UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS – RIO CLARO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS (BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR) CARACTERIZAÇÃO DE DUAS LINHAGENS SIMPÁTRICAS DE Atta laevigata CINTIA MARIA SANTOS BEZERRA Tese apresentada ao Instituto de Biociências do Campus de Rio Claro, Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Ciências Biológicas (Área: Biologia Celular e Molecular). Março – 2013 CINTIA MARIA SANTOS BEZERRA CARACTERIZAÇÃO DE DUAS LINHAGENS SIMPÁTRICAS DE Atta laevigata Tese apresentada ao Instituto de Biociências do Campus de Rio Claro Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, como parte dos requisitos para obtenção do titulo de Doutor em Ciências Biológicas. (Área: Biologia Celular e Molecular). Orientador: Prof. Dr. Maurício Bacci Júnior Coorientador: Prof. Dr. Luíz Carlos Forti Rio Claro 2013 Dedicatória Dedico esta tese aos meus pais Sebastião e Ginalva, vocês foram responsáveis pelo alicerce de minha história. Agradecimentos Agradeço a Deus por tudo que me concedeste e por colocar em meu caminho pessoas amigas e preciosas. Agradeço ao meu amor Gerônimo, que mesmo estando alguns quilômetros de distância, se manteve firme. Muito obrigada pela paciência, compreensão e companheirismo. Você é um presente de Deus. Amo você! Aos meus pais, em especial a minha mãe, que sempre compartilhou de todos os momentos de minha vida, meu ponto de apoio. Aos meus irmãos Samuel e Denison, as minhas cunhadas Ryvia, Tatiane, Miriam e Rosineire pela força e pelo cuidado para comigo. Não poderia deixar de agradecer aos meus sobrinhos Isly, Inlan e Luiz pelos momentos agradáveis e descontraídos. Amo todos vocês! Sou muito grata ao Dr. Maurício Bacci, pela orientação, paciência, pelos conselhos, idéias e pela confiança em mim depositada durante a execução deste trabalho. Sob a sua orientação tive a oportunidade de aprender bastante. Muitíssimo obrigada! Agradeço ao meu coorientador Dr. Luiz Carlos Forti, pelo apoio no trabalho de campo. Aos meus colegas e amigos do CEIS, Carol, Joaquim, Franco, Paula, Carlos, Mariana, Alexandre Takara, Suzana, Daiane, Necis, Amanda, Ita e Sandra. Muito obrigada pelos momentos alegres. Sou muito grata a Cynara, Joana, Letícia, Alexandre Somera e Tássio vocês me ajudaram bastante. Em especial a duas pessoas que Deus colocou em minha vida para me ajudar, Sérgio Kakazu e Milene não tenho palavras para expressar a minha gratidão. A todos vocês muito obrigada! As minhas novas amigas Sueli Sanches, Fabiana Alonso e Cíntia Henrique muito obrigada pela força, ajuda e carinho durante a minha estada em Rio Claro, vocês foram sensacionais. E também aos velhos amigos que mesmo distante sempre torceram por mim Taciana, Marta, Tânia Regina, Ednailza, Estela Ferraz, Daracy, Nicolino e Marcos Luciano. Amo todos vocês! Por fim, agradeço a Unesp, pela infraestrutura e a Fapesp, pelo apoio financeiro. Resumo Resumo As formigas da tribo Attini apresentam um mutualismo com fungos basidiomicetos. Entre as attíneas, uma das mais derivadas é a formiga cortadeira Atta laevigata, que se apresenta com ampla distribuição na América do Sul e dividida em duas linhagens mitocondriais. Esta cortadeira já foi classificada em até três subespécies ou mesmo em duas espécies distintas, mas atualmente é considerada uma única espécie com grande variação morfológica. No presente trabalho, foram analisados indivíduos de 84 ninhos de A. laevigata em duas áreas na região Sudeste do Brasil. Nessas áreas foram encontrados indivíduos em ambas as linhagens mitocondriais, denominadas de linhagem I e II. Os machos da linhagem I se apresentaram distintos dos machos da linhagem II, com relação ao peso, dimensões do abdômen e estruturas da genitália. A congruência entre os marcadores morfológicos e mitocondriais sugere que as duas linhagens simpátricas de A. laevigata estão reprodutivamente isoladas, caracterizando um processo de especiação em andamento. Ninhos de ambas as linhagens de A. laevigata contiveram o mesmo fungo mutualista, Leucoagaricus gongylophorus, em três grupos gênicos distintos. Portanto, o processo de especiação em A. laevigata não foi causado por uma especialização no cultivo de um determinado grupo de fungo. Indivíduos simpátricos de linhagens distintas puderam realizar o voo nupcial simultaneamente. No entanto, análises de quatro lócus mitocondriais e seis lócus microssatélites mostraram que cada fêmea em uma das linhagens é fecundada exclusivamente (ou ao menos predominantemente) por machos da mesma linhagem. Portanto, há uma barreira pré-zigótica levando ao isolamento reprodutivo entre indivíduos simpátricos de linhagens distintas. Esta barreira foi provavelmente causada pelas diferenças corpóreas dos machos, incluindo a genitália, que dificulta, ou mesmo impede, a cópula entre indivíduos de linhagens distintas. Palavras-chaves: barreira pré-zigótica, formiga cortadeira, linhagem mitocondrial, variação morfológica. Abstract Ants of Attini tribe have a mutualism with basidiomycete fungi. Among Attini ants, one of the most derived species is the leafcutter ant Atta laevigata, which has a wide distribution in South America and split into two mitochondrial lineages. This leafcutter has been classified into three subspecies or even up into two distinct species, but nowadays is considered a single species with great morphological variation. In this study, we analyzed 84 individuals from nests of A. laevigata located in two areas of southeastern region of Brazil. Individuals from both mitochondrial lineages, called lineage I and II, were found in those areas. Males of lineage I were different from males of lineage II, concerning weight, dimensions of the abdomen, and genitalia structures. The congruence between morphological and mitochondrial markers suggests that the two sympatric lineages of A. laevigata are reproductively isolated, characterizing a speciation process in progress. Nests of both A. laevigata lineages contained the same mutualistic fungus, Leucoagaricus gongylophorus, in three distinct genetic groups. Therefore, A. laevigata speciation process was not caused by a specialization in the cultivation of a particular group of fungi. Sympatric individuals of distinct lineages could perform the nuptial flight simultaneously. However, analysis of four mitochondrial and six microsatellite locus showed that each female from a lineage is fertilized exclusively (or at least predominantly) by one to six males from the same lineage. Thus, there is a pre zygotic barrier leading to reproductive isolation between sympatric individuals of distinct lineages. This barrier was probably caused by physical differences of males (including the genitalia) that makes it difficult, or even prevents the mating between individuals of different lineages. Keywords: pre zygotic barrier, mitochondrial lineage, morphological variation SUMÁRIO Página INTRODUÇÃO GERAL................................................................................. 10 OBJETIVOS ................................................................................................... 20 REFERÊNCIAS .............................................................................................. 22 CAPÍTULO I………………………………………………………………... 25 Characterization of two sympatric and morphologically distinct lineages of Atta laevigata F. SMITH 1858 (Formicidae: Myrmicinae: Attini) Resumo ……………………………………………………………………... 27 Abstract ……………………………………………………………………... 28 Introduction …………………………………………………………………. 29 Results ………………………………………………………………………. 30 Discussion …………………………………………………………………... 31 Conclusion ………………………………………………………………….. 33 Materials and methods ……………………………………………………… 33 List of abbreviation used ……………………………………………………. 36 Authors’ contributions ……………………………………………………… 36 Acknowledgements …………………………………………………………. 36 Figure legends ………………………………………………………………. 36 References …………………………………………………………………... 38 Tables ……………………………………………………………………….. 40 Figures ………………………………………………………………………. 43 Appendix……………………………………………………………………... 48 CAPÍTULO II .................................................................................................. 49 Fatores envolvidos com a especiação em Atta laevigata F. Smith 1858 (Formicidae: Myrmicinae: Attini) Resumo ……………………………………………………………………... 51 Abstract ……………………………………………………………………... 52 Introdução ...................................................................................................... 53 Material e métodos ........................................................................................ 55 Resultados ...................................................................................................... 59 Discussão ........................................................................................................ 72 Conclusão ....................................................................................................... 75 Referências ..................................................................................................... 76 CONCLUSÃO FINAL ................................................................................... 