JOSÉ LÚCIO PÁDUA GEMEINDER Avaliação da eficácia da biomembrana de látex natural incorporada com gentamicina na cicatrização de feridas experimentais em ovinos. Tese apresentado ao Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Biotecnologia. Orientador: Dr. Rondinelli Donizetti Herculano Coorientador: Dr. Breno F. M. de Almeida Coorientadora: Dra. Isabela B. da Costa Araraquara 2022 DADOS CURRICULARES IDENTIFICAÇÃO Nome: Jose Lucio Padua Gemeinder Nome em citações bibliográficas: GEMEINDER, J. L. P.; Gemeinder, Jose Lucio Padua; GEMEINDER, JOSÉ LÚCIO PÁDUA; GEMEINDER, J ENDEREÇO PROFISSIONAL: Centro Universitário de Ourinhos - Curso de Farmácia. Rodovia BR-153, Km 338+420m - Água do Cateto - 19909100 - Ourinhos, SP – Brasil FORMAÇÃO ACADÊMICA/TITULAÇÃO • 2017-Atual – Doutorado em Biotecnologias Universidade Estadual Paulista ‘Júlio de Mesquita Filho’ (UNESP), Instituto de Química, Araraquara-SP, Brasil. • 2014 - 2016 – Mestrado em Biociências Universidade Estadual Paulista ‘Júlio de Mesquita Filho’ (UNESP), Faculdade de Ciências e Letras de Assis, Assis-SP, Brasil. • 2015 - 2017 - Especialização em Farmacologia e Farmacoterapia. Centro Universitário das Faculdades Integradas de Ourinhos (Unifio), Ourinhos-SP, Brasil. • 1993 - 1996 - Graduação em Farmácia Industrial. Universidade de Marília (UNIMAR), Marília-SP, Brasil. ATUAÇÃO PROFISSIONAL • Centro Universitário das Faculdades Integradas de Ourinhos 2012 – Atual: Professor - Disciplinas: Estágio Supervisionado em Farmácia de Manipulação; Controle de Qualidade em Medicamentos e Cosméticos; Enzimologia e Tecnologia das Fermentações; Cálculos Farmacêuticos e Farmacotécnica I e II. • Universidade de Marília – UNIMAR 2021 – Atual: Professor - Disciplinas: Estágio Supervisionado em Farmácia de Manipulação; Tecnologia Farmacêutica; Tecnologia Cosméticas e Fitoterápica e Farmacotécnica I e II. PRODUÇÃO BIBLIOGRÁFICA Artigos completos publicados em periódicos 1. GEMEINDER, J.L.P., BARROS, N.R., PEGORIN, G.S., SINGULANI, J.L., BORGES, F.A., DEL ARCO, M.C.G., GIANNINI, M.J.S.M., ALMEIDA, A.M.F., SALVADOR, S.L.S., HERCULANO, R.D. Gentamicin encapsulated within a biopolymer for the treatment of Staphylococcus aureus and Escherichia coli infected skin ulcers, Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition, p.1- 19, 2021. DOI: https://doi.org/10.1080/09205063.2020.1817667 2. MORISE, B.T., CHAGAS, A.L.D., BARROS, N.R., MIRANDA, M.C.R., BORGES, F.A., GEMEINDER, J.L.P., SILVA, R.G., PAULINO, C.G., HERCULANO, R.D., NORBERTO, A.M.Q. Scopolamine loaded in natural rubber latex as a future transdermal patch for sialorrhea treatment. International Journal of Polymeric Materials and Polymeric Biomaterials, v.68, n.13, p.788-795, 2019. DOI: https://doi.org/10.1080/00914037.2018.1506984 3. BARROS, N.R., MIRANDA, M.C.R., BORGES, F.A., GEMEINDER, J.L.P., MENDONÇA, R.J., CILLI, E.M. Natural rubber latex: development and in vitro characterization of a future transdermal patch for enuresis treatment. International Journal of Polymeric Materials and Polymeric Biomaterials, v.66, n.17, p.871-876, 2017. DOI: http://dx.doi.org/10.1080/00914037.2017.1280795 4. BORGES, F.A., BARROS, N.R., GARMS, B.C., MIRANDA, M.C.R., GEMEINDER, J.L.P., RIBEIRO‐PAES, J.T., SILVA, R.F., TOLEDO, K.A., HERCULANO, R. D. Application of natural rubber latex as scaffold for osteoblast to guided bone regeneration. Journal of Applied Polymer Science. v.134, n.39, P.1-10 (45321), 2017. DOI: https://doi.org/10.1002/app.45321 Uma imagem do artigo foi selecionada como imagem de capa. 5. GARMS, B.C., BORGES, F.A., SANTOS, R.E., NIGOGHOSSINA, K., MIRANDA M.C.R., MIRANDA, I.U., DALTRO, P., SCARPARI, S.L., GIAGIO, R.J., BARROS, N.R., ALARCON, K.M., DRAGO, B.C., GEMEINDER, J.L.P., OLIVEIRA, B.H., NASCIMENTO, V.M.G., HERCULANO, R.D. Characterization and Microbiological Application of Ciprofloxacin Loaded in Natural Rubber Latex Membranes. British Journal of Pharmaceutical Research. v.15, n.1, p.1-10, 2017. https://doi.org/10.9734/BJPR/2017/31614 6. BARROS, N.R., CHAGAS, P.A.M., BORGES, F.A., GEMEINDER, J.L.P., MIRANDA, M.C.R., GARMS, B.; HERCULANO, R.D. Diclofenac Potassium Transdermal Patches Using Natural Rubber Latex Biomembranes as Carrier. https://doi.org/10.1080/09205063.2020.1817667 https://doi.org/10.1080/00914037.2018.1506984 http://dx.doi.org/10.1080/00914037.2017.1280795 https://doi.org/10.1002/app.45321 Journal of Materials, v.2015, p.1-7, 2015. DOI: http://dx.doi.org/10.1155/2015/807948 Resumos expandidos publicados em anais de congressos 1. MANEA, R. R.; MANEA, R. R.; Gemeinder, J. L. P.; GEMEINDER, A. C. S. Evaluation of industrialized capsules with enteretic coating available for magistral use. In: XIX Congresso de Iniciação Científica, 2020, Ourinhos. XIX Congresso de Iniciação Científica, 2020. 2. GONÇALVES, M.S.; GEMEINDER, J. L. P.; GEMEINDER, A. C. S. Avaliação da eficácia em saneantes domissanitários com ação antimicrobiana. In: XVIII Congresso de Iniciação Científica, 2019, Ourinhos. Anais do XVIII Congresso de Iniciação Científica, 2019. p. 106-105. 3. GONÇALVES, M.S.; GEMEINDER, J. L. P.; GEMEINDER, A. C. S. Efficacy evaluation in domissanitarian saneantes with antimicrobian action. In: XVIII Congresso de Iniciação Científica, 2019, Ourinhos. XVIII Congresso de Iniciação Científica, 2019. p. 106. 4. BARROS, N. R.; MIRANDA, M. C. R.; GARMS, B. C.; CHAGAS, P. A. M.; GEMEINDER, J. L. P.; Herculano, R. D. Natural rubber latex as Diclofenac Potassium carrier system. In: 9th Brazilian-German Workshop on Applied Surface Science, 2016, São Sebastião. 9th Brazilian German Workshop on Applied Surface Science, 2016. 5. BARROS, N. R.; MIRANDA, M. C. R.; GARMS, B. C.; CHAGAS, P. A. M.; GEMEINDER, J. L. P.; Herculano, R. D. O látex natural como sistema de liberação controlada de diclofenaco de potássio. In: VI Congresso Científico da UNESP e II Jornada de Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia, 2016, Araraquara. VI Congresso Científico da UNESP e II Jornada de Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia. Araraquara: Faculdade de Ciências Farmacêuticas/School of Pharmaceutical Sciences, 2016. v. 37. 6. SANTOS, N. P.; PONTES, A.; GEMEINDER, J. L. P. GEMEINDER, A. C. S. Physico-chemical comparisons between tablets and effervescent powders. In: XV Congresso de Iniciação Científica, 2016, Ourinhos. XV CIC - Congresso de Iniciação Científica, 2016. v. 4. p. 1-162. 7. LUZ, D. P.; MARTINS, C. B.; GEMEINDER, A. C. S.; GEMEINDER, J. L. P. Chemical physical evaluation tablets of captopril of 25mg: partial results. In: XV Congresso de Iniciação Científica - Faculdades Integradas de Ourinhos, 2016, Ourinhos. XV Congresso de Iniciação Científica - Faculdades Integradas de Ourinhos, 2016. v. 4. p. 1-162. 8. HERAKI, B. S. R.; LIMA, E. C.; CARDOSO, F.; GEMEINDER, A. C. S.; GEMEINDER, J. L. P. Evaluation of effectiveness in antimicrobial disinfectants products. In: XV Congresso de Iniciação Científica - Faculdades Integradas de Ourinhos, 2016, Ourinhos. XV Congresso de Iniciação Científica - Faculdades Integradas de Ourinhos, 2016. v. 4. p. 1-162. 7. ELOI, A. C. G.; SILVA, L. B.; HAGGI, J. H. B.; GEMEINDER, J. L. P.; GEMEINDER, A. C. S. Creams to urea based on pregnancy: hydration or risk? In: XV Congresso de Iniciação Científica - Faculdades Integradas de Ourinhos, 2016, Ourinhos. XV Congresso de Iniciação Científica - Faculdades Integradas de Ourinhos, 2016. v. 4. p. 1-162. 8. FARIA, N. S.; LOPES, T. A.; VAZ, L. G.; GEMEINDER, J. L. P.; GEMEINDER, A. C. S. Evaluation of the effect of antioxidant extracts Rosmarinus officinalis and Origanum vulgare front of hydroquinone. In: XV Congresso de Iniciação Científica - Faculdades Integradas de Ourinhos, 2016, Ourinhos. XV Congresso de Iniciação Científica - Faculdades Integradas de Ourinhos, 2016. v. 4. p. 1-162. 9. SOARES, P. F. N.; SILVA, P. O.; GEMEINDER, J. L. P.; GEMEINDER, A. C. S. Evaluation physical in capsules of omeprazole 20mg prepared masterfully. In: XV Congresso de Iniciação Científica - Faculdades Integradas de Ourinhos, 2016, Ourinhos. XV Congresso de Iniciação Científica - Faculdades Integradas de Ourinhos, 2016. v. 4. p. 1-162. 10. SILVA, R. P. P.; SANTOS, R. B.; GIMENES, C.; GEMEINDER, A. C. S.; GEMEINDER, J. L. P. Appraisal physical and chemical syrup herbal industrialized. In: XV Congresso de Iniciação Científica - Faculdades Integradas de Ourinhos, 2016, Ourinhos. XV Congresso de Iniciação Científica - Faculdades Integradas de Ourinhos, 2016. v. 4. p. 1-162. 11. GEMEINDER, J. L. P.; GUARIDO, C. F. Pharmaceutical analysis of antimicrobial prescriptions in a popular drugstore facility from Brazil. In: XV Congresso de Iniciação Científica - Faculdades Integradas de Ourinhos, 2016, Ourinhos. XV Congresso de Iniciação Científica - Faculdades Integradas de Ourinhos, 2016. v. 4. p. 1-162. 12. SANCHES, C. P.; OLIVEIRA, G. R.; GEMEINDER, A. C. S.; GEMEINDER, J. L. P. Avaliação De Teste Físico-Químico Em Cápsulas Gastro-Resistentes Preparadas Em Farmácias De Manipulação. In: XIII Congresso de Iniciação Científica - Faculdades Integradas de Ourinhos (FIO), 2014, Ourinhos. XIII Congresso de Iniciação Científica - Faculdades Integradas de Ourinhos (FIO), 2014. v. 6. p. 18-142. http://lattes.cnpq.br/3722706364081896 13. RODRIGUES, M. P.; CONCEICAO, K. S.; GARGUERRA, T. J.; GEMEINDER, J. L. P.; GEMEINDER, A. C. S. Estudo De Agentes Suspensores Em Formulações Magistrais De Hidróxido De Alumínio. In: XIII Congresso de Iniciação Científica - Faculdades Integradas de Ourinhos (FIO), 2014, Ourinhos. XIII Congresso de Iniciação Científica - Faculdades Integradas de Ourinhos (FIO), 2014. v. 6. p. 18-142. 14. SILVA, G. D. B.; PAIVA, R.; GEMEINDER, J. L. P.; GEMEINDER, A. C. S. Avaliação do controle de qualidade de cápsulas de atenolol manipuladas no município de Ourinhos - SP. In: XII Congresso de Iniciação Científica - Faculdades Integradas de Ourinhos (FIO), 2013, Ourinhos, SP. Anais do XII Congresso de Iniciação Científica - Faculdades Integradas de Ourinhos (FIO), 2013. v. 5. p. 18-119. 15. BENATTO, M. S.; SILVA, G. D. B.; GEMEINDER, A. C. S.; GEMEINDER, J. L. P. Comparação de diferentes técnicas de manipulação de cápsulas gelatinosas duras. In: XII Congresso de Iniciação Científica - Faculdades Integradas de Ourinhos (FIO), 2013, Ourinhos. Anais do XII Congresso de Iniciação Científica - Faculdades Integradas de Ourinhos (FIO), 2013. v. 5. p. 18-119. 16. PAIVA, R.; SILVA, G. D. B.; GEMEINDER, J. L. P.; GEMEINDER, A. C. S. Emprego de diferentes métodos para a determinação do peso médio de cápsulas magistrais na cidade de Ourinhos/SP. In: XII Congresso de Iniciação Científica - Faculdades Integradas de Ourinhos (FIO), 2013, Ourinhos. Anais do XII Congresso de Iniciação Científica - Faculdades Integradas de Ourinhos (FIO), 2013. v. 5. p. 18-119. 17. SILVA, C.; SILVA, G. L.; RIZZO, M. F. GATTI, L. L.; GEMEINDER, J. L. P.; CASTELO BRANCO Jr., A. Perfil Físico, Químico, Microbiológico e Ecológico de Três Cursos D'água Tributários da Bacia do Alto Paranapanema nos Estados de São Paulo e Paraná. In: XII Congresso de Iniciação Científica - Faculdades Integradas de Ourinhos (FIO), 2013, Ourinhos. XII Congresso de Iniciação Científica - Faculdades Integradas de Ourinhos (FIO), 2013. v. 5. p. 18-119. PARTICIPAÇÃO EM BANCAS Monografias de cursos de aperfeiçoamento/especialização 1. SILVA, R. D.; GEMEINDER, A. C. S.; GEMEINDER, J. L. P.; OBRELI NETO, P. R. Participação em banca de Renata Dias da Silva. Uso de medicamentos potencialmente inapropriados para idosos. 2021. Monografia (Aperfeiçoamento/Especialização em Farmacologia e Farmacoterapia) - Centro Universitário das Faculdades Integradas de Ourinhos. 2. ARAUJO, R. R.; GEMEINDER, A. C. S.; GEMEINDER, J. L. P.; OBRELI NETO, P. R. Participação em banca de Raquel Ribeiro de Araújo. Interações medicamentosas potenciais em pacientes idosos internados em unidades de terapia intensiva. 