Carlos Roberto de Souza Camilo Estudo por dinâmica molecular da ação do colesterol sobre o acoplamento entre as faces de bicamadas fosfolipídicas. São José do Rio Preto 2017 Campus de São José do Rio Preto Carlos Roberto de Souza Camilo Estudo por dinâmica molecular da ação do colesterol sobre o acoplamento entre as faces de bicamadas fosfolipídicas. Dissertação apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Biofísica Molecular, junto ao Programa de Pós-Graduação em Biofíscia Molecular, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto. Financiadora: CAPES Orientador: Prof. Dr. José Roberto Ruggiero São José do Rio Preto 2017 Estudo por dinâmica molecular da ação do colesterol sobre o acoplamento entre as faces de bicamadas fosfolipídicas. Camilo, Carlos Roberto de Souza. Estudo por dinâmica molecular da ação do colesterol sobre o acoplamento entre as faces de bicamadas fosfolipídicas. / Carlos Roberto de Souza Camilo . -- São José do Rio Preto, 2017 138 f. : il., tabs. Orientador: José Roberto Ruggiero Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas 1. Biologia molecular. 2. Biofísica. 3. Dinâmica molecular. 4. Colesterol. 5. Curcumina. 6. Bicamadas fosfolipídicas. 7. Polifenóis. I. Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho". Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas. II. Título. CDU – 539.2 Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca do IBILCE UNESP - Câmpus de São José do Rio Preto Carlos Roberto de Souza Camilo Estudo por dinâmica molecular da ação do colesterol sobre o acoplamento entre as faces de bicamadas fosfolipídicas. Dissertação apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Biofísica Molecular, junto ao Programa de Pós-Graduação em Biofíscia Molecular, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto. Financiadora: CAPES Comissão Examinadora Prof. Dr. José Roberto Ruggiero UNESP – São José do Rio Preto Orientador Prof. Dr. Jorge Chahine UNESP – São José do Rio Preto Prof. Dr. Roberto Dias Lins Neto FIOCRUZ – Recife São José do Rio Preto 28 de Abril de 2017 gcq#480: "The most exciting phrase to hear in science, the one that heralds new discoveries, is not Eureka but That's funny… ." Isaac Asimov “A ciência, meu rapaz, é feita de erros, mas de erros que é bom cometer, pois conduzem pouco a pouco à verdade.” Jules Verne Viagem ao Centro da Terra (1864) AGRADECIMENTOS Este trabalho é inteiramente dedicado à José Roberto Ruggiero, orientador, professor, conselheiro, amigo, e foi concluído graças à sua dedicação e auxílio. Pela formação, agradeço à todos os professores do Departamento de Física do IBILCE/UNESP e docentes do Programa de Pós-Graduação em Biofísica Molecular e, em especial, aos professores Leandro Cristante de Oliveira e Alexandre Suman de Araujo, pela avaliação do trabalho na Qualificação e conselhos durante minha formação; aos professores Jorge Chahine, Márcia Perez dos Santos Cabrera, Gustavo O. Bonilla Rodriguez e Sidney Jurado de Carvalho, sempre disponíveis para conversas e auxílio. Agradeço ao Conselho do Programa de Pós-Graduação em Biofísica Molecular, na pessoa de seu coordenador, professor Marinonio Lopes Cornelio. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pelo suporte financeiro. Aos meus colegas de curso e, em especial à Josimar Fernando da Silva e Mirian Guerra. E, à minha mulher, Adriana Pereira da Silva, pelo companheirismo, dedicação e apoio fundamentais, mas também pelas críticas, incentivo e revisão do trabalho. RESUMO Simulações de bicamadas fosfolipídicas por dinâmica molecular são uma alternativa para o estudo computacional de propriedades estruturais e dinâmicas de membranas biológicas e de sua interação com outras moléculas. O colesterol é um importante componente lipídico das membranas de eucariotos e induz grandes alterações nas propriedades de uma membrana. Sua ação produz a coesão do plano da bicamada, induzindo o ordenamento das caudas dos fosfolipídios e o aumento da espessura. Este estudo avalia os efeitos da concentração de colesterol em bicamadas POPC, e revela que o colesterol reduz o acoplamento das faces da bicamada, com consequente redução da interação entre as duas faces constituintes; afeta também o acesso da água ao interior da estrutura, agindo principalmente sobre as caudas insaturadas do fosfolipídio. A curcumina é um polifenol que têm associado à diversas atividades terapêuticas, inclusive ação antioxidante. Este trabalho avalia também a interação e estabilização de uma molécula de curcumina em bicamadas POPC com ou sem colesterol, e revela que o flavonoide se internaliza à estrutura, mas a posição em relação à bicamada e sua conformação de estabilidade são alteradas pela presença do colesterol. Palavras-chave: Bicamadas fosfolipídicas. Colesterol. Acoplamento entre as faces de uma bicamada. Dinâmica molecular. Curcumina. Polifenóis. ABSTRACT Molecular dynamics simulations of phospholipid bilayers are an alternative for the computational study of structural and dynamic properties of biological membranes and their interaction with other molecules. Cholesterol is an important lipid component of eukaryotic membranes and it induces large changes in the properties of a membrane. Its action produces the lateral condensation of the bilayer, inducing the ordering of the tails of the phospholipids and increasing the bilayer thickness. This study evaluates the effects of cholesterol concentration on POPC bilayers, and reveals that cholesterol reduces de interleaflet coupling of the bilayer, with consequent reduction of the interaction between the two leaflets; also affecting the access of water to the interior of the structure, acting mainly on unsaturated tails of the phospholipid. Curcumin, a polyphenol, has been associeted with various therapeutic activities, including antioxidant action. This work also evaluates the interaction and stabilization of a curcumin molecule in POPC bilayers with or without cholesterol, and shows that the flavonoid is internalized to the structure, but the position in relation to the bilayer and its conformation of stability are altered by the presence of cholesterol. Keywords: Phospholipidic bilayers. Cholesterol. Interleaflet coupling. Molecular Dynamics. Curcumin. Polyphenols. LISTA DE FIGURAS 1.1 – Microscopia de um corte de célula mostrando a membrana plasmática e os meios celular e externo... 1.2 – Ilustração de uma micela e de uma bicamada…………………………………………………………. 1.3 – Agregação de lipídios de caudas saturadas e mistura de lipídios de caudas saturadas e insaturadas…. 1.4 – Esquematização da estrutura de um fosfolipídio……………………………………………………… 2.1 – Representação dos potenciais de interação harmônicos Vl e Vθ e do potencial torcional Vφ …………. 2.2 – Representação do potencial diedral impróprio………………………………………………………... 2.3 – Ilustração de uma molécula de POPC na representação de todos os átomos e de átomos unidos……. 2.4 – Ilustração esquemática do método de integração leap-frog…………………………………………… 2.5 – Representação da idealizada das condições periódicas de contorno…….……………………………. 2.6 – Ilustração de modelos de três e quatro sítios para representação da molécula de água…….…………. 2.7 – Distribuição da radial de pares entre Oágua-Oágua para os modelos SPC e TIP3P………………………. 3.1 – Estrutura química de uma molécula de POPC (1-palmitoil-2-oleoilfosfatidilcolina)………………… 3.2 – Gráfico da oscilação da pressão do sistema com uma bicamada POPC pura…………………………. 3.3 – Oscilação da temperatura da caixa de simulação – bicamada POPC pura……………………………. 3.4 – Oscilação da energia potencial da caixa de simulação – bicamada POPC pura………………………. 3.5 – Energia de interação (Coulomb e VdW) entre os lipídios constituintes da bicamada POPC pura……. 3.6 – Energia de interação (Coulomb e VdW) entre os lipídios da bicamada e as moléculas de água……... 3.7 – Oscilação das dimensões da caixa de simulação – bicamada POPC pura…………………………….. 3.8 – Projeção frontal (plano xz) da posição dos átomos de fósforo das moléculas de POPC…………….... 3.9 – Ilustração da decomposição de um plano em diagramas de Voronoi…………………………………. 3.10 – Oscilação da área por lipídio da bicamada POPC pura……………………………………………… 3.11 – Visualização do sistema contendo uma bicamada POPC pura………………………………………. 3.12 – Perfil de densidade para a bicamada POPC pura…………………………………………………….. 3.13 – Comparação do perfil de densidade do grupo fosfato e dos átomos de fósforo do POPC…………... 3.14 – Oscilação da espessura da bicamada POPC pura……………………………………………………. 3.15 – Parâmetro de ordem (SCD) para as caudas saturadas da bicamada POPC pura…………………….… 3.16 – Perfil de densidade dos grupos CH3 terminais – comparação entre a face inferior e superior……..... 3.17 – Comparação do perfil de densidade CH3 terminais das caudas saturadas e insaturadas…………….. 14 15 16 18 28 28 29 31 34 36 37 43 45 46 46 47 48 49 50 50 51 53 53 55 56 57 59 60 3.18 – Perfil de densidade dos CH3 terminais da face superior – comparação em relação ao tipo de cauda.. 4.1 – Estrutura química da molécula de colesterol………………………………………………………….. 4.2 – Representação do sistema contendo uma bicamada mista POPC/Colesterol…………...…………….. 4.3 – Comparação da energia de interação (Coul.) estabelecida entre os lipídios das bicamadas…………... 4.4 – Comparação da energia de interação (VdW) entre os lipídios das diferentes bicamadas POPC/Col…. 4.5 – Interação lipídios-água (Coul.) nas bicamadas de diferentes concentrações de colesterol………….… 4.6 – Interação lipídios-água (termo van der Waals) nas diferentes bicamadas POPC/Colesterol………….. 4.7 – Comparação dos perfis de densidade nas bicamadas de diferentes concentrações de colesterol……... 4.8 – Área por lipídio nas bicamadas de diferentes concentrações de colesterol…………………………… 4.9 – Oscilação da espessura das bicamadas POPC/Colesterol……………………………………………... 4.10 – Parâmetro de ordem das caudas saturadas das bicamadas de diferentes concentrações de colesterol. 4.11 – Parâmetro de ordem das caudas insaturadas das bicamadas POPC/Colesterol……………………… 4.12 – Representação de uma molécula de POPC com as caudas desordenadas (a) e ordenadas (b)………. 4.13 – Energia de interação POPC-POPC (Coulomb) nas diferentes bicamadas…………………………… 4.14 – Energia de interação POPC-POPC (van der Waals) nas diferentes bicamadas……………………… 4.15 – Energia de interação POPC-Colesterol (Coul. e VdW) nas diferentes bicamadas…………………... 4.16 – Energia de interação Colesterol-Colesterol (Coul. e VdW) nas bicamadas mistas………………….. 4.17 – Comparação perfil de densidade carbonilasPOPC com a distribuição da água nas bicamadas………... 4.18 – Distribuição radial de pares entre os átomos de fósforoPOPC e as moléculas de água………………… 4.19 – Comparação perfis de densidade CH3 terminais face superior x face inferior………………………. 4.20 – Comparação perfis de densidade CH3 terminais caudas saturadas x caudas insaturadas……………. 4.21 – Comparação perfis de densidade CH3 terminais caudas saturadas x insaturadas na face superior.….. 4.22 – Quantidade de moléculas de água calculada a partir dos CH3 terminais – comparação tipo de cauda 4.23 – Energia de interação (Coul. e VdW) interna à monocamada superior, e inferior – bicamada 20%…. 4.24 – Energia de interação (Coul. e VdW) entre a monocamada superior e inferior – comparação……….. 5.1 – Estrutura química molécula de curcumina………...…………………………………………………... 5.2 – Ilustração configuração inicial e final – (A) curcumina inserida na fase aquosa……………………... 5.3 – Ilustração configuração inicial e final – (B) curcumina inserida dentro da bicamada (fase lipídica)… 5.4 – Ilustração configuração inicial e final – (C) automontagem da bicamada em presença da curcumina.. 5.5 – Processo de automontagem acompanhado através da projeção em z das coordenadas átomos PPOPC ... 61 64 67 68 68 69 69 71 72 73 74 74 74 76 76 77 77 82 84 86 88 89 91 92 93 97 101 103 103 105 5.6 – Molécula de curcumina na representação de átomos unidos e átomos de interesse marcados………... 