78 10 Introdução 11 Introdução geral As formigas cortadeiras (Hymenoptera: Formicidae) são as mais apomórficas dentro da tribo Attini de formigas cultivadoras de um fungo mutualista. São classificadas em dois gêneros: Atta, conhecidas popularmente como saúvas, e Acromyrmex, conhecidas como quenquéns. São consideradas herbívoros generalistas, atacando uma grande variedade de plantas (CHERRETT, 1989). Consumindo mais vegetação que qualquer outro herbívoro de diversidade semelhante (HÖLLDOBLER; WILSON, 1990). As formigas cortadeiras recebem esse nome porque cortam as plantas e transportam os fragmentos para o interior do ninho. Sobre estes fragmentos cultivam um fungo simbionte, Leucoagaricus gongylophorus, que lhes serve de fonte de alimento e enzimas (MÜLLER et al., 2001; SILVA et al., 2003; SILVA-PINHATI et al., 2004). Esse mutualismo proporciona benefícios a ambos os organismos: o fungo fornece nutriente e enzimas que facilitam degradação do material vegetal, a formiga coleta e prepara o substrato para o crescimento do fungo (SIQUEIRA, 1998; SILVA et al., 2003) e oferece um ambiente livre de competidores através da aplicação de compostos antibióticos por elas produzidos (CURRIE et al., 1999). Este fungo apresenta-se como duas linhagens simpátricas e distribuídas indistintamente entre espécies de Atta e de Acromyrmex (SILVA-PINHATI et al., 2004). As cortadeiras são endêmicas da região neotropical (WEBER, 1972; HÖLLDOBLER; WILSON 1990). As saúvas ocorrem em todos os países americanos, exceto no Chile, em algumas ilhas das Antilhas e no Canadá (MARICONI, 1970; WEBER, 1972) e também até altitude de 2500 m acima do nível do mar (HOLLDOBLER; WILSON 1990). Dentre as saúvas, destacamos Atta laevigata F. Smith, 1858, conhecida popularmente como “saúva cabeça de vidro” caracterizada por apresentar soldados com cabeça e gáster brilhantes e sem pelos (ANJOS et al., 1998). A. laevigata tem na Venezuela o extremo Norte de sua distribuição e ocupa praticamente todas as regiões do Brasil, exceto a Região Sul (Figura 1) (DELABIE et al., 2011). Essas formigas nidificam na beira de estradas, em terrenos arenosos, em vegetação rasteira ou capoeiras e na periferia de áreas de mata (DELABIE et al., 1997) e são consideradas pragas agrícolas. Um único ninho adulto de saúva pode chegar a até 20 anos de idade e (WEBER, 1996) conter aproximadamente oito milhões de operárias, todas geradas a partir de uma única rainha (HÖLLDOBLER; WILSON, 1990). Ninhos adultos investem muita energia na produção de machos e fêmeas (KELLER, 1995), que, em um determinado período do ano, se acasalam e dispersam, num fenômeno 12 denominado de reviada (HÖLLDOBLER; WILSON, 1990). A revoada acontece em períodos diferentes em cada região brasileira (MARICONI, 1970; DELLA LUCIA; BENTO, 1993; DELABIE et al., 2002). No estado de São Paulo a revoada ocorre entre os meses de setembro a dezembro em dias de calor após chuvas fortes (AUTUORI, 1941). Nesta fase as formas reprodutivas (as fêmeas içás e os machos bitus) saem do formigueiro para realizarem seu voo nupcial. Mas, antes de abandonarem o formigueiro, as içás carregam um pellet de fungo mutualista em sua cavidade infrabucal (KERR, 1961) para cultivo de seu próprio jardim. O acasalamento acontece no ar e, durante o voo nupcial, os machos liberam um feromônio responsável pela atração sexual das fêmeas da mesma espécie (MARICONI, 1970). Há evidências genéticas e morfológicas indicando de que os machos são capazes de copular com várias fêmeas (BAER; BOOMSMA, 2004; FJERDINGSTAD, BOOMSMA, 1997) e que as fêmeas podem acasalar com até oito machos (KERR, 1961; FJERDINGSTAD; BOOMSMA, 1997; BAER et al., 2006). Depois do acasalamento, o macho morre e a rainha começa a escavação de um novo formigueiro. 13 A. laevigata como modelo de especiação Selecionamos A. laevigata como objeto de estudo porque Vinha et al. (2007), através de marcadores mitocondriais, evidenciou duas linhagens simpátricas de A. laevigata, nas regiões Norte e Sudeste do Brasil (Figura 2). Outras análises filogenéticas que incluíram várias espécies do gênero Atta, também com base em marcadores mitocondriais, também evidenciaram evidenciaram dois clados irmãos em A. laevigata (Figura 3 a, b) (SOLOMON et al., 2008; BACCI et al., 2009). Portanto, o contexto histórico dos estudos envolvendo A. laevigata, leva-nos a pensar que pode haver um processo de especiação em andamento, fazendo dessa cortadeira um potencial modelo de estudo em processos de especiação. A especiação (formação de novas espécies) tem sido considerada o evento chave da evolução. Entender seus mecanismos é uma questão intrigante para os cientistas, pois é um processo bastante complexo e várias forças evolutivas estão envolvidas. Figura 1: distribuição de A. laevigata 14 Durante o processo de especiação, as linhagens chegam a divergir e acabam se modificando ao longo do tempo, de tal forma que o intercruzamento não pode mais ocorrer (COYNE; ORR, 1998). Deste modo, a especiação completa-se com o surgimento do isolamento reprodutivo. Isso pode ser evidenciado através da observação de diferenças no comportamento reprodutivo, da incompatibilidade no tamanho e na estrutura dos órgãos reprodutores, da inexistência de descendentes ou da formação de híbridos estéreis se eles existirem. Ocorrendo alguma dessas possibilidades, o isolamento reprodutivo está completo confirmando, desse modo, o sucesso do processo de especiação (BROWN; LOMOLINO, 2006). Além da evidência das duas linhagens, A. laevigata já foi classificada em até três subespécies (GONÇALVES, 1942; BORGMEIER, 1950) ou mesmo em duas espécies distintas Atta silvai e A. laevigata. Gonçalves, 1982 descreveu A. silvai com base na morfologia das operárias e formas sexuada, mas atualmente é considerada uma única espécie com grande variação morfológica (DELABIE, 1998). A variabilidade fenotípica encontrada em A. laevigata dificulta a aplicação de um único método tradicional para estudos taxonômicos, pois as chaves dicotômicas que existem são aplicáveis apenas às operárias maiores. Alguns autores já chamavam atenção para importância da genitália masculina no estudo da sistemática do gênero Atta (MAYR, 1868; GONÇALVES, 1942; BORGMEIER, 1950). Para uma análise mais acurada da morfologia, é necessário estudar as operárias com as formas sexuadas correspondentes (GONÇALVES, 1942). 15 Figura 2 - Evidência de dois grupos gênicos distintos de A. laevigata Vinha et al., 2007 16 Solomon et al., 2008 Figura 3a - Árvore filogenética de A. laevigata evidenciando três clados irmãos. 17 Bacci et al., 2009 Marcadores moleculares utilizados no presente estudo Atualmente, existe uma grande quantidade de marcadores moleculares descritos e que têm sido empregados com o intuito de compreender melhor as variações genéticas dos indivíduos e populações. Os marcadores moleculares como o DNA mitocondrial e os nucleares (Rhodopsina, Wingless, Fator de elongação1, microssatélites e DMC1) foram empregados para distinguir as linhagens e investigar os fatores envolvidos na diferenciação das populações de A. laevigata. O DNA mitocondrial é um marcador muito utilizado em estudos evolutivos e sistemáticos em formigas (MARUYAMA et al., 2008; WYSOCKA et al., 2011; Figura 3b - Análise filogenética do gênero Atta evidenciando dois clados irmãos de A. laevigata. 18 GOROPASHNAYA et al., 2012). Este marcador apresenta características interessantes para tais estudos, pois são herdados predominantemente da linhagem materna, apresentam alta taxa mutacional e abundância, uma vez que se encontram em grande número de cópias por célula (AVISE et al.,1987; MORITZ et al., 1987). O DNA mitocondrial foi também utilizado no presente estudo, pois já evidenciou os dois clados de A. laevigata. Os microssatélites são de herança Mendeliana codominante, rápida evolução e com altas taxas de mutação, além de serem altamente polimórficos (ZHANG; HEWITT, 2003). Foram usados no presente estudo com a finalidade de verificar a existência de alelos exclusivos e para registrar também a contribuição da linhagem paterna. Selecionamos também os marcadores nucleares DMC1, Fator de elongação1 Rhodopsina, Wingless, porque são genes de cópia única no genoma (PETERSEN; SEBERG, 2002; HELGASON et al., 2003; DANFORTH et al., 2004), o que evita problemas advindos da duplicação gênica e possibilita detectar polimorfismo e caracterizar o isolamento reprodutivo em A. laevigata. Áreas de estudo Selecionamos as regiões de Bauru e Botucatu, porque elas contêm grande quantidade de ninhos de A. laevigata e são relativamente próximas à UNESP de Rio Claro, o que facilita a coleta e observação das formigas. Apresentação dos capítulos No presente estudo, encontramos resultados interessantes que deram origem a dois trabalhos. O primeiro artigo mostra que há indivíduos simpátricos em duas linhagens mitocondriais distintas em ambas as regiões geográficas estudadas. Mostra também que há diferenças morfológicas relacionadas ao aparelho reprodutor entre os machos de cada uma das linhagens. A congruência entre marcadores morfológicos e mitocondriais confirmou a existência um processo de especiação ocorrendo em A. laevigata. No segundo trabalho decorrente do presente estudo, foram investigados os possíveis eventos envolvidos com a diferenciação das populações em A. laevigata. Um desses fatores foi o voo nupcial, que poderia ocorrer em períodos diferentes para cada uma das linhagens, acompanhando o isolamento reprodutivo. 19 O segundo evento investigado foi a coespeciação entre as formigas e seu fungo mutualista. As razões desse estudo foram duas: a proposta de que o cultivo de fungos mutualistas distintos poderia ser a razão para o surgimento de duas espécies de Attini no gênero Cyphomyrmex (SCHUTLZ et al., 2002); a existência de dois grupos gênicos do fungo Leucoagaricus gongylophorus, simbionte das formigas cortadeiras (SILVA-PINHATI et al., 2004). O terceiro evento investigado foi a fecundação, verificando se machos de uma determinada linhagem estariam impedidos de fecundar fêmeas de outra linhagem de A. laevigata. Ou seja, verificar se há um isolamento reprodutivo pré-zigótico entre as linhagens. 20 Objetivos 21 1.1 Objetivo Geral O objetivo central desse estudo é caracterizar o grau de diferenciação na formiga A. laevigata. 1.1.1 Objetivos específicos - Caracterizar geneticamente as formigas através de marcadores mitocondriais e nucleares. - Analisar a genitália dos machos e verificar se existem diferenças morfológicas. - Observar se há quebra no sincronismo temporal do voo nupcial. - Caracterizar geneticamente o fungo mutualista Leucoagaricus gongylophorus através de marcadores nucleares e verificar se a co-especiação poderia estar relacionada com o processo de especiação. - Analisar o conteúdo da espermateca das fêmeas fecundadas para obter mais informações sobre o comportamento reprodutivo de A. laevigata. 22 REFERÊNCIAS AUTUORI, M. Contribuição para o conhecimento da saúva (Atta spp. Hymenoptera: Formicidae). Evolução do sauveiro (Atta sexdens rubropilosa Forel, 1908). 