Universidade Estadual Paulista Instituto de Química de Araraquara Programa de Pós-graduação em Biotecnologia LAÍS SIMÕES SAMPAIO APLICAÇÃO DE DNA BARCODING NA IDENTIFICAÇÃO DE ESPÉCIES DOS GÊNEROS Senna, Lantana E Casearia. DISSERTAÇÃO DE MESTRADO ARARAQUARA 2015 LAÍS SIMÕES SAMPAIO Aplicação de DNA Barcoding na identificação de espécies dos gêneros Senna, Lantana e Casearia. Dissertação apresentada ao Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Biotecnologia. Orientadora: Profa. Dra. Regina Maria Barretto Cicarelli Araraquara 2015 Dedicatória Dedico este trabalho aos meus pais Eduardo e Isabel, e ao meu irmão Daniel, que sempre me apoiaram na minha jornada. Amo vocês. “A persistência é o menor caminho do êxito”. Charles Chaplin Agradecimentos Gostaria de agradecer a minha orientadora professora Dra. Regina Maria Barretto Cicarelli pela oportunidade e confiança. Aos amigos de laboratório Bianca Januário, Flávia Alves, Andrea Kohatsu, Juliana Martinez, Danilo Braganholi, Fernanda Polverari, Isabela Brunelli, Ana Valéira Freitas pelos ensinamentos e pela ajuda. Ao Instituto de Química de Araraquara - UNESP pela oportunidade de realizar este trabalho, e ao Programa de Pós-graduação em Biotecnologia. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela concessão da bolsa de estudo. Ao Dr. Nelson Wulff, Msc. Elaine Martins e Daniela Coletti pelos ensinamentos que me passaram e a ajuda quando necessitei. Ao professor Dr. Alberto José Cavalheiro e a Msc. Paula Carolina Pires Bueno pela parceria e pela ajuda durante esses dois anos. À professora Dra. Rejane Maria Tommasini Grotto, Msc. Viviam Milanez Massolini e Aline Faria Galvani da UNESP Botucatu pelo uso do analisador genético ABI 3500 para eletroforese capilar. Aos meus professores, principalmente a professora Dra. Márcia Aparecida Silva Graminha, que passaram seus conhecimentos para minha formação e pela ajuda sempre que necessitada. Ás amigas Kely Imamura e Paula Daltro, pela amizade, pelas risadas e pela ajuda. Ao Thiago Candido por me ajudar na finalização deste trabalho e pela paciência!!! Aos meus avós, por terem criado as duas pessoas mais maravilhosas do mundo. E a minha família, meus tios e primos!!! Agradeço ao meu irmão Daniel, que além de irmão, é meu companheiro e meu amigo, e sempre esteve ao meu lado. Aos meus cachorros, Pingo e Spike, por sempre me ouvirem nas horas de estresse e nunca me julgarem. A Deus, pela saúde que tenho. A todos que me ajudaram durante toda minha vida. E por último, e não menos importante, gostaria de agradecer aos meus pais, Eduardo e Isabel, pela dedicação, paciência, amor, ensinamentos e tudo o que eles me propiciaram, e acima de tudo por acreditarem no meu potencial. Amo muito vocês, e obrigada por tudo!!! RESUMO O Brasil possui uma grande diversidade botânica, graças a seus diversos biomas, sendo a documentação das espécies existentes muito importante para o conhecimento da biodiversidade mundial. O gênero Senna possui 80 espécies enquanto o gênero Casearia apresenta 37 espécies no Brasil. O gênero Lantana possui cerca de 150 espécies. Alguns princípios ativos dessas espécies foram testados previamente no laboratório da Orientadora, apresentando atividade tripanocida promissora; entretanto existem dificuldades na classificação de alguns espécimes desses gêneros. Novas técnicas de identificação surgem para auxiliar na taxonomia. DNA Barcoding é uma técnica muito útil, pois é rápida, precisa, e com alta relação custo-benefício, utilizando uma pequena sequência de DNA para identificação. Suas aplicações vão desde identificar espécies crípticas até na luta contra o comércio ilegal de espécies ameaçadas de extinção e madeira extraída ilegalmente, dentre outras. Para realização desta técnica em plantas, utilizam-se genes localizados no cloroplasto – matK (codifica a proteína maturase K), rbcL (codifica a proteína ribulose 1,5-bifosfato ou Rubisco) e/ou regiões de espaçador intergênicos presente no cloroplasto (trbH-psbA). Neste trabalho em parceria com o NuBBE – Núcleo de Bioensaios, Biossíntese e Ecofisiologia de Produtos Naturais, visamos identificar as espécies pela técnica de DNA Barcoding, utilizando as regiões rbcL, trbH-psbA e ITS2, para para verificar a acurácia de banco de dados e melhorar a classificação taxonômica. Os resultados mostraram que a região rbcL é uma boa região para amplificação e sequenciamento, com boa taxa de discriminação de espécie. A região psbA-trnH é menos efetiva na discriminação de espécie comparada à região rbcL. A região ITS2 apresentou identidade com sequência de fungos, mostrando dificuldade na utilização desta região. ABSTRACT Brazil has a great botanical diversity, thanks to its various biomes, and the documentation of existing species is very important for understanding the world's biodiversity. Senna genus has 80 species while Casearia genus has 37 species in Brazil. The Lantana genus has about 150 species. Some active compounds of these species were tested in the laboratory presenting promising trypanocidal activity; however there are difficulties in classification of some specimens of these genres. New identification techniques emerge to assist in taxonomy. DNA barcoding is a very useful technique because it is fast, accurate, and highly cost-effective, using a small DNA sequence for identification. Its applications range from identifying cryptic species to the fight against illegal trade in endangered species and illegally harvested timber, among others. To perform this technique, in plants, use genes located in the chloroplast - matK (encoding the protein maturase K) rbcL (encoding ribulose 1,5-bisphosphate or protein Rubisco) and/or intergenic spacer regions in the chloroplast (trbH-psbA). In this work in partnership with NuBBE - Center for Bioassays, Biosynthesis and Ecophysiology of Natural Products, we aimed to identify the species by DNA barcoding technique, using the regions rbcL, trbH-psbA and ITS2, to check the database accuracy and improve the taxonomic classification. The results showed that the rbcL region is a good region for amplification and sequencing, with good species discrimination rate. The psbA-trnH region is less effective in discrimination compared to the rbcL region. The ITS2 region showed identity with fungal sequence, showing difficulty in using this region. LISTA DE FIGURAS Figura 1 Ilustração de uma mitocôndria. 18 Figura 2: Ilustração de um cloroplasto. 19 Figura 3: Os três genomas onde estão presentes as regiões utilizadas como DNA Barcode de plantas. Marcadores verdes são potenciais Barcode; marcadores vermelhos são pobres candidatos e os marcadores amarelos estão pendentes para serem investigados. 20 Figura 4: Parte de um ramo com as folhas da espécie Senna alata. 23 Figura 5: Arbusto da espécie Lantana câmara L. 24 Figura 6: Folha da espécie Casearia sylvestris. 21 Figura 7: Eletroforese em gel de agarose do teste de temperatura da região psbA- trnH (300 a 500 pb) (pente 1) e ITS2 (300 a 400 pb) (pente 2). 42 Figura 8: Eletroforese em gel de agarose do teste de concentrações. 43 Figura 9: Eletroforese em gel de agarose da amplificação da região rbcL. 44 Figura 10: Eletroforese em gel de agarose da amplificação da região psbA-trnH. 44 Figura 11: Eletroforese em gel de agarose da amplificação da região ITS2. 45 Figura 12: Árvore filogenética construída a partir do marcador rbcL com o gênero Casearia. O grupo externo* é a espécie Bryum argenteum Hedw. 54 Figura 13: Árvore filogenética construída a partir do marcador psbA-trnH com o gênero Casearia. O grupo externo* é a espécie Bryum argenteum Hedw. 55 Figura 14: Árvore filogenética construída a partir do marcador ITS2 com o gênero Casearia. O grupo externo* é a espécie Bryum argenteum Hedw. 56 Figura 15: Árvore filogenética construída a partir do marcador rbcL com os gêneros Senna e Lantana. O grupo externo* é a espécie Bryum argenteum Hedw. .57 Figura 16: Árvore filogenética construída a partir do marcador psbA-trnH com os gêneros Senna e Lantana. O grupo externo* é a espécie Bryum argenteum Hedw. 57 Figura 17: Árvore filogenética construída a partir do marcador ITS2 com os gêneros Senna e Lantana. O grupo externo* é a espécie Bryum argenteum Hedw. 58 Figura 18: Árvore filogenética construída a partir do marcador rbcL com os gêneros Matayba, Guazuma e Ephedranthus. O grupo externo* é a espécie Bryum argenteum Hedw. 58 Figura 19: Árvore filogenética construída a partir do marcador psbA-trnH com os gêneros Matayba, Guazuma e Ephedranthus. O grupo externo* é a espécie Bryum argenteum Hedw.. 59 Obs.: As figuras de 8 a 19 são de autoria da candidata e elaboradas ao longo do desenvolvimento deste trabalho. LISTA DE TABELAS Tabela 1: Localidade das coletas, identificação morfo-anatômica e perfíl químico das amostras. 29 Tabela 2: Lista de primers utilizados no trabalho. 34 Tabela 3: Número de acesso das sequências de DNA obtidas no GenBank (NCBI). 38 Tabela 4: Resultado da quantificação de DNA. 39 Tabela 5: Tamanho das sequências consenso obtidas. 45 Tabela 6: Resultados obtidos no BLAST para região rbcL (03 de junho 2015). 47 Tabela 7: Resultados obtidos no BLAST para região psbA-trnH (03 de junho 2015). 48 Tabela 8: Resultados obtidos no BLAST para região ITS2 (03 de junho 2015). 50 Tabela 9: Comparação dos resultados entre banco de dados para região rbcL. 51 Tabela 10: Comparação dos resultados entre banco de dados para região ITS2. .52 Tabela 11: Resumo dos resultados encontrados no BLAST com a classificação de família. 60 Obs: As tabelas de 1 a 11 são de autoria da candidata e elaboradas ao longo do desenvolvimento deste trabalho. Lista de Abreviaturas A Base nitrogenada adenina ATP Trifosfato de Adenosina C Base nitrogenada citosina CTAB Brometo de cetiltrimetilamônio DNA Ácido desoxirribonucleico dNTP Desoxirribonucleotídeo trifosfatado EDTA Ácido etilenodiaminotetracético G Base nitrogenada guanina g Gravidade Kb Kilobase MgCl2 Cloreto de Magnésio NCBI NuBBE National Center for Biotechnology Information Núcleo de Bioensaios, Biossíntese e Ecofisiologia de Produtos Naturais pb Pares de Base PCR Polymerase Chain Reaction qsp. Quantidade suficiente para T Base nitrogenada timina Lista de Símbolos % Porcentagem °C Grau Celsius cm Centímetro mL Mililitro μL Microlitro mM Milimolar M Molar ng Nanograma pH Potencial hidrogeniônico U Unidade x Vezes SUMÁRIO 1. Introdução ......................................................................................................... 