UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” INSTITUTO DE QUÍMICA ARARAQUARA INVESTIGAÇÃO ELETROQUÍMICA E APLICAÇÃO DE ELETRODOS DE CARBONO VÍTREO MODIFICADOS POR FILMES DE POLI-L-LISINA NA DETERMINAÇÃO DE ANTIOXIDANTES. ELAINE RENATA DE CASTRO VIANA PEREIRA ABRIL/2010 ELAINE RENATA DE CASTRO VIANA PEREIRA Investigação eletroquímica e aplicação de eletrodos de carbono vítreo modificados por filmes de poli-L-lisina na determinação de antioxidantes. Tese apresentada ao Instituto de Química, Universidade Estadual de São Paulo, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Química. Orientadora Profª Drª Maria Valnice Boldrin Araraquara 2010 FICHA CATALOGRÁFICA Pereira, Elaine Renata de Castro Viana P436i Investigação eletroquímica e aplicação de eletrodos de carbono vítreo modificados por filmes de poli-L-lisina na determinação de antioxidantes / Elaine Renata de Castro Viana Pereira – Araraquara : [s.n], 2010 148 f. : il. Tese (doutorado) – Universidade Estadual Paulista, Instituto de Química Orientador: Maria Valnice Boldrin 1. Química analítica. 2. Eletroquímica. 3. Quercetina. 4. Catequina. I. Título. Elaboração: Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação do Instituto de Química de Araraquara Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação Dados Pessoais Nome Elaine Renata de Castro Viana Pereira Endereço eletrônico ercviana@gmail.com ______________________________________________________________________________ Formação Acadêmica/Titulação 2006 - 2010 Doutorado em Química Analítica (Arar.). Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, São Paulo, Brasil Título: Investigação Eletroquímica e Aplicação de Eletrodo de Carbono Vítreo Modificado por Filmes de Poli-L-Lisina na Determinação de Antioxidantes, Ano de obtenção: 2010 Orientador: Profª Drª Maria Valnice Boldrin Bolsista a: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Mato Grosso Palavras-chaves: Eletrodos Modificados, Poliaminoácidos, Antioxidantes, Poli-L-Lisina, Cromatografia Líquida de Alta Eficiência Áreas do conhecimento: Química Analítica, Eletroanalítica, Instrumentação Analítica Setores de atividade: Pesquisa e desenvolvimento científico 2001 - 2003 Mestrado em Química. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, São Paulo, Brasil Título: Investigação Eletroquímica E Aplicação De Eletrodo De Carbono Vítreo Modificado Por Filmes De Poli-L-Lisina Na Determinação Do Corante Reativo Cibacron Blue F3GA, Ano de obtenção: 2003 Orientador: Profª Drª Maria Valnice Boldrin Zanoni Palavras-chaves: Eletroquímica, Eletrodos Modificados, Corantes Reativo, Poliaminoácidos Áreas do conhecimento: Eletroanalítica, Análise de Traços e Química Ambiental Setores de atividade: Produtos e Serviços Voltados Para A Defesa e Proteção do Meio Ambiente, Incluindo O Desenvolvimento Sustentado, Fabricação de Produtos Têxteis 1995 - 2000 Graduação em Licenciatura e Bacharelado Em Química. Fundação Educacional de Barretos, FEB, Barretos, Brasil Título: Análise do Teor de Flúor em Águas Minerais Orientador: Prof. Dr. Jeosadaque José de Sene ______________________________________________________________________________ Formação complementar 2009 - 2009 Biossensores. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, São Paulo, Brasil Palavras-chaves: Eletroanalítica, Sensores Eletroquímicos 2008 - 2008 Treinamento de Análise Voltamétrica modelo 663. Universidade Federal de Mato Grosso, UFMT, Cuiabá, Brasil Palavras-chaves: Treinamento em equipamento 2007 - 2007 Treinamento POTENCIOSTATO/GALVANOSTATO PGSTAT 302. Universidade Federal de Mato Grosso, UFMT, Cuiabá, Brasil Palavras-chaves: Informação 2006 - 2006 Treinamento Operação e Manutenção básica no Sistema de HPLC. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, São Paulo, Brasil Palavras-chaves: Treinamento em equipamento 2002 - 2002 Extensão universitária em Temas Geradores no Ensino da Química. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, São Paulo, Brasil Bolsista do: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico 2001 - 2001 Extensão universitária em Extensão Universitária Em Tecnologia da Informação. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, São Paulo, Brasil ______________________________________________________________________________ Atuação profissional 1. Universidade Federal de Mato Grosso - UFMT Vínculo institucional 2005 - 2008 Vínculo: Colaborador, Enquadramento funcional: Estudante Colaborador, Carga horária: 40 horas. Regime: Dedicação Exclusiva Atividades 10/2005 - 04/2008 Projetos de pesquisa, Departamento de Química Participação em projetos: Desenvolvimento de métodos eletroanalíticos para avaliação da capacidade antioxidante total de extratos de Plantas Medicinais 2. Sistema de Ensino Tristão de Athaíde - SETA Vínculo institucional 2005 - 2005 Vínculo: Professor, Enquadramento funcional: Professor, Carga horária: 40 horas. Regime: Dedicação Exclusiva Atividades 03/2005 - 09/2005 Ensino médio Especificação: Química Geral, Físico-Química, Química Orgânica 3. Secretaria Educacional de Educação - SEE Vínculo institucional 2000 - 2005 Vínculo: Servidor público, Enquadramento funcional: Professor, Carga horária: 33 horas. Regime: Parcial Atividades 03/2000 - 05/2005 Ensino médio Especificação: Físico-Química, Química Geral, Química Orgânica 4. Laboratório de Análise Clínica São Matheus - LABORATÓRIO Vínculo institucional 1999 - 1999 Vínculo: Colaborador, Enquadramento funcional: Estagiária, Carga horária: 30 horas. Regime: Parcial Atividades 06/1999 - 07/1999 Estágio, Particular Estágio: Analista ______________________________________________________________________________________________ Linhas de pesquisa 1. Construção e aplicação de eletrodos modificados com poliaminoácidos na análise antioxidantes Objetivo: Investigar a formação e aplicação de filmes dos poliaminoácidos poli- L-lisina sobre eletrodos de carbono vítreo com o intuito de estudar a interação para determinação de alguns antioxidantes. Palavras-chaves: Antioxidantes, catequina, quercetina Áreas do conhecimento: Eletroanalítica Setores de atividade: Pesquisa e desenvolvimento científico _______________________________________________________________________________________________ Projetos 2005 - 2010 Desenvolvimento de métodos eletroanalíticos para avaliação da capacidade antioxidante total de extratos de Plantas Medicinais ______________________________________________________________________________ Áreas de atuação 1. Eletroanalítica 2. Instrumentação Analítica 3. Química dos Produtos Naturais ______________________________________________________________________________ Idiomas Inglês Compreende Razoavelmente, Fala Pouco, Escreve Pouco, Lê Bem Espanhol Compreende Razoavelmente, Fala Razoavelmente, Escreve Razoavelmente, Lê Razoavelmente _____________________________________________________________________________ Produção bibliográfica Artigos completos publicados em periódicos 1. VIANA, E. R. C., PEREIRA, F. C.; ZANONI, M. V. B. Electrochemical reduction and determination of Cibacron Blue F3Ga at poly-L-lysine modified glassy carbon electrode. Dyes e Pigment. v.71, p.148 - 155, 2006. Palavras-chaves: Dye determination, Poly-L-lysine, Reactive dyes, Modified electrode Áreas do conhecimento: Eletroanalítica, Análise de Traços e Química Ambiental Trabalhos publicados em anais de eventos (completo) 1. VIANA, E. R. C., SERAFIM, D. M., ZANONI, M. V. B. Redução eletroquímica e determinação voltamétrica do tinidazol em formulação farmacêutica. In: XIII Simpósio Brasileiro de Eletroquímica e Eletroanalítica, 2002, Araraquara. XIII Simpósio Brasileiro De Eletroquímica E Eletroanalítica, 2002. Trabalhos publicados em anais de eventos (resumo) 1. VIANA, E. R. C., CASTILHO, M., ZANONI, M. V. B. Eletrodo modificado por filme de poli-L-lisina/siloxano propilenoglicol para determinação de catequina. In: XVII Simpósio Brasileiro de Eletroquímica e Eletroanalítica, Fortaleza-CE. XVII Simpósio Brasileiro de Eletroquímica e Eletroanalítica, 2009. 2. Viana, E. R. C., CASTILHO, M., ZANONI, M. V. B. Aplicação de eletrodo de carbono vítreo modificado por filme de poli-l-lisina na determinação de quercetina. In: 14 Encontro Nacional de Química Analítica - ENQA, 2007, João Pessoa - Pb. XIV Encontro Nacional de Química Analítica - ENQA. Enqa, 2007. 3. VIANA, E. R. C., SANTOS, M P, TEREZO, A. J., KAWASHITA, N H, CASTILHO, M. Determinação eletroquímica da capacidade antioxidante do extrato da planta Vatairea macrocarpa In: Simpósio Brasileiro de Química, 2006, Águas de Lindóia. Reunião Anual do Simpósio Brasileiro de Química, 2006. Trabalhos publicados em anais de eventos (resumo expandido) 1. VIANA, E. R. C., PEREIRA, F. C., ZANONI, M. V. B. Determinação do corante têxtil Cibacron Blue F3GA usando eletrodo de carbono vítreo modificado por poli-L-lisina In: XIV Simpósio Brasileiro de Eletroquímica e Eletroanalítca, 2004, Teresópolis. XIV Simpósio Brasileiro de Eletroquímica e Eletroanalítca, 2004. 2. SERAFIM, D. M, VIANA, E. R. C., SENE, J. J, STRADIOTTO, N. R. Determinação de Oxamniquina em Produtos Farmacêuticos por Voltametria de Onda Quadrada In: XIII Simpósio Brasileiro de Eletroquímica e Eletroanalítica, 2002, Araraquara. XIII Simpósio Brasileiro de Eletroquímica e Eletroanalítica, 2002. 3. VIANA, E. R. C.; PEREIRA, F. C.; ZANONI, M. V. B. Determinação do corante Cibacron Blue F3GA em eletrodo de carbono vítreo modificado com filme de poli-L-lisina. In: XV Congresso da Sociedade Iberoamericano de Electroquímica, 2002, Évora. XV Congresso da Sociedade Íberoamericano de Electroquímica, 2002. Apresentação de Trabalho 1. VIANA, E. R. C., CASTILHO, M., ZANONI, M. V. B. Eletrodo modificado por filme de poli-L-lisina/siloxano propilenoglicol para determinação de catequina, 2009. (Congresso, Apresentação de Trabalho) 2. VIANA, E. R. C., CASTILHO, M., ZANONI, M. V. B. Aplicação de eletrodo de carbono vítreo modificado por filme de poli-L-lisina na determinação de quercetina, 2007. (Congresso, Apresentação de Trabalho) 3. VIANA, E. R. C., SANTOS, M P, KAWASHITA, N H, TEREZO, A. J., CASTILHO, M. Determinação eletroquímica da capacidade antioxidante do extrato da planta Vatairea macrocarpa, 2006. (Congresso, Apresentação de Trabalho) Demais Trabalhos 1. Viana, E. R. C., SERAFIM, D. M., NASRRALLAH, A. A., SENE, J. J. Determinação de Flúor em Águas Minerais, 1999. Eventos Participação em eventos 1. Global Sustainable Bionergy (GSB) Latina American Convetion, 2010. (Simpósio). 2. Apresentação de Painel no XVII Simpósio Brasileiro de Eletroquímica e Eletroanalítica, 2009. (Congresso) Eletrodo modificado por filme de poli-L-lisina/siloxano propilenoglicol para determinação de catequina. 3. Apresentação de Painel no 14º Encontro Nacional de Química Analítica - ENQA, 2007. (Congresso) Aplicação de eletrodo de carbono vítreo modificado por filme de poli-l-lisina na determinação de quercetina. 4. Apresentação de Painel no 29º Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, 2006. (Congresso) Determinação eletroquímica da capacidade antioxidante do extrato da planta Vatairea macrocarpa. 