PATRÍCIA RONDON PLEFFKEN DA SILVA INFLUÊNCIA DO TRATAMENTO DENTINÁRIO COM CLOREXIDINA, ÁCIDO HIALURÔNICO OU VITAMINA C NA RESISTÊNCIA ADESIVA E NAS PROPRIEDADES MECÂNICAS DA CAMADA HÍBRIDA Tese apresentada ao curso de Odontologia do Instituto de Ciência e Tec- nologia, UNESP - Univ Estadual Paulista, Campus de São José dos Cam- pos, como parte dos requisitos para a obtenção do título de DOUTOR, pelo Programa de Pós-Graduação em ODONTOLOGIA RESTAURADO- RA, Especialidade Dentística. Orientador: Profa. Tit. Maria Amélia Maximo de Araujo Co-orientador: Profa. Dra. Maria Filomena Rocha Lima Huhtala São José dos Campos 2013 BANCA EXAMINADORA Profa. Titular Maria Amélia Máximo de Araújo (Orientador) Instituto de Ciência e Tecnologia UNESP - Univ Estadual Paulista Campus de São José dos Campos Profa. Dra. Miriam Lacalle Turbino Faculdade de Odontologia Universidade de São Paulo - USP Prof. Dr. César Rogério Pucci Instituto de Ciência e Tecnologia UNESP - Univ Estadual Paulista Campus de São José dos Campos Prof. Titular Sérgio Ricardo Garcia Badini Universidade Metropolitana de Santos - UNIMES Profa. Dra. Ana Paula Martins Gomes Instituto de Ciência e Tecnologia UNESP – Univ Estadual Paulista Campus de São José dos Campos São José dos Campos, 6 de dezembro de 2013. DEDICATÓRIA A Deus pelo dom da vida e pela salvação em Jesus Cristo, por ser meu refúgio em momentos difíceis, por seu eterno amor por mim, por ter me sustentado emocio- nalmente e espirituamente em todas as fases da minha vida, por ter cuidado de mim e por colocar pessoas mara- vilhosas no meu caminho. Ao meu marido André, que sempre me deu força em momentos que estive desanimada. Obrigada pe- la paciência, amizade e amor. Você torna os meus dias mais coloridos. Agradeço a Deus por você estar ao meu lado. Te amo! Aos meus pais Edsel e Silvia, que são exemplos de amor e referência de vida. Pessoas que amo muito, a vocês todo meu respeito e gratidão. Aos meus irmãos Daniel, Gabriela (cunhada- irmã) Cristiane e Talita por todo carinho e companhei- rismo, vocês são presente de Deus em minha vida. Aos meus avôs, Edison e Maria que sempre me apoiaram e acreditaram nos meus sonhos, vibrando co- migo em cada conquista. Muito obrigada por todos os mimos e carinho. AGRADECIMENTOS ESPECIAIS Á minha orientadora Profa. Tit. Maria Amé- lia Máximo de Araújo, por acreditar e cuidar de mim, obrigada por toda orientação e apoio durante todo está- gio deste trabalho, pessoa que sempre respeitei e admira- rei pela sua competência indiscutível como profissional e hoje admiro ainda mais pela pessoa que é, nunca irei me cansar de te agradecer por tudo. A minha co-orientadora Profa. Maria Filo- mena R. Lima Huhtala que muito me ensinou, sempre compreensiva me apoiando em momentos difíceis com pa- lavras de incentivo. Às amigas do Curso de Pós-Graduação em Dentística: Beatriz, Daphne, Graziela, Natália, Luciana, Heleine, Monique, Ana Luiza, Tânia, Stella, Erika e Fer- nanda pelo incentivo constante, amizade e companhei- rismo. A minha amiga Ten Camilla Bengston, pela amizade e pela imprescindível colaboração durante a fase experimental. Obrigada pelo carinho e amizade! A toda a minha família que conquistei na Aeronáutica, que sempre torceu por mim, me incentivou e vibrou comigo a cada vitória! AGRADECIMENTOS À Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, na pessoa do diretor do Instituto de Ci- ência e Tecnologia de São José dos Campos, na pessoa do diretor Carlos Augusto Pavanelli. Ao programa de Pós-Graduação em odonto- logia Restauradora, coordenado pelo Profa. Tit Márcia Carneiro Valera Garakis. Aos professores: Prof. Sérgio Eduardo de Paiva Gonçalves, Prof. César Rogério Pucci, Prof. Carlos Rocha Gomes Torres e Profa. Alessandra Bühler Borges, pela a- mizade e conhecimentos transmitidos durante estes 12 anos de Unesp desde graduação, estágio e pós- graduação. Ao Prof.Ivan Balducci, pela realização da análise estatística. As funcionárias do Laboratório Fernanda (Tiago) e Josiana, e a secretária Rosangela, pelo auxílio e colaboração em todas as partes deste estudo. À todos da seção de Pós-graduação pelas in- formações e atenção prestada. Ao laboratório do Departamento de Dentísti- ca da Faculdade de Odontologia de São Paulo (USP), re- presentado pela Profa. Dra. Miriam Lacalle Turbino que realizou os ensaios de nanoindentação. A todos que, direta ou indiretamente, contri- buíram para a realização deste estudo, que Deus abençoe a vida de cada um de vocês. Uma noite eu tive um sonho… Sonhei que estava andando na praia com o Senhor, e no céu, passavam cenas de minha vida. Para cada cena que passava, percebi pegadas na areia; Uma era minha e a outra do Senhor. Quando a última cena de minha vida passou diante de nós, olhei para as pegadas na areia, notei que muitas vezes no caminho da minha vida havia apenas um par de pegadas na areia. Notei também que isso aconteceu nos momentos mais difíceis da minha vi- da. Isso me aborreceu ,e perguntei então ao Senhor: -Senhor, Tu me disseste que, uma vez que eu resolvi Te se- guir,Tu andarias sempre comigo, todo o caminho, mas notei que nos momentos das maiores atribulações do meu viver havia na areia dos caminhos da vida, apenas um par de pegadas. - Não compreendo…Porque nas horas em que eu mais ne- cessitava, Tu me deixastes? O Senhor respondeu : - Minha preciosa filha, Eu te amo e jamais te deixaria nas horas da tua prova e do teu sofrimento. Quando vis- tes na areia apenas um par de pegadas, foi exatamente aí que EU TE CARREGUEI EM MEUS BRAÇOS! SUMÁRIO LISTA DE FIGURAS........................................................................... LISTA DE QUADROS E TABELAS.................................................... LISTA DE ABREVIATURA E SIGLAS................................................ RESUMO............................................................................................. ABSTRACT......................................................................................... 1 INTRODUÇÃO.................................................................................. 2 REVISÃO DE LITERATURA............................................................ 2.1 Hibridização.................................................................................. 2.2 Diferentes substâncias utilizadas parar melhorar a união adesiva da resina composta à dentina............................................ 2.2.1 Clorexidina.................................................................................. 2.2.2 Ácido hialurônico......................................................................... 2.2.3 Vitamina C.................................................................................. 2.3 Nanoindentação........................................................................... 3 PROPOSIÇÃO.................................................................................. 4 MATERIAL E MÉTODOS................................................................. 4.1 Materiais empregados................................................................. 4.2 Preparo dos espécimes............................................................... 4.3 Divisão dos grupos...................................................................... 4.4 Teste de microtração................................................................... 4.5 Análise do padrão de fratura...................................................... 4.6 Teste nanoindentação................................................................. 4.6.1 Dureza........................................................................................ 4.6.2 Módulo de Elasticidade............................................................... 4.6.3 Aplicação da Técnica da nanoindentação.................................. 4.6.4 O Método Oliver-Pharr................................................................ 11 14 16 18 20 21 25 25 39 39 52 55 60 76 77 77 78 80 85 86 87 88 89 90 93 4.7 Análise estatística........................................................................ 5 RESULTADOS................................................................................. 5.1 Teste de microtação.................................................................... 5.1.1 Estatística descritiva................................................................... 5.1.2 Estatística Inferencial.................................................................. 5.1.3 Análise dos Padrões de fratura................................................... 5.2 Nanoindetação............................................................................. 5.2.1 Nanodureza................................................................................ 5.2.2 Módulo de elasticidade............................................................... 6 DISCUSSÃO..................................................................................... 6.1 Da Metodologia............................................................................ 6.2 Dos Resultados........................................................................... 7 CONCLUSÃO................................................................................... 8 REFERÊNCIAS............................................................................... 96 97 97 97 99 101 103 103 106 107 107 116 124 125 LISTA DE FIGURAS Figura 1 – A) Sistema adesivo Adper Single Bond; B) Resina composta Filtek Z250...................................................... 77 Figura 2 – A) Dente bovino; B) Torno de alta rotação; C) Raiz sec- cionada; D) Coroa utilizada............................................. 78 Figura 3 – A) Coroa seccionada; B) Politriz circular; C) Dentina exposta............................................................................ 79 Figura 4 – A) Matriz de silicona; B) Coroa posicionada na matriz; C) Resina acrílica; D) Coroa embutida............................ 79 Figura 5 – A) Condionamento ácido; B) Aplicação da substância experimental; C) Aplicação do sistema adesivo.............. 82 Figura 6 – Esquema representativo da divisão dos grupos experi- mentais............................................................................ 83 Figura 7 – A) Matriz de silicone; B) Inserção da resina composta; C) Espécime finalizado.................................................... 84 Figura 8 – Confecção dos Palitos..................................................... 85 Figura 9 – A) Fixação individual do corpo-de-prova no dispositivo para teste de microtração; B) Corpo-de-prova fratura- do..................................................................................... 86 Figura 10 – Curva típica de tensão versus deformação..................... 89 Figura 11 – A) Impressão da indentação; B) Indentador Berkovich... 90 Figura 12 – Pontos de medição para nanoindentação....................... 91 Figura 13 – Representação esquemática da curva de carregamento e descarregamento.......................................................... 92 Figura 14 – Perfil da superfície durante o carregamento máximo e após a retirada da carga, num teste de indentação ins- trumentada...................................................................... 93 Figura 15 – Gráfico de colunas (média ±desvio padrão) dos valores da resistência adesiva s as variáveis em estudo (G1: Controle; G2: Clorexidina; G3: Ácido hialurônico e G4: Vitamina C)...................................................................... 98 Figura 16 – Figura 17 – Figura 18 – Gráfico das médias – Ilustração dos efeitos: tratamento dentinário e efeito armazenamento................................. Gráfico de barras- % da redução de RA dos valores da resistência adesiva após 6 meses de armazenamento (G1: Controle; G2: Clorexidna; G3: Ácido hialurônico e G4: Vitamina C)............................................................... Gráfico de colunas – classificação do padrão de fratura dos grupos....................................................................... 