5.7 – Interação entre curcumina e bicamadas 0% colesterol (métodos A, B e C)…………………………... 5.8 – Interação entre curcumina e bicamadas 20% colesterol acompanhada através projeção em z……….. 5.9 – Interação entre curcumina e bicamadas 40% colesterol………………………………………………. 5.10 – Comparação (SCD) das caudas saturadas – bicamadas 20% colesterol com e sem curcumina………. 5.11 – Comparação (SCD) das caudas insaturadas – bicamadas 20% colesterol com e sem curcumina…….. 5.12 – Perfil de densidade bicamada com curcumina – exemplo da bicamada com 20% colesterol……….. 5.13 – Perfis de densidade átomos marcados – bicamadas 0% colesterol (informação conformação)……... 5.14 – Perfis de densidade átomos marcados na curcumina – bicamadas 20% colesterol………………….. 5.15 – Perfis de densidade átomos marcados na curcumina – bicamadas 40% colesterol………………….. 5.16 – Histograma do ângulo estabelecido pelos átomos marcados (informação sobre a conformação)…… 5.17 – Distribuição radial de pares entre os átomos H-hidroxilaCurcumina e as moléculas de água……………. 106 107 108 109 113 113 115 118 119 120 122 123 LISTA DE TABELAS 1.1 – Principais fosfolipídios de interesse biológico………………………………………………………... 4.1 – Ligações H estabelecidas pelos lipídios nas bicamadas de diferentes concentrações de colesterol…... 4.2 – Área média ocupada por molécula de lipídio (APOPC e ACol.) nas diferentes bicamadas……………….. 4.3 – Espessura e distâncias CarbonilasPOPC-CarbonilasPOPC e NPOPC-NPOPC nas diferentes bicamadas.…….... 5.1 – Área por lipídio e espessura nas diferentes bicamadas – comparação sistemas com e sem curcumina. 5.2 – Distância curcumina – plano da bicamada nos diferentes sistemas…………………………………… 5.3 – Interação energética total (Coul. + VdW) entre a curcumina e demais componentes dos sistemas…... 5.4 – Ligações H estabelecidas entre curcumina e os demais componentes dos sistemas………………….. A1 – Composição das caixas e tempo total de simulação………………………………………………….. A2 – Composição das bicamadas, por face…………………………………………………………………. 18 79 81 83 111 116 124 124 134 135 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ATB - Automated Topology Builder and Repository Col. - Colesterol Curc. - Curcumina DOPC – dipalmitoilfosfatidilcolina GROMACS – Groningen Machine for Chemical Simulations GROMOS – Campo de forças lo – liquid-ordered ld – liquid-disordered MemGen – Membrane Generator MD – Molecular Dynamics POPC – 1-palmitoil-2-oleoilfosfatidilcolina Pref – Pressão de referência RMN – Ressonância Magnética Nuclear SPC – Modelo para representação computacional da molécula de água TIP3-P – Modelo computacional para a representação da molécula de água Tm – Temperatura de transição de fase (melting temperature) Tref – Temperatura de referência SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO 1.1 Lipídios e Membranas Biológicas…………………………...……………………….……………….. 1.2 Lipídios em Solução Aquosa………………………………...……………………….……………….. 1.3 Fosfolipídios………………….……………………………...……………………….……………….. 1.4 Colesterol…………………….……………………………...………………………………………... 1.5 Interação entre as Monocamadas de uma Membrana………...………………………………………. 1.6 Peroxidação Lipídica e Polifenóis…………………………...……………………….……………….. 1.6.1 Curcumina…………………………………………...……………………………….………….. 1.7 Simulação Computacional de Sistemas Biológicos….……...………………………………………... 1.8 Objetivos……………….…………………………………...………………………...………………. 2 METODOLOGIA 2.1 Dinâmica Molecular…………...……………………………………………………....……………… 2.1.1 Campo de forças………………………………………………………………....………………. 2.1.2 Equações de movimento e integração numérica………………………………...………………. 2.1.3 Condições iniciais, minimização e equilibração………………………………...………………. 2.1.4 Ensemble e controle de temperatura e pressão…………………………………....……………... 2.1.5 Caixa de simulação e condições periódicas de contorno………………………...……………… 2.1.6 Mínima imagem, raio de corte e interações de curto e longo alcance………………………...… 2.1.7 Solvatação e modelos para a molécula de água……………………………………………...….. 2.1.8 Pacotes de Simulação……………………………………………………………….………...…. 2.2 Estrutura e Topologia das Moléculas……………………………………………….……………..….. 2.3 Parâmetros de Simulação………………………………………………………...…………………… 2.3.1 Construção das caixas de simulação………………………………………...…………………... 2.3.2 Análise das trajetórias………………………...………………………...……………………….. 3 SIMULAÇÃO DE BICAMADAS FOSFOLIPÍDICAS 3.1 Introdução……………………………...……………………………………………………………... 3.2 POPC…………………………………...………………………………………………………….….. 3.3 Simulação de uma Bicamada POPC Pura……...………………………………………………….….. 3.3.1 Estabilidade do sistema………………………………………………………………………….. 3.4 Análise da Bicamada………..…………………..…………………………………………………….. 3.4.1 Área por lipídio…………………………...……………………………………………………... 3.4.2 Análise da estrutura da bicamada………………………………………………………………... 3.4.3 Espessura da bicamada…………………………………………………………………………... 3.4.4 Parâmetros de ordem………………………………………………………………………....….. 3.4.5 Acoplamento entre as faces da bicamada………………………………………………………... 14 15 17 19 20 22 23 24 25 26 26 30 32 32 33 35 36 38 38 40 41 41 42 43 44 44 48 48 52 54 56 58 3.5 Conclusão…………………………………………………………………………………………….. 4 AÇÃO DO COLESTEROL EM BICAMADAS FOSFOLIPÍDICAS 4.1 Introdução…………………………………………………………………...………………………... 4.2 Simulações de Bicamadas Contendo Colesterol…………………………..…………………………. 4.3 Efeitos da Concentração de Colesterol em Bicamadas POPC………..……..………………………... 4.3.1 Estabilidade das bicamadas…………………………………………...…………………………. 4.3.2 Estruturação das bicamadas…………………………………………...………………………… 4.3.3 Área por lipídio, espessura da bicamada e parâmetro de ordem…………………………...……. 4.3.4 Ação do colesterol sobre as interações energéticas na bicamada.……...………………………... 4.3.5 Efeitos sobre a hidratação das bicamadas……………………………...………………………... 4.3.6 Ação sobre o acoplamento entre as faces das bicamadas…….………...………………………... 4.4 Conclusão…………………………………………………………….……………………………….. 5 CURCUMINA 5.1 Introdução………………………………………………………………...…………………………... 5.2 Interação da Curcumina com Bicamadas de Diferentes Concentrações de Colesterol……………..... 5.2.1 Método A: inserção da curcumina na fase aquosa………………………...……….……………. 5.2.2 Método B: inserção da curcumina na fase lipídica………………………...……………………. 5.2.3 Médoto C: automontagem da bicamada em presença da molécula de curcumina....………….... 5.2.4 Resultados………………………………………………………………………….……………. 5.3 Efeitos da Curcumina sobre as Propriedades da Bicamada…………………………….…………….. 5.4 Estabilização da Molécula de Curcumina…………………………………………………………….. 5.5 Conformação da Molécula no Ambiente de Bicamada………….…………….……….……………... 5.6 Interações Energéticas Estabelecidas pela Curcumina……………….………………………………. 5.7 Conclusão………………………………………...…………………………………………………... REFERÊNCIAS APÊNDICE – Resumo das simulações e composição dos sistemas estudados………..…………………... 62 63 64 66 67 70 72 75 82 85 94 96 99 100 102 104 105 110 115 117 123 125 127 134 14 1. INTRODUÇÃO 1.1 Lipídios e Membranas Biológicas "A primeira célula provavelmente veio a existir quando uma membrana formou-se, delimitando um pequeno volume de solução aquosa e separando-a do resto do ambiente" (Nelson e Cox, 2004). A compartimentalização de moléculas em um ambiente isolado consistiu num processo fundamental para evolução das moléculas abióticas em sistemas mais complexos e o surgimento da vida. Membranas biológicas são as estruturas responsáveis pela separação do conteúdo celular do resto do ambiente (ver Figura 1.1); seu componente fundamental são os lipídios – moléculas orgânicas anfipáticas ou hidrofóbicas. Moléculas de lipídios desempenham diversas funções em organismos vivos, sendo classificadas de acordo com suas características moleculares; as principais classes de lipídios de importância biológica são os esteroides (como o colesterol), que desempenham funções de sinalização hormonal entre tecidos e também sinalização intracelular, e os ácidos graxos, ou ácidos graxos esterificados ao glicerol (mono, di ou triglicerídeos), que constituem a principal forma de armazenamento de energia em organismos superiores. Glicerídeos podem ser modificados com a adição de um grupo fosfato ao glicerol dando origem a moléculas chamadas de fosfolipídios, as componentes estruturais das membranas biológicas. Figura 1.1 – Microscopia de um corte de célula. A membrana plasmática delimita o ambiente celular, propiciando um microambiente com características distintas das do meio externo. Extraída de Nelson e Cox, 2004. 15 1.2 Lipídios em Solução Aquosa Ácidos graxos são cadeias longas de átomos de carbono cujas ligações podem ser completamente saturadas, ou conter várias insaturações. A esterificação de ácidos graxos ao glicerol dá origem a moléculas anfipáticas (apresentam uma região hidrofílica, solúvel em água, e outra hidrofóbica, insolúvel): os glicerídeos. Em solução aquosa, as interações hidrofóbicas tendem agrupar as cadeias de carbono, que são apolares, minimizando sua superfície de contato com a água e expondo somente grupos polares à região hidratada. A estrutura formada depende da quantidade de cadeias de ácidos graxos e também da quantidade de insaturações presentes nestas. Lipídios de apenas uma cadeia carbônica apresentam simetria cônica e tendem a agrupar-se em estruturas globulares (que podem ter alta excentricidade) chamadas micelas (ver Figura 1.2a). A simetria cilíndrica de lipídios de duas cadeias carbônicas, entretanto, lhes confere a possibilidade de agrupar-se em estruturas constituídas por duas camadas antiparalelas, as chamadas bicamadas (Figura 1.2b); os componentes fundamentais das bicamadas são os fosfolipídios e sua organização estrutural é a chave para a formação das membranas biológicas. Figura 1.2 – Micela (a) e bicamada (b), duas possibilidades de organização estrutural de lipídios em água: a geometria dos lipídios constituintes, principalmente de suas caudas, determina a estrutura formada. Adaptada de Averill e Eldredge, 2007. A duas monocamadas, ou faces, de uma bicamada são organizadas de forma que as cadeias de carbono, aqui chamadas de caudas, estejam internas à estrutura, enquanto que os grupos polares, aqui chamados de cabeças, ficam voltadas para o lado externo, em contato 16 com a água. Esta organização propicia uma separação de fases no sistema, definindo um ambiente aquoso interno e outro externo (as bicamadas são estruturas fechadas), além da região hidrofóbica das caudas, onde podem estar presentes outras moléculas apolares. Existe ainda uma terceira possibilidade estrutural, as lipossomas, que são estruturas esféricas formadas por bicamadas concêntricas. Tais estruturas são vesículas que mantém um microambiente interno isolado do meio e por isso desempenham papel no transporte de substâncias (peptídeos, proteínas, genes não-virais, etc.) que precisam ser mantidas em seu meio nativo para permanecerem biologicamente ativas. Micelas, bicamadas e lipossomas são estruturas lipídicas observadas em solução aquosa devido à característica anfipática dos lipídios (gliceróis e fosfolipídios). Sua formação ocorre por interações hidrofóbicas1, mas sua estabilização é devida a interações do tipo van der Waals entre seus componentes, e ligações de hidrogênio entre as cabeças dos lipídios. A estabilização de tais estruturas depende não somente das características das cabeças polares dos lipídios que as constituem, mas também das de suas caudas (tamanho e quantidade de insaturações). A dupla ligação presente nas insaturações das cadeias de carbono impõem restrições ao movimento das caudas e lhes confere uma torção – característica que afeta a acomodação das caudas em estruturas lipídicas devido a impedimentos estéricos (Figura 1.3). Figura 1.3 – A presença de insaturações nas caudas dos lipídios (em amarelo; as cabeças são apresentadas em azul) afeta as propriedades da estrutura formada pelas moléculas em solução aquosa: a) estrutura viscosa formada por ácidos graxos saturados; b) estrutura fluida constituída por uma mistura de ácidos graxos saturados e insaturados (as insaturações estão destacadas em rosa). Extraída de Nelson e Cox, 2004. 