2021. Monografia (Aperfeiçoamento/Especialização em Farmacologia e Farmacoterapia) - Centro Universitário das Faculdades Integradas de Ourinhos. 3. CARVALHO, L. A. M.; GEMEINDER, A. C. S.; GEMEINDER, J. L. P.; OBRELI NETO, P. R. Participação em banca de Letícia Angélica Monteiro de Carvalho. Interações medicamentosas potenciais em pacientes com câncer. 2021. Monografia (Aperfeiçoamento/Especialização em Farmacologia e Farmacoterapia) - Centro Universitário das Faculdades Integradas de Ourinhos. 4. AGUERA, V. J.; GEMEINDER, A. C. S.; GEMEINDER, J. L. P.; OBRELI NETO, P. R. Participação em banca de Vitório José Aguera. Comparação da ocorrência de hipoglicemia em pacientes com diabetes mellitus tipo 1 usando insulina glargina versus insulina detemir. 2021. Monografia (Aperfeiçoamento/Especialização em Farmacologia e Farmacoterapia) - Centro Universitário das Faculdades Integradas de Ourinhos. 5. ROSA, R. M.; GEMEINDER, A. C. S.; GEMEINDER, J. L. P.; OBRELI NETO, P. R. Participação em banca de Raiane Manoele Rosa. Fatores que interferem na adesão ao tratamento medicamentoso de pacientes com hipertensão arterial no brasil. 2021. Monografia (Aperfeiçoamento/Especialização em Farmacologia e Farmacoterapia) - Centro Universitário das Faculdades Integradas de Ourinhos. 6. CALISTRO, A. C. P.; GEMEINDER, A. C. S.; GEMEINDER, J. L. P.; OBRELI NETO, P. R. Participação em banca de Ana Carolina Pagani Calistro. Relevância clínica da interação entre clopidogrel e inibidores da bomba de prótons. 2021. Monografia (Aperfeiçoamento/Especialização em Farmacologia e Farmacoterapia) - Centro Universitário das Faculdades Integradas de Ourinhos. 7. MARTELINE, V. A. G.; GEMEINDER, A. C. S.; GEMEINDER, J. L. P.; OBRELI NETO, P. R. Participação em banca de Victor André Grandini Marteline. Efetividade dos inibidores do co-transportador de sódio glicose tipo 2 versus demais antidiabéticos na redução da concentração sanguínea de glicose em pacientes com diabetes mellitus tipo 2. 2021. Monografia (Aperfeiçoamento/Especialização em Farmacologia e Farmacoterapia) - Centro Universitário das Faculdades Integradas de Ourinhos. 8. BATTILANI, B. M.; GEMEINDER, A. C. S.; GEMEINDER, J. L. P.; OBRELI NETO, P. R. Participação em banca de Bruna Marques Battilani. Comparação da ocorrência de hipoglicemia noturna em pacientes com diabetes mellitus tipo 1 usando insulina glargina versus insulina neutral protamine hagedorn. 2021. Monografia (Aperfeiçoamento/Especialização em Farmacologia e Farmacoterapia) - Centro Universitário das Faculdades Integradas de Ourinhos. 9. FELICCETI, R. M.; GEMEINDER, A. C. S.; GEMEINDER, J. L. P.; OBRELI NETO, P. R. Participação em banca de Rafaela Marocolo Felicceti. Benefícios da liraglutida no tratamento da obesidade. 2021. Monografia (Aperfeiçoamento/Especialização em Farmacologia e Farmacoterapia) - Centro Universitário das Faculdades Integradas de Ourinhos. PARTICIPAÇÃO EM EVENTOS CIENTÍFICOS: 1. IV Encontro Nacional de Patologia Clínica Veterinária – ENPC – Trabalho Apresentado: “Teste de sensibilidade antimicrobiana de bactérias isoladas de feridas cirúrgicas de pele em ovinos”. 2020. 2. IV Encontro Nacional de Patologia Clínica Veterinária – ENPC – Trabalho Apresentado: “Identificação de bactérias isoladas de feridas cirúrgicas de pele de ovinos”. 2020. 3. Encontro Internacional de Farmácia - Centro Universitário de Ourinhos - UNIFIO – 2020. Ouvinte. 4. Congresso Biotecnologia Brasil – Movimento Biotecnologia Brasil – 2020. Ouvinte. 5. Simpósio de Pesquisa e Extensão NuPE/Unifio - Centro Universitário de Ourinhos - UNIFIO – 2019. Ouvinte. 6. Workshop de Órgãos, Biomateriais e Engenharia de Tecidos – OBI – Trabalho apresentado: “Desenvolvimento de membranas de látex natural para liberação prolongada e aplicações na regeneração dérmica, reparo ósseo e periodontia”. 7. Congresso da Saúde - Centro Universitário de Ourinhos - UNIFIO – 2019. Ouvinte. 8. CONIC-SEMESP – 18º Congresso Nacional de Iniciação Científica. Orientação: “Avaliação Comparativa de Parâmetros Físico-Químicos de Comprimidos de hidroclorotiazida 25mg”. 9. XVII – Congresso de iniciação Científica - Centro Universitário de Ourinhos - UNIFIO – 2018. Comissão Científica de Avaliação. 10. XVI – Congresso de iniciação Científica - Centro Universitário de Ourinhos - UNIFIO – 2017. Comissão Científica de Avaliação. ORIENTAÇÃO DE TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO DE GRADUAÇÃO 1. Alison da Rosa Romano. Avaliação das características físico-químicas de especialidades de ibuprofeno disponíveis em farmácias comerciais. 2021. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Farmácia) – Centro Universitário de Ourinhos – UNIFIO. 2. Ana Barbara Silva Camargo. A importância de uma central de mistura intravenosa em um hospital. 2021. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Farmácia) – Centro Universitário de Ourinhos – UNIFIO. 3. Sthefani de Oliveira Gomes. Benefícios da aromaterapia na qualidade de vida, relacionados ao estresse, ansiedade e autoestima. 2021. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Farmácia) – Centro Universitário de Ourinhos – UNIFIO. 4. Leydiane Lima Leal. Análise da atividade antibacteriana de spray bucal fitoterápico. 2020. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Farmácia) – Centro Universitário de Ourinhos – UNIFIO. 5. Luiza De Assis Saad. Avaliação da composição de cápsulas de maleato de enalapril 10mg preparadas magistralmente. 2020. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Farmácia) – Centro Universitário de Ourinhos – UNIFIO. 6. Thais Aline De Azevedo. Avaliação do medicamento paracetamol em diferentes marcas de especialidades farmacêuticas. 2020. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Farmácia) – Centro Universitário de Ourinhos – UNIFIO. 7. Eloíse Cavalheiro Ovçar. Quantificação de teor de ativo do medicamento industrializado atenolol 25mg antes e após o vencimento. 2019. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Farmácia) – Centro Universitário de Ourinhos – UNIFIO. 8. Isabel Aparecida Gonçalves Mussato. Análise de cápsulas de captopril 25mg preparadas magistralmente. 2019. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Farmácia) – Centro Universitário de Ourinhos – UNIFIO. 9. Vinicius Liyossei Figueiredo Arakaki. Avaliação comparativa de parâmetros físico-químicos de comprimidos de hidroclorotiazida 25mg. 2018. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Farmácia) – Centro Universitário de Ourinhos – UNIFIO. 10. Patrícia Yukie Tao. Avaliação físico-química da qualidade de comprimidos contendo sinvastatina 20mg na forma genérica e similar de uma mesma marca comercial. 2018. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Farmácia) – Centro Universitário de Ourinhos – UNIFIO. PRODUÇÃO TÉCNICA • 09/2021 – Agência FAPESP – Ciência SP _ Membranas de látex para feridas _ Link: https://www.youtube.com/watch?v=-9YhJeEALAw • 09/2021 – UNESP – Faculdade de Ciências Farmacêuticas/Araraquara _ Membranas de látex com antibiótico são aplicadas em feridas de ovinos _ Link: https://www2.fcfar.unesp.br/#!/noticia/476/membranas-de-latex-para-feridas • 10/2021 - Entrevista TV Brasil _ Curativo brasileiro tem látex e antibióticos para cicatrização _ Link: https://tvbrasil.ebc.com.br/reporter-brasil/2021/10/curativo-brasileiro-tem- latex-e-antibioticos-para-cicatrizacao https://www.youtube.com/watch?v=-9YhJeEALAw https://www2.fcfar.unesp.br/#!/noticia/476/membranas-de-latex-para-feridas https://tvbrasil.ebc.com.br/reporter-brasil/2021/10/curativo-brasileiro-tem-latex-e-antibioticos-para-cicatrizacao https://tvbrasil.ebc.com.br/reporter-brasil/2021/10/curativo-brasileiro-tem-latex-e-antibioticos-para-cicatrizacao “Dedico este trabalho aos meus eternos amores, minha esposa Adriana e a meu filho Luís Antônio pelo apoio incondicional, pela nossa união e cumplicidade” AGRADECIMENTOS A minha esposa Adriana e ao meu filho Luís Antônio pela paciência, compreensão dos momentos ausentes e incentivo ao longo deste trabalho. Aos meus pais Jorge e Regina, meus irmãos Márcio e César, apesar de distantes, pelo apoio, conselho e orientações nas decisões de minha vida. À minha sogra Rose Mary e meu sogro Dante “in memoriam”, que continue olhando por nós como sempre fez. A todos meus familiares, cunhados, cunhadas, tios, tias, primos, primas que de alguma forma me apoiaram nesta tarefa. Ao meu orientador, Prof. Dr. Rondinelli Donizetti Herculano pelos anos de compartilhamento de conhecimento, pelas orientações, pela paciência e sapiência das minhas dificuldades, pelo conhecimento adquirido e pelo novo amigo. Ao amigo e coorientador Breno pela sua dedicação, ensinamentos e empenho no auxílio para o desenvolvimento prático e laboratorial deste estudo. As alunas, agora médicas veterinárias, Giovana, Lidiana e Luana por todo trabalho, tempo e dedicação durante o manuseio dos animais e as práticas laboratoriais, Aos colegas do grupo de Biomateriais, liderado pelo brilhante “Rondi”, sempre dispostos a ajudarem, sem questionamentos, uma perfeita equipe. A coorientadora Isabela pelo aceite na colaboração deste trabalho. À Profª. Cristiane, pois sem seu apoio não realizaria este feito, obrigado. À CAPES e a FAPESP por participarem deste projeto. Enfim, a todos que de alguma forma contribuíram de alguma forma para realização deste trabalho EPÍGRAFE “Aprenda o máximo que puder com aqueles que sabem mais do que você, que fazem melhor do que você, que veem mais claramente do que você” (Dwight Eisenhower) GEMEINDER, José Lúcio Pádua. Avaliação da eficácia da biomembrana de látex natural incorporada com gentamicina na cicatrização de feridas experimentais em ovinos. 2022. 113f. Tese (Doutorado em Biotecnologia). – Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista, Araraquara, 2022. RESUMO A antibioticoterapia visa reduzir ou eliminar o número de microrganismos presentes na ferida. Os sistemas de liberação de fármacos, como os transdérmicos, são fundamentais para promoção de ações terapêuticas, onde é possível controlar a liberação dos fármacos por um longo período. O látex extraído da seringueira Hevea brasiliensis, um polímero natural, destaca-se por suas propriedades físicas e pela produção de biomembranas. Acerca disto, o objetivo deste estudo visou avaliar diferentes tratamentos de feridas induzidas em ovinos utilizando biomembrana de látex com e sem gentamicina quanto a melhora da cicatrização e redução da carga bacteriana, correlacionando a carga bacteriana e cicatrização, e verificar possíveis alterações dos marcadores bioquímicos de lesão hepatocelular e função renal causadas pelas biomembranas. Para isso, 10 ovinos receberam três ferimentos no hemitórax esquerdo e direito, os quais ficaram expostos por 24 h, a fim de promover contaminação microbiana. Após isso, os animais receberam tratamento, de forma aleatória (randomizada), com cobertura de biomembrana sem e com gentamicina ou não receberam cobertura alguma (grupo controle). Foi realizado a microscopia de força atômica nas biomembranas. As feridas foram avaliadas morfometricamente e quanto a carga bacteriana total, e além disso, foi testada a sensibilidade a diferentes antimicrobianos e às próprias biomembranas. Foi realizada avaliação hematológica e bioquímica para verificar alterações renais e hepáticas. Foi verificado o processo cicatricial por análises histológicas nos momentos dia zero (M0), dia treze (M13) e dia vinte e cinco (M25). As diferenças entre os tratamentos foram verificadas pelo teste de ANOVA com pós-teste de Tukey ou Friedman com pós-teste de Dunn, e as correlações foram realizadas pelos coeficientes de Pearson ou Spearman. Observou- se uma superfície uniforme com presença de grânulos nas biomembranas sem fármaco e nas incorporadas a dispersão homogênea do fármaco, não alterando a estrutura da superfície. As biomembranas com ou sem associação do antibiótico não aceleraram o processo de cicatrização de feridas cutâneas em ovinos. O tamanho das feridas tratadas reduziu em 40% em 7 dias e o fechamento total ocorreu em 25 dias. Os testes hematológicos e bioquímicos não apresentaram alterações relevantes, nem renais e hepáticas. Não houve correlação entre o tamanho da ferida e a carga bacteriana. Das 121 colônias isoladas, as mais frequentes foram Staphylococcus coagulase negativa (50,41%). A biomembrana de látex com gentamicina promoveu redução da carga bacteriana sem indução de resistência antimicrobiana. Observou- se aumento da inflamação no M13 da ferida controle e no M13 e M25 dos tratamentos com a biomembrana de látex e de látex incorporado com gentamicina. A biomembrana incorporada com o antimicrobiano promoveu melhor aparência macroscópica da cicatrização sem evidência de cicatrizes hipertróficas e queloides. Palavras-chave: Biomembrana de látex natural. Liberação sustentada. Atividade antimicrobiana. Biomaterial. Liberação de Fármaco. GEMEINDER, José Lúcio Pádua. Evaluation of effectiveness of natural latex biomembranes incorporated to gentamicin in the healing of experimental wounds in ovine 2022. 