100 100 103 Figura 19 – Gráfico de colunas (média±desvio padrão) dos valores de nanodureza da camada híbrida, obtidos pelos dife- rentes tipos de tratamento dentinário.............................. 104 Figura 20 – Gráfico de colunas (média±desvio padrão) dos valores de módulo de elasticidade da camada híbrida, obtidos pelos diferentes tipos de tratamento dentinário............... 106 LISTA DE QUADROS E TABELAS Quadro 1 – Materiais, composições e fabricantes.......................... 77 Quadro 2 – Divisão dos grupos conforme o tipo de tratamento realizado....................................................................... 83 Tabela 1 – Análise Descritiva dos dados de microtração (MPa) s as estratégias adesivas obtida no período de 24 h.................................................................................... 98 Tabela 2 – Análise Descritiva dos dados de microtração (MPa) s as estratégias adesivas obtida n período de 6 me- ses................................................................................ 98 Tabela 3 – Teste de análise de variância (ANOVA) a dois fatores 99 Tabela 4 – Teste de Tukey (5%) para o efeito Tratamento denti- nário em 24 h................................................................ 101 Tabela 5 – Teste de Tukey (5%) para o efeito Tratamento denti- nário em 6 meses......................................................... 101 Tabela 6- Classificação quanto ao tipo de fratura (número de palitos).......................................................................... 102 Tabela 7 – Teste de análise de variância (ANOVA) a um fator...... 105 Tabela 8 – Teste de Tukey para o efeito Tratamento dentinário em 6 meses.................................................................. 105 Tabela 9 – Teste de análise de variância (ANOVA) a um fator 106 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS AH= ácido hialurônico ANOVA = análise de variância APMA= p-aminophenylmercuric acetate ºC = grau Celsius Ca = cálcio CO2 = dióxido de carbono C4S = condroitina-4-sulfato CHX= clorexidina DCM = Matriz Desmineralizada de Colágeno GPa = Giga Pascal GAGs = Glicosaminoglicanos h = hora HEMA = hidroxi etil metacrilato K= quilo (103) Kg = quilograma Kgf /cm2 = quilograma força por centímetro quadrado m = mili (10-3) M= mega (106) µm = micrometro MMPs = Metaloproteinases MET = microscopia eletrônica de transmissão 4-META = 4-metacriloxietil trimelitato anidrido MEV = microscopia eletrônica de varredura µ = micro (10-6) min = minuto mj = milijoule mm = milímetro mm2 = milímetro quadrado MMA/TBB = metil metacrilato/tri-n-nbutil burano MPa = mega Pascal mRNA= ácido ribonucléico mensageiro MTBS = Resistência à microtração η = nano (10-9) N = newton NaOCl = hipoclorito de sódio nm = nanômetro RA= resistência adesiva rpm = rotações por min s = segundo Vit C= vitamina C Da Silva PRP. Influência do tratamento dentinário com Clorexidina, Ácido Hialurônico ou Vitamina C na resistência adesiva e propriedades mecâni- cas da camada híbrida [tese]. São José dos Campos (SP): Instituto de Ciência e Tecnologia, UNESP - Univ Estadual Paulista; 2013. RESUMO O objetivo deste estudo foi avaliar a influencia da Clorexidina, Ácido Hialu- rônico e Vitamina C na resistência adesiva à dentina e na propriedade mecânica (nanodureza e módulo de elasticidade) da camada híbrida. A dentina superficial de noventa e seis dentes bovinos foi exposta. Os es- pécimes foram divididos em quatro grupos (n=24) de acordo com o trata- mento dentinário: G1 (Controle) - aplicação do sistema adesivo (Adper Single Bond 2); G2 - tratamento com solução de clorexidina a 2% por 1 min + sistema adesivo; G3 - tratamento de solução com Ácido Hialurônico 1% por 1 min + sistema adesivo; G4 - tratamento com solução de Vitami- na C (Vit C) 10% por 1 min + sistema adesivo. Após polimerização do sis- tema adesivo foi aplicado duas camadas de resina composta Filtek 250 (3M ESPE) de forma incremental com auxílio de uma matriz e fotopolime- rizada por 20 s cada. Em seguida, os espécimes foram armazenados em água destilada a 37°C por 24 h (n=12) e 6 meses (n=12). Após o período de armazenamento, os espécimes foram seccionados onde se obteve um espécime de aproximadamente 1 mm2 de área. Foram submetidos ao tes- te de microtração em máquina de ensaio universal (DL-1000, EMIC/10 kgf/ 0,5 mm/min). Cinco espécime de cada grupo armazenado por 6 me- ses foi submetido ao teste de nanodureza e módulo de elasticidade da camada híbrida. Os dados foram submetidos aos testes estatísticos Ano- va 2 fatores e Tukey. No grupo após armazenamento 24 h mostraram que os maiores valores foram obtidos nos G1, G2 e G3, mas após 6 meses de armazenamento apenas o G2 e G3 apresentaram os maiores valores. Com relação às propriedades mecânicas o G3 apresentou o maior valor de dureza quando comparado aos demais grupos estudados. Não houve diferença estatística significante quanto ao módulo de elasticidade entre os grupos. Concluimos que a aplicação da clorexidina e ácido hialurônico na dentina foi eficiente em manter os valores da resistência adesiva após 6 meses de armazenamento entretato somente o ácido hialurônico apre- sentou o maior valor de nanodureza na camada híbrida. ___ Palavras-chave: Clorexidina. Ácido Hialurônico. Vitamina C. Resistência adesiva. Propriedades mecânicas. Dentina bovina. Da Silva PRP. Influence of dentin treated with chlorhexidine, hyaluronic acid or vitamin c on the adhesive bond strength and on the mechanical properties of the hybrid layer [tese]. São José dos Campos (SP): Institute of Science and Technology, UNESP - Univ Estadual Paulista, UNESP – Univ Estadual Paulista; 2013. ABSTRACT The aim of this study was to evaluate the influence of chlorhexidine, hyalu- ronic acid and C vitamin C on dentin bond strength and on the hybrid layer mechanical properties. The buccal surface of ninety six extracted bovine teeth was ground to exposure a flat dentin surface. The specimens were divided in four experimental groups (n=24): G1 (Control) - application of the adhesive system (Adper Single Bond 2); G2: dentin treatment with chlorhexidine 2% for 1 min + adhesive system; G3: dentin treatment with hyaluronic acid 1% for 1 min + adhesive system; G4: dentin treatment with C vitamin 10% for 1 min + adhesive system. After polymerization of the adhesive system, two increments of the composite resin, Filtek Z 350 (3M ESPE), were placed on dentin with the aid of a matrix and polymerized for 20 s each. The specimens were stored in distilled water at 37ºC for 24 h (n=12) and 6 months (n=12). They were then sectioned in order to obtain specimens with an area of approximately 1 mm2. They were submitted to microtensile bond strength tests using a universal testing machine (DL- 1000, EMIC/10 kgf/ 0,5 mm/min). One specimen of each of the groups stored for 6 months was submitted to nanohardness and elasticity module tests for the hybrid layer. Data were analyzed by two-way ANOVA and Tukey's test. Tests performed after 24 h showed higher adhesive bond strength for groups G1, G2 and G3, but after six months the highest values were presented by groups G2 and G3. Nanohardness tests revealed greater resistance for G3 compared to the other groups. Modulus of elas- ticity was found to be the same for all groups. It could be concluded that the application of chlorhexidine and hyaluronic acid on dentin was effec- tive in keeping high bond strength values after 6 months but regarding the hybrid layer only hyaluronic acid increased nanohardness. Keywords: Mechanical properties. Dentin. Nanoindentation technique. hybrid layer. Bond strength. Bovine dentin. 21 1 INTRODUÇÃO O principal objetivo da adesão é a união efetiva entre a estrutura dentária e o material restaurador, e a sua longevidade. Porém a degradação da interface adesiva continua sendo a grande responsável pela perda das restaurações em curto espaço de tempo, principalmente na dentina (Sano et al., 1999; Dos Santos et al., 2011). Qualidade e uniformidade da camada híbrida, com boas propriedades mecânicas, dureza e modulo de elasticidade, são fatores importantes para se obter adesão e estabilidade favoráveis no tecido den- tinário. No caso das restaurações adesivas, o bom selamento esta rela- cionado com a capacidade que o material apresenta em resistir esforços mecânico imediatos, que ocorrem na contração de polimerização da resi- na composta, ou tardios devido a ações fisiopatológicas do aparelho es- tomatognático. Estudos têm sido realizados com o uso de substâncias que mantenham a estabilidade do colágeno com objetivo de aumentar a união entre a restauração adesiva e a dentina. A biomodificação da denti- na por meio de agentes bioativo pode melhorar a qualidade e a durabili- dade da interface adesiva (Dos Santos et al., 2011). Para tanto, é impor- tante pesquisar o comportamento físico-mecânico das interfaces adesivas criadas por estas substâncias para se obter o prognóstico restaurador destes tratamentos dentinário. Entre os agentes bioativos estudados estão às substância consideradas inibidoras das metaloproteinases (MMPs), enzimas respon- sáveis pela degradação do colágeno, tornando-as inócuas ao colágeno exposto. As MMPs constituem uma família de proteases neutras, funda- mentais na degradação da matriz extracelular em diversos processos fi- 22 siológicos e patológicos. Apresentam variação de atividade catalítica se- gundo o tipo de colágeno (Garcia-Godoy et al., 2007). Na matriz orgânica da dentina humana sadia já foi identificada inúmeras proteínas, nas quais estão incluídos alguns tipos de MMPs: MMP-2, MMP-8, MMP-9, MMP-20, sendo essas, portanto, as MMPs relacionadas ao processo de degrada- ção das uniões com a dentina. (Bourd-Boittin et al., 2005; Sulkala et al., 2007). Estudos recentes mostraram que a aplicação de inibidores de MMPs reduziu a solubilização da camada híbrida e diminuiu a progressão de lesões de cáries (Carrilho et al., 2007b; Pashley DH et al., 2011). Na odontologia adesiva alguns estudos tem relacionado a clorexidina como inibidor destas enzimas, pesquisas têm demonstrado resultados promissores desta substância, confirmando a manutenção da resistência adesiva ao longo do tempo, com a inibição das MMPs (Osório et al., 2011; Stanislawczuk et al., 2011). Na área da Dermocosmética, o Ácido Hialurônico (AH) e a Vitamina C (ácido ascórbico) tem sido amplamente utilizado como produ- tos cosméticos de aplicação tópica. O primeiro, por proporcionar efeito hidratante, estimular fibroblastos na produção do colágeno e ser extre- mamente bem tolerado, e o segundo por aumentar o nível de RNA-m dos colágenos I e III, ser co-fator de algumas enzimas de conversão e tam- bém atuar como agente antioxidante (Tezel, Fredrickson, 2008; Liao et al., 2005; Bogovic et al., 2011). O ácido hialurônico (AH) é um polissacarídeo pertencente ao grupo dos glicosaminoglicanos, se faz presente na matriz extracelular do tecido conjuntivo frouxo, interage com várias macromoléculas incluindo as fibras colágenas e micromoléculas de forma a determinar sua permea- bilidade à água (Fraser et al., 1997; Stern, 2008). A vasta aplicabilidade do AH deve-se à sua excelente característica higroscópica, ao seu ótimo comportamento reológico e à sua propriedade visco-elástica, o seu efeito hidratante pode favorecer a completa infiltração dos monômeros no colá- geno exposto (Weindl et al., 2004; Liao et al., 2005). De acordo com Bo- 23 govic et al. (2011) o ácido hialurônico pode ser aplicado no tratamento de capeamento pulpar direto. Autores também relataram em estudos que o ácido hialurônico possui a capacidade de acelerar o processo de cicatri- zação e de aumentar a formação do colágeno do tipo I (Mendes et al., 2008, 2010; Li et al., 2012) O colágeno é uma proteína fibrosa que apresenta estrutu- ra longa, rígida com três cadeias polipeptídicas, chamadas cadeias V que se encontram entrelaçadas. Estes contêm dois aminoácidos que são ca- racterísticos desta proteína: hidroxiprolina e