UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA Rodrigo Mendes de Camargo Estudo de Associação de Genes da Região Cromossômica 10p15 com a Forma Clínica da Hanseníase Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de Botucatu, para obtenção do título de Mestre em Doenças Tropicais. Orientadora: Profa. Dra. Ana Carla Pereira Latini Botucatu 2018 Rodrigo Mendes de Camargo Estudo de Associação de Genes da Região Cromossômica 10p15 com a Forma Clínica da Hanseníase Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de Botucatu, para obtenção do título de Mestre (a) em Doenças Tropicais. Orientadora: Ana Carla Pereira Latini Botucatu 2018 RESUMO A hanseníase é causada pelo Mycobacterium leprae, que infecta macrófagos e células de Schwann, gerando lesões cutâneas e comprometendo nervos periféricos. A doença se apresenta sob diferentes formas clínicas, fortemente determinadas pela resposta imune do hospedeiro, podendo ser classificada como multibacilar (MB) e paucibacilar (PB). Trata-se de uma doença complexa e estudos voltados para a relação genótipo/fenótipo têm evidenciado a participação do componente genético humano nos desfechos da doença. O gene IL2RA está localizado na região cromossômica 10p15, próximo à região 10p13 que foi previamente associada à forma PB da doença, sendo um candidato posicional e funcional para estudos de associação genética com a forma clínica da hanseníase. Este receptor, também denominado CD25, tem papel fundamental na atividade imunorregulatória exercida pelas células Tregs. O TGF-β1 é uma das principais citocinas efetoras da atividade imunorreugulatória das Tregs e está presente em maior quantidade na forma MB. O objetivo do presente trabalho é investigar a associação dos genes IL2RA e TGFB1 com as formas clínicas da hanseníase. Para tanto, conduzimos um estudo de associação baseado em duas amostras caso-controles incluindo 885 casos de hanseníase: 406 casos de Rondonópolis-MT como população primária; 479 casos provenientes do Estado de São Paulo como população de replicação. Os dados de frequências nos grupos de pacientes MB e PB foram comparados por modelo de regressão logística univariada, com e sem ajuste para as co-variáveis sexo, etnia e procedência. O genótipo AA do polimorfismo rs2386841 no gene IL2RA apresentou associação com susceptibilidade para a forma PB da doença na população de Rondonópolis (OR: 4,29; IC95%: 1,57-11,6; p- valor=0,0043), mas que não foi confirmada na população do Estado de São Paulo. O alelo C do marcador rs1800470 no gene TGFB1 foi associado à forma MB da hanseníase na população de Rondonópolis (OR: 2,36; IC95%: 1,12-4,98; p=0,0238). Esta associação foi replicada na população do Estado de São Paulo (OR: 2,10; IC95%:1,07-4,11; p=0,0300). Em análise combinada das duas populações, com ajuste para a co-variável procedência, a associação desta variante foi confirmada (OR: 1,81; IC95%: 1,00-3,25; p=0,0475). Demonstramos assim, pela primeira vez, a associação dos genes IL2RA e TGFB1 com o desfecho forma clínica da hanseníase, colocando estes genes como candidatos para estudos de validação e replicação sobre a genética da forma clínica da hanseníase. Palavras-chave: hanseníase; epidemiologia genética; TGFB1; IL2RA; Tregs. ABSTRACT Leprosy is an infectious chronic disease compromising skin and peripheral nerves. There is a spectrum encompassing the clinical forms of leprosy, directed by host immune response. Leprosy has been classified as multibacillary (MB) and paucibacillary (PB), in accord to number of lesions and bacillary burden. Here we have conducted a genetic association study to clinical forms of leprosy based on two case-control samples from Brazil. We have investigated the association of the IL2RA and TGFB1 genes with clinical forms of leprosy. These genes codify important molecules to immunosuppressive activity of the Treg cells, and present differential expressions in accord to the clinical forms of leprosy. A total of 885 leprosy cases were included in the study: 406 cases from Rondonópolis municipality as start population, and 479 cases from the State of São Paulo as a replication population. The AA genotype of the rs2386841 polymorphism in the IL2RA gene was associated to PB form in the start population (OR: 4.29; p-value = 