CLAUDIA PEREIRA DA SILVA Filtros UV na água de abastecimento público na região da Bacia Hidrográfica Tietê-Jacaré: desenvolvimento de método, estudo de ocorrência e concentrações ambientais Tese apresentada ao Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do titulo de Doutor em Química Orientadora: Profª Drª Mary Rosa Rodrigues de Marchi Araraquara 2014 FICHA CATALOGRÁFICA Silva, Claudia Pereira da S586f Filtros UV na água de abastecimento público na região da Bacia Hidrográfica Tietê-Jacaré: desenvolvimento de método, estudo de ocorrência e concentrações ambientais / Claudia Pereira da Silva. – Araraquara : [s.n], 2014 125 f. : il. Tese (doutorado) – Universidade Estadual Paulista, Instituto de Química Orientador: Mary Rosa Rodrigues de Marchi 1. Contaminantes emergentes na água. 2. Planejamento experimental. 3. Filtro Solar. 4. Cromatografia a gás. 5. Desreguladores endócrinos. I. Título. Elaboração: Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação do Instituto de Química de Araraquara Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação DADOS CURRICULARES DADOS PESSOAIS Nome: Claudia Pereira da Silva Filiação: Gedeão Pereira da Silva e Tereza Pereira da Silva E-mail: claudiaufs@yahoo.com.br FORMAÇÃO ACADEMICA/TITULAÇÃO 2010 – Atual: Doutorado em Química Analítica Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, Instituto de Química – Araraquara, São Paulo, Brasil. Orientador: Mary Rosa Rodrigues de Marchi Bolsista da: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior 2008 - 2010 Mestrado em Química Universidade Federal de Sergipe, UFS, São Cristovão, Brasil. Título: Determinação de ácidos haloacéticos em água utilizando técnicas cromatográficas, Ano de obtenção: 2010. Orientador: Sandro Navickiene Bolsista do: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico 2004 - 2007 Graduação em Química Licenciatura Universidade Federal de Sergipe, UFS, São Cristovão, Brasil. FORMAÇÃO COMPLEMENTAR 2010 - 2010 Curso de curta duração em "Saber Água - SE". Instituto Tecnológico e de Pesquisas do Estado de Sergipe, ITPS, Aracaju, Brasil. 2009 - 2009 Curso de curta duração em Os desafios do Pré-Sal e o Novo Marco Regulatório. Universidade Federal de Sergipe, UFS, São Cristovão, Brasil. 2008 - 2008 Curso de curta duração em Decomposição de Amostras por Micro- ondas. Embrapa Tabuleiros Costeiros, EMBRAPA, Brasil. 2008 - 2008 Curso de curta duração em Análise de Metais-traço em Biotas Marinhas. Universidade Federal de Sergipe, UFS, São Cristovão, Brasil. 2008 - 2008 Curso de curta duração em "Princípios Básicos de GC e GC-MS" Operação e manutenção. Scientific Instruments Co.SINC, Brasil. 2008 - 2008 Curso de curta duração em HPLC: dos fundamentos à aplicação. Universidade Federal de Sergipe, UFS, São Cristovão, Brasil. 2008 - 2008 Curso de curta duração em Técnica de Absorção Atômica. Instituto Tecnológico e de Pesquisas do Estado de Sergipe, ITPS, Aracaju, Brasil. 2008 - 2008 Curso de curta duração em Cromatografia Líquida de Alta Eficiência. Embrapa Tabuleiros Costeiros, EMBRAPA, Brasil. 2008 - 2008 Curso de curta duração em Produção e Qualidade de Biodiesel. Embrapa Tabuleiros Costeiros, EMBRAPA, Brasil. 2008 - 2008 Curso de curta duração em Workshop Sedimentos Aquáticos e Poluição por Metais. Instituto de Tecnologia e Pesquisa, ITP, Aracaju, Brasil. 2007 - 2007 Curso de curta duração em Alimentação Natural. Universidade Federal de Sergipe, UFS, São Cristovão, Brasil. 2007 - 2007 Curso de curta duração em Catalisadores Metálicos. Universidade Federal de Sergipe, UFS, São Cristovão, Brasil. 2007 - 2007 Curso de curta duração em Ensino Pesquisa e Extensão. Universidade Federal de Sergipe, UFS, São Cristovão, Brasil. 2006 - 2006 Curso de curta duração em III workshop em Química e Biotecnologia. Universidade Federal de Sergipe, UFS, São Cristovão, Brasil. 2006 - 2006 Curso de curta duração em Planejamento e Otimização de Experimentos. Universidade Federal de Sergipe, UFS, São Cristovão, Brasil. 2006 - 2006 Curso de curta duração em A Eletroquímica como Ferramenta na Química Ambiental. Universidade Federal de Sergipe, UFS, São Cristovão, Brasil. 2005 - 2005 Curso de curta duração em Modelagem Molecular no Planejamento de Drogas. Universidade Federal de Sergipe, UFS, São Cristovão, Brasil. 2005 - 2005 Curso de curta duração em Bioeletroquímica. Universidade Federal de Sergipe, UFS, São Cristovão, Brasil. 2005 - 2005 Curso de curta duração em Amostragem Estocagem e Preparo de Amostras Ambientais. Universidade Federal de Sergipe, UFS, São Cristovão, Brasil. 2004 - 2004 Extensão universitária em Meio Ambiente e Química Analítica. Universidade Federal de Sergipe, UFS, São Cristovão, Brasil ATUAÇÃO PROFISSIONAL 1. Secretaria de Estado da Educação (SE) - SEED 2007 - 2008 Vínculo: Professor, Enquadramento funcional: Professor de química, Carga horária: 16. PRODUÇÃO BIBLIOGRÁFICA Artigos completos publicados em periódicos 1. DA SILVA, CLAUDIA PEREIRA , SOARES EMÍDIO, ELISSANDRO, DE MARCHI, MARY ROSA RODRIGUES. Method validation using weighted linear regression models for quantification of UV filters in water samples. Talanta (Oxford). , v.131, p.221 - 227, 2015. 2. SILVA, CLAUDIA P. DA , EMÍDIO, ELISSANDRO S., MARCHI, MARY R. R. DE. UV Filters in Water Samples: Experimental Design on the SPE Optimization followed by GC-MS/MS Analysis. Journal of the Brazilian Chemical Society (Impresso). , v.24, p.1433 - 1441, 2013. 3. DA SILVA, ROGERIO LUIZ, DA SILVA, CLAUDIA PEREIRA , NAVICKIENE, SANDRO. Multiresidue determination of carbamate, organochlorine, organophosphorus, and dicarboximide pesticides in lettuce by GC/MS. Journal of Environmental Science and Health. Part B. Pesticides, Food Contaminants, and Agricultural Wastes. , v.45, p.589 - 594, 2010. Trabalhos publicados em anais de eventos (resumo) 1. SILVA, C. P. da, EMIDIO, E. S., MARCHI, M. R. R. Determination of UV filters by gas chromatography coupled to tandem ion trap mass spectrometry in natural waters from São Paulo state (Brazil). In: 38th International Symposium on Capillary Chromatography & 11 th GCxGC Symposium (38th ISCC & 11th GCxGC, 2014, Riva del Garda. 2. SILVA, C. P. da, EMIDIO, E. S., MARCHI, M. R. R. Multivariate optimization on UV filters extraction from natural water In: 14th EuCheMS International Conference on Chemistry and the Environment , 2013, Barcelona. 3. LUIZETE, M. F., SILVA, C. P. da, MARCHI, M. R. R. Otimização experimental da derivação de parabenos para analise via CG-EM In: 5º Congresso Ibero americano de Química Analítica. 2º Congresso Uruguaio de Química Analítica , 2012, Montevidéu. 4. SILVA, C. P. da, MARCHI, M. R. R. Análise de produtos de cuidado pessoal (PPC) em água: Otimização de método cromatográfico para análise de resíduos de filtros UV. In: IX Latin American symposium on environmental and sanitary analytical chemistry , 2011, Salvador, 2011. 5. SILVA, R. L. da, FROES, M. B. R., SILVA, C. P. da, NAVICKIENE, S. Desenvolvimento de método para determinação de resíduos de pesticidas em alface produzida em sistema convencional. In: 34ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química , 2011, Florianópolis, 2011. 6. SILVA, C. P. da, ZOCOLO, G. J., MARCHI, M. R. R. Otimização de método e avaliação do efeito matriz na análise de resíduos de PCPs em água por GC-MS/MS In: 16º Encontro Nacional de Química Analítica , 2011, Campos do Jordão, 2011. 7. SILVA, C. P. da, SILVA, R. L. da, FROES, M. B. R., DOREA, H. D., NAVICKIENE, S. Determinação de ácidos haloacéticos em água utilizando extração em fase sólida e cromatografia a gás com detecção por captura de elétrons In: 33ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química , 2010, Águas de Lindóia, 2010. 8. FROES, M. B. R., NAVICKIENE, S., DOREA, H. D., SILVA, C. P. da, SILVA, R. L. da. Desenvolvimento de método analítico para determinação de resíduos de pesticidas em cupuaçu usando MSPD e HPLC. In: 15º Encontro Nacional de Química Analítica e 3º Congresso Ibero americano de Química Analítica , 2009, Salvador-BA, 2009. 9. SILVA, C. P. da, NAVICKIENE, S., DOREA, H. D., SILVA, R. L. da, FROES, M. B. R. Desenvolvimento de Método para Determinação de Ácidos Haloacéticos em Água utilizando EFS e CG/DCE In: 15º Encontro Nacional de Química Analítica e 3º Congresso Ibero americano de Química Analítica , 2009, Salvador-BA, 2009. 10. SILVA, R. L. da, NAVICKIENE, S., DOREA, H. D., SILVA, C. P. da, FROES, M. B. R. Desenvolvimento de Método para Determinação de Resíduos de Pesticidas em Alface Utilizando GC/MS In: 15º Encontro Nacional de Química Analítica e 3º Congresso Iberoamericano de Química Analítica , 2009, Salvador-BA, 2009. 11. MOREIRA, F. K. V., SILVA, C. P. da, GIMENEZ, I. F., BARRETO, L. S. Aplicação de Peneiras Moleculares de Carbono no Tratamento de Água Contaminada por Compostos Orgânicos In: XVII Encontro de Iniciação Científica - UFS/CNPq, 2007, São Cristóvão, 2007. 12. SILVA, C. P. da, MOREIRA, F. K. V., GIMENEZ, I. F., VIEIRA, E. F. S., BARRETO, L. S. Biocompósitos de Celulose do Pó Residual do Coco e outros Biopolímeros: Preparação, Caracterização e Aplicação. In: XVII Encontro de Iniciação Científica , 2007, São Cristóvão, 2007. Apresentação de trabalho e palestra 1. SILVA, C. P. da, MARCHI, M. R. R. Análise de produtos de cuidado pessoal (PPC) em água: Otimização de método cromatográfico para análise de resíduos de filtros UV , 2011. (Simpósio, Apresentação de Trabalho) 2. SILVA, C. P. da, MOREIRA, F. K. V., GIMENEZ, I. F., VIEIRA, E. F. S., BARRETO, L. S. Biocompósitos de Celulose do Pó Residual do Coco e outros Biopolímeros: Preparação, Caracterização e Aplicação , 2007. (Congresso, Apresentação de Trabalho) Dedico esse trabalho a minha mãe Tereza a meu pai Gedeão, pela educação pelo amor, pelo carinho e pela enorme e maravilhosa família. Os quais foram, são e sempre serão tudo pra mim. Também, dedico a meu amado Elissandro por todo apoio, incentivo, carinho e cuidado. AGRADECIMENTOS Agradeço... primeiramente ao meu bom Deus por ter me guiado por todo esse tempo, por ter feito de mim uma pessoa forte, forte o suficiente para enfrentar sem fraquejar todas as dificuldades. Obrigado aos meus queridos pais (dona Tereza e seu Dida) pelos exemplos diários de nobreza e dignidade, pelos vários sacrifícios enfrentados para proporcionar a mim e aos meus irmãos sempre o melhor possível. Obrigada a meus irmãos (Teninho, Jato, Nanã, Nega, Zilda, Aninha, José, Márcio, Valeria e Nando) pelo carinho, pela força, pelo incentivo e pelo auxilio financeiro no tempo das “vacas magras” rsrsrsr. Obrigada ao meu querido e amado, Elissandro... pelo carinho, pelo amor, pela atenção, pelo apoio psicológico véspera prova de seleção, vinda para Araraquara e permanência em Araraquara e principalmente pela paciência em ouvir todas as prévias: previa de apresentação de seminário, de qualificação, de apresentação em congresso e prévias e mais prévias da defesa. Muito obrigada pela ajuda nas coletas, pelas horas de extração pelas horas de estudo, pelos puxões de orelha para que eu fosse escrever... Resumindo MUITO OBRIGADA POR TUDO!!! Obrigada ao William, pela ajuda nas coletas, aos motoristas da UNESP que sempre foram muito gentis e prestativos durante as coletas. A Dona Mariley, a Poli e a Maria por todo auxílio no laboratório. Obrigada aos amigos do GRESCO principalmente ao Guilherme por toda sua boa vontade em ajudar e a Lucy pela amizade, pela alegria contagiante, pelas conversas e conselhos..., também aos amigos da Análise Térmica e agregados. Agradeço especialmente a professora Drª Mary Rosa por ter me recebido e me incentivado diariamente a crescer, não só como profissional, mais também como pessoa, incentivo esse que não ficou só em palavras, mas a partir de exemplos diários. Muito obrigada pela confiança, pela atenção e especialmente