hidroxilisina. A configuração helicoidal é estabilizada pela prolina, devido a sua estrutura em anel. Exis- tem colágenos tipos I, II, III, V e XI, sendo que o colágeno tipo I é o mais abundante do corpo humano e está presente também na dentina (Blanck, Peterkofsky, 1975). A vitamina C ou ácido ascórbico (AA) é considerada uma vitamina hidrossolúvel e os seres humanos são incapazes de sintetiza-la. Esta vitamina possui um papel importante na formação do colágeno, pois ela é um co-fator para hidroxiprolina e hidroxilisina (Geesin, 1988; Peter- kofsky, 1991). Esta substância também possui característica antioxidante, agindo como neutralizante dos efeitos nocivos dos radicais livres, o que protege a integridade estrutural dos tecidos (Campo et al., 2004; Halicka et al., 2009). Este fato é importante, pois a presença de oxigênio pode facilitar o processo de degradação da matriz colágena da camada hibrida e também inibir a polimerização dos monômeros resinosos, prejudicando a longevidade da restauração (Gutteridge 1994; Hilton, Schwartz, 1995; Erhardt et al., 2011). O conhecimento das propriedades elástica e plástica da interface de união é dificil, pois esta região possui dimensões muito pe- quenas. Atualmente as pesquisas buscam na nanociência, e mais especi- ficamente na nanotecnologia, o conhecimento para alcançar este objetivo. A análise da nanodureza e módulo de elasticidade são realizados através da técnica da nanoindentação. É uma técnica seletiva 24 e não destrutiva que fornece dados de materiais rígidos. Apesar da ampla utilização deste teste na física e engenharia, o seu uso na odontologia é muito recente. O teste consiste em ensaiar amostras utilizando penetrado- res de geometria conhecida sob condições controladas de carga, tempo e profundidade de penetração. A geração automática de curvas, força X profundidade de penetração, permite o acesso a diferentes propriedades mecânicas do material que está sendo pesquisado. A análise dos dados obtidos no teste de nanoidentação mais utilizado é o de Oliver e Pharr (1992), que resulta em dois parâmetros, módulo de elasticidade (E) e du- reza (D). O equipamento utilizado para este teste possui alta resolução de medidas de carga (micro-Newtons) e deslocamento (nanômetros) (Van Meerbeek et al., 1993; Schulze et al., 2005). Diante do exposto se faz necessário averiguar se as subs- tâncias bioativas, citadas acima, interferem na resistência adesiva imedia- ta; e após 6 meses de armazenamento e também nas propriedade mecâ- nicas (nanodureza e módulo de elasticidade) da camada híbrida. 25 2 REVISÃO DE LITERATURA Para facilitar a compreensão do leitor, a revisão da litera- tura foi dividida em três tópicos principais: Hibridização; Diferentes subs- tâncias utilizadas para melhorar a união adesiva da resina composta à dentina; e Nanoidentação. 2.1 Hibridização A formação da camada híbrida foi descrita pela primeira vez por Nakabayashi et al. (1982) em um estudo que verificava a efetivi- dade da solução 4-META/metil metacrilato-tri-n-butil borano (MMA-TBB) associada a um agente condicionador composto pela união do cloreto fér- rico a 3% em ácido cítrico a 10%. Esta combinação de ácidos, conhecida como solução 10-3, além de remover totalmente a lama dentinária, des- mineralizava a dentina subjacente em aproximadamente 5 µm de profun- didade. A diferença desta solução com as anteriores, é que as outras a- penas tratavam a lama dentinária e não modificavam a dentina subjacente para receber os monômeros resinosos. Os autores utilizaram cilindros de esmalte e dentina humana e bovina condicionados, os monômeros resi- nosos hidrofóbicos e hidrofílicos (4-META), infiltraram-se entre as fibras colágenas expostas e, posteriormente, foram polimerizados. Os autores observaram, nas imagens em microscopia eletrônica de varredura, uma região mista abaixo da interface adesiva, com monômeros resinosos no interior da dentina desmineralizada e a denominaram camada híbrida. 26 Este estudo demonstrou que a adesão ocorria entre os agentes resinosos e as fibras colágenas. Para conceituar agentes condicionadores e primers, Pas- hley DH (1992), observaram que a remoção da camada de smear layer pelo condicionamento ácido, ocasionam um aumento da permeabilidade da dentina, umidade superficial, potencial de irritação pulpar, desnatura- ção do colágeno e possível discrepância entre profundidade de desmine- ralização e capacidade de penetração do agente adesivo. Em virtude dis- so, os autores concluíram que o sistema adesivo deve ser hidrofílico, ter afinidade à água, com capacidade de penetrar tanto em dentina intertubu- lar como em dentina peritubular. Os autores ainda acrescentaram que a profundidade de desmineralização causada pelo ácido depende não só do tempo de condicionamento, como também da concentração, tipo de ácido utilizado e concentração mineral do substrato em questão. Testes in vitro de sistemas adesivos aplicados na dentina ainda requerem comprovação através de estudos clínicos de longevidade para avaliar sua efetividade. Van Meerbeek et al., em 1994 realizaram um estudo clínico com objetivo de avaliar, retrospectivamente, a eficácia clíni- ca de sistemas adesivos dentinários autocondicionantes (Scotchbond, Gluma, Clearfil New Bond, Scotchbond 2, Garantia e Tripton), e compara- ram os resultados clínicos obtidos com quatro sistemas adesivos conven- cionais (Bayer exp. 1 e 2, Clearfil Liner Sistema de Bond e Scotchbond multi-Purpose). No total, foram restaurados 1.177 lesões cervicais do tipo classe V em dentes de 346 pacientes. Os autores concluíram que à estra- tégia de adesão, os sistemas adesivos que removeram à camada de smear layer e consequentemente desmineralizaram a camada superficial da dentina revelaram melhor desempenho clínico que os sistemas que apenas modificaram esta camada sem sua completa remoção. A hibrida- ção por infiltração dos monômeros resinosos pela camada de colágeno exposto da dentina, combinada com a formação dos tags na dentina, pa- 27 receu ser essencial para a resistência adesiva dentinária. Afirmaram ainda que a formação adicional de uma área de interface adesiva elástica, que funcione como amortecedor para a contração de polimerização e também a aplicação de uma resina composta com carga de partículas pequenas, garantiu um resultado clínico eficaz com relação a sua longevidade. Sano et al. (1995), examinaram através do MEV uma no- va modalidade de infiltração marginal denominada nanoinflitração, estabe- lecida não entre a parede cavitária e o material restaurador, mas entre a camada de colágeno desmineralizado, sem ter sido impregnado por mo- nômeros adesivos. Para tanto, foram utilizados terceiros molares não ir- rompidos, extraídos sobre os quais foram confeccionadas cavidades clas- se V, seguida da aplicação de cinco sistemas adesivos diferentes. A se- guir, as cavidades foram restauradas. Realizado o isolamento dos espé- cimes, com exceção de 1 mm ao redor das restaurações, estes foram i- mersos por 8 h em solução fotoreveladora. Os resultados revelaram a pe- netração de prata através da dentina desmineralizada. A infiltração ocor- reu via poros nanométricos (20 a 100 nm) abaixo da interface adesiva, mesmo na ausência de fendas. Concluíram que a camada híbrida era permeável, e apresentava porosidades de dimensões nanométricas. As- sim, poderiam ocorrer infiltrações bacterianas e de outras substâncias prejudiciais à estrutura dentária, denominada pelos autores como nanoin- filtração. Tay et al., em 1996 realizaram um estudo com o objetivo de ilustrar e definir a micromorfologia da interface resina-dentina, quando dois sistemas adesivos de frasco único water-free e à base de acetona (One-Step, Bisco, e Prime & Bond, Dentsply / LD Caulk) quando aplicados à dentina desmineralizada sob diferentes condições de adesão, à seco e úmida. Para isso foram utilizados quarenta e oito discos de 1 mm de den- tina que foram condicionados com ácido fosfórico 10% e lavados por 20 s. Os discos foram divididos aleatoriamente em 4 grupos de acordo com a 28 condição de umidade restantes: Grupo I - A superfície da dentina foi sua- vemente seca com jato de ar, paralelo à superfície por 30 s, e com a dis- tância de 20 cm; Grupo II - A superfície da dentina foi suavemente seca com jato de ar, paralelo à superfície por 3 s, e com distância de 20 cm; Grupo III – A superfície da dentina foi seca utilizando papel absorvente removendo o excesso de água; Grupo IV - Após o condiconamento e la- vagem da superfície, 20 ml de água destilada foi adicionada à superfície de maneira que esta ficou totalmente coberta por água (overwet). Seis discos de dentina foram unidos com One-Step e o restante dos discos com Prime & Bond, resultando em oito sub-grupo. Os espécimes foram desmineralizados em EDTA e incluídos em resina epóxi para a análise em microscopia eletrônica de transmissão (MET). Os autores relataram que os espectros micromorfológicos dos dois sistemas adesivos foram prati- camente semelhantes. Ambos foram afetados pela desidratação leve (3 s), que resultou na infiltração incompleta dos monômeros na região inter- tubular. A impregnação completa foi alcançada quando a rede de coláge- no foi mantida úmida nesta mesma região. Sano et al., em 1999, avaliaram a estabilidade da resis- tência adesiva e a morfologia da interface produzida por um sistema ade- sivo, aplicado in vivo, após diferentes períodos de tempo. Para esse es- tudo foi utilizado um primata adulto (Macaca fuscata), um ano antes de ser sacrificado, o animal foi anestesiado e em quatro dentes foram reali- zadas cavidades rasas classe V em dentina, que foram restauradas com o sistema adesivo Clearfil Liner Bond II (Kuraray) e resina Clearfil Photo Posterior (Kuraray). Após 180 dias foi realizado o mesmo procedimento restaurador em mais quatro dentes. Um dia antes de sacrificar o animal, este foi novamente anestesiado e os procedimentos realizados em mais quatro dentes. No dia seguinte os dentes foram cuidadosamente extraí- dos e armazenados em 37 °C por 24 h. Após este período, os dentes fo- ram submetidos ao teste de microtração. As superfícies adesivas, após a fratura, foram observadas em microscopia eletrônica de varredura (MEV). 