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S 1 Email: sandraverza@yahoo.com Bacci, M 1* Email: mbacci@rc.unesp.br 1 Instituto de Biociências, UNESP - Univ Estadual Paulista, Campus Rio Claro, Centro de Estudos de Insetos Sociais. *Corresponding author Maurício Bacci Júnior Centro de Estudos de Insetos Sociais, Universidade Estadual Paulista, Av. 24A, n. 1515 – Bela Vista, Zip Code: 13506-900 – Rio Claro, SP – Brazil. Tel.: +55 19 3526 4165; Fax: +55 19 3534 8523; e-mail: mbacci@rc.unesp.br mailto:cintiams_bezerra@yahoo.com.br mailto:mbacci@rc.unesp.br 27 Resumo A formiga cortadeira Atta laevigata já foi classificada em duas espécies distintas, denominadas A. laevigata e A. silvai, mas atualmente é considerada uma única espécie com grande variação morfológica. A morfologia da genitália dos machos tem sido utilizada com sucesso na sistemática das cortadeiras. As análises do DNA mitocondrial e nuclear têm sido também utilizadas para estudos evolutivos e sistemáticos em formigas. O presente trabalho apresenta resultados de mapeamento de 89 ninhos, genotipagem de operárias maiores e análise da morfologia de machos A. laevigata em duas áreas geográficas do sudeste e de amostras da localidade de Maraú (BA), local tipo de A. silvai. Uma operária foi genotipada em cada um dos ninhos analisados, dividindo-os em duas linhagens mitocondriais, que se mostraram simpátricas nas regiões do Sudeste. Todos os ninhos de Maraú foram agrupados na linhagem I. Todavia, não foi possível separar os indivíduos em linhagens distintas, com base nos marcadores nucleares. Em 15 ninhos do Sudeste foi possível acompanhar a produção anual de alados de 2009 a 2011. Os machos da linhagem I foram mais pesados e maiores do que os machos da linhagem II. As dimensões de abdômen, estipe, cardo e volsela, além do peso corpóreo, distinguiram significativamente as linhagens uma da outra. Machos atípicos com genitália variante foram encontrados com mais frequência na linhagem II do que na linhagem I. A genitália variante não foi uma característica diferencial, embora foi encontrada em indivíduos de ambas as linhagens. Já nos indivíduos com genitália normais foi possível detectar caracteres diferencias entre as linhagens, associados ao peso corpóreo e dimensões do abdômen e da genitália. Esses caracteres diferenciais foram congruentes com os dados genéticos. A congruência entre marcadores moleculares e morfológicos separando linhagens simpátricas sugere um processo de especiação ocorrendo em A. laevigata. Palavras-chaves: Formiga cortadeira, DNA mitocondrial, variação morfológica, genitália masculina. 28 Abstract The Atta laevigata ant has already been classified into two distinct species, A. laevigata and A. silvai. However, recent studies have suggested that A. laevigata is a single species with appreciable variations. The morphlogy of the male genitalia has been successfully used for systematic identification and species delimitation of A. laevigata. Furthermore, analysis of mitochondrial and nuclear DNA sequence has also been widely used for evolutionary studies in ants. Here, we combined genetic and morphlogical studies to characterize A. laevigata in two geographic areas in Southwest Brazil and in Maraú (BA), which is the type locality of A. silvai. Specifically, A. laevigata nests were mapped, worker ants were genotyped by mitochondrial DNA, and the morphlogy of male genitalia was examined. Based on mitochondrial DNA genotyping of 89 workers collected from different nests, A. laevigata comprised two lineages (I and II). The lineages were sympatric, as members from each lineage were detected in both studied area in Southwest Brazil. Individuals from the type locality of Atta silvai were grouped in the mitocondrial lineage I. However, the nuclear markers could not distinguish the lineages de A. laevigata. In 15 nests from Southwest Brazil, it was possible to follow the annual production of winged ants from 2009 to 2011. The males from lineage I were heavier and larger than the males from lineage II. Measurements of the abdomen, stipites, thistle, volsella, and body weight, provided sufficient discrimination between the two lineages. Variant males with atypical genitalia were found more often in lineage II than in lineage. Rates of variant males with atypical genitalia were not a distinguishing feature between lineage I and lineage II ants, as both lineages harbored individuals with atypical genitalia. However, the two lineages were differentiated based on body weight, dimensions of the abdomen, and structure of male genitalia. Moreover, these characteristics were consistent with genetic data. Congruence between molecular and morphlogical markers for distinct lineages suggests that an ongoing process of speciation in A. laevigata. Keywords: leaf-cutter ant, mitochondrial DNA, morphlogical variation, male genitalia. 29 Introduction With a little more than 230 valid species, the Attini tribe includes fungus-growing ants [1, 2], which are endemic to the Americas [3,4]. The genera Atta and Acromyrmex are most derived in the Attini tribe. Identification criteria for the species Atta laevigata have traditionally been vague. The species was classified into either three subspecies [5, 6]. Gonçalves in 1982 [7] described a new species of ant similar to A. laevigata called Atta silvai that was found in the south of Marau, Bahia, Brazil. The description was based on worker ants and sexual forms. The characteristics that justified the new species were based on worker ants who had head and gaster with few hairs, being the head narrower than that of A. laevigata and females with more shiny gaster. The analysis also showed that the male genitalia extremity had a thinner V slit than that found in A. laevigata. Delabie in 1998 [8] compared samples of A. silvai with A. laevigata present in several locations, including Marau, and contested the existence of A. silvai. According to this author, A. laevigata shows a marked within species morphlogical variation in relation to other species of Attini tribe. This variation creates intermediate phenotypes in A. laevigata soldiers and large workers and between individuals from different geographical regions. So, these variations would have been mistaken as species diagnostics for A. silvai. The brightness of the gaster of female found in A. silvai was also observed in other A. laevigata individuals in different geographic regions. The author also examined the male genitalia and noted no morphlogical differences. The difference in sagittae would therefore be the product of technical artifacts of desiccation. Finally, the author concluded that A. silvai is synonymous with A. laevigata. A viable method towards systematic identification and classification of Atta and other insects is the examination of the reproductive system of males [5, 6, 9-11], which is morphlogically diverse throughout evolution [12]. In addition to morphlogical data, mitochondrial markers are important markers in the genetic characterization of ants [13-15]. Thus, the present study aimed to map A. laevigata nests in two geographic area in Brazil, genotype individuals from each nest using mitochondrial and nuclear markers, and compare morphlogical variations of the male genitalia by traditional morphmetrics. 30 Results Sampling and mapping of nests workers ants from 89 A. laevigata nests mapped in the Botucatu, Bauru and Marau, were collected from September 2009 to March 2011 (Figure 1). 33 males from Botucatu and 22 males from Bauru were collected from 15 nests (Table 1). These individuals were deposited into the Entomological Collection of the Laboratory of Molecular Evolution at the State University Júlio de Mesquita Filho. Molecular analyses A soldier from each nest was genotyped, resulting in 89 sequences [GenBank access # xxxxxx to yyyyyy] of the mitochondrial DNA region (472 bp) comprising COI, intergenic spacer (IGS), Leu-tRNA, and COII. Analysis of the intergenic spacer (IGS), revealed two distinct lineages in A. laevigata. However, the IGS sequence was excluded from subsequent examinations because it was highly variable and caused noise in the network of haplotypes. Consistent with the IGS sequence analysis, the phylogenetic relationship among haplotypes revealed two distinct and sympatric lineages of A. laevigata (Figure 2). The 89 sequences were classified into 15 haplotypes: lineage I was represented by haplotypes 1-8 and 15; and lineage II was represented by haplotypes 9-14. The haplotype 15 was found in Marau. Haplotypes 12 and 13 were the predicted ancestors and others seem to be evolutionarily more recent. The distribution of haplotypes was not related to geographic location, because haplotypes 4, 10, 12 and 13 were detected in both regions. Sequences of nuclear genes were obtained from a small subset of workers and showed no differences between individuals of distinct mitochondrial lineages in rhodopsin (519 bp), wingless (381 bp) or EF-1α F2 (475 bp) (Appendix). Morphlogical analysis Atypical genitalia morphlogic variation was found in 20 of 75 collected males in lineage I and lineage II (Table 1). These males were called morph II and described separately (see below). The remaining 55 males without genitalia variation were further examined. The t-Test showed lineage I males were heavier and larger than lineage II males. Moreover, the volsella length, thistle width, stipites length, and dimensions of the abdomen (Table 2) were distinct in both lineages. The results were subjected to multivariate analysis using multivariate analysis 31 of variance (MANOVA). This analysis showed that the two lineages were morphlogically different (Pr (> F) = 5.409e-07, Df residuals = 52). Polymorphisms In general, the analyzed traits were more variable in lineage II than in lineage I (Figure 3). Figure 3 also shows that the thistle width, stipites length, body dimensions and abdominal length and height were somewhat variable while the sagittae and volsella measurements were highly variable in lineage II. Atypical genitalia variation Morph II genitalia was detected in three of the 25 (12%) subjects