16 2. Revisão de Literatura ........................................................................................ 18 2.2 Genoma Vegetal .......................................................................................... 18 2.2.1 Mitocôndria ............................................................................................ 18 2.2.2 Plasto ..................................................................................................... 19 2.3 DNA Barcoding ............................................................................................ 20 2.3.1 Região rbcL ........................................................................................... 22 2.3.2 Região ITS2 ........................................................................................... 22 2.3.3 Região psbA-trnH .................................................................................. 22 2.4 Gêneros estudados ...................................................................................... 23 2.4.1 Gênero Senna ........................................................................................... 23 2.4.2 Gênero Lantana ........................................................................................ 25 2.4.3 Gênero Casearia ....................................................................................... 25 2.8 Sistemática Filogenética .............................................................................. 26 3. Objetivos ........................................................................................................... 28 4. Material e Métodos ............................................................................................ 29 4.1 Obtenção das amostras ............................................................................... 29 4.2 Extração de DNA ......................................................................................... 33 4.3 Teste de temperatura de anelamento .......................................................... 34 4.4 Teste de concentração do DNA na PCR ...................................................... 34 4.5 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) .................................................... 35 4.6 Eletroforese em gel de agarose ................................................................... 36 4.7 Purificação ................................................................................................... 36 4.8 Reação de Sequenciamento ........................................................................ 36 4.9 Purificação e Precipitação ............................................................................ 37 4.10 Eletroforese Capilar ................................................................................... 37 4.11 Análise das Sequências ............................................................................. 38 4.12 Sistemática Filogenética ............................................................................ 38 5. Resultados ........................................................................................................ 40 5.1 Extração de DNA ......................................................................................... 40 5.1 Teste de Temperatura de Anelamento ......................................................... 42 5.2 Teste de Concentração de DNA .................................................................. 43 5.3 Amplificação por PCR e Sequenciamento ................................................... 44 5.3.1 Comparação com sequências de Banco de Dados ............................... 52 5.4 Sistemática Filogenética .............................................................................. 54 5.5 Análises dos resultados obtidos ................................................................... 60 6. Discussão .......................................................................................................... 63 7. Conclusão ......................................................................................................... 66 Referências ........................................................................................................... 67 Apêndice A ............................................................................................................ 71 Apêndice B ............................................................................................................ 81 Apêndice C ............................................................................................................ 87 Apêndice D ............................................................................................................ 91 Apêndice E ............................................................................................................ 96 Apêndice F ............................................................................................................ 99 Apêndice G.......................................................................................................... 101 Apêndice H .......................................................................................................... 109 16 Introdução 1. Introdução Flora é o conjunto de espécies vegetais que compõe a cobertura vegetal de uma determinada área. A flora mundial é um recurso de enorme valor para os organismos vivos que podem fazer seu uso de diversas maneiras como na alimentação, medicina, vestuário, habitação e atividade industrial. Uma das principais atividades econômicas no Brasil é o extrativismo vegetal (PORTAL BRASIL, b). Atualmente, o Brasil é o grande exportador de produtos florestais. Além da extração de madeira, a Região Amazônica também é responsável pela produção nacional de castanha do Pará, látex (retirado da seringueira), babaçu entre outras sementes e frutas tipicamente brasileiras, manufaturadas pelas indústrias alimentícia, farmacêutica e até de combustíveis. Essas atividades garantem a subsistência de famílias e movimentação dos mercados locais (PORTAL BRASIL, a). O Brasil é um país de proporções continentais, com um território de 8,5 milhões de km² que abriga 22% da diversidade de plantas do mundo (PEIXOTO; MORIM, 2003). Abrangendo várias zonas climáticas, desde o semiárido no Nordeste a áreas temperadas no Sul, contêm diversos biomas ou zonas biogeográficas distintas e que refletem em uma enorme biodiversidade. Os biomas brasileiros são: Floresta Amazônica, Pantanal, Cerrado, Caatinga, Pampas, e Mata Atlântica. Assim, a flora brasileira abriga 45.835 espécies descritas, sendo 4.680 algas, 32.715 angiospermas, 1.519 de briófitas, 5.652 fungos, 30 gimnospermas e 1.239 samambaias e Licófitas (SiBBr). Muitas dessas espécies são endêmicas, e diversas têm importância econômica mundial, como o abacaxi, o amendoim, a castanha do Brasil (ou do Pará), a mandioca, o caju e a carnaúba (BRASIL, 2013). Com tamanha diversidade, tem-se a necessidade de identificação das espécies. Segundo Hebert et al. (2003) a única perspectiva para a capacidade de 17 identificação sustentável reside na construção de sistemas que empregam sequências de DNA como "códigos de barras" para os táxons, surgindo assim a técnica de DNA Barcode. DNA Barcode é uma técnica para identificação de espécies rápida, precisa e automatizada que utiliza regiões curtas e padronizadas de genes do organismo estudado. Para animais utiliza-se a subunidade 1 da Citocromo c Oxidase (COI) presente no DNA mitocondrial, para fungos, a região ITS presente no DNA nuclear, e para plantas ainda não se tem uma região padrão para identificação (HEBERT; GREGORY, 2005). 18 Revisão de Literatura 2. Revisão de Literatura 2.2 Genoma Vegetal As espécies vegetais possuem além do genoma nuclear, o genoma mitocondrial e o genoma cloroplastidial (KLABUNDE, 2012). 2.2.1 Mitocôndria As mitocôndrias são organelas arredondadas ou alongadas, presentes no citoplasma da maioria das células eucarióticas. São constituídas por duas membranas: membrana externa, que é lisa e muito permeável; e membrana interna, que é seletiva e controla o trânsito de moléculas nos dois sentidos. Esta membrana apresenta muitas pregas, denominadas cristas mitocondriais, que aumentam a área para o sistema transportador de elétrons. O espaço entre a membrana interna e a externa é chamado de espaço intermembranoso. O interior da organela, limitado pela membrana interna, contém a matriz mitocondrial (Figura 1). As mitocôndrias contêm ribossomos 70S e DNA próprio, bem como uma maquinaria para replicar, transcrever e traduzir a informação codificada pelo seu DNA (TORTORA; FUNKE; CASE, 2010). 19 Figura 1: Ilustração de uma mitocôndria. Fonte: www.alunosonline.com.br. A subunidade 1 da Citocromo c Oxidase (COI) do DNA mitocondrial é parte de um complexo gênico codificante de proteínas transmembrana, envolvidas no transporte elétrico e catálise na cadeia respiratória de organismos eucariotos. Este gene vem sendo alvo de estudos populacionais de variabilidade genética pela sua universalidade e importância evolutiva em animais (MORAIS; MARRELLI, 2009). 2.2.2 Plasto Algas e plantas possuem uma organela exclusiva denominada cloroplasto, uma estrutura revestida por membrana que contém o pigmento clorofila e as enzimas necessárias para as fases de captação de luz da fotossíntese. A clorofila está contida em sacos achatados de membranas denominados tilacóides. As pilhas de tilacóides são denominadas grana (singular: granum) (Figura 2). Assim como as mitocôndrias, os cloroplastos contêm ribossomos 70S, DNA e enzimas envolvidas na síntese proteica (TORTORA; FUNKE; CASE, 2010). O genoma cloroplastidial é constituído por 120-180 Kilobases (Kb) na maioria das plantas superiores, observando-se um conteúdo genético extremamente conservado mesmo entre espécies filogeneticamente distantes. 