UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” CAMPUS DE ARAÇATUBA - FACULDADE DE ODONTOLOGIA DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS PROGRAMA MULTICÊNTRICO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FISIOLÓGICAS ANGELA CRISTINA DE NICOLA ATIVIDADE DOS NEURÔNIOS NORADRENÉRGICOS DO LOCUS COERULEUS E O CONTEÚDO DE GnRH EM RATAS WISTAR ACÍCLICAS ARAÇATUBA 2013 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” CAMPUS DE ARAÇATUBA - FACULDADE DE ODONTOLOGIA DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS PROGRAMA MULTICÊNTRICO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FISIOLÓGICAS ATIVIDADE DOS NEURÔNIOS NORADRENÉRGICOS DO LOCUS COERULEUS E O CONTEÚDO DE GnRH EM RATAS WISTAR ACÍCLICAS Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação Multicêntrico em Ciências Fisiológicas para obtenção do título de mestre em Ciências Fisiológicas. Área de Concentração: Fisiologia Orientada: Angela Cristina de Nicola Orientadora: Profª Drª Rita Cássia Menegati Dornelles Co-orientadora: Profª Drª Janete Aparecida Anselmo- Franci ARAÇATUBA 2013 Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte. Catalogação na Publicação (CIP) Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação – FOA / UNESP Nicola, Angela Cristina de. N634a Atividade dos neurônios noradrenérgicos do Locus coeruleus e o conteúdo de GnRH em ratas Wistar acíclicas / Angela Cristina de Nicola. - Araçatuba, 2013 77 f. : il. + 1 CD-ROM Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Odontologia de Araçatuba Orientadora: Profa. Rita Cássia Menegati Dornelles Coorientadora: Profa. Janete Aparecida Anselmo- Franci 1. Área pré-óptica 2. Hormônio Liberador de Gonadotro- finas 3. Hipotálamo médio Basal 4. Locus coeruleus. 5. En- velhecimento I. T. CDD 612 FOLHA DE APROVAÇÃO Angela Cristina de Nicola Atividade dos neurônios noradrenérgicos do Locus Coeruleus e o conteúdo de GnRH em ratas Wistar acíclicas Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação Multicêntrico em Ciências Fisiológicas para obtenção do título de mestre em Ciências Fisiológicas. Área de Concentração: Fisiologia Orientadora: Prof.ª. Dr.ª Rita Cássia Menegati Dornelles Co-orientadora: Profª Drª Janete Aparecida Anselmo- Franci Aprovado em: 02/08/2013 Banca Examinadora Prof.(a). Dr.(a): Maristela de Oliveira Poletini Instituição: Universidade Federal de Minas Gerais/UFMG Prof.(a). Dr.(a): Jacqueline Nelisis Zanoni Instituição: Universidade Estadual de Maringá/UEM Prof.(a). Dr.(a): Rita Cássia Menegati Dornelles Instituição: Faculdade de Odontologia de Araçatuba/UNESP DADOS CURRICULARES Nascimento: 12.11.1983, Birigui - SP Filiação: Vitor de Nicola Eurides Garbuio de Nicola 2003/2006: Curso de Graduação em Licenciatura para Ciências Biológicas Fundação Educacional de Penápolis – FUNEPE – Penápolis – SP. 2008/2010: Curso de Pós-Graduação Latu-Sensu em Planejamento Ambiental - Fundação Educacional de Penápolis – FUNEPE – Penápolis – SP. 2011/2013: Curso de Pós-Graduação Stricto Sensu em Ciências Fisiológicas, nível de Mestrado, na Faculdade de Odontologia do Campus de Araçatuba - Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP. DEDICATÓRIA A minha família, por sempre ser meu porto seguro. AGRADECIMENTOS À UNESP – Universidade Estadual Paulista, pela oportunidade de realizar este curso. À Diretora da Faculdade de Odontologia de Araçatuba – UNESP, Profª. Adj. Ana Maria Pires Soubhia e ao Vice-Diretor Prof. Titular Wilson Roberto Poi pelo apoio. Ao apoio financeiro da CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento Pessoal de Nível Superior) pela concessão da bolsa de mestrado e à FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado se São Paulo) pela concessão do auxílio à pesquisa (processo nº 2012/14464-6) À FUNDUNESP (Fundação para Desenvolvimento da UNESP) e a Pró-Reitoria de Pós- graduação da UNESP (PROPG-UNESP) pelo apoio financeiro durante as viagens para realização de disciplinas e conclusão dos experimentos. A todos os funcionários da UNESP, que de acordo com suas funções, prestaram sua importante parcela de contribuição nos diferentes estágios de realização desta pesquisa. À Profª Drª Janete Aparecida Anselmo-Franci e seu grupo de pesquisa, pela acolhida e valiosa colaboração de seu laboratório. Aos professores Dr° João César Bedran de Castro pelos pareceres semestrais do projeto e Dr° João Carlos Callera pela cessão do criostato para os cortes dos encéfalos. As minhas amigas Natália Manrique, Aline Gozzi, Nayara Pestana de Oliveira e Letícia Oliveira Neri da Silva, que prontamente receberam-me em suas residências durante o período em que permaneci em Ribeirão Preto. As minhas queridas amigas de Departamento Ligia, Ariana (Zuca) e Rita, que sempre estiveram junto comigo nas boas e nas horas mais difíceis. Aos meus colegas de laboratório e de departamento, pela companhia de todas as horas. Ao Departamento de Morfologia desta instituição, por ceder seu espaço para a realização de parte deste trabalho e a todos os seus funcionários e professores pela valiosa atenção e colaboração. A todos os professores do departamento de Ciências Básicas: Sandra Helena Penha de Oliveira, Ana Cláudia Nakamune, Dóris Hissako Sumida, Cristina Antoniali Silva, Wilson Galhego Garcia, João Carlos Callera, João César Bedran de Castro, por somarem seus conhecimentos durante meu aprendizado. Às professoras da banca Drª Maristela de Oliveira Poletini, Drª Jacqueline Nelisis Zanoni e Drª Rita Cássia Menegati Dornelles, pela valiosa contribuição intelectual neste trabalho. A todos os funcionários da biblioteca e da seção de pós-graduação da FOA, por me auxiliarem em todos os momentos. A todos que direta ou indiretamente fizeram parte das novas descobertas aqui relatadas. AGRADECIMENTOS ESPECIAIS Ao meu eterno companheiro Dennis, que incondicionalmente soube compreender minhas ausências e incansavelmente apoiou-me nesta caminhada. A meus pais, por seus impagáveis incentivos e socorro diante dos obstáculos encontrados. Às novas pessoas que conheci durante a realização de parte deste trabalho na Universidade de São Paulo, campus de Ribeirão Preto, em especial, à Drª Cristiane Mota Leite, que me ofereceu algo muito além de sua colaboração: sua sincera amizade. As minhas jovens e senis ratinhas, por cederem suas vidas em prol de novas descobertas científicas. A minha orientadora Drª Rita Cássia Menegati Dornelles, que me deu a oportunidade de tê-la como minha dirigente na busca pelo conhecimento científico e soube compreender minhas limitações, acreditando na superação e no bom desenvolvimento da pesquisa a mim confiada. A DEUS, que me proporcionou chegar até aqui, tornando-me capaz de realizar um bom trabalho e proveu-me de espírito investigativo em busca do conhecimento que move um cientista. “A ciência não é acumulação de fatos, mas resolução de mistérios.” (Matt Ridley) RESUMO Resumo NICOLA, A.C. Atividade dos neurônios noradrenérgicos do Locus Coeruleus e o conteúdo de GnRH em ratas Wistar acíclicas. 2013. 77 f. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Odontologia, Universidade Estadual Paulista, Araçatuba, 2013. RESUMO As alterações nos componentes reprodutivos do eixo hipotálamo-hipófise-gônadas em muitas fêmeas de mamíferos determinam a transição gradual de ciclos reprodutivos regulares para ciclos irregulares, com perda de fertilidade. A interação dos neurônios do hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH) e esteróides gonadais representa função chave na neurobiologia do envelhecimento, pois a sobreposição temporal da senescência endócrina e neural está mecanicamente interligada pelas alças de retroalimentação. Estímulos do locus coeruleus (LC) para a área pré-óptica (APO) e eminência mediana são essenciais para a liberação das gonadotrofinas e seus neurônios apresentam receptores para estrógeno e progesterona, sugerindo controle dos esteróides ovarianos. Neste estudo foi avaliado a atividade de células neuronais localizadas em áreas e núcleos envolvidos com o controle de ação dos neurônios GnRH de ratas Wistar no período de transição para a aciclicidade. Para este trabalho foram utilizadas fêmeas Wistar cíclicas (4 meses) e acíclicas (18-20 meses) submetidas à decapitação ou perfusão às 10, 14 e 18 h na fase do diestro. Após serem retirados, os cérebros dos animais decapitados foram congelados e armazenados para posterior determinação do conteúdo de GnRH hipotalâmico e do conteúdo de noradrenalina e dopamina na APO. Os cérebros perfundidos foram cortados seriadamente em secções coronais de 30 µm para a APO e o LC e posteriormente submetidos à marcação imunohistoquimica para Fos (FRA) e FRA/TH, respectivamente. Para análise quantitativa da APO foram considerados os plates que contêm o AVPe sendo a contagem dos neurônios FRA-ir realizada a partir da inserção de caixa com diâmetro variando em função da altura do 3º ventrículo e para o LC foram considerados somente os neurônios duplamente marcados para FRA/TH. Em todas as análises foram considerados os plates comuns a todos os animais. O plasma dos animais experimentais foi utilizado para as dosagens de LH, FSH, PRL e esteróides gonadais. O conteúdo de GnRH hipotalâmico e as concentrações plasmáticas de LH das ratas acíclicas foi menor e constante nos três horários analisados, com maior taxa de turnover (MHPG/NA) na APO destes animais durante os horários estudados. A concentração plasmática de FSH foi semelhante entre os animais experimentais. Os valores para PRL foram maiores e decrescentes ao longo dos horários nos animais senis e o conteúdo de dopamina menor nos neurônios da APO nesse grupo de animais. Nas ratas acíclicas, a concentração plasmática do Resumo estrógeno foi maior e crescente enquanto que a de progesterona foi decrescente nos horários analisados. A análise da imunohistoquímica para Fos (FRA) no AVPe e FRA/TH no LC evidenciou maior atividade neuronal na APO e atividade noradrenérgica no LC em animais acíclicos durante o diestro persistente. A partir destes resultados pode-se sugerir que durante o envelhecimento, os neurônios noradrenérgicos da APO e LC apresentam maior atividade compensatória, possivelmente, em razão da menor capacidade de síntese e armazenamento do neurotransmissor e que alterações na secreção dos hormônios ovarianos não parece ser a causa primária no estabelecimento da senescência reprodutiva. PALAVRAS-CHAVE: Envelhecimento reprodutivo, GnRH, Esteroides ovarianos, APO, LC, Noradrenalina, Gonadotrofinas, Aciclicidade ABSTRACT Abstract NICOLA, A.C. Activity of the Locus Coeruleus noradrenergic neurons and the GnRH content in female acyclic rats. 2013. 