auxiliaram na coleta de amostras e tornaram tudo isso possível: Márcia Furlan e toda a equipe da Embrapa, e prof Daniel Moura de Aguiar e toda a equipe da UFMT. Obrigada pelas discussões sobre AIE, pelos telefonemas, pelas viagens da Márcia para nos trazer as amostras. Se esse trabalho está finalizado hoje, vocês tem tanto mérito quanto eu. À FAPESP, EMBRAPA e FUNDIBIO, pelo auxílio financeiro para a realização deste trabalho. Falando em coleta de amostras, devo meu respeito e sinceros agradecimentos aos animais Malagueta e Luna, cujas amostras foram essenciais para esse projeto. Sei que nenhum de vocês está mais nesse plano e suas existências irão ajudar muitas outras aqui neste mundo. Obrigada! Ao prof. Ângelo Magro, pelo auxílio nas análises de bioinformática e proteínas. Obrigada por responder todas as minhas perguntas, mesmo as mais simples! Ao Jedson Cardoso, que se prontificou em analisar os dados do NGS em plataformas que não conhecíamos, para trazer mais resultados com a análise denovo. Sei que seu tempo era curto, muito obrigada! À todos os funcionários do IBB, que sempre nos ajudaram seja recebendo amostras, seja para uma pausa gostosa para o café: Ana, Lulinha, Luiz Alquati, Rafael, Larissa, Ivana, dentre outros. À todos os funcionários do IBTEC, a segunda casa que o laboratório ganhou com mais espaço e desafios: Edna, Raquel, Mary, Bruno, Valter, dentre outros. Aos alunos da primeira turma da Pós Graduação de Biotecnologia, que compartilharam comigo as experiências, disciplinas, aflições e alegrias de trabalhos finalizados. Vocês são incríveis e quem fez parte dessa turma sabe o que é alunos unidos pela pós. Sucesso a todos! À todos aqueles que me ajudaram na rotina do LDMVET, seja na bancada, seja com laudos, seja com caronas: eu não conseguiria terminar esse trabalho sem o suporte de todos! Muito, mas muito obrigada! Compartilhar um ambiente como um laboratório é uma experiência única. Tive muita sorte em ter colegas de laboratório que tornaram essa experiência maravilhosa. A todos vocês, obrigada por me manterem firme até o fim. É maravilhoso ver que vocês não são apenas colegas, mas amigos. Curan e Duroc, obrigada por me fazerem rir e repensar muitas das minhas ações para me superar sempre. Ingrid, você é o melhor presente que o Duroc trouxe para nosso grupo (rs) e sou grata por ter conhecido alguém com sua garra, mesmo com você mesma duvidando dela. Michely, sinto falta de você todos os dias em nosso lab para xingarmos a vida, mas torço todos os dias pelo seu sucesso. Raíssa, obrigada por iniciar esse projeto com AIE e por passá-lo para mim depois de seu mestrado. Arrase na sua nova jornada! Ariani e Jacqueline, obrigada pelos momentos de aprendizado enquanto vocês trabalhavam em seus doutorados. Taís, você me ensinou bem mais do que um ELISA e um qPCR de diagnóstico, e estamos todos no laboratório rezando por sua saúde. Claudia Filoni, você foi uma mãe para todos nós em seu período aqui no LDM. Tenha certeza que cresci enormemente como pessoa com seus conselhos. Clau Tozato, obrigada por ajudar a todos sem medir esforços. Todos ficamos muito tristes e muito felizes também com sua mudança para o exterior. Desejo a você toda felicidade do mundo lá. Marianna, obrigada por sempre estar disposta a ajudar e ensinar a todos. Aprendi mais sobre pescados com você do que durante toda a minha graduação! Luana, obrigada pela sua energia no lab, estamos todos torcendo pelo seu sucesso! Leticia, foi um prazer te ajudar no doutorado; desejo-lhe que encontre a felicidade em qualquer caminho que você escolher (e que o próximo Tróia nos aguarde!). Guilherme, obrigada pela força no laboratório e nas corridas (Tróia) também! Cristiano, obrigada