113f. Tese (Doutorado em Biotecnologia). – Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista, Araraquara, 2022. ABSTRACT The antibiotic therapy aims to reduce or eliminate the number of microorganisms living in the wound. The releasing system of drugs, like transdermal ones, are fundamental for the promotion of therapeutical actions, which make it possible to control the release of drugs for a long period. The latex extract from the rubber tree Hevea brasiliensis, a natural polymer, stands out for its physical features and for the production of biomembranes. Hereof, the objective of this study aims to evaluate different treatments of experimental wounds in ovine using latex biomembranes with or without gentamicin in relation to the improvement of healing and reduction of the of bacteria, correlating to the load of bacteria and wound healing, checking possible alterations of the biochemistry markers of hepatocellular injuries and renal functions caused by the biomembranes. To this end, 10 ovine received three wounds in their left and right hemithorax, which were exposed for 24 hours, aiming to promote macrobiotics contamination. After that, the animals received treatment, in a random way, with the coverage of the biomembrane with or without the gentamicin or didn’t receive any coverage (control group). Atomic force microscopy was conducted in the biomembranas. The wounds were evaluated morphometrically in relation to the total load of bacteria, and besides that, the sensibility was tested to different antimicrobials and to the biomembranes themselves. Hematologic and biochemistry evaluation was made in order to check renal and liver changes. The healing process was verified through histological analyses in the moments day zero(M0), day thirteenth (M13) and day twenty-fifth(M25). The differences between the treatments were verified by the ANOVA test with post-test of Tukey or Friedman with post-test of Dunn, and the correlations were made by the coefficients of Pearson or Spearman. An even surface containing granules was seen in the biomembranes without drugs and in the incorporated ones a homogeneous dispersion of the drugs was observed, which didn’t change the aspect of the surface. The biomambranes with or without the association of the antibiotics didn’t accelerate the healing process of skin wounds in ovine. The size of the wounds treated was reduced by 40% in 7 days and the total healing of the wounds happened in 25 days. The hematological and biochemical tests didn’t show significant changes, neither renal nor hepatic. There wasn’t correlation between the size of the wound and the bacterial load. From the 121 isolated colonies, the more frequent ones were Staphylococcus with negative coagulases (50,41%). The latex biomembrane with gentamicin promoted the reduction of the bacterial load without the induction of antimicrobial resistance. It was observed an increase in the inflammation in M13 of the wound control and in M13 and M25 of the treatments using the latex biomembrane and with latex incorporated to gentamicin. The incorporated biomembrane with antimicrobials promoted better macroscopic aspect of the healing with no evidence of hypertrophic scars or keloids. Keywords: Natural Latex Biomembrane. Sustained Release. Antimicrobial Activity. Biomaterial. Drugs Releasing. LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Representação de sistemas de entrega transdérmica de fármacos......... 24 Figura 2 - Esquema do processo de cicatrização de feridas com células envolvidas em cada fase............................................................................................. 26 Figura 3 - a) Estrutura do sulfato de gentamicina; b) Estruturas que se diferem na posição 5’ e 6’ no anel I.............................................................................. 27 Figura 4 - Implante de biomembrana de látex – Angiogênese: a) Controle, b) Tratamento................................................................................................ 29 Figura 5 - Ovinos: a) Aprisco individual; b) Roupa protetora..................................... 33 Figura 6 - Partícula de borracha de látex natural....................................................... 35 Figura 7 - Processo de confecção das biomembranas de látex por casting: a) Materiais utilizados na produção da biomembrana; b) Látex, c) Mistura látex com a gentamicina, d) Deposição do látex nos moldes, e) Secagem da biomembrana, f) Biomembrana seca.................................................... 36 Figura 8 - Funcionamento da técnica de AFM: a) Esquema do sistema de microscopia de força atômica, b) Topografia de “blend” látex natural com nanotubos de carbono............................................................................... 37 Figura 9 - Confecção das feridas: a) Esquema para indução das feridas; b) Marcação para indução das feridas........................................................... 38 Figura 10 - a) Punch 30 mm utilizado para confecção das feridas cirúrgicas dos ovinos; b) Remoção do tampão de pele..................................................... 39 Figura 11 - Demonstração das feridas induzidas cirurgicamente em um dos ovinos selecionados para o experimento recebendo tratamento na seguinte sequência sorteada, da esquerda para direita: biomembrana de látex, controle, biomembrana de látex com gentamicina..................................... 40 Figura 12 - As feridas cirúrgicas foram confeccionadas utilizando punch de fabricação própria medindo 30 mm de diâmetro no hemitórax direto na região do gradil costal do ovino. Decorridas 24 h abertas, as feridas receberam, da esquerda para direita, cobertura com biomembrana de látex, cobertura com biomembrana de látex com gentamicina e não recebeu cobertura alguma (controle). As feridas foram limpas e as biomembranas foram trocadas a cada 72h................................................ 41 Figura 13 - Procedimento de coleta dos swabs para análise microbiológica nas feridas do gradil costal direito, padronizado por 10 passagens pela ferida, sempre rotacionando, sendo realizada sempre pelo mesmo indivíduo.................................................................................................... 43 Figura 14 - Após preparação do inóculo bacteriano a partir do swab das feridas, exatos 10 µL foram semeados em placas de Petri com Ágar Sangue e Ágar MacConkey para isolamento e determinação do número de unidades formadoras de colônias por mililitro (UFC/mL) de inóculo.......... 46 Figura 15 - Antibiograma após isolamento e identificação bacteriana......................... 47 Figura 16 - Imagens de AFM biomembrana de látex puro: a) Imagem 2D (256 pixels); b) Imagem 3D (512 pixels)............................................................. 50 Figura 17 - Imagens de AFM biomembrana de látex + gentamicina: a) Imagem 2D (256 pixels); b) Imagem 3D (512 pixels)..................................................... 50 Figura 18 - Relação dos diâmetros horizontal (H) e vertical (V) determinados por paquímetro digital em feridas de pele de ovinos (n=10) sem tratamento algum (Controle) ou cobertas com biomembrana de látex (L) e biomembrana de látex com gentamicina (L+G) 24 h após a realização (M0) e aos 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22 e 25 dias. Os valores são expressos em porcentagem em relação ao M0. As barras indicam valores mínimos e máximos e o quadro representa o primeiro e terceiro quartis e a diferença estatisticamente significante é indicada por * (p<0,05), ** (p<0,01), *** (p<0,001) ou **** (p<0,0001) ................................................ 52 Figura 19 - Áreas determinadas por software digital (ImageJ®) de feridas de pele de ovinos (n=10) sem tratamento algum (Controle) ou cobertas com biomembrana de látex (L) e biomembrana de látex com gentamicina (L+G) 24 h após a realização (M0) e aos 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22 e 25 dias. Os valores são expressos em porcentagem em relação ao M0. As barras indicam valores mínimos e máximos e o quadro representa o primeiro e terceiro quartis e a diferença estatisticamente significante é indicada por * (p<0,05), ** (p<0,01), *** (p<0,001) ou **** (p<0,0001) ....... 53 Figura 20 - Tamanho das feridas determinado por paquímetro digital (A) ou por software digital (ImageJ®, B) de feridas de pele de ovinos (n=10) sem tratamento algum (Controle) ou cobertas com biomembrana de látex (L) e biomembrana de látex com gentamicina (L+G) 24 h após a realização (M0) e aos 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22 e 25 dias. Os valores são expressos em porcentagem em relação ao M0. Os gráficos são expressos por média e desvio-padrão e a diferença estatisticamente significante é indicada por * (p<0,05), ** (p<0,01), *** (p<0,001) ou **** (p<0,0001) ....... 54 Figura 21 - Hemácias (A), hemoglobina (B), volume globular (VG, C) volume corpuscular médio (VCM, D) e concentração hemoglobínica corpuscular média (CHCM, E) em ovinos saudáveis (n=10) antes (M0) e 7 (M7), 13 (M13), 19 (M19) e 25 (M25) dias após realização de ferida cirúrgica e tratamento com biomembrana de látex com e sem incorporação de gentamicina. As barras indicam valores médios e desvios-padrão e a diferença estatisticamente significante em relação a M0 é indicada por * (p<0,05), ** (p<0,01), *** (p<0,001) ou **** (p<0,0001). A linha tracejada indica os valores de referência para a espécie ovina segundo (Wood e Quiroz-Rocha (2010) ................................................................................ 58 Figura 22 - Leucócitos totais (A), neutrófilos segmentados (B), linfócitos (C), monócitos (D), eosinófilos (E) e basófilos (F) em ovinos saudáveis (n=10) antes (M0) e 7 (M7), 13 (M13), 19 (M19) e 25 (M25) dias após realização de ferida cirúrgica e tratamento com biomembrana de látex com e sem incorporação de gentamicina. As barras indicam valores médios e desvios-padrão e a diferença estatisticamente significante em relação a M0 é indicada por * (p<0,05), ** (p<0,01), *** (p<0,001) ou **** (p<0,0001). A linha tracejada indica os valores de referência para a espécie ovina segundo (Wood e Quiroz-Rocha (2010) ............................. 59 Figura 23 - Plaquetas (A), proteína plasmática total (PPT, B) e fibrinogênio plasmático (FP, C) em ovinos saudáveis (n=10) antes (M0) e 7 (M7), 13 (M13), 19 (M19) e 25 (M25) dias após realização de ferida cirúrgica e tratamento com biomembrana de látex com e sem incorporação de gentamicina. As barras indicam valores médios e desvios-padrão e a diferença estatisticamente significante em relação a M0 é indicada por * (p<0,05), ** (p<0,01), *** (p<0,001) ou **** (p<0,0001). A linha tracejada indica os valores de referência para a espécie ovina segundo (Wood e Quiroz-Rocha (2010) ................................................................................ 