0.0043), but this was not confirmed for the replication population. The C allele of the rs1800470 marker at the TGFB1 gene was associated to MB form in the start population (OR: 2.36; p-value = 0.0238). This association was replicated for the replication population (OR: 2.10; p-value = 0.0300). In a combined analysis joining both populations the association of the rs1800470 was confirmed (OR: 1.81; p-value = 0.0475). We have demonstrated, for the first time, an association data for the candidate region at chromosome 10 associated to PB form. In addition, we reported the association of TGFB1 gene with the MB form. Our results place these genes as candidates for validation and replication studies and confirm the regulatory activity of Tregs as important to clinical outcome in leprosy. Keywords: leprosy; genetic epidemiology; TGFB1; IL2RA; Tregs. LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS BAAR - Bacilos álcool-ácido resistentes CUBN - Cubulina DC - Dendritic Cell (Célula Dendritica) DD - Dimorfo-dimorfo DNA - Ácido desoxirribonucleico DT - Dimorfo-tuberculóide DV - Dimorfo-virchowiano ELISA - Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ensaio de imunoabsorção enzimática) ENH - Eritema nodoso hansênico FGFb - Fator de Crescimento Fibroblástico básico FoxP3 - Fator de Transcrição Regulatório GWA - Genome-WideAssociation HI - Hanseníase Indeterminada HLA - HumanLeukocyteAntigen (Complexo principal de Histocompatibilidade) IFN - Interferon IL – Interleucina iNOS - Óxido Nítrico Sintase LAM - Lipoarabinomanana LD - Desequilíbrio de ligação MB -Multibacilar MHC - Major Histocompatibility Complex (complexo principal de histocompatibilidade) NEBL - Nebulete NGF - Fator de Crescimento Nervoso NLR – Nod-Like Receptor OMS - Organização Mundial da Saúde OR –Odds ratio (razão de chances) PAMP -Padrões moleculares associados aos patógenos PB -Paucibacilar PBMC - PeripheralBlood Mononuclear Cell PCR - Polimerase Chain Reaction (Reação em cadeia da polimerase) PGL-1 - Antígeno Glicolipídeo Fenólico-1 PQT – Poliquimioterapia PRR - Receptores de reconhecimento de padrões RNA -Ácido ribonucleico RR - Reação reversa SNP - Single nucleotidepolymorphism (Polimorfismo de base única) TDT - Teste de desequilíbrio de transmissão TGF-β–Transforming growth factor beta Th - T helper TLR - Toll-Like Receptor TNF - Fator de necrose tumoral Tregs- Células T regulatórias TT – Tuberculóide VV - Virchowiano SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO E REVISÃO DA LITERATURA 1 1.1. Aspectos gerais da doença ................................................................................ 2 1.2. Formas clínicas da hanseníase........................................................................... 4 1.3. Imunologia......................................................................................................... 7 1.4. Epidemiologia Genética..................................................................................... 10 1.5. Genética em hanseníase..................................................................................... 12 2. OBJETIVOS 16 2.1. Objetivo geral..................................................................................................... 16 2.2. Objetivos específicos......................................................................................... 16 REFERÊNCIAS 17 Manuscrito................................................................................................................. 26 1 INTRODUÇÃO E REVISÃO DA LITERATURA 2 1. INTRODUÇÃO E REVISÃO DA LITERATURA 1.1. ASPECTOS GERAIS DA DOENÇA A hanseníase é uma doença infecciosa, sendo o Mycobacterium leprae o agente etiológico. No entanto, a doença é frequentemente confundida com outras dermatoses devido a certas similaridades nos sinais clínicos (1). Trata-se de doença que gera estigma, muitas vezes vinculada a credos religiosos, castigos e punições divinas, o que acarreta aos portadores um fator de exclusão social em decorrência da falta de conhecimento dos mecanismos de infecção e transmissão da doença (2). Devido à falta de conhecimento dos mecanismos de transmissão da doença, a reclusão dos pacientes em leprosários era um esforço para contenção da doença. Este modelo isolacionista foi incorporado à política