29 Não houve diferença significativa na resistência adesiva, que permaneceu estável em aproximadamente 19 Mpa durante um ano. As observações em MEV das superfícies fraturadas revelaram no topo da camada híbrida e dentro da resina adesiva, porosidades que aumentaram com o tempo de armazenamento. Arrais e Giannini (2002) estudaram a morfologia e espes- sura da difusão da resina através da dentina desmineralizada ou sem condicionamento. Dezesseis terceiros molares humanos foram armaze- nados em formalina a 2% por duas semanas e mantidos por 24 h em á- gua destilada, antes do experimento. As raízes foram removidas e as co- roas seccionadas no sentido mésio-distal, obtendo-se 32 hemi-coroas. A superfície oclusal foi removida até se obter 2 mm de remanescente denti- nário, e lixas de carbeto de silício (600) foram utilizadas para regularizar a smear layer. Os espécimes foram divididos em quatro grupos de acordo com sistema adesivo: 1 - Sistema adesivo convencional de múltiplos pas- sos (Scotchbond Multipurpose Plus –3M); 2 - Sistema adesivo convencio- nal monocomponente (Single Bond – 3M); 3 - Sistema adesivo autocondi- cionante (Etch & Prime 3.0 – Degussa); 4 - Sistema adesivo autocondicio- nante (Clearfil SE Bond – Kurarai). Após a aplicação dos adesivos segui- dos da inserção da resina, as amostras ficaram 24 h em água destilada a 37 °C. A superfície axial de cada amostra foi polida com lixa e óxido de alumínio e pasta de diamante. Em seguida foi aplicado ácido fosfórico a 37% por 5 s para facilitar a visualização da camada híbrida. Foram fixadas em solução de Karnovsky e tetróxido de ósmio, desidratadas em acetona e revestidas em ouro. Os autores utilizaram microscopia eletrônica para análise e concluíram que o adesivo Scotchbond seguido pelo Single Bond, apresentaram a camada híbrida mais espessa, em comparação com as finas e homogêneas camadas apresentadas pelos adesivos auto- condicionantes. Em 2002, Carrilho et al., testaram a resistência adesiva de quatro sistemas adesivos aplicados à dentina humana. Doze terceiros 30 molares tiveram o esmalte oclusal removido para a exposição de uma su- perfície plana de dentina e foram divididos aleatoriamente em quatro gru- pos: Gupo 1 - Single Bond e P60 (3M Dental); Grupo 2 - Bond 1 e Surefil (Jeneric/Pentron); Grupo 3 – Prime&Bond NT e Alert (Dentsply); Grupo 4 - Prime&Bond 2.1 e TPH (Dentsply). Após 24 h de armazenagem em água destilada a 37 ºC, os dentes sofreram cortes longitudinais perpendiculares para obtenção de espécimes de 0,8 mm2 de área e 10 mm de comprimen- to e foram submetidos ao teste de microtração. Os pesquisadores não encontraram diferenças estatísticas significantes entre os adesivos testa- dos. O Single Bond apresentou a menor evidência de espécimes que so- freram fratura precoce. Em 2003, Tay e Pashley realizaram um estudo utilizando o MET para verificar a presença de canais de água (“Water Treening”) presentes ao longo da interface dentina/resina. Terceiros molares foram selecionados e seccionados no terço médio da coroa, expondo uma su- perfície dentinária profunda, abrasionada com lixa de granulação 180. Pa- ra análise em esmalte a superfície vestibular foi jateada com óxido de a- lumínio 50 μm, para remover a superfície aprismática. Diferentes tipos de sistemas adesivos foram utilizados. S os autores a impregnação de prata nos adesivos, ocorre nos sítios hidrofílicos do material e nos finos canais deixados pela passagem de água, durante o fenômeno de permeabilidade dos adesivos. Os autores realizaram fotomicrografias eletrônicas de transmissão, obtidas na interface adesiva, tratada pela técnica de impreg- nação com nitrato de prata. Os resultados mostraram que todos os adesi- vos apresentaram certo grau de nanoinfiltração na camada híbrida. Ca- nais de água foram observados na superfície da camada híbrida e se es- tendendo para dentro da camada de adesivo. Os autores concluíram que esses canais ao longo da interface, representam a incompleta remoção da água residual, os quais podem surgir como sítios de degradação hidrolíti- ca da interface adesiva ao longo do tempo. 31 Susin et al., em 2003, compararam a espessura da cama- da híbrida formada por sistemas adesivos atuais sob influência de diferen- tes condições de substrato dentinário (úmido, desidratado e reumidifica- do). Para a realização deste estudo, foram utilizados 180 terceiros mola- res humanos hígidos, seccionados na altura do 1/3 médio da coroa den- tal. Os fragmentos foram divididos em seis grupos de acordo com sistema adesivo utilizado: 1- Scotchbond Multi Uso (3M); 2- Single Bond (3M); 3- Prime & Bond 2.1 (Dentsply); 4- One Coat Bond (Tokuyama); 5- Clearfil SE Bond (Kuraray) e 6- One Up Bond F (Tokuyama). As técnicas adesi- vas foram aplicadas nos respectivos substratos de acordo com as orienta- ções dos fabricantes e duas camadas de resina composta Z250 (3M), de 1 mm cada, foram aplicadas sobre a área de teste. Os fragmentos foram seccionados e preparados para observação em MEV. Os resultados quanto à espessura de camada híbrida, mostraram que os sistemas ade- sivos que empregaram condicionamento ácido separadamente, tiveram comportamentos semelhantes em função dos substratos, sendo que em dentina úmida a espessura de camada híbrida encontrada, foi maior do que em dentina desidratada e reumidificada. Entretanto, os sistemas ade- sivos autocondicionante apresentaram diferentes performances, quando comparados aos primeiros, apresentando melhores resultados em dentina reumidificada. Consideram que as condições do substrato dentinário e os sistemas adesivos apresentaram interação e isso determina que as técni- cas adesivas realizadas em dentina, previnam o colapso das fibras colá- genas, que ocorre pela utilização de ar comprimido como meio de seca- gem. Pashley DH et al., em 2004 afirmam que as fibrilas colá- genas expostas pelo condicionamento ácido que não foram completamen- te impregnadas pelo adesivo são suscetíveis à degradação. A hipótese dos autores neste estudo é que a degradação ocorre na ausência de bac- térias. Foram utilizados vinte e sete terceiros molares, O esmalte oclusal e a raiz dos dentes foram removidos e descartados. A superfície dentiná- 32 ria exposta foi condicionada com ácido fosfórico a 32% por 15 s, mas sem a aplicação do sistema adesivo. Os espécimes foram divididos aleatoria- mente em três grupos de acordo com a forma em que os espécimes fo- ram estocados. No grupo controle os espécimes foram armazenados em saliva articial e no grupo experimental foram adicionados inibidores de enzimas proteoliticas. Cada grupo foi subdividido em três, de acordo com o tempo de armazenamento (24 h, 90 e 250 dias), as amostras foram e- xaminadas medindo-se a extensão de degradação da DCM (matriz des- mineralizada de colágeno). No grupo experimental (24 h) e no grupo con- trole (90 e 250 dias), foi observado 6 mm de espessura de DCM. As DCMs foram praticamente destruídas nas amostras do grupo experimen- tal de 250 dias, porém no grupo em que as amostras foram incubadas com inibidores da enzima ou óleo mineral estas não foram destruídas. Na análise funcional foi observado pelos autores que a atividade colagenolíti- ca foi diminuida por inibidores de protease ou pela clorexidina 0,2%. Os autores concluíram que a degradação do colágeno ocorreu ao longo do tempo através das metaloproteinases, que são liberados lentamente ao longo do tempo. Cho e Dickens (2004) investigaram a hipótese de que a variação do conteúdo de acetona de sistemas adesivos dentinários pode afetar a espessura da camada adesiva e resistência à microtração (MTBS), e verificaram se a espessura da camada adesiva é um indicador válido para MTBS. Adesivos dentinário experimental foram preparados com 27, 37, 47, 57 ou 67% de acetona e foram utilizados para adesão da resina composta em superfícies de dentina na oclusal de molares huma- nos. A espessura da camada adesiva foi determinada por análise de ima- gens digitalizadas. A MTBS foi medida após 48 h. As superfícies de fratu- ra foram observadas em MEV. Com o aumento do teor de acetona, a MTBS variou de 38 MPa (acetona 67%) para o maior valor MTBS de 64 MPa (acetona 37%), enquanto que a espessura da camada adesiva de- cresceu linearmente. Ambas as variáveis dependentes mostraram corre- 33 lação inversa com o teor de acetona (p < 0,0001), mas não foram correla- cionados entre si (P> 0,05). Noventa e quatro por cento das amostras a- presentaram fraturas na camada adesiva estendendo para as interfaces com a camada híbrida ou a resina composta. Nos grupos contendo 57 e 67% de acetona, as fraturas foram observadas nas interfaces. Em vez da espessura da camada adesiva, trincas interfaciais na amostras contendo adesivos ricos em acetona pode ter causado MTBS inferiores. Os autores concluíram que a menor concentração de acetona, devido a evaporação do solvente durante o uso clínico do sistema adesivo, não parecem dimi- nuir MTBS, mas sim melhorar a integridade da interface adesiva. Em 2007, Hosoya et al., avaliaram as propriedades bio- mecânicas e a dureza e módulo de elasticidade, da dentina decídua con- dicionada por sistema adesivo de um passo. Foram utilizados seis dentes sem cáries e seis dentes cariados. Para os dentes saudáveis, as superfí- cies oclusais foram desgastadas para expor a dentina superficial. Nos dentes cariados, a dentina infectada foi corada com um detector de cáries e removida em baixa rotação com refrigeração constante. Foi aplicado sobre a dentina preparada o sistema com One-Up Bond F Plus (Tokuya- ma Dental Co., Tóquio, Japão). A interface resina-dentina e a dentina a- baixo da interface foi medida com um nanoindentador e observada com SEM e TEM. Para ambos os dentes cariados e saudáveis não houve dife- rença significativa na dureza da dentina a 10-80 μm abaixo da interface. A dureza da dentina na região da interface foi significativamente menor na dentina cariada do que na não-cariada. Quanto ao módulo de elasticidade da dentina interfacial, ambos os substratos apresentaram valores signifi- cativamente mais baixos do que a dentina subjacente. Além disso, o mó- dulo de elasticidade da dentina interfacial foi significativamente menor na dentina afetada. A camada híbrida nos dentes cariados foi mais espessa e exibia características morfológicas mais complexas. Pashley et al., em 2007 realizaram uma pesquisa cujo ob- jetivo foi revisar o uso de um modelo de adesão de uma nova resina cha- 34 mada macro-hibrida, foi avaliado a sua penetração, contração e evapora- ção do solvente. Relataram também que a matriz dentinária é muito sen- sível, principalmente na secagem com jato de ar, onde ocorre o colapso das fibras colágenas que impede a infiltração dos monômeros resinosos. Os autores introduziram também um novo conceito da utilização do etanol como solvente, onde a presença de água após a desmineralização da dentina é trocada pelo etanol durante o processo adesivo o que facilitaria a penetração dos monômeros do sistema adesivo. Ermis et al. (2008) avaliaram a resistência de união atra- vés de teste de microtração, utilizando um sistema adesivo de condicio- namento total (controle) e três sistemas adesivos autocondicionantes com diferentes níveis de acidez (forte, médio e fraco) em dentina preparada com três pontas com diferentes granulações (média, fina e extrafina). Fo- ram utilizados os sistemas adesivos autocondicionantes Adper Prompt L- Pop, 3M ESPE, (AP), de um passo com ácido forte; Clearfil SE Bond, Ku- raray, (CSE) de dois passos com acidez média; Clearfil S3 Bond, Kuraray, (CS3) de um passo com acidez fraca e o sistema adesivo OptiBond FL, Kerr, (OB) de condicionamento total de três passos (grupo controle). Fo- ram utilizados dentes humanos extraídos, onde as coroas foram seccio- nadas no terço médio. Após a dentina ser exposta, os espécimes foram divididos em três grupos de acordo com o preparo da dentina com pontas de granulação média, fina e extrafina. Os quatro sistemas adesivos foram aplicados em três dentes de cada grupo de acordo com as especificações dos fabricantes. Em seguida foi aplicada resina composta em incremen- tos, na superfície de dentina preparada com espessura de 5-6 mm. Os espécimes foram mantidos por 24 h em água destilada a 37 °C. Os den- tes foram cortados perpendicularmente em pequenos retângulos de apro- ximadamente 0,90 mm2 de secção transversal. Os dados foram submeti- dos ao teste de ANOVA dois fatores, post hoc Tukey com comparação múltipla. Os resultados obtidos mostraram que os diferentes tipos de gra- nulação das pontas não afetaram as propriedades mecânicas da interfa- 35 ce, exceto para o sistema adesivo autocondicionante CS3 de acidez fraca de um passo, que obteve um resultado melhor (34,4 ± 22,3 MPa) quando foi utilizada uma ponta de menor granulação no preparo da dentina. Con- clui-se neste estudo que para os sistemas adesivos de condicionamento total OB e autocondicionante de acidez forte, o tipo de ponta utilizada não influenciou na eficácia da adesividade. Entretanto, nos sistemas adesivos (CS3) de acidez fraca a adesividade pode ser significantemente aumen- tada utilizando as pontas de granulação fina para acabamento. Albaladejo et al. (2010) avaliaram a eficácia na formação de tags de resina, ramos laterais e da camada híbrida de cinco sistemas adesivos (Single Bond -SB-; Prime & Bond NT -PNT-; Clearfil SE Bond - SEB-, Protect Bond –PB-Etch &Prime 3.0 -EP). Superfícies planas de dentina de 25 molares foram tratadas com os sistemas adesivos de acor- do com as instruções dos fabricantes. Em seguida foi aplicada resina composta na forma incremental. Os espécimes foram seccionados parale- lamente ao longo eixo. Uma parte foi tratada com ácido fosfórico e hipo- clorito de sódio a fim de