60 Figura 24 - Albumina (A), alanina aminotransferase (ALT, B), aspartato aminotransferase (AST, C), cálcio (D), creatinina (E), colesterol total (F), fósforo (G), gama glutamiltransferase (GGT, H), glicose (I), globulina (K), proteína total (L), triglicerídeos (M) e ureia (N) em ovinos saudáveis (n=10) antes (M0) e 7 (M7), 13 (M13), 19 (M19) e 25 (M25) dias após realização de ferida cirúrgica e tratamento com biomembrana de látex com e sem incorporação de gentamicina. As barras indicam valores médios e desvios-padrão e a diferença estatisticamente significante em relação a M0 é indicada por * (p<0,05), ** (p<0,01), *** (p<0,001) ou **** (p<0,0001). A linha tracejada indica os valores de referência para a espécie ovina segundo Kaneko et al. (2008) ............................................ 61 Figura 25 - Carga bacteriana determinada pelo número de unidades formadoras de colônia (UFC) das feridas de pele de ovinos (n=10) sem tratamento algum (Controle, C) ou cobertas com biomembrana de látex (L) e biomembrana de látex com gentamicina (L+G) 24 h após a realização (M0) e aos 7, 13 e 19 dias de tratamento. Os gráficos são expressos por média e desvio-padrão e a diferença estatisticamente significante é indicada por * (p<0,05), ** (p<0,01), *** (p<0,001) ou **** (p<0,0001) ....... 66 Figura 26 - Carga bacteriana determinada pelo número de unidades formadoras de colônia (UFC) das feridas de pele de ovinos (n=10) sem tratamento algum (Controle, C) ou cobertas com biomembrana de látex (L) e biomembrana de látex com gentamicina (L+G) 24 h após a realização (M0) e aos 7, 13 e 19 dias de tratamento................................................... 67 Figura 27 - Infiltrado inflamatório crônico presente em menos de 25% do campo (HE - 40x). Seta preta grossa: Vasos sanguíneos. Seta preta fina: Fibroblastos. Seta vermelha fina: célula mononuclear.............................. 76 Figura 28 - Infiltrado inflamatório crônico presente de 25-50% do campo (HE - 40x). Seta preta grossa: Vasos sanguíneos. Seta vermelha fina: célula mononuclear............................................................................................. 76 Figura 29 - Infiltrado inflamatório agudo presente em mais de 50% do campo (HE 40x). Seta vermelha fina: célula polimorfonuclear..................................... 77 Figura 30 - Infiltrado inflamatório crônico presente em mais de 50% do campo (HE 40x) .......................................................................................................... 77 Figura 31 Avaliação do processo cicatricial nos diferentes tratamentos realizados das feridas de pele de ovinos (n=10) sem tratamento algum (Controle, C) ou cobertas com biomembrana de látex (L) e biomembrana de látex com gentamicina (L+G) 13 e 25 dias de tratamento. Os gráficos são expressos por média e desvio-padrão e a diferença estatisticamente significante é indicada por * (p<0,05), ** (p<0,01), *** (p<0,001) ou **** (p<0,0001) ................................................................................................ 78 Figura 32 Avaliação da inflamação nos diferentes tratamentos realizados das feridas de pele de ovinos (n=10) sem tratamento algum (Controle, C) ou cobertas com biomembrana de látex (L) e biomembrana de látex com gentamicina (L+G) sob efeito do tempo. Os gráficos são expressos por média e desvio-padrão e a diferença estatisticamente significante é indicada por * (p<0,05), ** (p<0,01), *** (p<0,001) ou **** (p<0,0001) ....... 79 Figura 33 Avaliação da angiogênese nos diferentes tratamentos realizados das feridas de pele de ovinos (n=10) sem tratamento algum (Controle, C) ou cobertas com biomembrana de látex (L) e biomembrana de látex com gentamicina (L+G) sob efeito do tempo. Os gráficos são expressos por média e desvio-padrão e a diferença estatisticamente significante é indicada por * (p<0,05), ** (p<0,01), *** (p<0,001) ou **** (p<0,0001) ....... 80 Figura 34 Avaliação do número de fibroblastos nos diferentes tratamentos realizados das feridas de pele de ovinos (n=10) sem tratamento algum (Controle, C) ou cobertas com biomembrana de látex (L) e biomembrana de látex com gentamicina (L+G) sob efeito do tempo. Os gráficos são expressos por média e desvio-padrão e a diferença estatisticamente significante é indicada por * (p<0,05), ** (p<0,01), *** (p<0,001) ou **** (p<0,0001) ................................................................................................ 81 LISTA DE TABELAS Tabela 1 Dados hematológicos e bioquímicos (média e desvio-padrão) dos ovinos selecionados para inclusão no estudo (n=10) .......................................... 34 Tabela 2 Esquema para coleta das amostras para avaliação hematológica, bioquímica, microbiológica e histopatológica, além de avaliação da cicatrização nos ovinos submetidos à procedimento cirúrgico para indução de feridas de pele medindo 30 mm de diâmetro........................... 42 Tabela 3 Grupos de bactérias isoladas das feridas de pele de ovinos (n=10) sem tratamento algum (Controle, C) ou cobertas com biomembrana de látex (L) e biomembrana de látex com gentamicina (L+G) 24 h após a realização (M0) e aos 13 e 19 dias de tratamento...................................... 69 Tabela 4 Perfil do teste de sensibilidade antimicrobiana (média) de bactérias isoladas das feridas de pele de ovinos (n=10) sem tratamento algum (Controle) ou cobertas com biomembrana de látex (Látex) e biomembrana de látex com gentamicina (Látex + Gentamicina) 24 h após a realização (M0) e aos 13 e 19 dias de tratamento.......................... 70 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 23 2. OBJETIVOS ............................................................................................................... 32 2.1 Objetivo Geral ..................................................................................................... 32 2.2 Objetivos Específicos .......................................................................................... 32 3. MATERIAL E MÉTODOS .......................................................................................... 33 3.1 Comitê de ética ................................................................................................... 33 3.2 Seleção dos animais ........................................................................................... 33 3.3 Confecção das biomembranas ............................................................................ 34 3.4 Microscopia de força atômica – AFM .................................................................... 37 3.5 Protocolo de indução de tratamento das feridas ................................................... 38 3.6 Coleta das amostras ........................................................................................... 42 3.7 Avaliação da cicatrização .................................................................................... 43 3.7.1 Morfometria .................................................................................................. 43 3.8 Avaliação dos parâmetros hematológicos e bioquímicos ..................................... 44 3.9 Identificação bacteriana ....................................................................................... 45 3.10 Teste de sensibilidade antimicrobiana ............................................................... 46 3.11 Avaliação histopatológica .................................................................................. 47 3.12 Análise estatística .............................................................................................. 48 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................. 49 4.1 Microscopia de força atômica – AFM .................................................................. 49 4.2 Avaliação da cicatrização .................................................................................... 51 4.3 Avaliação dos parâmetros hematológicos e bioquímicos ................................... 57 4.4 Carga bacteriana das feridas .............................................................................. 65 4.5 Identificação bacteriana e teste de sensibilidade antimicrobiana ....................... 69 4.6 Avaliação histopatológica .................................................................................... 75 5. CONCLUSÃO ............................................................................................................ 83 6. REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 84 Apêndice 1 - Gentamicin encapsulated within a biopolymer for the treatment of Staphylococcus aureus and Escherichia coli infected skin ulcers ……............................ 93 Anexo A - Parecer Do Comitê De Ética No Uso De Animais (CEUA) .............................. 113 23 1. INTRODUÇÃO A aplicação de antibióticos tópicos em um sistema de absorção percutânea originou-se em 1965, sendo um processo adotado por Stoughton (ALLEN JR; POPOVICH; ANSEL, 2013). O emprego da terapia antimicrobiana tópica é comumente utilizado em feridas procedentes ou não de procedimentos cirúrgicos e tratamentos crônicos (LINEAWEAVER et al., 1984) na finalidade de reduzir, eliminar (FOSSUM, 2013) e prevenir contaminação bacteriana (GERONEMUS; MERTZ; EAGLSTEIN, 1979). Ademais, a carga bacteriana presente no sítio da ferida pode ser considerada não somente um risco de infecção, mas também um fator de retardo cicatricial, má formação do tecido de granulação, exsudação excessiva e presença de dor (KRAHWINKEL; BOOTHE, 2006). A classe dos aminoglicosídeos são bactericidas e agem contra microrganismos Gram-negativos aeróbicos, comumente encontrados em lesões expostas e são aplicados para prevenir infecções por estes (GARNER et al., 2020). A antibioticoterapia pretende reduzir ou eliminar o número de microrganismos presentes na ferida, sendo que no tratamento de feridas abertas, a antibioticoterapia tópica é preferível à sistêmica (WELCH FOSSUM, 2013), na medida em que a aplicação tópica propicia maiores concentrações de antibiótico na ferida independentemente da circulação sanguínea local (KRAHWINKEL; BOOTHE, 2006). Além dos riscos da infecção, a presença de microrganismos atrasa a cicatrização dos tecidos, ocasionando em má formação do tecido de granulação, exsudação excessiva e aumento da dor (KRAHWINKEL; BOOTHE, 2006). O sistema de liberação do princípio ativo da forma farmacêutica, seja ela líquida ou sólida, é a principal etapa do desenvolvimento de um medicamento, pois o foco principal é conseguir com que o agente terapêutico chegue ao local específico com níveis de concentração suficiente para desenvolver o efeito terapêutico desejado (HERCULANO et al., 2009). Para uma melhor compreensão, quando é administrado um medicamento por via oral ele percorrer todo o trajeto do trato gastrointestinal para ser absorvido e chegar na corrente sanguínea para alcançar a região-alvo necessária para o efeito terapêutico. Nos últimos anos os materiais poliméricos tem se sobressaído no 24 desenvolvimento de matrizes para liberação controlada de fármacos (HERCULANO; BRUNELLO; GRAEFF, 2007). O desenvolvimento de um novo sistema de liberação de fármacos é fundamental na promoção das ações terapêuticas, contudo isto só é possível à medida que novas tecnologias são desenvolvidas, de forma a reduzir as limitações existentes nas terapias existentes (ALLEN JR; POPOVICH; ANSEL, 2013). Um método interessante para o transporte de fármacos são as formulações transdérmicas, que facilitam a passagem do fármaco através da pele, com a finalidade de atingir a circulação sanguínea e que representa uma alternativa em relação às propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas dos fármacos (SILVA et al., 2010). Os polímeros são o principal suporte para o desenvolvimento de um sistema transdérmico para entrega de medicamentos, os quais funcionam