20 As regiões rbcL, psbA-trnH e matK estão presentes no genoma cloroplastidial das plantas. Figura 2: Ilustração de um cloroplasto. Fonte: www.sobiologia.com.br 2.3 DNA Barcoding Em 2003, Paul Hebert propôs “DNA Barcoding” como um método de identificar espécies utilizando uma pequena sequência genética de uma parte do genoma (CONSORTIUM FOR THE BARCODE OF LIFE). O objetivo do DNA Barcoding é ser preciso, rápido, com alta relação custo- benefício e acesso a base de dados para identificação de espécies (JOLY et al., 2009). DNA Barcoding pode ser utilizado para várias aplicações, tais como identificar espécies crípticas, fragmentos de espécies, como raízes de árvores; detecção de espécies invasoras no ecossistema; descoberta de espécies; revisão taxonômica; desvendar teias alimentares e relações presa-predador; e na luta contra o comércio ilegal de espécies ameaçadas de extinção e madeira extraída ilegalmente (COSTION et al, 2011). Como padrão para maioria dos grupos animais, utiliza-se uma região de 649 pares de bases presente no DNA mitocondrial, a subunidade 1 do gene citocromo 21 c oxidase – “COI”. Porém COI não é uma região eficiente para plantas, pois possui uma baixa taxa de diversidade, então utiliza-se genes localizados em outras partes do genoma como no cloroplasto – matK (codifica a proteína maturase K) e rbcL (codifica a proteína ribulose 1,5-bifosfato ou Rubisco) (HOLLINGSWORTH et al., 2009). Atualmente, utiliza-se mais de um gene, sendo um conservado (rbcL) e os outros de rápida evolução (parte do gene matK e o espaçador intergênico psbA- trnH) (Figura 3) (KRESS et al, 2009). Figura 3: Os três genomas onde estão presentes as regiões utilizadas como DNA Barcode de plantas. Marcadores verdes são potenciais Barcode; marcadores vermelhos são pobres candidatos e os marcadores amarelos estão pendentes para serem investigados. Fonte: modificado de Chen et al, 2010. 22 2.3.1 Região rbcL A região do gene rbcL (rbclaf - rbclajf634r) codifica uma proteína altamente conservada, ribulose-1, 5-bisfosfato ou Rubisco (FORD et al, 2009). Sua escolha como DNA Barcode foi adotado por ser um gene comum entre as plantas e seu uso histórico em estudos filogenéticos. 2.3.2 Região ITS2 ITS2 (espaçador interno transcrito) é uma região ribossomal nuclear tem provado ser uma região com boas características para estudos filogenéticos em muitas famílias de angiospermas (BALDWIN et al, 1995). O DNA ribossomal (DNAr) é composto por longos arranjos de unidades de repetição em tandem, separadas por um espaçador intergênico não transcrito (IGS ou NTS), o qual possui número variável de pequenas subrepetições internas e que são variáveis em comprimento entre espécies intimamente relacionadas e indivíduos da mesma espécie, e um espaçador externo transcrito (ETS). Cada unidade transcrita contém as sequências que codificam para três genes ribossômicos, 18S, 5.8S e 28S, que são altamente conservadas e essencialmente invariáveis. Localizado entre os genes 18S e 5.8S encontra-se o primeiro espaçador interno transcrito (ITS1) e, entre os genes 5.8S e 28S o segundo (ITS2) (SABATINI, 2003). 2.3.3 Região psbA-trnH A região psbA-trnH (espaçador intergênico não transcrito) é facilmente amplificada e sequenciada, mostra alta variação de nucleotídeos na maioria das espécies de angiospermas e gimnospermas (KRESS et al., 2005). 23 2.4 Gêneros estudados O NuBBE – Núcleo de Bioensaios, Biossíntese e Ecofisiologia de Produtos Naturais estabelecido no Instituto de Química da UNESP participa do programa BIOTA – FAPESP, realizando principalmente estudos de bioprospecção, na área de Química de Produtos Naturais presentes na flora do Cerrado e Mata Atlântica. A união entre os laboratórios da UNESP (IQ - NuBBE, FCF, FC), Instituto de Botânica – SMA/SP, UFMG (DATAPLAMT), UFC (LOE, LPN e CENAUREMN) e UFPI (Laboratórios de Produtos Naturais e de Farmacologia, BIOTEN) tem como objetivo a documentação de acessos a espécies vegetais da flora brasileira, com foco nos biomas Cerrado e Mata Atlântica, incluindo localização dos indivíduos e identificação a partir de dados morfo-anatômicos e genéticos (DNA Barcoding). Os projetos desenvolvidos são para o estudo químico de espécies vegetais e micro-organismos associados, com ênfase na busca de novas substâncias antimicrobianas, antitumorais, anti-inflamatórias e antioxidantes e estudos metabolômicos que incluem dinâmica metabólica, variabilidade intraespecífica e biossíntese de metabólitos secundários. Estes estudos visam a descoberta de novas moléculas bioativas com potencial terapêutico e a identificação de papéis ecofisiológicos dessas moléculas, com o objetivo maior de gerar informações que permitam a utilização e desenvolvimento sustentável do Cerrado e Mata Atlântica (NÚCLEO DE BIOENSAIOS, BIOSSÍNTESE E ECOFISIOLOGIA DE PRODUTOS NATURAIS). Em parceria com o NuBBE, os gêneros escolhidos para realização deste trabalho foram os gêneros Senna, Lantana e Casearia, com foco no último gênero, onde em trabalhos realizados no NuBBE foi avaliado o perfil químico das amostras. 2.4.1 Gênero Senna O gênero Senna, pertencente à família Leguminosae, sub-familia Caesalpinioideae, da tribo Cassieae, subtribo Cassiinae, possui aproximadamente 24 300 espécies de distribuição pantropical, sendo 200 presentes nas Américas e 80 no Brasil, no Bioma Cerrado (Figura 4) (DANTAS, DA SILVA, 2013). Espécies deste gênero são utilizadas medicinalmente desde longa data por tribos americanas, indianas e africanas como tônico, febrífugo, estomáquico e purgativo. Além disso, apresenta indicações como antimalárica em regiões da Amazônia e da África. Na medicina indiana é considerada uma importante droga para o tratamento de problemas hepáticos e infecções da pele. Estudos científicos comprovam que espécies do gênero Senna podem atuar como agente antimicrobiano, antiparasitário, inseticida, antitumoral, hepatoprotetor e laxativo. Trabalhos mostram também que ela apresenta propriedades tóxicas para animais, sendo assim, de grande interesse à Medicina Veterinária (LOMBARDO; KIYOTA; KANEKO, 2009). Figura 4: Parte de um ramo com as folhas da espécie Senna alata. Fonte: http://www.boldsystems.org/ 25 2.4.2 Gênero Lantana O gênero Lantana, pertencente à ordem Lamiales, família Verbenaceae, possui cerca de 150 espécies com ocorrência nas regiões tropicais e subtropicais do mundo (Figura 5). Na literatura, referem-se a Lantana como sendo uma planta tóxica para animais, mas é frequentemente utilizada na medicina popular como anti-séptico, antiespasmódico, contra hemorragias, gripes e resfriados e inibição diarréica. São reconhecidos também propriedades alelopáticas, que é o efeito inibitório ou benéfico, de uma planta sobre outra, via produção de compostos químicos que são liberados no ambiente; e efeitos repelentes contra larvas de mosquitos Aedes (COSTA et al., 2009). Figura 5: Arbusto da espécie Lantana câmara L. Fonte: http://herbarivirtual.uib.es/. 2.4.3 Gênero Casearia O gênero Casearia, pertencente a ordem Violales, tradicionalmente pertencente à família Flacourtiaceae, foi recentemente sugerido encaixar-se na 26 família Salicaceae (CAVALLARI et al., 2008); possui 160 espécies, sendo 70 pertencentes ao continente americano e 37 ao Brasil, no Bioma Cerrado (Figura 6) (TININIS et al., 2006). Segundo Sleumer (1980), a espécie Casearia sylvestris possui duas variedades, Casearia sylvestris var sylvestris, encontrada em florestas úmidas e densas, e Casearia sylvestris var língua, restrita a ambientes abertos e secos (SLEUMER, 1980). A espécie Casearia sylvestris Swartz é conhecida no Brasil por diversos nomes populares, tais como guaçatonga, cafeeiro-do-mato, erva-de-lagarto e erva –de-bugre. A espécie é popularmente utilizada na fitoterapia brasileira pelas propriedades antiofídicas, antiinflamatórias, cicatrizantes, antivirais e antirreumáticas. Nos últimos anos, a Casearia sylvestris tem sido citada como espécie interessante do ponto de vista farmacológico pela atividade antitumoral e antiulcerogênica (SPANDRE et al., 2012). Figura 6: Folha da espécie Casearia sylvestris. Fonte: http://www.boldsystems.org/ 2.8 Sistemática Filogenética O objetivo da Sistemática Filogenética é entender as relações entre as espécies para inferir a história da vida desde sua origem, representando-a numa 27 estrutura de árvore, chamada Filogenia ou Árvore Filogenética. Diz-se então que a Sistemática infere de forma confiável as relações históricas a partir de similaridades (VIANA, 2007). Estas árvores podem ser representadas por grafos. Cada nó do grafo representa uma unidade taxonômica. Uma unidade taxonômica é uma unidade do sistema de classicação de espécies, podendo ser a própria espécie, ou outros agrupamentos como gêneros e até mesmo reinos. As arestas representam as relações de herança genética ou parentesco entre as unidades taxonômicas (OLIVEIRA, 2010). Existem três métodos comumente utilizados em estudos de sistemática filogenética: Cladistica, funcionando segundo o princípio da Máxima Parcimônia (MP); Maximum Likelihood (ML) e Inferência Bayesiana (IB). Nos últimos anos, vem sendo utilizado o método de Neighbor-Joining (NJ), que não é um método filogenético. Neighbor-Joining é um método muito utilizado em estudos de DNA Barcode e seu algoritmo foi criado por Saitou & Nei (1987) que gera uma única "árvore filogenética" final, que, segundo os autores, não necessariamente será a "árvore real". No passo inicial, ligam-se os dois neighbors (sequências) que têm a menor distância genética (PENÃ, 2011) . O método da Máxima Parcimônia é baseado na suposição de que a árvore mais provável é aquela que requer o menor número de mudanças para explicar toda a variação observada na matriz de caracteres (MARTINS, 2007). Os métodos Maximum Likelihood (ML) e Inferência Bayesiana (IB) são baseados em modelos estatísticos de evolução molecular. O método ML estima a probabilidade de quão bem a matriz de caracteres é explicada por árvores filogenéticas, enquanto IB estima a probabilidade de quão bem árvores filogenéticas são explicadas pelos dados (a matriz de caracteres) (PENÃ, 2011). 28 Objetivos 3. Objetivos Identificar espécies dos gêneros Senna, Lantana e Casearia, presentes na flora brasileira, pela técnica de DNA Barcoding para verificar a acurácia de banco de dados e melhorar a classificação taxonômica. 