1 O contato da água (ou outro solvente polar) com moléculas apolares reduz seus graus de liberdade; na tentativa de restituir os graus de liberdade perdidos, as moléculas de água tendem a interagir somente entre si ou com moléculas polares, isolando e agrupando moléculas apolares. É a interação hidrofóbica, portanto, que promove a agregação de moléculas ou grupos apolares quando em solução aquosa. 17 1.3 Fosfolipídios Fosfolipídios são compostos por moléculas de glicerol esterificadas por duas cadeias de ácidos graxos, enquanto que a terceira hidroxila da molécula é modificada por um grupo fosfato. Um dos oxigênios do fosfato está ligado a um grupo substituinte que confere propriedades características ao fosfolipídio. Fosfolipídios normalmente apresentam uma cadeia saturada e uma insaturada2, e o tamanho destas pode variar (ver Figura 1.4). Os átomos presentes no grupo característico de um fosfolipídio conferem características próprias à molécula pois são eles que definem a carga total do lipídio, podendo compensar a carga negativa do fosfato, tornando o fosfolipídio zwitteriônico, ou lhes conferindo outros valores de carga líquida (ver Tabela 1.1). A quantidade e a organização dos átomos do grupo característico podem interferir também na geometria da molécula. Fosfolipídios são os componentes estruturais fundamentais de membranas pois são eles que definem e estabilizam estruturas em bicamada; eles não são os componentes majoritários em massa das membranas celulares – perfazem de 20~40% do "peso seco", dependendo do organismo e do tipo de célula (Nelson e Cox, 2004) – mas é o seu comportamento em solução aquosa que possibilita a formação de membranas e a necessária separação das fases do sistema para que haja a compartimentalização do ambiente. O fato de bicamadas serem estabilizadas por interações do tipo van der Waals e Coulomb, ligações de hidrogênio, e efeito hidrofóbico, mas não por ligações covalentes, é de fundamental importância para a atividade biológica das membranas, pois é isto que lhes confere a fluidez necessária para compartimentalizar ambientes e, ao mesmo tempo, serem flexíveis para permitir o transporte de substâncias e a interação com proteínas – bicamadas são estruturas semipermeáveis. A composição lipídica de uma bicamada (e consequentemente de uma membrana) afeta suas propriedades devido não apenas à diferenças entre os grupos característicos das cabeças polares, mas também pelo comprimento das caudas dos fosfolipídios. Membranas constituídas por lipídios de caudas maiores terão maior espessura e uma região apolar maior; fator que afeta sua fluidez, sua interação com outras moléculas e o transporte de substâncias através da membrana. Membranas biológicas são estruturas fluidas, e a liberdade com que 2 Existem fosfolipídios em que as duas caudas são saturadas (como o DPPC, DPPE, etc.), ou em que as duas caudas apresentam insaturação (DOPC, DOPE, etc.). As duas primeiras letras da sigla designam os ácidos graxos que constituem as caudas do fosfolipídio, e as duas últimas indicam o grupo característico da cabeça. 18 seus componentes se deslocam pela estrutura (sua difusão) também é dependente das características dos lipídios que compõem a membrana. Figura 1.4 – Esquematização da composição de um fosfolipídio; o grupo substituinte e o tamanho das caudas afetam as características da estrutura que grupos destas moléculas formam quando em solução aquosa. Adaptada de Averill e Eldredge, 2007. Tabela 1.1 – Principais fosfolipídios de interesse biológico. Adaptada de Nelson e Cox, 2004. 19 1.4 Colesterol O colesterol é o principal esteroide encontrado em membranas biológicas; abundante em células animais, representa 20~30% dos lipídios da membrana plasmática, mas pode atingir 50% nas células sanguíneas (Róg et al., 2009). É um lipídio de cadeia mista e longa, apresentando diversos anéis, que conferem rigidez à molécula, e uma pequena cadeia acíclica num dos extremos de sua estrutura; no extremo oposto, a presença de uma hidroxila determina uma região polar na molécula. O colesterol é portanto uma molécula anfipática, mas de propriedades muito diferentes das dos fosfolipídios; sua estrutura diversificada faz com que o colesterol atue como um modificador das propriedades de membranas biológicas. No passado, a presença do colesterol no organismo foi associada à diversas doenças cardiovasculares, o que gerou uma concepção negativa da ação da molécula pela população em geral, com muitas pessoas buscando evitar o consumo de alimentos ricos em colesterol (como gema de ovo, queijos e fígado). Entretanto, sabe-se atualmente que a maior parte do colesterol presente no organismo de animais é sintetizada pelo próprio organismo; apenas uma pequena parte é adquirida pela alimentação3 (Alberts et al., 2002) e o organismo compensa o que é absorvido reduzindo a produção do esterol (Lecerf e Lorgeril, 2011). O nível de colesterol no sangue (medido através das lipoproteínas que o transportam no meio celular) consiste, na realidade, num indício de se organismo apresenta algum problema – o colesterol atua como um sinalizador. Diversas modificações estruturais em membranas biológicas são atribuídas à ação do colesterol: seu efeito regulador altera a fluidez da bicamada, afetando propriedades como a área de contato da cabeça dos lipídios com a água e a espessura da região hidrofóbica, além de reduzir a permeabilidade da estrutura lipídica à moléculas de água (Hofsäβ et al., 2003; Róg et al., 2009). Tais modificações implicam em alterações na redução da mobilidade de lipídios e outras moléculas dentro da bicamada – o colesterol possui a capacidade de regular a fluidez de uma membrana. Na ausência do colesterol, a membrana pode tornar-se excessivamente fluida e permeável, o que compromete sua função de seletividade às moléculas que passam através da estrutura (Alberts et al., 2002). 3 A incidência de doenças cardiovasculares está sim associada à má alimentação, mas não pela ingestão de colesterol; o consumo exagerado de alimentos ricos em gordura eleva o risco de doenças como pressão alta e parada cardíaca porque se não houver compensação com o aumento do gasto metabólico (com atividade física, por exemplo), ocorrerá o acúmulo de lipídios no organismo, principalmente na forma de triglicerídios. Aliada à má alimentação, o sedentarismo e o tabagismo são os principais fatores de risco de doenças cardiovasculares. O excesso de produção de colesterol em alguns indivíduos está associado a distúrbios genéticos. 20 O colesterol é um componente necessário em membranas biológicas de animais, mas em altas concentrações pode enrijecer excessivamente a estrutura, podendo inclusive fazer com que a membrana perca sua função biológica: as caudas dos fosfolipídios tornam-se tão ordenadas que a fluidez e permeabilidade da membrana ficam comprometidas; neste caso ocorre a transição da membrana da fase líquido-cristalina (fase em que as membranas são biologicamente ativas, havendo um equilíbrio entre fluidez e permeabilidade), para a fase gel4. Portanto, deve haver um equilíbrio entre a concentração de colesterol na membrana e as propriedades que ela deve apresentar; e é por este motivo que, assim como ocorre com os fosfolipídios, a proporção de colesterol na bicamada varia de acordo com o tipo de célula, com o tipo de organela, e até mesmo quanto à face considerada (se a face é voltada para o meio externo, ou para meio celular) (Nelson e Cox, 2004). A influência da composição e da proporção de fosfolipídios e colesterol sobre as propriedades de uma membrana é alvo de estudos experimentais há décadas (Papahadjopoulos et al., 1973; Hjort Ipsen et al., 1987; Ohvo-Rekilä et al., 2002) e mais recentemente passou a ser abordada através de simulações computacionais de bicamadas (Berkowitz et al., 2009; Róg et al., 2009; Baoukina e Tieleman, 2015), que permitem o estudo das interações entre os componentes a nível atômico. Acredita-se que a compreensão das alterações promovidas pelo colesterol na estrutura e na dinâmica das membranas seja importante para entendimento de como ocorre sua atividade e de como esta pode vir a ser regulada (Yesylevskyy e Demchenko, 2015). 1.5 Interação entre as Monocamadas de uma Membrana Membranas são sistemas constituídos por faces (ou monocamadas) antiparalelas que são mantidas unidas pela interação dos lipídios com a fase aquosa em ambas as monocamadas e também por interações do tipo van der Walls estabelecidas pelos átomos das caudas de uma monocamada com os da monocamada oposta. Uma das funções biológicas desempenhada pelo colesterol é a de sinalização hormonal através das membranas, e a transmissão da 4 A fase líquido-cristalina de uma membrana é chamada de ld, do inglês, liquid-disordered, enquanto que na fase gel, a estrutura é denominada lo, do inglês, liquid-ordered. A transição de determinada região da membrana de uma fase para a outra está intimamente ligada à concentração local de colesterol (Berkowitz, 2009). Desconsiderando-se a ação do colesterol, a transição lo-ld ocorre em função da temperatura do sistema e a temperatura em que é verificada (Tm) depende da composição lipídica da estrutura. 21 informação envolve a passagem de moléculas através da estrutura. Inicialmente, os estudos sobre a sinalização e transporte através de membranas focavam no papel desempenhado por proteínas transmembrânicas que, integradas à estrutura lipídica, expõem regiões da molécula à fase aquosa através de ambas as monocamadas da membrana; esta abordagem pressupunha que as monocamadas atuavam independentemente uma da outra, desempenhando apenas a função estrutural de compartimentalizar o ambiente. Thompson e colaboradores (Schmidt et al., 1978), estudando vesículas compostas por um tipo de fosfolipídio e esfingomielina (um lipídio de apenas uma cadeia carbônica, que desempenha papel de sinalização no processo de sinapse entre neurônios) através de ressonância magnética nuclear (RMN), encontraram evidências de que as duas monocamadas interagiam entre si, apresentando algum tipo de acoplamento. Estudos posteriores, indicaram que a fraca interação entre as monocamadas estava relacionada à fase (lo ou ld) da membrana, e que, ao induzir a transição de fases na monocamada externa de uma vesícula, o fenômeno repercutia na monocamada interna, sugerindo que o acoplamento poderia consistir no contato intercalado entre as caudas das duas monocamadas (Düzgünes et al., 1988). A ação do colesterol modula as propriedades de uma membrana e pode induzir localmente a transição de fase da estrutura; o estabelecimento de domínios ricos em colesterol numa membrana têm sido associado à formação dos chamados lipid rafts – microdomínios funcionais na membrana que estão relacionados à processos de reconhecimento celular e sinalização (Berkowitz, 2009). Regiões de rafts são caracterizadas por um comportamento dinâmico distinto do resto da membrana e acredita-se que a acomodação dos extremos das caudas dos fosfolipídios desempenhe um papel importante em sua estruturação (Róg et al., 2009). Mas o extremo das cadeias dos fosfolipídios é a região onde ocorre o acoplamento entre as monocamadas; o estudo da interação dos grupos presentes nesta região pode portanto fornecer informações relevantes sobre a formação de microdomínios na membrana e seu papel na sinalização através da estrutura (Niemelä et al., 2009). Embora a interação entre as monocamadas constituintes de uma membrana biológica ainda não tenha sido bem caracterizada, a recente abordagem computacional do problema através de simulações têm revelado informações que podem auxiliar na compreensão de como se dá o acoplamento entre as faces de uma bicamada, e qual é o efeito