como reservatório de fármacos ou formadores de matriz (Figura 1) (KANDAVILLI; NAIR; PANCHAGNULA, 2002). Figura 1: Representação de sistemas de entrega transdérmica de fármacos. Fonte: Adaptado de Kandavilli; Nair; Panchagnula, 2002. A entrega transdérmica de fármacos podem ocorrer por diferentes sistemas, entre os quais, temos os sistemas reservatórios onde o fármaco encontra-se entre uma camada de suporte impermeável e uma membrana polimérica que controla a taxa de liberação, ou os fármacos podem estar dispersos em polímeros adesivos nos sistemas matriciais, e nos sistemas de dispersão-matriz, no qual o fármaco é disperso em uma matriz polimérica hidrofílica ou lipofílica, e os sistemas de micro reservatório que combina sistemas de reservatórios e dispersão em matriz (KANDAVILLI; NAIR; PANCHAGNULA, 2002). Dentre estas aplicações, destacam-se o uso nas cicatrizações de feridas, que pode ocorrer por primeira intenção (as bordas das feridas estão justapostas sendo Sistema Reservatório Sistema Dispersão/Matriz Sistema Micro reservatório Sistema Adesivo Suporte Controle liberação Camada adesiva Reservatório Camada liberação Base oclusiva 25 possível uni-las), por segunda intenção (as bordas não estão próximas, não sendo possível a união e a ferida cicatriza-se de forma aberta) ou de terceira intenção (corrigidas cirurgicamente após formação de tecido de granulação) (MARIA DE FÁTIMA; ANDRADE; MORIYA, 2008). O processo dinâmico para restauração da estrutura lesionada ocorre imediatamente com a liberação de grânulos de plaquetas, contendo citocinas e fatores de crescimento que permitem o recrutamento de células inflamatórias para o sítio da lesão (GURTNER et al., 2008; VELNAR; BAILEY; SMRKOLJ, 2009). O processo de cicatrização de uma ferida não pode ocorrer sem a formação de novos vasos sanguíneos, processo denominado de angiogênese (DVORAK et al., 1995; SINGER; CLARK, 1999). A atividade angiogênica é fundamental para os organismos vivos em processos como o crescimento de órgãos, reprodução e reparação de feridas. Caracteriza-se pela formação de novos vasos sanguíneos a partir da vascularização pré-existente, envolvendo a proliferação, migração, regulação e diferenciação das células vasculares durante o processo de cicatrização, benéfica na recuperação de lesões, tais como acidente vascular cerebral isquêmico, quando bem regulada (MELO-REIS et al., 2010). Dessa forma, a sequência do processo cicatricial inicia-se com o desbridamento local (fase inflamatória), formação de tecido de granulação e angiogênese, seguido de proliferação de fibroblastos, formação de matriz extracelular e colágeno, reepitelização e remodelamento tecidual (GURTNER et al., 2008; VELNAR; BAILEY; SMRKOLJ, 2009). A Figura 2, representa o esquema do processo de cicatrização de feridas sem infecção, o que compreende a fase de hemostasia, onde ocorre a formação do coágulo sanguíneo evitando o sangramento e a contaminação microbiana. Posteriormente ocorre a fase inflamatória responsável pela liberação de plaquetas e queratinócitos, além de fatores de crescimento e citocinas precursores da formação de novos vasos. Na fase da proliferação ocorre a chegada das células epiteliais, na borda da ferida, em conjunto com a angiogênese e a produção de colágeno pelos fibroblastos, formando assim uma nova matriz extracelular. Desta forma a lesão é regenerada de forma contínua, onde os fibroblastos se diferenciam em miofibroblastos, os quais apresentam um maior efeito contrátil favorecendo o fechamento da lesão (KARPPINEN et al., 2019; PEREIRA et al., 2019). 26 Figura 2: Esquema do processo de cicatrização de feridas com células envolvidas em cada fase. Fonte: Adaptado de Tottoli et al., 2020. O processo de cicatrização das feridas provenientes de traumatismos e cirurgias, também chamadas de feridas agudas, segue as etapas normais do processo cicatricial de forma previsível e organizada. As feridas classificadas como crônicas, como as úlceras de pressão, vasculares e diabéticas, se caracterizam pela reparação tecidual de forma desordenada devido a etapa de inflamação persistente, aparecimento de microrganismos e formação de biofilme (TOTTOLI et al., 2020). As feridas crônicas geralmente são infectadas por Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa e Escherichia coli, o que pode interferir no processo cicatricial. Uma vez instalada a infecção, os microrganismos podem chegar à corrente sanguínea e/ou levar a formação de biofilme, uma matriz rica em nutriente que protege os microrganismos aumentando sua proliferação e deixando-os mais resistentes aos tratamentos (GARMS et al., 2019; TOTTOLI et al., 2020). Existem uma série de antibióticos comumente empregados para o tratamento de infecções dérmicas, tais como: ciprofloxacina, metronidazol, moxifloxacina, gentamicina, etc. O sulfato de gentamicina (C21H43O7) é um complexo de aminoglicosídeo congêneres com as principais estruturas C1, C1a, C2, C2a e C2b, produzido por fermentação de Micromonospora purpurea ou M. echinospora, utilizado como o sal de sulfato (Figura 3) (FRIESEN et al., 2018; GEMEINDER et al., 2021). Queratinócitos Plaquetas Fibroblastos Micrófagos Neutrófilos A - H E M O S T A S IA B - I N F L A M A Ç Ã O C - P R O L IF E R A Ç Ã O D - R E M O D E L A Ç Ã O Microfibroblastos s Micrófagos 27 Figura 3: a) Estrutura do sulfato de gentamicina; b) Estruturas que se diferem na posição 5’ e 6’ no anel I. Fonte: Adaptado de O’Sullivan et al., 2020. Trata-se de um antibiótico de largo espectro e que apresenta sua ação por inibir o crescimento de uma vasta variedade de microrganismos Gram-positivos e Gram- negativos, incluindo espécies resistentes à tetraciclina, cloranfenicol, canamicina, e colistina, especialmente as Pseudomonas spp., Proteus spp., Staphylococcus spp. e Streptococcus spp. (KORZYBSKI; KOWSZYK-GINDIFER; KURYLOWICZ, 2013). Os aminoglicosídeos apresentam características bactericida, são melhor absorvidos com a pele lesionada, queimada ou em processo de cicatrização, e mesmo com a descobertas de novas classes de antimicrobianos, seu uso persiste devido a frequentes problemas de resistência bacteriana (FERNANDES et al., 2009) O mecanismo de ação do fármaco ocorre na inibição da síntese protéica bacteriana por ligação à subunidade ribossomal 30S, levando à leitura incorreta do RNA mensageiro, ocasionando a morte celular (AMSTERDAM, 2015). A gentamicina pode ser aplicada topicamente para tratamento de infecções locais, como impetigo contagioso, dermatite eczematosa e dermatite seborreica, e infecções oculares superficiais (conjuntivites, ceratites, ceratoconjuntivites, úlceras na córnea, blefaroconjuntivites) (BRASIL, 2017). Como desvantagem, o sulfato de gentamicina, quando utilizado em altas concentrações e por um longo período de tempo, promove sérios problemas de toxicidade (nefrotoxicidade e ototoxicidade) (OLIVEIRA; CIPULLO; BURDMANN, 2006). As drogas nefrotóxicas levam a um desequilíbrio dos mecanismos fisiológicos da filtração glomerular e tubular, ocasionando o aumento dos níveis de creatinina sérica (MARTINEZ et al., 2006). a) b) 28 A otoxicidade se dá pelo acúmulo do fármaco na endolinfa e perilinfa do ouvido interno e consequentemente leva à perda de audição (GARDNER et al., 2016). Ademais, outros órgãos também parecem ser afetados, como o fígado, induzindo ao aumento da atividade sérica das enzimas hepáticas, além de ocorrer infiltração leucocitária, congestão e necrose hepáticas (GARDNER et al., 2016; NAJAFI et al., 2017). Todos esses efeitos adversos parecem ser reduzidos quando a gentamicina é aplicada topicamente, reduzindo a absorção sistêmica da mesma (WANG et al., 2019). Todavia, seu uso se faz importante pelo amplo espectro de ação diante das bactérias Gram-negativas, além do baixo custo em relação a outras classes de antimicrobianos de igual efetividade (ALMEIDA; WAGNER, 2014). A incorporação de antibióticos em dispositivos para liberação controlada tem se tornado uma prática comum no meio médico, pois proporcionam uma elevada concentração do fármaco no local infectado, sem que haja toxicidade sistêmica (FERNANDES et al., 2009). Os biopolímeros naturais têm sido uma alternativa interessante como suporte para liberação controlada, tais como a quitosana, alginato, celulose e o látex natural. O látex natural utilizado é extraído da seringueira Hevea brasiliensis, uma árvore extensivamente cultivada no sudeste da Ásia, no entanto é nativa da bacia do rio Amazonas, no Brasil (GEMEINDER et al., 2021). Este suporte tem se mostrado promissor em aplicações biomédicas, onde pesquisas demonstraram que o látex natural é um material biocompatível com inúmeras aplicações (FRADE et al., 2001; HERCULANO et al., 2010). O biomaterial apresenta alta resistência mecânica e baixo custo. Outros estudos evidenciaram que o látex possui a propriedade de acelerar a angiogênese e que algumas moléculas angiogênicas, como fatores de crescimento, são conhecidos por estimular a proliferação celular (Figura 4) (ALVES, 2010; FERREIRA et al., 2009). 29 Figura 4: Implante de biomembrana de látex – Angiogênese: a) Controle, b) Tratamento. Fonte: (FERREIRA et al., 2009). A utilização do látex com o intuito de cicatrização já foi descrito em humanos em feridas de pacientes diabéticos (NUNES et al., 2016), úlceras venosas crônicas (FRADE et al., 2012), feridas e queimaduras (SILVA; ALENCAR, 2017) e em animais avaliando-se a reparação tecidual de bovinos (ZIMMERMANN et al., 2018), de coelhos em transplante conjuntival (PINHO et al., 2018), em estômago (FERREIRA et al., 2014) e feridas cutâneas (ROSA, 2016); em ratos em lesão térmica corporal por escaldamento (BOLINA-MATOS et al., 2013), neoformação tecidual (ANDRADE, 2007), lesões cutâneas agudas (BOLINA-MATOS et al., 2013), regeneração de ossos longos (CARLOS et al., 2019) e em cães em herniorrafia diafragmática (ZIMMERMANN et al., 2008). Contudo, apesar de seu potencial cicatricial, a biomembrana de látex não apresenta atividade antimicrobiana quando não impregnada a uma substância com essa finalidade (GARMS et al., 2017). Yonashiro Marcelino et al. (2018), ao analisarem biomembranas incorporadas com o antifúngico fluconazol observaram em ensaios in vitro a liberação do fármaco pela biomembrana por 48 h. Em ensaios baseados na metodologia de difusão em disco e diluição em caldo, verificaram de forma positiva a susceptibilidade do microrganismo Candida albicans frente a biomembrana com o fármaco em concentrações de 25 µg e 50 µg, sugerindo seu uso como curativo dermatológico. Outro estudo com antifúngico incorporado ao látex natural foi apresentado por Silva et al. (2020), no qual o fármaco utilizado foi o voriconazol. Dentre os ensaios realizados neste estudo, relataram que a biomembrana liberou 13,23% do fármaco em 1 hora e 24,20% durante 48 horas, o que demonstra a liberação sustentada e em testes de macrodiluição a biomembrana incorporado com o voriconazol apresentaram a) b) 30 valores de concentração inibitória mínima (CIM) de 4,37 µg. mL-1 frente ao microrganismo Candida parapsilosis. Tanaka et al. (2021), incorporaram sulfadiazina de prata ao látex natural com o escopo de desenvolver um curativo dérmico para o tratamento de queimaduras infectadas com Candida ssp. . Em suas análises observaram que a biomembrana produzida com o fármaco liberou a 32,4% da sulfadiazina de prata ao longo de 192 horas e no ensaio de macrodiluição o curativo desenvolvido inibiu o crescimento dos microrganismos Candida albicans e Candida parapsilosis em concentrações de 75,0 e 37,5 µg. mL-1. Em ensaios realizados em biomembranas de látex contendo o fármaco metronidazol incorporado, observou-se a entrega do fármaco, em ensaios in vitro, de 10,63mg (53,15%) por 29,9 horas e ainda quando o metronidazol foi incorporado ao látex, não houve interação química conforme resultados dos testes em espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) (HERCULANO et al., 2011). Garms et al. (2017), apresentaram resultados satisfatórios ao analisarem biomembranas de látex incorporadas com ciprofloxacino, um antimicrobiano efetivo aos microrganismos Gram-positivos e Gram-negativos. Nos ensaios realizados parametrizados com a metodologia de diluição em caldo, os resultados revelaram inibição bacteriana completa da biomembrana com o fármaco frente ao fungo Burkholderia lata. Apesar de recentemente alguns trabalhos mostrarem a incorporação de antimicrobianos e antifúngicos nas biomembranas de látex, até o momento, não existem estudos avaliando o efeito da biomembrana de látex na cicatrização de feridas em ovinos, nem mesmo estudos avaliando sua toxicidade por meio da avaliação das alterações laboratoriais e dos parâmetros clínicos e padrão microbiológico decorrentes do uso da biomembrana de látex impregnada com gentamicina. Em estudos com outras espécies, Fernandes et al. (2009) descreveram o uso de quitosana como dispositivo de liberação controlada de gentamicina e avaliaram in vitro a resistência de Staphylococcus aureus (S. aureus), Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) e Klebsiella pneumoniae, tendo um crescimento bacteriano inibitório satisfatório. Já Gemeinder et al., (2021), ao avaliar as bactérias S. aureus e Escherichia coli (E. coli), observaram que a biomembrana de látex natural puro induziu halo inibitório de crescimento bacteriano para o S. aureus e não apresentou ação antimicrobiana 31 para E. coli, enquanto a mesma biomembrana incorporada com gentamicina desencadeou halos de inibição maiores que as referências em ambos os microrganismos testados. 