29 Material e Métodos 4. Material e Métodos 4.1 Obtenção das amostras Folhas das árvores selecionadas foram coletadas e armazenadas em sílica gel até o momento da extração de DNA, sendo quatro amostras do gênero Senna, uma do gênero Lantana e 31 do gênero Casearia. As amostras foram cedidas pela Profa. Dra. Maria Goretti de Vasconcelos Silva, da Universidade Federal do Ceará e, pelo Prof. Dr. Alberto José Cavalheiro, do Instituto de Química da Unesp de Araraquara/NuBBE. Todas as equipes que coletaram as amostras deste trabalho possuem autorização pelo órgão gestor e cadastro no Sistema de Autorização e Informação em Biodiversidade (Sisbio - IBAMA). A localidade das coletas, a identificação morfo-anatômica e o perfil químico das amostras está descita na Tabela 1. 30 Tabela 1: Localidade das coletas, identificação morfo-anatômica e perfíl químico das amostras. Amostra Localidade Identificação Perfil Químico Senna IBIAP – 01 Senna IBIAP – 02 Senna IBIAP – 03 Senna IBIAP – 04 Lippia IBIAP – 01 AJC CE 002 Município de Pacoti, CE Casearia sylvestris var. sylvestris AJC CE 003 Pico Alto, no município de Guaramiranga, CE Casearia sylvestris var. sylvestris AJC CE 004 Pico Alto, no município de Guaramiranga, CE Casearia sylvestris var. lingua AJC CE 005 Município de Mulungu, CE Casearia sylvestris var. sylvestris AJC CE 006 Guaraciaba do Norte, CE Família Sapindaceae AJC CE 007 Guaraciaba do Norte, CE Casearia arborea (Rich.) Urb. AJC CE 008 Guaraciaba do Norte, CE Casearia arborea (Rich.) Urb. AJC CE 009 Guaraciaba do Norte, CE C. cf. commersoniana Cambess. AJC CE 010 Guaraciaba do Norte, CE Casearia sp. AJC CE 011 Guaraciaba do Norte, CE Casearia cf. grandiflora Cambess. AJC CE 012 Guaraciaba do Norte, CE Casearia cf. grandiflora Cambess. AJC CE 013 Família Annonaceae AJC CE 014 Distrito de Inhuçu, CE Família Sapindaceae AJC CE 015 Entre os municípios de Ibiapina e Ubajara, CE Casearia sylvestris var. sylvestris AJC CE 016 Guazuma ulmifolia Lam. PRE05 Presidente Venceslau/SP Casearia sylvestris var. sylvestris/intermediária Rica em diterpenos 31 Amostra Localidade Identificação Perfil Químico CAM01 Campinas/SP Casearia sylvestris intermediária Rica em diterpenos; rica em fenólicos CAM07 Campinas/SP Casearia sylvestri var. lingua Rica em diterpenos; rica em fenólicos MOG01 Mogi-Guaçu/SP Casearia sylvestri var. lingua/intermediária Ricas em Diterpenos, Rica em fenólicos MOG04 Mogi-Guaçu/SP Casearia sylvestri var. lingua/intermediária Rica em fenólicos, presença de diterpenos LUI01 Luis Antônio/SP Casearia sylvestri var. lingua Rica em fenólicos LUI05 Luis Antônio/SP Casearia sylvestri var. lingua Rica em fenólicos LUI06 Luis Antônio/SP Casearia sylvestri var. lingua Rica em fenólicos ARA09 Araraquara/SP Casearia sylvestris intermediária Rica em fenólicos ARA13 Araraquara/SP Casearia sylvestri var. lingua Rica em fenólicos ARA14 Araraquara/SP Casearia sylvestris var. sylvestris Rica em Diterpenos, presença de fenólicos ANG02 Angatuba/SP Casearia sylvestris var. sylvestris/intermediária Rica em Diterpenos, presença de fenólicos CAR01 Cariri/CE Casearia sylvestri var. lingua Rica em fenólicos CAR05 Cariri/CE Casearia sylvestri var. lingua Rica em fenólicos CAC01 Cáceres/MT Casearia sylvestris intermediária Rica em fenólicos CAC05 Cáceres/MT Casearia sylvestris intermediária Rica em fenólicos PRE07 Presidente Venceslau/SP Casearia sylvestris var. sylvestris/intermediária Rica em diterpenos; presença de fenólicos PRE09 Presidente Venceslau/SP Casearia sylvestris var. sylvestris/intermediária Rica em diterpenos 32 Amostra Localidade Identificação Perfil Químico ANG01 Angatuba/SP Casearia sylvestris var. sylvestris/intermediária Rica em diterpenos; presença de fenólicos CAM03 Campinas/SP Casearia sylvestris var. sylvestris Rica em diterpenos MOG03 Mogi-Guaçu/SP Casearia sylvestris intermediária Rica em diterpenos; presença de fenólicos FLO01 Florianópolis/SC Casearia sylvestris var. sylvestris Rica em diterpenos FLO03 Florianópolis/SC Casearia sylvestris var. sylvestris Rica em diterpenos; presença de fenólicos FLO05 Florianópolis/SC Casearia sylvestris var. sylvestris Rica em diterpenos; presença de fenólicos CAR03 Cariri/CE Casearia sylvestri var. língua Rica em fenólicos CAC03 Cáceres/MT Casearia sylvestri var. lingua Rica em fenólicos Fonte: Próprio autor 33 A identificação morfo-anatômica foi realizada pela botânica Dra. Roseli Buzanelli Torres do Herbário do Instituto Agronômico de Campinas (IAC). O perfil químico das amostras foi realizado pelo NuBBE. 4.2 Extração de DNA O DNA foi extraído pelo protocolo CTAB (MURRAY; THOMPSON, 1980), como descrito a seguir: triturar 0,2 g de material vegetal de folhas secas, e colocar em tubos de microcentrífuga de 2 mL com microesferas de porcelana; adicionar 3 mL de tampão de extração CTAB (CTAB 0,053 M; NaCl 1,4 M; PVP 10000 2%; Tris 0,1 M pH 8,0; e EDTA 0,25 M pH 8,0) contendo beta–mercaptoetanol (0,2%): 20 μL de beta-mercaptoetanol para 10 mL de tampão; a maceração foi realizada no aparelho Precellys (Bertin Technnologies) a 6.500 g e temperatura ambiente para a lise celular e liberação do DNA; transferir o conteúdo macerado para um tubo de microcentrífuga de 2 mL, e deixar 30 minutos em banho-maria a 65° C; centrifugar a 20.000 g por 5 minutos e recuperar 400 μL do sobrenadante. Adicionar (volume/volume) de clorofórmio: isoamil álcool (24:1) (400 μL) e homogeneizar invertendo o tubo; centrifugar a 20.000 g por 5 minutos para separação dos ácidos nucleicos das proteínas, recuperar 300 μL do sobrenadante, adicionar 0,6 do volume de isopropanol (180 μL), e incubar 30 minutos a -4° C, para a precipitação do DNA. Após centrifugação a 20.000 g por 20 minutos, lavar o sedimento duas vezes com 900 μL de etanol 70%. Após o material ser precipitado, secar a vácuo por 6 minutos. Ressuspender a amostra em 50 μL de água ultrapura e incubar a 65° C por 30 minutos para dissolução completa do DNA; armazenar a -20° C até o momento do uso. O DNA foi quantificado em espectrofotômetro Epoch (Biotek) e diluído com água ultrapura autoclavada para 5 ng/mL. 34 4.3 Teste de temperatura de anelamento Foi realizado um teste para saber qual a temperatura ideal de anelamento na amplificação das regiões psbA-trnH e ITS2. A região rbcL foi padronizada previamente por Janúario, 2014, sendo a temperatura utilizada de 55° C. Foram utilizadas três amostras, uma do gênero Senna, uma do gênero Lantana e uma do gênero Casearia, denominadas S04, L01 e A04, respectivamente. Para as reações de amplificação foram utilizadas 1U da enzima Platinum® Taq DNA Polymerase (Invitrogen), 10 x PCR Buffer (200 mM Tris-HCl (pH 8,4), 500 mM KCl) (Invitrogen), 50 mM MgCl2 (Invitrogen), 10 mM dNTP (dNPT Mix Fermentas), Primer Forward e Primer Reverse a 10 mM, 5 ng de DNA e água ultrapura autoclavada q.s.p. 20 μL. As temperaturas testadas foram 54° C, 56° C e 58° C. Os produtos de amplificação da PCR foram separados em eletroforese em gel de agarose 1,0% em tampão TAE 1x (Tris 40 mM, ácido acético 40 mM e EDTA 1 mM), utilizando marcador de massa molecular de 1kb (Invitrogen), o gel foi posteriormente corado com brometo de etídio para visualização do DNA amplificado em transiluminador de luz ultravioleta AlphaImager® HP System (AlphaInnotech) e obtida a imagem digitalizada do gel. 4.4 Teste de concentração do DNA na PCR Foi realizado um teste para saber qual a concentração ideal de DNA para utilizar-se na PCR com os primers para as regiões rbcL, psbA-trnH e ITS2. Foram utilizadas duas amostras do gênero Casearia denominadas A13 e A14. O DNA das amostras foi extraído pelo protocolo CTAB, quantificado em espectrofotômetro Epoch (Biotek) e diluído com água ultrapura autoclavada para 5 ng/μL. 35 Para as reações de amplificação foi utilizada a enzima Platinum® Taq DNA Polymerase do mesmo modo que para o teste de temperatura citada no item 3.3 e as masas finais de DNA utilizadas no teste foram 2,5 ng, 5 ng e 7,5 ng. Os produtos de amplificação da PCR foram separados em eletroforese em gel de agarose 1,0% em tampão TAE 1x (Tris 40 mM, ácido acético 40 mM e EDTA 1 mM), utilizando marcador de massa molecular de 1kb (Invitrogen), sendo posteriormente corado com brometo de etídio para visualização do DNA amplificado em transiluminador de luz ultravioleta AlphaImager® HP System (AlphaInnotech) e obtida a imagem digitalizada do gel. 4.5 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) As reações de amplificação foram realizadas em tubos de microcentrífuga de 0,2 mL em termociclador Veriti (Applied Biosystems) conforme o protocolo da enzima Platinum® Taq DNA Polymerase, utilizando os primers da Tabela 2. Tabela 2: Lista de primers utilizados no trabalho. Primers Sequência 5’ – 3’ Referência psbA_f GTTATGCATGAACGTAATGCTC SANG et al., 1997. trnH_r CGCGCATGGTGGATTCACAATCC SANG et al., 1997. rbcLa_f ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC FAZEKAS et al., 2008. rbcLajf634R GAAACGGTCTCTCCAACGCAT FAZEKAS et al., 2008. ITS2_f CATCGATGAAGAACGCAGC LESKINEN; ALSTRÖM-RAPAPORT, 1999. ITS2_r TTCCTTCCGCTTATTGATATGC LESKINEN; ALSTRÖM-RAPAPORT, 1999. Fonte: Próprio autor 36 As ciclagens utilizadas foram as seguintes: para a região rbcL, 4 minutos a 95° C para desnaturação, seguido de 35 ciclos a 94° C por 30 segundos, 55° C por 1 minuto e 72° C por 1 minuto, e extensão final a 72° C por 10 minutos; para as regiões psbA-trnH e ITS2, 5 minutos a 94° C para desnaturação, seguido de 30 ciclos a 94° C por 30 segundo, 56° C por 30 segundos e 72° C por 45 segundos, e extensão final a 72° C por 10 minutos. 4.6 Eletroforese em gel de agarose Após a ciclagem, o produto de amplificação da PCR foi separado em eletroforese em gel de agarose 1% em tampão TAE 1x (Tris 40 mM, ácido acético 40 mM e EDTA 1 mM), utilizando um marcador de massa molecular de 1kb, sendo posteriormente corado com brometo de etídio para visualização do DNA amplificado em transiluminador de luz ultravioleta AlphaImager® HP System (AlphaInnotech) e obtida imagem digitalizada do gel para documentação e análise. 