de saúde pública brasileira na década de 30, dando origem aos asilos-colônias que, com o tempo, mostraram-se ineficientes ao seu propósito e, por volta da década de 50, deixaram de ser uma medida recomendada (1). A hanseníase representa uma preocupação para o Ministério da Saúde do Brasil, uma vez que o país está em segundo lugar em números de casos da doença, ficando atrás apenas da Índia, apresentando 25.218 novos casos no ano de 2016 (3). Os índices epidemiológicos no Brasil permanecem elevados, mesmo com avanços no diagnóstico e no tratamento, uma vez que o estigma causado pela doença dificulta a procura por assistência médica por parte dos acometidos, sendo um fator limitante para a sua erradicação (2). Em 1873 o médico Gerard Henrik Armaeur Hansen identificou o M. leprae como o agente causador da lepra. Este bacilo pode se apresentar como reto ou ligeiramente encurvado, com as extremidades arredondadas, medindo de 1 a 8 µm de comprimento por 0,3 µm de diâmetro, e possui longo tempo de replicação, em torno de 13 dias (4). Uma característica deste bacilo é o não crescimento em meios axênicos, havendo a necessidade de cultivá-lo através da inoculação em mamíferos, como camundongos e tatus. Somadas à ausência de modelo experimental para a doença, essas peculiaridades têm representado uma dificuldade para o avanço dos estudos da doença (5). 3 Pertence à ordem Actinomycetalis e família Mycobacteriaceae, classificado como álcool-ácido resistente (BAAR) devido à elevada concentração de lipídeos em sua parede celular, revelada por meio da coloração de Ziehl-Neelsen, onde a fucsina se associa fortemente aos lipídeos e não é removida pela solução de álcool-ácido (6). O M. leprae infecta macrófagos e as células de Schwann, sendo um parasita intracelular obrigatório com predileção por regiões do corpo com temperaturas ligeiramente inferiores a 37°C, como nervos periféricos, mucosas e pele. Provoca o espessamento dos nervos, bem como o bloqueio da transmissão do impulso elétrico através do mesmo ao infectar as células de Schwann, constituintes da bainha de mielina que leva a parestesia no local da lesão (7). Quando comparado com outras espécies do gênero Mycobacterium, como o M. tuberculosis, o M. leprae possui um genoma com variabilidade reduzida, o que pode representar uma explicação para a alta especificidade com as células do hospedeiro, bem como a dificuldade em cultivar o bacilo in vitro. Compreende-se que o M. leprae possui restrições em seu metabolismo devido à uma evolução redutiva sofrida em seu genoma. Através do sequenciamento genomico do M. leprae foi possível o uso da biologia molecular no diagnóstico da hanseníase, por meio da técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) utilizando-se sequências especificas de DNA para a identificação da presença do bacilo (8). Adicionalmente,este estudo revelou a existência de variações em cepas de M. leprae obtidas de diversas regiões do globo terrestre, incluindo uma variedade proveniente do Brasil(9). Desdobramentos destes estudos revelaram o predomínio de cepas de acordo com a região geográfica e possibilitaram a compreensão da rota de transmissão da doença ao redor do mundo, sendo plausível a hipótese de que a hanseníase tenha se originado na Ásia e se disseminado pela Europa com as tropas de Alexandre o Grande, sendo mais tarde levada as demais áreas do planeta por meio do mercado de escravos (10). Assim, são fortes os indícios de que a doença tenha chegado às Américas com os colonizadores por volta do século XVI (1). O exame clínico do paciente representa a ferramenta de maior relevância no diagnóstico da hanseníase, onde a análise dermatológica e neurológica tem por objetivo localizar áreas hipocrômicas com perda de sensibilidade e comprometimento de nervos periféricos, com ou sem espessamento. A baciloscopia da lesão ou de pontos índices é um exame laboratorial que auxilia no diagnóstico, 4 entretanto, porém um resultado negativo não exclui a possibilidade de infecção pelo bacilo(6). A reação de Mitsuda é outra ferramenta auxiliar no diagnóstico que fornece informações sobre a resposta do hospedeiro frente à inoculação intradérmica de antígenos isolados do bacilo, e possui grande relevância para o prognóstico de forma clínica (11). Do ponto