77 f. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Odontologia, Universidade Estadual Paulista, Araçatuba, 2012. ABSTRACT Changes in reproductive components of the hypothalamic-pituitary-gonadal axis in many female mammals determine the gradual transition from regular reproductive cycles to irregular cycles, with loss of fertility. The interaction of neurons of gonadotropin-releasing hormone (GnRH) and gonadal steroids represents key role in the neurobiology of aging, because the temporal overlap of endocrine and neural senescence is mechanically interconnected by feedback loops. Stimulation of the locus coeruleus (LC) for the preoptic area (POA) and median eminence are essential for the release of gonadotropins and their neurons have receptors for estrogen and progesterone, suggesting control of ovarian steroids. Therefore, in this study we evaluated the activity of neuronal cells located in areas and nuclei involved in the control of action of GnRH neurons of female rats during the transition to acyclicity. For this study, we used cyclic female (4 months) and acyclic (18-20 months) rats underwent perfusion or decapitation at 10, 14 and 18 h of diestrus day. The brains from decapitated animals, after removed, were frozen and stored for subsequent determination of the hypothalamic GnRH content and the noradrenaline and dopamine content in the POA. The perfused brains were serially cut into coronal sections of 30 µm to POA and LC and subsequently submitted to immunohistochemical labeling for Fos (FRA) and FRA / TH, respectively. For quantitative analysis of the POA were considered plates containing AVPe being the counting of neurons FRA-ir performed from the insertion of the box with a diameter varying depending on the height of the 3 rd ventricle and the LC were considered only neurons doubly labeled for FRA / TH. In all analyzes were considered plates common to all animals. The plasma of the experimental animals was used for the assay of LH, FSH, PRL and gonadal steroids. The GnRH content and LH concentrations of the acyclic rats were smaller and constant at the time intervals analyzed, with increased of turnover rate (MHPG / NE) in the POA of these animals during the times studied. The concentration of FSH was similar among the experimental animals. Values for PRL were higher and decreasing over the time in old animals and the dopamine content was lower in the POA neurons in this group of animals. In acyclic rats, the plasma concentration of estrogen was higher and growing while progesterone was decreasing at time intervals analyzed. Immunohistochemical analysis for the Fos (FRA) in AVPe and FRA / TH in LC showed greater neural activity in POA and noradrenergic Abstract activity in the LC in acyclic animals during persistent diestrus. From these results it can be suggested that during aging, the noradrenergic neurons of the LC and POA have higher compensatory activity, possibly due to reduced capacity for synthesis and storage of neurotransmitters and changes in the secretion of ovarian hormones don´t seem to be the primary cause in the establishment of reproductive senescence. KEY WORDS: Reproductive aging, Locus coeruleus, Preoptic Area, GnRH, Noradrenaline, Acyclicity, Ovarian steroids, Gonadotropins LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1 – Representação dos núcleos cerebrais envolvidos com o controle da ativação dos neurônios GnRH, mediante as alças de retroalimentação mediada pelos esteroides ovarianos. Figura 2 – Nomenclatura dos estágios do envelhecimento reprodutivo normal em mulheres. Figura 3 - Esquema da microdissecção do hipotálamo médio basal. Figura 4 - Representação esquemática dos cortes coronais seriados realizados na Área Pré- óptica. Figura 5 - Representação esquemática dos cortes coronais seriados realizados no Locus Coeruleus. Figura 6 - Esquema mostrando o procedimento para contagem dos neurônios imunorreativos para FRA/TH no LC. Figura 7 – Secções coronais da APO indicando os neurônios imunorreativos para FRA no AVPe de acordo com a distância do bregma para cada secção rostral. Figura 8 – Esquema mostrando o procedimento para contagem dos neurônios imunorreativos para FRA no AVPe. Figura 9 – Incidência da fase de diestro nos grupos experimentais. (A) Animais jovens (4 meses) e (B) Animais senis (18-20 meses). Figura 10 – Concentração de GnRH no hipotálamo médio basal de animais jovens e senis por RIE, em função do horário de coleta. Figura 11 – Concentração de LH e FSH plasmáticos de animais jovens e senis por RIE, em função do horário de coleta. Figura 12 – Concentração de PRL plasmática de animais jovens e senis por RIE, em função do horário de coleta. Figura 13 – Concentração de estradiol e progesterona plasmáticos de animais jovens e senis por RIE, em função do horário de coleta. Figura 14 – Conteúdo de neurotransmissores (NA e DA) e respectivos metabólitos (MHPG e DOPAC) na APO de animais jovens e senis por HPLC, em função do horário de coleta. Figura 15 - Número de neurônios imunorreativos para FRA no AVPe da APO durante três horários do diestro de animais jovens e senis. Figura 16 - Número de neurônios imunorreativos para FRA no AVPe da APO durante três horários do o diestro de animais jovens e senis. Figura 17 – Fotomicrografias do AVPe evidenciando a marcação nuclear para FRA em animais jovens e senis às 10 e 14 h do diestro. Figura 18 – Fotomicrografias do LC evidenciando a dupla marcação (nuclear e citoplasmática) para FRA/TH em animais jovens e senis às 10 e 14 h do diestro. Figura 19 – Incidência cronológica de ciclos estrais regulares e irregulares em ratas. Figura 20 – Modelo clássico dos ritmos circadianos do eixo HPG de fêmeas (esq.), modelo de controle multi-oscilador dos ritmos circadianos do eixo HPG de fêmeas (dir.) LISTA DE ABREVIATURAS APO – área pré-óptica APOM – área pré-óptica medial ARC - arqueado AVPe – núcleo pré-óptico periventricular BSA – albumina sérica bovina DA – dopamina DAB – diaminobenzidina DOPAC - ácido 3,4-dihidroxifenilacético EDTA – ácido etilenodiamino tetracético EM – eminência mediana EPM – erro padrão da média ER – receptor de estrógeno FRA – antígeno relacionado ao fos FSH – hormônio folículo estimulante GnRH – hormônio liberador de gonadotrofinas H2O2 – peróxido de hidrogênio HCl – ácido clorídrico HHG – hipotálamo-hipófise-gônadas HMB – hipotálamo médio basal HPLC-EC – cromatografia líquida de alta performance com detecção eletroquímica ip - intraperitoneal ISOP - isoproterenol Kg – kilograma LC – locus coeruleus LH – hormônio luteinizante µL – microlitro µm – micrômetro M – molar mg – miligrarma MHPG - 3-methoxi-4-hidroxifenilglicol min – minuto mL – mililitro NA – noradrenalina NiSO4 – sulfato de níquel PBS – tampão fosfato salina PCA – ácido perclórico PFA – paraformaldeído PR – receptor de progesterona RIE – radioimunoensaio rpm – rotação por minuto SCN – núcleo supraquiasmático SNC – sistema nervoso central TH – tirosina hidroxilase TRH - hormônio liberador de tireotrofina VIP - peptídeo vasoativo intestinal SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 25 2 MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................................ 34 2.1 Animais ............................................................................................................................... 34 2.2 Ciclo estral .......................................................................................................................... 34 3 EXPERIMENTO I: Avaliação do conteúdo de GnRH do HMB e dosagem de catecolaminas da APO de ratas acíclicas e cíclicas .................................................................. 34 3.1 Coleta das Amostras ........................................................................................................... 34 3.2 Microdissecção das áreas cerebrais: HMB e APO ............................................................. 35 3.4 Dosagem de Catecolaminas da APO por cromatografia líquida de alta performance com detecção electroquímica (HPLC-EC) ....................................................................................... 36 4 EXPERIMENTO II: Atividade dos neurônios do núcleo Anteroventral Periventricular (AVPe) da Área Pré-Óptica e neurônios noradrenérgicos do Locus Coeruleus de ratas cíclicas e acíclicas. ................................................................................................................................. 37 4.1 Coleta das Amostras ........................................................................................................... 37 4.1.1 Perfusão ........................................................................................................................... 37 4.2 Imunohistoquímica ............................................................................................................. 38 4.2.1 Obtenção dos cortes ......................................................................................................... 38 4.2.2 Preparação do tecido ........................................................................................................ 39 4.2.3 Incubação com os anticorpos ........................................................................................... 40 4.2.4 Montagem dos cortes ....................................................................................................... 