RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta dissertação será disponibilizado somente a partir de 28/02/2021. Caracterização anatômica, química e ultraestrutural de espinhos secretores em duas espécies de Opuntioideae (Cactaceae) STEFANY CRISTINA DE MELO SILVA BOTUCATU-SP 2019 Dissertação de Mestrado apresentada ao Instituto de Biociências, campus de Botucatu, UNESP, para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas (Botânica), Área de concentração: Morfologia e Diversidade Vegetal. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “Julio de Mesquita Filho” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU Caracterização anatômica, química e ultraestrutural de espinhos secretores em duas espécies de Opuntioideae (Cactaceae) STEFANY CRISTINA DE MELO SILVA PROFª DRª TATIANE MARIA RODRIGUES ORIENTADORA BOTUCATU-SP 2019 Dissertação de Mestrado apresentada ao Instituto de Biociências, campus de Botucatu, UNESP, para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas (Botânica), Área de concentração: Morfologia e Diversidade Vegetal. DEDICATÓRIA Dedico este trabalho aos meus pais, Cecília e José, ao meu irmão Lucas, à minha avó Catarina e ao meu namorado Henrique por todo o amor, incentivo e apoio na trajetória da minha vida. AGRADECIMENTOS À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pela bolsa de Mestrado (Proc. 2017/14891-5). À Coordenação de Aperfeiçoamento Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) pelo apoio financeiro (Código de Financiamento 001). À Profa. Dra. Tatiane Maria Rodrigues pelos ensinamentos, orientação e comprometimento. À Profa. Dra. Silvia Rodrigues Machado pela colaboração e auxílio nas análises das amostras. À Profa. Dra. Elza Guimarães pelas dicas sobre a coleta de néctar; e à doutoranda Marília Quinalha por ter me ensinado a realizar as coletas de néctar. Ao Prof. Dr. Nepi Massimo pela colaboração com as análises químicas de néctar. Aos membros da banca de Qualificação Dra. Camila Kissmann, Dr. Sérgio Adachi e Dra. Emília Arruda pelas contribuições. Aos docentes do departamento de Botânica pela boa convivência e ensinamentos. À todos funcionários do departamento de Botânica pela convivência e auxílios. Agradeço em especial, à Inara, à Heloísa, ao Kleber e ao Sr. Áureo pelos auxílios nos diversos momentos. Aos funcionários da biblioteca/ Ponto de Apoio FAPESP pela atenção e pelo ótimo atendimento. Aos funcionários da Seção de Pós-Graduação, IBB, UNESP, pelo pronto atendimento. À Yve Canaveze e ao Sérgio Adachi pela amizade, convivência e ensinamentos. Às queridas amigas Laisa Cabral e Eliandra Nunes por todo carinho, companheirismo e apoio. Aos colegas de laboratório: Ricardo, Fernanda, Diana, Juan, Daiane, Tayeme e Wanderléia pela amizade e pelos bons momentos compartilhados. Agradeço, em especial, à Deus pela graça de realizar este sonho acadêmico e profissional. Agradeço ao meu companheiro Henrique Vasque por todo apoio, paciência, compreensão, conselhos e pela troca de conhecimento. Muito obrigada! Obrigada à minha família que é a minha base, meu apoio! Enfim, a todos que de alguma forma contribuíram para a realização deste estudo, meus sinceros agradecimentos! Sumário Resumo.......................................................................................................................................1 Abstract ......................................................................................................................................2 Introdução...................................................................................................................................3 Material e Métodos.....................................................................................................................4 Resultados...................................................................................................................................9 Discussão..................................................................................................................................14 