por todas as palavras de incentivo quando as coisas não davam certo (e pelos chocolates também!). Por favor, continue essa pessoa que nos passa tranquilidade e paz. Cid, muito obrigada por complementar o nosso laboratório! Esse laboratório cheio de mulheres precisava de alguém como você para nos ajudar a ter equilíbrio (e brejas também!). Tenho um agradecimento especial para as meninas que formaram o “Lab da bagunça”. Pam, Jéssica, Jaqueline, Marina, Leila e Camila. Todas vocês não só me ajudaram enormente com meu doutorado, mas me ajudaram a sobreviver a ele. Os almoços, as noites de cinema, os exercícios, os conselhos, a companhia para fazer exame de sangue, estão todos no meu coração. Vocês são maravilhosas e sou uma pessoa melhor sabendo que vocês estão ao meu lado. À Prof. Leila Ullmann, ou Leilinha, que além de ser minha coorientadora e me ajudar a não desistir em nenhuma etapa do trabalho, é uma amiga valiosa que Botucatu me trouxe. À minha vó Maria Cecília, que tem o dom de amar e enlouquecer todos os filhos e netos (rs). Obrigada pelo orgulho que você sente de mim, vó, bem como todo apoio que sempre deu. A Daniel e Marlene, que me adotaram como filha, e me apóiam com sorrisos e boa comida para eu continuar minha jornada. Muito obrigada!!! À pessoa que possibilitou tudo isso desde o início. Mãe, obrigada por me fazer o que sou hoje. Tenho desde pequena o melhor exemplo de luta e superação dentro de minha casa. A você devo tudo e mais um pouco. Esse doutorado é uma conquista, não só minha mas sua também. Te amo! Junto comigo, minha mãe criou alguém que seria minha cara metade. Mana, você cresceu me fazendo crescer junto com você. Eu nunca duvidei da sua capacidade assim como você nunca duvidou da minha. Somos a melhor face uma da outra. Te amo sempre, doutora. Por último, mas jamais menos importante, obrigada por tudo, Luca. Seu apoio não se resume a não me deixar desistir e suportar minha ausência e mau humor. Esta tese está escrita graças a você. Você ajudou desde a repor ponteiras até emitir laudos. Obrigada por deixar meu mundo mais colorido e melhor para vivê-lo. “I close my eyes and I can see A world that's waiting up for me That I call my own Through the dark, through the door Through where no one's been before But it feels like home They can say, they can say it all sounds crazy They can say, they can say I've lost my mind I don't care, I don't care, so call me crazy We can live in a world that we design 'Cause every night I lie in bed The brightest colors fill my head A million dreams are keeping me awake I think of what the world could be A vision of the one I see A million dreams is all it's gonna take Oh a million dreams for the world we're gonna make [...]” A million dreams - The Greastest Showman (2018) Resumo MALOSSI, C. D. Caracterização molecular do Vírus da Anemia Infecciosa Equina no Pantanal e padronização de qPCR para diagnóstico. 2019. 139 f. Tese (Doutorado) – Instituto de Biociências de Botucatu, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Botucatu, São Paulo. O Vírus da Anemia Infecciosa Equina (VAIE) é um lentivírus que infecta equídeos causando a Anemia Infecciosa Equina. A doença possui distribuição mundial e o principal método de controle empregado é a eutanásia dos animais positivos, uma vez que não existe cura ou vacina disponível. No Brasil, a região do Pantanal é endêmica para a doença e, somente nessas áreas, a eutanásia não é obrigatória. A alta variação genética de lentivírus durante uma infecção prolongada é bem conhecida em várias espécies e também descrita em sequências de VAIE de outros países. Não há sequência genômica brasileira completa descrita ou mesmo um estudo da variação genética