40 5 Dosagens hormonais plasmáticas .......................................................................................... 42 6 Análise Estatística ................................................................................................................. 43 7 RESULTADOS ..................................................................................................................... 45 7.1 Ciclo estral – Modelo experimental.................................................................................... 45 7.2 Ensaios Hormonais ............................................................................................................. 45 7.3 Dosagem de Catecolaminas ................................................................................................ 48 7.4 Imunohistoquímica da Área Pré-óptica .............................................................................. 49 7.5 Imunohistoquímica do Locus coeruleus ............................................................................. 51 8 DISCUSSÃO ....................................................................................................................... 54 9 CONCLUSÃO ..................................................................................................................... 61 REFERÊNCIAS ...................................................................................................................... 63 ANEXOS ................................................................................................................................. 77 INTRODUÇÃO Introdução 25 1 INTRODUÇÃO Todos os organismos vivos passam pelo processo de envelhecimento programado, conforme determina seu código genético, somado a fatores ambientais (DENG, 2012). Alterações na maioria dos sistemas fisiológicos que incluem degeneração estrutural, perda da capacidade funcional e prejuízo de coordenação dentro e entre os sistemas acompanham este processo (MILLER, 1998). Aspecto surpreendente do envelhecimento é a senescência reprodutiva em fêmeas, que diferentemente dos machos, se manifesta por declínio e cessação da reprodução tempos antes (após aproximadamente 1/3 do seu tempo de vida) do envelhecimento somático (DENG, 2012). Esta fase é acompanhada por alterações da função ovariana, que trazem como resultado a diminuição abrupta de estrogênio (devido a redução do número de folículos ovarianos) e alterações na secreção de progesterona, que acarretam mudanças a nível corporal e cerebral (CHAKRABORTY; GORE, 2004) resultando na transição gradual de ciclos reprodutivos regulares para ciclos irregulares, até culminar com a perda da fertilidade (YIN; GORE, 2006). O número de evidências associando o envelhecimento às alterações dinâmicas nos componentes hipotálamo-hipofisários do eixo reprodutivo têm aumentado (HALL et al, 2000). O declínio das gonadotrofinas e a redução da resposta hipofisária ao hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH) relacionados ao envelhecimento, indicam influência da idade nos componentes neuroendócrinos do eixo reprodutivo feminino independentemente de alterações na função ovariana (SHAW, 2011). Estudos utilizando lesões eletrolíticas na área pré-óptica (APO) de animais jovens demonstraram que estes animais exibem ciclos irregulares assim como os animais senis (CLEMENS; BENNET, 1977) e que a estimulação eletroquímica deste mesmo núcleo resulta em aumento da secreção do hormônio luteinizante (LH) em animais senis com aciclicidade (WUTTKE; MEITES, 1973). O GnRH constitui fator regulador primário do eixo reprodutivo que controla a puberdade, a ovulação e estimula a secreção hipofisária de gonadotrofinas (GORE, 2002). Em roedores, neurônios GnRH localizam-se em diferentes regiões cerebrais, incluindo estruturas septais, olfatórias, pré-ópticas e hipotalâmicas (SILVERMAN et al., 1987). Neurônios de estruturas como o núcleo anteroventral periventricular (AVPe) e o núcleo arqueado (ARC), projetam-se diretamente para os neurônios GnRH e são Introdução 26 essenciais no controle da liberação do decapeptídeo e na indução do pico de LH através da modulação pelos esteroides ovarianos (BU; LEPHART, 2007; SMITH, 2008) (Figura 1). A secreção contínua de GnRH ou o prolongamento de seus pulsos podem ser acompanhados de redução em sua degradação enzimática na eminência mediana ou na circulação porta-hipofisária (ADVIS; KRAUSE; MCKELVY 1982) pelo estradiol, sugerindo regulação direta deste nesta degradação bem como redução na duração do pico de LH pode levar ao prolongamento dos pulsos de GnRH, demonstrando que a frequência da secreção hormonal é mais importante, muitas vezes, que a quantidade do hormônio liberado (CLARKE, 1995). O pico de GnRH é influenciado diretamente pelo estradiol (RADOVICK; LEVINE; WOLFE, 2012) e pode ser iniciado por aumento na amplitude de pulso, aumento na frequência de pulsos ou por um único pulso longo, conforme sugerem os resultados obtidos a partir de ovelhas ovariectomizadas tratadas com estrógeno (CLARKE, 1993). Em roedores, o pico de GnRH/LH não é somente dependente da retroalimentação exercida pelo estradiol, mas também envolve sinais neurais Fig. 1 – Representação dos núcleos cerebrais envolvidos com o controle da ativação dos neurônios GnRH, mediante as alças de retroalimentação mediada pelos esteroides ovarianos. Adaptado de Smith, 2008 Introdução 27 circadianos do núcleo supraquiasmático (SCN) em horários apropriados do dia (CHRISTIAN; MOENTER, 2008) e dos efeitos excitadores e inibidores de neurônios VIP (peptídeo vasoativo intestinal) que indiretamente controlam os neurônios GnRH via núcleo AVPe da APO (WATSON et al., 1995; OTTEM et al., 2004). Segundo Smith e colaboradores (2005a), durante o envelhecimento reprodutivo de ratas o eixo neuroendócrino passa por importante processo de envelhecimento, com destaque para a participação dos receptores de estradiol no eixo hipotálamo-hipofisário- gonadal (HHG), visto que este esteróide atua diretamente por retroalimentação, estimulando o GnRH e os hormônios gonadotróficos [hormônio folículo-estimulante (FSH) e LH]. O estrógeno exerce função crítica na regulação de muitos processos fisiológicos em tecidos reprodutivos e não-reprodutivos, além de ser mediador da sinalização intracelular através de ligação ao seu receptor (LI et al., 2013). Os receptores estrogênicos (ERα e ERβ) ao se ligarem ao seu ligante, agem como fatores de transcrição, cujos produtos em última análise, alteram a fisiologia da célula (GIESKE et al., 2008) ou auxiliam o funcionamento de órgãos e tecidos através da ação não- genômica estrogênica sobre receptores associados à superfície da membrana celular (LI et al., 2013) As alterações relacionadas com a idade na regulação neuroendócrina da secreção máxima de LH no proestro não somente servem como indicadores da idade reprodutiva, mas também contribuem imediatamente para diminuir a taxa de ovulação e/ou anovulação. Análise da magnitude do pico de LH e taxa de ovulação em ratas jovens e de meia idade revelaram correlação da magnitude da secreção máxima de LH e o número de óvulos, de forma que ratas de meia idade com picos de LH atenuados apresentaram diminuição no número de folículos (LAPOLT et al., 2001). Classicamente conhecida por agir sobre as glândulas mamárias (mamogênese), síntese de leite (lactogênese) e manutenção da secreção de leite (galactopoiese) (FREEMAN et al., 2000), a prolactina (PRL), um hormônio proteico produzido pelos lactotrofos adehipofisários, também possui efeito regulador sobre o comportamento reprodutivo e modula o eixo hipotálamo-hipófise-gônadas (BOLE-FEYSOT et al., 1998; FREEMAN et al., 2000), sendo que em roedores, seu pico é regulado pela neurotransmissão noradrenérgica na APOM (SZAWKA et al., 2007a). http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Szawka%20RE%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17425612 Introdução 28 A tonicidade de liberação deste hormônio é inibida pela secreção de dopamina (DA) de neurônios hipotalâmicos (FREEMAN et al., 2000). Três populações neuronais fornecem DA para a hipófise: os neurônios tuberoinfundibulares dopaminérgicos (TIDA), neurônios localizados na porção dorsomedial do núcleo arqueado (ARC) que se projetam para a eminência mediana (KAWANO; DAIKOKU,1997), os neurônios tuberohipofisários dopaminérgicos que partem do ARC rostral e projetam-se para os lobos intermediário e neural da hipófise (HOLZBAUER; RACKE, 1985), e os neurônios dopaminérgicos periventriculares hipofisários que surgem do núcleo periventricular (PE), e inervam exclusivamente o lobo intermediário da hipófise (GOUDREAU et al., 1995). A secreção de PRL pelos lactotrofos adenohipofisários é regulada diretamente pelo estradiol, que os aumenta em tamanho e número (DE PAUL et al., 1997), induzindo a síntese (YAMAMOTO et al., 1986), o armazenamento (KIINO; DANNIES, 1981) e a liberação deste hormônio (WEST; DANNIES, 1980). O estradiol ainda é capaz de reduzir a responsividade dos lactotrofos à inibição dopaminérgica in vitro (RAYMOND et al., 1978; WEST; DANNIES, 1980) e in vivo (LIVINGSTONE et al., 1998) e aumentar a responsividade dos lactotrofos a fatores estimuladores como o hormônio liberador de tireotrofina (TRH) (GUIGUERE et al., 1982) e (VIP) (PIZZI et al., 1992). Durante a senescência reprodutiva, as mulheres vivenciam alterações na regularidade e comprimento do ciclo menstrual, bem como alterações endócrinas que acompanham os vários estágios do envelhecimento reprodutivo, denominados de peri e posmenopausa, conforme ilustra a Figura 2 (SOULES et al., 2001). O termo menopausa significa “pausa dos ciclos menstruais e ovulatórios” e é caracterizado pelo fim irreversível da vida reprodutiva em mulheres como consequência da depleção progressiva dos folículos ovarianos (VERMEULEN, 1993). Introdução 29 Fêmeas de roedores, assim como as mulheres, possuem ritmicidade cíclica durante a fase reprodutiva e também experimentam perda de fertilidade e “pausa” em