4.7 Purificação Os produtos de amplificação da PCR foram purificados com o GFX™ PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healthcare), de acordo com instruções do fabricante, posteriormente quantificados em espectrofotômetro Epoch (Biotek) e o produto purificado foi diluído para 5 ng/μL. 4.8 Reação de Sequenciamento A reação de sequenciamento foi realizada em ambas as fitas do DNA, forward e reverse, utilizando os mesmos iniciadores utilizados para amplificação por PCR (Tabela 2) conforme o protocolo do fabricante do BigDye® Terminator v3.1, utilizando a massa final de 5 ng do produto da PCR purificado. 37 A ciclagem utilizada para as três regiões foi a seguinte: um minuto a 96° C para desnaturação, seguido de 30 ciclos a 96° C por 15 segundos, 55° C por 15 segundos, para anelamento do primer, e 60° C por 4 minutos, para extensão. 4.9 Purificação e Precipitação Os produtos das reações de sequenciamento foram purificados e precipitados com etanol/EDTA, como descrito a seguir: Após a ciclagem, retirar os tubos do termociclador e centrifugar por 1 minuto. Transferir as amostras para uma placa de 96 poços e adicionar 2,5 μL de EDTA 125 mM e 25 μL de etanol 100%, em cada poço, selar a placa e envolvê-la em papel alumínio; misturar por inversão e incubar a temperatura ambiente e abrigo da luz por 15 minutos. Centrifugar a 2.500 g por 30 minutos a 4º C, imediatamente, destampar a placa e inverter para descartar o sobrenadante; centrifugar a 185 g por 15 segundos, adicionar 100 μL de etanol 70% em cada poço, selar a placa, e centrifugar a 2.500 g por 15 minutos a 4º C; inverter a placa para descartar o sobrenadante e centrifugar por 1 minuto a 185 g; deixar a placa secando no termociclador com a tampa aberta por 2 minutos a 90º C. Ressuspender as amostras na placa utilizando 10 μL de Formamida HI-DI (Applied Biosystems), colocar a placa em agitador, durante 1 minuto. Desnaturar as amostras a 95° C em termociclador Veriti (Applied Biosystems), com a tampa aberta por 3 minutos, e colocá-las no gelo por 3 minutos. 4.10 Eletroforese Capilar A eletroforese capilar foi realizada no analisador genético ABI 3500 (Applied Biosystems) com o polímero POP-7 (Applied Biosystems) e capilar de 50 cm (Applied Biosystems), conforme programa pré-determinado no ABI 3500. 38 4.11 Análise das Sequências As sequências foram feitas em duplicata, editadas, onde houve a deleção da sequência dos primers, e alinhadas no programa BioEdit (HALL, 1999) para obtenção da sequência consenso. As matrizes foram conferidas manualmente, com auxílio das ferramentas de bioinformática BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (ZHANG, 2000; MORGULIS, 2008) e BOLD Systems (The Barcode of Life Data Systems) (RATNASINGHAM; HEBERT, 2007), onde se encontram regiões de similaridade entre sequências locais, ou seja, sequências depositadas nestes bancos de dados. O programa compara as sequências de nucleotídeos ou sequências de proteínas com aquelas do banco de dados e calcula a significância estatística dos resultados (NATIONAL CENTER FOR BIOTECHNOLOGY INFORMATION). 4.12 Sistemática Filogenética Para construção das árvores filogenéticas foi utilizado o método Neighboor- Joining, pois é o método mais empregado para estudos de DNA Barcode e utilizou- se o programa MEGA6 (TAMURA et al., 2013). O suporte dos ramos resultantes foi obtido por bootstrap como método de reamostragem, utilizando 1000 réplicas. Para as análises filogenéticas e comparação dos gêneros nas árvores de rbcL, psbA-trnH, e ITS2 foram inseridas sequências (Tabela 3) obtidas no GenBank das espécies do gênero Casearia, Senna, Cassia e Lantana. A amostra denominada como pertencente ao gênero Lippia, após a realização das análises de sequenciamento, foi identificada como sendo do gênero Lantana, utilizando assim Lantana para comparação nestas análises. E para enraizamento da árvore, um grupo externo foi anexado para indicar que o mesmo está ramificado fora do grupo analisado. A escolha do grupo externo foi uma espécie que tivesse dados para as três regiões estudadas e que fosse distante dos grupos analisados. 39 Tabela 3: Número de acesso das sequências de DNA obtidas no GenBank (NCBI). rbcL psbA ITS2 Casearia barteri GI:480308538 GI:480310915 C. sylvestris GI:384596782 GI:313502339 C. praecox GI:384595510 GI:764013426 C. arborea GI:384595478 GI:313502335 C. javitensis GI:224382739 GI:441523765 C. velutina GI:756775987 GI:756777916 GI:756773334 C. glomerata GI:756778284 Senna occidentails GI:818946237 GI:312603436 GI:670735818 S. tora GI:670736082 GI:670735996 GI:670735824 S. alata GI:2343005 GI:670735978 GI:670735812 S. obtusifolia GI:818946235 GI:312603488 GI:267822408 S. auriculata GI:670736068 GI:670735984 GI:670735815 Cassia grandis GI:384590818 GI:764006902 GI:222354702 Lantana camara GI:270155965 GI:559072823 GI:33320127 Matayba guianensis GI:594551157 Guazuma ulmifolia GI:384595966 GI:313502417 Ephedranthus parviflorus GI:57338617 GI:56786873 Rhysotoechia bifoliolata GI:763902510 Bryum argenteum* GI:24021822 GI:27228014 GI:48857086 *grupo externo Fonte: Próprio autor 40 Resultados 5. Resultados 5.1 Extração de DNA A extração de DNA foi realizada com as folhas dessecadas das plantas selecionadas, utilizando o protocolo CTAB de Murray; Thompson (1980). Foram extraídos DNA de 46 amostras. A concentração do DNA extraído e a relação 260/280 estão presentes na Tabela 4. A relação 260/280 indica a pureza do DNA. Uma amostra de DNA é considerada pura quando apresenta esta razão entre 1,8 e 2,0. Se a razão for menor que estes valores possivelmente há contaminação com proteínas, fenol ou outros contaminantes que absorvem fortemente em 280 nm (PALMA et al., 2007). Tabela 4: Resultado da quantificação de DNA. Amostra Concentração (ng/μL) Relação 260/280 Senna IBIAP - 01 30,08 1,39 Senna IBIAP - 02 25,45 1,37 Senna IBIAP - 03 114,17 2 Senna IBIAP - 04 242,07 2,03 Lippia IBIAP - 01 365,98 1,97 AJC CE 002 796,39 1,92 AJC CE 003 139,32 1,74 AJC CE 004 1.234,98 2,11 AJC CE 005 243,87 2,02 AJC CE 006 186,33 1,9 AJC CE 007 117,92 2,04 AJC CE 008 76,51 2,05 AJC CE 009 126,48 2,04 41 Amostra Concentração (ng/μL) Relação 260/280 AJC CE 010 162,51 2,08 AJC CE 011 85,33 2,03 AJC CE 012 115,22 2,02 AJC CE 013 564,32 2,05 AJC CE 014 235,64 1,89 AJC CE 015 169,01 1,52 AJC CE 016 247,29 1,78 PRE05 300,8 1,76 CAM01 245,58 1,93 CAM07 421 1,89 MOG01 636,09 2,01 MOG03 559 1,94 MOG04 547 1,77 LUI01 30,82 1,68 LUI05 53,89 1,73 LUI06 46,123 1,82 ARA09 142,67 1,85 ARA13 480,68 2,05 ARA14 570,7 1,76 ANG02 235,02 1,95 CAR01 199,21 1,89 CAR05 108,91 2 CAC01 536,94 1,85 CAC05 175,08 1,99 PRE07 449 1,57 PRE09 765 1,48 ANG01 502 1,56 CAM03 501 1,75 MOG03 559 1,94 42 Amostra Concentração (ng/μL) Relação 260/280 FLO01 599,34 1,52 FLO03 316,84 1,50 FLO05 128,57 1,70 CAR03 30,11 1,32 CAC03 95,27 2,01 Fonte: Próprio autor 5.1 Teste de Temperatura de Anelamento Inicialmente, foram realizados testes para averiguar qual a melhor temperatura de anelamento dos primers para as regiões psbA-trnH e ITS2. A temperatura escolhida foi de 56° C, pois para região ITS2 foi a melhor temperatura, pois além da amostra L1, que foi amplificada nas três temperaturas, a amostra A04 foi amplificada somente a 56° C, e para região psbA-trnH também foi eficiente, podendo assim realizar as amplificações das duas regiões na mesma ciclagem. 43 Figura 7: Eletroforese em gel de agarose do teste de temperatura da região psbA- trnH (300 a 500 pb) (pente 1) e ITS2 (300 a 400 pb) (pente 2). (L) Marcador de Massa Molecular 1kb (Invitrogen). Amostras (S4) Senna IBIAP–04, (L1) Lippia IBIAP–01, (A04) AJC CE 004, (C-) controle da reação. 5.2 Teste de Concentração de DNA Posteriormente foram realizados testes de concentração de DNA para amplificação para os três marcadores. A concentração de DNA escolhida foi de 5 ng para amplificação por PCR para todos os marcadores; para a reação de sequenciamento, utilizou-se 5 ng do produto da PCR para reduzir o risco de perda do mesmo durante a purificação, assim, se ocorrer, ela não será significativa para a reação de sequenciamento. 500 pb 400 pb 300 pb 400 pb 300 pb 44 Figura 8: Eletroforese em gel de agarose do teste de concentrações. (L) Marcador de Massa Molecular 1kb (Invitrogen). Amostras (A13) Casearia sylvestris, (A14) Casearia sylvestris, (C-) controle da reação. 5.3 Amplificação por PCR e Sequenciamento Foram analisados 36 dos 46 DNA extraídos, de diferentes gêneros de plantas terrestres, Senna, Lantana e Casearia, para as regiões rbcL e psbA-trnH e 20, para a região ITS2. Nesta análise, não se obteve sucesso na amplificação das amostras PRE 07, PRE 09, ANG 01, CAM 03, MOG 03, FLO 01, FLO 03, FLO 05, CAR 03 e CAC 03 para as regiões rbcL e psbA-trnH. Os perfis de amplificação para as regiões rbcL, psbA-trnH e ITS2 estão documentados nas Figuras de 9 a 11. 