do vírus em um ambiente endêmico como o Pantanal Brasileiro. Com isso, este trabalho teve como objetivos a caracterização molecular do VAIE em equinos da região do Pantanal Brasileiro, e a padronização da PCR quantitativa (qPCR) para detecção do DNA proviral de VAIE. Duas amostras de plasma equino positivas para VAIE foram submetidas ao sequenciamento do genoma completo utilizando uma combinação de técnicas tradicionais e de nova geração. O genoma a partir do RNA viral foi obtido, anotado e comparado com sequências virais obtidas de animais naturalmente infectados em outros países. As sequências provenientes do Pantanal apresentaram identidade entre 75 e 77 % com sequências de outros países e 88,54 % entre si, classificando-as em um clado individual na árvore filogenética dos vírus já descritos, exibindo a maior variação genética descrita entre sequências de um mesmo país. Com a análise do gene do envelope viral, observou-se que os dois animais estudados estavam infectados por diferentes quasispécies virais. Baseado nas sequências obtidas, um qPCR foi padronizado para amplificar 71pb do gene tat de VAIE. A técnica foi testada em 255 amostras de DNA total de equinos do Pantanal e comparada com os resultados obtidos em testes sorológicos (IDGA e ELISA) e uma Semi Nested PCR. A qPCR apresentou melhor sensibilidade, especificidade e alta correlação com os resultados da Semi Nested PCR, sendo ainda um teste com menor risco de contaminação e melhor praticidade. A qPCR detectou o mesmo número de amostras positivas que o padrão ouro IDGA, porém ambos detectaram amostras diferentes, confirmadas por sequenciamento. Um fluxograma diagnóstico foi proposto para diminuir o risco de falsos negativos em áreas endêmicas, com o uso de IDGA, seguido de ELISA e qPCR. Palavras-chave: Vírus da Anemia Infecciosa Equina, Anemia Infecciosa Equina, Pantanal, área endêmica, sequenciamento genômico, diagnóstico, equinos. Abstract MALOSSI, C. D. Molecular characterization of Equine Infectious Anemia Virus from Pantanal and qPCR standardization for diagnosis. 2019. 139 p. Thesis (Doctorade) – Botucatu Biosciences Institute, São Paulo State University “Júlio de Mesquita Filho”. Botucatu, São Paulo. Equine infectious anemia virus (EIAV) is a lentivirus that infects equids and causes equine infectious anemia (EIA). This disease presents worldwide distribution and the main control method is the euthanasia of positive animals, since there is no cure or vaccine available. The Pantanal region in Brazil is endemic for the disease, and euthanasia is not mandatory in this area. The high lentivirus genetic variation during a prolonged infection is well known in several species and also described in EIAV sequences in other countries. There are no Brazilian viral genomic sequences available or even a study of genetic variation in an environment such as Brazilian Pantanal. This work aimed to characterize the EIAV complete genome in equines from Brazilian Pantanal and to standardize a quantitative real time PCR (qPCR) for detection of EIAV proviral DNA. Two plasma samples of EIAV positive horses were submitted to massive sequencing by combination of Sanger and NGS sequencing. The complete genome from viral RNA was obtained, annotated and compared with viral sequences of naturally infected animals from other countries. Sequences from Pantanal showed identity between 75% and 77% with other countries sequences and 88.54% with each other, classifying them into an individual cluster in EIAV cladogram and exhibiting the greatest genetic variation between sequences from the same country. With viral envelope gene analysis, both Brazilian sequences were classified as two quasispecies. A qPCR