da composição lipídica sobre tal interação (Nickels et al., 2015; Capponi et al., 2016; Tian et al., 2016) 22 1.6 Peroxidação Lipídica e Polifenóis Diversos processos biológicos que ocorrem na vizinhança das membranas biológicas podem induzir a peroxidação lipídica, que consiste na degradação oxidativa de lipídios por radicais livres. A ação da radiação (UV e raios-X), e também da poluição, continuamente promove a formação de radicais livres no ambiente celular (Košinová et al., 2011) que, entre diversos efeitos degenerativos, podem agir sobre membranas celulares, capturando elétrons das insaturações de ácidos graxos e se ligando à cauda insaturada do lipídio. As propriedades de uma membrana são sensíveis à quantidade de carbonos das caudas dos fosfolipídios que as constituem, e também à quantidade de insaturações que estas apresentam; assim, a ligação de um radical livre à cadeia acíclica promove profundas modificações nas características do fosfolipídio, induzindo alterações locais nas propriedades da membrana. A recorrência do processo de peroxidação pode levar à degradação da membrana e à perda de sua atividade biológica e, em larga escala, pode causar doenças ao organismo e também é associado ao processo de envelhecimento (Rikans e Hornbrook, 1997). A ação de moléculas com propriedades antioxidantes reduz a formação de radicais livres e consequentemente previne a degradação de membranas celulares. Polifenóis são uma ampla classe de moléculas sintetizadas por plantas, muitas das quais fazem parte da dieta humana (frutas, vegetais, especiarias), e também são encontrados em produtos derivados destas plantas, como chás, chocolate, vinho e cervejas (Košinová et al., 2011); são divididos em diversos grupos, de acordo com sua estrutura química (flavonoides, taninos, lignanas, etc.), e têm sido muito estudados por sua possível atividade contra doenças cardíacas, câncer, envelhecimento e doenças degenerativas (Košinová et al., 2011; Havsteen, 2002). Entre suas diversas atividades biológicas, são poderosos antioxidantes. Polifenóis são moléculas anfipáticas, constituídas por anéis aromáticos aos quais estão ligados uma ou mais hidroxilas (formando o grupo fenol, que dá nome ao grupo de moléculas); a ligação entre seus anéis é estabelecida por anéis condensados ou por cadeias acíclicas onde podem estar presentes grupos polares, como carbonilas. São as hidroxilas que conferem a atividade antioxidativa aos polifenóis, pois a reação e captura de radicais livres por estas inibe sua ação sobre componentes biológicos – como os fosfolipídios (Trouillas et al, 2006). A anfipaticidade dos polifenóis lhes confere a possibilidade de interagirem ou integrarem membranas biológicas, e sua posição e orientação dentro de membrana dependerá 23 da quantidade e posição de suas hidroxilas. A localização de polifenóis em membranas permanece um caso controverso (ocorre na interface com a água, ou em regiões mais internas e apolares da membrana?) e o estudo por simulações computacionais da interação destas moléculas com bicamadas fosfolipídicas pode fornecer informações relevantes (Košinová et al., 2011; Kopeć et al. 2013). Por outro lado, a própria presença destas moléculas pode vir a modificar as propriedades da membrana, e sabe-se que em concentrações elevadas os polifenóis são tóxicos, com o efeito reverso de induzirem a formação de radicais livres (Burgos-Morón et al., 2010). A ação destas moléculas sobre as propriedades de uma membrana é outra característica passível de ser estudada através de simulações computacionais. 1.6.1 Curcumina A curcumina é um flavonoide (um subgrupo dos polifenóis) a que têm sido atribuído um amplo espectro de atividades terapêuticas: ação antioxidante, anti-inflamatória, anticancerígena e antimutagênica; entretanto, seus mecanismos de ação permanecem desconhecido (Ingolfsson et al., 2007). Abordagens computacionais ao problema têm fornecido dados que podem auxiliar na compreensão de como a molécula interage com o DNA (Koonammackal et al., 2011) e com proteínas envolvidas no processo de sinalização por lipopolissacarídeos (Wang et al., 2015). A curcumina é o principal componente bioativo do açafrão-da-terra (Curcuma longa), possuindo portanto uma íntima relação com a culinária oriental. Estudos in vitro revelam que a curcumina modula as propriedades de bicamadas fosfolipídicas, tendo ação semelhante à observada em peptídeos antimicrobianos (também de características anfifílicas) (Ingolfsson et al., 2007; Hung et al., 2008), mas a forma como se dá tal interação ainda não é conhecida. 24 1.7 Simulação Computacional de Sistemas Biológicos O estudo de sistemas biológicos através de simulações computacionais possibilita a análise de sua dinâmica e estabilidade a níveis atômico e molecular, resolução difícil de ser atingida através de técnicas experimentais. Simulações por dinâmica molecular possibilitam estudar a evolução temporal de um sistema e, se este estiver adequadamente representado, fornecer informações sobre a interação entre os componentes do sistema e os mecanismos de ação de moléculas. Aplicadas ao estudo de membranas biológicas, simulações de bicamadas que mimetizam características importantes da estrutura lipídica, contribuem com dados sobre a dinâmica das interações estabelecidas entre os lipídios e as implicações destas sobre as propriedades da membrana (Tieleman et al., 1997; Marrink et al., 2009). Estudos sobre o comportamento de sistemas compostos por mais de um tipo de lipídio auxiliam na elucidação da ação específica de um tipo de molécula sobre a estrutura, possibilitando a avaliação de questões como formação de domínios e a condensação do sistema promovida por moléculas como o colesterol (Edholm e Nyberg, 1992; Berkowitz, 2009). A ação de moléculas de interesse biológico sobre a membrana também pode ser abordada por simulações de bicamadas de composição apropriada, com o estudo da interação que a molécula estabelece com os lipídios da estrutura. 25 1.8 Objetivos O objetivo geral deste trabalho compreende a simulação por dinâmica molecular de bicamadas compostas por um tipo de fosfolipídio (POPC) e colesterol, e também a avaliação da interação destes sistemas com um tipo de flavonoide de interesse biológico (curcumina). Dentre os objetivos específicos do trabalho estão: a) Validar os parâmetros de simulação empregados, e a modelagem utilizada na representação computacional das moléculas, através de grandezas de interesse calculadas para uma bicamada POPC pura e sua comparação com dados experimentais disponíveis, e também com valores obtidos em outros trabalhos de simulação; b) Avaliar o efeito da concentração de colesterol sobre a estrutura lipídica através de bicamadas constituídas por moléculas de POPC e colesterol em três concentrações diferentes de colesterol: 0, 20 e 40%. As modificações promovidas pela ação do colesterol, com foco nas alterações sobre o acoplamento entre as duas faces da bicamada, serão analisadas por comparação com os resultados obtidos da bicamada pura (0% colesterol); c) Avaliar a interação entre uma molécula de curcumina e bicamadas de diferentes concentrações de colesterol, com foco na estabilização do flavonoide na estrutura e em possíveis alterações na bicamadas em decorrência da presença da curcumina. A interação entre flavonoide e bicamada será avaliada através de três métodos diferentes de inserção da molécula: na fase aquosa do sistema, na fase lipídica (na região apolar da bicamada), e através do processo de automontagem da bicamada em presença do flavonoide. 26 2. METODOLOGIA 2.1 Dinâmica Molecular Simulações por dinâmica molecular constituem uma técnica computacional muito versátil que pode ser aplicada ao estudo desde macromoléculas de interesse biológico, até a ciência dos materiais. Fundamentadas nos princípios da Mecânica Clássica, simulações por dinâmica molecular podem fornecer informações sobre o comportamento dinâmico do sistema de interesse, a nível atômico e em escalas de tempo infinitesimais (normalmente, a partir de ps, isto é, ~10-12 segundos). Propriedades macroscópicas dos sistemas também podem ser obtidas com a aplicação de formulações de Mecânica Estatística – o que possibilita a dedução de propriedades observáveis (temperatura, energia potencial, volume, densidade, etc.) a partir do comportamento microscópico do sistema. As seções a seguir apresentam tópicos básicos ao desenvolvimento de simulações por dinâmica molecular. 2.1.1 Campo de forças Em simulações por dinâmica molecular, as moléculas são tratadas como uma coleção de átomos unidos por potenciais clássicos. O conjunto de funções potencial de interação e os parâmetros nelas definidos constitui o chamado campo de forças – o campo de forças é uma modelagem matemática que tenta mimetizar o ambiente físico do sistema, e portanto deve ser adequado a representar as condições sob as quais se deseja realizar seu estudo (no vácuo, em ambiente aquoso implícito, ou explícito, etc.). Um campo de forças deve incluir termos para representar átomos ligados (comprimentos e ângulos de ligação, ângulos diedros) e termos para átomos não ligados (interações de van der Waals e de Coulomb); átomos são denominados ligados se estiverem separados por, no máximo, três ligações químicas, e ditos não ligados quando, seguindo as ligações químicas da molécula, forem separados por mais de três ligações. 27 Para se assegurar que o campo de forças representa satisfatoriamente o ambiente em estudo, às vezes é necessário modificá-lo a partir de dados empíricos, parametrizá-lo de forma que os resultados obtidos nas simulações sejam comparáveis à medições experimentais. A aplicação do campo de forças a um sistema bem caracterizado, uma simulação de controle, às vezes é necessária para se avaliar se o campo de forças utilizado é adequado, se necessita de modificações, ou até mesmo se deve ser substituído por outro. O conjunto de potenciais de interação que compõem o campo de forças deve permitir o cálculo da energia potencial do sistema a partir da estrutura tridimensional de seus átomos. Um típico campo de forças assume a forma V ( r⃗ )=∑V l+∑V θ+∑V φ+∑V VdW +∑V Eletros . , (2.1) onde Vl são termos que descrevem a vibração das ligações atômicas em torno do seu valor de equilíbrio, Vθ descreve as torções em torno das ligações de uma molécula, Vφ descreve a variação dos diedros em torno de um ângulo de equilíbrio, VVdW representa o conjunto de termos que descrevem as interações do tipo van der Waals, e VEletros. descreve as interações eletrostáticas entre cargas (ver Figura 2.1). Os potenciais harmônicos Vl e Vθ são construídos com base na lei de Hooke, isto é, em termos de constantes de mola, kl e kθ, e da variação l e θ em torno da posição de equilíbrio l0 e θ0: V l=k l(l−l0) 4 e V θ=kθ(θ−θ0) 4 . (2.2 e 2.3) Como a própria lei que os fundamenta, estes potenciais são válidos apenas para pequenas oscilações em torno da posição de equilíbrio. O potencial torcional Vφ trata dos diedros e normalmente assume a forma V φ= V n 2 [1+cos (nφ−γ)] , (2.4) onde V n é a barreira de energia para a torção, n é o número de máximos (ou mínimos) de energia em uma torção completa, φ é o ângulo diedro e γ é a diferença de fase no ângulo diedro que pode gerar um ponto de máximo ou mínimo em φ = 0. 28 Figura 2.1 – Da esquerda para a direita, idealização dos potenciais harmônicos Vl e Vθ e e do potencial torcional Vφ. Adaptada de Martínez, 2010. As interações entre pares (i, j) de átomos não ligados são descritas por potenciais dos tipos van der Waals e eletrostático, representados, respectivamente, pelos potenciais de Lennard-Jones e de Coulomb V VdW=4 εij [( σ ij r ij ) 12 −( σ ij r ij ) 6 ] e V Eletros .