in lineage I and 17 of 50 (34%) subjects in lineage II. Two out of five lineage I nests (40%) contained subjects with morph II genitalia, while in lineage II, eight of 10 nests (80%) had subjects with morph II genitalia. The inclusion criteria for atypical genitalia variation included: large angle in the dorso-ventral projection of the stipites and sagittae, and short thistle (Figure 4). Discussion The results show congruence between mitochondrial markers and morphlogical data. They indicate that A. laevigata is formed by two distinct gene pools. Indeed, the haplotype network formed by the median-joining method (Figure 2) confirmed the presence of two distinct lineages. Haplotypes 12 and 13 were likely ancestral haplotypes because of their frequent occurrence in population and wide geographic distribution [16, 17]. Evolutionarily recent haplotypes were located at the ends of the network and were present within the geographical regions occupied by ancestral haplotypes [17]. Haplotypes in lineage I were not geographically isolated from haplotypes in lineage II, indicating that lineage I and lineage II ants were sympatric in both Botucatu and Bauru regions of southeastern Brazil. Through traditional morphmetric data, we found that the two lineages are different in their body dimensions (length, height, and weight) and genitalia (length of the volsella and width of the stipites and thistle) (Table 2). These structures have proven to be good parameters for distinguishing the two lineages. Most of these characteristics showed low variance (Figure 3, Table 2), which contributed to the clear demarcation of the two lineages. Although the body 32 weight and dimensions of volsella were highly variable, they still signified the presence of two lineages in A. laevigata. However, the sagittae measurements were too variable to distinguish between lineages. Sagittae polymorphism has been previously described [6] and controversially used to suggest the existence of A. silvai as a distinct species from A. laevigata [8]. Therefore, special attention should be given to the structural features and dimensions of sagittae, although in our study these characteristics did not distinguish the two genetic and phenotypic lineages we identified in A. laevigata. Still, sagittae structure is useful for differentiating species of the genus Atta [6]. The stipites and volsella measurements provide discrimination potential not only for Atta species [5], but for both lineages in A. laevigata. Body dimensions and thistle width have not been used previously to differentiate Atta species. The finding that sympatric lineages of Atta laevigata are also morphlogically distinct from each other, suggest each of these lineages compose a distinct isolated species. The finding that individuals from Marau are within the lineage I, reinforce the proposition that Atta laevigata lineage I should be called Atta silvai. We analyzed morph II genitalia rate in the lineage I or II of A. laevigata. Lineage II ants had a higher rate of morph II genitalia; twice the rate of lineage I ants if normalized by the number of nests and almost three times if normalized by the number of individuals. Despite these differences, morph II genitalia was not a suitable metric to characterize A. laevigata since both lineages contained individuals with this genitalia variation. The formation of morph II genitalia can result from the accumulation of deleterious traits in haploid males, which would be minimized in heterozygous and diploid females. It is possible that the morphlogical changes, which are more drastic in haploid males, hinder copulation. Thus, the annual production of a large number of males in leaf-cutter ants [18,19], including in A. laevigata, may be an strategy to guarantee that a sufficient number of fertile males not presenting morph II genitalia is produced. The results presented here indicate the presence of two lineages within A. laevigata that are morphlogically and genetically discernable. Congruence between genotypic and phenotypic examinations suggests that the two sympatric lineages are reproductively isolated. Thus, it is possible that there is a barrier for mating between individuals of these two lineages. Morphlogical differences between male genitalia have been previously proposed to act as reproductive barriers, explained by a mechanism known as lock and key [12,20]. It is possible that the differences between lineage I and linage II, including the dimensions of the genitalia (volsella, stipites and thistle) and body size, are related to a pre-zygotic reproductive isolation. 33 Future experiments are needed to verify the existence of barriers and their possible influences on the reproductive isolation of the two lineages of A. laevigata. Conclusion We identified and characterized two sympatric and morphlogically distinct lineages of A. laevigata. The body dimensions (length, height and weight) and genitalia structure (volsella length, stipites width, and thistle width) were good characteristics for distinguishing the two lineages. It is likely that these differences hinder reproduction between sympatric individuals of different lineages of A. laevigata, suggesting a reproductive barrier. Therefore, it seems that a process of speciation took place, splitting A. laevigata in two distinct isolated species. One of these species dominates the region of Marau, which is the type locality of a previously proposed species of Atta called Atta silvai. Therefore, our results reinforce the proposition of Atta silvai as a new species. Materials and Methods Sample collection Workers ants of A. laevigata were collected with tweezers, immediately placed in vials containing 100% ethanol, and stored at -20 °C for further analyses. Males were collected from the orifice of each nest with forceps and stored in 70% ethanol at room temperature until they were used for morphlogical analysis. The worker ants were collected in pasture area, edge of cerrado, grange, farmstead, roadsides and in urban area (Table 3). At each sampling point, were determined the latitude and longitude with a GPS (Global Positioning System) and through the program ArcGIS (1999) were elaborated maps. Molecular analyses Genomic DNA extraction DNA was extracted from the head of major workers ants from each nest following the protocol described by Martins et al. [21]. Individual specimens were crushed in 1.5 ml microcentrifuge tubes containing 500 µl of ice-cold TNES (Tris NaCl-EDTA-SDS) solution 34 (250 mM Tris Base (Promega, Madison, WI), pH 7.5, 2 M NaCl (Merck, Darmstadt, Germany), 100 mM EDTA (Ethylenediamine tetraacetic acid; Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, MO), 2% SDS (Sodium dodecyl sulfate; Promega, Madison, WI). Then, 5 µl of 20 mg / ml proteinase K (USB Corporation, Cleveland, OH, cat # 76230Y) was added to the tubes and the mixture was incubated for 3 h at 55 °C, followed by addition of 5 µl of 4 mg / ml RNAse A (Calbiochem, San Diego, CA, cat # 556746) and 30 min incubation at 37 °C. Proteins were precipitated by adding 200 µl of 5 M NaCl and centrifuged to pellet. The supernatant was collected and DNA was precipitated with 100% isopropanol, washed with 70% ethanol, centrifuged, dried and resuspended in 30 µl TE buffer (pH=8.0). DNA amplification DNA amplification was performed in 30 µl reactions using a buffer containing 10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 2.5 mM KCl (cat # EPO402 Fermentas), 1.5 mM MgCl2 (Fermentas cat # EPO402); 0.4 mM dNTP mix (Fermentas cat # RO192), ~ 100 ng DNA template, and ultra- pure water. For mitochondrial markers, 10 pmol ANT-F primer (5'- ATTCATTCTTATCTTGAAATATTATTTC-3'), 10 pmol ANT-RG primer (5'- TTCATAAGTTCAGT ATCATTGGTG - 3') (Martins et al. 2007) were used. PCR reactions were performed following the program: an initial cycle at 94°C for 5 min, followed by 40 cycles of 94°C for 60 s, 47°C for 60 s and 68°C for 2 min and a final extension of 68°C for 15 min. The nuclear markers long-wavelength opsin (rhodopsina), wingless and elongation factor 1-α (EF-1α F2) were amplified using the primers described in Schultz & Brady (2008). PCR reactions were performed following the program: an initial cycle at 94°C for 5 min, followed by 35 cycles of 94°C for 60 s, 50°C for 45 s and 68°C for 2 min. PCR products were purified with GFX PCR DNA Gel Band Purification Kit (GE Healthcare cat # 27-9602-01). DNA Sequencing Sequencing was performed in a final volume of 20 µl containing 20 ng DNA template, 6 pmol primers, 1 µl BigDye (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA, cat # 4336919), 2.0 µl buffer (200 mM Tris.HCl and 5 mM MgCl2) and ultra-pure water. PCR reactions were performed following the program: an initial cycle at 96°C for 2 min, followed by 28 cycles of 96°C for 45 s, 50°C for 30 s and 60°C for 4 min. 35 The sequencing products were purified and then resolved in an ABI3500 sequence automated machine (Applied Biosystems) on the Laboratory of Molecular Evolution, CEIS at the State University Júlio de Mesquita Filho. Sequence analysis Sequences were edited with BIOEDIT 7.0.5 software [22] and aligned with CLUSTALW [23] using default parameters. The haplotype network was analyzed with NETWORK 4.5 [24]. Morphlogical Analysis Male external genitalia were removed in saline (0.9% NaCl) under a stereoscopic microscope. Analyses of external structures were based on studies published by Gonçalves in 1942 [5] and by Borgmeier in 1950 [6]. Males were removed from the 70% ethanol, left at room temperature for about 1 h to dry and then their mass was determined. Each male were measured for the nine indicated characteristics with the aid of a stereoscopic microscope with software Pro Auto Montage version 5.02.0096. Height and length of the abdomen were taken in lateral view. The genitalia of each male was photographed at various angles, with the goal of assembling a digital archive. Measurements of the male genitalia were performed in ventral view: (a) thistle width (b) the stipites length, (c) sagittae length (d) sagittae width (e) volsella length, (f) volsella width (g) opening sagittae (Figure 5). Statistical analysis The normality of results was evaluated by D'Agostino-Pearson 1973 test [26]. Statistical analyses were performed using the R 2.14.0 software [27]. MANOVA p ≤ 0.05 was used to assess the equality of the lineages. The values of body size were expressed as mean and standard deviation. The t-Test was used to investigate the differences between the lineages regarding the same body size. Polymorphisms were estimated by the variance of each body size. The variances of body measurements were normalized to dimensionless values with lower and upper limits equal to 0 and 100, respectively. The results were displayed in graphs constructed in Origin 6.0 software. 