revelar a formação da camada híbrida. A outra metade foi armazenada em ácido clorídrico a 30% para detectar a forma- ção de tags e ramo lateral de resina. Os dois adesivos convencionais a- presentaram camadas híbridas mais espessas do que aqueles encontra- dos em sistemas adesivos autocondicionantes, porém eram contínuas e uniformes de espessura em todos os adesivos. Os adesivos convencio- nais formaram maior número de tags de resina do que os adesivos auto- condicionantes. Formação do ramo lateral foi observada nos adesivos convencionais e no adesivo autocondicionante Clearfil SE Bond (SEB). Os autores concluíram que o SEB apresentou infiltração de resina adequada. Sarr et al., em 2010, avaliaram mecanicamente e morfo- logicamente, 11 diferentes sistemas adesivos aplicados sobre a dentina. A ultra-estrutura resultante da interface dentina/adesivo foi caracterizada por microscopia eletrônica de transmissão (MET). Terceiros molares humanos tiveram a dentina superficial exposta. Os adesivos selecionados foram 36 aplicados conforme as instruções do respectivo fabricante, para a medi- ção da resistência à microtração (MTBS) após armazenamento em água a 37 ºC por 24 h, ou para caracterização interfacial (MET). A MTBS variou de 11,1-63,6 MPa; os maiores valores obtidos foram do adesivo conven- cional três passos e os menores com adesivos autocondicionantes de um passo. Na avaliação morfológica (TEM), mostraram padrões de interação muito diferente, especialmente para os adesivos autocondicionantes. Os autores concluíram que quando ligado à dentina, os adesivos com os pro- cedimentos de aplicação simplificada (em particular, autocondicionante de único passo) ainda possuem um desempenho inferior em relação aos convencionais. Sabemos que o procedimento de preparo cavitário realizado por ins- trumentos rotatórios forma uma camada amorfa na superfície dental de- nominada smear layer ou lama dentinária, contendo fibras colágenas, cris- tais de hidroxiapatita, além de sangue, saliva e bactérias. A presença da smear layer aderida à superfície dentinária pode comprometer a adesão, sendo indicada sua remoção através do condicionamento ácido total e hibridização da dentina para produzir interfaces adesivas mais seguras e duráveis. Contudo, estudos desenvolvidos com sistemas adesivos auto- condicionantes, baseados na incorporação da smear layer à camada hí- brida, têm obtido resultados promissores em relação à adesão, eliminando o risco de impregnação incompleta do colágeno desmineralizado, como se observa comumente com os sistemas convencionais. Todavia, devido à sua menor acidez, a efetividade destes materiais pode ficar prejudicada, levando a resultados inferiores em relação aos sistemas que empregam o condicionamento total. Baseado nisso, Pleffken et al. (2011) avaliaram a influência de modificações na técnica de aplicação dos sistemas adesivos autocondicionantes sobre a resistência adesiva à dentina, visando melho- rar a seu desempenho. Foram utilizados 255 dentes bovinos que foram embutidos em resina acrílica e tiveram a superfície vestibular desgastada até a exposição da dentina. Eles foram divididos em quatro grupos expe- 37 rimentais, dependendo do sistema adesivo autocondicionante aplicado, e um grupo controle que recebeu um adesivo que utiliza condicionamento ácido total. Cada grupo experimental foi dividido em quatro subgrupos, recebendo a aplicação de uma ou duas camadas dos sistemas autocon- dicionantes, de forma ativa ou passiva. Foram confeccionados sobre a área de adesão cilindros de resina composta Z250 (3M/ESPE, St. Paul, Mn, USA). Os espécimes foram submetidos ao ensaio de cisalhamento e os dados analisados estatisticamente. Os autores concluíram que a apli- cação dos sistemas adesivos de forma ativa promoveu uma melhora sig- nificativa na resistência adesiva à dentina em relação à aplicação de for- ma passiva. Yassen et al. (2011) realizaram um estudo com objetivo de analisar estudos in vitro e in situ ,que compararam diretamente o uso de dentes bovinos como um substituto para dentes humanos em experi- mentos odontológicos. A pesquisa foi incluiu artigos publicados de 30 de dezembro de 1953 até 2010, com as seguintes palavras-chave: "dente, bovino, humano" ou "dentina, bovino, humano" ou "esmalte, bovino, hu- mano". Os resumos dos trabalhos resultantes da pesquisa com estas pa- lavras-chave foram analisados. Apenas artigos originais escritos em in- glês e comparando diretamente substratos humanos e bovinos foram in- cluídos na revisão. A pesquisa foi complementada por busca manual das referências de cada artigo identificado. De 76 estudos inicialmente sele- cionados, 68 preencheram os critérios de seleção para a inclusão. Os es- tudos foram separados em 7 categorias: morfologia dental, composição química, propriedades físicas, cárie dentária, erosão/abrasão dentária, resistência adesiva e microinfiltração marginal. Os autores concluíram qie existem dados inconsistentes, sobre se dentes bovinos podem ser consi- derados um substituto apropriado para os dentes humanos, na pesquisa odontológica. Morfológica, composição química e diferenças de proprie- dades físicas entre os dois substratos devem ser considerados na inter- 38 pretação dos resultados obtidos a partir de qualquer experimento com substrato de dente bovino. Sistemas adesivos atuais oferecem resultados imediatos favoráveis em termos de resistência adesiva. No entanto, a durabilidade das restaurações adesivas tem sido vista como um grande problema. Pa- rece que a simplificação das técnicas adesivas, prejudica a estabilidade ao longo do tempo da interface resina-dentina. A pressão hidrostática pul- par, o fluxo do fluido dentinário e a umidade na dentina pode afetar a inte- ração íntima de alguns monômeros resinosos dos sistemas adesivos com o tecido dentinário. Degradação na camada híbrida ocorre através da ab- sorção da água, esta provoca a hidrólise das ligações dos monômeros, e consequentemente ativação das metaloproteinases endógenas, presentes na interface dentinária. Manuja et al. (2012) relataram nesta revisão de literatura que as etapas realizadas nos adesivos convencionais continuam sendo o padrão ouro em termos de durabilidade. Scheffel et al., em 2012 realizaram um estudo para de- terminar o efeito do tempo de condicionamento ácido na dentina na solu- bilização do cálcio Foram realizados desgaste na superfície oclusal ob- tendo superfícies planas de dentina exposta em dentes decíduos (n = 8) e em dentes permanentes livres de cáre (n = 8). Três áreas de 2 mm de diâmetro foram delimitadas em cada superfície e atribuída a 5, 10 ou 15 s de condicionamento ácido. Cinco microlitros de H3PO4 a 35%, foram apli- cados em cada área, durante os tempos predeterminados, e 4 microlitros foram recuperados para análise. A quantidade de cálcio foi determinada colorimetricamente usando reagente de Arsenazo III e expressa como microg Ca/mm2 da dentina. Os dados foram submetidos a ANOVA 2 fato- res, e teste de Tukey (alfa = 5%). Para a dentina dos decíduos e perma- nentes, foi observada uma correlação estatisticamente significativa entre o tempo de condicionamento ácido e concentração de cálcio (decíduo R2 = 0,79; permanente R2 = 0,73). Valores de média (DP) da dentina decídua desmineralizada após 5, 10 e 15 s, foi de 1,00 (0,25); 1,74 (0,11) e 2,30 39 (0,42), ao passo que para a dentina permanente, os valores foram 0,47 (0,13) 0,89 (0,36) e 1,38 (0,20) mcg Ca/mm2, respectivamente. Observa- ram um aumento diretamente proporcional ao tempo de condicionamento nas duas dentinas analisadas. Mais solubilização de cálcio (P < 0,05) foi detectada para a dentina decídua do que para na dentina permanente, depois de todos os tempos de condicionamento ácido. 2.2 Diferentes substâncias utilizadas parar melhorar a união adesiva da resina composta à dentina: Clorexidina, Ácido hialurônico e Vita- mina C 2.2.1 Clorexidina Gendron e colaboradores (1999) avaliaram o efeito inibitório da clorexidina (CHX) na atvidade das: MMP-2 (gelatinase A), MMP-9 (gelatinase B) e MMP-8 (colagenase 2). Foram usadas 1,5 U/ml MMP-2 em 50 mM NaCl –20mM Tris-HCl, e 20 μg/ml de MMP-9 em 5 mM Tris-HCl, contendo 0,1 mM CaCl2, Brij 35 e glicerol 10%. Ambas gelatina- ses foram ativadas após incubação por 30 min a 37ºC em 0,5 mM de p- aminofenil mercúrio acetato (APMA). As MMPs-2 (3 μl) e 9 (5 μl) ativadas foram incubadas com 10 μl de CLX e 5 μl de 50 mM Tris-HCl por 30 min em temperatura ambiente. As concentrações finais de CLX preparadas em água destilada testadas, foram 0,03%, 0,015% 0,008%, 0,004%, 0,002% e 0,0001%. EDTA 10 mM foi usado como controle na inibição da atividade das MMPs -2 e -9. Após a incubação, as amostras foram aque- cidas por 30 min a 60ºC na presença de solução tampão de eletroforese e as proteínas coradas. O efeito inibitório da CLX foi analisado na presença de 0,75 mM CaCl2, que foi adicionado ao ensaio. A atividade da MMP-8 40 foi tratada ou não tratada com 0,005; 0,01 ou 0,02% de CLX e incubada com 1,5 μM de colágeno tipo I a 3 mg/ml em 50 mM Tris-HCl – 0,2 M Na- Cl – 0,5 mM CaCl2 por 12 h a 22ºC. Produtos da quebra do colágeno fo- ram testados por eletroforese e corados. Sendo avaliados na ausência ou presença de 1 mM APMA, ativador da MMP-8 latente. A concentração de CLX a 0,03% inibiu completamente a atividade das MMPs 2 e 9, sendo sua ação inibidora dependente da concentração. A dose mínima capaz de inibir a atividade da MMP-9 foi de 0,002%, a MMP-2 foi mais susceptível a ação inibidora sendo inativada por uma concentração de 0,0001%. A ati- vidade da MMP-8 sem APMA foi completamente inibida pela CLX 0,02% e 0,01%. Os autores concluiram que o efeito inibitório da clorexidina sobre as metaloproteinases ocorre através de uma ação quelante, ou seja, se- qüestradora de cálcio. Hebling et al. (2005) avaliaram a degradação da interface adesiva usando um sistema adesivo convencional associado ou não a CLX após o condicionamento com ácido fosfórico. Vinte e oito crianças (8 – 12 anos) com molares decíduos bilaterais cariados, que necessitavam de preparos foram selecionadas, sendo que somente 11 delas foram se- lecionadas pelos dentes que permanecerem na cavidade oral 6 meses, antes de serem extraídos. Oito das 11 crianças tiveram pelo menos um dos dois dentes restaurados esfoliados antes de 6 meses, sendo retirados da pesquisa. No grupo controle foi aplicado o ácido fosfórico por 15 s, em seguida recebeu o sistema adesivo Single Bond e restauração com resina composta. O Grupo experimental recebeu tratamento semelhante ao gru- po controle, porém previamente ao sistema adesivo foi aplicado a clorexi- dina 2%. Após 6 meses os dentes decíduos foram extraídos, e secciona- dos em 4 partes de 1,0 mm. Duas amostras de cada dente foram selecio- nados aleatoriamente e imersos em solução de nitrato de prata a 50%, por 24 h e em seguida avaliados em MET. As amostras restantes foram completamente desmineralizados e tiveram também sua interface adesiva avaliada. Houve uma maior extensão de depósitos de nitrato de prata nas 41 amostras do grupo controle que não foi desmineralizados. Os grupos em que foram aplicados CLX e desmineralizados para análise, apresentaram uma camada híbrida sem falha com a rede de fibras colágenas intactas, enquanto no grupo controle que foi desmineralizado apresentou falhas no interior da camada híbrida e degradação da rede de fibras colágenas. Os autores concluiram que a clorexidina evita a degradação da matriz colá- gena dentinária da camada híbrida, in vivo. Em 2007 Brackett et al. avaliaram através de MET e mi- crotração a degradação de camada híbrida de restaurações adesivas na face oclusal quando a dentina foi tratada com clorexidina, um estudo in vivo. Premolares hígidos que tinham indicação a extração ortodôntica fo- ram preparados, restaurados e avaliados após dois ou seis meses respec- tivamente. O sistema adesivo empregado foi o Single Bond. Somente o grupo experimental recebeu aplicação de uma solução