= qi q j 4 πε0 εr rij , (2.5 e 2.6) onde ϵ ij representa a profundidade do poço de potencial e σi,j é a distância para qual o potencial interpartícula é zero, q i e q j são as cargas parciais dos átomos i e j, r ij é a distância entre estes, ε0 é a permitividade elétrica do vácuo e εr a constante dielétrica relativa do meio. Todos estes parâmetros são empíricos ou deduzidos de cálculos teóricos. Em alguns campos de força, um potencial adicional é incluído com o objetivo de manter a estrutura tridimensional, e suas oscilações, de átomos com quatro ligações simples (σ); este potencial é utilizado quando é necessário manter a tetraedricidade, ou a planaridade, de quatro átomos não ligados sequencialmente (ver Figura 2.2), e pode ser expresso por V DI= 1 2 kα (α−α0) 2 , (2.7) onde α 0 é ângulo de equilíbrio (α0 = 0, se o arranjo é planar; α0 ≈ 36º, se tetraédrico) e kα é uma constante elástica que varia de acordo com o tipo de hibridização no átomo central. Figura 2.2 – Os três átomos ligados (A, B e C) estabelecem um plano enquanto o átomo central hibridizado (D) pode oscilar em relação à este; α é o ângulo de oscilação entre a ligação AD e o plano ABC. Adaptada de: . 29 O potencial diedral impróprio é harmônico, com a energia oscilando com a variação conformacional do arranjo de átomos, e é um termo particularmente necessário para a manutenção da tetraedricidade dos átomos de carbono quando utilizada a representação de átomos unidos para os grupos CH, CH2 e CH3 para carbonos pouco reativos. Na representação de átomos unidos, grupos de átomos são substituídos por uma nova espécie atômica capaz de representar as propriedades mecânicas moleculares do grupo; os quatro átomos de um grupo CH3, por exemplo, são substituídos por um pseudo-átomo cujas propriedades são equivalentes à do grupo (ver Figura 2.3). Figura 2.3 – Molécula de um fosfolipídio (POPC) nas representações de todos os átomos (esq.) e átomos unidos (dir.). A redução do número de atómos implica em ganho de tempo computacional. Extraída de Cascella e Vanni, 2015. A escolha do campo de forças a ser utilizado numa simulação depende, essencialmente, do sistema a ser estudado e das propriedades de interesse a serem investigadas. Diversos campos de força foram desenvolvidos especificamente para sistemas compostos por moléculas biológicas, sendo os campos das famílias GROMOS (van Gunsteren e Berendsen, 1987; van Gunsteren et al., 1996), OPLS (Jorgensen e Tirado-Rivers, 1988), AMBER (Case et al., 2014) e CHARMM (Brooks et al., 1983; Brooks et al., 2009), exemplos bem-sucedidos. As simulações desenvolvidas neste trabalho são baseadas no campo de forças GROMOS96 53A6 (van Gunsteren et al., 1996), otimizado com os parâmetros dos “lipídios de Berger” (Berger et al., 1997). Tal modificação é necessária devido ao fato das cadeias de alcanos das caudas dos fofolipídios não serem satisfatoriamente tratadas pelo parâmetros ligados naturais do GROMOS. Os chamados “lipídios de Berger” utilizam a representação de átomos unidos para os grupos CH, CH2 e CH3 e são uma espécie de híbrido entre os tipos de átomos dos campos de força GROMOS e OPLS. 30 Este conjunto, campo de força GROMOS96 53A6 otimizado com parâmetros de Berger, apresenta desempenho satisfatório quando comparado a outros campos de forças utilizados para a simulação de bicamadas fosfolipídicas, conseguindo também reproduzir adequadamente algumas grandezas físicas de interesse (Piggot et al., 2012), como área por lipídio, espessura da bicamada, parâmetros de ordem e coeficiente de difusão. 2.1.2 Equações de movimento e integração numérica Uma simulação de dinâmica molecular clássica (onde não há troca de elétrons) consiste fundamentalmente na resolução das equações de movimento de todos os i átomos do sistema em cada instante t: F⃗i(t )=mi a⃗i . (2.8) Como não existe solução analítica para problemas com muitos corpos, a solução deve ser encontrada através de métodos numéricos. A implementação de um campo de forças possibilita o cálculo das forças que atuam sobre cada átomo i do sistema através da derivada da energia potencial obtida do campo de forças empregado, F⃗i(t )= −∂ V ( r⃗i) ∂ r⃗ i =−∇⃗ iV (r⃗ i)=mi a⃗ i , (2.9) cálculo que fornece diretamente a aceleração a⃗i da partícula i no instante t. Conhecida a aceleração, pode-se integrar as equações do movimento para obter a velocidade da partícula que, com uma nova integração, fornece a posição da partícula em t+Δt. Determinadas as posições de todas as partículas do sistema, pode-se calcular a energia potencial total, cuja derivada fornecerá a aceleração a⃗i de cada partícula em t+Δt. A aplicação sucessiva deste método possibilita a determinação da posição e velocidade de cada partícula ao longo do tempo, ou seja, sua trajetória. Na prática, as trajetórias das partículas são obtidas pela integração numérica das equações de movimento utilizando-se algoritmos baseados no método das diferenças finitas, que aproximam a derivada da energia potencial por pequenas diferenças finitas de intervalos 31 Δt (chamados de passo de integração), o que possibilita simular movimentos que ocorrem em intervalos de tempo tão pequenos quanto se desejar. Existem diversos algoritmos de integração que são empregados em dinâmica molecular, sendo os mais comuns os algoritmos de Verlet (Swope et al., 1982) e Beeman (Beeman, 1976) e o método leap-frog (Hockney e Eastwood, 1974). O algoritmo leap-frog utiliza as posições r no instante t e as velocidades v no instante t− 1 2 Δt (metade do passo de integração) para calcular as forças F(t) sobre a partícula e atualizar sua velocidade v em t+ 1 2 Δt e sua posição r no instante t+Δt através das fórmulas recursivas: v⃗ ( t+ 1 2 Δt )= v⃗ (t−1 2 Δt)+ Δt m F⃗ (t) (2.10) r⃗ (t+ Δt )=r⃗ (t )+Δ t . v⃗ (t +1 2 Δt) (2.11) onde m é a massa da partícula. Velocidade e posição não são calculadas portanto para o mesmo instante de tempo, estando sempre intercaladas; esta característica é a origem do nome do método, como mostra a Figura 2.4. O algoritmo leap-frog é dito ser de terceira ordem em r, pois trunca os termos da série de Taylor (de onde são derivadas as Equações 2.10 e 2.11) no termo de quarta potência, O(Δt4) (van der Spoel et al., 2010). Figura 2.4 – Esquematização do método leap-frog. Posições e velocidades são atualizadas de forma intercalada, como os saltos de um sapo ao andar. Extraída de van der Spoel et al., 2010. 32 2.1.3 Condições iniciais, minimização e equilibração Um requisito para a aplicação dos algoritmos numéricos, que resolvem as equações de movimento e determinam a trajetória e velocidades das partículas em cada instante, são as condições iniciais do sistema, ou seja, a posição e a velocidade de cada partícula no instante t =0, que fornecem as constantes de integração necessárias para a resolução da equação diferencial de 2ª ordem. A distribuição das posições iniciais deve ser feita de forma a se evitar a ocorrência de aproximações indevidas entre os átomos, podendo ser utilizados algoritmos que otimizam a distribuição inicial, alterando a posição de partículas de forma a minimizar a energia potencial do sistema; este processo é conhecido como minimização da energia e os algoritmos mais utilizados são o método dos gradientes conjugados e o método steepest descent. Definidas as posições iniciais, são atribuídas velocidades aleatórias às partículas seguindo um distribuição de Maxwell-Bolztmann para a temperatura de referência T ref em que se deseja estudar o sistema. Normalmente, a determinação das condições iniciais não garante que o sistema esteja em equilíbrio termodinâmico, por isso é prática comum desconsiderar os passos iniciais de uma simulação onde suas propriedade não são constantes, ou realizar o aquecimento em incrementos pequenos da temperatura. Este período é chamado de equilibração do sistema e varia de acordo com os sistemas a serem estudados. 2.1.4 Ensemble e controle de temperatura e pressão A partir do conjunto das posições e velocidades de todas as partículas da caixa de simulação em determinado instante t, pode-se definir o estado macroscópico do sistema correlacionando-o às variáveis macroscópicas que caracterizam um ensemble estatístico. Diversas opções de ensemble podem ser empregados em simulações por dinâmica molecular, sendo os mais comuns o micro-canônico, ou NVE (o sistema é ajustado para que o número de partículas N, o volume V e a energia total E da caixa de simulação sejam conservadas), o canônico, ou NVT (número de partículas, volume e temperatura), e o isotérmico-isobário, ou NPT (número de partículas, pressão e temperatura) (Namba et al., 2008). 33 Pressão, temperatura e quantidade/concentração de reagentes, são grandezas frequentemente controladas em técnicas experimentais. De maneira geral, simulações computacionais precisam fornecer resultados passíveis de serem comparados a medições experimentais, e é por este motivo que simulações no ensemble NPT são mais comuns do que nos demais ensembles. O controle da temperatura do sistema em simulação é realizado através do reescalonamento das velocidades das partículas por um fator de correção adequado a cada certo número de passos de integração, fazendo com que a temperatura oscile em torno do valor de referência. O efeito deste tratamento é equivalente a acoplar o sistema a um banho térmico de temperatura igual à temperatura Tref de referência do sistema e é implementado através de algoritmos conhecidos como termostatos, sendo os mais comuns os termostatos de Berendsen (Berendsen et al., 1984), V-Rescale (Bussi et al., 2007) e Nosé-Hoover (Nosé, 1984; Hoover, 1985). Um procedimento análogo ao do controle de temperatura é utilizado para garantir que a pressão do sistema oscile em torno de uma pressão de referência Pref, mas desta vez, reescalonando as coordenadas e as dimensões da caixa de simulação. Os algoritmos que implementam este processo são chamados de barostatos e os mais comuns são os barostatos de Berendsen (Berendsen et al., 1984) e o de Parrinello-Rahman (Parrinello e Rahman, 1981; Nosé e Klein, 1983). 2.1.5 Caixa de simulação e condições periódicas de contorno Simulações de dinâmica molecular normalmente são aplicadas a sistemas que contém de centenas a milhões de átomos, quantidade praticamente insignificante se comparada ao número de átomos em sistemas macroscópicos (~1023 partículas), o que torna necessário um tratamento para que não haja influência de efeitos de borda (da caixa de simulação) sobre o sistema. A forma mais comum de se contornar este problema é a utilização das chamadas condições periódicas de contorno. Nesta técnica, o sistema é construído dentro de uma "caixa" de simulação que é replicada em imagens em todas as direções do espaço, de forma que, se uma partícula sai da caixa adentrando uma caixa imagem, uma partícula idêntica entrará na 34 caixa de simulação vindo da caixa imagem da face oposta (ver Figura 2.5). Matematicamente, se Li é o tamanho da caixa de simulação, i = x, y, z, tem-se que se ri (t+Δt) > Li, então ri (t+Δt) = ri (t+Δt) – Li , ou, (2.12) se ri (t+Δt) < 0, então ri (t+Δt) = ri (t+Δt) +Li . (2.13) . As condições periódicas de contorno fazem com que os átomos do sistema nunca enxerguem uma borda e garantem que o número total de partículas na caixa de simulação seja sempre o mesmo (fica então assegurada a convervação do número de partículas do sistema). O formato da caixa de simulação não deve interferir nos resultados obtidos; ela deve ser suficientemente grande, nas três dimensões, de forma a garantir que uma molécula não interaja com sua própria imagem – o que, além de trazer problemas à evolução da simulação, implicaria em resultados espúrios originados do tratamento matemático aplicado ao sistema (as condições periódicas de contorno). Este problema torna-se mais relevante com o aumento do tamanho das moléculas simuladas e a questão de qual deve ser o tamanho da caixa de simulação para garantir que não ocorra será tratada na próxima seção. Figura 2.5 – Representação idealizada das condições periódicas de contorno: a caixa de simulação onde o sistema de interesse foi construído é envolvida por um número infinito de réplicas, em todas as direções. Extraída de: . As dimensões da caixa de simulação são constantes apenas quando a simulação é realizada à volume constante. Quando é aplicado um controle de pressão sobre o sistema, caso mais comum, os eixos da caixa de simulação são deformados como parte do processo para garantir que a pressão do sistema oscile em torno do valor de referência Pref. Isto pode ocorrer de três formas: no caso do acoplamento de pressão isotróprico, as dimensões x, y e z da caixa 35 de simulação são deformadas igualmente, mantendo a relação entre elas (se a caixa de simulação inicialmente for cúbica, permanecerá cúbica durante a simulação, embora sua aresta possa variar); no acoplamento semi-isotrópico, as dimensões x e y são acopladas e deformam-se igualmente, mas z é independente; e, no caso anisotrópico, todos os eixos são controlados de forma independente. 