Referências bibliográficas.........................................................................................................19 Tabelas......................................................................................................................................26 Figuras e legendas.....................................................................................................................28 Conforme estabelecido pelo Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Botânica) do IBB, UNESP, os resultados obtidos durante a execução do Projeto de Mestrado foram reunidos em um artigo científico para publicação apresentado de acordo com as normas do periódico Plant Biology (A2 – Comitê de Biodiversidade da Capes). 1 SILVA, S. C. M. CARACTERIZAÇÃO ANATÔMICA, QUÍMICA E ULTRAESTRUTURAL DE ESPINHOS SECRETORES EM DUAS ESPÉCIES DE OPUNTIOIDEAE (CACTACEAE). 2019. 54p. DISSERTAÇÃO (MESTRADO) – INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS, UNESP – UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA, BOTUCATU. Resumo. Nectários extraflorais (NEFs) são comuns e morfologicamente diversos em Cactaceae, podendo se apresentar como espinhos altamente modificados ou não, folhas escamiformes e regiões epidérmicas e corticais especializadas na base ou ao redor das aréolas. Contudo, pouco é conhecido sobre a natureza dos NEFs em cactos e, mesmo, há dúvidas se o exsudato pode ser qualificado como néctar. Nosso objetivo foi analisar a morfologia, anatomia e ultraestrutura dos espinhos secretores em Brasiliopuntia brasiliensis e Nopalea cochenillifera e a composição química da secreção. Espinhos secretores foram processados para análises aos microscópios de luz (campo claro e confocal) e eletrônicos de varredura e transmissão (convencional e citoquímica). A composição dos açúcares e de aminoácidos foi analisada por cromatografia líquida de alta performance (HPLC). Observações de campo mostraram que o exsudato acumulado no ápice dos espinhos é removido por formigas. Os aspectos ontogenéticos, estruturais e funcionais dos espinhos secretores se mostraram semelhantes nas duas espécies estudadas. Os espinhos secretores se originam a partir do meristema areolar, tendo início como pequenas protuberâncias formadas por protoderme e meristema fundamental. Espinhos na fase secretora apresentaram a) base dilatada preenchida por células pequenas com paredes pecto- celulósicas delgadas, citoplasma denso e núcleo volumoso; b) região mediana alongada composta por células fibriformes com paredes não-lignificadas; e c) porção apical afilada com células fusiformes com paredes não-lignificadas. Tecidos vasculares estão presentes na região basal dos espinhos. Ultraestruturalmente, as células da região basal apresentaram contorno irregular e parede com plasmodesmos amplos; a lamela média é intumescida nos ângulos entre as células; no citoplasma ocorrem mitocôndrias, retículo endoplasmático rugoso, poliribossomos, plastídios e dictiossomos abundantes. Análises citoquímicas permitiram identificar a origem dictiossomal das vesículas encontradas no citoplasma dessas células e o mecanismo de liberação da secreção via exocitose. As análises químicas indicaram que o exsudato liberado pelos espinhos secretores é rico em açúcares; em ambas as espécies o exsudato se mostrou sacarose-dominante e com perfil de aminoácidos similar. Nossos resultados indicam a ocorrência de intensa síntese de substâncias hidrofílicas confirmando que tais espinhos são nectários extraflorais. Palavras-chave: cacto, estrutura, funcionamento, néctar, nectário extrafloral 2 SILVA, S. C. M. ANATOMICAL, CHEMICAL AND ULTRASTRUCTURAL CHARACTERIZATION OF SECRETORY SPINES IN TWO SPECIES OF OPUNTIOIDEAE (CACTACEAE). 2019. 