36 Competing interests The authors declare no competing interests. List of abbreviation used pb: base pair; PCR: polymerase chain reaction Authors' Contributions CMSB conducted field and laboratory work, and drafted the manuscript. AFS performed the statistic analysis. SSV collaborated with the laboratory work and provided comments on the manuscript. MBJ led the research, contributed to data interpretation and manuscript writing. All authors read and approved the final version of the manuscript. Acknowledgements We thank Mauricio Silveira, Luiz Carlos Forti for help with field collections, Tassio Brito, Dr. Fábio Akashi for help in taking the photos, Sergio Kakazu for assistance with DNA sequencing and FAPESP for financial support. Figure legends Figure 1. Collection area of A. laevigata. Figure 2. Haplotype network based on mitochondrial sequences comprising the COI, Leu- tRNA, and COII genes. Diameter of each circle is proportional to the frequency of the haplotype. The blue color represents individuals from Bauru, yellow color represents individuals from Botucatu and red color represents individuals from Marau. Numbers in green indicate the nests used in morphlogical analyses of males. The red dots represent unsampled and predicted haplotypes. 37 Figure 3. Polymorphisms of the male characteristics. A: thistle width, B: length of stipites; C: sagittae length, D: sagittae width, E: volsella length, F: volsella width; G: opening of the lateral expansion of sagittae, H: width of abdomen, I: length of the abdomen, J: wet mass. * Structures that presented low polymorphism. Figure 4. External genitalia of A. laevigata males in lineages I and II. Ventral view: lineage I (a) and lineage II (b); lateral view: lineage I (c) and lineage II (d). Variation genitalia, ventral view: lineage I (e) and lineage II (f); lateral view: lineage I (g) and lineage II (h). Figure 5. Morphmetry of A. laevigata male genitalia. (a) thistle width (b) stipites length, (c) sagittae length (d) sagittae width (e) volsella length, (f) volsella width and (g) sagittae opening. 38 Reference 1. Bolton B: Synopsis and classification of Formicidae. Gainesville: Memoirs of the American Entomological Institute; 2003. 2. 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Lineage classification of male A. laevigata collected from two regions in Brazil. *: Number of males with normal genitalia. #: Number of males with deformed genitalia. Table 2. Dimensions and results of the t-Test for different body structures of males. Dimensões representadas em média ± desvio padrão. Numbers followed by letter are significantly different according to the t- Test. 55 males were examined, lineage I (LI) had 22 subjects and lineage II (LII) had 33 individuals. Sagittae (mm) Volsella (mm) Thistle (mm) Stipites (mm) Abdomen (mm) Body (g) length width Expansion (width) length width width length width length Mass LI 2.48±0.19 1.01±0.07 0.31±0.43 2.43±0.18 0.57±0.05 3.24±0.15 3.25±0.13 5.00±0.29 8.66±0.46 0.19±0.01 LII 2.41±0.10 0.98±0.26 0.22±0.06 2.26±0.34 0.59±0.05 3.04±0.18 3.01±0.15 4.53±0.25 7.92±0.47 0.15±0.02 t -1.82826 -0.54846 -1.28049 -2.20125 1.40942 -4.28848 -6.12923 -5.81294 -6.29919 -7.08072 p 0.07314 0.58568 0.20595 0.03209 b 0.16455 7.65E-05 b 1.13E-07 b 3.59E-07 b 6.03E-08 b 3.34E-09 b Nest Lineage Region Normal* Deformed # N 01 01 Botucatu 5 - N 02 01 Botucatu 5 - N 06 01 Botucatu 5 - N 37 01 Botucatu 3 2 N 74 01 Botucatu 4 1 N 14 02 Botucatu 5 - N 29 02 Botucatu 4 1 N 30 02 Botucatu 2 3 N 24 02 Bauru 3 2 N 28 02 Bauru 3 2 N 56 02 Bauru 3 2 N 46 02 Bauru 3 2 N 55 02 Bauru 5 - N 27 02 Bauru 3 2 N 80 02 Bauru 2 3 Total - - 55 20 41 Table 3. Atta laevigata nests collected Code Lineage Site Longitude Latitude Collection area N 01 I Botucatu -48.26565 -22.50366 Pasture N 02 I Botucatu -48.26326 -22.50880 Pasture N 03 II Botucatu -48.26209 -22.50981 Pasture N 04 I Botucatu -48.26175 -22.51077 Pasture N 05 I Botucatu -48.26187 -22.51079 Pasture N 06 I Botucatu -48.26421 -22.50935 Pasture N 08 II Bauru -49.02839 -22.14669 farmstead N 09 II Bauru -49.02839 -22.14669 farmstead N 10 I Bauru -49.02880 -22.14125 grange N 11 II Bauru -49.03626 -22.16520 Pasture N 12 II Bauru -49.03447 -22.16482 Pasture N 13 II Bauru -49.02241 -22.13981 Farmstead N 14 II Botucatu -48.26215 -22.51837 Urban area N 15 II Botucatu -48.25933 -22.51630 Urban area N 16 II Botucatu -48.25908 -22.51620 Pasture N 17 II Botucatu -48.25892 -22.51634 Edge of cerrado N 19 I Botucatu -48.28338 -22.50959 Pasture N 20 II Bauru -49.03543 -22.15233 Pasture N 21 II Bauru -49.03523 -22.15254 Pasture N 22 II Bauru -49.03531 -22.15241 Pasture N 24 II Bauru -49.02978 -22.20037 Urban area N 26 II Bauru -49.01588 -22.23073 Urban area N 27 II Bauru -49.00904 -22.21838 Edge of cerrado N 28 II Bauru -49.00977 -22.21730 Edge of cerrado N 29 II Botucatu -48.26156 -22.50250 Pasture N 30 II Botucatu -48.26143 -22.50229 Pasture N 31 II Bauru -49.01854 -22.23155 Urban area N 32 II Botucatu -48.26156 -22.21730 Pasture N 33 II Botucatu -48.26143 -22.50229 Pasture N 34 I Botucatu -48.26172 -22.51074 Urban area N 35 I Botucatu -48.26168 -22.51059 Urban area N 36 I Botucatu -48.26242 -22.55874 Urban area N 37 I Botucatu -48.25931 -22.55939 Urban area N 38 I Botucatu -48.26274 -22.51061 Pasture N 39 II Botucatu -48.26217 -22.50961 Pasture N 40 I Botucatu -48.26210 -22.50964 Pasture N 41 I Botucatu -48.26252 -22.50986 Pasture N 42 I Botucatu -48.26345 -22.50930 Pasture N 44 I Botucatu -48.26192 -22.50992 Pasture N 45 I Botucatu -48.26219 -22.50966 Pasture N 47 II Bauru -49. 00978 -22.21727 Edge of cerrado N 48 II Bauru -49.00905 -22.21834 Edge of cerrado N 49 II Bauru -49.00906 -22.21839 Edge of cerrado N 50 II Bauru -49.02571 -22.21188 Urban area N 51 I Botucatu -48.26212 -22.59096 Pasture N 52 II Botucatu -48.2206 -22.50967 Pasture N 53 I Botucatu -48.26220 -22.50967 Pasture N 54 II Botucatu -48.25944 -22.51641 Pasture N 55 II Bauru -49.01597 -22.21502 Urban area N 56 II Bauru -49.01597 -22.21079 Edge of cerrado N 57 II Bauru -49.00486 -22.21079 Edge of cerrado N 58 II Bauru -49.00486 -22.21079 Edge of cerrado N 59 II Bauru -49.00484 -22.21002 Edge of cerrado N 60 II Bauru -49.00461 -22.23155 Urban area N 61 II Bauru -49.01854 -22.21182 Urban area N 62 II Bauru -49.02563 -22.21091 Edge of cerrado 42 Continuation - table 3 Code Lineage Site Longitude Latidude Área de coleta N 63 II Bauru -49.00328 -22.22906 Edge of cerrado N 65 II Bauru -49.00292 -22.87810 Edge of cerrado N 66 II Bauru -49.00154 -22.20792 Edge of cerrado N 67 II Bauru -49.00133 -22.20773 Edge of cerrado N 68 II Bauru -49.00145 -22.20785 Edge of cerrado N 69 II Bauru -49.00277 -22.20839 Edge of cerrado N 70 II Bauru -49.00214 -22.14084 Edge of cerrado N 71 II Bauru -49.05156 -22.23724 Edge of cerrado N 72 II Bauru -49.05134 -22.23710 Edge of cerrado N 73 II Bauru -49.05137 -22.23711 Edge of cerrado N 74 I Botucatu -48.25788 -22.55907 Edge of cerrado N 77 II Marau -14.12932 -39.03521 Urban area N 79 II Bauru -49.00228 -22.20840 Edge of cerrado N 80 II Bauru -49.00758 -22.21648 Edge of cerrado N 81 II Bauru -49.00839 -22.21670 Edge of cerrado N 82 II Bauru -49.01099 -22.21678 Edge of cerrado N 83 II Bauru -49.01263 -22.21677 Edge of cerrado N 84 II Bauru -49.01288 -22.21673 Edge of cerrado N 85 II Bauru -49.01098 -22.21680 Edge of cerrado N 86 II Bauru -49.00462 -22.21305 Edge of cerrado N 87 II Bauru -49.00715 -22.21641 Edge of cerrado N 88 II Bauru -49.01005 -22.21703 Edge of cerrado N 89 II Bauru -49.00293 -22.20879 Edge of cerrado N 90 II Bauru -49.01151 -22.21680 Edge of cerrado N 91 II Bauru -49.01505 -22.21571 Edge of cerrado N 92 II Bauru -49.00741 -22.21649 Edge of cerrado N93 II Bauru -49.00870 -22.21679 Edge of cerrado N94 II Bauru -49.22220 -22.20790 Edge of cerrado N95 II Bauru -49.25932 -22.55940 Edge of cerrado N96 II Marau -39.00727 -14.06705 Roadsides N97 II Marau -39.01182 -14.06205 Roadsides N98 II Marau -39.03150 -14.21507 Roadsides N99 II Marau -39.00665 -14.06900 Roadsides 43 Fgure 1 44 Figure 2 45 Figure 3 46 Figure 4 47 Figure 5 48 Appendix Alignment of sequences - (long-wavelength [LW] opsin (rhodopsin) Alignment of sequences - Wingless Alignment of sequences - elongation factor 1-α [EF-1α] 49 Capítulo II 50 Fatores envolvidos com a diferenciação das populações em Atta laevigata F. Smith 1858 (Formicidae: Myrmicinae: Attini) Cintia Maria Santos Bezerra 1 , Sérgio kakazu 1 , Letícia Mara Lima Angelini 1 , Milene Ferro 1 , Maurício Bacci Jr 1* 1 Instituto de Biociências, UNESP - Univ Estadual Paulista, Campus Rio Claro, Centro de Estudos de Insetos Sociais. E-mail CMSB: cintiams_bezerra@yahoo.com.br SK: miaguisam@yahoo.com.br LMLA: leticiaangelini@yahoo.com.br MF: milenef@gmail.com MB: mbacci@rc.unesp.br *Corresponding author Maurício Bacci Júnior Centro de Estudos de Insetos Sociais, Universidade Estadual Paulista, Av. 24A, n. 1515 – Bela Vista, Zip Code: 13506-900 – Rio Claro, SP – Brazil. Tel.: +55 19 3526 4165; Fax: +55 19 3534 8523; e-mail: mbacci@rc.unesp.br mailto:cintiams_bezerra@yahoo.com.br mailto:leticiaangelini@yahoo.com.br mailto:milenef@gmail.com mailto:mbacci@rc.unesp.br 51 Resumo A formiga cortadeira Atta laevigata se apresenta dividida em duas linhagens mitocondriais, cada uma delas com machos morfologicamente distintos. A congruência entre os marcadores morfológicos e genéticos sugere que essas formigas estão em processo de especiação. No presente trabalho, foram estudados alguns fatores que poderiam estar relacionados com este processo. Com base em marcadores nucleares, três grupos gênicos do fungo mutualista Leucoagaricus gongylophorus foram encontrados associados com fêmeas de ambas as linhagens de A. laevigata. Portanto, o processo de especiação não foi acompanhado de uma especialização no cultivo de um determinado grupo de fungo. Formigas simpátricas de linhagens distintas puderam realizar o voo nupcial simultaneamente. No entanto, análises de quatro loci mitocondriais e seis loci microssatélites mostraram que cada fêmea em uma das linhagens é fecundada exclusivamente (ou ao menos predominantemente) por um a seis machos da mesma linhagem. Portanto, há uma barreira pré-zigótica levando ao isolamento reprodutivo entre indivíduos simpátricos de linhagens distintas. Esta barreira foi provavelmente causada pelas diferenças corpóreas dos machos, incluindo a genitália, que dificulta, ou mesmo impede a cópula entre indivíduos de linhagens distintas. Palavras-chaves: barreira pré-zigótica, comportamento reprodutivo, formiga cortadeira, Leucoagaricus gongylophorus, linhagem mitocondrial. 