pela liberdade em me deixar crescer no meu ritmo e do meu jeito. Isso foi fundamental para meu progresso. Obrigada a CAPES e FACTE pelo auxílio financeiro. A UNESP por todo suporte técnico e acadêmico. “Seu trabalho vai preencher uma parte grande da sua vida, e a única maneira de ficar realmente satisfeito é fazer o que você acredita ser um ótimo trabalho. E a única maneira de fazer um excelente trabalho é amar o que você faz”. Steve Jobs RESUMO Substâncias orgânicas capazes de absorver radiações ultravioletas A e B (UVA e UVB) são utilizadas em protetores solares e, cada vez mais, têm sido empregadas na formulação de diversos cosméticos e produtos de higiene pessoal em virtude da crescente preocupação com os danos causados pela radiação solar, em especial os cânceres de pele. Diante dessa ampla utilização, tais substâncias acabam por aportar em ambientes aquáticos por meio de atividades recreacionais ou lançamento de esgoto doméstico. Estudos realizados em países europeus apontaram a presença de filtros UV em águas superficiais, sedimentos e peixes. A preocupação quanto à presença deste tipo de substância no ambiente e à exposição de organismos aquáticos reside na potencialidade de bioacumulação e capacidade de atuarem como interferentes endócrinos. Diversos bioensaios in vitro e in vivo mostram que as substâncias benzofenona-3 (BP-3), etilhexil salicilato (ES), etilhexil metoxinamato (EHMC) e octocrileno (OC), alvos deste estudo, apresentam atividade estrogênica. Apesar de tais evidências, existem poucos estudos sobre a ocorrência e destino deste tipo de substância no ambiente e nenhum se refere ao Brasil. Com isso, o presente estudo descreve o desenvolvimento, otimização e validação de método além do estudo de ocorrência dos filtros UV em matrizes ambientais. O metodo desenvolvido baseou-se em extração em fase sólida (SPE) e cromatografia a gás acoplada à espectrometria de massas em tandem. A otimização utilizada foi a multivariada onde as variáveis que podiam afetar a eficiência da extração foram estudadas simultaneamente utilizando um planejamento experimental, um planejamento fatorial fracionário (PFF) 25-1. O uso do PFF proporcionou um desenvolvimento de método de extração rápido eficiente e econômico. Os parâmetros de validação avaliados foram seletividade, curva analítica, precisão, exatidão, limite de detecção e limite de quantificação. A avaliação da seletividade, particularmente do efeito matriz, é um aspecto muito importante do estudo de validação e não foi negligenciado. Na avaliação das curvas, embora os modelos de calibração por regressão linear por mínimos quadrados não ponderados tenham sido tradicionalmente utilizados, eles não são necessariamente os modelos ótimos. Nesse trabalho, como a homocedasticidade dos dados não foi assumida, foi utilizada regressão linear por mínimos quadrados ponderados. Então, para o método proposto, todas as figuras de mérito foram satisfatórias, com recuperações para os quatro níveis de fortificação entre 62 e 107%, desvio padrão relativo menor que 14%. Os limites de quantificação foram encontrados na faixa de ng L-1, variando entre 10 e 50 ng L-1. O método foi aplicado para a análise dos quatro filtros UV em amostras de águas naturais, especificamente nas estações de tratamento de água (ETAs) da Bacia Hidrográfica Tietê- Jacaré (UGRHI-13), no Estado de São Paulo num período de 6 meses a 1 ano. Todos os analitos foram detectados em algum momento do período de estudo. No entanto, apenas BP-3 e EHMC em concentrações quantificáveis, variando de 18 a 115 ng L-1. Palavras-chave: Filtros UV. SPE. GC-MS/MS. Otimização multivariada. Homocedasticidade. Validação. ABSTRACT Organic substances capable of absorbing ultraviolet radiation A and B (UVA and UVB) are used in sunscreens and, increasingly, have been employed in the formulation of various cosmetics and personal care products (PCPs) due to the increasing concern about the damage caused by radiation solar, especially skin cancers. Because of their widespread use, these substances eventually contribute in aquatic environments through recreational activities or release of wastewater. Studies in European countries indicated the presence of UV filters in surface water, sediments and fish. The concern about the presence of these substance in the environment and exposure of aquatic organisms is the potential for bioaccumulation and ability to act as endocrine disruptors. Bioassays in vitro and in vivo show that substances benzophenone-3 (BP-3), ethylhexyl salicylate (ES), ethylhexyl metoxinamato (EHMC) and octocrylene (OC), targets of this study, have estrogenic activity. Despite the evidence, there are few studies on the occurrence and fate of this type of substance in the environment and none refers to Brazil. Thus, this work describes the development, optimization, validation of the method and the occurrence of UV filters in environmental matrices. The developed method is based on solid phase extraction (SPE) and gas chromatography-tandem mass spectrometry. The multivariate optimization was used where the variables affecting the extraction efficiency were studied simultaneously using an experimental design. A fractional factorial design (FFD) 25-1. The use of FFD provided a development method of extraction fast efficient and economical. The validation parameters evaluated were selectivity, calibration curve, precision, trueness, limit of detection and quantification. The selectivity, particularly the matrix effect, is a very important aspect of the validation study and this parameter was not been overlooked. In the evaluation of the analytical curve, although the calibration models by non-weighted least squares linear regression model has traditionally been used for calibration, but it is not necessarily the optimal model in all cases. In this work, as the homoscedasticity of the data was not assumed, we used weighted least squares linear regression. Thus, for the proposed method, all figures of merit were satisfactory, with recoveries for the four fortification levels between 62 and 107%, relative standard deviation less than 14%. The limits of quantification were found in the range of ng L-1 (10 to 50 ng L-1). The method was applied to the analysis of the four UV in natural water samples filters, specifically in water treatment plants of the hydrographic basin Tietê-Jacaré (UGRHI-13), in São Paulo stations within 6 months to one year. All analytes were detected at some point during the study period. However, only BP-3 and EHMC in measurable concentrations between 18 and 115 ng L-1. Keywords: UV filters. SPE. GC-MS/MS. Multivariate optimization. Homoscedasticity. Validation. LISTA DE FIGURAS Figura 1 – Vias de aporte dos filtros UV em água. 30 Figura 2 – Processos de alteração endócrina: (a) Resposta natural, (b) Efeito agonista, (c) Efeito antagonista. 34 Figura 3 – Etapas do processo de Extração em Fase Sólida (SPE). 37 Figura 4 – Fluxograma das etapas geralmente utilizadas na analise de filtros UV em amostras de águas naturais. 40 Figura 5 – Gráfico residual para avaliação da regressão com distribuição satisfatória dos resíduos. 43 Figura 6 – Passos para avaliação dos dados da curva analítica 46 Figura 7 – Fluxograma das etapas de um estudo ambiental. 49 Figura 8 – Etapas envolvidas na estratégia de amostragem. 49 Figura 9 – Percentagens da coleta e tratamento de esgoto do Brasil e regiões. 51 Figura 10 – Mapa do Estado de São Paulo segundo a divisão do território em UGRHI (numeradas de 1 a 22). 51 Figura 11 – Localização dos municípios, da UGRHI-13, selecionados como sítios de amostragem. 53 Figura 12 – Localização da UGRHI-13 no território nacional e dos municípios selecionados como sítios de amostragem. 59 Figura 13 – Localização do município de Araraquara-SP. 59 Figura 14 – Etapas convencionais do tratamento de água para abastecimento público. 61 Figura 15 – Fotos dos pontos de coleta da ETA da Fonte. a) foto da fachada da ETA b) ponto de coleta da água de rio, c) ponto de coleta da água tratada e d) ponto de coleta da água clorada. 62 Figura 16 – Fotos dos pontos de coleta da ETA de Bueno de Andrada. a) ETA, b) ponto de coleta da água bruta e c) dosador automático d) ponto de coleta da água clorada. 63 Figura 17 – Localização do município de Bauru-SP. 64 Figura 18 – Fotos dos pontos de coleta da ETA de Bauru. a) foto da fachada da ETA b) ponto de coleta da água de rio, c) ponto de coleta da água tratada e da água clorada. 64 Figura 19 – Localização do município de Jau-SP. 65 Figura 20 – Fotos dos pontos de coleta da ETA de Jau. a) foto da fachada ETA b) ponto de coleta da água de rio, c) ponto de coleta da água tratada e d) ponto de coleta da água clorada. 66 Figura 21 – Localização do município de São Carlos-SP. 66 Figura 22 – Fotos dos pontos de coleta da ETA de São Carlos. a) foto da fachada da ETA b) ponto de coleta da água de rio e da água clorada c) ponto de coleta da água tratada. 67 Figura 23 – Localização do município de Trabiju-SP. 68 Figura 24 – Foto dos pontos de coleta da ETA de Trabiju. 68 Figura 25 – Cromatograma (TIC) para a solução mista dos filtros UV em acetato de etila a 500 µg L-1, usando as condições otimizadas (Tabela 6) 72 Figura 26 – Espectro de massas obtidos a partir do cromatograma no modo “full scan” (Figura 25). Íons precursores selecionados (BP-d10 – 192 m/z; ES – 120,0 m/z; BP-3 – 227,2 m/z; BC – 193,1 m/z; EHMC – 178,3 m/z; OC – 250,2 m/z). 73 Figura 27 – Escolha do mecanismo de SPE para amostras aquosas. 75 Figura 28 – Gráfico de Pareto para as respostas normalizadas. 83 Figura 29 – Sistema utilizado para realizar várias extrações simultaneamente. Em destaque o reservatório para acondicionar a amostra. 84 Figura 30 – Fluxograma do procedimento de SPE otimizado. 86 Figura 31: Cromatograma obtido no modo MRM com fortificações dos filtros UV e surrogate a 200 ng L-1 (concentração na amostra). O padrão interno (BC) a 100 µg L-1 (concentração no extrato final). EHMCs estão presentes ambos (Z) e (E) isômeros. 87 Figura 32 – Curvas analíticas (GC-MS/MS) em solvente ( ) e no extrato da matriz ( ) para os analitos em estudo. 88 Figura 33 – Gráfico dos resíduos versus concentração. 90 Figura 34 – Percentagem do erro relativo (ER%) versus concentração obtida para o modelo 2 ( ), modelo 4 ( ) e modelo 8 ( ). 92 Figura 35 – Concentração média (n=3) mensal para BP-3 em água de rio ( ), água tratada ( ) e água clorada( ) da ETA de Araraquara. 102 Figura 36 – Percentagem do erro relativo (ER%) versus concentração obtida para o modelo 2 ( ), modelo 5 ( ) e modelo 8 ( ). 124 Figura 37 – Percentagem do erro relativo (ER%) versus concentração obtida para o modelo 1 ( ), modelo 3 ( ), modelo 4 ( ) e modelo 8 ( ). 124 Figura 38 – Percentagem do erro relativo (ER%) versus concentração obtida para o modelo 2 ( ), modelo 3 ( ), modelo 5 ( ) e modelo 8 ( ). 125 Figura 39 – Percentagem do erro relativo (ER%) versus concentração obtida para o modelo 2 ( ), modelo 3 ( ), modelo 5 ( ) e modelo 8 ( ). 125 LISTA DE TABELAS Tabela 1 – Substância, abreviação, Nº de registro CAS, estrutura química, massa molar, valores de log Kow e ponto de ebulição para os filtros UV incluídos neste trabalho. 26 Tabela 2 – Concentração máxima permitida, em produtos de cuidado pessoal, para BP-3, ES, EHMC e OC no Brasil, União Europeia, Estados Unidos e Japão. 27 Tabela 3 - Sumário das matrizes, métodos de extração e análise e das concentrações médias ou faixas de concentrações dos filtros UV no ambiente. 