seus ciclos reprodutivos, por isso são consideradas modelos para o estudo experimental da avaliação das funções reprodutivas (LeFEVRE; McCLINTOCK, 1988; WISE, 1999). Exibem ciclo denominado estral, que possui duração aproximada de cinco dias e quatro fases distintas: metaestro, diestro, proestro e estro, onde as concentrações plasmáticas dos hormônios ovarianos variam. Em Westwood e colaboradores (2008) estas fases encontram-se descritas: metaestro e diestro compõem as fases finais do ciclo estral e caracterizam o período secretor , pois há predomínio de progesterona nas concentrações plasmáticas, refletida pelos tipos celulares encontrados no esfregaço vaginal: leucócitos, células nucleadas e corneificadas no metaestro e predomínio de leucócitos no diestro. O metaestro possui duração aproximada de 6 a 8 horas e o diestro de 55 a 57 horas. As fases de proestro e estro duram 12 a 14 horas e 24 a 27, respectivamente e são influenciadas pelas concentrações plasmáticas de estradiol, a qual reflete os tipos celulares nucleados encontrados no proestro e corneificados no estro. Estas fases marcam o período denominado de proliferativo, onde há ocorrência do pico pré-ovulatório de LH e exibição da fase fértil do animal. Durante a senescência reprodutiva em fêmeas de roedores com regularidade cíclica, há diminuição da magnitude (WISE, 1982), atraso no tempo de latência (GORE, 2001; HWANG et al., 1990) do pico pré-ovulatório do LH no proestro e a depleção de Fig. 2 – Nomenclatura dos estágios do envelhecimento reprodutivo normal em mulheres. Introdução 30 ovócitos parece não ser a causa primária deste processo, pois mesmo em ratas acíclicas há folículos funcionais (HUANG; MEITES, 1975). Portanto, a cessação do ciclo estral parece ter origem hipotalâmica, uma vez que pode ocorrer nestes animais o reaparecimento da ciclicidade quando seus ovários são transplantados em animais que exibem regularidade de ciclo estral (CLEMENS; BENNET, 1977). A redução na liberação de GnRH é refletida na diminuição do número de neurônios GnRH que expressam Fos e Jun (RUBIN et al., 1994; STEGER et al., 1980). No entanto, é relatado em alguns estudos que o número de neurônios GnRH e o conteúdo deste hormônio no hipotálamo médio basal (HMB) não é alterado logo após o estabelecimento da senescência reprodutiva (GORE; ROBERTS, 1995; GORE et al., 2000; LE et al., 2001; YIN; GORE, 2006), sugerindo que o déficit durante o período de meia-idade está na(s) via(s) aferente(s) que regula(m) a síntese e/ou secreção de GnRH. Foi verificado por Nakamura e colaboradores (2011) declínio na amplitude da atividade elétrica das células do SCN de camundongos na meia-idade. É de conhecimento que projeções diretas do SCN para os neurônios GnRH são responsáveis pela geração do sinal neural ovulatório bem como controlam a ritmicidade e sincronização do relógio biológico com as pistas ambientais, traduzindo as informações do comprimento do ciclo de claro/escuro (POLETINI, 2012). Portanto, o início da menopausa em humanos (WISE et al., 1999) e da “estropausa” em fêmeas de roedores (CHAKRABORTY; GORE, 2002; EDERY 2000; LU et al., 1979; SATINOFF et al., 1993) parece ser acompanhado por alterações nos ritmos biológicos ou circadianos, cujo controle ocorre principalmente a nível transcricional no SCN através da regulação dos genes do relógio (BALSALOBRE, 2002) expressos de maneira circadiana em neurônios GnRH, gonadotrófos hipofisários e nos ovários, cujas proteínas possivelmente sejam parte do sinal circadiano responsável pelo pico pré-ovulatório de LH, o qual ocorre em sincronia com as variações no fotoperíodo (POLETINI, 2012). Conjunto de evidências experimentais sinaliza a importância da sincronia e coordenação dos sinais neurais para a liberação precisa de GnRH e manutenção do ciclo estral regular (WISE et al., 1999; YIN; GORE, 2006). Entre os neurotransmissores, a noradrenalina (NA) exerce importante atuação para a regulação do eixo HHG em várias espécies (HERBISON, 1997; PAU et al., 2000), caracterizada pela correlação na liberação de NA, que atua amplificando e antecipando o pico e a secreção de LH pré- ovulatório (SZAWKA et al., 2009; WISE,1982). Porém, a ação da NA, principalmente através do receptor α-adrenérgico, estimulando a liberação de GnRH, é diminuída no Introdução 31 envelhecimento (TEMEL et al., 2002). Além disso, receptores de estrógeno (ERα e ERβ) (PEREIRA et. al., 2010; HELENA et.al., 2009) e progesterona (PRα e PRβ) (HELENA et.al., 2009) foram evidenciados em neurônios noradrenérgicos, sugerindo que essas células são sensíveis às variações na concentração plasmática dos esteróides ovarianos e representam via aferente primária para os neurônios GnRH, que expressam receptores adrenérgicos imunorreativos (HOSNY; JENNES, 1998). Dentre as regiões cerebrais que expressam receptores para os esteróides femininos, a APO de fêmeas de roedores expressa notável concentração destes receptores, sendo sítio crítico no qual o estrógeno atua para regular o comportamento sexual e a secreção dos hormônios reprodutivos. Além disso, esta área recebe densas projeções noradrenérgicas dos núcleos A1, A2 (HAN; HERBISON, 2008) e A6 (ANSELMO-FRANCI et.al., 1999) da medula e tronco cerebral cujas subpopulações neuronais também expressam receptores de estrogênio e atuam sob a ação neurotransmissora da NA (SMITH et. al., 2005b; SZAWKA et al., 2013). Regiões do Sistema Nervoso Central (SNC) que não estão primordialmente ligadas à função reprodutiva também expressam receptores para estrógeno e progesterona. Dentre elas, destaca-se o Locus Coeruleus (LC), que é fonte primária de NA no cérebro e de onde o feixe noradrenérgico ascende com projeção para regiões do SNC (GRZANNA; MOLLIVER, 1980) onde ocorre a síntese de GnRH, como a área pré-óptica medial (APOM) e os terminais de GnRH na eminência mediana (EM), localizado no HMB (WRIGHT; JENNES, 1993). Este núcleo da formação reticular pontina, está envolvido, entre outras funções, com a regulação da função reprodutiva de fêmeas, as quais possuem maior número de neurônios noradrenérgicos que os machos (PENDERGAST; TUESTA; BETHEA, 2008). Estudos de Martins-Aférri e colaboradores (2003) evidenciaram a atuação estimuladora do LC na secreção de LH, observada pelo seu aumento, após estimulação eletroquímica. Este mesmo grupo verificou que lesão do LC (ANSELMO-FRANCI et al., 1999) resulta em diminuição na concentração de NA no hipotálamo e APO e impede a ocorrência do pico pré-ovulatório de LH (SZAWKA et.al., 2013). Portanto, há evidências precisas da participação dos neurônios noradrenérgicos do LC na ativação de neurônios GnRH (MARTINS-AFÉRRI et al., 2003) bem como a modulação fisiológica dos esteróides gonadais na atividade dos neurônios do LC em fêmeas, com possíveis implicações para a secreção de LH (SZAWKA et al., 2009) . Introdução 32 Neste estudo foi avaliada a atividade de células neuronais localizadas em áreas e núcleos envolvidos com o controle de ação dos neurônios GnRH de ratas Wistar cíclicas e acíclicas. Para tanto, realizou-se: (1) avaliação da atividade dos neurônios da área pré- óptica e LC dos animais experimentais, determinado pela imunorreatividade para antígenos relacionados ao Fos (FRA); (2) determinação e análise do conteúdo de GnRH do hipotálamo médio basal, (3) análise das concentrações plasmáticas de estradiol, progesterona, gonadotrofinas e prolactina, por radioimunoensaio (RIE), dos animais cíclicos (jovens) e acíclicos (senis) e (4) determinação das concentrações hipotalâmicas de noradrenalina e dopamina na APO destes animais através de HPLC. MATERIAIS E MÉTODOS Materiais e Métodos 34 2 MATERIAIS E MÉTODOS 2.1 Animais Para o presente estudo, foram utilizadas ratas da linhagem Wistar (Rattus norvegicus) cíclicas (4 meses) e acíclicas (18 a 20 meses), segundo descrito por Lu e colaboradores (1979) e Lefevre e Mcclintock (1988). Os animais foram mantidos em gaiolas coletivas (quatro animais/caixa) em ambiente com temperatura (22 ± 2°C) e ciclo de luz regular controlado (12/12 h), com acesso livre à água e ração (Presence ® ratos e camundongos). Após o acompanhamento do ciclo estral, os mesmos foram distribuídos em dois grandes grupos experimentais: G1- Senis acíclicas em diestro persistente e G2 – Jovens cíclicas. Todos os animais experimentais foram submetidos à à perfusão transcardíaca (sob prévia anestesia) ou à decapitação, em três horários distintos da fase do diestro: 10, 14 e 18 horas, a fim de determinar o perfil cíclico e a ritmicidade preparatória do organismo rumo à ocorrência do pico pré-ovulatório. Todos os procedimentos utilizados para realização deste estudo foram aprovados pelo Comitê de Ética para o Uso de Animais da Universidade Estadual Paulista, Brasil, sob o número de protocolo CEUA: 01829-2011 (Anexo A). 2.2 Ciclo estral O acompanhamento do ciclo estral de todos os animais foi realizado diariamente através do esfregaço vaginal colhido no período matutino (9h), e analisado à fresco ao microscópio óptico, segundo a técnica de LONG e EVANS (1922), durante todo o período experimental. Para este estudo foram utilizadas somente ratas jovens com comprovada ocorrência do ciclo estral e ratas senis em diestro persistente durante período que caracterizaria três ciclos consecutivos. 