45 Figura 9: Eletroforese em gel de agarose da amplificação da região rbcL. (L) Marcador de Massa Molecular 1kb (Invitrogen). Amostras (S1) Senna IBIAP -01, (S2) Senna IBIAP – 02, (S3) Senna IBIAP – 03, (S4) Senna IBIAP – 04, (L1) Lippia IBIAP – 01, (A2) AJC CE 002, (A3) AJC CE 003, (A4) AJC CE 004, (A5) AJC CE 005, (A6) AJC CE 006, (A7) AJC CE 007, (A8) AJC CE 008, (C-) controle da reação. Figura 10: Eletroforese em gel de agarose da amplificação da região psbA-trnH. (L) Marcador de Massa Molecular 1kb (Invitrogen). Amostras (S1) Senna IBIAP -01, (S2) Senna IBIAP – 02, (S3) Senna IBIAP – 03, (S4) Senna IBIAP – 04, (L1) Lippia IBIAP – 01, (A2) AJC CE 002, (A3) AJC CE 003, (A4) AJC CE 004, (A5) AJC CE 005, (A6) AJC CE 006, (A7) AJC CE 007, (A8) AJC CE 008, (C-) controle da reação. L S1 S2 S3 S4 L1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 C- L S1 S2 S3 S4 L1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 C- 600 pb 400 pb 500 pb 600 pb 500 pb 46 Figura 11: Eletroforese em gel de agarose da amplificação da região ITS2. (L) Marcador de Massa Molecular 1kb (Invitrogen). Amostras (S1) Senna IBIAP -01, (S2) Senna IBIAP – 02, (S3) Senna IBIAP – 03, (S4) Senna IBIAP – 04, (L1) Lippia IBIAP – 01, (A2) AJC CE 002, (A3) AJC CE 003, (A4) AJC CE 004, (A5) AJC CE 005, (A6) AJC CE 006, (A7) AJC CE 007, (A8) AJC CE 008, (C-) controle da reação. As amostras que não foram amplificadas nestes géis, foram repetidas posteriormente, obtendo-se, portanto, à amplificação das 36 amostras para as regiões rbcL e psbA-trnH e 20 amostras para região ITS2. O tamanho das sequências consenso após sequenciamento obtidas em pares de base (pb) está descrita na Tabela 5. Tabela 5: Tamanho das sequências consenso obtidas. Amostra ITS2 (pb) psbA (pb) rbcL (pb) Senna 01 307 326 558 Senna 02 266 363 569 Senna 03 305 292 524 L S1 S2 S3 S4 L1 A02 A03 A04 A05 A06 A07 A08 C- 300 pb 400 pb 47 Amostra ITS2 (pb) psbA (pb) rbcL (pb) Senna 04 302 348 536 Lippia 01 314 291 542 AJC CE 002 311 190 527 AJC CE 003 323 196 545 AJC CE 004 288 213 542 AJC CE 005 294 208 548 AJC CE 006 326 280 542 AJC CE 007 258 179 537 AJC CE 008 302 198 541 AJC CE 009 282 169 545 AJC CE 010 269 163 554 AJC CE 011 241 198 563 AJC CE 012 261 210 544 AJC CE 013 202 310 531 AJC CE 014 238 293 553 AJC CE 015 281 203 567 AJC CE 016 323 515 556 PRE05 NA 181 541 CAM 01 NA 216 576 CAM07 NA 257 487 MOG 01 NA 219 565 MOG04 NA 177 472 LUI 01 NA 223 552 LUI 05 NA 271 468 LUI 06 NA 214 554 ARA 09 NA 214 485 ARA13 NA 163 554 ARA14 NA 197 559 ANG 02 NA 252 554 48 Amostra ITS2 (pb) psbA (pb) rbcL (pb) CAR 01 NA 214 549 CAR 05 NA 206 568 CAC 01 NA 210 360 CAC 05 NA 257 437 NA – não amplificadas. Fonte: Próprio autor Os resultados obtidos da análise das sequências constam das Tabelas 6 a 8. Tabela 6: Resultados obtidos no BLAST para região rbcL (03 de junho 2015). Amostra Espécie Max Score Total Score Query Cover E- value Ident. Query lenght Senna 01 Senna tora 1022 1022 100% 0.0 99% 558 Senna 02 Senna tora 1046 1046 100% 0.0 99% 569 Senna 03 Cassia javanica 941/935 941/935 100% 0.0 99% 524 Senna 04 Cassia roxburghii 985/979 985/979 100% 0.0 99% 536 Lippia 01 Lantana camara 1002 1002 100% 0.0 100% 542 AJC CE 002 Casearia sylvestris 968 968 100% 0.0 99% 527 AJC CE 003 Casearia sylvestris 994 994 100% 0.0 99% 545 AJC CE 004 Casearia sylvestris 996 996 100% 0.0 99% 542 AJC CE 005 Casearia sylvestris 994 994 100% 0.0 99% 548 AJC CE 006 Matayba guianensis 1002 1002 100% 0.0 100% 542 AJC CE 007 Casearia sylvestris 953 953 100% 0.0 99% 537 AJC CE 008 Casearia sylvestris 961 961 100% 0.0 99% 541 AJC CE 009 Casearia javitensis 1007 1007 100% 0.0 100% 545 AJC CE 010 Casearia sylvestris 996 996 100% 0.0 99% 554 AJC CE 011 Casearia sylvestris 1002 1002 100% 0.0 99% 563 AJC CE 012 Casearia sylvestris 972 972 100% 0.0 99% 544 AJC CE 013 Ephedranthus parviflorus 981 981 100% 0.0 100% 531 AJC CE 014 Matayba guianensis 1022 1022 100% 0.0 100% 553 AJC CE 015 Casearia sylvestris 1022 1022 100% 0.0 99% 567 49 Amostra Espécie Max Score Total Score Query Cover E- value Ident. Query lenght AJC CE 016 Guazuma ulmifolia 1027 1027 100% 0.0 100% 556 PRE05 Casearia sylvestris 987 987 100% 0.0 99% 541 CAM 01 Casearia sylvestris 1051 1051 100% 0.0 99% 576 CAM07 Casearia sylvestris 845 845 100% 0.0 98% 487 MOG 01 Casearia sylvestris 1038 1038 100% 0.0 99% 565 MOG04 Casearia sylvestris 863 863 99% 0.0 99% 472 LUI 01 Casearia sylvestris 1007 1007 100% 0.0 99% 552 LUI 05 Casearia sylvestris 865 865 100% 0.0 100% 468 LUI 06 Casearia sylvestris 998 998 100% 0.0 99% 554 ARA 09 Casearia sylvestris 878 878 100% 0.0 99% 485 ARA13 Casearia sylvestris 1018 1018 100% 0.0 99% 554 ARA14 Casearia sylvestris 1027 1027 100% 0.0 99% 559 ANG 02 Casearia sylvestris 1016 1016 100% 0.0 99% 554 CAR 01 Casearia sylvestris 1000 1000 99% 0.0 99% 549 CAR 05 Casearia sylvestris 1050 1050 100% 0.0 100% 568 CAC 01 Casearia sylvestris 665 665 100% 0.0 100% 360 CAC 05 Casearia sylvestris 795 795 100% 0.0 99% 437 Fonte: Próprio autor Tabela 7: Resultados obtidos no BLAST para região psbA-trnH (03 de junho 2015). Amostra Espécie Max Score Total Score Query Cover E-value Ident. Query lenght Senna 01 Caesalpinia eriostachys 490 490 100% 6,00E-135 94% 326 Senna 02 Caesalpinia eriostachys 505 505 99% 2,00E-139 92% 363 Senna 03 Senna tora 407 407 100% 6,00E-110 92% 292 Senna 04 Cassia javanica 601 601 97% 3,00E-168 99% 348 Lippia 01 Lantana camara 532 532 100% 9,00E-148 99% 291 AJC CE 002 Casearia praecox 329 329 100% 8,00E-87 98% 191 50 Amostra Espécie Max Score Total Score Query Cover E-value Ident. Query lenght AJC CE 003 Casearia praecox 344 344 100% 3,00E-91 98% 196 AJC CE 004 Casearia praecox 375 375 100% 1,00E-100 99% 213 AJC CE 005 Casearia praecox 318 318 87% 2,00E-83 98% 208 AJC CE 006 Rhysotoechia bifoliolata 470 470 93% 7,00E-129 99% 280 AJC CE 007 Casearia arborea 281 281 87% 2,00E-72 99% 179 AJC CE 008 Casearia arborea 316 316 88% 6,00E-83 99% 198 AJC CE 009 Casearia javitensis 305 305 100% 1,00E-79 99% 169 AJC CE 010 Casearia decandra 176 176 100% 9,00E-41 86% 163 AJC CE 011 Casearia arborea 309 309 86% 1,00E-80 99% 198 AJC CE 012 Casearia arborea 311 311 83% 3,00E-81 99% 210 AJC CE 013 Ephedranthus parviflorus 562 562 100% 1,00E-156 99% 310 AJC CE 014 Rhysotoechia bifoliolata 483 483 91% 9,00E-133 99% 293 AJC CE 015 Casearia sylvestris 303 303 86% 5,00E-79 98% 203 AJC CE 016 Guazuma ulmifolia 952 952 100% 0.0 100% 515 PRE05 Casearia praecox 318 318 100% 2,00E-83 98% 181 CAM 01 Casearia sylvestris 355 355 95% 1,00E-94 98% 216 CAM07 Casearia sylvestris 361 361 80% 4,00E-96 98% 257 MOG 01 Casearia praecox 381 381 100% 2,00E-102 98% 219 MOG04 Casearia sylvestris 219 219 68% 2,00E-53 99% 177 LUI 01 Casearia sylvestris 357 357 91% 4,00E-95 98% 223 LUI 05 Casearia praecox 309 449 91% 1,00E-80 98% 271 LUI 06 Casearia praecox 268 268 80% 2,00E-68 95% 214 ARA 09 Casearia sylvestris 361 361 96% 3,00E-96 98% 214 51 Amostra Espécie Max Score Total Score Query Cover E-value Ident. Query lenght ARA13 Casearia barteri 143 143 88% 6,00E-31 81% 163 ARA14 Casearia sylvestris 294 294 90% 3,00E-76 97% 197 ANG 02 Casearia sylvestris 283 283 82% 8,00E-73 91% 252 CAR 01 Casearia sylvestris 357 357 95% 4,00E-95 98% 214 CAR 05 Casearia sylvestris 368 368 100% 2,00E-98 99% 206 CAC 01 Casearia sylvestris 289 289 95% 1,00E-74 93% 210 CAC 05 Casearia sylvestris 296 296 80% 1,00E-76 92% 257 Fonte: Próprio autor Tabela 8: Resultados obtidos no BLAST para região ITS2 (03 de junho 2015). Amostra Espécie Max Score Total Score Query Cover E-value Ident. Query lenght Senna 01 Poincianella pluviosa 531 531 97% 3,00E-147 98% 317 Senna 02 Poincianella pluviosa 453 453 100% 6,00E-124 97% 266 Senna 03 Senna gardneri 481 481 99% 3,00E-132 95% 305 Senna 04 Cassia grandis 540 540 100% 5,00E-150 99% 302 Lippia 01 Aloysia triphylla 270 270 65% 8,00E-69 90% 314 AJC CE 002 Fungal endophyte 87.9 87.9 40% 9,00E-14 80% 311 AJC CE 003 Teratosphaeria nubilosa 119 119 37% 3,00E-23 85% 323 AJC CE 004 Casearia velutina 451 451 100% 2,00E-123 95% 288 AJC CE 005 Uncultured endophytic fungus 239 239 89% 2,00E-59 83% 294 AJC CE 006 Matayba guianensis 508 508 98% 2,00E-140 95% 326 AJC CE 007 Uncultured Cladosporium 364 364 96% 3,00E-97 93% 258 AJC CE 008 Calicium sp. 141 141 36% 6,00E-30 90% 302 AJC CE 009 Scleroramularia shaanxiensis 237 237 100% 7,00E-59 82% 282 AJC CE 010 Zasmidium rothmanniae 180 180 45% 1,00E-41 93% 269 AJC CE 011 Uncultured fungus 183 183 48% 8,00E-43 95% 241 52 Amostra Espécie Max Score Total Score Query Cover E-value Ident. Query lenght AJC CE 012 Botryosphaeriales sp. 211 211 100% 4,00E-51 82% 260 AJC CE 013 Ascomycota sp. 180 180 72% 9,00E-42 89% 202 AJC CE 014 Matayba guianensis 361 361 98% 3,00E-96 94% 238 AJC CE 015 Casearia glomerata 350 350 100% 9,00E-93 89% 281 AJC CE 016 Guazuma ulmifolia 542 542 99% 2,00E-150 97% 323 Fonte: Próprio autor 5.3.1 Comparação com sequências de Banco de Dados Foi desenvolvido um banco de dados para DNA Barcode chamado BOLD Systems (RATNASINGHAM; HEBERT, 2007), onde há sequências de DNA de animais, região COI; fungos, região ITS e plantas, região rbcL e matK. A comparação dos dados encontrados em ambos bancos de dados, BLAST e BOLD Systems está apresentada nas Tabelas 9 e 10. Tabela 9: Comparação dos resultados entre banco de dados para região rbcL. AMOSTRA BOLD Systems BLAST SENNA 01 Senna tora Senna tora SENNA 02 Senna tora Senna tora SENNA 03 Senna rizzini Cassia javanica SENNA 04 Cassia javanica subsp. nodosa Cassia roxburghii LIPPIA 01 Lantana camara Lantana camara AJC CE 002 Malpighiales Casearia sylvestris AJC CE 003 Casearia sylvestris Casearia sylvestris AJC CE 004 Casearia sylvestris Casearia sylvestris AJC CE 005 Casearia sylvestris Casearia sylvestris AJC CE 006 Synima reynoldsiae Matayba guianensis AJC CE 007 Casearia arborea Casearia sylvestris AJC CE 008 Casearia sylvestris Casearia sylvestris AJC CE 009 Casearia javitensis Casearia javitensis AJC CE 010 Casearia sylvestris Casearia sylvestris 53 AMOSTRA BOLD Systems BLAST AJC CE 011 Casearia sylvestris Casearia sylvestris AJC CE 012 Casearia sylvestris Casearia sylvestris AJC CE 013 Ephedranthus sp. Ephedranthus parviflorus AJC CE 014 Synima reynoldsiae Matayba guianensis AJC CE 015 Casearia sylvestris Casearia sylvestris AJC CE 016 Guazuma ulmifolia Guazuma ulmifolia PRE05 Casearia sylvestris Casearia sylvestris CAM 01 Casearia sylvestris Casearia sylvestris CAM07 Malpighiales Casearia sylvestris MOG 01 Casearia sylvestris Casearia sylvestris MOG04 Malpighiales Casearia sylvestris LUI 01 Casearia sylvestris Casearia sylvestris LUI 05 Casearia sylvestris Casearia sylvestris LUI 06 Casearia sylvestris Casearia sylvestris ARA 09 Casearia sylvestris Casearia sylvestris ARA13 Casearia sylvestris Casearia sylvestris ARA14 Casearia sylvestris Casearia sylvestris ANG 02 Casearia sylvestris Casearia sylvestris CAR 01 Casearia sylvestris Casearia sylvestris CAR 05 Casearia sylvestris Casearia sylvestris CAC 01 Malpighiales Casearia sylvestris CAC 05 Casearia sylvestris Casearia sylvestris Fonte: Próprio autor Tabela 10: Comparação dos resultados entre banco de dados para região ITS2. AMOSTRA BOLD Systems BLAST SENNA 01 Caesalpinia sappan Poincianella pluviosa SENNA 02 Caesalpinia sappan Poincianella pluviosa SENNA 03 Cassia auriculata Senna gardneri SENNA 04 Cassia fistula Cassia grandis. LIPPIA 01 Phyla nodiflora Aloysia triphylla AJC CE 002 Mycosphaerella coffeicola Fungal endophyte AJC CE 003 Teratosphaeria nubilosa Teratosphaeria nubilosa AJC CE 004 Populus alba Casearia velutina 54 AMOSTRA BOLD Systems BLAST AJC CE 005 Cladosporium perangustum Uncultured endophytic fungus AJC CE 006 Sapindus emarginatus Matayba guianensis AJC CE 007 Cladosporium sphaerospermum Uncultured Cladosporium AJC CE 008 Populus alba Calicium sp. AJC CE 009 Scleroramularia shaanxiensis Scleroramularia shaanxiensis AJC CE 010 Rimularia furvella Zasmidium rothmanniae AJC CE 011 Peltaster sp. Uncultured fungus AJC CE 012 Cladosporium sphaerospermum Botryosphaeriales sp. AJC CE 013 Pseudocercospora sp. Ascomycota sp. AJC CE 014 Sapindus emarginatus Matayba guianensis AJC CE 015 No Match Casearia glomerata AJC CE 016 Malva parviflora Guazuma ulmifolia Fonte: Próprio autor A comparação não pode ser feita com a região psbA-trnH pois não há registros no BOLD Systems. 