31 Tabela 4 – Avaliação semi-quantitativa das atividades agonistas e antagonistas dos compostos em ensaios com (hER) e hAR. 35 Tabela 5 – Carga orgânica poluidora de origem doméstica dos municípios da UGRHI-13. Em negrito, os municípios inseridos nesta tese. 52 Tabela 6: Condições cromatográficas otimizadas 71 Tabela 7 – Condições otimizadas para as análises com dupla fragmentação por GC-MS/MS. 74 Tabela 8 – Variáveis envolvidas no procedimento de SPE dos filtros UV. 77 Tabela 9 – Áreas obtidas por meio de injeções com e sem secagem da solução padrão mista de filtros UV em isooctano. E seus respectivos coeficientes de variação (CV). 78 Tabela 10 – Áreas obtidas para os filtros UV após testes de secagem (avolumando por fluxo suave de N2, secando completamente por rota evaporador e secando completamente por fluxo suave de N2). E seus respectivos CVs. 79 Tabela 11 – Variáveis e níveis estudados por PFF 25-1 na otimização do procedimento de SPE. 81 Tabela 12 – Recuperações (expressas como porcentagem) obtidas para os filtros UV após SPE dos testes de Planejamento experimental e a resposta normalizada para cada um desses experimentos. 82 Tabela 13 – Valores de pH estudados na otimização da extração e as respectivas recuperações (%). 84 Tabela 14 – Recuperações médias (%) obtidas na avaliação da perda dos filtros UV no reservatório da amostra. 84 Tabela 15 – Recuperações médias (%) obtidas na avaliação da lavagem dos reservatórios da amostra. 85 Tabela 16 – Curvas analíticas (GC-MS/MS) para os analitos de interesse na matriz. 89 Tabela 17 – Parâmetros de regressão da curva de calibração (y=ax+b) gerada para cada peso (W) e as respectivas somas dos erros relativos ( %∑ER ) para o BP- d10. 92 Tabela 18 – Parâmetros (otimizados) de regressão da curva de calibração gerada para cada analito e as respectivas somas dos erros relativos (∑ ER%). 93 Tabela 19 – Recuperações médias e coeficientes de variação (CV) para n = 3 94 Tabela 20 – Limite de detecção e quantificação do método de extração por SPE e GC- MS/MS. 95 Tabela 21 – Concentração dos filtros UV em água (ng L-1) de março/2013 a fevereiro/2014 na ETA de Araraquara. Para BP-10 recuperações médias e coeficientes de variação (n=3). 98 Tabela 22 – Concentração dos filtros UV em água (ng L-1) de Abril/2013 a setembro/2013 na ETA de Bauru. Para BP-10 recuperações médias e coeficientes de variação (n=3). 99 Tabela 23 – Concentração dos filtros UV em água (ng L-1) de abril/2013 a setembro/2013 na ETA de São Carlos. Para BP-10 recuperações médias e coeficientes de variação (n=3). 99 Tabela 24 – Concentração dos filtros UV em água (ng L-1) de março/2013 a agosto/2013 na ETA de Jau. Para BP-10 recuperações médias e coeficientes de variação (n=3). 100 Tabela 25 – Concentração dos filtros UV em água (ng L-1) de março/2013 a agosto/2013 na ETA de Bueno de Andrada. Para BP-10 recuperações médias e coeficientes de variação (n=3). 100 Tabela 26 – Concentração dos filtros UV em água (ng L-1) de março/2013 a agosto/2013 na ETA de Trabiju. Para BP-10 recuperações médias e coeficientes de variação (n=3). 101 Tabela 27 - Parâmetros de regressão da curva de calibração (y=ax+b) gerada para cada peso (W) e as respectivas somas dos erros relativos ( %∑ER ) para o ES. 121 Tabela 28 - Parâmetros de regressão da curva de calibração (y=ax+b) gerada para cada peso (W) e as respectivas somas dos erros relativos ( %∑ER ) para o BP-3. 122 Tabela 29 - Parâmetros de regressão da curva de calibração (y=ax+b) gerada para cada peso (W) e as respectivas somas dos erros relativos ( %∑ER ) para o EHMC. 122 Tabela 30 - Parâmetros de regressão da curva de calibração (y=ax+b) gerada para cada peso (W) e as respectivas somas dos erros relativos ( %∑ER ) para o OC. 123 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ABIHPEC – Associação Brasileira da Indústria de Higiene Pessoal, Perfumaria e Cosméticos AcOEt – acetato de etila ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária BAµE-LD – microextração por barra adsortiva com dessorção líquida BC – benzil cinamato BP-3 – benzofenona-3 BP-d10 – benzofenona-d10 CETESB – Companhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental CID – dissociação induzida por colisão CV – coeficiente de variação DAAE – Departamento autônomo de água e esgoto DAE – Departamento de água e esgoto DCM – diclorometano DLLME – microextração líquido-líquido dispersiva DP – desvio padrão DPR – desvio padrão relativo EHMC – etil hexil metoxinamato ER – erro relativo ES – etil hexil salicilato ETA – Estação de tratamento de água ETE – Estação de tratamento de esgoto FPS – fatores de proteção solar GC-MS – cromatografia a gás acoplada à espectrometria de massas GC-MS/MS– cromatografia a gás acoplada à espectrometria de massas com dupla ionização hAR – receptor androgênico humano HCl – ácido clorídrico hERα – receptor estrogênico humano HPLC-UV-DAD – cromatografia líquida de alta eficiência com detector espectrofotométrico de absorção no ultravioleta/visível com arranjo de fotodiodos IV – infravermelho IBGE – Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística IE – interferente endócrino LC(ESI)MS/MS – cromatografia líquida acoplada a espectrometria em tandem com ionização por electrospray LC(APPI)MS/MS – cromatografia líquida acoplada a espectrometria em tandem com fotoionização à pressão atmosférica LC-MS/MS – cromatografia à líquido acoplada a espectrometria de massas em tandem LLE – extração líquido-líquido LOD – limite de detecção LOQ – limite de quantificação LPME – microextração em fase líquida m/z – massa carga MALLE – extração líquido-líquido assistida por membrana MeOH – metanol MEPS – microextração por sorbente empacotado MRM – monitoramento de reações múltiplas MSPD – dispersão da matriz em fase sólida NaOH – hidróxido de sódio OC – octocrileno PCPs – produtos de cuidados pessoais PFC – planejamento fatorial completo PFF – planejamento fatorial fracionário PLE – extração líquido pressurizada QuEChERS – rápido, fácil, barato, eficaz, robusto e seguro do inglês (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, and Safe) SAEMJA – Serviço de Água e Esgoto do Município de Jaú SBSE – extração sortiva em barra magnética SIM – monitoramento de íon seletivo SPE – extração em fase sólida SPLE – extração seletiva líquido pressurizada SPMD – dispositivo de membrana semipermeável SPME – microextração em fase sólida TC-IL-DLPME – microextração em fase líquido dispersiva com líquido iônico com temperatura controlada TD-GC-MS – cromatografia a gás acoplada a espectrometria de massas com dessorção térmica TIC – cromatograma de íons total TiO2 – dióxido de titânio UA-DLLME – microextração líquido-líquido dispersiva assistida por ultrassom UGRHI – Unidades de Gerenciamento de Recursos Hídricos UHPLC–(ESI)MS/MS – cromatografia á líquido de ultra performance acoplada a espectrometria em tandem com ionização por electrospray UV – ultravioleta UVA – ultravioleta A UVA – ultravioleta B UVA – ultravioleta C Vis – visível ZnO – óxido de zinco SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO 22 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 24 2.1 Radiação solar 24 2.2 Filtros UV 25 2.3 Aporte dos Filtros UV ao ambiente 28 2.4 Interferentes endócrinos 33 2.5 Métodos analíticos para determinação dos filtros UV 35 2.5.1 Técnicas para extração dos filtros UV de matrizes aquosas 36 2.5.1.1 Extração em Fase Sólida 36 2.5.1.2 Otimização do procedimento de SPE 37 2.5.2 Técnicas de análise dos Filtros UV em água 39 2.5.2.1 Cromatografia em fase Gasosa acoplada a Espectrometria de Massas (GC MS/MS) 40 2.6 Validação do método SPE e GC-MS/MS 41 2.6.1 Seletividade 41 2.6.2 Curva analítica 42 2.6.3 Precisão e exatidão 47 2.6.4 Limite de detecção (LOD) e limite de quantificação (LOQ) 47 2.7 Amostragem 48 2.7.1 Seleção da área a ser inserida no estudo ambiental 50 3 OBJETIVOS: 54 4 PARTE EXPERIMENTAL 55 4.1 Reagentes e soluções padrão 55 4.2 Instrumentação e condições cromatográficas (otimizadas) 56 4.3 Procedimento de extração em fase sólida (SPE) (otimizado) 56 4.4 Planejamento experimental e ferramentas estatísticas 57 4.5 Procedimento de Validação 57 4.6 Amostragem 58 4.6.1 Localização dos pontos amostrais 58 4.6.1.1 Araraquara 59 4.6.1.2 Bueno de Andrada 62 4.6.1.3 Bauru 63 4.6.1.4 Jaú 65 4.6.1.5 São Carlos 66 4.6.1.6 Trabiju 67 4.7 Lista de materiais utilizados 69 4.7.1 Reagentes e solventes 69 4.7.2 Materiais e equipamentos 69 5 RESULTADOS E DISCUSSÕES 70 5.1 Limpeza da vidraria 70 5.2 Condições cromatográficas 70 5.3 Procedimento de extração 74 5.4 Validação 87 5.4.1 Seletividade 87 5.4.2 Curva analítica 89 5.4.3 Exatidão e precisão 93 5.4.4 Limite de Detecção (LOD) e Limite de Quantificação (LOQ) 94 5.5 Ocorrência e concentrações dos filtros UV na Bacia Hidrográfica Tietê-Jacaré 97 6 CONCLUSÕES 105 DESTINAÇÃO DOS RESÍDUOS QUÍMICOS GERADOS 107 TRABALHOS FUTUROS 108 REFERÊNCIAS 109 22 1 INTRODUÇÃO Substâncias orgânicas capazes de absorver radiação UV são utilizadas em protetores solares e, cada vez mais, têm sido empregadas na formulação de produtos de higiene pessoal, isso em virtude da crescente preocupação com os danos causados pela radiação solar, em especial os cânceres de pele (CHISVERT e SALVADOR, 2007). Tais substâncias acabam por aportar em ambientes aquáticos por meio de atividades recreacionais ou lançamento de esgoto doméstico (GIOKAS, SALVADOR e CHISVERT, 2007). Estudos realizados em diversos países apontaram a presença de substâncias em águas superficiais, sedimentos e peixes entre outras matrizes. A preocupação quanto à presença deste tipo de substância no ambiente e à exposição de organismos aquáticos reside na potencialidade de bioacumulação e capacidade de atuarem como interferentes endócrinos (DÍAZ- CRUZ e BARCELO, 2009). Apesar dessas evidências, existem poucos estudos sobre a ocorrência e destino deste tipo de substância no ambiente e nenhum se refere ao Brasil. A determinação fidedigna de microcontaminantes orgânicos em matrizes ambientais requer procedimentos de otimização e validação analítica rigorosos e criteriosos, que frequentemente tem sido negligenciada pelos pesquisadores. Esse trabalho apresenta dois enfoques um analítico e um ambiental. No primeiro, inicialmente foi realizada a otimização do método de extração/pré- concentração utilizando (SPE, com fase polimérica), essa otimização foi efetuada empregando-se estatística multivariada. Posteriormente, iniciou-se a validação do método (incluindo SPE e determinação por GC-MS/MS). Na validação os parâmetros avaliados foram seletividade, curva analítica, precisão, exatidão, limite de detecção e limite de quantificação, com destaque à obtenção da curva analítica, onde se mostrou necessário o uso de curvas analíticas ponderadas, isso para garantir a confiabilidade das quantificações e a possibilidade de trabalhar em um maior intervalo de concentrações. No segundo enfoque, o ambiental, avaliou-se a presença dos filtros UV (presentes com maior frequência em protetores solares comercializados em Araraquara) em matrizes ambientais. As matrizes estudadas foram água bruta 23 (rio ou subterrânea), tratada (sem cloração/fluoretação) e potável (com cloração/fluoretação), sendo incluídos neste estudo cinco municípios e um distrito da UGRHI-13, em uma base temporal de 6 a 12 meses, com periodicidade mensal. 