3 EXPERIMENTO I: Avaliação do conteúdo de GnRH do HMB e dosagem de catecolaminas da APO de ratas acíclicas e cíclicas 3.2 Coleta das Amostras Após o acompanhamento do ciclo estral das fêmeas jovens e senis, realizou-se a decapitação dos animais com 4 e 18 meses, na fase de diestro (ratas cíclicas) e diestro persistente (ratas acíclicas), às 10, 14 e 18 horas do mesmo dia. Os cérebros foram rapidamente retirados, as regiões anterior e posterior foram separadas e imediatamente Materiais e Métodos 35 congeladas à -70°C, em freezer, para posterior microdissecção de áreas da região anterior e dosagem de GnRH destas, por RIE. 3.3 Microdissecção das áreas cerebrais: HMB e APO Para a remoção do HMB e da APO foi utilizada a técnica de “punch” descrita por Palkovits (1973). O cérebro foi fixado em plataforma recoberta com meio próprio para congelação (Tissue-tek o.c.t. coumpound, Miles INC.) adaptada ao criostato com temperatura mantida à –15°C. A localização desta área baseou-se no Atlas para coordenadas estereotáxicas de Paxinos (PAXINOS; WATSON, 2007). Duas fatias consecutivas de 1000 µm foram obtidas a partir 1,8 mm posterior ao bregma para o HMB e uma fatia de 1500 µm para a APO foi obtida a partir de +0,48 mm posterior ao bregma. O HMB foi microdissecado com auxílio de agulha quadrada com 1,0 mm de diâmetro, sendo considerado como o ponto médio do terceiro ventrículo, e a APO foi microdissecada com auxílio de agulha circular com 1,5 mm de diâmetro, inserida acima do quiasma óptico (Figura 3). B Fig. 3 – (A) Esquema das secções coronais indicando o ponto de inserção da agulha quadrada de 1 mm para microdissecção do HMB e da agulha redonda de 2.0 mm para microdissecção da APO. As coordenadas indicam a distância do bregma para cada secção rostral conforme Atlas de Watson e Paxinos, 2007. (B) Fotografias das secções coronais do HMB e APO em extensão aproximada de 1.8 mm e 3.8 mm do bregma para o HMB e +0.48 mm a -1.02 mm para a APO. (como representado em Helena et al., 2009). (B) (A) Materiais e Métodos 36 3.4 Dosagem de GnRH por radioimunoensaio (RIE) As amostras do HMB de animais jovens e senis foram sonicadas com 50 µL de HCl e centrifugadas (Eppendorf ® modelo 5417 R) a 12000 rpm (aproximadamente 4000 Gs), durante 20 min, a 4 °C. O sobrenadante foi retirado para ser realizada dosagem do conteúdo de GnRH por RIE e os pellets de tecido, utilizados para dosagem proteica pelo método de Bradford (1976) através de espectrofotometria, como fator de correção. Para a dosagem de GnRH, foi realizado ensaio utilizando-se o anticorpo para GnRH R1245 produzido por Terry Nett (Department of Biomedical Sciences, Colorado State University, CO, USA) e padrão fornecido pela Península Laboratories INC (Bachem INC, CA, USA). Também foi utilizado o hormônio marcado com 125 I pela PerkinElmer (NEX 1630-10µCi, PerkinElmer Life and Analytical Sciences, MA, USA). Todas as diluições foram realizadas em tampão fosfato gel com EDTA (pH=7.4). O ensaio foi mantido a 4°C e sua duração foi de cinco dias. A precipitação do complexo foi feita com álcool absoluto gelado. A radioatividade do precipitado foi determinada em contador gama (Wizard 1470 Automatic Gamma Counter, PerkimElmer). O menor limite detectável foi de 0,24 pg/mL. Todas as amostras foram dosadas em duplicata no mesmo ensaio para evitar erro inter-ensaio. Os resultados foram corrigidos em função do teor de proteína do sedimento restante [Bradford (1976)] em ensaio de espectrofotometria de luz, e expressos em pg/µg de proteína do HMB. 3.5 Dosagem de Catecolaminas da APO por cromatografia líquida de alta performance com detecção electroquímica (HPLC-EC) As concentrações de NA e seu metabolito 3-metoxi-4-hyidroxifenilglicol (MHPG) bem como de dopamina (DA) e seu metabólito ácido 3,4-dihidroxifenilacético (DOPAC) na APO foram determinadas através de HPLC-EC. Após a homogeneização das amostras com 100 µL de solução de ácido perclórico (PCA 0,15 M) + EDTA (0,1 mM) contendo 10 pg/µL de isoproterenol (ISOP) como padrão interno, o homogenato foi centrifugado a 13.000 rpm por 5 min a 4ºC e filtrado em membrana 0.22 µm (Durapore, Millipore) para ser hidrolisado por aquecimento a 94ºC durante 5 min antes da injeção no sistema de HPLC com auto-injector (SIL-10Advp; Shimadzu, Kyoto, Japão). A separação foi realizada a 35 °C em coluna de fase reversa RP-18e 250x4 mm (Purospher, 5 um; Merck, Darmstadt, Alemanha), precedida por pré-coluna RP-18e 4x4 mm (Lichrospher, 5 um; Merck). A fase móvel foi constituída por 100 mM de Materiais e Métodos 37 dihidrogenofosfato de sódio, 15 mM citrato de sódio, 10 mM cloreto de sódio, 0,1 mM EDTA, 0,4 mM de ácido 1-octanesulfônico de sódio (Sigma-Aldrich) e 16% de metanol (Omnisolv; Merck Chemical Inc., Gibbstown, NJ, EUA). O pH foi ajustado para 3,5 com ácido fosfórico. A vazão da bomba (LC-10Advp; Shimadzu) foi de 0,4 mL/min e o potencial detector foi de 0,75 V (Década; Antec, Leyden, Holanda). Os dados de cromatografia foram plotados com o software Class-VP (Shimadzu). NA, MHPG, DA e DOPAC foram identificados pelo seu tempo de retenção de pico, e quantificados pelo método-padrão interno em função da área sob o pico. Todas as amostras foram processadas na mesma análise para evitar erro inter-ensaio e o coeficiente de variação intra-ensaio foi de 2,6% para NE, 6,6% para MHPG, 9,4% para DA e 1,82% para DOPAC. O menor limite detectável foi de 0,5 pg. Os níveis de NA e DA foram considerados para estimar estoque do neurotransmissor em vesículas sinápticas, ao passo que os níveis de MHPG e DOPAC refletem, respectivamente, a quantidade do neurotransmissor liberado na amostra. As taxas de MHPG / NA e DOPAC/DA foram utilizadas como medida de volume do neurotransmissor. No sedimento restante, foi determinado o teor de proteína pelo método de Bradford (BRADFORD, 1976). 4 EXPERIMENTO II: Atividade dos neurônios do núcleo Anteroventral Periventricular (AVPe) da Área Pré-Óptica e neurônios noradrenérgicos do Locus Coeruleus de ratas cíclicas e acíclicas. 4.1 Coleta das Amostras 4.1.1 Perfusão Animais adultos jovens e senis foram perfundidos transcardiacamente nos horários das 10, 14 e 18 horas do diestro. Para a experimentação, os animais foram previamente anestesiados com Cloridrato de Cetamina (Syntec ® 80 mg/Kg pc/ip) e Cloridrato de Xilazina (Syntec ® 40 mg/Kg pc/ip) e tiveram sua região torácica exposta para a retirada de aproximadamente 5 mL de sangue, em seringa heparinizada, diretamente do ventrículo esquerdo do coração, para dosagens plasmáticas posteriores dos hormônios esteroidais ovarianos, gonadotrofinas e prolactina. A artéria aorta abdominal foi clampeada e realizada injeção de 0,1 mL de heparina diretamente no músculo cardíaco, para evitar coagulação. Pequena incisão foi realizada no ápice do músculo, que foi divulcionado para a introdução da cânula conectada à bomba de Materiais e Métodos 38 perfusão (Masterflex modelo 7518-12) até atingir a artéria aorta ascendente para o clampeamento de todo o conjunto (músculo cardíaco e bomba). Durante a perfusão, utilizou-se aproximadamente 100 mL de tampão fosfato salina (PBS) a 0,01 M para a lavagem sistêmica do animal (fluxo 14 mL/min, por aproximadamente 5 min) e limpeza do cérebro. Posteriormente, volume aproximado de 700 mL de paraformaldeído (PFA) a 4% (obtido a partir da mistura de solução PBS 0,2 M e PFA 8% na proporção 1:1) foi injetado no animal para a fixação do tecido cerebral, durante 50 minutos. Após a remoção, o encéfalo foi mantido no mesmo fixador (PFA 4%) durante 2 horas, em geladeira. Após este período, foi retirado e imerso em solução de sacarose 30% diluída em PB 0,2 M, onde permaneceu até a saturação (aproximadamente 48 h). Em seguida, o mesmo foi cuidadosamente seco em papel absorvente para ser congelado através de mergulho rápido em isopentano (temperatura entre -45 e -50ºC) durante 1min. Logo após, foi armazenado a -70º C para processamento e análise posteriores. 4.2 Imunohistoquímica 4.2.1 Obtenção dos cortes Cortes coronais seriados de 30 µm das regiões da APO (Figura 4) e LC (Figura 5), conforme Atlas de Watson e Paxinos para coordenadas estereotáxicas em cérebro de rato (2007), foram obtidos em criostato a –22º C, armazenados em tubos com 1,5 mL de solução crioprotetora e estocados a -20°C para serem processados imunohisto- quimicamente um em cada quatro cortes/poço para FRA na APO e FRA/TH no LC, totalizando 60 cortes para a APO e 70 corte para o LC, aproximadamente. Fig. 4 – Representação esquemática dos cortes coronais seriados realizados em toda a extensão da Área pré-óptica (Bregma +0.48 mm ao Bregma -1.32mm) (Watson; Paxinos, 2007). Materiais e Métodos 39 4.2.2 Preparação do tecido A imunohistoquímica foi realizada pelo método “free-floating”. Antes do início da imunohistoquímica os cortes foram lavados três vezes, por 5 minutos, em PBS 0,01M para remoção da solução crioprotetora. Todas as etapas da preparação do tecido foram realizados à temperatura ambiente, com soluções diluídas em PBS 0,01M, pH 7.4, intercalados por três lavagens com PBS durante 5 minutos. Os cortes seriados foram lavados rapidamente com glicina (0,1M) para eliminação do excesso de PFA, incubados em Triton X-100 (TX-100 0,4%) por 30 minutos, para aumentar a permeabilidade celular, e com água oxigenada (H2O2 1%) durante 60 minutos, para eliminação da peroxidase endógena. A seguir, os cortes foram Fig. 5 – Representação esquemática dos cortes coronais seriados realizados em toda a extensão do Locus coeruleus (Bregma -9.48mm ao +10.32 mm) (Watson; Paxinos, 2007) Materiais e Métodos 40 lavados com PBS até a eliminação da água oxigenada. As ligações inespecíficas foram bloqueadas com a incubação por 60 minutos em albumina bovina (BSA 3%). 