5. Apresentação de Painel no XIII Simpósio Brasileiro de Eletroquímica e Eletroanalítica, 2002. (Simpósio) Redução eletroquímica e determinação voltamétrica do tinidazol em formulação farmacêutica. À Deus, por ter me dado forças durante toda caminhada, por conduzir meus passos na direção exata e em todos os momentos da minha vida. Aos meus pais Élcio e Isaura, por ser parte imprescindível em na minha vida, pelo carinho, amor e ensinamentos. Aos meus irmãos Edilson e Edgar por sempre me apoiarem apesar da distância e da falta de encontros, mas em pensamentos e palavras nas horas mais necessárias. AMO VOCÊS!!!!!!!!!! AAGRADECIMENTO ESPECIAL Ao esposo Gustavo pelo amor, compreensão, companheirismo, paciência e o essencial de tudo, por me incentivar e apoiar a minha escolha independente da distância e da saudade. AMO VOCÊ!!!!!!!!!!!!! AGRADECIMENTOS Agradeço A Profª Drª Maria Valnice Boldrin, pela confiança, respeito e amizade adquirido durante todos esses anos. Por ter acreditado no meu potencial e pelos ensinamentos e orientação, que contribuíram para o meu aprendizado e crescimento profissional e pessoal. A Profª Drª Marilza Castilho e Prof. Dr. Ailton José Terezo por terem me acolhido no grupo de pesquisa em eletroquímica e eletroanalítca de UFMT (Cuiabá), pelas horas de trabalhos, discussões e especialmente pela amizade e carinho durante toda a minha permanência no grupo e fora dele. Às Profª Drª Hideko e Pillar, por ter me incentivado em todos os aspectos: amizade, paciência e conhecimentos transmitidos, contribuindo de alguma maneira a minha vida. Ao Prof. Dr. Nelson Ramos Stradiotto, pelas discussões científicas e disposição em contribuir para minha formação, além da amizade adquirida durante o desenvolvimento deste trabalho. Aos meus amigos (e anjos da guarda) Thiago (Pessoa), Michelle (Cunhada) e Paula (amiga-irmã) por tudo o que passamos, vivemos e comemoramos juntos. Esses anos não seriam os mesmos sem vocês!!!!!!!!!!!!! Muito obrigada. Especialmente as minhas amigas (irmãs de alma) Diana, Fernanda e Paula...........vocês são a minha família que escolhi AMO VOCÊS!!! A Josiane, Mariana, Marly pela verdadeira amizade, convivência divertida e alegre, troca de experiências, incentivo, amizade, companheirismo, pelas palavras de conforto e apoio incansável em todos os momentos. Aos amigos do laboratório NDCOM: Marcelo Faber, Daniela, Lahys, Tina, Leonardo Paim e aos ex-participantes Priscila, Magno (Maguinho) e Leandro pela grande amizade e pelos momentos de descontração durante o tradicional café da tarde. A todo grupo de Eletroanalítica. Aos funcionários da Secretaria de Pós-Graduação (Sandra, Célia, Patrícia e Wennia) e da Biblioteca especialmente a Cristina (Cris), pela simpatia, amizade, atenção e paciência com que sempre me receberam. A FAPEMAT pela bolsa concedida e aos demais órgãos de fomento (FAPESP, CAPES, CNPq), pelo apoio financeiro concedido para a manutenção da infra-estrutura do laboratório. ““Basta ser sincero e desejar profundo Você será capaz de sacudir o mundo” Raul Seixas RESUMO O presente trabalho reporta estudos sobre o uso do polímero Poli-L-Lisina (PLL) na modificação de eletrodo de carbono vítreo e sua aplicação na determinação dos antioxidantes quercetina e catequina. A imobilização desses poliaminoácido na superfície de eletrodo de carbono vítreo foi investigada usando diferentes metodologias: tais como a deposição direita de PLL, ligação cruzada com glutaraldeído (PLL/GA), imobilização com Quitosana (PLL/QTS) e polímeros híbridos de polipropilenoglicol (PPO), testando-se a pré-concentração e retenção de quercetina nestas matrizes. O método de incorporação mais eficiente para o antioxidante foi o uso de filmes híbridos de PPO, que mostrou ser um agente ancorante adequado para PLL na matriz polimérica do filme. Várias metodologias para pré-concentração e retenção do antioxidante no filme foram investigadas. A melhor condição experimental para formação de filme estável e retenção da quercetina foi obtida pela deposição de 0,5 µL de PPO, seguido da adição de 10µL de PLL (PLL/PPO). A oxidação voltamétrica de 1,0 x 10-6 mol L-1 de quercetina no eletrodo modificado por filmes ppo/pll apresenta um par de picos redox em +0,42/+0,40 V, cuja corrente é aproximadamente duas vezes maior que no eletrodo sem modificação. Utilizando a técnica de voltametria de onda quadrada, construiu-se uma curva analítica no intervalo de concentração de 1,0 x 10-8 a 1,0 x 10-7mol L-1. O limite de detecção foi. 2,76 ± 0,5 x 10 -9 mol L-1. O método proposto foi aplicado para a análise deste antioxidante em amostras de chá verde e comparado por cromatografia líquida de alta eficiência com arranjo de diodos (CLAE/DAD), no qual resultados compatíveis (7,36 ± 0,76 mg/g CLAE e 6,60 ± 0,80 mg/g) foram obtidos para quercetina na amostra. Os eletrodos modificados por filmes PPO/PLL, também, foram usados para a determinação de catequina. Um par de pico redox reversível em +0,46/+0,42 V foi obtido para a catequina em tampão B-R (pH 4). A curva analítica foi obtida no intervalo de 1,0 x 10-8 a 7,5 x 10-7 mol L-1 para usando a voltametria de pulso diferencial. O método apresenta limites de detecção de 6,2 ± 0,4 x 10-9 mol L-1. O método foi aplicado para a determinação de catequina em amostra de extrato bruto etanólico de Vatairea macrocarpa no qual foi detectado a concentração de 22,4 mg/g de catequina. A metodologia proposta apresentou resultados compatíveis quando comparada com a análise espectrofotométrica utilizada para testar o método. Palavras-chaves: eletrodos modificados; poli-L-lisina; polipropilenoglicol, antioxidantes. ABSTRACT This paper reports studies on the use of polymer poly-L-lysine (PLL) in the modification of glassy carbon electrode and its application in the determination of the antioxidants quercetin and catechin. The immobilization of this polyaminoacids on the surface of glassy carbon electrode was investigated using different methodologies such as the right deposition of PLL, cross-linked with glutaraldehyde (PLL / GA), immobilization with chitosan (PLL / QTS) and hybrid polymers of polypropylene (PPO), testing the pre-concentration and retention of Quercetin on these matrices. The incorporation method more efficient for the antioxidant was the use of hybrid films of PPO, which proved to be an agent suitable for anchoring PLL in the polymer matrix of the film. Several methodologies for pre-concentration and retention of the antioxidant in the film were investigated. The best experimental conditions for the formation of the stable film and retention of the Quercetin were obtained by deposition of 0.5 µL of PPO, followed by the addition of 10μL of PLL (PLL / PPO). The voltammetric oxidation of 1.0 x 10-6 mol L-1 of Quercetin on the modified electrode by PPO / PLL films shows a pair of redox peaks at +0.42 / +0.40 V whose the current is approximately two times higher than the unmodified electrode. Using the technique of square wave voltammetry, we constructed a calibration curve in the concentration range of 1.0 x 10-8 to 1.0 x 10-7mol L-1. The limit of detection was 2,76 ± 0,5 x 10 -9 mol L-1. The proposed method was applied to the analysis of this antioxidant in green tea samples and compared by high performance liquid chromatography with diode array (HPLC/DAD), in which consistent results (7.36 ± 0.76 mg / g HPLC and 6 , 60 ± 0.80 mg / g) were obtained for quercetin in the sample. The modified electrodes by PPO/PLL films, too, were used for the determination of catechin. A pair of reversible redox peak at +0.46 / +0.42 V was obtained for the Catechin in B-R buffer (pH 4). The calibration curve was obtained in the range of 1.0 x 10-8 to 7.5 x 10-7 mol L-1 for using the differential pulse voltammetry. The method shows the limit of detection of 6,2 ± 0.4 x 10-9 mol L-1. The method was applied for the determination of catechins in a sample of the ethanol extract of Vatairea macrocarpa which was detected the concentration of 22.4 mg/g of catechin. The proposed methodology showed consistent results when compared with the spectrophotometric analysis used to test the method. Keywords: modified electrodes; poly-L-lysine; polypropylene glycol; antioxidants. LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Estrutura molecular da Poli-L-Lisina. 39 Figura 2 - Esquema de reações da síntes e policondensação dos precursores híbridos siloxano- PPO (Tagliavini et. al. 2008) 42 Figura 3 - Estrutura química do antioxidante quercetina. 43 Figura 4 - Estrutura química do antioxidante catequina. 44 Figura 5 - Voltamograma cíclico correspondentes à oxidação de 1,0 x 10-6 mol L-1 de QT sobre ECV em solução hidro-etanólica pH 2,0. � = 50 mVs-1. 57 Figura 6- Voltamograma cíclico correspondentes à oxidação de 1,0 x 10-6 mol L-1 de QT sobre eletrodo de carbono vítreo em solução hidro-etanólica pH 2,0. � = 50 mVs-1. 58 Figura 7 - Voltamogramas cíclicos obtidos para ECV (A) recoberto por filmes de PLL após 10 minutos de imersão em solução de 1,0 x 10-3 mol L-1 de QT transferidos para solução hidro-etanólica pH 2,0 e (B) eletrodo sem modificar. � = 50 mVs-1. 60 Figura 8 - Voltamogramas cíclicos obtidos para eletrodo de carbono vítreo recoberto por filmes de PLL/GA após 10 minutos de imersão em solução de 1,0 x 10-3 mol L-1 de QT, transferidos para solução hidro-etanólica pH 2,0. � = 50 mVs-1. 61 Figura 9 - Voltamograma cíclico obtidos para eletrodo de carbono vítreo recoberto por filmes de PLL/QTS* após 10 minutos de imersão em solução de 1,0 x1 0-3 mol L-1 de QT, transferidos para solução hidro-etanólica pH 2,0. � = 50 mVs-1. 62 Figura 10 - Voltamograma cíclico obtido para eletrodo de carbono vítreo recoberto por filmes de PLL/QTS após 10 minutos de imersão em solução de 1,0 x 10-3 mol L-1 de QT, transferidos para solução hidro-etanólica pH 2,0. � = 50 mVs-1. 63 Figura 11- Voltamograma cíclico obtido para eletrodo de carbono vítreo recoberto por filmes de PPO após 10 minutos de imersão em solução de 1,0 x 10-3 mol L-1 de QT, transferidos para solução hidro-etanólica pH 2,0. � = 50 mVs-1. 65 Figura 12 - Voltamograma cíclico obtido para oxidação do filme de PLL/ PPO imobilizado sobre eletrodo de carbono vítreo em solução hidro-etanólica pH 2,0. � = 50 mV s-1. 66 Figura 13 - Voltamograma cíclico obtido para eletrodo de carbono vítreo recoberto por filmes de PLL/PPO após 10 minutos de imersão em solução de 1,0 x 10-3 mol L-1 de QT, transferidos para solução hidro-etanólica pH 2,0. � = 50 mVs-1. 67 Figura 14 - Esquema de formação do filme PLL/PPO* sobre eletrodo de carbono vítreo. 68 Figura 15 - (A) Voltamogramas cíclicos com varreduras sucessivos de potencial para eletrodo modificado PLL/PPO* carregados com 1,0 x 10-3 mol L-1 de QT, (B) transferido solução hidro-etanólica pH 2,0. (C) Efeito da variação do número de ciclos. � = 50 mV s-1. 69 Figura 16 - Voltamogramas cíclicos de 1,0 x 10-3 mol L-1 de QT sobre (a) ECV e (b) filme de PLL/PPO*, incorporação eletroquímica QT. � = 50 mV s-1. 70 Figura 17 - Voltamograma cíclico modificado PLL/PPO* com 1,0 x 10-3 mol L-1 de QT incorporado em circuito aberto e transferidos tampão B-R pH 2,0. (B) Gráfico de Ipa vs. número de ciclos. � = 50 mV s-1. 71 Figura 18 - Voltamogramas cíclicos de 1,0 x 10-3 mol L-1 de QT sobre (a) ECV e (b) filme de PLL/PPO*, incorporação de QT em circuito aberto. � = 50 mV s-1. 72 Figura 19 - Esquema de formação do filme PLL/PPO sobre eletrodo de carbono vítreo. 73 Figura 20 - (A) Voltamogramas cíclico com varreduras sucessivas de potencial (60 ciclos) realizados para eletrodo modificado PLL/PPO carregados com 1,0 x 10-3 mol L-1 de QT em tampão B-R pH 2,0. ˅ = 50 mV s-1. (B) Voltamograma representativo após a incorporação transferido o eletrodo para eletrólito e (C) Efeito da variação de número de ciclos sobre corrente de pico anódica. 74 Figura 21 - Voltamogramas cíclicos de 1,0 x 10-3 mol L-1 de QT sobre (a) ECV e (b) filme de PLL/PPO, incorporação eletroquímica de QT. � = 50 mV s-1. 74 Figura 22 - Voltamogramas cíclicos de 1,0 x 10-3 mol L-1 de QT sobre (a) ECV e (b) voltamograma cíclico para oxidação de QT sobre filme de PLL/PPO, incorporação em circuito aberto. (B) Efeito da variação de número de ciclos sobre corrente de pico anódica. � = 50 mV s-1. 75 Figura 23 - Voltamogramas cíclicos para oxidação de 1,0 x 10-6 mol L-1 de QT (a) ECV e (b) filme de PLL/PPO incorporação circuito aberto. � = 50 mV s-1. 76 Figura 24 - Efeito do tempo de acúmulo sobre voltamogramas cíclicos correspondentes a oxidação de 1,0 x 10-6 mol L-1 de Q em pH 2,0 sobre eletrodo modificado por filme de PLL/PPO. � = 50 mVs-1. 78 Figura 25 - Influência do tempo de imersão do eletrodo modificado com PLL/PPO carregado com 1,0 x 10-6 mol L-1 de QT em solução hidro-etanólica pH 2,0. 79 Figura 26 - Voltamogramas cíclicos com varredura sucessivos de potencial (10 ciclos) realizados para eletrodo modificado PLL/PPO carregado com 1,0 x 10-6 mol L-1 de QT em solução hidro-etanólica pH 2,0. � = 50mVs-1. 