24 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1 Radiação solar A radiação eletromagnética originária do Sol que atinge a Terra tem seus comprimentos de onda compreendidos entre 290 e 2000 nm, onde estão inclusas as radiações, infravermelha (IV), visível (Vis) e parte da ultravioleta (UV). A energia que cada uma dessas radiações possui é inversamente proporcional ao comprimento de onda. Delas, a radiação ultravioleta é a que apresenta os menores comprimentos de onda e dessa forma são as mais energéticas. Elas também são as mais propensas a induzir reações fotoquímicas (FLOR e DAVOLOS, 2007). A radiação ultravioleta é subdividida em faixas de energia distintas as quais são classificadas como UVA, UVB e UVC. A UVC é a de menor comprimento de onda, e então a mais intensa e que podem ocasionar sérios danos. Entretanto, essa radiação quase não atinge a superfície da Terra, pois é filtrada pela camada de ozônio. Também, parte da radiação UVB não incide sobre a terra, pois a camada de ozônio absorve comprimentos de onda mais curtos que ~310 nm (UVC e parte da UVB), de modo que a radiação UV que significativamente atinge a Terra é a UVA e parte da UVB (KANAVY e GERSTENBLITH, 2011). As quais podem ocasionar sérios danos a pele humana. Durante muito tempo, a toxidade da radiação UVB atraiu maior atenção que da UVA devido aos seus maiores danos. Contudo, as radiações UVA e UVB são clinicamente significativas, pois ambas tem sido associadas ao aumento de doenças de pele (KOSHY et al., 2010). A exposição crônica a estes dois tipos de radiação pode induzir danos à pele humana, tais como: queimaduras, eritemas, fotoenvelhecimento bem como o câncer (De ORSI et al., 2006). Convém esclarecer aqui que mesmo diante desses graves efeitos adversos que a radiação UV pode causar é importante considerar que a exposição à radiação solar, em pequenas quantidades, tem efeito terapêutico em diferentes patologias, uma vez que é imprescindível para a produção de vitamina D pelo corpo humano. Isso por sua vez aumenta a absorção de cálcio, 25 prevenindo dessa forma osteoporose e raquitismo, também tem efeitos benéficos em artrites, regulação da pressão arterial, diabetes, força muscular, e ainda melhora o humor (CHISVERT e SALVADOR, 2007). Destaca-se, ainda, que devido aos danos causados a camada de ozônio, a radiação UV que chega a Terra tem aumentado nos últimas décadas, o que poderia explicar o aumento da incidência de tumores de pele (CHISVERT e SALVADOR, 2007). Então, em resposta aos efeitos adversos da radiação UV, esforços têm sido realizados na tentativa de evitar ou minimizá-los. Dentre esses esforços, tem se destacado a obtenção de compostos que apresentem características de fotoproteção, os chamados filtros ultravioletas (filtros UV). 2.2 Filtros UV Filtros UV são substâncias incolores ou amarelas com absorção quase nula de radiação visível, mas significativa absorção da luz nas faixas UVA e UVB (DÍAZ-CRUZ e BARCELO, 2009). Uma característica comum a todos eles é a presença de um anel aromático com uma cadeia lateral mostrando diferentes graus de insaturação (DÍAZ-CRUZ e BARCELO, 2009). A maioria deles é de compostos lipofílicos (baixa solubilidade em água) (RICHARDSON, 2009). No entanto, a presença de grupos fenólicos em suas estruturas pode fornecer a eles certa mobilidade no ambiente aquático (NEGREIRA et al., 2009a). A Tabela 1 mostra as estruturas e algumas propriedades físico- químicas importantes dos filtros UV abordados nesse trabalho. Os filtros UV são tradicionalmente classificados como inorgânicos (ou físicos) e orgânicos (ou químicos). Os filtros inorgânicos (dióxido de titânio (TiO2), óxido de zinco (ZnO), por exemplo) atuam basicamente pela reflexão, espalhamento e absorção da luz UV (não serão abordados nesse trabalho), enquanto os filtros orgânicos (benzofenona (BP-3), octocrileno (OC), por exemplo) agem principalmente por absorção da luz UV (CUDERMAN e HEATH, 2007). A proteção se dá pela absorção do fóton, pela molécula do filtro, que rapidamente retornam ao estado fundamental por relaxamento vibracional, e então novamente ativa, absorvem adicionais fótons e repete-se o processo, protegendo assim dos danos causados pela radiação UV (FELIX, HALL e BRODBELT, 1998). 26 Tabela 1 – Substância, abreviação, Nº de registro CAS, estrutura química, massa molar, valores de log Kow e ponto de ebulição para os filtros UV incluídos neste trabalho. Substância (abreviação) Nº CAS Estrutura química Massa molar (g/mol) logKow pKa Solubilidade em água (mg/L) Ponto de ebulição (oC) Pressão de vapor (Torr) Benzofenona-3 (BP-3), 131577 O OHO CH3 228,24 3,79a 7,56 a 68,6c 150-160b 5,26x10-6 Etilhexil metoxicinamato (EHMC), 5466773 O O O CH3 CH3 CH3H H 290,40 5,80a --- 0,156c 198-200b 8,89x10-7 Etilhexil salicilato (ES),118605 250,33 5,97a 8,13 a 0,028 189-190* 8,07x10-5 Octocrileno (OC), 6197304 O O N CH3 CH3 361,49 6,88 a --- 0.004c 218** 2,56x10-9 Benzil cinamato (BC)103413 O O 238,28 4,06d ---. 0,0093d 195-200*** 1,05x10-5 Benzofenona-d10 (BP-d10), 22583751 O D D D D D D D DD D 192,28 3,18e --- n.e. 305b n.e. * 21mmHg (litoral) (SIGMA ALDRICH, 2014a) **1,5 mmHg (litoral) (SIGMA ALDRICH, 2014b) *** 5mmHg (litoral) (SIGMA ALDRICH, 2014c) a (RODIL; SCHRADER e MOEDER, 2009) b (ZENKER; SCHMUTZ e FENT, 2008) c (MOEDER et al., 2010) d (BHATIA et al., 2007) e (SIGMA ALDRICH, 2014d) n.e. = não encontrado. Fonte: Elaborado pelo autor, 2014. O O OH CH3 CH3 27 Os filtros UV têm diversas aplicações: em têxteis, produtos para o lar, tecidos, plásticos, produtos ópticos, produtos agrícolas (FENT, KUNZAC e GOMEZD, 2008), sendo a sua principal aplicação em produtos de cuidados pessoais (PCPs). Nesses, eles tem a função de proteger pele, lábios e cabelos dos danos que a radiação UV em excesso pode causar. Alguns desses filtros protegem da radiação UVB, outros oferecem proteção contra comprimentos de onda na faixa UVA e poucos outros cobrem as duas faixas. Deste modo, para garantir maiores fatores de proteção solar (FPS), além da maior concentração de cada um deles, geralmente, são usados mais que um filtro UV nas formulações dos PCPs (FENT, ZENKER e RAPP, 2010). Em virtude disso, maior atenção tem sido dada ao teor máximo dessas substâncias em protetores solares e cosméticos. Os filtros UV são regulamentados para PCPs em muitos países (De ORSI et al., 2006), inclusive no Brasil. Mas, nos diversos países em que há regulamentação, existem diferenças quanto a suas classificações (drogas de balcão, cosméticos etc), quanto as concentrações máximas permitidas, bem como o número de substâncias legisladas. A Tabela 2 mostra a concentração máxima permitida para os quatro filtros UV foco desse estudo, no Brasil e em outras partes do mundo (DÍAZ-CRUZ e BARCELO, 2009; AGENCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA, 2006) Tabela 2 – Concentração máxima permitida, em produtos de cuidado pessoal, para BP-3, ES, EHMC e OC no Brasil, União Europeia, Estados Unidos e Japão. Substância Nome INCI** Abreviação Concentração máxima permitida Brasil UE USA Japão 2-Hidroxi-4- metoxibenzofenona (Oxibenzona)* Benzofenona-3 BP-3 10% 0% 6% 5% Salicilato de 2- etilhexila Octil (ou Etilhexil) salicilato ES 5% 5% 5% 10% 4 – Metoxicinamato de 2 - etilhexila Octil (ou Etilhexil) metoxicinamato EHMC 10% 10% 7,5% 20% 2-Ciano-3,3 difenilacrilato de 2- etilexila Octocrileno OC 10% 10% 10% 10% *Para concentrações maiores que 0,5% incluir advertência na rotulagem: contém oxibenzona; ** Nomenclatura internacional para ingredientes cosméticos (do inglês International Nomenclature for Cosmetic Ingredient). Fonte: Adaptado de: (AGENCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA, 2006; CHISVERT e SALVADOR, 2007). Com relação ao número de filtros UV legislados: na União Europeia (UE) somam um total de 28, 16 nos EUA, 21 no Canadá e 26 na Austrália (TUCHINDA et 28 al., 2006), enquanto no Brasil são legislados 38 filtros UV. A regulamentação brasileira para essas 38 substâncias é feita pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), que descreve os filtros UV como substâncias adicionadas (dentro de limites e condições determinadas) aos produtos para proteção solar, cosméticos ou perfumes com a finalidade de filtrar os raios ultravioleta, visando proteger a pele de efeitos danosos causados pela radiação UVA e UVB. A ANVISA também indica que os filtros UV utilizados em PCPs somente com a finalidade de preservá-los da degradação fotoquímica, não segue a mesma determinação ANVISA (AGENCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA, 2006). Para esses casos, normalmente concentrações máximas vão de 0,05 a 2%, embora essa quantidade não seja estipulada por lei (ZENKER, SCHMUTZ e FENT, 2008). Convém lembrar aqui, que essa regulamentação da ANVISA quanto à concentração máxima permitida, dos filtros UV, refere-se aos produtos de cuidados pessoais. Com relação ao ambiente, não há nenhuma normativa regulamentadora no Brasil e no mundo até o momento. Essa ausência tem sido motivo de preocupação em anos recentes, pois, o fato dos filtros UV terem, durante muito tempo, sido notados apenas pela sua eficácia em atenuar os efeitos danosos da radiação solar, em especial o câncer de pele, fez com que esses compostos passassem a ser adicionados não apenas em produtos de proteção solar, mas também, passaram a fazer parte das formulações de muitos produtos de uso diário, tais como cosméticos, cremes para a pele, loções para o corpo, sprays e tinturas de cabelo, xampu dentre muitos outros. Os quais, de forma direta e/ou indireta terão como destino o ambiente (CHISVERT e SALVADOR, 2007). 2.3 Aporte dos Filtros UV ao ambiente Com a diversidade de aplicações dos filtros UV e com sua incorporação cada vez mais frequente dos PCPs de uso diário, tem se tornado muito expressiva as quantidades desses compostos lançadas diariamente no ambiente. Seja por meio das descargas de águas residuais de seu processo de obtenção, do descarte de embalagens e/ou principalmente a partir de seus vários usos, destacando-se o uso em PCPs. Quando usados em PCPs, os filtros UV podem atingir o ambiente aquático de maneira direta, pela remoção da pele nas atividades recreacionais ou de forma 29 indireta por meio da remoção de roupas, toalhas de banhos, das frações absorvidas e excretadas, os quais seguem para a rede coletora de efluentes domésticos, então para estação de tratamento, e a depender dos processos de tratamento empregado podem chegar ao ambiente. A Figura 1 mostra, de forma esquemática, as principais vias de aporte dos filtros UV ao ambiente (GIOKAS, SALVADOR e CHISVERT, 2007). Em termos de Brasil, o aporte dessas substâncias ao ambiente é provavelmente muito grande. Pois, levando em conta que o Brasil é um país tropical, com alta incidência de irradiação solar, que consequentemente apresenta um alto consumo de produtos com filtros UV. Segundo a Associação Brasileira da Indústria de Higiene Pessoal, Perfumaria e Cosméticos (ABIHPEC) o Brasil é o terceiro maior consumidor de cosméticos do mundo, ficando atrás apenas dos Estados Unidos e Japão (ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DA INDÚSTRIA DE HIGIENE..., 2012). Tudo isso vem a se somar com os baixíssimos índices de tratamento de esgoto. Como a questão de tratamento de esgoto no Brasil é incipiente, o lançamento de efluentes in natura ou mesmo processados parecem ser a principal via de aporte e contaminação do ambiente aquático por filtros UV. A velocidade com que isso acontece, é mais um agravante importantíssimo. Pois, mesmo que os filtros UV não apresentem tempos de meia-vida longos, o seu constante lançamento no ambiente, pode lhes conferir caráter pseudo-persistente. Isso porque essas substâncias são introduzidas no ambiente em uma frequência, muitas vezes maior que aquela necessária para sua remoção ambiental. Sendo assim, seu monitoramento ambiental tem despertado bastante interesse nos últimos anos. A Tabela 3 apresenta uma coletânea das concentrações médias ou faixas de concentração de alguns filtros UV detectados em diversas matrizes ambientais, usando variados métodos de extração. 