52 Abstract The leafcutter ant Atta laevigata is divided in two mitochondrial lineages, each one with a morphlogically distinct male. The congruence between morphlogical and genetic markers suggests that a speciation process is in progress for this ant. In the present work, some factors that could be related with this speciation process were studied. Based on nuclear markers, three genic groups of the mutualistic fungus Leucoagaricus gongylophorus were found associated with females from both A. laevigata lineages. Therefore, this speciation process was not accompanied by a specialization in the cultivation of a particular group of fungi. Distinct ants’ sympatric lineages could perform the nuptial flight simultaneously. However, analysis of four mitochondrial and six microsatellite locus showed that each female from a lineage is fertilized exclusively (or at least predominantly) by one at six males from the same lineage. Thus, there is a pre zygotic barrier leading to reproductive isolation between sympatric individuals of distinct lineages. This barrier was probably caused by physical differences of males (including the genitalia) that makes it difficult, or even prevents the mating between individuals of different lineages. Keywords: pre zygotic barrier, leafcutter ant, mitochondrial lineage, Leucoagaricus gongylophorus, reproductive behavior 53 Introdução A reconstrução dos eventos históricos que levaram ao surgimento de uma nova espécie é extremamente difícil e hipotética. Baseia-se em um conjunto de observações e estimativas que se demonstra encaixar em um modelo teórico. Um dos modelos difíceis de demonstrar na natureza é a especiação simpátrica. Esse modelo de especiação se dá quando uma barreira biológica ao intercruzamento se origina dentro dos limites de uma população, sem nenhuma segregação espacial das espécies incipientes (HARRISON, 2012). Por muito tempo, essa teoria foi desfavorecida devido à ausência de evidências empíricas disponíveis. Porém, nos últimos anos surgiram evidências desse tipo de especiação em populações naturais como aves, peixes e insetos (COYNE; PRICE, 2000; ELMER; MEYER, 2010; CROW et al., 2010; BERLOCHER, et al., 2002). Atta laevigata são formigas cortadeiras que podem ser consideradas como um excelente modelo de especiação, pois formam duas linhagens mitocondriais simpátricas com machos morfologicamente distintos em cada linhagem. Estão, portanto, possivelmente isoladas reprodutivamente (BEZERRA et al., submetido). Portanto, as linhagens representam provavelmente duas espécies biológicas distintas. No entanto, o intenso polimorfismo morfológico dificulta diferenciar as operárias de cada uma das linhagens utilizando a análise dos espinhos, que são os caracteres informativos à Taxonomia tradicionalmente aceitos. Inexiste, portanto, morfótipo distinto para as operárias pertencentes a cada uma das espécies propostas. Possivelmente, algumas diferenças foram importantes, ou mesmo determinantes, para resultar na divergência definitiva das espécies através do rompimento da coesão do pool gênico. Entre os fatores que acompanham ou causam o rompimento, podemos supor os seguintes: a) Quebra no sincronismo temporal do voo nupcial. As formigas, ao longo de sua história natural, desenvolveram estratégias importantes de reprodução e de dispersão (HÖLLDOBLER; WILSON, 1990). Uma dessas estratégias é a revoada, fenômeno no qual as formas reprodutivas (içás e bitus) saem do formigueiro para realizarem seu voo nupcial. A combinação dos fatores climáticos (umidade do ar e do solo, temperatura e vento) e biológicos (maturação sexual e feromônios) é determinante para a sincronização do voo nupcial e crucial para o encontro das formas reprodutivas de ninhos distintos. Se indivíduos de linhagens distintas de A. laevigata não acasalarem entre si devido a um assincronismo no 54 voo nupcial, é interessante pensar que esse evento pode ser um fator importante na determinação da especiação em A. laevigata. b) A co-especiação provocada por cultivo de linhagens distintas do basidiomiceto mutualista obrigatório. As cortadeiras originaram-se há cerca de 10 milhões de anos e desenvolveram um sistema agrícola especializado em coleta de folhas frescas sobre as quais cultivam o fungo Leucoagaricus gongylophorus (SILVA-PINHATI et al., 2004; SCHULTZ; BRADY, 2008). Este fungo apresenta-se como duas linhagens simpátricas em formigas cortadeiras (SILVA- PINHATI et al., 2004). Se cada uma das linhagens de A. laevigata cultivasse um grupo de fungo, seria razoável pensar no mutualismo como fator acompanhando a especiação da formiga. Nesse caso, a co-especiação poderia estar relacionada com o processo de especiação dessas formigas. A co-especiação pode ser definida como uma mudança evolutiva em duas espécies, sendo que cada alteração em uma delas exerce uma pressão seletiva sobre a outra, de modo que uma espécie evolui em resposta à outra espécie (JANZEN, 1980). Há registro na literatura que fungo mutualista pode estar envolvido no processo de especiação das formigas Attini. Schutlz et al. (2002) propuseram que o cultivo de fungos distintos por Cyphomyrmex longiscapus e Cyphomyrmex muelleri pode estar relacionado com a especiação dessas formigas. c) Frequência de acasalamento. Pequenas diferenças no comportamento reprodutivo poderiam direcionar fêmeas de A. laevigata a escolher parceiros geneticamente semelhantes a elas. A análise do conteúdo da espermateca de fêmeas fecundadas seria de suma importância para investigar as que linhagens dos machos que fecundam A. laevigata. Se indivíduos de linhagens distintas não acasalarem entre si, a frequência de acasalamento pode estar envolvida na especiação em A. laevigata. Para uma melhor compreensão da história natural dessas formigas, o objetivo do presente trabalho foi buscar evidências desses três fatores no processo de especiação em A. laevigata. 55 Material e métodos Coleta Foram coletadas 10 fêmeas virgens (içás) no orifício de cada ninho, com o auxílio de uma pinça para a retirada do pellet de fungo da cavidade infrabucal. Após o voo nupcial, procedeu- se a coleta aleatória de fêmeas fecundadas para obtenção da espermateca. As fêmeas foram armazenadas vivas em um pote de gesso umedecido com água destilada e transportadas em ambiente refrigerado. Um total de 39 fêmeas fecundadas de A. laevigata, foram coletadas sendo 19 da linhagem I da região de Botucatu e 20 da linhagem II da região de Bauru. Os indivíduos testemunhas foram depositados na Coleção Entomológica do Laboratório de Evolução Molecular da Universidade Estadual Júlio de Mesquita Filho. Fungo Foram utilizados pellets de fungo coletados de uma içá por ninho, exceto ninho 02 (linhagem I), do qual dois pellets foram coletados como resultado de teste piloto (Tabela 1). As amostras foram armazenadas em etanol 100 % a -80 C. Tabela 1: Coleta do fungo simbionte utilizada no presente estudo Código/ Localização Linhagem de A. laevigata Nº de pellets utilizado Marcador utilizado N 01 Botucatu I 01 EF1-α; DMC1 N 02 Botucatu I 02 EF1-α; DMC1 N 19 Botucatu I 01 EF1-α; DMC1 N 14 Botucatu II 01 EF1-α; DMC1 N 66 Bauru II 01 EF1-α; DMC1 N 24 Bauru II 01 EF1-α; DMC1 N 56 Bauru II 01 DMC1 N 80 Bauru II 01 EF1-α; DMC1 N 85 Bauru II 01 EF1-α; DMC1 Genotipagem da espermateca As fêmeas foram dissecadas para a retirada da espermateca e estocadas a seco em freezer a - 80 ºC. As cabeças foram armazenadas em álcool 100% e estocadas em freezer a -20º C para uma posterior identificação molecular. Com o auxílio de um microscópio estereoscópico e de 56 alfinete estéril, a espermateca foi perfurada e o sêmen foi coletado cuidadosamente com uma micropipeta. Extração de DNA O DNA foi extraído individualmente de cada pellet e do conteúdo de cada espermateca. A extração de DNA seguiu o protocolo de Martins et al. 2007. O material biológico foi extraído com TNES (250 mM Tris, 2 MNaCl, 100 mM EDTA, 2,5 % SDS, pH 7,5). Nesta etapa o pellet de fungo foi macerado em banho de gelo seco, seguido da adição de 5 µL de proteinase K e incubação a 55 ºC por 3 h. Em seguida foram adicionados 3 µL de RNAse A (4 mg/mL) seguindo incubação a 37 ºC por 30 min. A precipitação de proteínas foi feita com 200 µL de NaCl 5 M seguido de centrifugação por 6 min a 15000 xg. 600 µL de sobrenadante foram transferidos para um novo tubo. Posteriormente, adicionou-se ao sobrenadante 600 µL de isopropanol a 100 % seguido centrifugação por 5 min a 15000 xg. Após lavagem do precipitado com 600 µL etanol 70 % seguido de centrifugação por 6 min a 15000 xg o pellet foi deixado por 10 min na centrífuga a vácuo para secar. Em seguida o DNA foi hidratado com 30 µL de TE (10 mM Tris, pH 8,0 1 mM EDTA pH 8,0). Amplicação do DNA Fungo As reações de PCR foram conduzidas com um volume total de 25 µL, contendo em cada, reação o Kit Pure Taq Ready-To-Go PCR Beads, água Mili-Q autoclavada, ~10 ng DNA, 10 pmol de primers forward e reverse. Os primers