32 2. OBJETIVOS 2.1 Objetivo Geral Avaliar a eficiência do tratamento de feridas induzidas experimentalmente em ovinos utilizando biomembrana de látex com e sem gentamicina. 2.2 Objetivos Específicos Comparar os marcadores de lesão hepatocelular dos ovinos que receberam ferida cirúrgica antes e após a aplicação da biomembrana de látex incorporada com gentamicina, objetivando avaliar possível hepatotoxicidade. Comparar os marcadores de séricos de função renal dos ovinos que receberam ferida cirúrgica antes e após a aplicação da biomembrana de látex incorporada com gentamicina, objetivando avaliar possível nefrotoxicidade. Comparar a área de feridas em ovinos realizadas cirurgicamente sem tratamento algum (controle) com a área de feridas tratadas com biomembrana de látex e biomembrana de látex impregnada com gentamicina. Comparar a carga bacteriana de feridas em ovinos realizadas cirurgicamente sem tratamento algum (controle) com a carga bacteriana de feridas tratadas com biomembrana de látex e biomembrana de látex impregnada com gentamicina. Verificar se a aplicação de biomembrana de látex impregnada com gentamicina é capaz de selecionar bactérias resistentes a esse antibiótico no teste de sensibilidade a antimicrobianos. 33 3. MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Comitê de ética O projeto de pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais do Centro Universitário das Faculdades Integradas de Ourinhos (Unifio) sob protocolo número 022/2018 (ANEXO A). 3.2 Seleção dos animais Todos os ovinos incluídos no projeto foram provenientes da Fazenda Experimental da Unifio. Os animais foram mantidos em sistema intensivo em baias individuais medindo 2,0 x 1,5 m, cercadas de madeira, e receberam alimentação composta por volumoso e concentrado. O volumoso é silagem de milho à vontade e o concentrado é ração farelada composta por 63% milho, 34% soja e 3% sal mineral, sendo fornecido duas vezes ao dia na quantidade de 250 g/animal no período da manhã e da tarde. Cada baia possui bebedouros individuais em seu interior com fornecimento à vontade. Todos os animais foram vermifugados e apresentam controle parasitário em dia (Figura 5). Figura 5: Ovinos: a) Aprisco individual; b) Roupa protetora Fonte: Arquivo pessoal. Foram selecionados 10 ovinos, sendo cinco machos e cinco fêmeas com idade entre 1,5 e 3 anos, da raça Santa Inês, de pelagem curta, pesando entre 30 e 40 kg, a) b) 34 sem alterações clínicas, hematológicas e bioquímicas (Tabela 1) uma semana antes da realização da ferida cirúrgica. Tabela 1: Dados hematológicos e bioquímicos (média e desvio-padrão) dos ovinos selecionados para inclusão no estudo (n=10). Parâmetro Resultado Referência Hematologia Volume globular % 30,50 ± 2,27 27 – 45 Hemácias (x1012/L) 9,05 ± 0,74 9 – 15 Hemoglobina (g/dL) 10,19 ± 0,76 9 – 15 VCM (%) 31,70 ± 0,82 28 – 40 CHCM (%) 36,14 ± 3,01 31 – 34 Leucócitos totais (x109/L) 8,19 ± 2,35 4 – 12 Neutrófilos segmentados (x106/L) 2.959 ± 974 700 – 6.000 Linfócitos (x106/L) 4.529 ± 1.488 2.000 – 9.000 Monócitos (x106/L) 243 ± 157 0 – 750 Eosinófilos (x106/L) 428 ± 239 0 – 1.000 Basófilos (x106/L) 0 ± 0 0 – 300 PPT (g/dL) 6,68 ± 0,19 6,0 – 7,5 Fibrinogênio g/dL 0,24 ± 0,08 0,2 – 0,6. Plaquetas (109/L) 530,40 ± 152,34 300 – 600 Bioquímica Albumina (g/dL) 2,91 ± 0,61 2,4 – 3,0 AST (UI/L) 99,20 ± 23,59 60 – 280 Creatinina (mg/dL) 1,21 ± 0,18 1,2 – 1,9 Proteína total (g/dL) 6,78 ± 0,80 6,0 – 7,9 Ureia (mg/dL) 34,57 ± 9,65 17 – 42 GGT(Ul/L) 34,92 ± 4,76 20 – 52 Valores de referência para a espécie ovina: Hematologia (WOOD, QUIROZ-ROCHA, 2010) e bioquímica (KANEKO et al., 2008). Abreviações: AST, aspartato aminotransferase; CHCM, concentração hemoglobínica corpuscular média; GGT, gamaglutamil transferase; PPT, proteína plasmática total; VCM, volume corpuscular médio. 3.3 Confecção das biomembranas A confecção das biomembranas seguiu o protocolo de Gemeinder et al. (2021). Resumidamente, o látex natural foi adquirido comercialmente (BDF Comércio de Produtos Agrícolas Ltda., Guarantã, SP) e mantido em estado líquido pela adição de amônia com pH 10,0. O material foi centrifugado a 8000 g com a finalidade de reduzir proteínas presentes no látex que poderiam ocasionar reações alérgicas. O látex natural, quando em forma líquida, é formado basicamente por uma suspensão de partículas de borracha envolvidas por moléculas fosfolipídicas e proteínas, que pela repulsão eletrostática de suas cargas, deixam a suspensão 35 estável (Figura 6). Desta forma, se o pH da suspensão diminuir, ou ocorrer a evaporação da água ou com a ação de bactérias que secretam ácido graxo, ela se tornará instável, o que resultará na coalescência das partículas de borracha formando um coágulo de látex ou o látex sólido (NAWAMAWAT et al., 2011). Figura 6: Partícula de borracha de látex natural Fonte: Adaptado de Pegorin et al., 2021. A biomembrana foi confeccionada por casting, depositando-se 3 mL de látex sobre placa circular por no mínimo 24 horas para a obtenção da biomembrana em sua consistência padrão. Para a confecção das biomembranas de látex natural com sulfato de gentamicina (Fagron, Fuan Pharm. Group Yantai Justaware Pharm. Co., Ltd, China) uma solução estoque do fármaco foi preparada diluindo a gentamicina em água destilada, obtendo uma concentração de 30 mg/mL. Para uma melhor homogeneidade da solução, o vórtex foi utilizado por 5 min. Depois disso, as biomembranas foram fabricadas depositando 3 mL de látex natural acrescidos de 3 mL de solução de gentamicina, seguindo o mesmo procedimento de secagem da biomembrana sem fármaco (Figura 7). Proteínas Fosfolipídios Poli (cis-1, 4-sopreneno) 36 Figura 7: Processo de confecção das biomembranas de látex por casting: a) Materiais utilizados na produção da biomembrana; b) Látex, c) Mistura látex com a gentamicina, d) Deposição do látex nos moldes, e) Secagem da biomembrana, f) Biomembrana seca. Fonte: Arquivo pessoal. O desenvolvimento e caracterização das biomembranas de látex puro e incorporadas com gentamicina foi evidenciado em pesquisa anterior. Os ensaios de caracterização das biomembranas como resistência mecânica, taxa de liberação, atividade antimicrobiana e hemolítica estão descritas no Apêndice 1. a) b) c) d) e) f) 37 3.4 Microscopia de força atômica – AFM A microscopia de força atômica (AFM) tem como princípio medir as forças ou as interações entre uma ponteira e a superfície da amostra para produzir imagens a partir de um material isolante ou não (PINTO; RAMOS; DA FONSECA FILHO, 2015). A leitura das interações é realizada por uma sonda composta por uma ponteira acoplada à uma haste flexível (cantilever), a qual incide um feixe de laser que é refletido através de uma lente em um fotodetector onde é medido às variações de posição e intensidade produzidas pelas deflexões do cantilever quando a ponteira entra em contato com a superfície da amostra (Figura 8). Estas variações são armazenadas e transformadas em imagens topográficas da superfície da amostra (FERREIRA; YAMANAKA, 2006) Figura 8: Funcionamento da técnica de AFM: a) Esquema do sistema de microscopia de força atômica, b) Topografia de “blend” látex natural com nanotubos de carbono. Fonte: (NEVES; VILELA; ANDRADE, 1998; SOUSA; SCURACCHIO, 2014). Apresenta vantagens como imagem tridimensional, alta resolução, a amostra em análise não precisa ser recoberta com material condutivo, análise do material em escala nanométrica e menor custo em relação aos microscópios eletrônicos (HERRMANN et al., 1997). Para a leitura topográfica das biomembranas foi utilizado o equipamento NaioAFM, Modelo NanoSurf (Suíça) acoplado a um cantilever “CONTR” em modo contato, com frequência de ressonância 15-350kHz, obtendo imagens em duas e três a) b) 38 dimensões (2D e 3D) com resolução de 256 x 256 ou 515 x 512 pixels em frequência de 1 linha por segundo. 3.5 Protocolo de indução e tratamento das feridas Cada animal recebeu seis feridas cutâneas na região do gradil costal, sendo três do lado esquerdo (E) e três do lado direito (D) com distância de pelo menos 3 cm entre os ferimentos (Figura 9). Figura 9: Confecção das feridas: a) Esquema para indução das feridas; b) Marcação para indução das feridas. Fonte: Arquivo pessoal. As feridas receberam como tratamento cobertura de biomembrana de látex, cobertura com biomembrana de látex impregnada com gentamicina ou como controle, ausência de cobertura direta da ferida. A disposição dos tratamentos em cada animal foi realizada por sorteio no dia da aplicação do tratamento, sendo que cada ferida dos diferentes animais teve a mesma chance de receber qualquer tratamento e o tratamento realizado do lado esquerdo foi repetido no lado direito do mesmo animal. Para confecção da ferida cirúrgica, foi realizada tricotomia, limpeza da região com água e sabão, seguido de antissepsia com clorexidine a 3% e clorexidine alcoólico 0,5% em cada hemitórax do animal. A analgesia local foi realizada utilizando lidocaína 5% sem vasoconstritor (Lidovet, Bravet, Rio de Janeiro, Brasil) e as três feridas em cada hemitórax foram confeccionadas com um punch (Figura 10) de Região Caudal Região Escápula E D a) b) 39 fabricação própria estéril medindo 30 mm de diâmetro, sendo a profundidade suficiente apenas para passar as três camadas da pele do animal. Então o tampão de pele foi removido com auxílio de pinça e tesouras cirúrgicas estéreis. Figura 10: a) Punch 30 mm utilizado para confecção das feridas cirúrgicas dos ovinos; b) Remoção do tampão de pele. Fonte: Arquivo pessoal. Após realização das feridas, as mesmas ficaram abertas e expostas por um período de 24 h com o intuito de obterem-se feridas contaminadas. Os animais foram mantidos em baias individuais, recebendo normalmente água e alimentação normais. Decorridas as 24 h, foi coletado material para avaliação microbiológica e determinação da carga microbiana inicial, posteriormente as feridas foram limpas com gaze e solução fisiológica estéreis, secas e receberam os tratamentos definidos por sorteio (controle, biomembrana de látex ou biomembrana de látex com gentamicina). As biomembranas foram fixadas à ferida com adesivo à base de etil cianoacrilato (TEK BOND, Saint-Gobain, Embu das Artes, Brasil) (Figura 11). a) b) 40 Figura 11: Demonstração das feridas induzidas cirurgicamente em um dos ovinos selecionados para o experimento recebendo tratamento na seguinte sequência sorteada, da esquerda para direita: biomembrana de látex, controle, biomembrana de látex com gentamicina. Fonte: Arquivo pessoal. A cada 72 h, período máximo de liberação de gentamicina in vitro (GEMEINDER et al., 2021; MARINHO et al., 2013; SILVA, 2015), as biomembranas foram removidas, as feridas foram limpas com gaze e solução fisiológica estéreis e novas biomembranas foram aplicadas. A troca das biomembranas e a limpeza das feridas ocorreram até que a ferida estivesse completamente fechada, que segundo nosso estudo piloto ocorreu entre o 22º e 25º dia (Figura 12). 