30 Figura 1 – Vias de aporte dos filtros UV em água. Fonte: Adaptado de: (GIOKAS, SALVADOR e CHISVERT, 2007). Aporte dos filtros UV ao ambiente Resíduos de fabricação e lavagem Produção de filtros UV Utilização Resíduos em embalagens Lavados de roupas e toalhas Descarga de águas industriais Produtos de cuidados pessoais (PCPs) Aplicação na pele Deposição em aterros Rede de esgoto Penetração na pele Excreta Lavados em atividades balneárias ETE Fração em lodo / fração solúvel Água residual não tratada Degradação/sorção Percolação Esgoto transbordado Outras aplicações: têxteis, produtos para o lar, produtos ópticos, produtos agrícolas plásticos etc. 31 Tabela 3 - Sumário das matrizes, métodos de extração e análise e das concentrações médias ou faixas de concentrações dos filtros UV no ambiente. Compostos Analisados Matriz Concentrações encontradas Método de extração e análise País/ano Referência BP-3 e metabólitos Água e urina humana 200 – 260 µg L-1 SPME-GC-MS EUA, 1998 FELIX, 1998 Filtros UV Água de piscina e do mar 2,1 – 9,9 µg L-1 SPME-GC-MS Grécia, 2002 LAMBROPO ULOU, 2002 Filtros UV Água do mar e piscina 1,8 – 10 ng L-1 SPE LC-UV-DAD e GC-MS Grécia, 2004 GIOKAS, 2004 Filtros UV Água superficial 5- 266 ng L-1 SPE GC–MS-SIM Suíça, 2004 POIGER, 2004 Filtros UV Água, águas residuais e peixe 0,01 – 119 µg L-1 SPE, SPMDs Suíça, 2005 BALMER, 2005 Filtros UV Águas de banho --- GC–MS e LC-UV DAD Grécia, 2005 GIOKAS, 2005 BP-3 e metabólitos Água e solo 47 – 85 ng L-1 27 – 18380 ng kg-1 LLE GC-MS Coreia do Sul JEON, 2006 Filtros UV Águas 15 - 400 ng L-1 SPE GC-MS Eslovênia, 2007 CUDERMAN , 2007 Filtros UV Esgoto 34- 2128 ng L-1 SPE GC-MS China, 2007 LI, 2007 Filtros UV Água de rio, lado e esgoto 2-250 ng L-1 SBSE TD-GC-MS Espanha, 2008 RODIL, 2008 Filtros UV Água e tecido adiposo de peixe 4 -1344 ng g-1 LC(ESI)MS/MS GC-MS/MS Suíça, 2008 ZENKER, 2008 Benzofenonas Água de rio 68,9-85 ng L-1 LPME GC-MS Japão, 2008 OKANOUCH I, 2008 Filtros UV Água 20-2679 ng L-1 SPE LC-ESI-MS/MS Espanha, 2008 RODIL, 2008 Filtros UV Esgoto e rio 13 – 462 ng L-1 SPME-GC- MS/MS Espanha, 2009 NEGREIRA, 2009a Produtos de cuidados pessoais Água de rio e esgoto 11 – 5613 ng L-1 SPE e UHPLC– (ESI)MS/MS Espanha, 2009 PEDROUZO, 2009 Filtros UV Água logo e esgoto 3 – 5322 ng L-1 MALLE LC(APPI)- MS/MS Espanha, 2009 RODIL, 2009 PCPs Peixe 17-970 ng g-1 GC (SIM) MS e GC-MS/MS EUA, 2009 MOTTALEB, 2009 Filtros UV Poeira de apartamentos e veículos 35-41000 ng g-1 MSPD GC-MS/MS Espanha, 2009 NEGREIRA 2009b PCPs Água superficial e residual 11-286 ng L-1 SPE UHPLC(ESI) MS/MS Espanha, 2009 PEDROUZO, 2009 Filtros UV e fragrâncias sintéticas Água de rio 8 – 520 ng L-1 SPME-GC-MS China, 2010 LIU, 2010 Filtros UV e fragrâncias sintéticas Lago e esgoto 10 – 3052 ng L-1 MEPS-GC–MS Alemanha, 2010 MOEDER, 2010 BP-3 e metabólitos Água do mar 280 – 3300 ng L−1 DLLME-GC-MS Espanha, 2010 TARAZONA, 2010 32 Tabela 3 - Continuação Compostos Analisados Matriz Concentrações encontradas Método de extração e análise País/ano Referência Produtos de cuidados pessoais Água de torneira --- SPME-GC-MS Itália, 2011 BASAGLIA, 2011 Filtros UV Água de rio, lado e esgoto e sedimento 1 – 4928 ng L-1 e 2,0 - 3422 mg kg-1 SPE e GC-MS Japão, 2011 KAMEDA, 2011 Filtros UV Água de rio e esgoto --- SPE e GC-MS/MS Taiwan, 2011 HO, 2011 Filtros UV Água de rio e esgoto 32,7 – 2206 ng L-1 SPE e GC-MS/MS Australia, 2011 LIU, 2011 Filtros UV Esgoto --- SPE e HPLC-DAD Irã, 2011 VOSOUGH, 2011 Benzofenonas Água de lago --- DLLME HPLC China, 2011 ZHANG, 2011 Benzofenonas e salicilatos Solo e sedimento 0,6 – 20 ng g−1 GC–MS Espanha, 2011 SÁNCHEZ- BRUNETE, 2011 Filtros UV Água do mar 55 – 216 ng L−1 SBSE LC-MS/MS Itália, 2011 NGUYEN, 2011 Filtros UV Lodo de esgoto 0,04 to 9,17 ng g-1 PLE UPLC–ESI(+)- MS/MS Espanha, 2011 GAGO- FERRERO, 2011 Filtros UV Lodo 93 - 3263 ng g_1 PLE GC–MS Espanha, 2011 NEGREIRA, 2011 Produtos de cuidados pessoais Esgoto 4 – 16 ng L-1 SPME-GC-MS Itália, 2012 BASAGLIA, 2012 Filtros UV Água de rio n.d. SPME-GC-MS Singapura, 2012 ZHANG, 2012 Filtros UV Água de torneira 1,5 – 295 ng L-1 SPE e GC-MS Espanha, 2012 DÍAZ-CRUZ, 2012 Filtros UV Água de rio, mar e esgoto 3 – 551 ng L-1 SBSE e HPLC– APCI–MS/MS Itália, 2012 MAGI, 2012 Filtros UV Água do mar 91 – 880 ng L-1 DLLME e GC-MS Espanha, 2014 BENEDÉ, 2014 Benzofenonas Água do mar e esgoto 2,2 – 2,5 µg L-1 BA µE- LD/HPLC-DAD Portugal, 2013 ALMEIDA, 2013 Filtros UV e retardantes de chama Sedimento 0,08 – 143 ng g-1 SPLE e GC-MS e/ou LC-MS/MS Chile e Colômbia, 2013 BARÓN, 2013 Filtros UV Peixe 11,2 – 241,7 ng g-1 PLE/SPE e LC– MS/MS Espanha, 2013 GAGO- FERRERO, 2013 Filtros UV Água de rio, subterrânea e esgoto 4,3 – 1548 ng L-1 On-line SPE LC–MS/MS Espanha, 2013 GAGO- FERRERO, 2013 Filtros UV Água de rio e esgoto 6,1 – 21,4 ng L-1 UA-DLLME e GC–MS Taiwan, 2013 WU, 2013 Filtros UV Água de piscina e de torneira nd TC-IL-DLPME HPLC Singapura, 2013 ZHANG,2013 Filtros UV e fragrâncias mexilhões marinhos 78 - 3992 ng g-1 QuEChERS e GC–MS/MS Portugal, 2014 GROZ, 2014 33 Tabela 3 - Continuação Compostos Analisados Matriz Concentrações encontradas Método de extração e análise País/ano Referência Filtros UV Água subterrânea 3,2 – 36,6 ng L-1 on-line- SPE- LC-MS/MS Espanha, 2014 JURADO, 2014 Fonte: Elaborado pelo autor, 2014. A presença de filtros UV no ambiente, conforme referenciado na Tabela 3, tem gerado apreensão da comunidade científica. Essa preocupação reside na potencialidade de bioacumulação e principalmente na capacidade de atuarem como interferentes endócrinos (DÍAZ-CRUZ; BARCELO 2009). 2.4 Interferentes endócrinos O termo interferente endócrino (IE) tem várias definições. Mas, de modo mais simplificado, IE são substâncias químicas naturais ou sintéticas que podem interferir no funcionamento normal do sistema endócrino (GHISELLI e JARDIM, 2007). IEs podem causar distúrbios na síntese, secreção, transporte, ligação, ação ou eliminação de hormônios endógenos e, assim como o metabolismo, alteram também a diferenciação sexual e a função reprodutiva (BILA e DEZOTTI, 2007). Em um hormônio natural, a ação se inicia quando ele liga-se ao receptor hormonal específico no interior da célula (Figura 2a). Entretanto, certas substâncias químicas (os interferentes endócrinos) também podem se ligar ao receptor hormonal e, consequentemente, interferir a ação do hormônio natural. O interferente endócrino interage com os receptores hormonais, modificando a sua resposta de duas maneiras distintas (Figuras 2b e 2c): Primeira, o IE pode se ligar ao receptor hormonal e produzir uma resposta, atuando então como um mimetizador, ou seja, imitando a ação de um determinado hormônio (processo denominado de efeito agonista) (Figura 2b). Na segunda maneira, o IE se liga ao receptor, mas nenhuma resposta é produzida, agindo como um bloqueador, ou seja, estará impedindo a interação entre um hormônio natural e seu respectivo receptor, (processo denominado de efeito antagonista) (Figura 2c) (GHISELLI e JARDIM, 2007). 34 Figura 2 – Processos de alteração endócrina: (a) Resposta natural, (b) Efeito agonista, (c) Efeito antagonista. Fonte: Adaptado de: (GHISELLI e JARDIM, 2007). Uma substância já bem caracterizada como estrogênica é o 17-beta-estradiol (o mais comum dos estrógenos naturais) e tem sido relatado, por literatura especializada, que a atividade estrogênica de alguns filtros UV orgânicos está na mesma faixa desse estrógeno. (GIOKAS, SALVADOR e CHISVERT, 2007; PEDROUZO et al., 2011). Além da atividade estrogênica, em trabalho de Kunz e Fent, 2006 é estudada a atividade antiestrogênica, androgênica e a antiandrogênica (múltipla atividade hormonal) de 18 filtros UV e 1 metabólito (Tabela 4). Nesse estudo, todos os compostos estudados apresentaram múltipla atividade hormonal in vitro, sendo que onze deles apresentaram três das quatro atividades hormonais. Ainda, desses 19 compostos estudados, 10 atuaram como mimetizadores e 14 como inibidores da interação do hormônio natural e o receptor estrogênico humano (hERα). Já, com relação a interação do hormônio natural e o receptor androgênico humano (hAR) 6 atuaram como mimetizadores e 17 como inibidores (KUNZ e FENT, 2006). Essa múltipla atividade hormonal mostrada na Tabela 4 pode levar a graves alterações no ecossistema e, especialmente, no desenvolvimento normal do eixo endócrino dos seres vivos. Preocupações a esse respeito tem aumentado consideravelmente o interesse na melhor compreensão da ocorrência e destino dessas substâncias no ambiente (FENT, ZENKER e RAPP, 2010). O monitoramento dessas substâncias nos compartimentos ambientais é realizado fazendo uso de técnicas analíticas sensíveis. 35 Tabela 4 – Avaliação semi-quantitativa das atividades agonistas e antagonistas dos compostos em ensaios com (hER) e hAR. Composto Atividade estrogênica Atividade antiestrogênica Atividade androgênica Atividade antiandrogênica 4-metilbenzilideno cânfora -- +++ -- +++ 3-Benzilideno cânfora + +++ -- +++ Benzofenona-1 +++ -- -- +++ Benzofenona-2 +++ -- +++ +++ 4-hidroxi benzofenona +++ -- -- +++ 4,4-dihidroxi benzofenona +++ -- -- +++ Benzofenona-3 + +++ -- +++ Benzofenona-4 + +++ -- +++ 4-Metoxicinamato de isopentila -- +++ ++ +++ Etil hexil metoxinamato -- +++ ++ +++ octocrileno -- +++ + +++ Benzil salicilato + +++ -- +++ Fenil salicilato ++ +++ -- +++ Homosalato -- +++ +++ +++ Etil hexil salicilato -- +++ ++ +++ Ácido 4-aminobenzóico -- +++ -- -- 4-aminobenzoato de etila +++ -- -- ++ 4-Dimetil-aminobenzoato de 2-etilhexila -- +++ -- +++ N-Etoxi-4-aminobenzoato de etila -- + -- -- Abreviaturas: Os sinais indicam a eficácia de cada composto em diferentes ensaios: +++, máximas curvas de dose-resposta, com eficácia ≥ a 80%; ++, submáxima curvas de dose-resposta com eficácia ≥ a 30%; + e submáximas curvas dose-resposta com eficácia < que 30%; -- não detectado. Fonte: KUNZ e FENT, 2006. 2.5 Métodos analíticos para determinação dos filtros UV Quando se trabalha com matrizes ambientais, geralmente, os métodos analíticos utilizados para detecção e quantificação de filtros UV são restritos à técnicas cromatográficas. Entretanto, antes que as amostras sejam introduzidas no sistema cromatográfico algum procedimento de pré-tratamento (extração, clean-up, e concentração dos analitos de interesse) deve ser utilizado para melhorar a determinação dos compostos de interesse. O pré-tratamento tem a finalidade de melhorar a detectabilidade do instrumento analítico. Visto que, nos grandes volumes de amostras ambientais é esperado que os analitos alvo estejam em pequenas quantidades, enquanto é esperado uma grande quantidade e variedade de interferentes. Em virtude disso, diferentes técnicas de extração têm sido utilizadas com intuito de encontrar aquela mais adequada para análise de cada tipo de amostra e analito. 36 2.5.1 Técnicas para extração dos filtros UV de matrizes aquosas Métodos tradicionais de preparo da amostra, tal como a extração líquido-líquido (LLE), ainda são utilizadas (JEON, CHUNG e RYU, 2006). Entretanto, uma tendência em técnicas de extração é diminuir o consumo de solventes orgânicos, dessa forma, a LLE tem sido cada vez menos utilizada (CALDAS et al., 2011). A técnica de extração em fase sólida (SPE) se destaca por consumir menos tempo, menos solventes e vem sendo desenvolvida e/ou aperfeiçoada na efetiva aplicação para extração de filtros UV em amostras aquosas (PEDROUZO et al., 2011). Por outro lado, técnicas miniaturizadas vêm ganhando espaço recentemente, por exemplo, a microextração em fase sólida (SPME) (LIU et al., 2010), a extração sortiva em barra magnética (SBSE) (RODIL e MOEDER, 2008) e a microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME) (TARAZONA et al., 2010) têm sido utilizadas para determinar filtros UV. Entretanto, a variedade de polaridades dos materiais comerciais, para algumas dessas técnicas, é limitada (PEDROUZO et al., 2011). Dessa forma, a SPE com sua variedade de sorbentes é ainda, a técnica de extração preferida por muitos autores para a extração e pré-concentração dos filtros UV em amostras aquosas (CUDERMAN e HEATH, 2007; RODIL et al. 2008; PEDROUZO et al., 2009). 