5.4 Sistemática Filogenética As árvores desenvolvidas com o método Neighboor-Joining estão demonstradas nas Figuras 12 e 17. Os alinhamentos das sequências analisadas neste trabalho estão apresentados nos Apêndices de A a H. 55 Figura 12: Árvore filogenética construída a partir do marcador rbcL com o gênero Casearia. O grupo externo* é a espécie Bryum argenteum Hedw. * 56 Figura 13: Árvore filogenética construída a partir do marcador psbA-trnH com o gênero Casearia. O grupo externo* é a espécie Bryum argenteum Hedw. * 57 Figura 14: Árvore filogenética construída a partir do marcador ITS2 com o gênero Casearia. O grupo externo* é a espécie Bryum argenteum Hedw. 58 Figura 15: Árvore filogenética construída a partir do marcador rbcL com os gêneros Senna e Lantana. O grupo externo* é a espécie Bryum argenteum Hedw. Figura 16: Árvore filogenética construída a partir do marcador psbA-trnH com os gêneros Senna e Lantana. O grupo externo* é a espécie Bryum argenteum Hedw. 59 Figura 17: Árvore filogenética construída a partir do marcador ITS2 com os gêneros Senna e Lantana. O grupo externo* é a espécie Bryum argenteum Hedw. Figura 18: Árvore filogenética construída a partir do marcador rbcL com os gêneros Matayba, Guazuma e Ephedranthus. O grupo externo* é a espécie Bryum argenteum Hedw. 60 Figura 19: Árvore filogenética construída a partir do marcador psbA-trnH com os gêneros Matayba, Guazuma e Ephedranthus. O grupo externo* é a espécie Bryum argenteum Hedw. 5.5 Análises dos resultados obtidos Após as análises os resultados foram agrupados na Tabela 11 para interpretação com maior clareza. Foi observado que as espécies encontradas para as diferentes regiões pertencem a mesma família. A região ITS2 apresentou em algumas amostras identidade com fungos endofíticos. 61 Tabela 11: Resumo dos resultados encontrados no BLAST com a classificação de família. Amostra rbcL psbA ITS2 Família Identificação Senna 01 Senna tora Caesalpinia eriostachys Poincianella pluviosa Fabaceae - Senna 02 Senna tora Caesalpinia eriostachys Poincianella pluviosa Fabaceae - Senna 03 Cassia javanica Senna tora Senna gardneri Fabaceae - Senna 04 Cassia roxburghii Cassia javanica Cassia grandis Fabaceae - Lippia 01 Lantana camara Lantana camara Aloysia triphylla Verbenaceae - AJC CE 002 Casearia sylvestris Casearia praecox Fungal endophyte* Flacourtiaceae Casearia sylvestris var. sylvestris AJC CE 003 Casearia sylvestris Casearia praecox Teratosphaeria nubilosa* Flacourtiaceae Casearia sylvestris var. sylvestris AJC CE 004 Casearia sylvestris Casearia praecox Casearia velutina Flacourtiaceae Casearia sylvestris var. lingua AJC CE 005 Casearia sylvestris Casearia praecox Uncultured endophytic fungus* Flacourtiaceae Casearia sylvestris var. sylvestris AJC CE 006 Matayba guianensis Rhysotoechia bifoliolata Matayba guianensis Sapindaceae Família Sapindaceae AJC CE 007 Casearia sylvestris Casearia arborea Uncultured Cladosporium* Flacourtiaceae Casearia arborea AJC CE 008 Casearia sylvestris Casearia arborea Calicium sp.* Flacourtiaceae Casearia arborea AJC CE 009 Casearia javitensis Casearia javitensis Scleroramularia shaanxiensis* Flacourtiaceae C. cf. commersoniana AJC CE 010 Casearia sylvestris Casearia decandra Zasmidium rothmanniae* Flacourtiaceae Casearia sp. AJC CE 011 Casearia sylvestris Casearia arborea Uncultured fungus* Flacourtiaceae Casearia cf. grandiflora AJC CE 012 Casearia sylvestris Casearia arborea Botryosphaeriales sp.* Flacourtiaceae Casearia cf. grandiflora AJC CE 013 Ephedranthus parviflorus Ephedranthus parviflorus Ascomycota sp.* Annonaceae Família Annonaceae AJC CE 014 Matayba guianensis Rhysotoechia bifoliolata Matayba guianensis Sapindaceae Família Sapindaceae AJC CE 015 Casearia sylvestris Casearia sylvestris Casearia glomerata Flacourtiaceae Casearia sylvestris var. sylvestris AJC CE 016 Guazuma ulmifolia Guazuma ulmifolia Guazuma ulmifolia Sterculiaceae Guazuma ulmifolia 62 *Fungos endofíticos; NA – Não Avaliada. Fonte: Próprio autor Amostra rbcL psbA ITS2 Família Identificação PRE05 Casearia sylvestris Casearia praecox NA Flacourtiaceae Casearia sylvestris var. sylvestris/intermediária CAM 01 Casearia sylvestris Casearia sylvestris NA Flacourtiaceae Casearia sylvestris intermediária CAM07 Casearia sylvestris Casearia sylvestris NA Flacourtiaceae Casearia sylvestri var. lingua MOG 01 Casearia sylvestris Casearia praecox NA Flacourtiaceae Casearia sylvestri var. lingua/intermediária MOG04 Casearia sylvestris Casearia sylvestris NA Flacourtiaceae Casearia sylvestri var. lingua/intermediária LUI 01 Casearia sylvestris Casearia sylvestris NA Flacourtiaceae Casearia sylvestri var. lingua LUI 05 Casearia sylvestris Casearia praecox NA Flacourtiaceae Casearia sylvestri var. lingua LUI 06 Casearia sylvestris Casearia praecox NA Flacourtiaceae Casearia sylvestri var. lingua ARA 09 Casearia sylvestris Casearia sylvestris NA Flacourtiaceae Casearia sylvestris intermediária ARA13 Casearia sylvestris Casearia barteri NA Flacourtiaceae Casearia sylvestri var. lingua ARA14 Casearia sylvestris Casearia sylvestris NA Flacourtiaceae Casearia sylvestris var. sylvestris ANG 02 Casearia sylvestris Casearia sylvestris NA Flacourtiaceae Casearia sylvestris var. sylvestris/intermediária CAR 01 Casearia sylvestris Casearia sylvestris NA Flacourtiaceae Casearia sylvestri var. lingua CAR 05 Casearia sylvestris Casearia sylvestris NA Flacourtiaceae Casearia sylvestri var. lingua CAC 01 Casearia sylvestris Casearia sylvestris NA Flacourtiaceae Casearia sylvestris intermediária CAC 05 Casearia sylvestris Casearia sylvestris NA Flacourtiaceae Casearia sylvestris intermediária 63 Discussão 6. Discussão A busca por um barcode para plantas terrestres vem gerado várias discussões, mas ainda não foi possível chegar a um padrão como para animais e fungos. Um DNA barcode ideal deve ser rotineiramente recuperável com um único par de primers, ser passível de sequenciamento bidirecional com pouca exigência de edição manual e fornecer discriminação máxima entre as espécies (HOLLINGSWORTH et al., 2009). Neste trabalho foi avaliado a eficácia de três loci (psbA-trnH, rbcL e ITS2) descritos como DNA barcode para identificação das espécies dos gêneros Senna, Lantana e Casearia, as quais estão inseridas dentro de importantes biomas brasileiros, o Cerrado e a Caatinga. Dentro dos três loci escolhidos para este trabalho, as regiões rbcL e psbA- trnH mostraram-se eficientes na PCR e no sequenciamento, pois são regiões fáceis de amplificar e as sequências obtidas são de boa qualidade, necessitando de pouca edição manual. Segundo Hollingsworth et al., (2009), as duas regiões possuem atributos desejáveis para um barcode de plantas terrestres, mas elas não preenchem os três critérios, ser rotineiramente recuperável com um único par de primers, ser passível de sequenciamento bidirecional com pouca exigência de edição manual e fornecer discriminação máxima entre as espécies, perfeitamente. A região psbA-trnH tem uma boa amplificação com um único par de primers e possui alto nível de discriminação, porém há problemas em se obter sequências bidirecionais de alta qualidade. A região rbcL é fácil de amplificar por PCR e de se obter sequências bidirecionais de alta qualidade, porém é uma região pouco variável, já que ela codifica a proteína ribulose-1,5-bisfosfato que é muito importante para fotossíntese. 64 Após o sequenciamento da região ITS2 verificou-se algumas dificuldades no processamento das amostras, como problemas com sequências de baixa qualidade e identidade com fungos endofíticos como relatado anteriormente. O termo endófito, originalmente descrito por De Bary em 1866, refere-se a qualquer micro-organismo que vive nos tecidos de plantas, distinguindo-se dos epifíticos que vivem na superfície. Os fungos endofíticos são um grupo diversificado de ascomicetos definidos por sua ocorrência assintomática nos tecidos vegetais. Chen et al., 2010 comentaram que na Conferência de DNA Barcode na Cidade do México foi relatado que uma parcela significativa dos registros de plantas para ITS2 no GenBank são sequências de fungos endófitos. Porém, em seu trabalho, com as sequências ITS2, analisadas usando BLAST, não encontrou quaisquer sequências fúngicas, devido ao conjunto de primers utilizados. Por ser uma metodologia recente, não há sequências de dados nos bancos suficientes para suprir a necessidade das análises. Porém, avaliando os resultados encontrados, as espécies identificadas, para as três regiões estudas, pertencem à mesma família. Para a região rbcL, a discriminação de espécies foi de 84,37%, para a região psbA-trnH foi de 62,5%, e para região ITS2 foi de 20%. Esse resultado é para as amostras com identificação morfo-anatômica. Nesta análise não foi possível identificar a variedade da espécie. Quanto a comparação com sequências de bancos de dados, para região rbcL, 75% das amostras foram identificadas sendo a mesma espécie nos dois bancos analisados, e para região ITS2 foi de 15%. O BOLD Systems por ser um banco de dados para DNA Barcode é um banco mais confiável, porém mais recente que o BLAST, tendo assim algumas falhas na identificação de espécies. Dentro da topologia gerada a partir do método de Neighboor-Joining, no geral, a maioria das espécies se agruparam em seus respectivos gêneros. A região psbA-trnH apresentou árvores com maiores bootstrap para todos os gêneros analisados, apesar de algumas falhas. Bootstrap mede a força de apoio (“confiança”) para o ramo de espécies: Se não há evidência clara para isso, uma atribuição confiante pode não ser possível 65 por qualquer método de atribuição de barcode, a menos que, todas as informações relevantes de haplótipos forem amostrados (FAZEKAS et al., 2008). As informações geradas em estudos de DNA Barcode com a disponibilização dos dados em banco de dados de acesso público possibilitará avanços científicos sobre o tema, e podendo auxiliar a taxonomia na identificação de espécies. 