41 Figura 12: As feridas cirúrgicas foram confeccionadas utilizando punch de fabricação própria medindo 30 mm de diâmetro no hemitórax direto na região do gradil costal do ovino. Decorridas 24 h abertas, as feridas receberam, da esquerda para direita, cobertura com biomembrana de látex, cobertura com biomembrana de látex com gentamicina e não recebeu cobertura alguma (controle). As feridas foram limpas e as biomembranas foram trocadas a cada 72h. Fonte: Arquivo pessoal. O hemitórax direito foi utilizado para avaliação da cicatrização e coleta do swab para exame microbiológico, enquanto o hemitórax esquerdo foi utilizado para coleta de tecido para biópsia e avaliação histopatológica. A analgesia foi realizada utilizando dipirona sódica 500 mg/mL (Pironal, Vetoquinol, São Paulo, Brasil) na dose de 5 mL/animal duas vezes ao dia (BID) durante 3 dias. Não foi utilizado antibiótico e anti-inflamatório para que não houvesse interferência com os tratamentos e com o processo de cicatrização. 42 3.6 Coleta das amostras Foram coletadas amostras para avaliação hematológica e bioquímica dos animais, biópsia da ferida para avaliação histológica do processo de cicatrização e swab para avaliação da carga bacteriana e realização do teste de sensibilidade a antimicrobianos (antibiograma), conforme resumo descrito na Tabela 2. Tabela 2: Esquema para coleta das amostras para avaliação hematológica, bioquímica, microbiológica e histopatológica, além de avaliação da cicatrização nos ovinos submetidos à procedimento cirúrgico para indução de feridas de pele medindo 30 mm de diâmetro. Procedimento Dia após aplicação do tratamento Basal (0) 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 Hemograma X X X X X X Bioquímico X X X X X X Carga bacteriana X X X X X* X* Antibiograma X X X Biópsia para histopatológico X X Avaliação morfométrica X X X X X X X X X X X *Caso a ferida ainda esteja aberta. Se ao final de 30 dias ainda houver feridas abertas, a avaliação persistirá até o completo fechamento. Para realização do hemograma e obtenção de soro para as análises bioquímicas, o sangue foi colhido por punção jugular e acondicionado, respectivamente, em tubo com K2EDTA (BD Vacutainer®, Becton-Dickson, New Jersey, USA) e com ativador de coágulo (BD Vacutainer®, Becton-Dickson, New Jersey, USA). O soro foi obtido após o tubo permanecer em repouso por 20 min em temperatura ambiente seguido de centrifugação a 3.000 rpm por 10 minutos. O swab para avaliação microbiológica foi colhido de forma padronizada sempre pelo mesmo indivíduo, por meio de 10 passagens por toda a extensão da ferida, sempre rotacionando-o, seguido de acondicionamento em um tubo de vidro com tampa contendo 1 mL de solução fisiológica, ambos estéreis, tomando-se os devidos cuidados para evitar contaminação (Figura 13). 43 Figura 13: Procedimento de coleta dos swabs para análise microbiológica nas feridas do gradil costal direito, padronizado por 10 passagens pela ferida, sempre rotacionando, sendo realizada sempre pelo mesmo indivíduo. Fonte: Arquivo pessoal. 3.7 Avaliação da cicatrização 3.7.1 Morfometria A medida das áreas das feridas foi realizada por meio de um paquímetro digital (DISMA, DISMA Ferramentas, Brasil), conforme método preconizado por Marinho et al., (2013). A partir da mensuração e multiplicação do maior comprimento e da maior largura com paquímetro digital, a área da ferida foi estabelecida. Paralelamente, foi realizada análise da área da ferida utilizando programa computacional ImageJ (versão 1.47v, 2012). As imagens foram obtidas por câmera fotográfica semiprofissional (Sony® Cyber-Shot DSC-H50, Carl Zeiss® - 31- 465 mm) com resolução de 9.1 megapixels no formato JPEG (Joint Photographic Experts Group). O registro fotográfico ocorreu com iluminação de luz solar para obtenção de melhor qualidade de coloração e a câmera foi posicionada com eixo perpendicular ao leito da ferida com distância de 30 cm da ferida, sempre se utilizando uma régua para controle da distância e outra régua junto à ferida para utilização como calibração pelo programa. Sempre o mesmo operador, sem conhecimento acerca do tratamento utilizado, realizou a demarcação manual da área/perímetro da ferida, sendo considerado como borda o limite do tecido róseo de cicatrização ou da pele íntegra. A área da ferida foi calculada após calibração com a régua fotografada junto à ferida, sendo a área fornecida em cm2. O percentual de contração (%C) das feridas 44 foi mensurado segundo Coelho, Rezende e Tenório (1999) pela fórmula %Co = (Ai – Af / Ai) x 100, em que Ai é a área no período inicial (primeiro dia pós-operatório) e Af é a área mensurada no dia pós-operatório correspondente. Os momentos em que foram realizadas as avaliações morfométricas estão descritos na Tabela 2. 3.8 Avaliação dos parâmetros hematológicos e bioquímicos Para realização do hemograma, as contagens de hemácias, leucócitos, plaquetas e determinação de hemoglobina foram realizadas em contador automatizado de células sanguíneas para uso veterinário (ABX Micros ESV 60, Paris, França). O volume globular foi determinado pelo método do microcapilar de Strumia (11.400 rpm por 5 minutos) e a contagem diferencial de leucócitos juntamente com avaliação morfológica de hemácias, leucócitos e plaquetas, foi realizada em esfregaço sanguíneo corado com corante hematológico comercial (Instant-Prov, Newprov, Pinhais, PR, Brasil), seguindo-se recomendações de Jain (1986). A determinação de proteína plasmática total (PPT) e fibrinogênio plasmático (FP), foram determinadas seguindo as recomendações de Allison (2015), respectivamente por refratometria e precipitação pelo calor a 56ºC por 3 minutos. As determinações bioquímicas foram realizadas em fotocolorímetro semiautomatizado (BIO 2000, BioPlus, Barueri, SP, Brasil) utilizando conjunto de reativos comerciais (Labtest Diagnóstica SA, Lagoa Santa, MG, Brasil) de acordo com as recomendações do fabricante. As determinações bioquímicas foram realizadas em duplicata a 37°C após calibração com calibrador (Calibra H, Labtest Diagnóstica SA, Lagoa Santa, MG, Brasil) e verificação com controles comerciais níveis I (Qualitrol 1H, Labtest Diagnóstica SA, Lagoa Santa, MG, Brasil) e II (Qualitrol 2H, Labtest Diagnóstica SA, Lagoa Santa, MG, Brasil). Os teores de colesterol total e triglicerídeos foram determinados pelo método enzimático-Trinder, glicose pelo método glicose oxidase-Trinder e as atividades de aspartato aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase (ALT) foi determinada por metodologia cinética ultravioleta (UV), albumina por método colorimétrico com verde de bromocresol, cálcio total pelo método colorimétrico cresolftaleína, creatinina por método colorimétrico do picrato alcalino – Jaffé, fosfatase alcalina (FA) pelo 45 método cinético de Bowers e McComb modificado, fósforo por determinação UV segundo método de Daly e Ertingshausen modificado, gama GT (GGT) pelo método de Szasz modificado, proteínas totais pelo método colorimétrico do biureto e ureia segundo metodologia enzimática UV. O teor de globulinas foi obtido a partir da subtração de albumina das proteínas totais. Os valores de referências utilizados foram os descritos por Kaneko et al. (2008). 3.9 Identificação bacteriana Para avaliação da carga bacteriana das feridas, o swab colhido conforme metodologia especificada anteriormente foi vortexado por 60 segundos e a quantidade de unidades formadoras de colônia por mililitro (UFC/mL) dessa solução foi quantificada seguindo-se protocolo da NCCLS (2003). Resumidamente, 10 µL da solução inicial e de suas diluições (10-1 a 10-5) foram inoculadas na superfície dos ágares MacConkey e sangue de ovino desfibrinado a 5% (Himedia Laboratories, Índia), utilizando alça de platina calibrada. O material foi distribuído em linha reta de uma extremidade a outra da placa e perpendicularmente foram realizadas estrias com a alça por toda a superfície do ágar de maneira uniforme. O procedimento foi repetido até que a superfície da placa estivesse completamente seca. As placas foram incubadas em estufa bacteriológica (ECB Linea, Olidef CZ) a 37°C por 18 a 24 horas para determinação do número de UFC/mL (Figura 14). Os isolados bacterianos foram inicialmente identificados pela morfologia da colônia e coloração de Gram (Conjunto para coloração de Gram, Labcenter, Campinas, SP, Brasil). Após isolamento bacteriano, as bactérias Gram-positivas foram submetidas às reações de catalase e coagulase, enquanto as Gram-negativas foram identificadas utilizando reagente comercial (Enterobactérias, Laborclin, Pinhais, PR, Brasil) segundo as instruções do fabricante. 46 Figura 14: Após preparação do inóculo bacteriano a partir do swab das feridas, exatos 10 µL foram semeados em placas de Petri com Ágar Sangue e Ágar MacConkey para isolamento e determinação do número de unidades formadoras de colônias por mililitro (UFC/mL) de inóculo. Fonte: Arquivo pessoal. 3.10 Teste de sensibilidade antimicrobiana O teste de sensibilidade antimicrobiana foi realizado das colônias isoladas das feridas seguindo a metodologia de disco-difusão em ágar Müeller-Hinton (Himedia Laboratories, Índia), segundo método de Bauer et al. (1966). A densidade do inóculo foi padronizada segundo solução padrão de MacFarland 0,5 (1,8 x 108 UFC/mL) (Nefelobac, Probac do Brasil, São Paulo, Brasil) e foram testados os seguintes antibióticos: amoxicilina e ácido clavulânico 20/10 µg, ampicilina 10 µg, azitromicina 15 µg, cefalexina 30 µg, ceftiofur 30 µg, ciprofloxacin 5 µg, cloranfenicol 30 µg, doxiciclina 30 µg, enrofloxacin 5 µg, gentamicina 10 µg, oxacilina 1 µg, penicilina G 10 µg, sulfazotrim 25 µg, rifampicina 5 µg e tetraciclina 30 µg (Laborclin Produtos para Laboratório, Pinhais, PR, Brasil). Adicionalmente, também foi avaliado o halo inibitório dos discos de 5 mm da biomembrana de látex e biomembrana de látex impregnada com gentamicina, com objetivo de verificar se as biomembranas foram capazes de inibir o crescimento de bactérias presentes nas feridas de pele de ovinos (Figura 15). 47 Figura 15: Antibiograma após isolamento e identificação bacteriana. Fonte: Arquivo pessoal. A interpretação do diâmetro dos halos de inibição dos antibióticos foi realizada conforme critérios previamente estabelecidos (CLSI, 2013). Os halos da biomembrana de látex e biomembrana de látex incorporada com gentamicina foram interpretados de acordo com o halo de inibição da gentamicina, sendo classificado como resistente (R) <12 mm, intermediário (I) de 13-14 mm, sensível (S) >15 mm. 3.11 Avaliação Histopatológica Para avaliação histológica do processo cicatricial, foram realizadas biópsias das feridas abrangendo o leito e a borda da ferida, alternando o local da punção entre os limites dorsal e ventral da ferida nos momentos de coleta. Foi realizada antissepsia, bloqueio anestésico local e com auxílio de um punch de 5 mm a pele foi incisionada, sendo o tampão retirado com auxílio de pinça e tesoura estéreis. Os fragmentos de pele foram conservados em formol a 10%, sendo posteriormente fixados, clivados, diafanizados e incluídos em parafina. Cortes foram realizados no em micrótomo com 5 µm e corados com Hematoxilina e Eosina (HE) para avaliação do infiltrado inflamatório, vasos sanguíneos e fibroblastos. 