a 2% de digluco- nato de clorexidina, previamente ao sistema adesivo. Após as extrações, cada dente foi seccionado em quatro fatias no sentido vestíbulo-lingual com 1 mm de espessura cada. Duas fatias foram analisadas em MET. Com o objetivo de confirmar que a aplicação da clorexidina não alterou a resistência adesiva, nas outras duas fatias foi realizado o teste de micro- tração. A resistência adesiva foi calculada, e os dados foram analisados estatisticamente. Os resultados revelaram que nenhuma degradação na camada hibrida ocorreu em ambos os grupos após dois meses. Leve de- gradação foi observada no grupo de controle após seis meses, mas não foi observado no grupo experimental. A utilização de uma solução de clo- rexidina, previamente a aplicação do sistema adesivo parece não ter efei- tos prejudiciais tanto para a resitência adesiva ou na manutenção clínica de restaurações Classe I de resina composta após dois meses e seis me- ses. As metaloproteinases de matriz (MMPs) são proteinases que partcipam da degradação do colágeno da camada híbrida e conse- qüentemente ocasionam a diminuição da resistência adesiva. Carrilho et 42 al. (2007a) verificaram se as falhas que ocorrem na camada híbrida que compromete a estabilidade da interface adesiva poderiam ser desacelera- das na presença da clorexidina pela inibiçãos das MMPs evitando assim a degradação da interface adesiva. Para isso foram realizados cavidades classe I em sete terceiros molares, que foram seccionados em duas hemi- coroas no sentido vestíbulo-lingual. Metade de cada dente foi restaurado de acordo com as recomendações do fabricante e a outra foi tratada com a substância bioativa clorexidina 2% após o condicionamento ácido por 1 min, em seguida o excesso de solução foi removido com papel absorven- te, e restaurados da mesma forma que grupo não tratado. Após o proce- dimento restaurador os dentes foram armazenados em água destilada a 37°C durante uma semana. Então, os dentes foram seccionados longitu- dinalmente para obtenção dos palitos. De 8 a 10 palitos foram obtidos. Um terço dos espécimes foram testados imediatamente, enquanto que os palitos restantes foram aleatoriamente divididos e armazenados a 37 °C durante 6 meses em saliva artificial (pH 7,1) contendo ou não inibidores da enzima proteolítica. O meio de armazenamento foi substituído sema- nalmente. Após o tempo de armazenamento determinado os espécimes foram fraturados para obter o valres de resistências adesiva. O pré- tratamento com clorexidina não prejudicou a resistência adesiva dos es- pécimes testados no período imediato. O armazenamento de seis meses resultou na redução significativa da resistência adesiva de todos os gru- pos. Armazenamento em saliva artificial sem inibidores da protease redu- ziu a resistência adesiva no grupo controle em 45,3%. No grupo da clore- xidina a resistência adesiva foi significativamente maior com redução de apenas 23,4%. O armazenamento em saliva artificial contendo inibidores de protease não afetou a resistência adesiva quando comparado com a- queles armazenados em saliva artificial sem inibidores de protease. O tipo de fratura que mais ocorre nas amostras do grupo controle, independen- temente da solução de armazenamento e do tempo, ocorreu na camada híbrida. No entanto, depois de 6 meses de armazenamento, a falha no 43 grupo da clorexidina foi predominantemente nas camadas adesiva e resi- na composta. Os autores relataram que tal fato demonstra a manutenção da matriz colagenosa da camada híbrida. Os autores concluíram que a clorexidina é grande valia para a preservação da camada híbrida ao longo do tempo. Bengston et al. (2008) avaliaram in vitro a influência da solução de digluconato de clorexidina 2% na adesão de dois sistemas adesivos (convencional e autocondicionante) à dentina de molares huma- nos. Foram utilizados 40 terceiros molares humanos livres de cárie, com a face oclusal lixada até a exposição dentinária. Os dentes foram divididos em 4 grupos (n=10) de acordo com o sistema adesivo utilizado e trata- mento: G1 – Controle do sistema adesivo convencional (Single Bond); G2 – Controle do sistema adesivo autocondicionante Clearfil SE Bond; G3 – Aplicação da clorexidina + Single Bond; G4 – Aplicação da clorexidina + Clearfil SE Bond. Em seguida foi realizada a restauração com resina composta e os dentes foram armazenados em água destilada à 37 ºC por 24 h. As amostras foram seccionadas para obtenção dos palitos, que fo- ram tracionados em máquina de ensaios universal. Os resultados de re- sistência adesiva foram analisados usando os testes estatísticos ANOVA e Tukey (p<0,05). Fatias de dentina foram obtidos de 3 dentes adicionais e as superfícies submetidas aos mesmos tratamentos realizados para o teste de microtração e foram observadas em MEV. Não foram encontra- das diferenças estatísticas entre os grupos controles (G1 = 31,52 ± 6,24 e G2 = 42,88 ± 2,31) e os grupos tratados com clorexidina (G3 = 34,41 ± 6,92 e G4 = 40,14 ±2,91). A solução de clorexidina 2% não interferiu na resistência de união dos sistemas adesivos utilizados. Beraldo e Andrade em 2008 realizaram um estudo em que analisaram as meta-análises e ensaios clínicos randomizados inde- xados no Medical Literature Analysis and Retrieval System e Cumulative Index para Enfermagem e bancos de dados Literatura Allied Health sobre o uso tópico de clorexidina na prevenção da pneumonia associada a ven- 44 tilação mecânica(PAV). Oito publicações foram analisadas, em sete delas (87,5%) a clorexidina diminuiu a colonização da orofaringe, e em quatro (50%), houve uma redução de PAV. Os autores conluiram que a clorexidi- na pode diminuir a colonização de bactérias, reduzindo assim a incidência de PAV. Em 2009 Breschi et al. avaliaram o efeito da clorexidina (CLX) a 0,2% e 2% sendo aplicado como um primer terapêutico na ade- são de sistemas adesivos convencionais. Cento e oito terceiros molares livres de cárie tiveram o esmalte e dentina superficial oclusal. As superfí- cies foram condicionadas com ácido fosfórico por 15 s. Os espécimes fo- ram divididos aleatoriamente em 6 grupos (n= 18) de acordo com o trata- mento de superfície: G1-CLX 0,2% aplicado antes do sistema adesivo Adper Scotchbond 1XT (SB1); G2- CLX 2% aplicado antes do sistema adesivo SB1; G3- aplicação do sistema adesivo sem tratamento dentinário (controle); G4- CLX 0,2% aplicado antes do sistema adesivo XP-Bond (XPB); G5- CLX 2% aplicado antes do sistema adesivo XPB e G6- aplica- ção do XPB sem tratamento prévio (controle). A CLX foi aplicada na su- perfície condicionada por 30 s e levemente seca. Aplicação dos sistemas adesivos foi de acordo com as instruções dos fabricantes e em seguida foi realizada a restauração adesiva com RC. Foi então realizada a secção dos espécimes para obtenção dos palitos, que foram subdivididos em 3 grupos de armazenamento (por 24 h, 6 meses e 12 meses em saliva arti- ficial a 37 ºC). Após cada período de armazenamento foi realizado teste de microtração. Os grupos SB1 e XPB apresentaram valores imediatos de resistenca adesiva semelhantes com ou sem tratamento com CLX. Após 6 meses os controles que não receberam tratamento com CLX apresenta- ram menor valor de resistência adesiva. Após 12 meses os controles tive- ram redução da resistência adesiva em 54% (SB1) e 65% (XPB), enquan- to os grupos tratados com CLX reduziram a resistência adesiva em 21% e 32%, respectivamente. As duas concentrações de CLX não apresentaram diferença estatística com relação ao tempo de armazenamento ou tipo de 45 sistema adesivo utilizado (p > 0,05). Doze espécimes (n= 2) adicionais foram preparados para análise de nanoinfiltração, e mostraram que após 6 e 12 meses houve um aumento da nanoinfiltração nos grupos controles, enquanto nos grupos tratados com CLX apresentaram pouca nanoinfiltra- ção em ambas concentrações e sistema adesivo. Com isso, os autores concluíram que fatores endógenos responsáveis pela degradação da in- terface adesiva podem ser inibidos pela CLX. Loguercio et al. (2009) analisaram a influencia na preser- vação da interface adesiva tratada com CLX em diferentes concentrações e tempo, usando sistemas adesivos convencionais: Adper Single Bond e Prime & Bond. Cento e vinte terceiros molares hígidos tiveram a dentina oclusal exposta. Experimento 1- Metade dos espécimes foram subdividos em 6 grupo (n=10) de acordo com o pré-tratamento, ou seja, condiciona- dos com ácido fosfórico a 37%, por 15 s, lavados por 15 s, secos e re- hidratados com água (controle), CLX a 0,002%, 0,02%, 0,2%, 2% e 4% por 60 s. A aplicação dos sistemas adesivos e das restauração com RC, seguiram as especificações instruções dos fabricantes. Experimento 2- Os outros 60 dentes foram subdivididos em 6 grupos, sendo que após o con- dicionamento ácido, foram rehidratados com água (controle), CLX 0,002% e 2% por 15 s, aplicação do sistema adesivo e restauração com RC. Os espécimes foram seccionados em palitos e divididos aleatoriamente para o teste de microtração. Metade dos espécimes (n= 5) foram testados ime- diatamente e a outra metade após 6 meses de armazenamento em água destilada 37 ºC. No primeiro experimento, o grupo controle teve sua resis- tência adesiva reduzida após reidratação. Na segunda etapa, houve uma redução significativa na resistência adesiva em ambos os sistemas adesi- vos quando rehidratados com água. No entanto, a reidratação com CLX em diferentes concentrações e tempo de armazenamento após 6 meses manteve a interface adesiva estável. Os autores concluíram que o uso da CLX 0,002% por 15 s, pode ser suficiente para preservar a interface ade- siva dentinária por 6 meses. 46 Chang e Shin (2010) analisaram o efeito da clorexidina (CLX) com relação ao tipo de aplicação na interface adesiva dentinária. Cinquenta molares hígidos tiveram a superfície oclusal desgastada para exposição da dentina. Os espécimes foram divididos aleatoriamente em 5 grupos (n= 10). G1: tratamento da cavidade com CLX 2% por 20 s, lava- gem com água por 20 s e condicionamento com ácido fosfórico 37% por 10 s, lavagem por 10 s, leve secagem por 10 s, aplicação do sistema ade- sivo Singe Bond 2 s o fabricante e restauração adesiva; G2: semelhante ao grupo 1, mas a CLX não foi removida; G3: CLX 2% aplicada após o condicionamento ácido, por 20 s, e lavagem por 20 s; G4: CLX 2% aplica- do de forma semelhante ao grupo 3, sem lavagem; G5: grupo controle, sem tratamento da CLX. Os grupos foram subdivididos em dois subgrupo de acord com o tipo de armazenamento: em água por 24 h e submetidos a 10.000 ciclos de termociclagem. Os espécimes foram seccionados lon- gitudinalmente para obtenção de palitos para o teste de microtração, que mostraram que o tratamento com CLX não alterou a resistência adesiva in vitro, no entanto a termociclagem reduziu significantemente a força adesi- va no grupo controle (p< 0,001). O Pré tratamento com a clorexidina não afetou a RA no grupo imediato, quando commparado com o grupo contro- le. Entretanto, após a ciclagem uma redução significativa foi observada no grupo controle. Em geral, a aplicação Ca CLX não apresentou diferença estatística significante. No entanto, houve diferença significante após a termociclagem nos grupos tratados com CLX antes do condicionamento e não houve diferença significante nos grupos tratados com a CLX após o consdicionamento. Breschi et al., em 2010 realizaram um estudo que avaliou o papel das MMPs dentinárias na degradação das fibras colágenas na interface adesiva com ou sem tratamento com CLX. Para isso, 10 molares sem cáries foram selecionados, e tiveram a dentina superficila exposta que foi pulverizada em nitrogênio líquido para obtenção do pó de dentina, obtendo-se 5 alíquotas com 1 g cada: G1- dentina mineralizada sem tra- 47 tamento; G2- dentina desmineralizada por 10 min em 1% de ácido fosfóri- co; G3- dentina mineralizada tratada com 3 ml de Adper Scotchbond 1XT (SB1XT) por 24 h a 4 ºC; G4 e G5- dentina mineralizada tratada previa- mente com 