80 Figura 27 - Efeito da variação do número de ciclos sobre a corrente de pico anódico para o eletrodo modificado por filmes de PLL/PPO carregado com 1,0 x 10-6 mol L-1 de QT em solução hidro-etanólica pH 2,0. 80 Figura 28 – Efeito de Epa vs. pH em 1,0 x 10-6 mol L-1 de QT sobre eletrodo de carbono vítreo (A) com modificação (B) sem modificação. � = 50 mV s-1. 82 Figura 29 - Efeito de Ipa vs. pH em 1,0 x 10-6 mol L-1 de QT sobre eletrodo de carbono vítreo (A) com modificação e (B) sem modificação. � = 50 mV s-1. 83 Figura 30 - Voltamogramas cíclicos de QT 1,0 x 10-6 mol L-1 em tampão hidro-etanólico pH 2,0 sobre eletrodo modificado em diferentes �. 84 Figura 31 - Gráfico de Ipa vs. � em solução de QT 1,0 x 10-6 mol L-1 em tampão hidro-etanólico pH 2,0 sobre eletrodo modificado. 85 Figura 32 - Voltamogramas de onda quadrada obtidos (A) para o eletrodo modificado por filmes de PLL/GA e (B) ECV carregados com 1,0 x 10-8 mol L-1 de QT. (f = 75Hz , amplitude 50,0 mV e incremento de potencial 2,0 mV). 86 Figura 33 - Voltamogramas de onda quadrada obtidos para determinação de QT em solução tampão B-R pH 2,0 em diferentes concentrações variando-se de 1,0 x 10-8 mol L-1 a 1,0 x 10-7 mol L-1 sobre eletrodo modificado por filmes de PLL/PPO. 87 Figura 34 - Curva analítica para oxidação de QT imobilizado em eletrodos de carbono vítreo modificados por filmes de PLL/PPO. 88 Figura 35 - Voltamograma de pulso diferencial obtidos para 5 μL de solução de chá verde em solução hidro-etanólica pH 2,0 sobre (A) ECV e (B) PLL/PPO. 89 Figura 36 - Voltamogramas de onda quadrada obtidos para oxidação de QT em chá verde por filmes de PLL/PPO carregados durante 8 minutos em solução tampão B-R pH 2,0 após adição de alíquotas de solução padrão de QT (7,5 x 10-8 mol L-1). 90 Figura 37 - Gráfico da Ipa vs. Concentração para oxidação de QT em chá verde por filmes de PLL/PPO carregados durante 8 minutos em solução tampão B-R pH 2,0. 90 Figura 38 - Estruturas química do ácido ascórbico (AA), ácido cafeico (AC), ácido clorogênico (ACL), ácido gálico (AG), catequina (CT) e rutina (R). 92 Figura 39 - Voltamogramas de onda quadrada obtidos para oxidação de 5,0 x 10-7 mol L-1 de ácido ascórbico sobre eletrodo (a) ECV e (b) modificado por PLL/PPO. 93 Figura 40 - Voltamogramas de onda quadrada para oxidação de 5,0 x 10-7 mol L-1 de ácido cafeico sobre eletrodo (a) ECV e (b) modificado por PLL/PPO. 93 Figura 41 - Voltamogramas de onda quadrada para oxidação de 5,0 x 10-7 mol L-1 de ácido clorogênico sobre eletrodo (a) ECV e (b) modificado por PLL/PPO. 94 Figura 42 - Voltamogramas de onda quadrada para oxidação de 5,0 x 10-7 mol L-1 de ácido gálico sobre eletrodo (a) ECV e (b) modificado por PLL/PPO. 94 Figura 43 - Voltamogramas de onda quadrada para oxidação de 5,0 x 10-7 mol L-1 de catequina sobre eletrodo (a) ECV e (b) modificado por PLL/PPO. 95 Figura 44 - Voltamogramas de onda quadrada para oxidação de 5,0 x 10-7 mol L-1 de rutina sobre eletrodo (a) ECV e (b) modificado por PLL/PPO. 95 Figura 45 - Voltamogramas de onda quadrada obtidos para oxidação de chá verde na presença de ácido ascórbico no intervalo de concentração de 0,5 a 5,0 μmol L-1 sobre eletrodo modificado por PLL/PPO. 97 Figura 46 - Voltamogramas de onda quadrada para oxidação de chá verde na presença de ácido cafeico no intervalo de concentração de 0,5 a 5,0 μmol L-1 sobre eletrodo modificado por PLL/PPO. 97 Figura 47 - Voltamogramas de onda quadrada para oxidação de chá verde na presença de ácido clorogênico no intervalo de concentração de 0,5 a 5,0 μmol L-1 sobre eletrodo modificado por PLL/PPO. 98 Figura 48 - Voltamogramas de onda quadrada para oxidação de chá verde na presença de ácido gálico no intervalo de concentração de 0,5 a 5,0 μmol L-1 sobre eletrodo modificado por PLL/PPO. 98 Figura 49 - Voltamogramas de onda quadrada para oxidação de chá verde na presença de catequina no intervalo de concentração de 0,5 a 5,0 μmol L L-1 sobre eletrodo modificado por PLL/PPO. 99 Figura 50 - Voltamogramas de onda quadrada para oxidação de chá verde na presença de rutina no intervalo de concentração de 0,5 a 5,0 μmol L-1 sobre eletrodo modificado por PLL/PPO. 99 Figura 51 - Espectros de absorção de 10 µL chá verde e adição de 5,0 x 10-6 mol L-1 de ácido ascórbico, em solução hidro-etanólica pH 2,0. 101 Figura 52 - Espectros de absorção de 10 µL chá verde e adição de 5,0 x 10-6 mol L-1 de ácido cafeico em solução hidro-etanólica pH 2,0. 101 Figura 53 - Espectros de absorção de 10 µL chá verde e adição de 5,0 x 10-6 mol L-1 de ácido clorogênico em solução hidro-etanólica pH 2,0. 102 Figura 54 - Espectros de absorção de 10 µL chá verde e adição de 5,0 x 10-6 mol L-1 de ácido gálico em solução hidro-etanólica pH 2,0. 102 Figura 55 - Espectros de absorção de 10 µL chá verde e adição de 5,0 x 10-6 mol L-1 de catequina em solução hidro-etanólica pH 2,0. 103 Figura 56 - Espectros de absorção de 10 µL chá verde e adição de 5,0 x 10-6 mol L-1 de quercetina em solução hidro-etanólica pH 2,0. 103 Figura 57 - Espectros de absorção de 10 µL chá verde adição de 5,0 x 10-6 mol L-1 de rutina em solução hidro-etanólica pH 2,0. 104 Figura 58 - Cromatograma correspondente à injeção de 20 µL do padrão de AA, AC, ACl, AG, CT, QT e R na concentração de 1,0 x 10-4 mol L-1 solubilizada em metanol. Fase móvel: (A) ácido fórmico 0,1% e (B) metanol com rampa de 5-50% de B (9 min.), 50-70% B (15 min.) 70-5% B (18 min.). Fluxo 1 mL min-1, temperatura da coluna = 40ºC, λ = 280 nm. 106 Figura 59 - (A) Cromatograma correspondente à injeção de 20 µL do padrão de AA na concentração a 1,0 x 10-4 mol L-1 solubilizada em metanol. Fase móvel: (A) ácido fórmico 0,1% e (B) metanol com rampa de 5-50 % de B (9 min.), 50-70 % B (15 min.) 70-5% B (18 min.). Fluxo 1 mL min-1, temperatura da coluna = 40ºC, λ = 280 nm. (B) Espectro de absorbância na região de UV-vis obtidos por detecção de arranjo de diodos para cada analito. λinicial = 190 nm e λfinal = 800 nm. 107 Figura 60 - (A) Cromatograma correspondente à injeção de 20µL do padrão de AC na concentração a 1,0 x 10-4 mol L-1 solubilizada em metanol. Fase móvel: (A) ácido fórmico 0,1 % e (B) metanol com rampa de 5-50% de B (9 min.), 50-70% B (15 min.) 70-5% B (18 min.). Fluxo 1 mL min-1, temperatura da coluna = 40ºC, λ = 280nm. (B) Espectro de absorbância na região de UV-vis obtidos por detecção de arranjo de diodos para cada analito. λinicial = 190 nm e λfinal = 800 nm. 107 Figura 61 - (A) Cromatograma correspondente à injeção de 20 µL do padrão de ACl na concentração a 1,0 x 10-4 mol L-1 solubilizada em metanol. Fase móvel: (A) ácido fórmico 0,1% e (B) metanol com rampa de 5-50% de B (9 min.), 50-70 %B (15 min.) 70-5 %B (18 min.). Fluxo 1 mL min-1, temperatura da coluna = 40ºC, λ = 280 nm. (B) Espectro de absorbância na região de UV-vis obtidos por detecção de arranjo de diodos para cada analito. λinicial = 190 nm e λfinal = 800 nm. 108 Figura 62 - (A) Cromatograma correspondente à injeção de 20 µL do padrão de AG na concentração de 1,0 x 10-4 mol L-1 solubilizada em metanol. Fase móvel: (A) ácido fórmico 0,1% e (B) metanol com rampa de 5-50% de B (9 min.), 50-70% B (15 min.) 70-5% B (18 min.). Fluxo 1 mL min-1, temperatura da coluna = 40ºC, λ = 280 nm. (B) Espectro de absorbância na região de UV-vis obtidos por detecção de arranjo de diodos para cada analito. λinicial = 190 nm e λfinal = 800 nm. 108 Figura 63 - (A) Cromatograma correspondente à injeção de 20 µL do padrão de CT na concentração a 1,0 x 10-4 mol L-1 solubilizada em metanol. Fase móvel: (A) ácido fórmico 0,1% e (B) metanol com rampa de 5-50% de B (9 min.), 50-70% B (15 min.) 70-5% B (18 min.). Fluxo 1 mL min-1, temperatura da coluna = 40ºC, λ = 280 nm. (B) Espectro de absorbância na região de UV-vis obtidos por detecção de arranjo de diodos para cada analito. λinicial = 190 nm e λfinal = 800 nm. 109 Figura 64 - (A) Cromatograma correspondente à injeção de 20 µL do padrão de QT na concentração a 1,0 x 10-4 mol L-1 solubilizada em metanol. Fase móvel: (A) ácido fórmico 0,1% e (B) metanol com rampa de 5-50% de B (9 min.), 50-70% B (15 min.) 70-5% B (18 min.). Fluxo 1 mL min-1, temperatura da coluna = 40ºC, λ = 280nm. (B) Espectro de absorbância na região de UV-vis obtidos por detecção de arranjo de diodos para cada analito. λinicial = 190 nm e λfinal = 800 nm. 109 Figura 65 - Cromatograma correspondente à injeção de 20 µL do padrão de R na concentração a 1,0 x 10-4 mol L-1 solubilizada em metanol. Fase móvel: (A) ácido fórmico 0,1% e (B) metanol com rampa de 5-50% de B (9 min.), 50-70% B (15 min.) 70-5% B (18 min.). Fluxo 1 mL min-1, temperatura da coluna = 40ºC, λ = 280 nm. (B) Espectro de absorbância na região de UV-vis obtidos por detecção de arranjo de diodos para cada analito. λinicial = 190 nm e λfinal = 800 nm. 110 Figura 66 - Cromatogramas CLAE/DAD correspondentes à injeção de 20µL do padrão de QT nas concentrações de 1) QT1 = 1,0 x 10-6, 2) QT2 = 5,0 x 10-6, 3)QT3 = 1,0 x 10-5, 4)QT4 = 5,0 x 10-5, 5)QT5 = 1,0 x 10-4, 6)QT6 = 5,0 x 10-4 e 7) QT7 = 1,0 x 10-3 mol L-1, em metanol. Fase móvel: (A) ácido fórmico 0,1% e (B) metanol com rampa de 5-50% de B (9 min.), 50-70% B (15 min.) 70-5% B (18 min.). Fluxo 1 mL min-1, temperatura da coluna = 40ºC, λ = 280 nm. 111 Figura 67 - Curva analítica obtida no intervalo de concentração de 1,0 x 10-5 a 1,0 x 10-4 mol L-1 de QT em metanol. Fase móvel: (A) ácido fórmico 0,1% e (B) metanol com rampa de 5- 50% de B (9 min.), 50-70% B (15 min.) 70-5% B (18 min.). Fluxo 1 mL min-1, temperatura da coluna = 40ºC, λ = 280 nm. 112 Figura 68 - Cromatogramas CLAE/DAD correspondentes à injeção de 20 µL da solução de chá verde em metanol e respectivas adições do padrão de QT na concentração de: 1) QT1 = 1,0 x 10-6, 2) QT2 = 2,0 x 10-6 e 3) QT3 = 3,0 x 10-6 mol L-1. Fase móvel: (A) ácido fórmico 0,1% e (B) metanol com rampa de 5-50% de B (9 min.), 50-70% B (15 min.) 70-5% B (18 min.). Fluxo 1 mL min-1, temperatura da coluna = 40ºC, λ = 280 nm. 113 Figura 69 - Gráfico da Área vs. Concentração de padrão adicionado em chá verde nas concentrações de: 1) QT1 = 1,0 x 10-6 , 2) QT2 = 2,0 x 10-6 e 3) QT3 = 3,0 x 10 -6 mol L-1. Fase móvel: (A) ácido fórmico 0,1% e (B) metanol com rampa de 5-50% de B (9 min.), 50-70% B (15 min.) 70-5% B (18 min.). Fluxo 1 mL min-1, temperatura da coluna = 40ºC, λ = 280 nm. 113 Figura 70 - Sobreposição de espectros de absorção na região o UV-vis obtidos por detecção de arranjo de diodos para a amostra de chá verde e do padrão QT na concentração 1,0 x 10-6 mol L-1. Fase móvel: (A) ácido fórmico 0,1% e (B) metanol com rampa de 5-50% de B (9 min.), 50-70% B (15 min.) 70-5% B (18 min.), fluxo 1 mL min-1. 114 Figura 71 - Voltamograma cíclico correspondente à oxidação de 1,0 x 10-6 mol L-1 de CT em solução tampão B-R (pH 4,0) sobre eletrodo de carbono vítreo. ˅ = 50mVs-1 116 Figura 72 - Voltamogramas cíclicos obtidos para oxidação de 1,0 x 10-6 mol L-1 de CT em B-R 4,0. Curvas: (a) ECV e (b) recoberto por filme de PLL/PPO. � = 50mVs-1. 118 Figura 73 - Efeito do tempo de acúmulo sobre voltamogramas cíclicos correspondentes à oxidação 1,0 x 10-6 mol L-1 de CT em pH 4,0 sobre eletrodo modificado por filme de PLL/PPO. 119 Figura 74 - Influência do tempo de imersão do eletrodo modificado com PLL/PPO carregado com 1,0 x 10-6 mol L-1 de CT em solução tampão B-R pH 4,0. 120 Figura 75 - Voltamogramas cíclicos com varreduras sucessivos de potencial, (10 ciclos) realizados para eletrodo modificado PLL/PPO carregados com 1,0 x 10-6 mol L-1 de CT em tampão B-R pH 4,0. ˅ = 50 mV s-1. 121 Figura 76 - Efeito da variação do número de ciclos vs. Ipa para o eletrodo modificado por filmes de PLL/PPO carregado com 1,0 x 10-6 mol L-1 de CT em solução tampão B-R pH 4,0. 121 Figura 77 - Efeito do pH sobre potencial de oxidação de CT 1,0 x 10-6 mol L-1 para eletrodo (A) modificado com filme de PLL/PPO. (B) eletrodo de carbono vítreo. � = 50mVs-1. 