2.5.1.1 Extração em Fase Sólida A técnica de SPE (esquematizado na Figura 3) foi o procedimento selecionado para ser utilizado na etapa de extração e pré-concentração dos analitos de interesse das amostras estudadas. SPE consiste basicamente na seguinte sequência de etapas: (1) Pré-condicionamento – recomendado para eliminação de possíveis impurezas oriundas de seu processo de fabricação. Essa etapa de limpeza geralmente e realizada com o solvente que será utilizado na eluição. (2) Condicionamento – tem a finalidade de ativar o material da sorbente, tornando-o mais predisposto para extração. Nesse processo, para sorbentes apolares de SPE são utilizados solventes orgânicos, por exemplo, metanol. (3) Aplicação da amostra – a transferência das amostras para o cartucho de SPE deve ser feita de forma quantitativa. A amostra deve ser percolada através do cartucho usando um sistema manifold para SPE, de maneira não muito rápida, de modo que haja tempo para interação do analito com a fase estacionária. (4) Lavagem – realizada com o intuito 37 de remover possíveis contaminantes que tenham sido adsorvidos juntamente com os analitos, e também pode ser utilizado para secagem do sorbente. (5) Eluição – a eluição dos filtros UV adsorvidos no sorbente serão dessorvidos com auxílio do solvente de eluição. Para que a eluição seja satisfatória, é importante a correta escolha do eluente e também é necessário que a vazão seja lenta o suficiente para a quebra das interações entre o analito e a fase extratora. Figura 3 – Etapas do processo de Extração em Fase Sólida (SPE). Fonte: Adaptado de (THURMAN e MILLS, 1998). Como pode ser notado pelo parágrafo anterior e pela ilustração da Figura 3, o procedimento de extração por SPE envolve várias etapas, consequentemente suas recuperações podem ser afetadas em cada uma dessas etapas por vários fatores (variáveis), tais como: pH da amostra, capacidade do cartucho, tipo de eluente, volume do eluente, solvente de lavagem etc. Sendo assim, a extração pode não ser satisfatória se os efeitos não são conhecidos e se os fatores não são otimizados. 2.5.1.2 Otimização do procedimento de SPE Para otimizar o procedimento de SPE, ou qualquer outro processo de extração, e obter recuperações máximas, primeiramente deve-se elencar todas as variáveis necessárias para descrever o sistema, e só então procurar ajustá-las até a obtenção da maior resposta, neste caso, área ou altura dos picos cromatográficos da 38 substância de interesse (EIRAS et al., 2000) ou ainda melhor, ajustá-las até obter recuperações na faixa compreendida entre 70 e 120% (INTERNATIONAL CONFERENCE ON HARMONIZATION..., 2005). Esse ajuste, da otimização, pode ser realizado com a variação de um fator por vez (método univariado) o que é demorado e pode conduzir a conclusões equivocadas. Outro modo é realizado com a variação de todos os fatores ao mesmo tempo (método multivariado), onde os possíveis efeitos sinérgicos e antagônicos dos fatores são levados em consideração, minimizando dessa forma conclusões erradas. Para isso, pode-se fazer o uso de planejamentos experimentais, um planejamento fatorial completo (PFC) ou ainda um planejamento fatorial fracionário (PFF). A utilização de planejamentos fatoriais mostra-se favorável na otimização de procedimentos, pois, usando-os é possível poupar tempo e recursos, já que, com poucos experimentos, podem-se identificar as variáveis que são significativas para o procedimento e ainda, apontar as possíveis interações entre as variáveis. E com mais alguns outros experimentos tem-se a maximização dos valores das variáveis significantes, ou seja, a melhor configuração dos fatores envolvidos, resultando assim nas melhores recuperações dos analitos (PASSEPORT et al., 2010). Em um planejamento fatorial, dois ou mais valores (níveis) são escolhidos para representar a faixa de variação de cada fator. Então, todas as possíveis combinações desses fatores (Planejamento Fatorial Completo – PFC) ou um subconjunto dessas combinações (Planejamento Fatorial Fracionário – PFF) são realizados (SVENNBERG, BERGH e STENHOFF, 2003). O planejamento fatorial completo (nível 2) necessita de 2k (onde k é o número de fatores) ensaios para sua execução. Portanto, sua principal desvantagem é o grande número de ensaios que devem ser realizados a cada fator adicionado ao estudo. Sabendo-se que os efeitos de altas ordens, principalmente para planejamentos com k > 4, são quase sempre não significativos, a realização de ensaios para estimar tais efeitos de interação pode ser irrelevante. Desta maneira, com um menor número de experimentos em um Planejamento Fatorial Fracionário (PFF), é possível, obter informações daqueles efeitos mais importantes e retirar, na maioria das vezes, as mesmas conclusões caso fosse realizado um fatorial completo (TEÓFILO, FERREIRA, 2006). Sabendo disso, e considerando o grande número de fatores (k > 4) a ser estudado na otimização do procedimento de SPE em questão. O PFF foi escolhido 39 para triagem das variáveis que realmente seriam significativas ao procedimento SPE em estudo. Após a realização da triagem, o analista passa a conhecer a quantidade de novos experimentos que ele ira necessitar para chegar ao procedimento otimizado. 2.5.2 Técnicas de análise dos Filtros UV em água Nas determinações de filtros orgânicos UV em cosméticos, diferentes técnicas instrumentais tem sido utilizadas tais como: espectrometria NRM, espectrometria Raman, espectroscopia de absorção no UV-Vis, cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), cromatografia a gás (GC), e especialmente cromatografia a gás acoplada a espectrometria de massas (GC-MS) (JEON, CHUNG e RYU, 2006). Já em amostras ambientais, após a extração, clean-up e concentração dos analitos, os métodos analíticos utilizados são quase sempre restritos à cromatografia em fase gasosa (GC) e/ou cromatografia líquida (LC) acoplada a espectrometria de massas (MS) ou MS tandem (MS/MS) (TARAZONA et al., 2010; ZHANG et al., 2011) A matriz é um fator que deve ser bastante considerado na escolha da técnica de análise a ser utilizada. Pois, a complexidade da matriz pode complicar o procedimento de preparação de amostra, obtendo-se um extrato final com altos níveis de interferentes, o que pode levar a pobre identificação e quantificação dos analitos. Para contornar isso, na determinação dos filtros UV, geralmente faz-se detecção por espectrometria de massas no modo tandem (MS/MS), alternativa utilizada para minimizar as interferências e também o background na exatidão no processo de quantificação. O detector no modo MS/MS tem vantagens sobre o MS, pois aquele apresenta maior seletividade e detectabilidade. Diminuindo dessa forma os valores obtidos para os limites de detecção e quantificação dos analitos (VERENITCH, LOWE e MAZUMDER, 2006). Devido à complexidade da matriz, a detecção por MS/MS é geralmente preferida, e a decisão em usar GC ou LC é principalmente baseada nas propriedades físico-químicas dos analitos (Figura 4). Por exemplo, analitos mais apolares e voláteis, tais como os filtros UV em estudo (BP-3, EHMC, ES e OC), são mais facilmente determinados utilizando GC-MS ou GC-MS/MS. Mas, alguns outros analitos mais polares e não voláteis são derivados antes da análise por GC, ou 40 ainda, para evitar a etapa adicional de derivação é preferível usar LC na determinação desses analitos. Figura 4 – Fluxograma das etapas geralmente utilizadas na analise de filtros UV em amostras de águas naturais. Fonte: Elaborado pelo autor, 2014. 2.5.2.1 Cromatografia em fase Gasosa acoplada a Espectrometria de Massas (GC MS/MS) Quando se trabalha com matrizes complexas, como matrizes ambientais por exemplo, onde os níveis de interferência são muito altos, a abordagem MS/MS é, sem dúvida mais vantajosa. O fato do método MS/MS poder selecionar e isolar um íon precursor, de determinado analito, em detrimento de todos os demais íons gerados pela matriz; e depois deixá-lo passar por uma segunda fragmentação não só reduz significativamente a interferência de fundo, como também aumenta a detectabilidade, e ainda melhora a confiança da identificação (VERENITCH, LOWE e MAZUMDER, 2006). Portanto, no modo tandem, uma vez bem otimizados os parâmetros, a determinação é menos sujeita a interferências, visto que para cada Amostragem Extração, clean up e pré-concentração GC-MS Derivação LC-MS GC-MS analitos: lipofílicos e voláteis analitos: polares e não voláteis Analise de filtros UV em águas naturais 41 pico obtido no cromatograma existe um respectivo espectro de massas que pode ser usado como uma espécie de identidade do composto. Depois de otimizado todo o processo cromatográfico e de extração é necessário demonstrar que a metodologia proposta atende as exigências das aplicações analíticas, assegurando a confiabilidade dos resultados (BERNARDES, SOUZA, 2011). 2.6 Validação do método SPE e GC-MS/MS Estudos de validação constituem uma ferramenta essencial na implantação e manutenção de boas práticas nas diversas áreas analíticas. Tais estudos são estruturados e geralmente tem como referências guias e documentos orientadores. Entretanto, como há varias divergências entre esses documentos, geralmente mais de um é utilizado (ROZET et al., 2007). Apesar dos vários desacordos, é consenso à necessidade da comprovação que o método está validado para finalidade destinada e que ele atende todas as exigências das aplicações analíticas, assegurando assim a confiabilidade dos resultados. Para isso é feita a verificação de parâmetros de desempenho analítico como, por exemplo, seletividade, linearidade, precisão, exatidão, limite de detecção e limite de quantificação (CARDOSO, NÓBREGA e ABRANTES, 2008). 2.6.1 Seletividade Muitas vezes usado erroneamente como sinônimo de especificidade (que é a capacidade do método em detectar apenas um composto específico em meio a outros compostos), a seletividade define a capacidade do método na detecção de várias substâncias em meio a outros componentes tais como impurezas, produtos de degradação e componentes da matriz (CASSIANO et al., 2009). Para garantir a seletividade do método proposto, devem ser consideradas a (i) seletividade específica – que se refere à presença de substâncias interferentes que apresentam características físico-químicas similares ao analito e a (ii) seletividade não específica – também conhecida como efeito matriz, que diz respeito à presença de interferentes inerentes à matriz (CASSIANO et al., 2009). Esses interferentes não mostram sinais aparentes nos testes de seletividade específica. 42 O estudo da seletividade específica é geralmente realizado pela comparação de amostras testemunho (branco da amostra, ou seja, amostra isenta do analito) e amostras fortificadas (às quais adiciona-se o analito). Já o estudo da seletividade não específica geralmente envolve a comparação de curvas analíticas preparadas no solvente com curvas preparadas no extrato da matriz, nas mesmas concentrações e no mesmo intervalo, seguindo estratégia preconizada na literatura (ECONOMOU et al., 2009; BERNARDES, SOUZA, 2011; CERQUEIRA et al., 2011). 2.6.2 Curva analítica A preparação da curva analítica (curva resposta) envolve a preparação de padrões de calibração no intervalo que se pretende estudar, e a averiguação se, nesse intervalo, os resultados obtidos são diretamente proporcionais à concentração do analito. Uma curva resposta adequada deve minimizar a inexatidão e imprecisão nas medidas analíticas. Varias funções podem ser usadas para obter a curva analítica, sendo o mais comum e simples a regressão linear pelo método dos mínimos quadrados ordinários. No entanto, faz-se necessário uma avaliação para se certificar que a curva analítica escolhida conduz a resultados analíticos precisos (ROZET et al., 2011). Embora, a avaliação da curva analítica seja comumente feita apenas pela análise dos valores obtidos para o coeficiente de correlação (valores de “r”). É importante destacar que o coeficiente de correlação é enganoso e inapropriado para essa avaliação e, portanto não deve ser usado para tal intuito (THOMPSON, ELLISON, WOOD, 2002). O coeficiente não mede a adequação de um modelo, indica somente o grau de ajuste dos dados a curva, independentemente do modelo (BERNARDES, SOUZA, 2011). Uma forma de verificar a aceitação da curva analítica é realizada pela avaliação da homocedasticidade (isto é, homogeneidade da variância dos resíduos) dos dados (INSTITUTO NACIONAL DE METROLOGIA, NORMALIZAÇÃO E QUALIDADE INDUSTRIAL, 2010; MANSILHA et al., 2010). Usa-se para isso o teste F e/ou o gráfico dos resíduos (SINGTOROJ et al., 2006). 