2.1.6 Mínima imagem, raio de corte e interações de curto e longo alcance A utilização de condições periódicas de contorno insere uma complicação às simulações: o cálculo de um potencial de interação demanda a soma das interações sobre todos pares de partículas, inclusive as que estão nas imagens da caixa – seria uma soma de infinitos termos, portanto. Este problema é contornado com a utilização da chamada convenção da mínima imagem; o potencial para interações de curto alcance (interações do tipo van der Waals) é truncado para pares de partículas cuja distância seja maior do que um valor especificado, chamado de raio de corte (sempre menor do que metade do tamanho da caixa de simulação; isto, nas três dimensões), evitando que uma partícula interaja com sua própria imagem. Desta forma, para garantir que a caixa de simulação tenha tamanho suficiente para evitar que uma molécula interaja com sua imagem, deve-se assegurar que a caixa meça, no mínimo, a dimensão da molécula mais a medida do raio de corte aplicado (normalmente, a solvatação do sistema garante margem suficiente para evitar o problema). O truncamento de termos a partir de um raio de corte pode ser aplicado à interações de curto alcance pois estas decaem com r6. Interações de longo alcance (interações de Coulomb) decaem muito mais lentamente e não podem ser tratadas da mesma forma sem que se corra o risco de serem produzidos efeitos artificiais que comprometam os resultados da simulação (o exemplo mais comum são saltos bruscos na energia potencial que podem tornar a dinâmica instável). Interações de longo alcance são tratadas por métodos baseados em somas de Ewald, sendo o mais comum o PME (Particle Mesh Ewald) (Darden e Pedersen, 1993; Essmann et al., 1995), ou por métodos aproximativos como o Reaction-Field (Tironi et al., 1995), ou mesmo através de um raio de corte, porém com a precaução de introduzir uma função potencial que faça a energia de interação se anular rapidamente (num segundo raio de corte). 36 2.1.7 Solvatação e modelos para a molécula de água Processos biológicos ocorrem na presença de solventes e, buscando uma representação mais realista, simulações por dinâmica molecular normalmente incluem a representação da ação do solvente sobre o sistema (de forma implícita, através de uma constante dielétrica, ou de forma explícita, com a inclusão das moléculas do solvente na caixa de simulação). A água é o principal solvente de sistemas biológicos e consequentemente sua representação adquire um papel crucial. Apesar de sua estrutura simples, a água apresenta dezenas de anomalias, algumas fundamentais em processos biológicos, que dificultam sua caracterização de forma simples (Huang et al., 2009). Existem diversos modelos para representar a molécula de água: modelos com três sítios, modelos com quatro sítios (um falso átomo é incluído para melhor representar a distribuição eletrostática da molécula; ver Figura 2.6), e também modelos mais complexos com cinco e até seis sítios. Quanto mais complexa a representação, mais complicada é sua implementação, pois as moléculas de água normalmente são o componente majoritário de uma caixa de simulação e os atómos adicionais do modelo também devem ser considerados no cálculo dos pares de interação1. Figura 2.6 – Representação de modelos de moléculas de água de três (a) e de quatro sítios (b). Para o modelo SPC, que é de três sítios, por exemplo, σ = 3,167 Å, q1= + 0,410, q2 = - 0,820, l1 = 1 Å e θ = 109,47º. Fonte: . Acesso em 03/01/2017. Alguns modelos simples de três sítios entretanto revelam grande aplicabilidade e satisfatória correpondência com dados experimentais (Zielkiewicz, 2005) e por isso são amplamente utilizados; é o caso dos modelos SPC (Berendsen et al., 1981) e TIP3P (Jorgensen et al., 1983). A Figura 2.7 apresenta o resultado de uma dinâmica de caixas de 1 Informações e referências sobre dezenas de modelos para a molécula de água e a comparação de propriedades aferidas destes com dados experimentais estão disponíveis no website de Martin Chaplin . 37 simulação contendo apenas moléculas de água, utilizando os modelos SPC (curva em vermelho) e TIP3P (preto). A figura mostra a ordenação do sistema, verificada através da função de distribuição radial de pares g(r), dada por g(r )=4 πr ² ρdr , ρ= N V , (2.14) onde ρ é a densidade de partículas na esfera de raio r. A comparação dos resultados obtidos para os dois modelos com um resultado experimental (destaque no gráfico), revela que ambos reproduzem satisfatoriamente a ordenação da água na fase líquida – neste caso, com vantagem para o modelo SPC, que produziu bons resultados até a 2ª camada de solvatação. Figura 2.7 – Distribuição radial de pares entre os átomos de oxigênio das moléculas de água. Os resultados referem-se à simulações de 10 ns cada de uma caixa contendo apenas água. 38 2.1.8 Pacotes de Simulação Nas seções acima realizou-se um resumo de tópicos fundamentais ao desenvolvimento de simulações por dinâmica molecular. Na prática, este tipo de simulação é realizada através de pacotes de softwares amplamente testados e aprimorados, alguns utilizados há décadas, sendo os principais exemplos: GROMACS (Groningen Machine for Chemical Simulations) (Abraham et al., 2015), Amber (Case et al., 2014), CHARMM (Chemestry at Harvard Molecular Mechaniscs) (Brooks et al., 2009) e NAMD (Scalable Molecular Dynamics) (Phillips et al., 2005). Tais pacotes normalmente agregam programas para a construção das caixas de simulação a partir da estrutura e topologia das moléculas a serem estudadas, desenvolvimento da dinâmica propriamente dita, e alguns tipos de análise das trajetórias obtidas. Na maioria dos casos, pacotes para simulação permitem a implementação de simulações em diversos campos de forças, sendo possível inclusive trabalhar com campo de forças modificados e até mesmo de desenvolvimento próprio. 2.2 Estrutura e Topologia das Moléculas O campo de forças modela o ambiente físico em que será desenvolvida uma simulação; portanto é necessário que as moléculas a serem simuladas estejam adaptadas a tal ambiente, ou tecnicamente, a representação para a molécula deve estar parametrizada no campo de forças a ser utilizado. A obtenção da estrutura de uma molécula (uma proteína, por exemplo) normalmente decorre de procedimentos experimentais (como cristalografia, ressonância magnética, etc.) que fornecem a disposição tridimensional dos átomos da molécula – sua estrutura. Entretanto, para que essa representação da molécula seja utilizada numa simulação, são necessários todos os parâmetros de interação dos átomos da própria molécula entre si e como estes interagem com outros tipos de átomos (com a água, por exemplo), ou seja, o campo de forças requer que a molécula seja descrita em termos dos potenciais e constantes relacionados na Seção 2.1.1. Parametrizar uma molécula é um procedimento complexo e delicado, pois possíveis erros repercutirão nos resultados das simulações (a própria estrutura da molécula pode vir a 39 ter de ser modificada de acordo com a filosofia do campo de forças – é o que ocorre na representação de átomos unidos, por exemplo). Os valores para as constantes devem ser obtidos experimentalmente ou por cálculos quânticos, mas podem também ser deduzidos a partir de homologia, isto é, através da comparação de grupos funcionais da molécula de interesse com grupos funcionais de outras moléculas já parametrizadas no campo de forças. A parametrização das moléculas utilizadas nas simulações deste estudo não está incluída no escopo do trabalho; as estruturas e topologias foram obtidas de trabalhos de outros autores: • Os arquivos contendo a estrutura e a topologia da molécula de POPC utilizados foram obtidos do website de Peter Tieleman, , que disponibiliza diversos tipos de fosfolipídios na representação dos lipídios de Berger, fornecendo também os arquivos contendo os parâmetros a serem incluídos no campo de forças para que este trabalhe com estes novos tipos de átomos; • A topologia utilizada para a molécula de colesterol segue a utilizada originalmente em Hötje et al., (2001), e os arquivos utilizados foram gentilmente cedidos por Justin Lemkul; • A topologia para a molécula de curcumina foi construída através da ferramenta online Automated Topology Builder and Repository (ATB) (Malde et al., 2011; Koziara et al., 2014) , voltada para a parametrização de moléculas em campos de forças da família GROMOS; • Utilizou-se o modelo SPC para a representação das moléculas de água com os parâmetros originais do campo de forças GROMOS. 40 2.3 Parâmetros de Simulação As simulações apresentadas neste estudo, salvo se explicitada alguma observação contrária, foram realizadas sob o seguinte conjunto de parâmetros: Pacote de simulação: GROMACS, versão 5.1.2 (Abraham et al., 2015); Campo de forças: GROMOS96 53A6 (van Gunsteren et al., 1996), otimizado com os parâmetros de Berger para lipídios (Berger et al., 1997); Algoritmo de integração: Leap-frog (Hockney e Eastwood, 1974); Passo de integração: 2 fs, com a trajetória das partículas sendo salva a cada 20 ps, e energias a cada 5 ps; Condições periódicas de contorno: Tridimensionais; Tratamento das interações de curto alcance: Raio de corte de 1.2 nm; Tratamento das interações eletrostáticas: PME (Particle-mesh Ewald) (Darden e Pedersen, 1993; Essmann et al., 1995); Algoritmo para controle do comprimento das ligações: LINCS (Linear Constraint Solver) (Hess et al., 1997); Controle de temperatura: Termostato de Nosé-Hoover (Nosé, 1984; Hoover, 1985); Temperatura de referência: Tref = 310K, com uma constante de acoplamento de 2 ps, para dois grupos independentes: solvente (água) e demais moléculas (lipídios e curcumina), o que garante maior precisão nos resultados e evita que a velocidade de todas as partículas seja reescalonada por um mesmo fator; Controle de pressão: Parrinello-Rahman (Parrinello e Rahman, 1981; Nosé e Klein, 1983); Pressão de referência: Pref = 1 bar = 0,987 atm, com uma constante de acoplamento de 0.8 ps, para dois grupos independentes: solvente (água) e demais moléculas; Acoplamento de pressão: Semi-isotrópico, com os eixos x e y acoplados; Minização da energia: Método dos gradientes conjugados; Equilibração: 1 ns, realizada com os mesmos parâmetros da dinâmica (a equilibração visava apenas avaliar o processo de construção da caixa de simulação, uma vez que o equilíbrio do sistema, e da bicamada, é acompanhado durante a dinâmica). 