utilizados para as amplificações são apresentados na tabela 2. O programado utilizado foi 3 min a 95 °C, seguidos de 40 ciclos de 94 °C a 25 segundos, 55-60 °C a 45 segundos e a 72 °C por 1 min, e uma extensão final de 15 min 72 °C. A temperatura de hibridização do EF1-α foi 55 ºC e o DMC1 60 ºC. Conteúdo da espermateca As reações de PCR foram conduzidas com um volume total de 30 μL, contendo em cada reação, água Mili-Q autoclavada, tampão 10 mM Tris-HCl, pH 8,3; 2.5 mM KCl (Fermentas cat # EPO402); MgCl2 1.5 mM (Fermentas cat # EPO402); 0.4mM dNTP mix (Fermentas cat 57 # RO192); ~100 ng DNA, 10 pmol primers forward e reverse. Os primers utilizados para as amplificações são apresentados na tabela 2. O programa utilizado foi 5 min a 94 °C, seguidos de 40 ciclos de 1 min a 94 °C, 1 min a 49 °C e 2 min a 68 °C e extensão final de 15 min a 68 °C. Os produtos das reações foram visualizados em gel de agarose 1 % em tampão TBE 1X e corados com Gel Red. Os produtos de PCR foram purificados em uma coluna de purificação utilizando o kit MN (MachereyNagel). Tabela 2 - Iniciadores utilizados para a amplificação das regiões EF1-α, DMC1 e para os lócus Citocromo I (COI), Espaçador Intergênico (IGS), RNA Transportador de Leucina (Leu- tRNA) e Citocromo II (COII). Nome do iniciador Sequência do iniciador (5’-3’) Referência Amostra EF1-α-F GTT GCT GTC AAC AAG ATG GAC ACT AC Mikheyev et al., 2006 Fungo EF1-α-R GCC TTG ATG ATA CCA GTC TCG ACA CG Mikheyev et al., 2006 Fungo DMC1-F AAG CTG CAC ACA AAA TCT TGG TTA G Mikheyev et al., 2006 Fungo DMC1-R GTC AAT GTC AAG AGA TCG GAT ACA C Mikheyev et al., 2006 Fungo ANT-F ATT CAT TCT TAT CTT GAA ATA TTA TTT C Martins, et al., 2007 Conteúdo da espermateca ANT-R TTC ATA AGT TCA GTA TCA TTG GTG Martins, et al., 2007 Conteúdo da espermateca Clonagem e sequenciamento Os pellets de fungos e o conteúdo da espermateca não foram sequenciados de forma direta porque os resultados iniciais do sequenciamento direto apresentaram ambiguidade. Portanto, os fragmentos purificados das amostras de fungo e do conteúdo da espermateca foram ligados ao vetor pGEM-T (Promega cat # A3600). Para cada reação de ligação foram utilizados 35 ng do produto de PCR purificado, três unidades de ligase T4 DNA, tampão 10X e 50 ng plasmídeo pGEM-T. A reação foi incubada overnight 4 ºC. Os fragmentos purificados foram ligados ao vetor pGEM- T (Promega), transfectados em Escherichia coli DH10B por choque térmico e purificado por miniprep e sequenciado com o primer forward do vetor. As reações de sequenciamento foram conduzidas com um volume total de 10 μL. Cada reação foi realizada com 700 ng de DNA, 6 pmol de primers, 1 µL BigDye (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA, cat # 4336919), 2 µL tampão (200 mMTris.HCl, 5 mM MgCl2) e água Mili-Q 58 autoclavada. O programa utilizado foi 96 ºC a 2 min seguidos de 28 ciclos de 96 ºC a 46 seg, 50 ºC a 30 seg e 60 ºC a 4 min. As amostras foram sequenciadas em um sequenciador automático ABI 3500 (Applied Biosystems). Análise das sequencias Após a etapa de pré-processamento feita com o sistema de geração de pipelines Egene (DURHAM et al., 2005), as sequências foram analisadas nos programas BIOEDIT (HALL, 1999) e alinhados com CLUSTALW (Thompson et al., 1994) A rede de haplótipos foi calculada através por “Median-Joining Network” através do programa NETWORK 4.5.0.0 (POLZIN et al., 2003) e DnaSP (LIBRADO; ROZAS, 2009). Marcadores microssatélites Para amplificação do DNA presente no conteúdo das espermatecas, as reações foram preparadas com volume final de 15 µL, contendo 25 ng de DNA genômico, água ultrapura, 1,5 mM de MgCl2, 125 μM de dNTP, 1U de taq DNA polimerase (Fermentas), tampão da enzima 0,66 x, 2 ρmol de primer forward, 8 ρmol de primer reverse, 8 ρmol de primer M13 contendo uma marca de fluorescência (FAM ou NED). Foram testados os primers Alae2, Alae 5, Alae 9, Alae 11, Alae 16 e Alae 24 desenvolvidos por Kakazu et al. (em preparação). O programa utilizado para amplificação do fragmento contendo a região SSR foi de 95 C por 4 minutos, seguido de 35 ciclos de 94 ºC por 30 segundos, 44-56 ºC por 30 segundos e 72 ºC por 30 segundos. Um segundo conjunto de ciclos foi feito para a incorporação da cauda M13 (12 ciclos de 94 ºC por 30 segundos, 53 ºC por 45 segundos, 72 ºC por 45 segundos e extensão final de 72 ºC por 20 minutos). Cada locus foi amplificado com temperatura de hibridização diferente variando de 42 a 52 ºC. A análise de fragmentos foi realizada em um sequenciador automático ABI 3500 (Applied Biosystems) no Laboratório de Evolução Molecular da UNESP - Rio Claro. 59 Resultados a) Temporalidade do voo nupcial de indivíduos de linhagens distintas No presente estudo, a revoada de A. laevigata foi acompanhada por três anos consecutivos, com anotações diárias do comportamento reprodutivo (Tabela 3). Durante o acompanhamento do comportamento em campo, foram observados três eventos: pré-revoada, revoada principal e revoada secundária. A pré-revoada foi caracterizada pela presença de diversos olheiros completamente limpos, com orifícios alargados, intenso forrageamento, agitação e agressividade das operárias. Esse evento também foi marcado pela saída de aproximadamente 15 alados por ninho com predominância de machos. Os alados surgiam na superfície, caminharam, movimentaram as asas e alguns voaram e outros retornaram para o interior do ninho. A revoada principal foi caracterizada pela saída maciça de alados seguida do voo nupcial. Na revoada secundária, houve liberação dos alados em pequena quantidade, também com voo nupcial e logo após a revoada principal. Apenas dois ninhos revoaram anos consecutivos. Em Bauru, no dia 16 de novembro de 2011, foi observada uma tentativa de revoada sem sucesso em 18 ninhos (Tabela 3). Içás e bitus saíram e caminharam na superfície do ninho por cerca de 5 horas ensaiando voo, mas, possivelmente porque havia rajadas de vento, retornaram para o interior do ninho. As formigas estavam extremamente agitadas e agressivas e exalavam um odor muito forte característico da colônia. No dia seguinte, a revoada foi iniciada com a saída maciça de bitus a partir das 14 h. Mais tarde, aproximadamente às 15 h, surgiram as içás que, em seguida, voaram acompanhando a direção do vento. O voo cessou aproximadamente às 17 h. As observações em campo mostraram um sincronismo e assincronismo no voo nupcial entre várias colônias de espécies do gênero Atta. As espécies apresentaram horários diferenciados de voo nupcial. Atta sexdens rubropilosa, Atta capiguara e A. laevigata revoaram pela tarde enquanto Atta bispaherica revoou pela manhã. Observou-se nas duas aéreas de estudo um assincronismo no voo nupcial dentro de cada linhagem de A. laevigata. Por exemplo, nem todos os ninhos da linhagem I observados revoaram no mesmo dia, o mesmo acontecendo com os ninhos da linhagem II. Esse assincronismo também foi observado em A. sexdens rubropilosa. Por outro lado, alguns ninhos da linhagem I e II em Botucatu revoaram no mesmo dia e no mesmo horário (Tabela 3). Nas regiões de Botucatu e de Bauru, foram marcados 84 ninhos de A. laevigata, mas observados 30, oito deles na linhagem I e 22 na linhagem II. Os resultados da observação dos 60 ninhos estão descritos na tabela 3. Em Botucatu, foram observados três eventos de voo nupcial em sincronismo entre ninhos de linhagens distintas: duas revoadas e uma pré-revoada (amarelo). Foram também observados quatro eventos de assincronismo entre linhagens distintas (verde): uma revoada, duas pré-revoadas e uma revoada secundária. Portanto, o sincronismo no voo nupcial entre ninhos simpátricos de linhagens distintas ocorreu em 43% das observações (três em sete eventos observados). A distância mínima entre esses ninhos era 1,29 km e a máxima de 1,86 Km. Em Botucatu, em ninhos da linhagem I, foi observado um maior número de eventos de voo nupcial, somando sete eventos em cinco ninhos, em 2009 e 2010. Cinco desses eventos envolveram mais de um ninho, ou seja, foram sincrônicos. Dois desses eventos envolveram apenas um ninho, ou seja, foram assincrônicos. Desta forma, o assincronismo no voo nupcial entre ninhos simpátricos na mesma linhagem I ocorreu em 29 % das observações (dois em sete eventos observados). A distância entre esses ninhos era 0,043 km e 0,273 km. Já na linhagem II, ocorreu apenas um evento sincrônico (33 % das observações) e dois eventos assincrônicos. A distância entre esses ninhos era 0,012 km e 1,92 km. Em Bauru, em 22 ninhos da linhagem II, foram observados voos nupciais em três eventos em 2011. Um desses eventos foi assincrônico e os outros dois foram sincrônicos. Desta forma, o sincronismo no voo nupcial entre ninhos simpátricos na mesma linhagem II ocorreu em 67 % das observações (dois em três eventos observados). A distância entre esses ninhos era 0,010 km e 2,10 Km. 61 Tabela 3 - Observação do comportamento reprodutivo das formigas em Botucatu e Bauru. P = pré-revoada; R = revoada; S = revoada secundária; T = tentativa de revoada sem sucesso; espaços não preenchidos: ausência de P, R, S e T; zero: ninhos não observados. Datas marcadas em amarelo indicam a ocorrência de sincronismo de voo nupcial em ninhos simpátricos de duas linhagens distintas. Datas marcadas em verde indicam eventos de assincronismo voo nupcial em ninhos simpátricos de duas linhagens distintas. * indica data de coleta de fêmeas fecundadas utilizadas para genotipagem do conteúdo das espermatecas. Ninho Data da observação - Botucatu Data da observação - Bauru 2009 2010 2011 11.09 21.10 10.11 28.10 31.10 01.11* 07.11 17.1 0 27.10 16.11 17.11* L I N H A G E M I N 01 P R S P P P R 0 0 0 0 N 02 R S 0 0 0 0 N 06 P R 0 0 0 0 N 19 R 0 0 0 0 N 74 P 0 0 0 0 L I N H A G E M II N 14 R R 0 0 0 0 N 29 P 0 0 0 0 N 30 P 0 0 0 0 N 24 0 0 0 0 0 0 0 T R N 26 0 0 0 0 0 0 0 N 27 0 0 0 0 0 0 0 T R N 28 0 0 0 0 0 0 0 R T S N 46 0 0 0 0 0 0 0 T R N 55 0 0 0 0 0 0 0 R N 56 0 0 0 0 0 0 0 R T S N 66 0 0 0 0 0 0 0 T R N 67 0 0 0 0 0 0 0 P N 79 0 0 0 0 0 0 0 T R N 80 0 0 0 0 0 0 0 P T R N 81 0 0 0 0 0 0 0 P T R N 82 0 0 0 0 0 0 0 T R N 83 0 0 0 0 0 0 0 R N 84 0 0 0 0 0 0 0 T R N 85 0 0 0 0 0 0 0 R T S N 86 0 0 0 0 0 0 0 T R N 87 0 0 0 0 0 0 0 T R N 90 0 0 0 0 0 0 0 T R N 91 0 0 0 0 0 0 0 P T R N 92 0 0 0 0 0 0 0 T R N93 0 0 0 0 0 0 0 T R Os resultados apresentados na tabela 3 permitiram concluir que a ocorrência de sincronismo de voo nupcial entre linhagens distintas (43 %) não pode ser considerada diferente daquelas ocorrendo dentro de cada uma das linhagens (71 ou 67 %). Portanto, não há assincronismo no voo nupcial entre as linhagens de A. laevigata. 