43 Pelo teste F a condição que deve ser assumida para que os dados estejam homogeneamente distribuídos é: o F tabelado ( tabF ) seja maior que o F experimental ( expF ) ( tabF > expF ). O tabF é obtido da tabela F com nível de confiança de 99%, para grau de liberdade (n-1). O expF é obtido usando a equação 1, de acordo com (ALMEIDA, CASTEL-BRANCO, FALCÃO, 2002). 2 2 1 2 exp S SF = Eq.: 1 Onde o valor de F exp é expresso como a razão obtida entre a variância do maior nível de concentração (S2 2) pela variância do menor nível de concentração (S2 1) da faixa de trabalho. Já na avaliação da homocedasticidade pelos gráficos dos resíduos, os resíduos são calculados pela equação 2, que estabelece a diferença entre os valores medidos ( iy ) e os valores calculados a partir da equação de regressão avaliada ( iŷ ) (INSTITUTO NACIONAL DE METROLOGIA, NORMALIZAÇÃO E QUALIDADE INDUSTRIAL, 2007). ii yyR ˆ−= Eq.: 2 onde: iy o sinal experimental e iŷ o sinal interpolado na equação de regressão. Depois de realizados os cálculos dos resíduos, plota-se os gráficos resíduos versus concentração, a partir dos quais, é feita a verificação se os dados estão homogeneamente distribuídos ao redor do eixo x. Idealmente, a variância residual deve ser constante e o gráfico deve apresentar o aspecto da Figura 5. Figura 5 – Gráfico residual para avaliação da regressão com distribuição satisfatória dos resíduos. Fonte: Adaptado de: (MILLER e MILLER, 2005). Conc. 44 Quando esse aspecto não é seguido fica comprovada a heterocedasticidade (não homogeneidade da variância dos resíduos) dos dados, revelando-se necessária, a escolha de um novo modelo de calibração. Esse novo modelo deve ser mais apropriado para definir a relação entre a concentração e a resposta dos analitos, e consequentemente propiciar a obtenção de resultados quantitativos com maior confiabilidade (MANSILHA et al., 2010). Há algumas opções a serem seguidas quando o modelo apresenta falta de ajuste conforme discutido por (CASSIANO et al., 2009), dentre elas está o uso de fator de peso (a regressão linear por mínimos quadrados ponderados). Os modelos ponderados são particularmente adequados para ensaios em que o desvio padrão relativo (DPR) é constante (isto é, o DP aumenta proporcionalmente à concentração) ao longo da série de concentrações (SINGTOROJ et al., 2006). Nestes casos, pesos são adotados para neutralizar a maior influência das concentrações maiores na linha de regressão (ALMEIDA, CASTEL-BRANCO, FALCÃO, 2002), proporcionando mais importância aos dados com baixa variância e menos importância aos pontos com elevada variância. Um modelo ponderado ideal irá equilibrar a linha de regressão para gerar um erro uniformemente distribuído em toda a faixa de calibração (SINGTOROJ et al., 2006). Os fatores de ponderação apropriados, iw , podem ser calculados a partir do inverso da variância ( 2− is ) usando a equação 3 (MANSILHA et al., 2010). ∑ − − = i i i i ns s w /2 2 Eq.: 3 No entanto, em muitos casos este peso é pouco prático, e outros pesos empíricos baseados na variável x (concentração) ou variável y (resposta) pode fornecer uma simples aproximação de variância. Os pesos ( iw ) empíricos mais utilizados são 5.0 1 y , y 1 , 2 1 y , 5.0 1 x , x 1 , 2 1 x (ALMEIDA, CASTEL-BRANCO, FALCÃO, 2002). Cada um desses pesos são aplicados nas equações de regressão linear tornando-as ponderadas. A conversão da equação de regressão linear sem 45 ponderação na equação linear ponderada é realizada usando o termo iw nos cálculos dos parâmetros a e b. Os coeficientes a e b, já ponderados, são calculados pelas equações 4 e 5: (MANSILHA et al., 2010). 22 wi ii wwi iii w Xnxw YXnyxw a ⋅− ⋅⋅− = ∑ ∑ Eq.: 4 www XbYb ⋅−= Eq.: 5 O coeficiente de correlação ponderado ( wr ) pode ser calculado pela equação 6 (MANSILHA et al., 2010): ∑ ∑∑∑ ∑∑ ∑ ∑∑∑ −⋅⋅−⋅ ⋅−⋅ = 2222 )()( iiiiiiiiii iiiiiiii ywywwxwxww ywxwyxww r Eq.: 6 Obtida a nova equação de regressão (agora com pesos), são calculados, para cada peso, os erros relativos percentuais (%ER), pela equação 7. Então aquele peso que apresentar as menores somas de %ER, em combinação com sua melhor distribuição aleatória, em torno do eixo das concentrações é eleito como melhor fator de ponderação. A soma %ER é um sensível indicador da qualidade do ajuste (MANSILHA et al., 2010). 100% )( )((exp) × − = nom nom C CC ER Eq.: 7 Onde: a concentração experimental (exp)C é a obtida a partir da equação ponderada e )(nomC é a concentração teórica ou nominal. O processo de avaliação dos dados da curva analítica, desde a averiguação da homocedasticidade dos dados até a escolha do melhor modelo para representar o conjunto de dados em questão, pode ser representado esquematicamente pela Figura 6. 46 Figura 6 – Passos para avaliação dos dados da curva analítica AVALIAÇÃO DA CURVA ANALÍTICA Modelo de calibração ponderado ESTÁ APTO para ser usado nas quantificações Teste F 1º PASSO: Testar a homogeneidade da variância dos dados (teste de homocedasticidade) 2º PASSO: A homogeneidade da variância dos dados foi confirmada? Gráfico dos resíduos – resíduos versus concentração Menores somas de %ER. Gráfico de % ER versus concentração com distribuição aleatória, em torno do eixo das concentrações. 4º PASSO: Escolher o fator de ponderação. Geralmente usa-se esse modelo quando pelo gráfico dos resíduos observa-se que a variação aumenta com o aumento da concentração. Novo intervalo de trabalho é estabelecido. Uso de modelos ponderados. Uso de modelo não linear. Geralmente, diminui o intervalo até alcançar a homocedasticidade dos dados Geralmente usa-se esse modelo quando pelo gráfico dos resíduos observam-se desvios da linearidade. Heterocedasticidade confirmada. Não Sim Homocedasticidade confirmada. Modelo de calibração NÃO ESTÁ APTO para ser usado nas quantificações Modelo de calibração ESTÁ APTO para ser usado nas quantificações 3º PASSO: Escolha de novo modelo de calibração. Fonte : Adaptado de: Francisco, 2008. 47 2.6.3 Precisão e exatidão A precisão de um método é o grau de concordância (grau de dispersão) entre resultados de testes independentes de amostragens múltiplas de uma amostra homogênea de acordo com condições prescritas. Geralmente é especificada em termos de desvio padrão ou o desvio padrão relativo. Ela é um importante parâmetro que possibilita avaliar se o método é confiável ou não para o objetivo da análise. A precisão pode ser expressa de diferentes maneiras dependendo das condições em que ela for calculada. Por meio da repetibilidade, da precisão intermediária e da reprodutibilidade (THOMPSON, ELLISON, WOOD, 2002; INTERNATIONAL CONFERENCE ON HARMONIZATION..., 2005). A exatidão trata da concordância entre os valores individuais obtidos em uma série de ensaios e um valor de referência aceito como verdadeiro (INTERNATIONAL CONFERENCE ON HARMONIZATION..., 2005). É importante observar que um valor verdadeiro ou exato é o valor obtido por uma medição perfeita e este valor é indeterminado por natureza. Assim, a exatidão é sempre considerada dentro de certos limites, a um dado nível de confiança (ou seja, aparece sempre associada a valores de precisão). Estes limites devem ser mais estreitos (< 15%) em níveis de concentração elevados e podem ser mais amplos (< 20%) em níveis de traços (U.S. DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN..., 2001). Os processos normalmente utilizados para avaliar a exatidão de um método são, entre outros: materiais de referência certificada (CRM); comparação de métodos e ensaios de recuperação (THOMPSON, ELLISON, WOOD, 2002; INSTITUTO NACIONAL DE METROLOGIA, NORMALIZAÇÃO E QUALIDADE INDUSTRIAL, 2007). As medições de recuperação são as mais comuns devido à dificuldade em se obterem Materiais de Referência Certificada (CRM) ou devido à impossibilidade de comparação com outros métodos. 2.6.4 Limite de detecção (LOD) e limite de quantificação (LOQ) O limite de detecção representa a menor concentração da substância em exame que pode ser detectada, mas não necessariamente quantificada, utilizando um determinado procedimento experimental (INTERNATIONAL CONFERENCE ON HARMONIZATION..., 2005). 48 O limite de quantificação é definido como a menor quantidade ou concentração do analito de interesse em uma amostra, que pode ser quantitativamente determinado com valores aceitáveis de precisão e exatidão (INTERNATIONAL CONFERENCE ON HARMONIZATION..., 2005). Depois do desenvolvimento do método e certificação de que ele atendia todas as exigências analíticas, exigências necessárias para certificação de que ele (o método desenvolvido) estava apto para a finalidade pretendida iniciaram-se os estudos de amostragens. 2.7 Amostragem No estudo da ocorrência de filtros UV em águas naturais (onde essas substâncias na maioria das vezes estão em pequenas quantidades), geralmente, dá- se maior destaque ao método de análise e ao método de extração e pré- concentração. Não obstante sua importância na confiabilidade analítica dos estudos ambientais cabe lembrar, que a estratégia de amostragem é outro aspecto que não deve ser negligenciado. Ou seja, para o estudo ambiental dos filtros UV com qualidade e confiança, é de fundamental importância que o procedimento proposto envolva todas as etapas analíticas (amostragem + pré-tratamento + análise + tratamento e interpretação dos dados) (Figura 7) com igual importância e cuidados, pois a negligência em qualquer dessas etapas pode levar a obtenção de falsos positivos ou falsos negativos. Idealmente, a avaliação da ocorrência de um contaminante químico no ambiente seria composta apenas pela etapa analítica (análise), ou seja, fazendo a determinação diretamente no ambiente (in situ), isso reduziria drasticamente as possibilidades de erros, custos e trabalho. No entanto, na maioria das vezes, e no caso em estudo (análise dos filtros UV em águas naturais) isso ainda é impossível, principalmente por duas razões: nas amostras estudadas a concentração da substância de interesse é pequena (ng L-1 a µg L-1) em meio a uma infinidade de outras substâncias que interferem na determinação; e, não há dispositivo analítico portátil que permita esta determinação com a confiabilidade requerida. Figura 7 – Fluxograma das etapas Fonte: Elaborado pelo autor, 2014 No cenário atual, ainda é necessário proceder à amostragem, o tratamento da amostra e, só então, realizar a determinação instrumental do analito. Enquanto as etapas analíticas tem merecido maior cuidado, a etapa de amostragem considerada como menos negligenciada. A etapa de deve representar de forma fidedigna o local amostrado e p planejamento minucioso amostrar, frequência de amostragem, quantidade amostrada, amostrad utilizados, logística etc. Também, no transporte até o laboratório e garantir a preservação da amostra degradação. Figura 8 – Etapas envolvidas na estratégia de amostragem Fonte: Elaborado pelo autor, 2014 análise tratamento dos dados Planejamento da amostragem Fluxograma das etapas de um estudo ambiental. , 2014. No cenário atual, ainda é necessário proceder à amostragem, o tratamento da amostra e, só então, realizar a determinação instrumental do analito. Enquanto as etapas analíticas tem merecido maior cuidado, a etapa de amostragem menos importante, por parecer simples . A etapa de amostragem (Figura 8) é crucial, pois o material coletado rma fidedigna o local amostrado e para isso minucioso dessa etapa, onde, se deve ter bem definido: amostrar, frequência de amostragem, quantidade amostrada, amostrad utilizados, logística etc. Também, cuidados devem ser tomados durante as coletas o transporte até o laboratório e, no armazenamento no laboratório garantir a preservação da amostra coletada, evitando perdas, contaminação e s envolvidas na estratégia de amostragem. , 2014. Entender o problema Estratégia de amostragem pré-tratamento da amostra análise tratamento dos Coleta das amostras transporte das amostras Estudo ambiental 49 No cenário atual, ainda é necessário proceder à amostragem, o tratamento da amostra e, só então, realizar a determinação instrumental do analito. Enquanto as etapas analíticas tem merecido maior cuidado, a etapa de amostragem ainda é importante, por parecer simples é muitas vezes crucial, pois o material coletado ara isso, é necessário um se deve ter bem definido: onde amostrar, frequência de amostragem, quantidade amostrada, amostradores cuidados devem ser tomados durante as coletas no laboratório, sempre para , evitando perdas, contaminação e Estratégia de amostragem Armazenamento das amostras 50 Chegado ao laboratório, as amostras devem ser analisadas o mais rapidamente possível, entretanto, em determinadas situações, as amostras que possuem prazo de validade mais longo podem ser armazenadas em câmara fria ou geladeira até o momento do ensaio (AGÊNCIA NACIONAL DE ÁGUAS; COMPANHIA AMBIENTAL DO ESTADO DE SÃO PAULO, 2011). 