de vista imunológico, a reação de Mitsuda negativa reflete a susceptibilidade à hanseníase MB devido ao predomínio da resposta humoral do hospedeiro, e um teste positivo reflete a capacidade de resposta imune celular do paciente, que confere resistência ao bacilo (12). Os níveis de anticorpos anti–PGL-1, também podem ser empregados como ferramenta auxiliar de diagnóstico atuando em conjunto com outras metodologias e como forma de avaliação da resposta terapêutica. São quantificados por meio de reação imunoenzimática (ELISA) e apresentam correlação direta com a carga bacilar, e por conta disso, é uma metodologia útil no diagnóstico da forma MB, devido ao predomínio da resposta humoral neste polo (13). 1.2. FORMAS CLÍNICAS DA HANSENÍASE A hanseníase apresenta um espectro clínico amplo, e a classificação clínica mais utilizada atualmente por pesquisadores e centros especializados divide a doença em dois pólos, tuberculóide (TT) e virchorwiano (VV), e três formas intermediarias, dimorfo-tuberculóide (DT), dimorfo-dimorfo (DD) e dimorfo- virchorwiano (DV), incluindo ainda a hanseníase indeterminada (HI), que caracteriza a fase inicial da doença. Esta classificação foi proposta em 1966 por Ridley e Jopling, abrangendo a doença de maneira completa, por levar em consideração aspectos clínicos, imunológicos, microbiológicos e histológicos (14). A hanseníase indeterminada é a fase inicial da doença, onde a resposta imunológica ainda não é definida, podendo evoluir para a cura espontânea, desenvolver-se de maneira lenta e gradativa, ou mesmo regredir, vindo a ressurgir posteriormente. São comumente observadas áreas hipocrômicas e discretamente eritematosas delimitadas ou não, com perda de sensibilidade, e leve ressecamento quando comparadas com áreas adjacentes(12) 5 No polo tuberculóide existe predomínio da resposta imune celular, Th1, que leva a contenção da multiplicação bacilar. As lesões aparecem de forma mais reduzida ou mesmo isoladas. O paciente apresenta reação de Mitsuda positiva, índice baciloscópico negativo e comprometimento dos nervos periféricos (14). A manifestação clínica oposta, polo virchorwiano, é caracterizada pelo predomínio da resposta imunológica humoral, Th2, com maior proliferação do bacilo devido à ineficácia desta resposta. O paciente apresenta resultado negativo ao teste de Mitsuda e a baciloscopia é altamente positiva. As lesões são mais amplas e distribuídas simetricamente pelo corpo, envolvendo diversos troncos nervosos, áreas difusas de tegumento e até outros órgãos (14). Na região central do espectro da doença se encontram os pacientes dimorfos sendo classificados como DT, DD ou DV, caracterizados por instabilidade imunológica, sendo utilizada como critério para a classificação a proximidade das características com as descritas para as formas polares. Pacientes DT apresentam reação de Mitsuda positiva, porém não muito pronunciada, não se observa a presença de bacilos na mucosa nasal e a baciloscopia revela índices de 1 a 3 cruzes. Indivíduos DD são Mitsuda negativos, não apresentam bacilos na mucosa nasal quando comparados com DT e DV, sendo o grupo dos dimorfos com menor estabilidade imunológica, e a baciloscopia indica índices de 3 a 4 cruzes. Por fim, indivíduos DV, por possuírem características mais próximas ao polo VV, são Mitsuda negativos, e, entre os dimorfos, são os que apresentam carga bacilar mais alta (índice baciloscópico de 4 a 5 cruzes) e bacilos podem ser encontrados na mucosa nasal. Na ausência de tratamento estas formas são caracterizadas pela instabilidade, podendo evoluir da forma DT para DV (14). O paciente hanseniano pode ainda apresentar reações imunológicas exacerbadas durante a evolução da doença, ao longo ou após o tratamento, sendo classificados como tipo 1 e tipo 2 (12). Na reação tipo 1, também conhecida como Reação Reversa (RR) existe um aumento abrupto da resposta imune celular com o aumento e piora das lesões, acometendo principalmente pacientes DT, DD e DV, ocorrendo entre 10 e 33% dos pacientes. Ocorre a elevação da resposta linfocitária frente aos antígenos bacilares, bem como um aumento de linfócitos TCD4+ nas lesões, em quantidade absoluta e relativa. Observa-se também a elevação de citocinas pró-inflamatórias e redução nas citocinas do perfil Th2 (15). Em pacientes VV e DV predomina a reação tipo 2, também conhecida como eritema nodoso 6 hansênico (ENH), caracterizada como uma reação inflamatória sistêmica, onde a resposta humoral gera nódulos inflamatórios e lesões máculo-papulares. Estas reações são as principais causas da morbidade decorrente da hanseníase já que levam a lesões e sequelas neurológicas e acomete entre 50 e 70% de indivíduos MB (15). No decorrer dos anos, a classificação clínica da hanseníase adotada pela Organização Mundial da Saúde (OMS) para fins de tratamento passou por algumas modificações. Inicialmente em 1982, com base na classificação de Ridley e Jopling (1966) (13) os pacientes foram divididos em paucibacilares (PB), incluindo os indivíduos TT e DT com baciloscopia menor ou igual a 1+, e multibacilares (MB), composto por indivíduos DD, DV e VV, ou com baciloscopia maior ou igual a 2 +(16). Posteriormente, em 1988, o critério adotado pela OMS considerou PB os pacientes com baciloscopia negativa e MB os pacientes com baciloscopia positiva (17). Por fim, devido às dificuldades operacionais da classificação de Ridley e Jopling (1966), já que se fazem necessários exames laboratoriais, a OMS propôs a classificação levando em conta o número de lesões, onde pacientes com até cinco lesões são classificados como PB, e pacientes com mais de cinco lesões como MB (18). O Ministério da Saúde do Brasil (portaria conjunta 125: 26.03.2015) segue a classificação proposta pela OMS, incluindo no diagnóstico a baciloscopia quando disponível. Nessa classificação pacientes PB são aqueles que apresentam baciloscopia negativa, enquanto os MB os que apresentam baciloscopia positiva (19). O esquema de tratamento é constituído de poliquimioterapia (PQT) composta por rifampicina, dapsona e clofazimina, e depende da classificação clínica proposta pela OMS. Os pacientes PB recebem dose mensal supervisionada de 600 mg de rifampicina e 100 mg de dapsona,e dose diária de 100 mg de dapsona auto administrada durante seis meses. Os casos MB são tratados com estas doses de rifampicina e dapsona por um ano, com acréscimo da clofazimina administrada em dose mensal supervisionada de 300mg e dose diária de 50 mg (20). 7 1.3. IMUNOLOGIA A manifestação da doença e suas formas clínicas possui relação direta com a resposta imunológica do hospedeiro frente ao patógeno. Sendo o M. leprae um parasita intracelular obrigatório, a resposta imunológica celular do tipo Th1 é a eficaz na eliminação do bacilo (15). Acredita-se que a maior parte da população seja naturalmente resistente ao M. leprae, sendo que, uma imunidade inata efetiva associada a baixa virulência do M. leprae resultaria na contenção do bacilo. A linha inicial de interação entre o bacilo e o hospedeiro é mediada pelos receptores de reconhecimento padrão (PRRs), sendo os mais importantes: receptores do tipo Toll (TLRs), tipo NOD (NLRs) e receptores do tipo lectina C como DC-SIGN e Dectina 1, que reconhecem padrões moleculares associados aos patógenos (PAMPs), ativando macrófagos e células dendríticas (DCs) para o reconhecimento e fagocitose destes microrganismos (21). As DCs, principais células apresentadoras de antígenos, após fagocitarem os bacilos migram para os linfonodos, onde fazem a apresentação dos antígenos processados ligados ao complexo principal de histocompatibilidade (MHC). Durante a migração sofrem processo de maturação e, chegando aos linfonodos, ativam linfócitos TCD4+ e estimulam sua diferenciação para os diferentes perfis de resposta (22) A interleucina 12 (IL-12) produzida pelas DCs desencadeia o perfil Th1, com subsequente produção de IL-2 e interferon gama (IFN-γ), culminando na ativação de macrófagos. Na ausência de IL-2, ou na presença de interleucina 4 (IL- 4), a polarização da resposta resulta no perfil Th2, onde ocorre a produção de interleucina 10 (IL-10), estimulando a produção de anticorpos e inibindo a função macrofágica (23). Inicialmente, o conceito predominante era o de que apenas os perfis Th1 e Th2 exerciam influencia na diferenciação das formas clínicas da hanseníase. Atualmente, sabe-se que outros perfis atuam neste processo. Tem sido demonstrado que linfócitos Th9 produzem citocinas como IL-9 e IL-10 que alteram o padrão da resposta imune. No entanto, este tipo celular