54p. DISSERTAÇÃO (MESTRADO) – INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS, UNESP – UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA, BOTUCATU. Abstract. Extrafloral nectaries (EFNs) are common and morphologically diverse in Cactaceae, and may be highly modified spines or not, scamiform leaves and specialized epidermal and cortical regions located at the base or around the areoles. However, little is known about the nature of EFNs in cacti, and even if the exudate can be qualified as nectar. We aimed to analyze the morphology, anatomy and ultrastructure of the secretory spines in Brasiliopuntia brasiliensis and Nopalea cochenillifera and the chemical composition of the secretion. Secretory spines were processed for light (bright field and confocal) and scanning and transmission (conventional and cytochemical) electron microscopy. The composition of sugars and amino acids was analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC). Field observations have shown that the exudate accumulated at the apex of the spines is removed by ants. The ontogenetic, structural and functional aspects of the secretory spines were similar in both species. Secretory spines originate from the areolar meristem, beginning as small protuberances formed by protoderm and fundamental meristem. Spines in the secretory phase presented a) dilated base filled by small cells with thin pecto-cellulosic walls, dense cytoplasm and voluminous nucleus; b) elongated median region composed of fibriform cells with non-lignified walls; and c) apical portion tapered with fusiform cells with non-lignified walls. Vascular tissues are present in the basal region of the spines. Ultrastructurally, the cells of the basal region presented irregular shape and walls with wide plasmodesmata; the middle lamella is swollen at the angles between the cells; mitochondria, rough endoplasmic reticulum, polyribosomes, plastids and abundant dictyosomes occurred in the cytoplasm. The cytochemical analyzes allowed us to identify the dictiosomal origin of vesicles found in the cytoplasm of these cells and the mechanism of secretion release via exocytosis. Chemical analyzes indicated that the exudate released by the secretory spines is rich in sugars; in both species the exudate was sucrose-dominant and with a similar amino acid profile. Our results indicated the occurrence of intense synthesis of hydrophilic substances confirming that these spines are extrafloral nectaries. Keywords: cactus, extrafloral nectary, functioning, nectar, structure 3 INTRODUÇÃO Nectários extraflorais (NEFs) são estruturas secretoras de néctar, um fluido aquoso constituído por mono (frutose, glicose) e dissacarídeos (sacarose) (Fahn 1979), podendo conter outras substâncias como, por exemplo, aminoácidos (Baker & Baker 1973; Koptur 2005). A secreção liberada pelos NEFs pode atrair insetos, principalmente formigas, em busca de recursos energéticos ou da água contida no néctar (Ruffner & Clark 1986). Essas glândulas podem ocorrer em porções vegetativas, tais como no caule, pecíolo, estípulas, ou até mesmo em porções reprodutivas das plantas; entretanto, não estão diretamente relacionados com a polinização (Bentley 1977; Koptur 2005). Estruturalmente, em seu formato mais comum, os NEFs são constituídos por parênquima especializado e por epiderme secretora; entretanto, os NEFs apresentam ampla diversidade morfológica dentre as Angiospermas (Fahn 1979; Nepi 2007). A presença de NEFs tem sido relatada em muitos grupos de plantas, ocorrendo em cerca de 3940 espécies e em 108 famílias, inclusive em Cactaceae (Weber & Keeler 2013). Os representantes de Cactaceae, geralmente, apresentam caules suculentos com numerosos espinhos localizados em aréolas (Rocha & Agra 2002; Sánchez et al. 2014). As aréolas representam uma das sinapomorfias de Cactaceae (Nyffeler 2002) e são constituídas por um conjunto de meristemas axilares e ramos encurtados (Soller et al. 2014; Mauseth et al. 2016) de onde se originam novos ramos vegetativos ou reprodutivos, além dos espinhos, gloquídeos e tricomas (Boke 1951; Nyffeler 2002). Os espinhos são evolutivamente relacionados com a perda de folhas em Cactaceae e podem representar a única evidência de