122 Figura 78 - Efeito do pH na corrente de pico para solução 1,0 x 10-6 mol L-1 de CT obtida para (A) eletrodo modificado com filme de PLL/PPO. (B) eletrodo de carbono vítreo. � = 50mV s-1. 123 Figura 79 - Voltamogramas cíclicos para oxidação de 1,0 x 10-6 mol L-1 de CT em pH 4,0 sobre eletrodo de carbono vítreo modificado por filme de PLL/PPO. 124 Figura 80- Gráfico de Ipa vs. �1/2 em solução de 1,0 x 10-6 mol L-1 solução tampão B-R pH 4,0 sobre eletrodo modificado. 125 Figura 81 - Voltamogramas de pulso diferencial obtido sobre (A) ECV e (B) PLL/PPO para oxidação de 1,0 x 10-6 mol L-1 de CT em solução tampão B-R pH 4,0 com tempo de acúmulo de 10 minutos. 126 Figura 82 - Voltamogramas de pulso diferencial obtido para oxidação de CT em tampão B-R pH 4,0 sobre eletrodos de carbono vítreo modificados por filmes de PLL/PPO. 127 Figura 83 - Curva analítica obtida para oxidação de CT imobilizado em eletrodos de carbono vítreo modificados por filmes de PLL/PPO. 128 Figura 84 - Voltamograma de pulso diferencial para 0,05 g de EBEtOH de Vatairea macrocarpa sobre eletrodo de carbono vítreo modificado por PLL/PPO em solução B-R pH 4,0. 129 Figura 85 - Voltamogramas de pulso diferencial obtidos para oxidação de CT na concentração de 1) 1,0 x 10-6, 2) 2,0 x 10-6 e 3) 3,0 x 10-6 mol L-1 em EBEtOH de Vatairea macrocarpa por filmes de PLL/PPO carregados durante10 minutos em solução tampão B-R pH 4,0. 130 Figura 86 - Gráfico de Ipa vs. Concentração para oxidação de CT em extrato bruto etanólico de Vatairea macrocarpa por filmes de PLL/PPO carregados durante 10 minutos em solução tampão B-R pH 4,0 130 Figura 87 - Espectros de absorbância de CT em solução tampão B-R 0,04 mol L-1 pH 4,0 variando- se a concentração de 1,0 x 10-5 a 1,0 x 10-4 mol L-1. 1131 Figura 88 - Curva analítica obtidas através dos espectros de absorção de CT em solução tampão B-R 0,04 mol L-1 pH 4,0. 132 Figura 89 - Espectros de absorbância de EBEtOH de Vatairea macrocarpa em solução tampão B- R 0,04mol L-1 pH 4,0 e adições de 1,0 x 10-5, 2,0 x1 0-5 e 3,0 x 10-5 mol L-1 do padrão de CT. 133 Figura 90 - Gráfico da Absorbância vs. Concentração para espectros de absorbância de EBEtOH de Vatairea macrocarpa e CT em solução tampão B-R 0,04mol L-1 pH 4,0 e adições de 1,0 x 10-5, 2,0 x 10-5 e 3,0 x 10-5 mol L-1 do padrão de CT. 133 LISTA DE TABELAS Tabela 1 – Valores de recuperação encontrados de quercetina utilizando PLL/PPO. 91 Tabela 2 - Parâmetros voltamétricos comparativos entre eletrodo de carbono vítreo e modificado por filme PLL/PPO. 96 Tabela 3- Determinação de quercetina em chá verde empregando o método proposto usando eletrodo modificado por PLL/PPO e CLAE/DAD. 114 Tabela 4 - Determinação de catequina em extrato bruto etanólico de Vatairea macrocarpa empregando o método proposto e o espectrofotométrico. 134 LISTA DE ESQUEMAS Esquema 2 – Esquema de oxidação da quercetina. (Ghica e Brett, 2003) 58 Esquema 1 – Provável interação entre quercetina e filme de PLL. 77 Esquema 3 - Esquema de oxidação da catequina (Janeiro e Brett, 2004) 117 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS AA - ácido ascórbico AC - ácido caféico ACl - ácido clorogênico AG - ácido gálico B-R - solução tampão Briton-Robinson CLAE - cromatografia líquída de alta eficiência CT - catequina EBEtOH - extrato bruto etanólico ECV - eletrodo de carbono vítreo GA - glutaraldeído PLL - poli-L-lisina PPO - óxido de polipropilenoglicol QT - quercetina QTS - quitosana R - rutina LISTA DE SÍMBOLOS � - velocidade de varredura �1/2 – raiz da velocidade de varredura µ - micro Epa - pontencial de pico anódico Epc - potencial de corrente catódica f – freqüência Ipa - corrente de pico anódica Ipc - corrente de pico catódica mV – mili Volte ʎ - comprimento de onda SUMÁRIO 1 - INTRODUÇÃO 31 1.1 - Antioxidantes 31 1.2 - Métodos analíticos para análise de antioxidantes 33 1.3 - Eletrodos modificados 36 1.4 - Eletrodos modificados por filmes de poli-l-lisina 38 1.5 - Filmes de siloxano-propilenoglicol preparados por método sol-gel 41 1.6 - Quercetina e Catequina 43 1.7 - Chá verde 45 1.8 - Extrato bruto etanólico da entre-casca da Vatairea macrocarpa 46 2 – OBJETIVO 48 3. - PARTE EXPERIMENTAL 49 3.1 – Reagentes, soluções, solventes e amostras 49 3.1.1 – Reagentes 49 3.1.2 – Soluções e solventes 49 3.1.3 – Síntese do precursor 50 3.2 – Experimentos voltamétricos e potenciométricos 51 3.2.1 – Preparação dos eletrodos modifcados por filmes de poli-L-lisina 51 3.2.2 – Imobilização A (PLL/PPO*) 52 3.2.3 – Imobilização B (PLL/PPO) 52 3.2.4 – Incorporação do analito sobre o filme de PLL/PPO 52 3.2.5 – Determinação de quercetina em chá verde 53 3.2.6 – Determinação de catequina em extrato bruto etanólico de Vatairea macrocarpa sobre eletrodo de carbono vítreo modificado por filme PLL/PPO 53 3.3 – Experimentos cromatográficos 54 3.3.1 – Determinação de quercetina em amostras de chá verde por cromatografia. 54 3.4 – Experimentos espectrofotométricos 55 3.4.1 – Determinação de flavonóide e ácidos fenólicos em amostras de chá verde por espectrofotometria 55 3.4.2 – Obtenção da curva analítica e determinação da catequina em amostra de extrato bruto etanólico de Vatairea macrocarpa por espectrofometria 55 4 - RESULTADOS E DISCUSSÃO 57 4.2 - Comportamento voltamétrico da quercetina sobre eletrodo de carbono vítreo 57 4.2 - Eletrodos de carbono vítreo modificados por filmes de poli-l-lisina (PLL) 59 4.2.1 - Modificações do eletrodo de carbono vítreo por filmes híbridos de polipropilenoglicol óxido (PPO) e PLL 64 4.2.2 - Influência da técnica de imobilização de PLL/PPO sobre eletrodo de carbono vítreo 68 4.2.2.1 - Imobilização com depósito de filmes de PLL/PPO* 68 4.2.2.2 - Incorporação eletroquímica 68 4.2.2.3 - Incorporação em circuito aberto 70 4.2.3 - Imobilização B (PLL/PPO) 72 4.2.3.1 - Incorporação eletroquímica 73 4.2.3.2 - Incorporação em circuito aberto 74 4.2.4 - Tempo de pré – concentração da quercetina sobre eletrodo modificado com filme de PLL/PPO 78 4.2.5 -Efeito do ph sobre a pré-concentração de quercetina 81 4.2.6 - Influência da velocidade de varredura de potencial na oxidação da quercetina 84 4.2.7 - Curva de calibração para quercetina 85 4.2.8 - Aplicação do eletrodo modificado com pll/ppo na determinação de chá verde 88 4.2.9 - Estudo de interferentes 91 4.2.10 - Comparação do método proposto por cromatografia líquida de alta eficiência para determinação da quercetina em chá verde 105 4.2.11 - Avaliação do método proposto para determinação de quercetina e amostras de chá verde com CLAE/DAD 111 4.3 - Oxidação voltamétrica de catequina 116 4.3.1 - Oxidação voltamétrica de catequina sobre eletrodo de carbono vítreo modificados por filmes de PLL/PPO. 117 4.3.2 - Tempo de pré – concentração da catequina sobre eletrodo modificado com filme de PLL/PPO 118 4.3.3 - Efeito do pH sobre os parâmetros voltamétricos 122 4.3.4 - Influência da velocidade de varredura de potencial na oxidação da catequina 124 4.3.5 - Curva analítica para determinação catequina 125 4.3.6 - Aplicação do método em amostra de extrato bruto etanólico de Vatairea macrocarpa 128 4.3.7 - Comparação do método proposto por espectrofotometria para determinação da catequina em extrato bruto etanólico de Vatairea macrocarpa 131 5 - CONCLUSÃO 135 REFERÊNCIA 136 31 1 - INTRODUÇÃO 1.1 - Antioxidantes Os antioxidantes são agentes responsáveis pela inibição e redução das lesões celulares causadas pelos radicais livres. Eles podem ser compreendidos como substâncias que, quando presentes em baixas concentrações comparadas ao substrato oxidável, retardam ou inibem significativamente a oxidação daquele substrato (HALLIWELL e GUTTERIDGE, 1989; HALLIWELL, 1990, SUNDQUIST, BRIVIBA, e SIES, 1994). Em decorrência da ineficiência parcial do sistema antioxidante endógeno do organismo humano, torna-se necessária a contribuição de antioxidantes obtidos através da dieta (PIETTA; SIMONETTI; MAURI, 1998). Os antioxidantes presentes nas plantas podem atuar como agentes redutores, seqüestradores de radicais livres, inibidores de enzimas e como quelantes de metais (WANG e LIN, 2000) e a maioria de seus efeitos biologicamente ativos são derivados das funções antioxidantes (VELIOGLU et al., 1998). O estudo de substâncias naturais que apresentam efeitos antioxidantes em nível biológico vem crescendo muito nos últimos anos. Em geral, os agentes antioxidantes protegem as células contra danos oxidativos ou atuam como sequestradores de espécies reativas de oxigênios (EROs), incluindo radicais livres (HALLIWELL e GUTTERIDGUE, 1985). O desequilíbrio entre a formação e eliminação destas espécies oxidativas em organismos vivos está relacionada a diversas doenças, como câncer e a arterosclerose, além de aceleração dos sinais de envelhecimento. Por isso, a ingestão de antioxidantes através da dieta tem uma importante função na prevenção destas doenças (BERG, 1999). A oxidação no sistema biológico ocorre devido à ação de radicais livres presentes no organismo humano. Estas moléculas possuem um elétron isolado, livre para se ligar a qualquer outro elétron, e por isso são extremamente reativas. As EROs podem ser geradas por fontes endógenas ou exógenas. Os antioxidantes de defesa têm função de prevenção da geração de EROs, destruição de potenciais oxidantes e degradação das EROs formadas. Dessa forma, os danos dos tecidos induzidos pelo estresse oxidativo são mínimos 32 (BENZIE, 1996). Os antioxidantes podem agir em diferentes níveis no processo oxidativo: (1) sequestrando os radicais iniciais, (2) ligação a íons metálicos, (3) aprisionamento de radicais peroxilas e (4) remoção de biomoléculas danificadas pela oxidação (BRIVIBA et al. 1993). Assim, de modo mais geral um antioxidante biológico é definido como qualquer substância que, presente em baixas concentrações reduz ou previne significativamente a oxidação de um substrato oxidável (BENZIE, 1996). Dentre vários compostos antioxidantes os compostos fenólicos têm merecido destaque. As propriedades biológicas dos compostos fenólicos estão relacionadas com a atividade antioxidante com que cada fenol exerce sobre determinado meio, que por sua vez, depende da estrutura química. Usualmente, esses compostos estão divididos em grupos de: flavonóides, triterpenos e derivados dos ácidos fenólicos, tais como: ácidos benzóicos, ácidos cinâmicos e seus derivados, curcuminas entre outros.(JACKSON, 1994). Para BITSCH (1996), a maioria das substâncias fenólicas presentes nos alimentos pode ser classificada em dois principais grupos: os ácidos carboxílicos fenólicos e os flavonóides. Os flavonóides são várias classes de substâncias naturais que contém dois anéis aromáticos unidos por uma cadeia de três átomos de carbono, que se encontram amplamente distribuídos no reino vegetal, com diversas propriedades farmacológicas (HUTCHINGS, 1994). Dentre eles, os flavonóides derivados do 2-fenil-benzopireno são classificados como o grupo mais importante. Os principais subgrupos são as catequinas e proantocianidinas, as antocianidinas e os flavonóis ou flavonas (HERRMANN, 1994). O reconhecimento dos benefícios à saúde, por parte das catequinas e proantocianidanas, levou ao uso de extratos de semente de uva como suplementação alimentar (LAPARRA; MICHAUD; MASQUELIER, 1979, VAN ACKER et al., 1996; KÄHKÖNEN et al., 1999; SOARES, 2002). De acordo com RICE-EVANS et al. (1996), as propriedades químicas relacionadas a atividade antioxidante dos polifenóis, são correlacionadas à capacidade dos grupos fenólicos de seqüestrar radicais livres. Para esses compostos serem definidos como antioxidantes, eles devem satisfazer duas condições básicas: (i) prevenir a auto-oxidação ou a oxidação gerada por radicais livres, quando presentes em baixa concentração relativa ao substrato a ser 33 oxidado, e (ii) o radical formado após a ligação deve formar produto final mais estável. O conteúdo dos compostos fenólicos, presentes nas frutas e hortaliças, é um dos principais responsáveis pela atividade antioxidante destes alimentos e sua concentração pode estar influenciada por fatores como: maturação, espécie, práticas de cultivo, origem geográfica, estágio de crescimento, condições de colheita e processo de armazenamento (KIM, 2003). Como a capacidade antioxidante dos compostos fenólicos está diretamente ligada à sua estrutura química, e capacidade de estabilizar radicais livres, alguns pesquisadores enaltecem sua participação na prevenção de processos degenerativos celulares que provocam arteriosclerose, câncer e outras doenças (MAMEDE; PASTORE, 2004, FRANKEL; WATERHOUSE; TEISSEDRE, 1995, KOVAC e PEKIC, 1991). Mais de 6.000 diferentes estruturas já foram identificadas para flavonóides presentes em plantas e este número continua a aumentar (BOBBIO e BOBBIO, 1989; FENNEMA, 1993; SLUIS et al., 2001; AHERNE e O’BRIEN, 2002; CORDENUNSI et al., 2002). Dentre esses flavonóides, os que merecem destaque são: a quercetina e a catequina, objetivo de interesse no presente trabalho. 