4.2.3 Incubação com os anticorpos Uma série em cada quatro, foi incubada a 4ºC por 40h com anticorpo policlonal produzido em coelho (1:2000; K-25, Santa Cruz Biotechnology, CA), em solução contendo TX-100 0,3% e BSA 1% em PBS 0,01M (PBS+). Depois de lavados, os cortes foram incubados com 2º anticorpo biotinilado, um anti-IgG de coelho produzido em cabra (BA-1000; Elite Kit, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) diluído 1:600 em PBS+ durante 1:30 h. Após as lavagens com PBS, os cortes foram incubados com o complexo Avidina-Biotina (1:100; KIT ABC Elite, Vectastain) por 60 minutos, à temperatura ambiente. A seguir, foi adicionado o substrato cromógeno 3,3’- diaminobenzidina (DAB) intensificado com cloreto de níquel (0,2 mg/mL DAB, Sigma; 25 mg/mL NiCl2, Riedel-de haën; 1 µL/mL de solução de H2O2 30%) em tampão acetato 0,05M (pH=7.5), por 12 minutos. A reação foi interrompida transferindo-se os cortes para o PBS e nas séries do LC, os cortes foram lavados com H2O2 1% diluída em PBS 0,01M, durante 15 min, e lavados com PBS 0,01M, cinco vezes, por 5 minutos, para posterior incubação com o anticorpo anti-TH, produzido em camundongo (anti-TH 2, Sigma), diluído 1:500.000 em PBS+ por 40 h à 4ºC. Depois de lavados, os cortes foram incubados com 2º anticorpo biotinilado, uma anti-IgG de camundongo produzido em cavalo (BA-2001, Vector), diluído 1:600 em PBS+ durante 1 h. Após as lavagens com PBS, os cortes foram incubados com o complexo Avidina-Biotina (1:100; KIT ABC Elite, Vectastain), por 60 minutos, à temperatura ambiente. A seguir, foi adicionado DAB (0,1 mg/mL e 1 µL/mL de solução de H2O2 30%) em tampão Tris-HCl 0,05M (pH=7,6), por 15 minutos e a reação foi interrompida transferindo-se os cortes para o PBS. 4.2.4 Montagem dos cortes Os cortes imersos em PBS foram montados em lâminas gelatinizadas e após secarem por algumas horas, foram desidratados em ácool etílico nas concentrações de 75, 95 e 100% e diafanizados em xilol, para serem recobertos por lamínula com o uso de Entelan (Merck) e guardadas até o momento da análise. Materiais e Métodos 41 4.2.5 Contagem dos neurônios FRA-ir na APO Utilizando-se microscópio óptico (Zeiss Axioshop 2 plus) associado a sistema para análise de imagens (Axiovision), foi realizada contagem dos neurônios imunorreativos ao Fos (FRA) nas secções correspondentes ao ao núcleo pré-óptico anteroventral periventricular (APO/AVPe) do atlas de Paxinos. A figura abaixo (Figura 6) demonstra a identificação e análise das lâminas conforme a distribuição dos neurônios ativados ao longo do AVPe da APO. As lâminas foram fotografadas (câmera Axiocam HCR) (Figura 16) para contagem bilateral dos neurônios imunorreativos (objetiva de 20x) ao Fos (FRA) com o auxílio do programa Axiovision. Em cada plate, foi inserida uma caixa no programa para a correta delimitação do AVPe, cujas dimensões variaram em função do tamanho de cada plate, tendo como referência de inserção a curvatura caudal do 3º ventrículo, conforme ilustra a figura 7. Para a análise estatística foram considerados somente os neurônios imunorreativos dos plates correspondentes ao Bregma 0.00 mm e Bregma - 0.12 mm (respectivamente plates 33 e 34) Fig. 6 – Secções coronais da APO indicando o AVPe conforme bregma. Plate 32 (bregma +0.12), Plate 33 (bregma 0.00) e Plate 34 (bregma -0.12). Adaptado de Watson; Paxinos, 2007 + 0.12 mm 0.00 mm - 0.12 mm Fig. 7 - Esquema mostrando o procedimento para contagem dos neurônios imunorreativos para Fos (FRA) no AVPe. Dimensões do Frame: Bregma +0.12 mm (240x480 µm), Bregma 0.00 mm (240x716 µm), Bregma -0.12 mm (240x956 µm). Objetiva 20x. Adaptado de Watson; Paxinos, 2007. Materiais e Métodos 42 4.2.6 Contagem dos neurônios FRA/TH-ir no LC Para a contagem dos neurônios do LC foi realizada a identificação dos cortes conforme a extensão do núcleo iniciada no bregma -9.36 mm ao -10.08 mm (plates 111 ao117). Somente foram contados os neurônios catecolaminérgicos que estiveram duplamente marcados para FRA/TH, sendo a contagem realizada em objetiva de 40 X (Figura 18 ) a partir da captura das imagens conforme previamente descrito. Foram considerados somente os plates comuns a todos os animais e que estiveram duplamente marcados para ambos os antígenos (Bregma -9.48 mm ao Bregma -10.08 mm) (Figura 8) 5 Dosagens hormonais plasmáticas As amostras sanguíneas coletadas durante os experimentos de decaptação e perfusão dos animais de ambos os grupos (jovem e senil) foram centrifugadas (3000 rpm; temperatura de 2° C; 15 min). O plasma foi aliquotado em eppendorfs (500 µL) e estocado em freezer (-20° C) para dosagem posterior dos hormônios hipofisários: FSH, LH e Prolactina (PRL); ovarianos: estradiol (E2) e progesterona (P4), por radioimunoensaio (RIE). As concentrações plasmáticas de LH, FSH e PRL foram determinadas utilizando-se o método de duplo anticorpo RIE utilizando-se kit específico fornecido pelo Instituto Nacional de Diabetes, Doenças Digestivas e Renais (NIDDK, Bethesda, MD, EUA). Os anticorpos utilizados foram anti-rat de LH-S10, S11-FSH e PRL-S9 diluídos com soro de coelho e padrão normal de preparação RP3-LH, FSH, PRL-RP3 Fig. 8 - Esquema mostrando o procedimento para contagem dos neurônios imunorreativos para FRA/TH no LC. Bregma -9.48 mm ao Bregma -10.08 mm. Objetiva 40 x. Adaptado de Watson; Paxinos, 2007. -9.48 mm -9.60 mm -9.72 mm -9.84 mm -9.96 mm -10.08 mm Materiais e Métodos 43 ng/ml diluídos em tampão fosfato gel de 0,1% (0,01 M, pH = 7,5). A dose mínima detectável foi de 0,16 ng/mL para a LH, 0,09 ng/mL para a FSH e 0,7 ng/mL para a PRL e o coeficiente de variação para o erro intra-ensaio foi de 4%. Para as concentrações de estradiol e progesterona foram utilizados kits comerciais. A dosagem de progesterona foi realizada utilizando-se o kit de MP Biomedicals LLC (divisões Diagnostics, Nova Iorque, EUA) e Siemens (Siemens Medical Solutions Dignostics, Los Angeles, EUA) para o estradiol. A dose mínima detectável de progesterona e de estradiol foi de 5,0 pg/mL e 0,3 ng/mL, respectivamente. O erro intra-ensaio foi de 4,3% para 7,6% para o estradiol e progesterona. Todas as amostras foram dosadas em duplicata no mesmo ensaio, para evitar erro inter-ensaio. 6 Análise Estatística Os resultados foram apresentados utilizando-se os valores da média  EPM e as comparações múltiplas foram realizadas por análise de variância (ANOVA) a dois critérios, seguida do pós-teste de Newman-Keuls. O nível de significância utilizado foi de P<0,05 para todas as comparações. RESULTADOS Resultados 45 7 RESULTADOS 7.1 Ciclo estral – Modelo experimental Os resultados das análises do ciclo estral revelaram que 78% do total de animais jovens analisados exibiram ciclo estral regular, os quais foram utilizados na fase do diestro. A análise do ciclo das ratas com 18 meses evidenciou que 90% dos animais permaneceram em diestro persistente durante período equivalente a três ciclos consecutivos (Figura 9). A análise do esfregaço vaginal das fêmeas Wistar evidenciou a ocorrência do diestro persistente, com citologia vaginal leucocitária, nos animais de 18 a 20 meses e possibilitou a caracterização de modelo animal para o estudo da senescência reprodutiva. Com o envelhecimento, as ratas tornam-se acíclicas e com “pausa” em seus ciclos reprodutivos, caracterizando a estropausa. 7.2 E 7.2. Ensaios Hormonais A Figura 10 apresenta o padrão das concentrações hipotalâmicas do GnRH de ratas cíclicas (jovens) e acíclicas (senis) nos diferentes horários do diestro. Nos animais jovens foi detectado aumento crescente no conteúdo de GnRH hipotalâmico nos diferentes horários, enquanto que nos animais senis este conteúdo foi menor e constante, independentemente do horário. A comparação entre as idades evidencia que Fig. 9 – Incidência da fase de diestro nos grupos experimentais. (A) Animais jovens (4 meses) e (B) Animais senis (18-20 meses). JOVEM (A) SENIL (B) Resultados 46 às 14 e 18 horas há maior conteúdo hipotalâmico de GnRH armazenado nas ratas jovens. A análise dos resultados de LH evidencia que a concentração plasmática deste hormônio manteve-se constante ao longo dos horários. Nos animais cíclicos do grupo jovem (Figura 11 A) estas concentrações apresentaram-se acima (aproximadamente 0,25 ng/mL) das obtidas para os animais acíclicos do grupo senil (aproximadamente 0,15 ng/mL). A análise dos resultados referentes à concentração plasmática de FSH (Figura 11 B) dos animais experimentais dos diferentes grupos revelou que não há diferença estatística entre os grupos e horários, permanecendo em torno de 3,0 ng/mL em ambos os grupos nos diferentes horários. O padrão da secreção de PRL dos animais jovens/cíclicos e senis/acíclicos está apresentado na figura 12. A concentração plasmática de PRL nas ratas jovens é significativamente menor que a das ratas senis e não demonstrou alterações nos três Fig. 10 - Conteúdo de GnRH do HMB de animais jovens ( ) e senis ( ) (n= 7-8 animais/horário), com aplicação do teste ANOVA Two-way e pós–teste de Newman-Keuls. # indica diferença estatística entre os grupos jovem e senil no mesmo horário. Valores expressos de acordo com a média ± EPM. *P<0,05 vs. 10 e 14 h/jovens 10 14 18 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0 * # # Tempo (h) G n R H ( p g /µ g d e p ro te ín a ) Fig. 11 - Concentração de LH (A) e FSH (B) plasmático de animais jovens ( ) e senis ( ) (n= 7-8 animais/horário), com aplicação do teste ANOVA Two-way e pós–teste de Newman-Keuls. # indica diferença estatística entre os grupos jovem e senil no mesmo horário. Valores expressos de acordo com a média ± EPM. 10 14 18 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0 # # # (A) Tempo (h) L H ( n g /m L ) 10 14 18 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 0 (B) Tempo (h) F S H ( n g /m L ) Resultados 47 horários analisados. Entretanto, nas ratas senis a concentração plasmática de PRL é maior do que dos animais jovens e apresenta diminuição significativa às 18 horas, quando comparada com animais de mesma idade nos horários das 10 e 14 h. A análise das concentrações plasmáticas dos esteróides ovarianos apresentou relação inversamente proporcional entre si (Figuras 13 A e B). Os valores da concentração de estradiol (Fig. 13 A) no grupo de ratas acíclicas/senis foram crescentes nos diferentes horários enquanto que a concentração de progesterona foi decrescente (Fig. 13 B). Nos animais cíclicos/jovens, as concentrações plasmáticas de estradiol (Fig. 13 A) e de progesterona (Fig.13 B) foram menores e não apresentaram diferença entre os horários. A concentração plasmática de progesterona entre os animais jovens e senis foi significativa nos horários das 10 e 14 h (P<0,05). Fig. 12 - Concentração de PRL plasmática de animais jovens ( ) e senis ( ) (n=7-8 animais/horário), com aplicação do teste ANOVA Two-way e pós–teste de Newman-Keuls. # indica diferença estatística entre os grupos jovem e senil no mesmo horário. Valores expressos de acordo com a média ± EPM. + P<0,05 vs. 10 e 14 h/senis. 