0,2% e 2% de CLX (respectivamente), por 30 min a 4ºC, lava- da com 1 ml de água destilada e aplicado o sistema adesivo de forma semelhante ao grupo 3. Em seguida, os espécimes foram centrifugados para precipitação e extração das proteínas mineralizadas e parcialmente desmineralizadas do pó de dentina, sendo a concentração dessas proteí- nas determinadas. Elas sofreram eletroforese, com ativação pela solução APMA (p-aminophenylmercuric acetate) e incubadas em solução tampão para zimografia, que analisou as atividades das MMPs. O controle foi in- cubado em EDTA com inibidor de gelatinases. Adicionalmente 48 molares foram seccionados para exposição da dentina oclusal que foi condiciona- da com ácido fosfórico 35% e divididos em três grupos (n=18): G1 e G2- pré-tratamento após o condicionamento com CLX 0,2% e 2% respectiva- mente, por 30 s, secagem e aplicação do sistema adesivo; G3- controle. Os espécimes foram subdivididos (n=9) e submetidos ao teste de micro- tração imediato e após 2 anos de armazenamento em saliva artificial. A análise zimográfica não mostrou atividade de proteínas na dentina mine- ralizada, o grupo desmineralizado com ácido fosfórico apresentou formas ativas de MMP-2 e -9, assim como no grupo tratado com SB1XT. No en- tanto os grupos tratados com CLX 0,2% e 2% apresentaram inibição das MMPs -2 e -9. Quanto a microtração, só houve diferença após 2 anos de armazenamento, com redução em 67% da resistencia adesiva no grupo controle, e apenas 16% no grupo tratado com CLX 0,2% (32,6 ± 8,3 MPa) e 30% tratado com CLX 2% (28,5 ± 7,2 MPa), revelando a efetiva ação inibitória das MMPs pela CLX. Ricci et al. (2010) avaliaram a estabilidade mecânica da interface adesiva resina-dentina realizada in vivo na presença de clorexi- dina. Crianças com pelo menos um par de molares decíduos bilaterais com lesões cariosas oclusais, foram incluídas no estudo. Após a prepara- 48 ção da cavidade e aplicação do ácido fosfórico, a dentina foi tratada com 5 microlitros de clorexidina 2% (grupo experimental) ou água deionizada (grupo controle). Treze pares de dentes foram restaurados e foram cole- tadas após a esfoliação fisiológica. Os períodos em função oral após a restauração foram divididos da seguinte forma: até 30 dias, e 1-5, 10-12 e 18-20 meses. Espécimes em forma de palitos com 0,81 milímetros2 foram obtidos e submetidos a testes de microtração. Uma redução significativa da resistência adesiva foi observada no grupo controle a partir do período de 1-5 meses (30,6%), entretanto no grupo experimental, esta diminuição começou apenas 10-12 meses após o período de função (26,3%). Os au- tores concluíram que o uso da clorexidina como coadjuvante na adesão dentinária não produziu qualquer efeito deletério para a resistência adesi- va imediata e foi capaz de reduzir a taxa de degradação da camada híbri- da, nos primeiros meses após a restauração. Osório et al. (2011). As Metaloproteinases da matriz dentinária (MMPs) estão envolvidas na degradação do colágeno da interface adesiva. Este estudo avaliou se a degradação do colágeno pode ser diminuida com a aplicação da clorexidina (CHX), após diferentes protocolo de desmineralização da dentina. Dez terceiros molares hígidos foram extraidos e armazenados por uma semana. Um Disco de dentina (0,75 ± 0,08 mm de espessura), foi obtido a partir da porção central de cada coroa. Quatro fatias de dentina (0,75 mm x 0,75 mm × 5,0 mm) foram obtidas a partir de cada disco, assim, 40 fatias de dentina estavam disponíveis. A desmineralização da dentina foi realizada com ácido fosfórico (PA), EDTA ou monómeros ácidos (Clearfil SE Bond e Xeno V). As amostras foram armazenadas (por 24 h, 1 e 3 semanas), na presença ou ausência de CHX. Em metade dos grupos, MMP-2 ativa foi incorporada na solução de armazenamento. No final de cada período de armazenamento, a quantidade de colágeno do Tipo I foi verificado pelo ensaio imunoenzimático tipo I. Os resultados mostraram que a degradação do colágeno foi maior no grupo PA e EDTA. A clorexidina 49 reduziu a degradação do colágeno nestes grupos apenas por 24 h. Quando a dentina foi desmineralizada com Clearfil SE Bond ou V Xeno, a degradação do colágeno foi reduzida em até 30%, mas a adição de MMP- 2 exógena aumentou a degradação do colágeno. Nestes mesmo grupos, o efeito inibitório da CHX nas MMPs, durou até 3 semanas. Os autores concluiram que a CHX possui efeito inibidor da atividade de MMPs. A degradação do colágeno por MMPs é menor na dentina tratada por adesivos autocondicionantes, pois a infiltração de monômero pode exercer proteção ao colágeno desmineralizado, provavelmente através da imobilização de MMPs. Kim et al. (2011) realizaram um estudo com objetivo de avaliar a influência de diferentes concentrações de clorexidina (CHX) no processo de remineralização e desmineralização da dentina. Blocos de dentina (2 mm x 7 mm x 0,9 m) foram desmineralizados em solução 0,2 M de ácido fórmico. Quantidade de CHX foi mensurada num espectrofotómetro e em seguida os blocos de dentina foram embebidos em soluções de CHX 0,02%, 0,2%, 2%, durante 1 min. A mudança no módulo de elasticidade dos blocos de dentina armazenada foi medida inicialmente, 2, 4, e 6 semanas após o armazenamento. Os aspectos micromorfológicos das amostras foram observadas no MEV, depois de 6 semanas de armazenamento. O grupo tratado com a concentração mais elevada de CHX reduziu o módulo de elasticidade em 2 semanas e um maior aumento foi verificado em 4 a 6 semanas. Amostras de dentina com a CHX 0,2% e 2%, depositaram maior quantidade de minerais granulares ao longo das fibras colágenas em comparação com o grupo 0,02% CHX. A aplicação de 0,2% a 2% CHX, pareceu ser eficaz em promover a remineralização da dentina desmineralizada. Stanislawczuk et al. (2011) avalaram o efeito do gel de á- cido fosfórico contendo CLX 2% e da solução aquosa de CLX 2%, na re- sistência adesiva imediata e após 2 anos, de dois tipos de sistemas ade- sivos convencionais. Quarenta e dois terceiros molares tiveram a superfí- 50 cie dentinária exposta. Nos grupos controle as superfícies foram condicio- nadas com ácido fosfórico, sem CLX, lavadas, secas e rehidratadas com água, e aplicados os sistemas adesivos Single Bond 2 (SB) e Pri- me&Bond (PB). Nos grupos condicionados com ácido fosfórico com CLX, os adesivos foram aplicados da mesma forma que no grupo controle. Nos grupos CLX, a reidratação após condicionamento ácido, foi feita com CLX 2% por 60 s. Após os tempos de armazenamento em água destilada os espécimes foram submetidos ao teste de microtração e os tipos de fratura classificados em coesiva, adesiva ou mista. Após 2 anos, houve uma re- dução significativa nos valores de resistencia adesiva nos grupos contro- les (p< 0,05), enquanto tanto nos grupos condicionados com ácido fosfóri- co com CLX 2%, e nos reidratados com CLX 2% a interface adesiva per- maneceu estável. Os autores do estudo concluiram que a adição de CLX pode aumentar a durabilidade das restarações adesivas por estabilizar as fibras colágenas da camada híbrida. Em 2012 Lafuente avaliou o efeito da aplicação de CLX 2% na camada híbrida usando adesivos convencionais e auto- condicionantes em dentes humanos, após armazenamento em água. Fo- ram realizados preparos cavitário do tipo MO e OD com 1,0 mm de pare- de de esmalte separando-as em 6 molares e 6 premolares. Os grupos experimentais foram: G1- as cavidades mesiais foram condicionadas com ácido fosfórico 37%, aplicação do sistema adesivo- Adper Single Bond 2 (SB2): e restauração adesiva; G2- nas cavidades distais foi aplicado CLX 2% por 30 s, após condicionamento ácido e remoção do excesso antes da aplicação do adesivo - Adper SE Plus. Todos os espécimes foram seccio- nados mesio-distalmente e armazenados em água por 125 dias a 37 ºC. Após o período de armazenamento, os espécimes tiveram sua interface adesiva analisadas em MEV em duas variáveis: imagem clara da camada híbrida em pelo menos 75% da extensão da interface adesiva, e presença de tags resinosos nos túbulos dentinários. Os espécimes tratados com CLX apresentaram uma camada híbrida mais espessa. O sistema adesivo 51 SB2 apresentou uma camada híbrida mais homogênea que o SEP. Am- bos os sistemas adesivos não tratados com CLX, apresentaram uma ca- mada híbrida com falhas ao longo da interface em metade das amostras. Em 3 das amostras SB2 não tratados com CLX não apresentavam tags resinosos ou estes eram muito pequenos, o que não ocorreu com os es- pécimes tratados com CLX. Os autores concluíram que o uso da CLX 2%, antes da aplicação do sistema adesivo, reduziu a degradação da camada híbrida quando armazenados em água, mas sem influenciar na formação dos tags resinosos nos túbulos dentinários. Kato et al. (2012) avaliaram se a redução da degradação da matriz orgânica desmineralizada (DOM) pelo tratamento com os inibidores da protease (PI) com a hipótese de a clorexidina ser eficaz contra a perda da matriz orgânica da dentina. Fatias de dentina foram desmineralizadas com ácido cítrico 0,87 M, pH 2,3, por 36 h. Na sequência, as amostras foram tratadas ou não, durante 1 min com géis contendo 3-epigalocatequina galato (EGCG, 400 | iM), clorexidina (CLX, 0,012%), FeSO (4) (1 mM), NaF (1,23 %), ou nenhum composto ativo (P, placebo). As amostras foram então armazenadas em saliva artificial (5 dias, 37 °C) com adição de colagenase (Clostridium histolyticum, 100 U / mL). Foi avaliado por ensaio de hidroxiprolina (HYP) a degradação do colágeno (n= 5), e avaliaram a perda da matriz de dentina por perfilometria (n= 12). Os resultados demonstraram que o tratamento com o gel contendo CLX, reduziu a degradação do colágeno e também a perda da matriz orgânica dentinaria. Os resultados deste estudo sugerem que a clorexidina é capaz de prevenir a erosão dentinaria devido à sua capacidade de reduzir a degradação da matriz orgânica desmineralizada. 52 2.2.2 Ácido hialurônico Campo et al., em 2004, realizaram uma pesquisa com ob- jetivo de avaliar os efeitos antioxidantes do HA no tratamento fibrose he- pática. A fibrose hepática envolve interação com vários fatores, incluindo espécies reativas ao oxigênio. Os glicosaminoglicanos (GAGs) que inclu- em o ácido hialurônico (HA) e condroitina-4-sulfato (C4S) possuem pro- priedades antioxidantes. Terapia com HA (25 mg/kg) foram administradas diariamente durante 6 semanas. Os dados obtidos mostraram que essas moléculas foram capazes de limitar a lesão hepática crônica e fibrose he- pática através do HA exercer mecanismo antioxidante. Liao et al., em 2005, relataram que o HA possui a capaci- dade de estabilizar as estruturas e de absorver choques. Atua como me- diador de funções fisiológicas através da interação com proteínas de liga- ção e como receptores celular incluindo a morfogênese, a regeneração, cicatrização e invasão de tumor. A natureza única viscoelástica do ácido hialurônico, juntamente com sua biocompatibilidade levou à sua utilização em vários tipos de cosméticos, e em aplicações médicas e farmacêuticas. Halicka et al., em 2009, observaram que o ácido hialurô- nico protege o DNA das células dos danos causados pelos oxidantes en- dógeno e exógeno e também é capaz de atenuar o processo inflamatório. Mendes et al. (2008) avaliaram os efeitos do ácido hialurônico (AH) no processo de cicatrização óssea em dentes recém extraidos. Imediatamente após a extração dos molares superiores de ratos, os alveolos da hemi arcada direita foi tratada com gel de 1% AH (aproximadamente 0,1 ml), enquanto que os alveolos esquerdos foram utilizados como controle (coágulo sanguíneo). Os animais foram sacrificados 2, 7 e 21 dias após e foi realizada a análise histológica e morfométrica dos terços apical e médio. A análise histológica mostrou que o tratamento com AH induziu a deposição óssea resultando em uma 53 matriz óssea mais organizado, aos 7 e 21 dias após a extração do dente. Além disso, o AH aumentou a quantidade de osso trabecular nos 7 e 21 dias após a extração dos