1.2 - Métodos analíticos para análise de antioxidantes Atualmente, há um crescente interesse no estudo de alimentos e plantas com comprovada ação antioxidante, devido ao elevado potencial econômico. Na busca de novos agentes que possam atuar como supressores de radicais livres, muitos métodos têm sido propostos para testar as propriedades antioxidantes de amostras biológicas, frutas, extratos de plantas e substâncias puras, sendo estas amostras submetidas a diversos ensaios “in vitro” (PRIOR e CAO, 1999). Os métodos cromatográficos, por serem mais seletivos, permitem separar e quantificar individual ou simultaneamente cada um dos compostos polifenólicos presentes na amostra. Portanto, é possível determinar se uma, entre as várias classes dessas substâncias, é mais representativa que outra. Com relação aos métodos espectrofotométricos, substâncias fenólicas têm espectro característico na região ultravioleta. Sendo assim, estes métodos têm sido usados para detectar adulteração em suco de laranja (ESCARPA e 34 GONZALEZ, 2001; BOCCHI et al., 1996). No entanto, geralmente empregam reações de oxidação e não é possível quantificar classes específicas desses compostos, uma vez que apresentam bandas de absorção muito próximas entre si. Embora haja alguma controversa com relação à seletividade dos métodos colorimétricos, muitos métodos são empregados para determinação de polifenóis totais. Por exemplo, Dressler, Machado e Martins (1995) e Celeste et al.(1994) têm usado métodos baseados em etapas de oxidação com reagente de Folin- Ciocalteu em meio básico para determinação de taninos e polifenóis totais, respectivamente. Dentre os principais métodos encontrados na literatura, destaca-se o teste de inibição do radical livre DPPH (2,2-difenil-1-pricil-hidrazil) por espectrofotometria na região do visível que é estável a temperatura ambiente. Esta supressão é acompanhada pela mudança da coloração violeta do DPPH em solução etanólica quando em estado radicalar, monitorando a banda de absorção característica no espectro visível no comprimento de onda em 517-518 nm (ʎmax = 9660/M/cm). Quando o DPPH-H volta ao estado reduzido, este se torna transparente. A solução etanólica/DPPH em contato com o material a ser testado, deste modo, diminui proporcionalmente à atividade antioxidante da amostra em estudo (NEILL et al., 2002; NAIK et al, 2002). Apesar de amplamente usado na literatura e grande simplicidade, seu emprego é limitado devido à baixa sensibilidade e alto custo do reagente DPPH. A quantificação de antioxidantes em alimentos e plantas tem despertado grande atenção na química analítica, tanto para desenvolvimento de métodos analíticos necessários para sua identificação e quantificação, quanto para entender os seus processos de atuação no metabolismo humano. Métodos analíticos mais comumente encontrados na literatura para sua direta quantificação baseiam-se principalmente nas técnicas cromatográficas e espectrofotométricas. Estes trabalhos envolvem cromatografia gasosa e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) com diversos tipos de detectores. Usando estes métodos é possível determinar compostos fenólicos por CLAE em suco de laranja, após etapa de derivatização e/ou extração em fase-sólida acoplada com ultravioleta, arranjo fotodiodo e detecção fluorescente (ROBARDS e ANTOLOVICH, 1995; BOCCHI et al., 1996; MOSKVIN et al., 1999; 35 KARAVICOKÁ e SIMKO, 2000; MILLER et al., 1997; CHRISTOFERSEN e CARDWELL, 1996). O uso da voltametria para a determinação da capacidade antioxidante total em diferentes amostras tem sido bastante empregado. O uso de técnicas voltamétricas pode também ser uma importante ferramenta para a avaliação da capacidade antioxidante de vários polifenóis e suas misturas (HOTTA et al., 2001; CHEVION, ROBERT, CHEVION, 2000, MANNINO et al., 1998) através da avaliação de suas propriedades redox. O grupo fenólico dos flavonóides pode ser eletroquimicamente oxidado, e a maioria dos flavonóides mostra pelo menos um pico anódico (YANG et al., 2001) e seus comportamentos voltamétricos podem ser comparados ao seqüestro dos radicais livres através do teste com radical 2,2- difenil-1-picrilhidrazil (DPPH), (HOTTA et al., 2002). A técnica voltamétrica mostrou ser uma ferramenta instrumental conveniente, e tem sido aplicada para a quantificação dos antioxidantes de baixo peso molecular (ABPM) hidrofílicos e lipofílicos presentes em amostras de plasma sangüíneo e extrato de pele (KOHEN, et al., 2000; CHEVION, et al., 2000). CHEVION et al. (1999) também empregaram a voltametria cíclica para avaliar a capacidade antioxidante total de vegetais e frutas. Os ABPM foram extraídos de diversos vegetais, como couve-flor, tomate, batata, brócolis etc., e a recuperação para vitamina C foi 93%. Os trabalhos de KILMARTIN et al. (2001, 2003) apresentam metodologias utilizando a voltametria cíclica como ferramenta adequada para caracterizar e quantificar antioxidantes em vinhos, infusões de chá verde e preto e também em café. A voltametria cíclica foi usada para a determinação da contribuição relativa de compostos antioxidantes fenólicos em suco de laranja processado (SOUSA et al., 2004). Os grupos hidroxila, presentes nos compostos fenólicos, são oxidados via transferência de dois elétrons levando a geração de uma quinona depois da liberação de 2H+. Os autores observaram que quanto maior o número de hidroxilas no anel aromático dos compostos analisados, menor o potencial de pico e, portanto maior sua atividade antioxidante. O extrato aquoso de uma erva natural Terminalia chebula foi testado pelo potencial atividade antioxidante (NAIK et al., 2002). O extrato mostrou ser um excelente seqüestrador do radical DPPH. Para entender o princípio ativo responsável pela sua atividade, foi feita análise do extrato por HPLC constando a 36 presença de compostos tais como, ácido ascórbico, ácido gálico e ácido elágico. Ainda no mesmo trabalho, utilizou-se a voltametria cíclica, para confirmar a atividade antioxidante do extrato. BRETT et al. (GHICA, BRETT, 2004; BRETT, GHICA, 2003; JANEIRO, BRETT, 2005) têm estudado o processo de eletro-oxidação de flavonóides, tais como: rutina, quercetina, catequina respectivamente no qual envolve uma etapa de adsorção de intermediários na superfície eletródica do carbono vítreo. Um biossensor amperométrico de pasta de carbono foi desenvolvido para a determinação de polifenóis em extratos vegetais (MELLO, 2003). O biossensor foi preparado com o compósito de sílica-titânio, DNA e peroxidase. Essa imobilização foi feita empregando a adsorção e ligação cruzada usando glutaraldeído 5% (m/v) seguido de secagem em temperatura ambiente. Após a homogeneização com pó de grafite e óleo mineral, essa pasta foi colocada na cavidade de 1mm entre as paredes de um tubo de vidro selado na extremidade com um disco de platina. Após otimizar todas as condições experimentais, o biossensor apresentou curva analítica em um intervalo de concentração de ácido clorogênico de 1 a 50,0 μmol L-1. Os resultados foram comparados com aqueles obtidos empregando-se o método de Folin-Ciocalteu. Um estudo eletroquímico detalhado de quatro flavonóides, incluindo a rutina com identificação de seus produtos de oxidação sobre eletrodo de carbono vítreo foi investigado por HENDRICKSON (1994), utilizando técnicas de voltametria cíclica e disco rotatório. A quantificação da rutina em chá foi investigada por MALAGUTTI, 2006, usando voltametria de onda quadrada sobre eletrodo de carbono vítreo e eletrodo compósito de grafite/poliuretana. O limite de detecção foi de 7,1x10-9mol L-1 para o eletrodo modificado e de 1,7 x 10-8 para mol L-1 para o eletrodo de carbono vítreo. A aplicação de eletrodos modificados pela adição direta de poli ácido glutâmico (1,0%) mostrou-se eficaz na pré-concentração ácido caféico sobre a superfície eletródica, na quantificação do mesmo em amostras de vinho tinto. Os valores encontrados foram concordantes com o apresentado na literatura e a validação do método confirma sua sensibilidade. (SANTOS et al., 2005). 1.3 - Eletrodos modificados 37 O aumento na demanda de testes analíticos cada vez mais sensíveis, rápidos, simples e econômicos para determinação de compostos biológicos importantes tem motivado inúmeros pesquisadores na busca por sensores eletroquímicos que atendam a essas exigências. Conseqüentemente, muito esforço tem sido despendido na modificação de eletrodos de platina, ouro, carbono vítreo e outros. A imobilização de microestruturas químicas na superfície de eletrodos tem apresentado notável crescimento na eletroquímica nos últimos anos (MURRAY, 1984, 1987; ABRUNA, 1986; WANG, 1991). Um eletrodo utilizado como suporte para a construção de um eletrodo modificado funciona como um conector para o fluxo de elétrons em um circuito eletrônico apropriado proporcionando condições para que possa ocorrer a transformação redox com filme imobilizado. Comparado a um eletrodo convencional, um maior controle das características e reatividade na superfície de um eletrodo modificado podem ser alcançados. Uma forma conveniente de incorporação de um modificador na superfície de um eletrodo pode ser realizada simplesmente pela utilização de uma camada de um filme polimérico. Muitos polímeros são aplicados para revestir superfícies eletródicas simplesmente pela combinação de propriedades de adsorção, atração eletrostática e baixa solubilidade na solução eletrolítica, ou ainda pela utilização de polímeros pré-formados ou obtidos através de polimerização eletroquímica. A vantagem de pré-concentração de espécies, observada com a utilização de um eletrodo modificado, pode ser obtida através do recobrimento de uma superfície com uma fina camada de um filme de um polímero de troca iônica (UGO, 1995). O sucesso da pré-concentração e determinação eletroquímica de um analito sobre um eletrodo recoberto com um filme poliônico começa com a escolha do polímero de troca-iônica e da variedade de técnicas disponíveis para detecção, tais como: voltametria de varredura linear, de onda quadrada e pulso diferencial e voltametria de re-dissolução utilizando-se eletrodo rotatório entre outras. O estudo do comportamento eletroquímico dos eletrodos modificados com poliaminoácidos iônicos e suas interações com compostos de interesse biológico e farmacêutico são de grande importância não só na área da eletroanálise, mas 38 em outras áreas correlacionadas, tais como aquelas envolvendo a saúde humana, uma vez que pode ser usado como modelo de interações mais complexas. Dentre estes modificadores, polieletrólitos sintéticos têm recebido particular atenção, devido à sua importância como modelos simplificados de polieletrólitos naturais tais como, proteínas e ácidos nucléicos. O uso destes polieletrólitos sintéticos como reagentes ancorados em superfícies eletródicas, tem permitido, além do estudo de interações mais complexas, aumentar a seletividade e sensibilidade analítica de métodos de detecção através de etapas de pré- concentração ocorrida através de interações específicas de grupos do polieletrólito e a espécie eletroativa. A escolha do polímero de troca-iônica a ser usado como modificador tem levado em consideração, principalmente, a facilidade de se obter filmes estáveis e reprodutíveis sobre a superfície eletródica. A deposição do filme pode ser obtida de diferentes maneiras, onde alguns métodos têm sido mais empregados (MURRAY, 1984). O procedimento mais simples é baseado na adição do polímero sobre a superfície eletródica, seguida de lenta evaporação do solvente. Outro procedimento bastante efetivo é a preparação envolvendo eletro- polimerização, baseada principalmente na oxidação de precursores monoméricos eletroativos (MURRAY, 1984; HILLMAN, 1987). Adicionalmente, algumas vezes, a estabilidade da camada polimérica é melhorada utilizando-se reações inter- cruzadas através de adição de contra-íons ou irradiação. 