10 14 18 100 200 300 400 500 0 + ### Tempo (h) P R L ( n g /m L ) 10 14 18 0 25 50 75 100 125 150 175 200 + # (A) Tempo (h) E 2 ( p g /m L ) 10 14 18 25 50 75 100 125 150 175 200 0 + ++ # # (B) Tempo (h) P 4 ( n g /m L ) Fig. 13 - Concentração plasmática de estradiol (A) e progesterona (B) de animais jovens ( ) e senis ( ) (n=7-8 animais/horário), com aplicação do teste ANOVA Two-way e pós–teste de Newman- Keuls). # indica diferença estatística entre os grupos jovem e senil no mesmo horário. Valores expressos de acordo com a média ± EPM. + P<0,05 vs. 10 e 14 h/senis; ++ P<0,05 vs. 10 h/senis. Resultados 48 7.3 Dosagem de Catecolaminas O conteúdo armazenado de NA (Figura 14 A) foi crescente ao longo dos horários nos animais do grupo de ratas cíclicas. No horário das 18h a concentração de NA foi maior (P<0,05) quando comparado com os horários de 10 e 14h. No grupo de animais acíclicos, o conteúdo de NA foi menor e constante nos três horários analisados, quando comparados aos respectivos horários do grupo jovem. Os valores para o metabólito MHPG (Figura 14 B) apresentaram diferenças (P<0,05) às 18 horas em ambos os grupos e no mesmo horário entre os grupos cíclicos e acíclicos (P <0,001). A taxa de liberação noradrenérgica dada pela relação MHPG/NA (Figura 14 C) foi maior nos horários das 14 e 18 h nos animais do grupo acíclico/senil comparado com os respectivos horários do grupo cíclico/jovem (P<0,05). A análise do conteúdo de DA (Figura 14 D) armazenado na APO evidencia maior concentração do neurotransmissor nos animais cíclicos do grupo jovem. Essa diferença é significativa nos horários das 10 e 18 h (P<0,05) quando comparado com ratas acíclicas do grupo senil. Seu respectivo metabólito, DOPAC (Figura 14 E), também foi maior nas ratas cíclicas, sendo as maiores concentrações no horário das 10 e 18 h (P<0,05) quando comparadas com as ratas acíclicas. A taxa de liberação dada pela relação DOPAC/DA (Figura 14 F) foi maior às 18 h no grupo de ratas acíclicas comparado com as ratas cíclicas/jovens. 10 14 18 0 20 40 60 80 # *# # (A) Tempo (h) N A ( p g /u g d e p ro te ín a ) 10 14 18 0 5 10 15 20 25 * ++ # (B) Tempo (h) M H P G ( p g /u g d e p ro te ín a ) 10 h 14 h 18 h 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 Tempo (h) # # (D) D A ( p g /u g d e p ro te ín a ) 10 h 14 h 18 h 0 5 10 15 20 25 30 Tempo (h) # ** + # + (E) D O P A C ( p g /u g d e p ro te ín a ) Resultados 49 7.4 Imunohistoquímica da Área Pré-Óptica A análise dos resultados para os neurônios imunorreativos ao Fos (FRA) no núcleo AVPe da APO permite constatar que a atividade neuronal neste núcleo é crescente ao longo dos horários em animais senis em diestro persistente, comparado aos animais jovens em diestro, sendo os horários das 14 h e 18 h (P<0,05) os de maior expressão desta atividade (Figura 15). A Figura 16 apresenta a marcação para Fos (FRA) na APO de animais jovens (A) e senis (B) às 14 h do dia do diestro. Fig. 15 - Número de neurônios imunorreativos para Fos (FRA) no AVPe da APO durante o diestro em animais jovens ( ) e senis ( ) (n= 4-7 animais/horário), com aplicação do teste ANOVA Two-way e pós–teste de Newman-Keuls. # indica diferença estatística entre os grupos jovens e senis no mesmo horário. Valores expressos de acordo com a média ± EPM. # P<0,05. 10 14 18 0 25 50 75 100 125 150 175 200 # # Tempo (h) n e u rô n io s F R A -i r Fig. 14 – Conteúdo de neurotransmissores e respectivos metabólitos na APO de animais jovens ( ) e senis ( ) (n=7-8 animais/horário), com aplicação do teste ANOVA Two-way e pós–teste de Newman- Keuls). (A) NA, (B) MHPG, (C) taxa de turnover MHPG/NA, (D) DA, (E) DOPAC, (F) taxa de turnover DOPAC/DA. # indica diferença estatística entre os grupos jovens e senis no mesmo horário. Valores expressos de acordo com a média ± EPM. * P<0,05 vs. 10 e 14 h/jovens; ** P<0,05 vs. 14 e 18 h/jovens; + P<0,05 vs. 14 e 18 h/senis; ++ P<0,05 vs. 10h/senil. 10 h 14 h 18 h 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 # # (C) Tempo (h) M H P G /N A ( p g /u g d e p ro te ín a ) 10 h 14 h 18 h 0 5 10 15 20 Tempo (h) # + + (F) D O P A C /D A ( p g /u g d e p ro te ín a ) Resultados 50 (A) Figura 16 – Representação fotográfica da marcação para Fos (FRA) no AVPe no grupo jovem (A) e senil (B) perfundidos às18h do diestro. 3V, terceiro ventrículo. Barra de escala para AVPe = 500 µm (Objetiva 5x) e 200 µm (Objetiva 20x). (B) 3V 3V (A) 3V 3V Resultados 51 7.5 Imunohistoquímica do Locus Coeruleus Os resultados (Figura 17) obtidos de um total de sete secções analisadas, que em média somaram 4 neurônios FRA/TH-ir para J/10h , 3 FRA/TH-ir para J/14h e 4 FRA/TH-ir para J/18h, 9 neurônios FRA/TH-ir para S/10h, 6 neurônios FRA/TH-ir para S/10h e 5 neurônios FRA/TH-ir para J/18h, evidenciaram significativo aumento da quantidade de neurônios FRA/TH imunorreativos em ratas senis às 10h e 14h (P<0.05) quando comparados com animais jovens do mesmo horário (P<0.05). O grupo senil das 18h apresentou menor atividade noradrenérgica sem diferença significativa comparada com grupo jovem do mesmo horário. A Figura 18 apresenta a marcação para FRA/TH no LC de animais jovens (A) e senis (B) às 10 e 14 h do dia do diestro. Fig. 17 - Número de neurônios imunorreativos para FRA/TH no LC durante o diestro em animais jovens ( ) e senis ( ) (n= 4-7 animais/horário), com aplicação do teste ANOVA Two-way e pós–teste de Newman-Keuls. # indica diferença estatística entre os grupos jovens e senis no mesmo horário. Valores expressos de acordo com a média ± EPM. # P<0,05. 10 14 18 0 3 6 9 12 15 Tempo (h) ## n e u rô n io s F R A /T H -i r Resultados 52 Figura 18 – Representação fotográfica da dupla marcação FRA/TH no LC no grupo jovem (A) e senil (B) perfundidos às 10 h do diestro. A seta indica o neurônio duplamente marcado (a coloração para TH é citoplasmática e para FRA é nuclear). 4V, quarto ventrículo. Barra de escala para LC = 500 µm (Objetiva 5x) e 200 µm (Objetiva 20x). (B) 4V 4V (A) 4V 4V DISCUSSÃO 4V Discussão 54 8 DISCUSSÃO Os resultados obtidos nesse estudo evidenciam desequilíbrio na taxa de liberação de hormônios do eixo HPG em ratas acíclicas/senis. O conteúdo de GnRH nestes animais permaneceu invariável durante os horários analisados, contribuindo para a determinação da aciclicidade estral e caracterizando o processo de senescência reprodutiva nas fêmeas de roedores. Na literatura (LU et al., 1979) há relatos de alteração nas fases do ciclo estral em fêmeas de roedores a partir de 10 meses, com aumento na incidência de ciclos irregulares e prevalência da fase de estro já aos 12 meses (Figura 19). Estudos realizados (GARCIA, 2012; COLLI, 2012) em nosso laboratório, com ratas da linhagem Wistar, evidenciaram manutenção da ciclicidade até os 12/13 meses, sendo a ocorrência do início da aciclicidade detectada aos 14 meses e a incidência do diestro persistente a partir dos 17/18 meses. O conjunto de dados obtidos nesse estudo, baseados em análises plasmáticas e hipotalâmicas dos hormônios envolvidos com a reprodução, bem como de núcleos e neurotransmissores controladores da atividade dos neurônios GnRH, refletem desequilíbrio na taxa de liberação dos hormônios do eixo HPG em ratas acíclicas/senis, correlacionado com a síntese e liberação de NA. Fig. 19– Incidência cronológica de ciclos estrais regulares e irregulares em ratas. Adaptado de Lu et. al., 1979 Discussão 55 É bem descrito pela literatura que a interação do GnRH com receptores de superfície celular de alta afinidade (GnRH-r) nos gonadotrofos hipofisários, resulta na transdução de sinal para a biossíntese e secreção de LH e FSH (CICCONE et al., 2008). Os resultados obtidos neste estudo evidenciaram a não ocorrência de alteração no conteúdo de GnRH dos animais acíclicos durante os horários analisados, sugerindo possível comprometimento no controle temporal do núcleo supraquiasmático sobre a liberação hormonal, contribuindo para a determinação da aciclicidade estral que caracteriza o processo de senescência reprodutiva em fêmeas de roedores. O aumento gradual do conteúdo de GnRH do HMB durante o diestro (Figura 9) em ratas jovens, essencial para sinalizar a ocorrência de secreção máxima de LH e subsequente ovulação, não ocorre durante os três horários analisados em ratas acíclicas/ senis e evidencia que o horário e a idade influenciam no conteúdo de GnRH neste núcleo. Estes resultados indicam que a menor produção de GnRH em ratas acíclicas compromete o padrão de secreção deste neurohormônio, e, consequentemente a secreção de LH, influenciando na ausência do pico pré-ovulatório e contribuindo para a iniciação do processo de senescência reprodutiva. Em ratas jovens, observou-se aumento do conteúdo de GnRH do HMB na tarde de diestro para proestro, o que permite maior estímulo à hipófise pelo neuro-hormônio para a sinalização da ocorrência de secreção máxima de LH. Análises realizadas, por Rubin e Bridges (1989), em neurônios GnRH de animais senis evidenciaram volume menor do aparelho de Golgi e retículo endoplasmático rugoso comparado com neurônios de ratas jovens em diestro, indicando possível comprometimento da síntese de proteínas. Além disso, o RNAm/GnRH aumentou significativamente com a idade e os níveis de transcrição primária de GnRH em ratas senis diminuiu em comparação com ratas jovens. Gore e colaboradores (2000) sugerem que as alterações em nível de RNAm/GnRH ocorrem independentemente das alterações na transcrição do gene, indicando o envolvimento de mecanismos de pós-transcrição. A teoria clássica de controle do eixo HPG atribui aos ritmos circadianos do SCN o controle sobre a liberação pulsátil de GnRH e gonadotrofinas. Estudos recentes de Sellix e Menaker (2010) (Figura 20) sugerem a existência de osciladores circadianos em cada componente do eixo, sendo necessária a sincronização entre os marcadores temporais do SCN, neurônios GnRH, células hipofisárias e células ovarianas para o controle dos eventos fisiológicos desencadeados pelo eixo HPG. Além disso, está Discussão 56 evidenciado a expressão de genes do relógio nas