dentes (osso trabecular de 7 dias: 13,21 (HY); 2,58 (controle). Os autores concluiram que o AH acelera o processo de cicatrização em alveolos de dentes extraidos de ratos pois estimulam a expressão de proteínas osteogénicas. Mendes et al. (2010) verificaram em seu estudo a possibilidade do ácido hialurônico (AH) acelerar o reparo de defeitos ósseos. No entanto, a estabilidade de formulações de AH fraco em ambientes aquosos tem dificultado a sua vasta utilização com isso a hipótese deste estudo era se a adição de nanotubos de carbono (SWCNT) em AH (HY-SWCNT) resultaria em um hidrogel reforçado com uma maior estabilidade. Para isso ratos foram submetidos a extração dos molares e os alvéolos foram tratados com SWCNT (50-400 ug / mL) + 1% de AH, ou carbopol (veículo). Depois de sete dias após a cirurgia, as análises histológica e morfométrica foram realizadas para avaliar a formação de osso trabecular. A expressão de colágeno tipo I e III foi determinada por imuno-histoquímica. Os autores observaram que o tratamento com SWCNT não alterou a deposição óssea. Em contraste, a adição de ácido hialuronico 1% induziu um aumento acentuado na formação de osso (AH:10,10 ± 1,99%; controle:3,69 ± 1,17%). Além disso, o colágeno tipo I aumentou com o tratamento com o AH. Bogovic et al., em 2011, investigaram os efeitos do ácido hialurônico na proliferação dos odontoblastos e fibroblastos e a possibili- dade de utilizá-lo como capeamento pulpar direto, comparando com hi- dróxido de cálcio e adesivo dentinário. Após o sacrifício dos ratos, os dentes foram imediatamente extraídos e seccionados transversalmente através da polpa. Os cortes foram colocados em meio de cultura com cé- lulas de soro bovino fetal a 10%. Durante duas semanas os espécimes foram tratados com ácido hialurônico, hidróxido de cálcio e adesivo denti- nário. A celularidade e a viabilidade dos fibroblastos e odontoblastos fo- 54 ram analisados utilizando um hemocitómetro. Em comparação com o gru- po controle o número de células e a viabilidade de fibroblastos e odonto- blastos foi maior na cultura tratada com ácido hialurônico. Em contraste o número de células necrosadas foi menor também nesta cultura. Na análi- se de viabilidade mostrou também ser menos tóxico e mais biocompatível com a polpa do que o adesivo dentinário e o hidróxido de cálcio. Os resul- tados deste estudo demonstraram alta eficiência terapêutica no tratamen- to de capeamento pulpar utilizando ácido hialurônico. Li et al. (2012), investigaram revestimentos com adição de ácido hialurônico a 1% (AH) para melhorar a biocompatibilidade de liga- mentos artificiais de polietileno tereftalato (PET). Os resultados deste estudos in vitro demonstraram que o AH aumentou significamente a adesão celular, facilitou o crescimento celular , e suprimiu a expressão de genes relacionados com a inflamação em relação a um enxerto controle. In vivo os resultados experimentais em animais mostraram que este o HA inibiu significativamente a infiltração de células inflamatórias e promoveu a regeneração de um novo tecido. Além disso, a formação de colágeno do tipo I no grupo que utilizou AH foi muito maior do que no grupo de controle. 2.2.3 Vitamina C A vitamina C ou ácido ascórbico (AA) é classificada como vitamina hidrossolúvel e termolábil, destruída por temperaturas altas por um período prolongado. Os seres humanos são incapazes de sintetizar o AA, devido à ausência da enzima gulonolactona oxidase, capaz de reali- zar esta síntese a partir da glicose (Nelson D and Cox M 2000). O àcido ascórbico encontra-se predominantemente na sua forma ionizada, o as- corbato (C6H8O) Atua como um antioxidante, sendo usado para transfor- 55 mar os radicais livres de oxigênio em formas inertes (Welch et al., 1995) e é essencial para a formação das fibras colágenas existentes em prati- camente todos os tecidos do corpo humano, incluindo a dentina. O AA é co-fator para duas enzimas férricas essenciais na biossíntese do colágeno, a lisil e prolil hidroxilases (Pinnel et al., 1987). Atua na prevenção da oxidação do ferro desta enzima, evitando sua auto- inativação. Estas enzimas catalisam a hidroxilação dos resíduos prolil e lisil nos polipeptídeos precursores do colágeno, e essas modificações pós-translacionais permitem a formação e estabilização do colágeno de tripla hélice, e sua subseqüente secreção no espaço extracelular como procolágeno (Pinnel et al., 1987). O procolágeno é então transformado em tropocolágeno, (Chan et al., 1990). Dessa forma o AA promove a síntese de uma trama colágena madura e normal por meio da perfeita manuten- ção da atividade das enzimas lisil e propil hidroxilases. Blanck e Peterkofsky (1975) analisaram o estimulo cau- sado pelo ácido ascórbico em fibroblastos, na secreção de colágeno de acordo com o aumento da hidroxilação da prolina, ou seja, pela incorpo- ração da prolina na proteína colágena. A prolina estabiliza a configuração helicoidal do colágeno. A fim de produzir diferentes níveis de hidroxilação, as células foram incubadas com diferentes concentrações de ácido ascór- bico. Relataram que o ácido ascórbico estimulou tanto a hidroxilação da prolina no colágeno, como também sua secreção e afirmaram que a se- creção de colágeno torna-se diretamente proporcional à hidroxilação da prolina. Em 1988, Geesin et al., pesquisaram a influencia do ácido ascórbico no aumento do nível de mRNA (RNA mensageiro) do Procolá- geno do Tipo I e do Tipo III em fibroblastos da pele humana. Em culturas de fibroblastos, a Vitamina C estimula a produção de colágeno, sem qual- quer alteração na degradação intracelular do procolágeno recém- sintetizado. Para entender mais sobre este assunto, os autores mediram os níveis mRNA dos procolágeno de tipo I e tipo III em células tratadas 56 com ascórbico ácido. Observaram um aumento de 3 a 4 vezes na síntese do colágeno, que foi associado a 2 ou 3 vezes o aumento do nível de mRNA, de ambos os tipos de procolágeno. Relataram que estes efeitos estão associados com o controle do ácido ascórbico na translação, ligado ao gene de transcrição do procolágeno ou à degradação do mRNAs. Nomoto et al. (2006) estudaram o efeito do ácido ascórbi- co sobre a resistência adesiva à dentina clareada. As superfícies dentiná- rias de incisivos bovinos foram tratadas por 30 min com peróxido de car- bamida a 10%, peróxido de hidrogênio a 30% ou água destilada. Em se- guida, foram submetidas à aplicação de ácido ascórbico a 10% por 0, 30, 90 e 180 min. Após o condicionamento com ácido cítrico e restauração com resina composta, os espécimes foram preparados para o teste de microtração e análise em MEV. O clareamento reduziu a força de adesão à dentina e promoveu uma grande oxidação superficial. O ácido ascórbico aumentou a força de adesão proporcionalmente ao tempo de aplicação. Concluiu-se que o ácido ascórbico foi capaz de reverter a força de adesão à dentina, após o clareamento. Muraguchi et al. (2007), avaliaram a ação do tratamento clareador e do ácido ascórbico (AA) sobre a resistenca adesiva (RA). To- dos os grupos, com exceção do controle, receberam aplicação do AA a- pós o procedimento clareador. A RA teve seus valores reduzidos após o clareamento porém restabelecida com a aplicação do AA. Com isso, os autores concluíram que o ácido ascórbico foi capaz de reverter a RA re- duzida após o tratamento clareador. Turkun et al. (2009) avaliaram a influencia de diferentes concentrações (2,5%, 5% e 10%) do AA em gel, sobre a RA ao esmalte que recebeu tratamento clareador com peróxido de carbamida a 10%. Neste estudo os autores observaram que a aplicação do gel AA a 10% a resistência adesiva do esmalte clareado foi superior quando comparada com o grupo que não recebeu o tratamento com AA. A concentração de 57 10% AA foi a mais efetiva para restabelecer a adesão após o clareamen- to. Kimyai et al. (2010) investigaram o efeito do ascorbato de sódio em gel ou solução, em dois periodos de tempo de aplicação, na re- sitência adesiva ao esmalte clareado com peróxido de carbamida. Para isso, 72 premolares foram divididos em 6 grupo (n= 12) um controle e cin- co experimentais, que receberam o tratamento clareador com peróxido de carbamida. O grupo dois foi realizado o procedimento adesivo imediata- mente após o clareamento. O grupo 3 e 4 foram clareados e em seguida tratados com solução de AA por 10 min e 3 h, respectivamente, e então foi realizado o procedimento adesivo. Nos grupos 5 e 6 o AA em gel foi aplicado da mesma forma que no grupo 3 e 4. Os resultados deste estudo revelaram que não houve diferença estatística entre o gel e a solução do AA, também verificarm que a resistência adesiva diminui após o tratamen- to clareador e que a resistência adesiva somente foi restabelecida com a aplicação de 3 h da solução ou gel AA após o clareamento com peróxido de carbamida. Soeno et al. (2008) investigaram a eficácia de um condicionador de dentina experimental consistindo de ácido ascórbico (AA) e cloreto férrico (Fe), em termos de resistência adesiva, a hipótese deste estudo era que o ácido ascorbico agiria como agente antioxidante, facilitando a polimerização dos adesivos, resultando em melhora da resistência adesiva. Cinco soluções experimentais foram preparadas e avaliadas: G1 - 10% de AA e 5% de Fe (10AA-5Fe), G2 - 10% de AA e Fe 0% (10AA-0Fe); G3 - 0% de AA e 5% de Fe (0AA-5Fe); G4 - 10% de ácido cítrico e 3% de cloreto férrico (10-3), e, G5 - 0% de AA e Fe 0% (0AA-0Fe). Foram utilizados 20 terceiros molares que tiveram a superficie oclusal removida. As superfícies dentinarias foram tratadas com cada uma das soluções experimentais e posteriormente realizados os testes de microtração. Os melhores resultados de resistência adesiva foram obtidos no grupo que foi tratado com ácido ascorbico 10% e 5% de cloreto férrico. 58 Celik et al. (2010) realizaram um estudo para avaliar os efeitos do ácido ascorbico na resistência de união de diferentes sistemas adesivos, à dentina tratada com hipoclorito de sódio. Oitenta dentes molares extraídos foram utilizados no estudo. As superfícies vestibulares de esmalte foram removida para se obter uma superfície plana na dentina. Os dentes foram inseridos em resina autopolimerizável e as superfícies de dentina foram irrigadas com NaOCl por 10 min. Metade das amostras foi tratada com ácido ascórbico, durante 10 min. Os dentes foram aleatoriamente divididos em quatro subgrupos de acordo com os sistemas adesivos utilizados (Clearfil SE Bond, Clearfil Tri-S Bond, Adper Prompt-L- Pop, Adper Single Bond 2). A resistência adesiva foi determinada com uma máquina universal de ensaios, a uma velocidade de 0,5 mm / min. Os dados foram analisados estatisticamente através d teste ANOVA a dois fatores, com nível de significância de 0,05. Os resultados obtidos revelaram que o efeito da aplicação de ácido ascorbico na resistência de união de sistemas adesivos, à dentina tratado com NaOCl, foi estatisticamente significativa (P < 0,05). Os autores concluiram que a aplicação do ácido ascórbico melhorou a resistência adesiva. Erhardt et al., em 2011, realizaram um estudo com o ob- jetivo de determinar o papel de um agente antioxidante (ácido ascórbico- AA), quando adicionado a fórmula de dois sistemas adesivo, na degrada- ção da interface adesiva. Para isso, a dentina de 48 molares humanos foi exposta e condicionada, em seguida foram aplicados os seguintes siste- mas adesivos de acordo com as recomendações do fabricante: condicio- namento total (Single Bond-SB) e um autocondicionante (Clearfil SE Bond-CSE). Em metade dos espécimes de cada grupo foi aplicado o mesmo sistema adesivo, porém com adição em sua fórmula de AA a 10%. Após aplicação dos sistemas adesivos, foi inserida de forma incremental a resina composta, em seguida os espécimes foram seccionados em forma de palitos (1,0 mm2), onde foram subdivididos em quatro grupos de acor- do com a forma de armazenamento: (1) imersão em água por 24 h, (2) 59 imersão em água por 1 ano; (3) imersão em ág