1.4 - Eletrodos modificados por filmes de Poli-L-Lisina Baseados nas propriedades destes poliaminoácidos, em especial a da Poli- L-Lisina (PLL) e suas facilidades em modificar uma superfície eletródica, com propriedades de troca iônica ou de promover uma ação eletrocatalítica, o sistema tem grande potencial para o estudo da interação com substâncias que apresentam atividade antioxidante. Sendo assim, polímeros derivados do poliaminoácido PLL podem ser usados com sucesso no desenvolvimento de sensores eletroquímicos através de métodos simples e rápidos na preparação e obtenção de eletrodos modificados. O polímero PLL é um poliaminoácido sintético obtido pela condensação de várias unidades de seu monômero, lisina. Esta unidade monomérica é um �- 39 aminoácido dotado de uma cadeia de hidrocarbonetos com cinco grupamentos CH2 e outra função-NH2 em posição �. Comercialmente, pode ser encontrado sobre diversos pesos moleculares resultantes do número de unidades matriciais utilizadas para sua confecção. O polímero apresenta um pKa= 10,7 (ANSON, 1983). De acordo com a literatura (IMMANENI, 1998; DAVIDSON, 1967), as reações de formação do polímero ocorrem entre as unidades monoméricas da lisina através da formação de ligações peptídicas entre os resíduos � (-NH2) de uma unidade com o terminal (-OH) da função carboxílica de outra matriz gerando a correspondente função peptídica. A estrutura final do polímero apresenta as funções peptídicas e o terminal � (-NH2) conforme mostra a Figura 1. Figura 1 - Estrutura molecular da Poli-L-Lisina. A modificação de eletrodos com PLL têm sido investigada por diversos autores, utilizando-se diversos materiais eletródicos, e diferentes técnicas de recobrimento nas aplicações analíticas. O uso de eletrodos recobertos por filmes de polieletrólitos com possibilidades analíticas tem se baseado em mecanismos típicos de troca-iônica, na incorporação de pares redox no recobrimento polimérico conferindo propriedades eletro-catalíticas ao eletrodo ou ainda, com características ligantes capazes de interagir especificamente com o analito através de reações de complexação (UGO e MORETTO1995). Os estudos pioneiros foram demonstrados por ANSON et al., 1983a, 1983b no qual estes estudos mostram que soluções aquosas de PLL quando aquecidas à 80oC sobre eletrodo de grafite, promovem a aderência do polímero à superfície eletródica, com mudança na sua conformação �-helicoidal para a conformação �- laminar. Desde 1995, MIZUTANI e colaboradores tem trabalhado intensamente na construção de biossensores com eletrodos modificados com PLL. Eletrodos de n C CH NH O (CH2)4 NH3 H2C CH NH O (CH2)4 NH2 OH + + 40 carbono vítreo modificados por membranas poliiônicas complexas, formadas por sanduíches de PLL e poli-(4-estirenosulfonato)(1995a), foram preparados pelos autores e utilizados como biossensores amperométricos em imobilização de lactato oxidase (1995b), colina oxidase, glucose oxidase (1996) e NADH (2000). A utilização de PLL na modificação de eletrodo de mercúrio foi investigada por FOGG et al., 1994a, 1994b. A aplicação do eletrodo de mercúrio modificado com PLL foi realizada na análise de compostos farmacêuticos aniônicos, tais como; nitroprussiato de sódio que é usado como vasodilatador no controle da pressão arterial e nedocromil de sódio que é usado como droga antiasmática. Um aumento de sensibilidade foi observado em relação ao eletrodo de mercúrio convencional. Do mesmo modo, a utilização da PLL no recobrimento do eletrodo de mercúrio, também, permite a análise voltamétrica de ceftazidima em matrizes biológicas. A adição de PLL na célula eletroquímica provoca grande incremento de corrente, propiciando um método sensível e seletivo para análise de ceftazidima em urina humana cujo limite de detecção encontrado foi de 1,0x10-10 mol L-1 (FERREIRA, et al., 1999). CAMPBELL, 2001 mostra que os grupos amino da PLL podem ser utilizados na complexação com derivados da vitamina B12. As propriedades catalíticas deste complexo foram avaliadas e mostraram eficiência na redução de alcenos halogenados. Um sensor eletroquímico foi construído para monitorar a formação do etanol durante processos de fermentação. O sensor é baseado na detecção amperométrica pulsada usando as disposições do microelétrodo de platina modificadas com uma membrana PLL e PVC (WARRINER et al., 2002). A aplicabilidade de eletrodos recobertos por filmes de PLL tem sido investigada como modelo de polieletrólitos eletricamente carregados capazes de modificar a superfície de diversos materiais eletródicos, e como potencialidade para a determinação de compostos farmacêuticos importantes (PEREIRA, et al., 2004). PEREIRA et al., 2004 mostraram que a utilização de glutaraldeído (GA), em reação cruzada com PLL, tem melhorado sensivelmente a aderência e retenção do poliaminoácido na superfície do eletrodo de carbono vítreo, permitindo analisar com alta estabilidade e sensibilidade o par ferri/ferrocianeto presente em solução aquosa. Neste caso, os filmes de PLL aderiram melhor à 41 superfície do eletrodo de carbono vítreo quando a PLL foi entre-cruzada parcialmente por meio do GA. Uma composição do filme de PLL e GA de 97,5%/2,5% confere boa adesão e retém a potencialidade de troca aniônica do PLL. O eletrodo modificado foi aplicado para a determinação do iodeto envolvendo a oxidação ao iodo. O método foi aplicado com sucesso à determinação do idoxuridina em amostra de urina (PEREIRA et al., 2005). O eletrodo modificado por filmes de PLL/GA foi empregado na análise de nitroprussiato de sódio, um vasodilatador comercial. A faixa de resposta linear do nitroprussiato em tampão B-R (pH 4,0) foi 1,0 x 10 -6 a 2,0 x 10 -5 mol L-1 e o e limite de detecção foi 1,0 x 10-7 mol L-1. O sensor voltamétrico foi aplicado diretamente a determinação do nitroprussiato em plasma humano e amostras de urina e a recuperação média para essas amostras foi cerca de 95-97%, sem qualquer pré-tratamento. (PEREIRA e ZANONI 2007). Os filmes de PLL / GA foram testados para determinação do corante reativo Cibacron Blue F3GA (CB). Os filmes podem ser usados para detectar níveis baixos do corante usando seu pico da oxidação em +0.75V por voltametria cíclica. O método descrito foi aplicado para a determinação do corante em água da torneira e amostras coletadas do reservatório de tratamento municipal com uma recuperação de 89,2% ± 5,4 e 88,0% ± 6,5, respectivamente (VIANA et al., 2006). Embora recobrimentos da superfície eletródica de carbono vítreo com filmes de Poli-L-Lisina sejam bem explorado, a maioria dos estudos mostra que sua aderência à superfície é limitada e melhores sensores são construídos quando outros agentes ancorantes são usados como no caso do glutaraldeído que permite fixação do poliaminoácido à superfície. Deste modo, foram exploradas outras formas de imobilização da PLL na superfície usando matrizes híbridas (orgânica-inorgânica) obtidas pelo processo sol-gel. 1.5 - Filmes de siloxano-polipropilenoglicol (PPO) preparados por método sol-gel A formação de filmes híbridos, obtidos pelo processo sol-gel, pode oferecer uma matriz físico-quimicamente apropriada para imobilização eficiente de diferentes compostos (GILL, BELLESTEROS, 1998). No processo sol-gel, 42 usualmente, uma molécula do precursor metal alcoóxido de baixo peso molecular (tretrametoxisilano ou tretraetoxisilano), é primeiramente hidrolisado na presença de água, catalisador ácido e solvente. A hidrólise resulta na formação de grupos silanóis (Si-OH) que reagem para a formação de uma suspensão coloidal (sol) e eventualmente gel. Depois desse processo, os solventes são evaporados para formação uma rede de poros sub-micrométricos e cadeias poliméricas. O tamanho da cadeia polimérica (parte orgânica da molécula) influência a compactação das cadeias, assim como, o tamanho dos poros formados. Outro fator importante é o catalisador empregado durante a poli-condensação do precursor, na qual há o empacotamento dos átomos de silício, conferindo maior rigidez à matriz polimérica. Essa é uma característica importante no filme para que o material fique retido (ocluído) no interior dessa matriz híbrida em soluções aquosas para que não seja lixiviado para solução. Diante das vantagens demonstradas pelas matrizes híbridas, é de interesse deste trabalho avaliar a utilização de filmes de siloxano- polipropilenoglicol (PPO) preparados pelo processo sol-gel (DAHMOUCHE et al. 1999), com a estrutura semelhante à mostrada na Figura 2, na tentativa modificar eletrodos de carbono vítreo e aumentar a aderência do poliaminoácido PLL na superfície. (2x) 3(OEt)-Si-(CH2)3–N=C=O(alcoóxido de silício modificado) + (1x) 2NH–CH(CH3)–CH2–(PPO)n–O–CH2–CH(CH3)–NH2(PPO modificado) 3(OEt)–Si-(CH2)3–NH–(C=O)–NH-CH(CH3)-CH2-(PPO)n–O-CH2-CH(CH3)–NH-(C=O)–NH- (CH2)3–Si-(OEt)3 (Precursor Híbrido Siloxano-poli(propilenoglico) 6 H2O HIDRÓLISE 3(OH)–Si-(CH2)3–NH-(C=O)–NH-CH(CH3)-CH2-(PPO)n–O-CH2-CH(CH3)–NH-(C=O)–NH- (CH2)3–Si-(OH)3 + 6EtOH CONDENSAÇÃO HO–Si-(CH2)3-NH-(C=O)-NH-CH(CH3)-CH2-(PPO)n-O-CH2-CH(CH3)-NH-(C=O)-NH- (CH2)3-Si-O-Si-(CH2)3-NH-(C=O)-NH-CH(CH3)-CH2-(PPO)n-O-CH2-CH(CH3)-NH-(C=O)- NH-(CH2)3-Si-OH + H2O Figura 2 - Esquema de reações da síntese e policondensação dos precursores híbridos siloxano- PPO. (Tagliavini et al. 2008) 43 Considerando as características e os êxitos das aplicações de eletrodos modificados com PLL, aliados à capacidade de promover interação eletrostática com ânions, ou exibir grupos amino na forma não-protonada disponíveis para reações específicas com moléculas portadoras de hidroxilas, seria bastante relevante investigar novos métodos eletroanalíticos para determinação de flavonóides em meio aquoso utilizando eletrodos de carbono vítreo modificados por filmes de PLL. Dentro deste contexto, é de interesse desenvolver sensores voltamétricos para determinação de dois flavonóides, quercetina e catequina em amostras de chá verde e extratos de plantas. 