based on the sequences obtained was standardized to amplify 71 bp of tat gene of EIAV. This technique was tested in 255 equine total DNA from Pantanal and compared with results of serological tests (AGID and ELISA) and a Semi Nested PCR. Quantitative PCR presented better sensitivity, specificity and high correlation with Semi Nested PCR results, still considered a test with lower risk of contamination and better practicality. The qPCR detected the same number of positive samples as the gold standard AGID, but both detected different samples, confirmed by sequencing. A diagnosis flowchart was proposed to decrease false-negative risks in endemic áreas, using a sequence of AGID, ELISA and qPCR. Key words: Equine Infectious Anemia Virus, Equine Infectious Anemia, Pantanal, endemic área, genome sequencing, diagnosis, equine. Sumário 1 Revisão bibliográfica 14 1.1 Histórico 14 1.2 Agente etiológico: o vírus da Anemia Infecciosa Equina 16 1.2.1 Genoma de VAIE: poliproteína gag 17 1.2.2 Genoma de VAIE: poliproteína pol 19 1.2.3 Genoma de VAIE: poliproteína env 22 1.2.4 Genoma de VAIE: genes acessórios 23 1.2.5 Genoma de VAIE: long terminal repeats (LTR) 25 1.3 Ciclo de replicação do vírus da Anemia Infecciosa Equina 26 1.4 Patogenia e clínica 33 1.5 A transmissão da anemia infecciosa equina 35 1.6 Diagnóstico 37 1.7 Evolução viral 39 1.8 Genomas de VAIE sequenciados 41 1.9 VAIE no Pantanal, Brasil 42 2 Justificativa 46 3 Objetivos 48 4 Artigo Científico 1 49 High variations in Equine infectious anemia virus genome from naturally infected horses in Pantanal, Brazil: an endemic region case 49 5 Artigo Científico 2 73 A quantitative PCR to Equine infectious anemia virus from Brazil: evidences of serological silent equids require a new diagnosis workflow to EIA control 73 6 Conclusões finais 93 7 Referências bibliográficas 94 8 Anexos 105 9 Apêndices 107 14 1 Revisão bibliográfica O vírus da Anemia Infecciosa Equina (VAIE) é o agente etiológico da Anemia Infecciosa Equina (AIE), uma doença considerada um desafio para a medicina veterinária desde sua descoberta. Afetando equídeos em geral e sendo uma doença persistente por toda a vida do animal (como observado em todas as doenças acometidas por lentivírus), os estudos até hoje realizados ainda não chegaram à cura ou vacina eficaz. Com isso, um diagnóstico com alta acurácia é essencial para o controle da doença. 1.1 Histórico O primeiro relato da doença data de 1843 na França (LIGNÉ, 1843), e em 1904 foi relacionada com um agente filtrável que persistiam no hospedeiro equídeo e era transmitida pelo sangue (VALEE; CARRE, 1904). Portanto, o vírus da anemia infecciosa equina (VAIE) foi o primeiro retrovírus animal a ser atribuído como agente etiológico de uma enfermidade viral, precedendo em alguns anos as principais descobertas de agentes filtráveis, como a leucemia aviária (ELLERMAN; BANG, 1908) e o sarcoma aviário (ROUS, 1910). A transmissão mecânica de VAIE por insetos hematófagos vetores (especificamente tabanídeos) foi demonstrada em 1942 (STEIN et al., 1942) e em 1967, o vírus foi pela primeira vez propagado em cultura de leucócitos de equino (KOBAYASHI; KONO, 1967). A limitação imposta pela falta do cultivo do vírus restringiu muito o conhecimento a respeito do vírus e consequentemente da doença (LEROUX; CADORÉ; MONTELARO, 2004). Dessa forma, práticas de controle para AIE somente foram possíveis a partir de 1972 quando foi padronizado o teste de imunodifusão em gel de ágar (IDGA) que detecta anticorpos contra o vírus usando antígeno extraído de baço de equinos infectados (COGGINS et al., 1972). Mais de 100 anos depois da descoberta da doença, em 1952, Manete admitiu a ocorrência da doença no Brasil (REIS; LEITE, 2016). Em 1967, no Jockey Club do Rio de Janeiro, Dupont relatou o primeiro caso no país em exame post mortem de um equino (REIS; LEITE, 2016) e a doença também foi constatada no Rio Grande do Sul (GUERRERO et al., 15 1968). Em 1984, Montagnier observou que o soro de equinos positivos para AIE reconhecia proteínas virais em soro de pacientes com HIV e descreveu a relação antigênica entre as doenças (REIS; LEITE, 2016). No Brasil, o diagnóstico, as ações de profilaxia e controle, a erradicação dos focos, o controle de trânsito dos animais e outras normas estão pautados na Instrução Normativa 45 (IN45) de 15 de junho de 2004, do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) (BRASIL, 2004). Nela, está determinada a notificação obrigatória, marcação e eutanásia de animais positivos confirmados pelo teste de IDGA em laboratórios credenciados. As propriedades identificadas com animal(is) positivo(s) devem ser interditadas e o isolamento dos demais deve ser realizado, bem como sorologia do efetivo equídeo restante do local. A contraprova é facultativa e não há indenização. Figura 1: Situação da Anemia Infecciosa Equina reportada mundialmente de 2005 a 2018 segundo o Banco de Dados de Informação sobre Saúde Animal Mundial (World Animal Health Information Database - WAHIS Interface) da Organização Mundial de Saúde (OIE) - Disponível em: . Acesso em: 08/10/2018. 16 Atualmente, equídeos infectados com anemia infecciosa equina são encontrados no mundo todo e reportados frequentemente em países da Europa, Ásia, Oceania e Américas. A OIE não apresenta relatos recentes de AIE na África, exceto um caso em março de 2013 em Shambiko, Eritrea (OIE, 2018). Desde 2005, 55 países reportaram a presença da doença no mundo (Figura 1) (OIE, 2018). 93 6 Conclusões finais Neste estudo foram obtidas duas sequências genômicas completas do VAIE em animais naturalmente infectados no Pantanal brasileiro, área endêmica para a doença. A estratégia da NGS desenvolvida foi capaz de obter leituras suficientes para uma sequência completa, sem pré-amplificação, da amostra de equídeos de RNA. Com base em alinhamentos de seqüência e análise da árvore filogenética, BRA1 e BRA2 não estão intimamente relacionados com qualquer outra linhagem relatada até o momento, formando um grupo monofilético separado. A análise molecular dos genes mostrou alta variação de nucleotídeos e aminoácidos em LTR e env, e genes já relatados como conservados pol e gag com menor variação. Com a análise do gene do envelope, quasispécies virais diferentes puderam ser observados em ambos equinos. Baseado nos dois genomas obtidos, um qPCR amplificando o gene tat de VAIE foi padronizado. A análise de 255 equinos com os testes diagnósticos disponíveis (IDGA, ELISA, Semi Nested PCR e o qPCR descrito neste trabalho) mostrou que nenhum teste possui capacidade de detectar todos os animais positivos. Um número significativo de equinos infectados pela VAIE pode escapar da detecção se apenas o teste AGID for realizado (padrão ouro). Para realmente implementar um plano de controle efetivo e minimizar a chance de manter animais positivos em meio a uma fazenda controlada, sugerimos a implementação dos testes disponíveis em uma sequência de diagnóstico. 94 7 Referências bibliográficas AMODEO, P.; MORELLI, M. A. C.; OSTUNI, A.; BATTISTUZZI, G.; BAVOSO, A. Structural features in EIAV NCp11: A lentivirus nucleocapsid protein with a short linker. Biochemistry, v. 45, n. 17, p. 5517–5526, 2006. ANDRAKE, M. D.; SKALKA, A. M. Retroviral Integrase: Then and Now. Annual Review of Virology, v. 2, n. 1, p. 241–264, 2015. BACCAM, P.; THOMPSON, R. J.; LI, Y.; SPARKS, W. 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