2.7.1 Seleção da área a ser inserida no estudo ambiental Apesar de existirem vários trabalhos que tratam da atividade estrogênica dos filtros UV, bem como sobre a ocorrência e destino dos mesmos no ambiente (principalmente nos recursos hídricos), não encontramos na literatura trabalhos com este enfoque para o cenário brasileiro. Essas moléculas ainda são negligenciadas no Brasil, mesmo considerando o alto consumo de filtros UV, devido à alta incidência de radiação solar durante o ano todo; o precário sistema de saneamento básico brasileiro; e o fato de que uma das principais rotas de aporte destes contaminantes em águas superficiais é o lançamento de esgoto in natura e o lançamento de efluentes de estações de tratamento de esgoto sanitário. A situação do Brasil torna-se crítica, pelo alto consumo nacional de cosméticos (terceiro no ranking mundial) e principalmente devido ao grande déficit de infraestrutura em saneamento. Segundo o Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE), somente 28,5% dos municípios brasileiros coletam e tratam o esgoto doméstico, 55,2% só dispõe do serviço de coleta e em 44,8% dos municípios o esgoto não coletado é lançado diretamente em rios ou no mar (INSTITUTO BRASILEIRO DE GEOGRAFIA E ESTATÍSTICA, 2008). Na região Sudeste do país a situação do saneamento básico é um pouco melhor (Figura 9), mas ainda assim, apenas 48,4% dos municípios têm serviço de coleta e tratamento do esgoto, 95,1% somente coletam e em 4,9% dos municípios não há sequer o serviço de coleta (INSTITUTO BRASILEIRO DE GEOGRAFIA E ESTATÍSTICA, 2008), fator que pode vir a contribuir na permanência dos filtros UV em água. Figura 9 – Percentagens da coleta e tratamento de esgoto do Brasil e regiões. Fonte: IBGE, Pesquisa Nacional de GEOGRAFIA E ESTATÍSTICA Com condições mais favoráveis que o resto do país, no sudeste, o estado São Paulo está dividido em 22 Unidades de Gerenciamento de Recursos Hídricos (UGRHI) (Figura 10). Sendo Hidrográfica Tietê-Jacaré que é composta por 34 municípios e da população do Estado se tratar de uma região populosa na qual a coleta do esgoto doméstico é praticamente 100% embora em alguns municípios não haja tratamento do esgoto coletado. Bauru por exemplo, o 10% do esgoto coletado AMBIENTAL, 2012). Figura 10 – Mapa do Estado de São Paulo segundo a divisão do território em UGRHI (numeradas de 1 a 22). Fonte : CUNHA et al., 2013. Percentagens da coleta e tratamento de esgoto do Brasil e regiões. IBGE, Pesquisa Nacional de Saneamento Básico 2008 (INSTITUTO BRASILEIRO DE GEOGRAFIA E ESTATÍSTICA, 2008). Com condições mais favoráveis que o resto do país, no sudeste, o estado São Paulo está dividido em 22 Unidades de Gerenciamento de Recursos Hídricos . Sendo uma delas a UGRHI-13, também chamada Bacia Jacaré que é composta por 34 municípios e abriga cerca de 3,5% Estado (Tabela 5), a qual foi selecionada como área de estudo por tratar de uma região populosa na qual a coleta do esgoto doméstico é praticamente 100% embora em alguns municípios não haja tratamento do esgoto . Bauru por exemplo, o município mais populoso dessa bacia trata apenas coletado (COMPANHIA DE TECNOLOGIA DE SANEAMENTO apa do Estado de São Paulo segundo a divisão do território em UGRHI (numeradas de 51 Percentagens da coleta e tratamento de esgoto do Brasil e regiões. INSTITUTO BRASILEIRO DE Com condições mais favoráveis que o resto do país, no sudeste, o estado de São Paulo está dividido em 22 Unidades de Gerenciamento de Recursos Hídricos 13, também chamada Bacia abriga cerca de 3,5% foi selecionada como área de estudo por tratar de uma região populosa na qual a coleta do esgoto doméstico é praticamente 100% embora em alguns municípios não haja tratamento do esgoto mais populoso dessa bacia trata apenas COMPANHIA DE TECNOLOGIA DE SANEAMENTO apa do Estado de São Paulo segundo a divisão do território em UGRHI (numeradas de 52 Tabela 5 – Carga orgânica poluidora de origem doméstica dos municípios da UGRHI-13. Em negrito, os municípios inseridos nesta tese. Município População Total 2012 Atendimento (%) Carga Poluidora (kg DBO/dia) Coleta Tratamento Potencial Remanescente Agudos 34.833 93 0 1.797 1.797 Araraquara 212.617 99 100 11.156 3.204 Arealva 7.932 98 100 337 98 Areiópolis 10.622 100 100 510 107 Bariri 32.102 100 100 1.645 132 Barra Bonita 35.210 100 5,5 1.861 1.765 Bauru 348.146 98 10 18.519 17.012 Boa Esperança do Sul 13.807 98 100 666 144 Bocaina 11.073 100 100 551 120 Boracéia 4.348 100 100 211 25 Borebi 2.348 100 0 111 111 Brotas 21.987 99 100 1.023 213 Dois Córregos 25.100 95 100 1.283 282 Dourado 8.610 98 0 425 425 Gavião Peixoto 4.464 100 0 195 195 Iacanga 10.275 95 100 484 93 Ibaté 31.380 80 50 1.627 1.028 Ibitinga 54.146 82 0 2.808 2.808 Igaraçu do Tietê 23.475 100 100 1.260 88 Itaju 3.338 100 100 131 18 Itapuí 12.446 80 0 642 642 Itirapina 15.930 95 100 776 179 Jaú 133.900 100 100 7.005 700 Lençóis Paulista 62.393 100 1,32 3.294 3.259 Macatuba 16.336 100 100 856 103 Mineiros do Tietê 12.133 100 100 626 125 Nova Europa 9.601 100 100 481 96 Pederneiras 42.235 96 100 2.120 163 Ribeirão Bonito 12.270 96 0 613 613 São Carlos 226.322 99,6 85 11.733 2.595 São Manuel 38.614 94 100 2.035 398 Tabatinga 14.943 97,4 95 691 52 Torrinha 9.405 100 100 432 194 Trabiju 1.569 90 100 78 16 UGRHI-13 1.503.910 97 69 77.982 38.800 Fonte: Adaptado de: (COMPANHIA DE TECNOLOGIA DE SANEAMENTO AMBIENTAL, 2012). Os municípios da UGRHI Bueno de Andrada (distrito de Araraquara), Jaú, São Carlos, e Trabiju os quais estão destacados no mapa da Figura 11 – Localização dos municípios Fonte: Adaptado de: (GAVA et al., 2014 Por se tratar de uma região populosa e na qual o tratamento de esgoto doméstico, apesar de apresentar a melhor condição nacional, ainda encontra muito longe do ideal, considera sobre a ocorrência dessas subst eficácia na remoção pelos processos de tratamento usualmente empregados nas estações de tratamento de água. Uma vez não tratado o esgoto, ou tratado de forma ineficiente, substâncias com potencial de bioacumul chegar aos pontos de captação, vindo a comprometer a qualidade da água destinada ao consumo humano. da UGRHI-13 inseridos neste estudo foram: Araraquara, Bauru, (distrito de Araraquara), Jaú, São Carlos, e Trabiju os quais estão destacados no mapa da Figura 11. municípios, da UGRHI-13, selecionados como sítios de amostragem GAVA et al., 2014). Por se tratar de uma região populosa e na qual o tratamento de esgoto doméstico, apesar de apresentar a melhor condição nacional, ainda encontra muito longe do ideal, considera-se de grande importância a obtenção de dados sobre a ocorrência dessas substancias na água de abastecimento, como também a eficácia na remoção pelos processos de tratamento usualmente empregados nas estações de tratamento de água. Uma vez não tratado o esgoto, ou tratado de forma ineficiente, substâncias com potencial de bioacumulação e estrogenicidade pode de captação, vindo a comprometer a qualidade da água destinada ao consumo humano. 53 foram: Araraquara, Bauru, (distrito de Araraquara), Jaú, São Carlos, e Trabiju os quais estão selecionados como sítios de amostragem. Por se tratar de uma região populosa e na qual o tratamento de esgoto doméstico, apesar de apresentar a melhor condição nacional, ainda encontra-se se de grande importância a obtenção de dados ancias na água de abastecimento, como também a eficácia na remoção pelos processos de tratamento usualmente empregados nas estações de tratamento de água. Uma vez não tratado o esgoto, ou tratado de forma ação e estrogenicidade podem de captação, vindo a comprometer a qualidade da água 54 3 OBJETIVOS: Considerando que os filtros UV (BP-3, ES, EHMC e OC) estão incluídos em uma categoria recente de poluentes ambientais que podem interferir nas funções do sistema endócrino; que essas substâncias têm sido encontradas no ambiente em concentrações da ordem de ng L-1 a µg L-1; sendo raros os trabalhos que discutem a dinâmica ambiental destes compostos. E ainda, levando em conta que o Brasil, por ser um país tropical, com alta incidência de irradiação solar, apresenta um alto consumo de produtos com filtros UV em sua formulação; além de ter um baixíssimo índice de tratamento de esgoto. Este trabalho tem como objetivo geral contribuir para o diagnóstico ambiental da ocorrência de interferentes endócrinos nos recursos hídricos brasileiros, destacando-se como objetivos específicos: � Otimizar e validar um método para determinação de BP-3, ES, EHMC e OC na entrada e saída de estação de tratamento de água (ETA); � Estudar a ocorrência das substâncias de interesse nas ETAs na região da Bacia Hidrográfica Tietê-Jacaré; � Avaliar a remoção desses resíduos pelos processos empregados nas ETAs; � Avaliar a influência da sazonalidade na ocorrência e remoção das substâncias; 55 4 PARTE EXPERIMENTAL Para a execução desse trabalho, inicialmente foi realizada uma pesquisa de mercado sobre os protetores solares mais comercializados em Araraquara/SP. Dentre as substâncias encontradas com maior frequência na formulação dos protetores solares, aquelas que apresentam maior potencial estrogênico, segundo a literatura, foram selecionadas para serem estudadas (BP-3, ES, EHMC e OC) (Tabela 1). Selecionados os analitos, foram adquiridos seus respectivos padrões de alta pureza e então se deu início às otimizações cromatográficas (GC-MS e GC- MS/MS) e posteriormente às otimizações do procedimento de extração (SPE). Após definidas as condições cromatográficas e de extração foi planejada e realizada a validação do procedimento de determinação dos filtros UV em amostras de água. Por último, num período de 6 meses a 1 ano foram realizados estudos da ocorrência e eventual sazonalidade dos filtros UV em água de rio e de abastecimento público (entrada e saída das ETAs) de Araraquara, Bauru, Bueno de Andrada, Jaú, São Carlos e Trabiju. 4.1 Reagentes e soluções padrão Os filtros UV BP-3, ES, EHMC, OC, benzofenona-d10 (BP-d10, surrogate) e o padrão interno benzil cinamato (BC) foram obtidos da Sigma-Aldrich (St.Louis, MO, USA) com pureza >97%. Nomes, estruturas químicas, abreviaturas, número de registro no