1.6 - Quercetina e Catequina Quercetina (QT) é um flavonóide de ocorrência generalizada em plantas (alcaparra, brócolis, alface, espinafre) e alimentos de origem vegetal (cebolas, maçãs além de vários chás). Apresentam em sua estrutura química (Figura 3) grupos hidroxilas adjacentes (orto-difenóis), localizados no anel B da molécula duplas ligações nos anéis benzênicos e dupla ligação da função oxo (-C=O), que em conjunto conferem a esses compostos, alta atividade antioxidante. Figura 3 - Estrutura química do antioxidante quercetina. Seu comportamento eletroquímico tem sido investigado em diferentes materiais eletródicos por diversos autores (ZARE, NAMAZIAN E NASIRIZADE, 2005; ZIELINSKA, NAGELS E PISKULA, 2008, TIMBOLA et al. 2006), bem como B OHO OH OH OH OH O 44 na determinação da capacidade antioxidante em produtos usados na alimentação humana (OSMAN, MAKRIS E KEFALAS, 2008). Segundo (BRETT e GHICA, 2004), a oxidação eletroquímica mostra três picos de oxidação e um pico de redução dependente das condições experimentais. Um processo de oxidação envolvendo dois prótons e dois elétrons no primeiro pico conduzem à formação da orto-quinona correspondente. As catequinas (CT) são encontradas em várias frutas, no vinho tinto, mas as maiores fontes são o chá verde e o chocolate (MANACH, 2004), cuja estrutura química é mostrada na Figura 4. Figura 4 - Estrutura química do antioxidante catequina. A catequina como outros flavonóides, apresenta uma estrutura com dois anéis aromáticos que são ligados por três átomos de carbono que formam um heterociclo oxigenado (MANACH, 2004). O número de grupos hidroxilas nas moléculas da quercetina e catequina no anel B é o mesmo, mas a atividade antioxidante dessas moléculas é bem diferente. A dupla ligação na posição 2,3 e a função oxo (-C=O) no anel C da quercetina promovem uma maior atividade antioxidante quando comparado com a catequina. Entretanto, não são apenas os grupos hidroxilas do anel C que são importantes para a atividade antioxidante dos flavonóides. Os grupos substituintes no anel B têm papel relevante nesta atividade, por ativar/desativar o grupo hidroxila, o qual é responsável pela maior atividade antioxidante em relação à catequina, mas não em relação à quercetina. (RICE-EVANS et al., 1995). O interesse na quantificação de catequina está relacionado à sua identificação e validação de seus benefícios potenciais em termos de saúde humana. A catequina tem sido correlacionada á vários efeitos biológicos e farmacológicos, incluindo antioxidante, anti-carcinogênica, anti-mutagênica, anti- O OH HO OH OH OH A C B 45 inflamatório, e as atividades antimicrobiana além de poder combater os radicais livres que danificam as células humanas sob condições oxidativas causando perturbações graves no metabolismo celular (MASUKAWA, 2006). A determinação e quantificação de catequinas por HPLC têm ocorrido particularmente com detectores espectrofotométricos na região do ultravioleta (MERKEN e BEECHER, 2000; DALLUNGE e NELSON, 2000, WANG, PROVAN e HALLIWELL, 2003), fluorimétricos (NAGAOKA, TOYOSHIMA e TAKEDA, 2002), de massa (DALLUGE e NELSON, 2002) e eletroquímicos (SANO et al., 2001). O mecanismo de oxidação eletroquímico da catequina foi investigado previamente por JANEIRO e BRETT (2004), em ampla faixa de pH, utilizando as técnicas de voltametria cíclica, pulso diferencial e onda quadrada. O mecanismo de oxidação ocorre segundo etapas bem definidas envolvendo o grupamento catecol e é dependente do pH. A oxidação do catecol (3,4-dihidroxila) ocorre em potenciais positivos muito baixos, e é uma reação caracterizada por um processo reversível. Deste modo, pretende-se imobilizar filmes de poli-L-lisina sobre o filme de PPO (PLL/PPO) diminuindo a possibilidade de lixiviação pelo encapsulamento da mesma no interior do polímero. O eletrodo assim modificado será empregado na determinação destes antioxidantes em amostras complexas de chá verde e extrato bruto etanólico de Vatairea macrocarpa. 1.7 - Chá verde A Camellia sinensis (L) O Kuntze é uma planta da família Theaceae, conhecida popularmente por chá verde ou “green tea”. Suas folhas secas possuem cerca de 30% de compostos polifenólicos, cuja principal atividade terapêutica é sua propriedade antioxidante (SIMÕES et al., 2004). O chá, uma das bebidas mais consumidas no mundo, é uma das fontes mais ricas em flavonóides. Produzidos a partir de folhas de Camelia sinensis, o chá verde e preto são largamente consumidos em países orientais e ocidentais, respectivamente. O chá verde é constituído de folhas secas colhidas de diferentes partes da planta, o que determina os vários tipos de chás disponíveis. Já o chá preto passa por diversas etapas de processamento, dentre elas a de 46 “fermentação”, que consiste, na verdade, de uma oxidação enzimática dos flavanóis a teaflavinas, que constituem um grupo característico deste tipo de chá. Os flavonóis, quercetina, miricetina e kaempfero foram quantificados em diversos tipos de chás, encontrando, para chá verde, teores 1,3 para miricetina, 1,6 para quercetina e 1,5 para kaempferol em mg/g de folha seca. (TOYODA et al. ,1997) Os pesquisadores, WANG e HALLIWELL (2000), encontraram valores entre 0,8 a 1,6 e 0,2 a 0,5 de miricetina; 1,8 a 4,0 e 1,0 a 3,0 de quercetina e 1,6 a 3,3 e 1,7 a 2,3 de kaempferol em mg/g de folha seca de quatro tipos de chá verde e dois tipos de chá preto, respectivamente. 1.8 - Extrato bruto etanólico da entre-casca da Vatairea macrocarpa No Brasil, quase toda a população faz uso de plantas medicinais (TEIXEIRA et al., 2006); o uso das plantas é, em muitos casos, único recurso terapêutico disponível. Os conhecimentos etnobotânicos (cultura popular), freqüentemente, guiam as pesquisas com produtos naturais, podendo contribuir para descobertas de fármacos. A importância e a potencialidade química das plantas medicinais podem ser identificadas com dados obtidos em pesquisas científicas, onde se constatou que aproximadamente 25% dos medicamentos prescritos em todo mundo, originam-se de plantas com compostos ativos utilizados em uso comum, (RATTES, 2001). O termo planta medicinal (CALIXTO, 2000) pode ser definido como plantas utilizadas para aliviar, prevenir e curar certas doenças e distúrbios fisiológicos. A Vatairea macrocarpa (Benth) Ducke (Leguminoseae) é uma árvore selvagem nativa de flora brasileira e amplamente distribuída em todo o território brasileiro. É conhecida como Amargosa, por seu gosto amargo, maleiteira ou como Angelim do Cerrado. O chá da Vatairea macrocarpa é extensivamente usado na medicina popular para tratar sintomas de diabete (GUARIM NETO, MORAIS, 2003). O uso tradicional recomenda ferver um pedaço da entrecasca de qual um chá avermelhado amargo é obtido com um rendimento de 2.5% (v/v) de extração. Na medicina popular, o chá da entrecasca desta planta é extensamente usado no combate de Diabetes Mellitus. A atividade anti-diabética do extrato bruto etanólico da entre-casca Vatairea macrocarpa, testada em ratos, mostrou que a 47 longo prazo seu uso poderá ser útil no tratamento de condições diabéticas (OLIVEIRA, et al. 2008). Em estudos recentes, foram isolados do extrato da entre- casca da Vatairea macrocarpa, dois flavonóides a catequina e epicatequina, tendo uma maior porcentagem de massa a forma catequina (PEREIRA, 2008). 48 2 – OBJETIVO O objetivo do presente trabalho é modificar eletrodos de carbono vítreo com filmes do poliaminoácido poli-L-lisina usando diferentes modos de imobilização, dentre eles o uso de filmes híbridos de siloxano-polipropilenoglicol (PPO) preparados por sol-gel. Considerando as características dos eletrodos modificados com PLL, aliados a capacidade de promover interação eletrostática com ânions, ou reações específicas com moléculas portadoras de hidroxilas, pretendem-se aplicar estes eletrodos na determinação de dois flavonóides, quercetina e catequina em amostras de chá verde e extratos de plantas, respectivamente. 49 3. - PARTE EXPERIMENTAL 3.1 – Reagentes, soluções, solventes e amostras 3.1.1 – Reagentes Os padrões dos flavonóides utilizados nos experimentos foram quercetina (QT), rutina (R) e catequina (CT) obtido da Sigma-Aldrich. Os ácidos fenólicos foram os ácido caféico (AC), ácido clorogênico (ACl) e ácido gálico(AG) obtidos da Fluka e ácido ascórbico(AA) da Merck. Os reagentes utilizados em soluções de eletrólito de suporte foram adquiridos das seguintes companhias: ácido acético, ácido bórico, ácido ortofosfórico e hidróxido de sódio (Merck), todos foram de grau de pureza analítico. E para os experimentos cromatográficos foram utilizados solventes Metanol (J. T. Baker) e ácido fórmico (Merck) grau HPLC. 3.1.2 – Soluções e solventes Soluções estoque de Q, CT, R, AA, AC, ACl e AG (0,01 mol L-1) foram preparadas a partir da dissolução de quantidades apropriadas do soluto em metanol (grau HPLC, J. T. Baker) mantidas sob refrigeração até a sua utilização. Soluções diluídas na concentração desejada foram preparadas imediatamente antes das análises por diluição de alíquotas da solução estoque ou por adição de alíquotas da solução estoque diretamente na célula eletroquímica contendo o eletrólito suporte. Para as análises cromatográficas as soluções estoques dos padrões foram filtradas em filtro MILLEX MilliPore (0,45 µm). Metanol (J. T. BAKER), ácido fórmico (MERCK) e água desmineralizada e deionizada em sistema Millipore (Milli-Q) foram utilizados como fase móvel para a separação dos antioxidantes As soluções tampão usadas como eletrólito suporte foram preparadas da seguinte forma: Tampão Britton-Robinson (B-R): mistura de ácido acético 0,04 mol L-1 50 (Merck), ácido bórico 0,04 mol L-1 (Merck) e ácido ortofosfórico 0,04 mol L-1 (Merck). Ajustando-se o pH desejado com hidróxido de sódio 1,0 mol L-1 (Merck). Previamente às medidas eletroquímicas, todas as soluções foram submetidas à desoxigenação através de borbulhamento de gás nitrogênio durante dez minutos. As vidrarias foram previamente lavadas com solução de Extran básico e água destilada e quando necessário colocado no aparelho de Ultra-som (Odontobras 1440D) e posteriormente seco em estufa à 80ºC. Solução de trabalho do polímero Poli-L-Lisina (Sigma) (peso molecular = 32.400) foi obtida pela dissolução direta de 25 mg do composto em 2,5 mL (solução a 1%) em água purificada de qualidade Milli-Q. Alíquotas de 0,1 mL foram mantidas em frasco hermeticamente fechado em freezer e descongeladas diariamente para uso. A solução alcoólica utilizada como catalisador da reação de policondensação da matriz híbrida foi fluoreto de amônio [NH4F] / [Si] = 1,0 x 10-3 mol L-1. 3.1.3 – Síntese do precursor Uma classe de nanocompósitos correspondente aos híbridos siloxano- poliésteres (siloxano-polipropilenoglicol) foi utilizada para a formação dos filmes híbridos orgânico-inorgânico preparados por processo sol-gel. O precursor foi obtido (DAHMOUCHE, et al., 1997) a partir da reação do alcoóxido de silício modificado 3-isocianatopropiltrietoxisilano (IsoTrEOS) e o polímero derivado do siloxano-polipropilenoglicol modificado (NH2-(PPO)n-NH2), de nome comercial Jeffamine (o sub-índice n indica a repetição do monômero). Quantidades equimolares de IsoTrEOS e O,O’ Bis((2-aminopropil)- polipropilenoglicol) (MM = 4000) foram misturadas adequadamente em tetrahidrofurano (THF) e mantidos sob agitação e refluxo à 80ºC por aproximadamente 20 horas. Em seguida o solvente foi extraído com o auxílio de um evaporador rotatório acoplado a uma bomba de vácuo, obtendo-se o híbrido siloxano-polipropilenoglicol puro. A solução do precursor híbrido foi armazenada em frasco de vidro e mantida em dessecador. O precursor foi submetido à reação de hidrólise e condensação resultando na formação de um filme. As quantidades adotadas na preparação dos filmes híbridos orgânicos-inorgânicos foram as seguintes: 1,0 g de precursor, 2,0 mL de 51 etanol contendo o catalisador da reação de condensação NH4F=1,0 x 10-3 mol L-1, 0,4 mL de água. Após agitação, obteve-se um sol homogêneo e transparente. Os filmes obtidos foram utilizados apenas para melhor aderência do poliaminoácido PLL. 3.2 – Experimentos voltamétricos e ponteciométricos As medidas eletroquímicas foram realizadas utilizando-se um potenciostato/galvanostato AUTOLAB modelo PGSTAT 30 (Eco Chemie) interfaceado a um microcomputador e gerenciado pelo software GPES 4.9 (Eco Chemie) para aquisição dos dados. Um sistema convencional de três eletrodos foi usado, composto por um eletrodo de carbono vítreo (ECV) (diâmetro de 2,0 mm) como eletrodo trabalho, um eletrodo de Ag/AgCl (E Ag/AgCl) usado como eletrodo de referência e um fio de platina usado como eletrodo auxiliar. Para este sistema, uma célula convencional com capacidade máxima de 10,0 mL foi usada para as medidas eletroquímicas. Todas as medidas de pH foram realizadas em um elétrodo de vidro combinado (Corning) conectado a um pH-metro digital (Corning, modelo pH/íon analyzer 455). A água deionizada foi purificada com um sistema de Milli-Q (modelo Simplicity 185, Millipore). Para a limpeza das vidrarias e preparo de algumas soluções utilizou-se um Ultrassom Odontobras modelo 1440D. A caracterização dos eletrodos modificados por filmes de PLL/PPO foi realizada testando-se o substrato antes e após a modificação por meio de técnicas voltamétricas. Dentre elas utilizaram-se as técnicas de voltametrica cíclica, onda quadrada e pulso diferencial. As análises foram realizadas por meio da medida de intensidade de corrente em função do potencial aplicado. As medidas foram realizadas pela imersão do eletrodo convencional ou modificado na célula eletroquímica contendo o analito de interesse e subsequentes análises. 