66 Conclusão 7. Conclusão Com os resultados obtidos neste trabalho, observou que a metodologia de DNA Barcoding é uma ferramenta aplicável para identificação das espécies vegetais aqui estudadas. Observou-se que a amostra apresentada como pertencente ao gênero Lippia, na verdade pertence ao gênero Lantana. Ambos os gêneros são da família Verbenaceae. Mostrou também que a região rbcL é uma ótima região para amplificação e sequenciamento, onde a discriminação de espécies foi de 84,37%, porém não foi muito eficiente para as análises filogenéticas. A região psbA-trnH é menos efetiva na discriminação de espécie que a região rbcL, mas em análises filogenéticas têm uma melhor cobertura. A região ITS2 apresentou identidade com sequência de fungos, mostrando uma dificuldade na utilização desta região, porém foi a melhor região nas análises filogenéticas, com maiores valores de bootstraps, provavelmente devido as sequências de fungos. Para análises de DNA Barcode para discriminação de espécies a melhor região é a rbcL, pois foi possível identificar ao nível de espécie 84,37% das amostras, e os 15,63% restantes, ao nível de gênero. 67 Referências Referências BRASIL. Ministério do Meio Ambiente. Biodiversidade brasileira. Disponível em: . Acesso em: 10 set. 2013. CAVALLARI, M. M; BILLOT, C.; BOUVET, J.-M.; FAVREAU, B.; ZUCCHI, M. I.; PALMIERI D. A.; GIMENES, M. A. Isolation and characterization of microsatellite markers for Casearia sylvestris Sw. (Salicaceae), a neotropical medicinal tree. Molecular Ecology Resources, v. 8, n. 4, p. 802-804, 2008. CHEN, S.; YAO, H.; HAN, J.; LIU, C.; SONG, J.; SHI, L.; ZHU, Y.; MA, X.; GAO, T.; PANG, X.; LUO, K.; LI, Y.; LI, X.; JIA, X.; LIN, Y.; LEON, C. Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species. PLoS ONE, v. 5, n. 1, 2010. doi:10.1371/journal.pone.008613. CONSORTIUM FOR THE BARCODE OF LIFE. What is DNA barcoding? Disponível em: . 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J.; HOLLINGSWORTH, M. L.; HUSBAND, B. C.; KELLY, L. J.; KESANAKURTI, P. R.; KIM, J. S.; KIM, Y.-D.; LAHAYE, R.; LEE, H.- L.; LONG, D. G.; MADRIÑÁN, S.; MAURIN, O.; MEUSNIER, I.; NEWMASTER, S. G.; PARK, C.-W.; PERCY, D. P.; PETERSEN, G.; RICHARDSON, J. E.; SALAZAR, G. A.; SAVOLAINEN, V.; SEBERG, O.; WILKINSON, M. J.; YI, D.-K.; LITTLE, D. P. A DNA barcode for land plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 106, n. 31, p. 12794- 12797, 2009. JANÚARIO, B. B. Aplicação de código de barras de DNA (DNA barcoding) na identificação das espécies Senna Mill (Fabaceae) e Casearia Jacq. (Salicaceae) para estudos de variabilidade genética. 2014. 71 f. Dissertação (Mestrado em Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia) - Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade Estadual Paulista, Araraquara, 2014. JOLY, C. A.; HADDAD, C. F. B.; VERDADE, L. M.; OLIVEIRA, M. C.; BOLZANI, V. S. Science plan and strategies for the next decade. 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-------------------------------------------TATTATACTCCTGACTA 02AJC ---------------GGCTGGTGTTAAAGATTATAAATTGACTTATTATACTCCTGACTA 1MOG-Casearia-sylvestris -------------TTAAAGATTATAAATT-GACTTAT---------TATACTCCTGACTA 1CAM-Casearia-sylvestris --------------GGCTGGTGTTAAAGATTATAAATTTGACTTATTATACTCCTGACTA 04AJC-Casearia-sylvestris ------------------GATTATAA----------ATTGACTTATTATACTCCTGACTA 03AJC-Casearia-sylvestris --------------------------------------GACTTATTATACTCCTTGACTA 05AJC-Casearia-sylvestris -----------------------------------------TTATTATACTCCTTGACTA 15AJC-Casearia-sylvestris ----------------GGTGTTAAAGAATTTATAAATTGGACTTATTATACTCCTGACTA 2ANG-Casearia-sylvestris --------------------------AAGATTATAAATTGACTTATTATACTCCTGACTA 13ARA-Casearia-sylvestris -------------------------AAAGATTATAAATTGACTTATTATACTCCTGACTA 14ARA-Casearia-sylvestris ---------------------TGTTAAAGATTATAAATTGACTTATTATACTCCTGACTA 1CAR-Casearia-sylvestris -------------AGGGCGGGTGTTAAAGATTATAAATTGACTTATTATACTCCTGACTA 5CAR-Casearia-sylvestris ---------------GGCTGGTGTTAAAGATTATAAATTGACTTATTATACTCCTGACTA 1LUI-Casearia-sylvestris -----------------------TTAAAGATTATAAATTGACTTATTATACTCCTGACTA 6LUI-Casearia-sylvestris -----------------------------TTATAAATTTGACTTATTATACTCCTGACTA 7CAM-Casearia-sylvestris -----------------------------------AAATGGACTTATTATCTCCTGACTA 4MOG-Casearia-sylvestris ---------------------------------TTAATTGACTTATTATACTCCTGACTA Casearia-sylvestris AAGTGTTGGATTCANGGCTGGTGTTAAAGATTATAAATTGACTTATTATACTCCTGACTA 72 1CAC-Casearia-sylvestris ------------------------------------------------------------ 5LUI-Casearia-sylvestris ------------------------------------------------------------ 5CAC-Casearia-sylvestris ------------------------------------------------------------ 07AJC-Casearia-sylvestris TGAAACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATTCCGA-GTAACTCCTCAACCCGGGGTTC 08AJC-Casearia-sylvestris TGAAACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATTCCGA-GTAACTCCTCAACCCGGGGTTC 12AJC-Casearia-sylvestris 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15AJC-Casearia-sylvestris TGAAACCAAAGATACTGATATTTTGGCAGCATTCCGA-GTAACTCCTCAACCCGGGGTTC 2ANG-Casearia-sylvestris TGAAACCAAAGATACTGATATTCTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCCGGGGTTC 13ARA-Casearia-sylvestris TGAAACCAAAGATACTGATATTTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCA-ACCCGGGGTTC 14ARA-Casearia-sylvestris TGAAACCAAAGATACTGATATTTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAA-CCCGGGGTTC 1CAR-Casearia-sylvestris TGAAACCAAAGATACTGATATTTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCC-GGGGTTC 5CAR-Casearia-sylvestris TGAAACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCC-GGGGTTC 1LUI-Casearia-sylvestris TGAAACCAAAGATACTGATATTTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACC-CGGGGTTC 6LUI-Casearia-sylvestris TGAAACCAAAGATACTGATATTTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCCGGGGTTCC 7CAM-Casearia-sylvestris TGAAACCAAAGATACTGATATTAAATAAAAATTCCGAGTAACTCCTCAACCCGGG-GTTC 4MOG-Casearia-sylvestris TGAAACCAAAGATACTGATATTTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCCGGG-GTTC 73 Casearia-sylvestris TGAAACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCCGGG-GTTC 1CAC-Casearia-sylvestris ---------------------------------CCGAGTAACTCCTCAACCCGGG-GTTC 5LUI-Casearia-sylvestris -----------GCAGGAGCCGCGGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTG 5CAC-Casearia-sylvestris --------------------TAGCTGCTGAA---TCTTCTACTGGTACATTGGACAACTG 07AJC-Casearia-sylvestris CGCCTGAGGAAGCAGGAGCCGCGGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTG 08AJC-Casearia-sylvestris CGCCTGAGGAAGCAGGAGCCGCGGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTG 12AJC-Casearia-sylvestris CGCCTGAGGAAGCAGGAGCCGCGGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTG 11AJC-Casearia-sylvestris CGCCTGAGGAAGCAGGAGCCGCGGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTG 09AJC-Casearia-javitensis CGCCTGAGGAAGCAGGAGCCGCGGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTG 10AJC-Casearia-sylvestris CGCCTGAGGAAGCAGGAGCCGCGGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTG 9ARA-Casearia-sylvestris CGCCTGAGGAAGCAGGAGCCGCGGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTG 5PRE-Casearia-sylvestris CGCCTGAGGAAGCAGGAGCCGCGGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTG 02AJC CGCCTGAGGAAGCAGGAGCCGCGGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTG 1MOG-Casearia-sylvestris CGCCTGAGGAAGCAGGAGCCGCGGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTG 1CAM-Casearia-sylvestris CGCCTGAGGAAGCAGGAGCCGCGGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTG 04AJC-Casearia-sylvestris CGCCTGAGGAAGCAGGAGCCGCGGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTG 03AJC-Casearia-sylvestris CGCCTGAGGAAGCAGGAGCCGCGGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTG 05AJC-Casearia-sylvestris CGCCTGAGGAAGCAGGAGCCGCGGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTG 15AJC-Casearia-sylvestris CGCCTGAGGAAGCAGGAGCCGCGGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTG 2ANG-Casearia-sylvestris CGCCTGAGGAAGCAGGAGCCGCGGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTG 13ARA-Casearia-sylvestris CGCCTGAGGAAGCAGGAGCCGCGGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTG 14ARA-Casearia-sylvestris CGCCTGAGGAAGCAGGAGCCGCGGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTG 1CAR-Casearia-sylvestris CGCCTGAGGAAGCAGGAGCCGCGGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTG 5CAR-Casearia-sylvestris CGCCTGAGGAAGCAGGAGCCGCGGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTG 1LUI-Casearia-sylvestris CGCCTGAGGAAGCAGGAGCCGCGGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTG 6LUI-Casearia-sylvestris GCCTCGAGGAAGCAGGAGCCGCGGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTG 7CAM-Casearia-sylvestris CGCCTGAGGAAGCAGGAGCCGCGGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTG 74 4MOG-Casearia-sylvestris CGCCTGAGGAAGCAGGAGCCGCGGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTG Casearia-sylvestris CGCCTGAGGAAGCAGGAGCCGCGGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTG 1CAC-Casearia-sylvestris CGCCTGAGGAAGCAGGAGCCGCGGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTG * * * * ********** 5LUI-Casearia-sylvestris TGTGGACCGACGGGCTTACCAGTCTTGATCGTTATAAAGGACGATGCTACGACATCGAGC 5CAC-Casearia-sylvestris TGTGGACCGACGGGCTTACCAGTCTTGATCGTTATAAAGGACGATGCTACGACATCGAGC 07AJC-Casearia-sylvestris TGTGGACCGACGGGCTTACCAGTCTTGATCGTTATAAAGGACGATGCTACGACATCGAGC 08AJC-Casearia-sylvestris TGTGGACCGACGGGCTTACCAGTCTTGATCGTTATAAAGGACGATGCTACGACATCGAGC 12AJC-Casearia-sylvestris TGTGGACCGACGGGCTTACCAGTCTTGATCGTTATAAAGGACGATGCTACGACATCGAGC 11AJC-Casearia-sylvestris 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