62 b) Co-especiação entre os mutualistas formiga e fungo Foram analisadas nove amostras de fungos, quatro da região de Botucatu e cinco da região de Bauru. Um total de 43 sequências da região EF1-α foi obtido a partir de pellets coletados de uma içá por ninho, sendo três ninhos da linhagem I e cinco ninhos da linhagem II. Uma exceção ocorreu no ninho 02 (linhagem I), do qual dois pellets foram coletados, um por içá (Tabela 1). Da região DMC1, 85 sequências foram obtidas a partir de pellets coletados de uma içá por ninho, sendo três ninhos da linhagem I e seis ninhos da linhagem II (Tabela 1). O comprimento final das sequências obtidas, após o alinhamento e cortes das extremidades, foi de 415 pares de bases para o gene EF1-α e 400 pares de bases para gene DMC1. A figura 1 mostra que quatro haplótipos (8, 12, 19, 21) da região EF1-α foram encontrados somente em fungos cultivados pela linhagem I das formigas e 23 haplótipos (1-7, 9-11, 13-17, 20, 22-28) foram encontrados somente em fungos cultivados pela linhagem II das formigas. O haplótipo 18 foi encontrado em fungos cultivados pelas duas linhagens de formigas. Três grupos de fungos foram encontrados (1A, 1B e 1C), cada um deles contendo, respectivamente, os haplótipos ancestrais H_4, H_13 e H_18, que são mais frequentes e centros de divergência dos demais haplótipos mais recentes. Formigas da linhagem II cultivam fungos dos três grupos, enquanto formigas da linhagem I cultivam fungos dos grupos 1A e 1C. A figura 2 mostra que os haplótipos 32 a 35 da região DMC1 foram exclusivamente encontrados em fungos cultivados pela linhagem I das formigas. E que 26 haplótipos (3,4, 7- 10, 12-31) foram encontrados em fungos cultivados apenas pela linhagem II das formigas. Os haplótipos 1, 2, 5, 6 e 11 foram encontrados em fungos cultivados pelas duas linhagens de formigas. Neste caso, foram também caracterizados três grupos de fungos (2A, 2B e 2C), cada um deles cultivado por ambas as linhagens de formigas. Cada grupo apresentou um haplótipo ancestral: H_11, H_7 e H_1. Em resumo, os resultados da rede de haplótipos para a região EF1-α demonstram que as formigas, sejam da linhagem I ou da linhagem II, podem cultivar fungos no mesmo grupo gênico, inclusive fungos compartilhando o mesmo haplótipo. O mesmo pode ser concluído a partir da análise da região DMC1. Portanto, não foram observadas diferenças significativas entre as linhagens de formiga com relação ao tipo de fungo mutualista cultivado. 63 Figura 1 - Rede de haplótipos para a região EF1-α, representados por círculos de tamanhos e áreas coloridas proporcionais às frequências haplotípicas encontradas nas linhagens I e II de A. laevigata. Os pontos vermelhos representam haplótipos preditos não amostrados. Os números em vermelho representam os passos mutacionais. Nota-se que o haplótipo H_18 foi encontrado em fungos cultivados pelas duas linhagens de formigas. 64 Figura 2 - Rede de haplótipos para a região DMC1, representados por círculos de tamanhos e áreas coloridas proporcionais às frequências haplotípicas encontradas nas linhagens I e II de A. laevigata. Os pontos vermelhos representam haplótipos preditos não amostrados. Os números em vermelho representam os passos mutacionais. Nota-se que os haplótipos 1, 2, 5, 6 e 11 foram encontrados em fungos cultivados pelas duas linhagens de formigas. Os dados apresentados nas figuras 1 e 2 permitiram uma averiguação adicional, que foi o estudo da diversidade de cepas do fungo L. gongylophorus associadas a cada ninho da formiga A. laevigata. Para facilitar a visualização da diversidade de haplótipos encontrada em cada ninho, marcamos com diferentes cores os haplótipos das figuras 1 e 2, utilizando uma cor para cada um dos nove ninhos analisados. A figura 3 mostra que em içás dos ninhos 14 e 66 foi encontrada grande diversidade fúngica, com seis e 11 haplótipos de EF1-α, respectivamente. Os haplótipos dos pellets da içá do ninho 14 estiveram distribuídos nos grupos 1B e 1C e os haplótipos do pellet da içá do ninho 66 nos grupos 1A e 1C. Os ninhos 24 e 85 também apresentaram içás carregando haplótipos em diferentes grupos. O ninho 2 do qual dois pellets foram usados apresentou apenas três haplótipos distintos para esse marcador. 65 A figura 4 mostra que a içá do ninho 14 apresentou 13 haplótipos de DMC1 distribuídos nos grupos 2A e 2B e içá do ninho 56 apresentou oito haplótipos nos grupos 2A e 2C. Içás dos ninhos 1 e 2 também apresentaram haplótipos em diferentes grupos. A análise de dois pellets de içás do ninho 2 mostrou sete haplótipos distribuídos nos grupos 2A e 2C. Portanto, em sete dos nove ninhos analisados com os marcadores EF1-α ou DMC1 foram encontradas içás com pellets de L. gongylophorus em mais de um grupo. Içás de ambas as linhagens I e II carregaram em seus pellets mais de um grupo de fungo mutualista. 66 Figura 3 - Análise de haplótipos para região EF1-α formando três grupos. O diâmetro do círculo do haplótipo é proporcional à sua frequência. Os pontos vermelhos representam haplótipos preditos não amostrados. Número amostral: Linhagem I – 3 ninhos; linhagem II – 5 ninhos. 67 Figura 4 - Análise de haplótipos para região DMC1 formando três grupos. O diâmetro do círculo do haplótipo é proporcional a sua frequência. Os pontos vermelhos representam haplótipos preditos não amostrados. Número amostral: Linhagem I – 3 ninhos; linhagem II – 6 ninhos c) Frequência de acasalamento Marcador mitocondrial A cabeça de cada fêmea fecundada foi sequenciada e comparada com as sequências de indivíduos de ambas as linhagens. O conteúdo das espermatecas das fêmeas fecundadas foi genotipado, resultando 154 sequências com 456 pares de base da região que compreende os genes mitocondriais COI, espaçador intergênico (IGS), Leu-tRNA e COII. O espaçador intergênico (IGS) distinguiu as duas linhagens de A. laevigata, mas a região foi excluída porque estava atrapalhando a análise. Das 39 amostras processadas para o marcador mitocondrial, obtivemos resultados apenas de 18 indivíduos, sendo sete da linhagem I de Botucatu e 11 da linhagem II de Bauru. Foram geradas 154 sequências contendo 43 haplótipos distintos. A linhagem I foi representada pelos 68 haplótipos 1 a 15 e a linhagem II foi representada pelos haplótipos 16 a 43. Os haplótipos H_2, H_16 e H_24 se destacam pela alta frequência e provavelmente são ancestrais, sendo os demais haplótipos mais recentes. Não foram encontradas sequências mitocondriais de espermatozoides da linhagem II em espermatecas de fêmeas da linhagem I e vice versa. Portanto, os dados mitocondriais mostram que não há evidências de acasalamento entre indivíduos de linhagens distintas. Uma média de cinco haplótipos mitocondriais foi encontrada por fêmea fecundada. 69 Figura 5 - Análise de haplótipos para região que compreende os genes mitocondriais COI, Leu-tRNA e COII de espermatozoides. O diâmetro do círculo é proporcional à frequência do haplótipo. O número em vermelho representa os passos mutacionais.Número amostral: Linhagem I – 7 fêmeas (85E; 89E 90E; 91E; 95E; 105E; 123E); linhagem II – 11 fêmeas (38E; 40E; 42E; 60E; 65E; 70E; 72E; 73E; 77E; 78E; 80E). Microssatélites O conteúdo das espermatecas de 19 içás da linhagem I de Botucatu e 20 da linhagem II de Bauru foi genotipado para seis loci de microssatélites. Apenas o locus Alae16 foi monomórfico, enquanto os cinco loci restantes apresentaram 26 alelos na linhagem I e 53 na linhagem II. Kakazu et al. (em preparação) definiram alguns alelos exclusivos para cada linhagem de A. laevigata, obtidos a partir de operárias de ambas as linhagens coletadas nas regiões de Botucatu e Bauru. A figura 6 mostra quatro a seis machos fecundando fêmeas de A. laevigata. Nesse estudo, o locus Alae5-161 foi encontrado exclusivamente em operárias da linhagem I e a figura 6 mostra que o locus Alae5-161 foi encontrado apenas em espermatecas 70 de seis fêmeas da linhagem I. O locus Alae24-209 foi encontrado por Kakazu exclusivamente em operárias da linhagem II e a figura 6 mostra que o locus Alae24-209 foi encontrado apenas em espermatecas de duas fêmeas da linhagem II. Estes dados reforçam aqueles obtidos com os dados mitocondriais indicando de que machos de uma linhagem inseminam fêmeas da mesma linhagem. No entanto, o locus Alae24-203, que foi encontrado somente em operárias da linhagem I (Kakazu, et al., em preparação), foi encontrado em espermatecas de três fêmeas (70E, 73E, 78E) da linhagem II, sugerindo a inseminação de fêmeas da linhagem II por machos da linhagem I. 7 1 F ig u ra 6 - M ic ro ss at él it es e m e sp er m at o zo id es d a es p er m at ec a d e 1 9 i çá s d a li n h ag em I ( 2 6 a le lo s, r o x o ) d e B o tu ca tu e 2 0 i çá s d a li n h ag em I I (5 3 a le lo s, r o sa ) d e B au ru . S ei s lo ci f o ra m a n al is ad o s: A la e2 , 5 , 9 , 1 1 ,1 6 e 2 4 . C ad a co lu n a re p re se n ta u m d et er m in ad o a le lo e c ad a li n h a o g en ó ti p o e n co n tr ad o n a e sp er m at ec a. E m a m ar el o , o s al el o s ex cl u si v o s d e ca d a li n h ag em ; em v er d e, o a le lo e x cl u si v o d a li n h ag em I e n co n tr ad o n a li n h ag em I I. 72 Discussão Explicar como a especiação ocorre é algo extremamente difícil. A especiação pode ocorrer em diferentes organismos de formas diferentes. Em A. laevigata, averiguamos alguns fatores que poderiam estar relacionados ao processo de especiação. Temporalidade do voo nupcial O primeiro fator avaliado foi à temporalidade do voo nupcial de indivíduos de linhagens distintas. As observações realizadas durante o evento da pré-revoada corroboram as observações de Autuori (1941). As observações do comportamen