3.2.1 – Preparação do eletrodo modificado por filmes de Poli-L-Lisina Primeiramente o eletrodo de carbono vítreo foi polido com alumina 0,3 µm dispersa sobre tecido aveludado, seguido de lavagem com água e depois seco a 52 temperatura ambiente. A obtenção dos filmes de PLL sobre a superfície do filme foi testada usando dois procedimentos conforme descritos a seguir. 3.2.2 – Imobilização A (PLL/PPO*) Filmes de Poli-L-Lisina (PLL) e do híbrido siloxano poliéster (PPO) foram preparados pela mistura de 5μL de solução de PLL (1%) e 0,5 µL de PPO e adicionadas diretamente sobre a superfície do eletrodo. Após a volatilização do solvente, o eletrodo foi submetido a aquecimento em estufa a 80˚C durante 2 minutos com intuito de promover a mudança de conformação do filme de PLL (ANSON, 1980) da forma de α-hélice para planar, proporcionando maior aderência ao eletrodo. 3.2.3 – Imobilização B (PLL/PPO) Filmes de Poli-L-Lisina (PLL) e Sol-Gel do híbrido siloxano poliéster (PPO) foram obtidos pela deposição de 0,5 μL do PPO na superfície do eletrodo seguido de evaporação do solvente resultando na formação de uma fina camada na superfície do eletrodo. Após esse processo uma alíquota de 10 μL de PLL foi colocada sobre esse filme. Após ambos os processos, realizou-se uma etapa da volatilização do solvente em estufa a 80ºC por 10 minutos. 3.2.4 – Incorporação do analito sobre o filme de PLL/PPO A incorporação do analito ao eletrodo recoberto por filmes de PLL foi realizada de duas maneiras: A) incorporação eletroquímica: imersão do eletrodo modificado em solução de 1,0 x 10-3 mol L-1 de quercetina submetido à ciclagem sucessiva do eletrodo entre potenciais de +0,2 a +0,7 V (50 ciclos), e B) através da imersão do eletrodo modificado em um béquer contendo 1,0 x 10-3mol L-1 de quercetina mantido sob agitação com tempo controlado entre 0 a 10 minutos. Completado este período, o eletrodo foi submetido à lavagem em água destilada e transferido para célula eletroquímica contendo solução hidro-etanólica de 50% solução tampão B-R e 50% etanol para quercetina ou somente o eletrólito de suporte para catequina. 53 3.2.5 – Determinação de quercetina em chá verde A solução de chá verde foi preparada com amostras de chá verde da marca Mate Leão. O preparo do chá foi através da infusão de 1g de chá verde por 10 minutos em água Milli-Q em ebulição (LIMA, MELO E LIMA, 2004), para maior extração dos compostos fenólicos. Em seguida, a infusão foi filtrada á vácuo em papel de filtro sendo resfriada em temperatura ambiente. Alíquota de 5 μL dessa solução foi transferida diretamente para um béquer contendo 10 mL de solução hidro-etanólica pH 2,0. O eletrodo modificado pelo filme de PLL/PPO foi imerso nesta solução agitando-se durante 10 minutos. Em seguida, este eletrodo foi transferido para uma célula eletroquímica e os voltamogramas de onda quadrada foram registrados (f = 75hz, amplitude de pulso de 50 mV e incremento potencial 2 mV). Os valores das correntes de pico foram obtidos e a concentração da QT foi determinada através do método da adição de padrão (HARRIS, 2001), adicionando-se alíquotas de uma solução 7,5 x 10-8 mol L-1 de quercetina a amostra original. Esta solução foi submetida ao tempo de deposição de 8 minutos e os voltamogramas foram registrados após cada adição. 3.2.6 – Determinação de catequina em extrato bruto etanólico de Vatairea macrocarpa sobre eletrodo de carbono vítreo modificado por filme PLL/PPO A análise de catequina foi realizada em amostras de extrato bruto etanólico (EBEtOH) de Vatairea macrocarpa (planta típica do cerrado matogrossense) obtido após coleta do material secagem em estufa a 40°C e posterior trituramento. Ao pó foi adicionada uma solução etanólica 70% (v/v) a qual foi macerada durante sete dias à temperatura ambiente. Posteriormente, o extrato foi filtrado e concentrado por rota-evaporação. O solvente residual foi evaporado em estufa a 40ºC e o extrato obtido armazenado sob refrigeração. A abordagem fitoquímica do extrato apresentou teste positivo para várias classes de antioxidantes inclusive a catequina. Uma massa de 0,05 mg do extrato foi transferida para célula eletroquímica e o volume completado para 10 mL com solução tampão B-R (pH 4,0), esta solução foi submetida à análise voltamétrica utilizando-se o eletrodo modificado 54 com PLL/PPO. Após prévio tempo de acúmulo (10 minutos) os voltamogramas de pulso diferencial foram registrados no intervalo de 0,2 a 0,6 V sob as seguintes condições: � = 5 mVs-1, amplitude de pulso de 50 mV e incremento potencial 2 mV). A quantificação foi realizada pelo método da adição de padrão, na qual se realizou três adições de CT, resultando em concentrações finais de 1,0, 2,0 e 3,0 x 10-7mol L-1. 3.3 – Experimentos Cromatográficos As análises em cromatografia líquida de alta eficiência com detecção de arranjo de diodo foram efetuadas em um cromatógrafo líquido Shimadzu HPLC SCL-10AVP, degaseificador DGV-14 A, mixer FCV-10ALVP, bomba LC-10ATVP, auto-injetor SIL-10ADVP, forno CTO-10AVP e válvula de injeção Rheodyne 7725i. A separação dos componentes foi efetuada utilizando-se uma coluna analítica de fase reversa Phenomenex� Luna C-18 (2) (250,0 x 4,6 mm, 5 µm), que possui uma pré-coluna Phenomenex� (SecurityGuard Holder, Phenomenex�, C-18, 4,0 � 3,0 mm). Todas as amostras foram filtradas, antes de cada injeção com auxílio de uma seringa em filtros MILLEX Millipore (0,45 µm). O sistema cromatográfico foi estabilizado pela passagem da fase móvel na proporção e vazão requerida para as análises. Após a estabilização, as soluções contendo a mistura dos analitos foram filtradas em membranas filtrante 0,45 �m (Millipore) e injetadas (20 �L). Para a realização da corrida cromatográfica utilizou-se a fase móvel ácido fórmico/água 0,1% (v/v) (solvente A) e metanol (solvente B) com vazão de 1 mL por minuto e volume de injeção de 20 µL, método gradiente Fase móvel: (A) ácido fórmico 0,1% e (B) metanol com rampa de 5-50% de B (9 min.), 50-70% B (15 min.) 70-5% B (18 min.). O comprimento de onda usado foi 285 nm para todos. 3.3.1 – Determinação de quercetina em amostras de chá verde por cromatografia. A extração dos fenólicos das amostras de chá verde foi baseado no trabalho desenvolvidos por Spáčil (2008) com algumas modificações. Para tanto, 55 foram realizados estudos de recuperação com os antioxidantes em três níveis de forticação, realizando-se três repetições, avaliando alguns parâmetros de validação, tais como exatidão e precisão. A solução de chá verde foi preparada com amostras de chá verde da marca Mate Leão. O preparo do chá foi através da infusão de 1,0 g de chá verde por 10 minutos em 100 mL água Milli-Q aquecida (LIMA, MELO E LIMA, 2004), para maior extração dos fenólicos. Em seguida, 25 mL da amostra foi transferida para um balão volumétrico de 50 mL o qual foi completado com metanol. Aproximadamente 2 mL dessa solução foram filtradas em filtro Millex Millipore (0,45 µm) e 20 µL dessa amostra foram injetadas no CLAE-DAD. 3.4 – Experimentos espectrofotométricos Um espectrofotômetro Hewlett Packard (modelo 8453) equipado com célula de quartzo com 1,0 cm de caminho ótico e operando em um intervalo de comprimento de onda de 190 a 1200 nm foi usado para as medidas espectrofotométricas. 3.4.1 – Determinação de flavonóide e ácidos fenólicos em amostras de chá verde por espectrofotometria Uma alíquota de 1,0 mL de chá verde foi adicionada em balão de 5 mL completado com solução hidro-etanólica (solução tampão B-R/etanol), em seguida alíquotas de 10,0 µL da solução estoque (1,0 x 10-3 mol L-1) dos padrões foram adicionadas. A absorbância foi medida monitorando os sinais de comprimento de onda utilizando a solução hidro-etanólica como branco. 3.4.2 – Obtenção da curva analítica e determinação da catequina em amostra de extrato bruto etanólico de Vatairea macrocarpa por espectrofometria A curva analítica para CT foi obtida no intervalo de concentração de 1,0 x 10-5 a 1,0 x 10-4mol L-1, utilizando-se soluções previamente preparada pela dissolução do padrão em etanol. A absorbância foi medida monitorando o máximo 56 de sinal em comprimentos de onda de 280 nm, utilizando solução tampão B-R como branco. A quantificação de CT em amostras de extrato bruto etanólico de Vatairea macrocarpa foi realizada pelo método de adição do padrão, a partir da diluição de 5 �L da amostra fortificada com 1,0 x 10-5 mol L-1 de CT para 5 mL da solução tampão B-R. A mistura resultante foi submetida à análise espectrofotométrica, registrando espectros na região do visível e o máximo de absorbância foi medida em comprimentos de onda de 280 nm. 57 4 – RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1 - Comportamento voltamétrico da QT sobre eletrodo de carbono vítreo A oxidação voltamétrica de solução hidro-etanólica (tampão B-R/etanol) de 1,0 x 10-6 mol L-1 de QT em pH 2,0 foi investigada sobre eletrodo de carbono vítreo e mostrada na Figura 5. 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 -0,2 -0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 I / � A E / V vs. E Ag/AgCl Figura 5 - Voltamograma cíclico correspondentes à oxidação de 1,0 x 10-6 mol L-1 de QT sobre ECV em solução hidro-etanólica pH 2,0. � = 50 mVs-1. A análise da Figura 5 mostra que QT, em meio ácido (pH 2,0), apresenta um pico de oxidação bem definido ao redor de +0,45 V (pico I). Já na varredura reversa, observa-se um pico de redução do produto em Epc = 0,410 V e separado por ΔEp = 25 mV do pico anódico. A relação entre a corrente de pico catódica e anódica (Ipa/Ipc) é 1,00, para todos os valores de pH estudados, sugerindo que o processo de oxidação de QT sobre eletrodo de carbono vítreo é caracterizado por 58 um processo reversível (BARD, FAULKNER, 2001), envolvendo a transferência de 2 elétrons. Segundo Ghica e Brett (2003), este pico está relacionado à oxidação dos grupos catecóis do anel B e envolve um processo de transferência reversível de dois elétrons e dois prótons com formação do radical semi-quinona como intermediário, de acordo com esquema apresentado no Esquema 1. Esquema 1 – Esquema de oxidação da quercetina. (Ghica e Brett, 2003). Voltamogramas cíclicos obtidos em ampla janela de potencial mostra que QT apresenta ainda mais dois picos de oxidação de pequena intensidade em potenciais de +0,65 V (pico II) e +0,81 V (pico III), como mostra a Figura 6. -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 -0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 I / � A E / V vs. EAg/AgCl II III Figura 6 - Voltamograma cíclico correspondentes à oxidação de 1,0 x 10-6 mol L-1 de QT sobre ECV em solução hidro-etanólica pH 2,0. � = 50 mVs-1. -e-, H+-e-, H+ OHO OH OH OH O O OHO OH OH O O O OHO OH OH OH OH O B B B 59 Estes resultados estão em concordância com aqueles obtidos na literatura para oxidação de QT sobre eletrodo de carbono vítreo (Hendrikson,1994; Yang, 2001, Brett e Ghica, 2003 e Nematollahi, 2003, e Timbola, 2006). 4.2 – Eletrodos de carbono vítreo modificados por filmes de Poli-L-Lisina (PLL) Nesta primeira etapa do trabalho, investigou-se a formação de filme de PLL utilizando as diferentes metodologias descritas acima, visando obter um sensor voltamétrico para antioxidantes. Considerando, que usualmente o anel catecol da QT é oxidado segundo um processo reversível de dois elétrons em potenciais de 0,45V / 0,41V (BRETT e GHICA, 2003), esta foi utilizada como composto modelo pra testar o efeito de pré-concentração e estabilidade destes filmes. A resposta voltametrica dos filmes de PLL imobilizad