41 2.3.1 Construção das caixas de simulação As caixas de simulação utilizadas neste trabalho, todas paralelepipédicas, foram construídas a partir de programas inclusos no pacote de simulação, GROMACS, ou através da ferramenta online Membrane Generator (MemGen) (Knight e Hub, 2015); a partir de arquivos de estrutura fornecidos pelo usuário, o MemGen alinha as moléculas em relação ao eixo z (a bicamada é construída no plano xy) e as dispõe na quantidade e proporção desejadas, construindo a bicamada como duas faces antiparalelas, e completando a caixa de simulação com a hidratação do sistema. O alinhamento realizado pelo construtor visa permitir a disposição dos lipídios numa bicamada compacta e consiste num artifício computacional não submetido a um campo de forças (não é uma simulação); por este motivo, o sistema deve ser submetido ao processo de minização de energia e uma extensa equilibração. O processo de equilibração das simulações deste estudo não compreende apenas o período indicado acima, 1 ns, pois a própria dinâmica consiste num processo de relaxação do sistema e estabilização da bicamada por centenas de nanosegundos, cuja evolução foi acompanhada atraveś de diversas grandezas (isto será abordado no Capítulo 3). As análises apresentadas a partir do próximo capítulo consideram apenas os 100 ns finais de estabilidade de cada simulação. Um resumo de todas as simulações, composição dos sistemas e extensão de cada dinâmica é apresentado no Apêndice. 2.3.2 Análise das trajetórias As análises das trajetórias obtidas foram realizadas através de programas do pacote de simulação; do programa GridMAT-MD (Allen et al., 2009), para o cálculo da área por lipídio; VMD (Humphrey et al., 1996), para visualização de moléculas e trajetórias, e algumas análises através de seu plugins; além de programas e scripts desenvolvidos para fins específicos. A descrição das principais análises realizadas é apresentada no próximo capítulo, antecedendo sua aplicação à simulação utilizada para validação dos parâmetros empregados (simulação de uma bicamada POPC pura). 42 3. SIMULAÇÃO DE BICAMADAS FOSFOLIPÍDICAS 3.1 Introdução A idealização da técnica de simulações por dinâmica molecular ocorreu no fim da década de 1950, com Alder e Wainwrigth (1957) estudando a interação de esferas rígidas; as partículas eram tratadas como bolas de bilhar numa caixa de simulação tridimensional, recocheteando ao esbarrarem nas paredes da caixa. Em 1964, Rahman (1964) desenvolveu a primeira simulação utilizando um potencial de interação realístico: as esferas passaram a assumir as propriedades de átomos de argônio (foram parametrizadas) e algumas propriedades obtidas do sistema, simulado na fase líquida, reproduziam aproximadamente resultados experimentais. A evolução dos modelos para a representação das moléculas e dos potenciais de interação, gradativamente possibilitou a simulação de sistemas mais complexos, como água na fase líquida (Stillinger e Rahman, 1974), uma proteína no vácuo (McCammon et al., 1977), uma bicamada lipídica (van der Ploeg e Berendsen, 1982) – como o sistema era simulado no vácuo, a estrutura era mantida por forças harmônicas representando as interações entre as cabeças dos lipídios e a água1. No fim da década de 1990, alguns trabalhos de simulação já abordavam a simulação de lipídios em ambiente aquoso, com as moléculas de água integrando o sistema (solvente explícito), mas o foco ainda era a modelagem e parametrização de ácidos graxos e esteróis (Murzyn e Pasenkiewicz-Gierula, 1999; Hötje et al., 2001). Dada a complexidade dos sistemas, as simulações foram gradativamente sendo aprimoradas para abordar fosfolipídios, micelas, bicamadas puras, bicamadas com mais de um componente lipídico e a interação de bicamadas com outras moléculas (Tieleman et al., 1997; Hirtz et al., 2014). Apesar do avanço tecnológico de hardware e software nas últimas duas décadas, a simulação de membranas biológicas permanece fora de alcance com a capacidade computacional disponível – são sistemas excessivamente complexos, com muitos componentes, e, muitas vezes, precisam ser grandes (para garantir que uma proteína não interaja com sua imagem, ou atingir as proporções adequadas de moléculas do sistema a ser simulado). A opção então é recorrer a sistemas mais simples que mimetizem as características 1 Tentativas de reproduzir o efeito da água sobre o sistema simulado, sem, no entanto, incluir moléculas de água na simulação, são conhecidas como simulações com solvente implícito. 43 mais importantes das membranas, principalmente o caráter aniônico das membranas de procariontes e zwitteriônico das membranas de células de eucariontes. Embora sejam biologicamente inconsistentes, a simulação de bicamadas puras (constituídas por apenas um tipo de fosfolipídio) ainda é muito comum: quando o interesse é observar o efeito da presença ou concentração de determinada molécula no sistema, o ponto de partida frequentemente é uma bicamada pura; estes sistemas servem também como corpo de prova em testes de novos parâmetros ou inovações nos algoritmos. E, no estudo de bicamadas puras, um grupo de fosfolipídios, as fosfatidilcolinas, sobressaem-se tanto em frequência quanto em proporção; a fundamentação é biológica: as fosfatidilcolinas são o tipo mais comum de fosfolipídio, tanto na parede celular de bactérias, quanto nas membranas plasmáticas de organismos superiores, perfazendo 20~50% da composição lipídica das células (Nelson e Cox, 2004). 3.2 POPC O tipo de fosfatidilcolina predominante em células de organismos eucariotos é a 1-palmitoil-2-oleoilfosfatidilcolina (POPC), um fosfolipídio zwitteriônico de caudas longas. A estrutura de uma molécula de POPC pode ser visualizada na Figura 3.1. Bicamadas formadas unicamente por moléculas de POPC são um dos sistemas lipídicos mais estudados por simulações por dinâmica molecular e por este motivo, aliado à relativa maior disponibilidade de dados experimentais, simulações de bicamadas puras POPC servem frequentemente de referência para a validação de conjuntos de simulações. Figura 3.1 – Representação de uma molécula de POPC (C42H82NO8P). A carga positiva do grupo colina compensa a carga negativa do fosfato, tornando a molécula zwitteriônica. O fosfolipídio apresenta uma cauda saturada (C1, ou sn-1) com 16 átomos de carbono, e uma cauda insaturada (C2, ou sn-2), com 18 átomos de carbono. 44 3.3 Simulação de uma Bicamada POPC Pura Com a finalidade de validar os parâmetros e modelagem utilizados nas simulações deste trabalho, a seguir faz-se um estudo de uma bicamada pura constituída de 130 moléculas de POPC e 4550 moléculas de água (35 moléculas por lipídio). Os valores de algumas grandezas de interesse são confrontados com dados experimentais disponíveis na literatura, e também referências de outros trabalhos de simulação. Os parâmetros de simulação utilizados são os apresentados na Seção 2.3 e a bicamada possui faces simétricas (cada monocamada é formada pela mesma quantidade de componentes); nesta, assim como para todas as demais simulações deste trabalho, não é verificada a troca de lipídios entre as faces da bicamada, o chamado flip-flop, e, portanto, cada monocamada permanece com a mesma quantidade e composição durante toda a simulação. Embora ocorra naturalmente, o flip-flop de um lipídio é um processo energeticamente muito desfavorável, pois envolve a passagem de grupos polares através da região apolar definida pelas caudas de ambas as faces da bicamada; a menos que o processo seja favorecido por algum mecanismo ou perturbação promovida, por exemplo, por proteínas ao se inserirem na membrana, arrastando junto moléculas de lipídio. Biologicamente, verifica-se flip-flop de fosfolipídios em escalas de tempo de horas (Nelson e Cox, 2014) – tempos muito superiores aos obtidos em simulações por dinâmica molecular. 3.3.1 Estabilidade do sistema A técnica de simulação por dinâmica molecular possibilita o estudo da evolução temporal de um sistema; sua dinâmica e estabilidade. No caso de simulações de bicamadas simples, formadas apenas por lipídios, sem proteínas ou outras moléculas que alterem a estrutura da bicamada, o foco é avaliar as propriedades da bicamada em condição estável; a estabilidade do sistema garante que as propriedades observadas sejam de fato características deste, e não devido a algum evento em particular verificável apenas sob certa condição ou intervalo de tempo. As propriedades calculadas devem portanto ser médias sobre períodos de verificada estabilidade do sistema. 45 Embora seja um dos sistemas miméticos de membrana mais simples possíveis, um sistema de fosfolipídios (POPC) e água não necessariamente apresenta um comportamento elementar – o período de observação do sistema é uma variável fundamental. Atualmente, períodos de análise de dezenas de nanosegundos de estabilidade são um padrão aceitável para estudos de bicamadas (40 ns: Zidar et al., 2009; 60 ns: Capponi et al., 2016; 80 ns: Porasso e Lópes Cascales, 2012; Ferreira et al., 2013; 100 ns: Wennberg et al., 2012); obviamente, quanto mais complexo o sistema, maior será o período de simulação necessário para a observação de um comportamento estável. O primeiro critério de avaliação da estabilidade do sistema simulado são suas variáveis termodinâmicas: a energia potencial da caixa de simulação e do sistema de interesse apresenta comportamento estável? A temperatura e a pressão, e consequentemente, também o volume, as dimensões da caixa de simulação e a densidade, estão oscilando em torno do valor desejado? As figuras a seguir trazem os gráficos de tais grandezas ao longo dos 100 ns finais da simulação – esta simulação em específico foi desenvolvida por 350 ns, dos quais somente os 100 ns finais são considerados nas análises, salvo se explicitado o contrário. O tamanho do período de análise dos sistemas, os 100 ns finais, leva em consideração não apenas a estabilidade da simulação em questão, mas também a de outras simulações do estudo; é portanto uma questão de padronização para as análises do conjunto de simulações do trabalho. Em cada gráfico, a linha tracejada indica o valor médio da grandeza ao longo do período considerado. O valor médio e o respectivo desvio padrão também são indicados no corpo dos gráficos. Figura 3.2 – Evolução temporal da pressão da caixa de simulação ao longo dos 100 ns finais da simulação. Os valores oscilam em torno da temperatura de referência, Tref = 1 bar = 0,987 atm. 46 Figura 3.3 – Gráfico da evolução temporal da temperatura da caixa de simulação ao longo dos 100 ns finais da simulação. Os valores oscilam em torno da temperatura de referência, Tref = 310K. Os gráficos da pressão (Figura 3.2) e temperatura (Figura 3.3) da caixa de simulação mostram que os valores destas grandezas oscilam em torno dos valores impostos como referência, Tref = 310K e Pref = 1 bar = 0,987 atm, respectivamente2, assegurando que os controles de temperatura e pressão estão atuando devidamente e que os valores aferidos para as propriedades da bicamada o serão na temperatura e pressão desejadas. Figura 3.4 – Evolução da energia potencial da caixa de simulação ao longo de seus 100 ns finais. 2 Deseja-se estudar a bicamada na fase líquido-cristalina, fase em que é biologicamente ativa. A temperatura escolhida para o estudo dos sistemas, 310K, está bem acima da temperatura de transição de fase gel/líquido- cristalina (transição lo-ld), 268K (Pozo-Navas et al., 2004), garantindo que, mesmo com as oscilações na temperatura, o sistema sempre estará na fase de interesse. 