48 As lâminas foram visualizadas no microscópio óptico Opton com a câmera Opticam microscopia ligada ao notebook com o software OPTHD para captura das imagens. Foram escolhidos 10 campos aleatórios de cada lâmina com a objetiva de 40x. A análise histológica compreendeu uma descrição dos infiltrados inflamatórios, realizada às cegas, que classificou a inflamação como crônica (predomínio de leucócitos mononucleares), aguda (predomínio de leucócitos polimorfonucleares), crônico-aguda (sem predomínio, presença de leucócitos mononucleares e polimorfonucleares); e quanto à quantidade, classificando-os como 1 (infiltrado inflamatório que ocupa até 25% do campo em aumento 40x), 2 (entre 25% e 50%) e 3 (acima de 50%) (GARCIA et al., 2010; ZIMMERMANN et al., 2018). A angiogênese foi classificada em 0 (ausente), 1 (menor do que no tecido normal), 2 (igual ao tecido normal), 3 (maior que no tecido normal) (GARCIA et al., 2010). Os fibroblastos foram avaliados como descrito em Prabhu et al. (2012) 0 (ausente), 1 (presente apenas perivascular), 2 (presente em menos de 50% do tecido) e 3 (presente em mais de 50% do tecido). 3.12 Análise estatística As variáveis foram testadas quanto a normalidade (Teste de Shapiro-Wilk) e as diferenças entre os tratamentos foram verificadas pelo teste de ANOVA com medidas repetidas e pós-teste de Tukey ou Friedman com pós-teste de Dunn. As correlações foram realizadas pelos coeficientes de Pearson ou Spearman. Todas as análises estatísticas foram efetuadas em programa computacional (GraphPad Prism, v.6.00 para Windows, GraphPad Software, La Jolla, CA, USA, www.graphpad.com), sendo considerados significantes quando p<0,05. 49 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1 Microscopia de força atômica – AFM A técnica de AFM é frequentemente utilizada nos ensaios de polímeros, uma vez que sua topografia microscópica apresenta imperfeições que podem prejudicar algumas de suas propriedades como a molhabilidade e adesão superficial. Ademais, esta técnica não requer tratamento prévio da amostra, pode ser aplicada a qualquer material, pois as leituras advêm de interações atrativas e repulsivas entre a ponta e a superfície, desta forma facilitando a elucidação da morfologia, microestruturas e cristalinidade da superfície dos diferentes polímeros (SOUSA; SCURACCHIO, 2014). As imagens obtidas pela microscopia de força atômica são formadas de acordo com o modo de operação, o que envolve a distância entre a ponteira e a amostra durante a varredura, bem como a forma de movimentá-la sobre a superfície (PINTO; RAMOS; DA FONSECA FILHO, 2015). Os modos de operação são divididos em três: modo contato onde ocorre um leve contato físico da ponteira com a amostra, no modo de não-contato a ponteira fica à nanômetros de distância da superfície da amostra, e no modo intermitente a ponteira mantém um contato periódico com a amostra (FERREIRA; YAMANAKA, 2006; PINTO; RAMOS; DA FONSECA FILHO, 2015). A caracterização topográfica da biomembrana de látex puro produziu imagens em 2D e 3D com dimensões de 52 µm x 52 µm, as quais foram ideais para observar sua superfície (Figura 16). Na Figura 16a é possível observar uma superfície uniforme com presença de grânulos, sugerindo esta ocorrência à coalescência das partículas de borracha que acontece durante o preparo das biomembranas. A imagem em 3D (Figura 16b), revela a superfície com formações de depressões (poros) e elevações que podem facilitar a troca de fluidos entre os meios. 50 Figura 16: Imagens de AFM biomembrana de látex puro: a) Imagem 2D (256 pixels); b) Imagem 3D (512 pixels). Fonte: Arquivo pessoal. Nas imagens produzidas pelas biomembranas de látex incorporadas com gentamicina (Figura 17), com dimensões de 52 µm x 52 µm, as quais foram ideais para observar a dispersão do fármaco de forma homogênea não alterando a forma da estrutura da superfície da biomembrana, o que sugere que a interação entre látex- fármaco não modificou a estrutura da gentamicina. Figura 17: Imagens de AFM biomembrana de látex + gentamicina: a) Imagem 2D (256 pixels); b) Imagem 3D (512 pixels). Fonte: Arquivo pessoal. a) b) b) a) 51 Wei et al. (2020), observaram que a rugosidade em filmes de látex diminui com o passar do tempo, onde comparou os filmes de látex natural (FLN), filmes de látex desproteinizado (FLND) e sem fosfolipídios (PF-FLND). Os autores observaram que as proteínas e os fosfolipídios presentes no látex natural retardam o início imediato de coalescência de suas partículas, o que demonstra uma maior rugosidade da superfície em comparação aos filmes de FLND e PF-FLND. Comparando as imagens 3D das biomembranas (Figura 16b e 17b) observa- se picos mais elevados na superfície das biomembranas com gentamicina sugerindo que o fármaco presente nestas elevações, por apresentar características hidrofílicas, sejam liberados mais rapidamente e posteriormente as partículas mais internas seriam liberadas de forma sustentadas. 4.2 Avaliação da cicatrização A avaliação morfométrica foi o parâmetro utilizado para verificar o percentual de contração das feridas e os momentos em que foram realizadas as medidas receberam denominação de momento basal (M0), quarto dia (M4), sétimo dia (M7), décimo dia (M10), décimo terceiro dia (M13), décimo sexto dia (M16), décimo nono dia (M19), vigésimo segundo dia (M22) e vigésimo quinto dia (M25). Nas Figuras 18 e 19 é possível comparar a evolução da cicatrização analisada nos métodos utilizados para mensuração das feridas, pela paquimetria e software digital (ImageJ), respectivamente. Observa-se, em ambas as Figuras, a diminuição do tamanho das feridas em 40% até o M7 e o fechamento total das feridas tratadas com látex sem e com gentamicina no M25. O tratamento da ferida com a biomembrana de látex promoveu aumento significativo do tamanho da ferida no M4 em relação ao controle em ambos os métodos de mensuração, já no M10 levou à redução significativa em relação ao controle, não havendo diferença entre os tratamentos nos demais momentos analisados. O tamanho da ferida tratada com a biomembrana de látex com gentamicina foi maior que o da ferida tratada com látex em ambos os métodos de mensuração no M7. 52 Figura 18: Relação dos diâmetros horizontal (H) e vertical (V) determinados por paquímetro digital em feridas de pele de ovinos (n=10) sem tratamento algum (Controle) ou cobertas com biomembrana de látex (L) e biomembrana de látex com gentamicina (L+G) 24 h após a realização (M0) e aos 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22 e 25 dias. Os valores são expressos em porcentagem em relação ao M0. As barras indicam valores mínimos e máximos e o quadro representa o primeiro e terceiro quartis e a diferença estatisticamente significante é indicada por * (p<0,05), ** (p<0,01), *** (p<0,001) ou **** (p<0,0001). Fonte: Arquivo pessoal. 53 Figura 19: Áreas determinadas por software digital (ImageJ) de feridas de pele de ovinos (n=10) sem tratamento algum (Controle) ou cobertas com biomembrana de látex (L) e biomembrana de látex com gentamicina (L+G) 24 h após a realização (M0) e aos 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22 e 25 dias. Os valores são expressos em porcentagem em relação ao M0. As barras indicam valores mínimos e máximos e o quadro representa o primeiro e terceiro quartis e a diferença estatisticamente significante é indicada por * (p<0,05), ** (p<0,01), *** (p<0,001) ou **** (p<0,0001). Fonte: Arquivo pessoal. Ao determinar o tamanho das feridas ao longo do tempo em cada tratamento, observou-se redução estatisticamente significativa das feridas a partir do M13 em todos os tratamentos (Figura 20). 54 Figura 20: Tamanho das feridas determinado por paquímetro digital (A) ou por software digital (ImageJ, B) de feridas de pele de ovinos (n=10) sem tratamento algum (Controle) ou cobertas com biomembrana de látex (L) e biomembrana de látex com gentamicina (L+G) 24 h após a realização (M0) e aos 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22 e 25 dias. Os valores são expressos em porcentagem em relação ao M0. Os gráficos são expressos por média e desvio-padrão e a diferença estatisticamente significante é indicada por * (p<0,05), ** (p<0,01), *** (p<0,001) ou **** (p<0,0001). Fonte: Arquivo pessoal. Em relação ao tamanho da ferida avaliada por duas diferentes metodologias, as biomembranas de látex não promoveram aumento significativo da velocidade de cicatrização. Entretanto, embora a biomembrana de látex no início da avaliação tenha 55 promovido menor retração da ferida, no meio do processo de cicatrização foi verificada maior retração da ferida. Brandão et al. (2016), também verificaram menor retração da ferida no sétimo dia de avaliação em feridas cutâneas induzidas cirurgicamente em ratos tratadas com gel de látex uma vez ao dia. Já no décimo dia essa redução foi inversa e a ferida tratada com o gel de látex se apresentou menor do que a ferida controle. Ainda nesse mesmo estudo, a ferida tratada com o gel de látex também apresentou uma redução no sétimo dia em relação à ferida tratada com o gel de látex incorporado com gentamicina. Penhavel et al. (2016), relatam que aos 14 dias pós-cirúrgico de feridas cutâneas em ratos, não houve diferença entre os diâmetros das feridas tratadas com látex e controle. Avaliando-se a cicatrização sob o efeito do tempo, observou-se que em todos os tratamentos as feridas apresentaram redução significativa a partir do décimo terceiro dia. As biomembranas de látex e látex com gentamicina não induziram uma cicatrização mais rápida quando comparadas à ferida controle em ovinos, assim como descrito por Frade et al. (2012) em feridas de humanos diabéticos que não houve significância estatística entre o tamanho da ferida nos grupos látex quando comparados com controle. Masud et al. (2020), demonstraram o potencial de cicatrização comparando biomembranas compostas por quitosana e nanopartículas de óxido de zinco e as mesmas impregnadas com sulfato de gentamicina. Esses autores utilizaram ratos em seu estudo, nos quais foram induzidas feridas, e consequentemente foram tratadas com as biomembranas. Observaram que a partir do quinto dia as feridas tratadas com as biomembranas apresentaram contração da ferida e formação de tecido de granulação, enquanto na ferida controle houve uma pequena formação de tecido de granulação e pouca inflamação. Após 10 dias foi observado o fechamento completo das feridas tratadas com o composto impregnado com gentamicina, apresentaram menor formação de crosta do que a ferida do tratamento controle, demonstrando que as propriedades antibacterianas da gentamicina e as nanopartículas de óxido de zinco, e o estímulo das propriedades cicatrizantes da quitosana melhoraram o desempenho de cicatrização das feridas. 56 As crostas formadas, geralmente em lesões cutâneas, advém dos exsudatos formados pelos leucócitos e eritrócitos que migram para o sítio inflamatório desempenham a função de barreira física frente aos microrganismos, porém podem proporcionar cicatrizes inestéticas quando formada desordenadamente (KRUPP et al., 2019). Yu et al. (2020), para avaliar a cicatrização em feridas infectadas com S. aureus, realizadas experimentalmente em ratos, compararam nanocarreadores com nanopartículas de prata associado ou não à gentamicina. Os autores observaram as feridas tratadas com o nanocarreador de prata com gentamicina não apresentaram reação inflamatória, ulceração ou edema demonstrando uma melhor capacidade na prevenção de infecção e aceleração da cicatrização, diferente dos outros grupos. Os tamanhos das feridas tratadas com o nanocarreador de prata com gentamicina diminuíram consideravelmente e apresentaram no 14º dia de tratamento uma completa cicatrização. Enquanto o grupo controle e o grupo tratado apenas com a nanopartícula de prata foi observado formação de crostas. No presente trabalho, as biomembranas de látex e látex com gentamicina não demonstraram, estatisticamente, uma cicatrização mais rápida, con