comporta-se de maneira distinta nas formas polares da doença. No polo tuberculoide a IL-9 induz o desenvolvimento da resposta microbicida dos macrófagos através do sinergismo da resposta entre IFN-γ, IL-6 e IL-12 e regula negativamente a produção de IL-10, 8 mostrando um perfilpro-inflamatório. Já no polo virchowiano, os linfócitos Th9 tem a produção de IL-4, IFN-γ e TNF-α inibida, enquanto a função imunossupressora da IL-10 é preservada com inativação da resposta microbicida dos macrófagos através da regulação positiva de TGF-β (24). Linfócitos Th17 tem atividade pró-inflamatória, e a resposta associada a este tipo celular está associada a processos inflamatórios consistentes com reações reversas (25). Um aumento na expressão de IL-17 foi encontrado na forma TT, que contribui para o recrutamento de células inflamatórias, ativação de células endoteliais e manutenção do processo inflamatório crônico (26). Nas formas de maior persistência do bacilo, a IL-17 potencializa a resposta pró-inflamatória, onde em nível de envolvimento neural, a resposta dos linfócitos Th17 tem sido associada a um processo de desmielinização inflamatória causado por danos nos tecidos, sendo assim, quando o processo inflamatório é estabelecido, a IL-17 regula negativamente a produção do fator de crescimento nervoso (NGF) e seu receptor nas formas TT e VV, contribuindo assim para a aparição de lesões neurais mais graves (24). Linfócitos Th22 fazem parte de um grupo de células que secretam citocinas como IL-22, TNF, IL-13 e IL-26, mas não produzem IL-17 ou IFN-γ. Entre as citocinas secretadas por estas células, a IL-22 tem destaque na hanseníase uma vez que na forma VV, esta citocina participa nos mecanismos de maturação do fagolisossoma. Em detrimento do desenvolvimento de uma resposta de macrófagos, a IL-22 induz a produção de STAT3, bem como óxido nítrico sintase (iNOS) que destroem o bacilo (27). In situ, a resposta dos linfócitos Th22 ganhou importância fundamental na forma VV da doença, pois o fator de crescimento fibroblástico básico (FGFb) pode regular diferentes funções celulares que podem interferir nos processos de cicatrização, migração, divisão celular, proliferação, diferenciação e angiogênese. Nessas circunstâncias, o aumento do FGFb na forma VV da doença reforça o papel crucial desse fator de crescimento no desenvolvimento da resposta reparadora, uma vez que esta forma clínica está associada a maior disseminação bacilar e maior dano tecidual (28). CélulasT regulatórias (Treg) representam subpopulações de linfócitos com o fenótipo CD4+CD25+FoxP3+, que também estão envolvidos na hanseníase. TGF-β1 e IL-10 são as principais citocinas envolvidas na diferenciação celular, sob controle do fator de transcrição regulatório FoxP3. Na hanseníase, células Treg 9 foram descritas como as células que mantêm o equilíbrio da resposta entre os linfócitos Th1 e Th2. O aumento da FoxP3 foi relatado na forma VV da doença, que está associada à natureza anti-inflamatória deste tipo de célula (29). No desenvolvimento da resposta imunossupressora, as células Treg que produzem TGF-β1 e IL-10 contribuem para a inibição da produção de citocinas pró- inflamatórias, bem como para o desenvolvimento da resposta dos linfócitos Th1 e Th17 na forma VV da doença (30). Desta forma, Tregs participam da manutenção e indução da resposta imunosupressora, tendo um importante papel na homeostasia da resposta imune, mas contribuindo com a sobrevivência do bacilo nas lesões (31). O TGF-β, é uma citocina pleiotrópica que atua na proliferação e diferenciação celular, morfogênese, homeostase e regeneração tecidual, e produzida e liberada principalmente por células T regulatórias (Tregs). Também possui função imunoregulatória, inibindo os mecanismos microbicidas dos macrófagos, direcionando a resposta imunológica para o perfil Th2 (33). Tem importante papel em doenças causadas por microorganismos intracelulares, como Leishmania, Trypanosoma cruzi, Toxoplasma gondii, Lacazia loboi, e micobactérias, uma vez que suprime a ativação de macrófagos (30). Dentre as suas três isoformas, a mais abundante é o TGF-β1. Estudos in vitro e in vivo tem demonstrado um aumento desta citocina em pacientes MB, uma vez que a inibição da função macrofágica favorece a multiplicação do