47 O gráfico da energia potencial da caixa de simulação (Figura 3.4) indica um comportamento estável em torno de um valor médio (linha tracejada vermelha). O cálculo de seu coeficiente angular (não mostrado na figura) resulta no valor de (-6 ± 3).10-1 kJ/mol.ns, desvio (drift) que indica que o sistema está bem equilibrado. Apesar da verificação da estabilidade do sistema, os valores apresentados para a energia potencial compreendem todos os componentes da caixa de simulação, ou seja, POPC e água, sendo este último predominante – são 35 moléculas de água para cada fosfolipídio. Mas o sistema de interesse é na realidade a bicamada e, pode-se questionar, uma relativa instabilidade desta pode estar sendo estatisticamente ocultada. Neste caso, para garantir a estabilidade da bicamada faz-se necessário verificar a interação energética somente das moléculas de fosfolipídio. Os gráficos a seguir mostram as energias de interação na bicamada: a interação das moléculas de POPC entre si (Figura 3.5), e a interação destas com as moléculas de água (Figura 3.6). Ambos indicam comportamento estável, tanto para as interações coulombianas, quanto para as do tipo van der Waals, revelando uma estabilidade dinâmica na interação entre os componentes lipídicos (a bicamada está formada e energeticamente estabilizada), e destes com a fase aquosa (há relativa estabilidade energética na interação entre os fosfolipídios e as moléculas de água), indicativo de que bicamada está estável e adequadamente hidratada. Figura 3.5 – Energia de interação (termos de Coulomb e van der Waals) entre os fosfolipídios da bicamada. Os valores estão normalizados pelo número de pares de interação, isto é, Nl. (Nl -1) /2, onde Nl é o número de moléculas de lipídio na bicamada. A linha tracejada (em vermelho) indica o valor médio de cada curva no período analisado, valor que também é apresentado no gráfico. 48 Figura 3.6 – Energia de interação (Coulomb e van der Waals) entre os fosfolipídios e as moléculas de água da caixa de simulação, normalizadas pelo total de pares de interação, ou seja, Np = (130 x4550) /2. 3.4 Análise da Bicamada Verificada a estabilidade da simulação, passa-se à análise de grandezas de interesse que caracterizem a bicamada para a temperatura e pressão de referência; quando disponíveis, a comparação dos valores obtidos com dados da literatura servirá à validação da simulação, e portanto dos parâmetros nela utilizados. As propriedades analisadas são dinâmicas e, consequentemente, também servirão como verificação da estabilidade (ou não) da bicamada no período considerado. 3.4.1 Área por lipídio Uma grandeza fundamental no estudo de bicamadas é a sua área por lipídio que, como o nome sugere, quantifica a área média ocupada por cada molécula de fosfolipídio no plano da bicamada. Neste caso, deve-se levar em consideração a constituição da bicamada em duas faces e como os lipídios estão distribuídos entre elas. Como a bicamada em análise é simétrica, as duas faces contém a mesma quantidade de lipídios, ou seja, cada monocamada é constituída por 65 moléculas de fosfolipídio. 49 Existem diversas fórmulas para se aferir a área por lipídio de uma bicamada em simulações computacionais, sendo a mais intuitiva a simples divisão da área do plano em que a bicamada está formada pelo número de lipídios em cada face (Zhao et al., 2007). A Figura 3.7 mostra como as dimensões da caixa de simulação flutuam em torno de um valor de equilíbrio sob o controle de pressão semi-isotrópico (as dimensões x e y são acopladas e deformam-se igualmente, produzindo curvas idênticas – curva preta; a dimensão z é independente das demais e seu valor é apresentado na curva verde). As dimensões da caixa de simulação são outra variável de estado importante na avaliação da estabilidade da dinâmica; caso alguma dimensão não estivesse estável, poderia ser um indicativo de mudança na estrutura da bicamada, o que não se verifica na simulação em análise. Figura 3.7 – Flutuação das dimensões da caixa de simulação que, sob o controle de pressão, são deformadas para garantir que a pressão do sistema oscile em torno do valor de referência. As linhas tracejadas em vermelho indicam o valor médio das curvas no período (valor que também é apresentado na legenda do gráfico). Embora prático, a divisão da área do plano da bicamada por metade do número de lipídios da caixa de simulação pode produzir erros por tratar de forma equivalente todos os lipídios. A Figura 3.8 mostra a projeção da posição dos átomos de fósforo de cada fosfolipídio em determinado instante da simulação. Pela posição destes, fica evidente que os fosfolipídios estão distribuídos essencialmente em duas regiões no eixo z, estabelecendo as duas faces da bicamada, mas esta distribuição está longe de ser planar – os fosfolipídios podem ocupar posições mais internas ou externas ao plano médio. Ao dividir a área do plano xy da caixa de simulação pelo número de lipídios da face, é atribuída a mesma participação no plano a cada fosfolipídio – o que não é rigorosamente correto. Algumas moléculas, por estarem mais 50 internas ao “plano” da bicamada (mais “enterradas” na estrutura), ocuparão uma área menor na interface, enquanto que as mais proeminentes participarão com uma área maior. Outra forma de calcular a área por lipídio de uma bicamada consiste na decomposição dos “planos” estabelecidos pelos lipídios em diagramas de Voronoi (Shinoda e Okazaki, 1998). Neste caso, a posição de cada átomo de fosfolipídio considerado constitui uma semente e o plano será descomposto num número de células equivalente ao número de lipídios constituintes da face; um ponto i do plano pertencerá à célula definida pelo átomo de fósforo Pi se, e somente se, a distância de i a Pi for menor do que sua distância à todas as demais sementes do plano. Tal método produz diagramas como o apresentado na Figura 3.9. Figura 3.8 – Projeção da posição dos átomos de fósforo das moléculas de POPC no plano xz num instante qualquer da simulação. Os 65 fosfolipídios de cada monocamada definem um “plano” (ilustrado pela posição de um dos átomos da cabeça do fosfolipídio), mas há diferenças individuais na disposição dos lipídios em relação ao eixo z, e consequentemente, a área ocupada por cada molécula na interface depende da posição do fosfolipídio em relação ao plano médio. Figura 3.9 – Decomposição de um plano em diagramas de Voronoi. Cada ponto do plano é atribuído à semente (em preto) que estiver mais próxima; o que resulta na segmentação do plano em tantos polígonos quanto forem as sementes. Atenção, o plano da bicamada ocorre no plano xy e sua decomposição ocorre de maneira semelhante à mostrada na figura ao lado; entretanto, para mostrar que a distribuição dos lipídios no eixo perpendicular ao plano da bicamada (eixo z) não é regular, na Figura 3.8 é mostrada a projeção dos átomos de fósforo no plano xz – não é plano da bicamada, portanto. Imagem extraída de: en.wikipedia.org/wiki/Voronoi_diagram. 51 Aplicando o método à bicamada, um fosfolipídio que estiver acima do plano médio (que estiver mais sobressaltado em relação à estrutura) participará com uma área maior no plano da bicamada, pois seu grupo fosfato, ou até mesmo o glicerol, apresentarão uma seção transversal (um polígono) de maior área – interpretando fisicamente, como o lipídio sobressaltado é mais volumoso naquela região, para evitar impedimentos estéricos, as demais moléculas estarão mais afastadas da molécula considerada e, consequentemente, a área ocupada por esta no plano médio será maior. Analogamente, um fosfolipídio que estiver mais “enterrado” na bicamada terá uma menor participação no plano médio desta (definirá um polígono de menor área, pois sua seção transversal será menor) e, por apresentar-se menos volumoso naquela região, possibilita a aproximação de outros fosfolipídios e terá uma menor participação no plano da bicamada. Assim, no cálculo da área por lipídio através de diagramas de Voronoi cada molécula de fosfolipídio é tratada individualmente e não incorre-se no erro de considerar que cada molécula ocupa a mesma área no plano, não em cada instante. Figura 3.10 – Oscilação da área por lipídio, calculada através de diagramas de Voronoi, ao longo dos 100 ns finais da simulação. Como as monocamadas da estrutura possuem a mesma quantidade de lipídios, e o acoplamento de pressão é semi-isotrópico, a área por lipídio obtida é igual para ambas as faces e estas podem ser tratadas sem distinção, por isso o gráfico apresenta uma única curva. A implementação do cálculo da área por lipídio através de diagramas de Voronoi foi feita através do software GridMAT-MD (Allen et al., 2009) e a variação da área por lipídio ao longo do período de simulação em análise é apresentada no gráfico da Figura 3.10. Observa- se um comportamento relativamente estável (ainda que com um sobressalto entre 30 e 40 ns), com os valores oscilando em torno do valor médio (0,66 ± 0,01) nm². O drift calculado para 52 os pontos do gráfico (não mostrado neste) é de (1.4 ± 1.2).10-5 nm²/ns, outro indicativo de estabilidade. A comparação do valor obtido, (0,66 ± 0,01) nm², com outros relatados em trabalhos de simulação por dinâmica molecular a 310K: (0,659 ± 0,009) nm² (Zhao et al., 2007), utilizando GROMOS96 modificado com parâmetros de Berger, (0,645 ± 0,02) nm² (Canto et al., 2011), utilizando GROMOS87; ou à 300K: (0,646 ± 0,01) nm² (Capponi et al., 2016), utilizando CHARMM36, revela boa concordância entre este estudo e a literatura; o que também se verifica se observadas medições experimentais para a área por lipídio de filmes (monocamadas) de POPC sob pressão, 0,63~0,66 nm² (Smaby et al., 1997; Hyslop et al., 1990) e espalhamento de raios-X à 303K, (0,643 ± 0,013) nm² (Kučerka et al., 2011). 3.4.2 Análise da estrutura da bicamada Análises da estrutura de bicamadas são realizadas através de gráficos de perfis de densidade (de massa ou eletrônica) no eixo perpendicular ao plano da membrana. Este tipo de gráfico consiste no resultado da varredura, ao longo de determinado eixo, para o grupo de átomos ou moléculas desejado, durante o período considerado; os valores obtidos são médias sobre o número de átomos ou moléculas e também médias sobre a quantidade de estruturas (frames) analisadas. Como os frames de uma dinâmica possuem correlação entre si, um frame é a evolução do anterior para determinado Δt, perfis de densidade são também médias temporais e servem ao propósito de revelar a estrutura formada, e a estabilidade desta, ao longo do eixo considerado. Bicamadas são estruturas ordenadas que promovem inclusive separação de fase no sistema (ver Figura 3.11). Por serem aproximadamente planares, a análise do perfil de densidade no eixo perpendicular ao plano ocupado pela bicamada é uma análise quantitativa da estrutura formada: ao longo do eixo, aonde o átomo ou molécula estiver presente, esta será quantificada; por outro lado, uma densidade nula indica a ausência daquele tipo de átomo ou molécula na região. Um perfil médio sobre diversos frames indicará a permanência ou não da estrutura formada – é uma análise quantitativa da estabilidade. Como o número de partículas numa caixa de simulação é sempre conservado, a soma dos valores para determinado átomo ou molécula deve ser o mesmo em cada frame e quanto maior for o pico observado, maior será o ordenamento do grupo considerado. A Figura 3.12 53 mostra o perfil de densidade de massa, no eixo perpendicular ao plano da bicamada (eixo z), para a bicamada POPC pura; fica evidenciada a estruturação da bicamada (a análise quantitativa da estrutura observada na Figura 3.11 – que apresenta apenas um frame) e a separação de fases promovida pela bicamada: nos extremos da caixa de simulação, o sistema é composto unicamente por moléculas de água; no centro, apenas por fosfolipídios (região das caudas apolares), e numa região intermediária coexistem moléculas água e fosfolipídio (região hidratada da bicamada, definida pelas cabeças polares). Figura 3.11 – Visualização ortogonal da configuração do sistema em determinado instante da simulação: água (vermelho e branco) e fosfolipídios (ciano), com destaque para os átomos de fósforo destes (esferas em laranja). Figura 3.12 – Perfil de densidade dos componentes da caixa de simulação: água e fosfolipídios (também é destacada a distribuição dos grupos fosfato das moléculas de fosfolipídio) ao longo do eixo perpendicular ao plano definido pela bicamada (eixo z). As curvas mostradas são médias para os 100 ns finais da simulação e comprovam a estabilidade da estrutura no período (não há perturbação aparente da bicamada, nem t