folhas em diversas espécies da família (Anderson 2001). Espinhos de Cactaceae, em geral, são considerados escamas modificadas da gema axilar, ou folhas modificadas de um caule reduzido (Mauseth 1976; Boke 1980). Assim como as aréolas, os espinhos são considerados uma das sinapomorfias da família (Judd et al. 2008) e podem ser classificados em dois tipos: a) espinhos lignificados, presentes na maioria das espécies de Cactaceae; e b) gloquídeos, um tipo de espinho pequeno encontrado apenas em membros da subfamília Opuntioideae (Gibson & Nobel 1986; Mauseth 2006). Nessa subfamília ocorre uma ampla variedade de formas de transição entre folhas e espinhos e entre folhas e gloquídeos na região areolar (Arruda & Melo-de-Pinna 2016). Na família, a ocorrência NEFs tem chamado a atenção de pesquisadores desde o final do século XIX (Ganong 1894; Lloyd 1908) e tem sido objeto de estudos até os dias atuais (Mauseth et al. 2016). A diversidade morfológica e a localização dos NEFs representam caracteres de valor taxonômico em Cactaceae, podendo contribuir com a distinção de gêneros 4 e espécies (Mauseth et al. 2016). Além disso, a importância ecológica dos NEFs na família também tem sido ressaltada em trabalhos que mostram os benefícios das relações mutualísticas com formigas e a sazonalidade da secreção (Pickett & Clark 1979; Ness 2006). Contudo, muitos detalhes sobre a localização, mofologia e anatomia dos NEFs em Cactaceae permanecem desconhecidos, até mesmo no que se refere a espécies com as glândulas mais evidentes e altamente modificadas (Mauseth et al. 2016). Assim, estudos sobre a morfogênese e funcionamento dos NEFs em Cactaceae podem apresentar grande valor agregado, fornecendo subsídios para estudos taxonômicos (Mauseth et al. 2016) e ecológicos (Díaz- Castelazo et al. 2005). Esse trabalho teve como objetivo analisar a morfologia, anatomia e ultraestrutura dos espinhos secretores em duas espécies de Opuntioideae, Brasiliopuntia brasiliensis (Willd.) A. Berger e Nopalea cochenillifera (L.) Salm-Dyck, além de investigar a composição química da secreção produzida por eles. Estas espécies foram escolhidas como modelo para os estudos uma vez que sobre o ápice de alguns espinhos presentes nas aréolas de caules jovens foram observadas pequenas gotas de líquido transparente e viscoso, as quais eram removidas por formigas. MATERIAIS E MÉTODOS Espécies estudadas Brasiliopuntia brasiliensis (Willd.) A. Berger. (sin. Opuntia brasiliensis) é uma espécie arbustiva (Fig. 1A) nativa do Brasil, com potencial ornamental (Azevedo et al. 2013), conhecida popularmente por xiquexique-do-sertão (Zappi & Taylor, in prep). É encontrada principalmente nas regiões Nordeste e Sudeste do Brasil (Scarano et al. 2001), havendo relatos de sua presença na Amazônia, Caatinga, Mata Atlântica, Cerrado e no Pantanal (Zappi & Taylor, in prep). Suas flores apresentam coloração esverdeada a amarela e seus frutos são globosos amarelo-esverdeados (Zappi et al. 2007). Apresenta porção caulinar principal com formato cilíndrico, além de segmentos basais e intermediários cilíndricos e segmentos terminais aplanados (cladódios) (Fig. 1A) contendo aréolas responsáveis pela formação de tricomas tectores e diferentes tipos de espinhos (Fig. 1B-E). Nopalea cochenillifera (L.) Salm-Dyck (sin. Nopalea coccenellifera (L.) Salm-Dyck) é uma espécie arbustiva nativa do México conhecida popularmente por palma-miúda ou palma-doce (Zappi & Taylor, in prep). No Brasil, ocupa regiões da Caatinga, Cerrado, Mata 20 Amato B., Petit S. (2017) A review of the methods for storing floral nectars in the field. Plant Biology, 19, 497-503. Anderson E.F. (2001) The Cactus Family. Timber Press, Portland, Oregon: 776 pp. Armstrong J.A. (1956) Histochemical differentiation of nucleic acids by means of induced fluorescence. Experimental Cell Research, 11, 640-643. Arruda E. (2010) Histogênese de segmentos caulinares de espécies de Opuntioideae (Cactaceae). 141 f. 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