células da granulosa, da teca e lúteas (FAHRENKRUG et al., 2006; HE et al., 2007a; 2007b; KARMAN; TISCHKAU, 2006) bem como a resposta circadiana do ovário ao LH independente do tempo endógeno de liberação da gonadotrofina. Essa resposta indica que o ritmo de sensibilidade ao LH é produzido pelo relógio circadiano local, exercendo controle sobre o tempo de ovulação e secreção de progesterona (SELLIX; MENAKER, 2011). A redução do teor de GnRH no HMB de ratas acíclicas (Figura 10) verificada nesse estudo, possivelmente se deve à alterações na maquinaria de secreção e à responsividade destas células ao estrogênio. É de conhecimento que os esteroides sexuais femininos, 17β-estradiol e progesterona, podem modular a transcrição do GnRH, atuando no hipotálamo para alterar os padrões de pulsos de GnRH ou através de ações diretas na hipófise para influenciar a expressão basal ou estimulada de GnRH (KARSCH, 1987; KAWAKAMI; WINTERS, 1999; SHUPNIK, et al., 1989). Os esteróides atuam alterando diretamente a transcrição do gene promotor ou não- genomicamente, alterando o padrão de sinalização citoplasmática (HALL, et al., 2001). Em fêmeas de roedores, os níveis de RNAm e a transcrição de subunidades das gonadotrofinas (LHβ ,FSHβ) variam durante o ciclo reprodutivo (KOWASE et al., 2007). Há relatos de que roedores apresentam atenuação da retroalimentação positiva de estrogênio em razão secundária ao envelhecimento hipotalâmico, como resultado do Fig. 20 – Modelo clássico dos ritmos circadianos do eixo HPG de fêmeas (esq.), modelo de controle multi-oscilador dos ritmos circadianos do eixo HPG de fêmeas (dir.). Extraído de Sellix; Menaker, 2010 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Winters%20SJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=10433215 Discussão 57 desequilíbrio de neurônios e neurotransmissores excitadores (NA e glutamato) e inibidores (GABA e opióides) (BRANN; MAHESH, 2005; DOWNS; WISE, 2009; ZUO et al.,1996) além da redução na atividade diurna do núcleo supraquiasmático e rede de aferências reguladoras dos neurônios GnRH (BLOCK, 1952; KRAJNAK et al.,1998) e dos neurônios kisspeptinérgicos (LEDERMAN, 2010). Provavelmente, a reduzida resposta à retroalimentação positiva e negativa na secreção de gonadotrofinas (LU et al., 1977, MARCHETTI; CIONI, 1988) está associada à diminuição no turnover hipotalâmico de catecolaminas e aumento no turnover de serotonina (SMITH, 2005) bem como na capacidade do eixo HPG em responder aos estímulos durante a transição para envelhecimento (WELT et al., 1999). Assim, as diferenças na liberação de LH e FSH podem ocorrer devido as alterações na capacidade de resposta da hipófise ao GnRH e/ou alterações no metabolismo de esteróides, que culminam em alterações de retroalimentação positiva e negativa pelos esteróides. Neste estudo, foi observado que o LH obedece ao padrão de conteúdo de GnRH, que em animais senis é menor e constante (Figura 10), indicando possível perda do sinal gerador de pulsos. Vários estudos mostram que o aumento na concentração de FSH na fase folicular está associado com a depleção dos folículos do ovário e subsequente diminuição na concentração de inibina B e hormônio antimülleriano (BLOCK, 1952; GOUGEO et al., 1994; STEGER, 1980; WISE, 2002) secretado pelos folículos antrais ovarianos (GROOME, 1996), em resposta compensatória à "falha" na retroalimentação e hiperestimulação (QUADRI, 1973) dos esteróides ovarianos. Estudos em mulheres evidenciam que as concentrações elevadas de FSH não indicam diagnóstico de perimenopausa (BURGER, 1994). Neste estudo foi verificado que em fêmeas de roedores também não ocorrem alterações significativas nas concentrações de FSH entre os animais cíclicos do grupo jovem e acíclicos do grupo senil (Figura 11 B). As alterações na secreção plasmática de PRL detectada nos organismos senis (Figura 12) estão, provavelmente, relacionadas às alterações hipotalâmicas em núcleos dopaminérgicos e no fator inibidor da secreção de prolactina (PIF), a dopamina. Estudos realizados nos anos 70 evidenciaram que ratas senis apresentam concentrações deficientes de catecolaminas, com menor concentração de noradrenalina e dopamina quando comparado com ratas jovens (CLEMENS, 1969; CLEMENS; MEITES, 1971; QUESADA; ETGEN, 2001) e que a administração de E2 em ratas anestras desencadeia aumento na secreção de PRL, possivelmente devido à ação estimuladora direta do Discussão 58 esteróide na hipófise (MEITES, 1976), ou pelo aumento da atividade serotoninérgica no HMB e APOM mediada pelo E2 (SZAWKA et al., 2007b) Os resultados deste estudo evidenciam menor síntese catecolaminérgica em animais senis (Figura 14) e indicam clara redução na razão entre síntese e liberação de dopamina nestes animais (Figura 14 F), bem como seu reflexo nas flutuações plasmáticas de PRL observadas durante o diestro persistente. Foi verificado aumento na expressão gênica do receptor de PRL nas regiões de APO e ARC de ratas senis e maior secreção do hormônio nestes animais (CHIU; WISE, 1996). Estas evidências sugerem que alteração no receptor de PRL pode resultar em ações neuroendócrinas no envelhecimento e na habilidade da PRL de atuar em várias regiões cerebrais. A concentração plasmática maior de PRL nos animais senis possivelmente ocorre devido à ação direta dos esteróides gonadais sobre a hipófise associado a menor atividade de fatores inibidores de PRL, como previamente sugerido (CLEMENS, 1969; CLEMENS; MEITES, 1971; QUESADA; ETGEN, 2001). A influência da PRL no eixo neuroendócrino da reprodução deve ser considerada, pois alguns neurônios GnRH apresentam receptores para PRL (PRL-r) e em humanos a hiperprolactinemia está associada com redução na frequência e amplitude dos pulsos de LH (MATSUZAKI et al., 1994) sendo esta redução revertida com o retorno para a concentração normal de PRL (MOULT et al., 1982). Estudo realizado por Kokay e colaboradores (2011) evidenciou RNAm de PRL-r nos neurônios GABAérgicos e KISSpeptinérgicos do ARC e AVPe, núcleos envolvidos com o controle da fertilidade. Esses resultados são consistentes com a hipótese de ação predominantemente indireta da PRL sobre os neurônios GnRH. Portanto, deve ser considerada a hipótese de que o menor conteúdo do decapeptídeo encontrado nos animais senis, neste estudo, pode resultar também do efeito inibidor das altas concentrações de PRL. Neste estudo foi verificado que a fase de diestro persistente é marcada por concentrações mais elevadas de estradiol e progesterona, em comparação com os animais cíclicos em diestro (Figuras 13 A e B) e evidencia a predominância do mecanismo de retroalimentação negativa do estradiol sobre os neurônios GnRH. Há relatos na literatura de que em mulheres, a média da concentração de estradiol na perimenopausa foi maior do que nas mulheres mais jovens/controles (BALLINGE et al., 1987; LEE et al., 1988). Em animais senis, a persistência desta fase leva à concentrações significativamente mais elevadas de esteróides, indicando que durante o Discussão 59 envelhecimento a capacidade de biossíntese destes hormônios é mantida. As alterações nos esteróides relacionadas com a idade têm sugerido que a hipersecreção de estrogênio ovariano e elevações prolongadas durante o ciclo provavelmente contribuem para reduzir a capacidade de resposta neuroendócrina ao efeito de retroalimentação positiva do estradiol sobre a secreção de LH. A análise da atividade de neurônios FRA na APO (Figura 15 e 16) mostrou aumento na tarde de diestro de ratas acíclicas, no entanto a concentração de NA (Figura 14 A) encontrada foi menor nestes animais. Níveis de MHPG (Figura 14 B) na APO de animais cíclicos e com aciclicidade mostraram alteração às 18 h e a relação MHPG/NA (Figura 14 C) sugere maior liberação de NA dos neurônios da APO de animais acíclicos na tarde do diestro persistente. Estes resultados refletem atividade neuronal elevada como mecanismo compensatório à possível redução na biossíntese de NA em animais acíclicos e possível diminuição da capacidade de armazenagem do neurotransmissor. Os resultados obtidos neste estudo sugerem que os neurônios noradrenérgicos (Figura 17 e 18) de animais com ciclicidade são mais eficazes na síntese e armazenagem do neurotransmissor, que estará disponível para liberação nas fases seguintes do ciclo estral com padrão específico de síntese e liberação de NA, caracterizada por progressivo e necessário aumento para a ocorrência da secreção máxima de LH. Os resultados aqui obtidos sugerem que durante o envelhecimento, neurônios noradrenérgicos da APO e do LC apresentam alta atividade, possivelmente, para compensar a menor capacidade de síntese e armazenamento do neurotransmissor. Além disso, os neurônios GnRH são alvo de outros fatores, excitadores e inibidores, sendo os fatores inibidores possivelmente superexpressos durante o envelhecimento, resultando em aciclicidade estral. Sendo assim, as complexas alterações que ocorrem no eixo HPG durante o envelhecimento exigem intensas investigações. CONCLUSÃO Conclusão 61 9 CONCLUSÃO Os resultados obtidos neste estudo permitem concluir que a alteração da atividade neuronal de núcleos envolvidos com o processo reprodutivo, tais como o AVPe e o LC, durante o envelhecimento, ocorrem primariamente às alterações periféricas ovarianas, possivelmente devido à mudanças no microambiente celular e sua maquinaria genética. A maior atividade dos neurônios noradrenérgicos, durante o diestro persistente, parece ser resposta compensatória em razão do baixo conteúdo de NA na APO, que interfere também no controle de secreção pulsátil do GnRH. Possivelmente a temporização circadiana em todo o eixo HPG encontra-se alterada no envelhecimento reprodutivo. Tais alterações refletem em descompasso para síntese e liberação de gonadotrofinas com consequente ausência do pico pré-ovulatório caracterizando a aciclicidade reprodutiva. REFERÊNCIAS Referências 63 REFERÊNCIAS ADVIS, J.P.; KRAUSE, J.E.; MCKELVY, J.F. 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