bacilo (30) (34) (35) (36). As micobactérias possuem mecanismos específicos de sobrevivência no interior das células que parasitam, liberando mediadores que modulam o maquinário celular. Como exemplo, o M. tuberculosis inibe a apoptose celular e previne a maturação do fagossomo através da secreção de lipoarabinomanana (LAM) e fosfatidilinositol. Nessa mesma linha, o M. leprae interfere na modulação de genes envolvidos na apoptose, regulando negativamente genes pró-apoptóticos e induzindo genes anti-apoptóticos da família Bcl-2 (37). Oglicolipídeo fenólico 1 (PGL- 1) é componente estrutural específico da parede celular do M. leprae, facilita a fagocitose do bacilo por macrófagos e DCs, e concomitantemente inibe a produção de citocinas pró-inflamatórias e a expressão de marcadores de maturação em DCs (38). Uma vez fagocitado, o bacilo libera mediadores que inibem a junção dos lisossomos com o fagossomo em que se encontra, evitando que as enzimas do macrófago o degradem, além de ser capaz de deixar o fagossomo e viver no citosol (38). 10 1.4. EPIDEMIOLOGIA GENÉTICA Atualmente a hanseníase é compreendida como uma doença complexa, onde diversas variáveis atuam em conjunto para o desenvolvimento da doença, desde a hanseníase per se até suas formas clínicas e complicações. Fatores pertinentes ao bacilo, ao ambiente e ao indivíduo determinam o curso da doença. Partindo desta premissa, as pesquisas científicas se voltaram para a investigação dos genomas do paciente e do bacilo, onde a relação genótipo/fenótipo passou a ser mais estudada, confirmando a idéia de que o contato com o bacilo é indispensável para a ocorrência da doença, porém não é suficiente. Sob a perspectiva da genética, não se aplica o padrão de herança mendeliano, monogênico com alta penetrância do genótipo. Como um traço complexo, diversos genes atuam para o desenvolvimento da hanseníase e suas formas clínicas, aliados ainda aos fatores relacionados ao patógeno e ao ambiente (2). A hipótese de participação da genética no desenvolvimento de uma doença parte de evidências que sugerem esta correlação. As abordagens iniciais para testar essa hipótese vêm de estudos epidemiológicos que comprovam agregação familial da doença, comparações de concordâncias de fenótipos entre gêmeos mono e dizigóticos, estudos de adoção e análises de segregação complexa. Todavia, tais estudos não são suficientes para a elucidação de genes e marcadores moleculares, fazendo-se necessário para tanto o uso de metodologias que envolvam a genética molecular, que englobam os estudos de ligação e de associação(2) Estudos de ligação objetivam identificar intervalos cromossômicos associados à doença utilizando marcadores moleculares conhecidos. Estes estudos são conduzidos a partir de pedigrees que contenham indivíduos afetados e de analises de cossegregação entre marcadores de regiões conhecidas e os lócus da doença. O resultado fornecido nessas análises é o LOD score, que acima de três indica uma região cromossômica que pode conter um lócus de susceptibilidade (39). As análises de associação baseiam-se principalmente no modelo populacional caso-controle, onde se compara as frequências de determinado marcador em indivíduos afetados (casos) e não afetados (controles). No caso do marcador apresentar-se em maior frequência no grupo de pacientes, o mesmo está associado com susceptibilidade à doença, e quando se apresenta em maior frequência no grupo controle, está associado com a resistência (40). 11 Outra forma de estruturar os estudos de associação é tomar por base o modelo familiar, onde se elimina a influência da estratificação populacional, sendo possível um controle genético interno. Para este tipo de estudo utiliza-se o teste de desequilíbrio de transmissão (TDT), onde é avaliado o desvio da transmissão alélica aos filhos afetados em relação ao esperado, tendo como controle o alelo não transmitido. Para tanto é necessária a formação do trio informativo, que se constitui de pelo menos um filho afetado e pais heterozigotos para o marcador em estudo. Uma dificuldade para este modelo de estudo, e que se aplica amplamente na hanseníase, é a manifestação tardia do fenótipo, que pode dificultar a recuperação de material genético dos pais (41). Os estudos de associação são frequentemente utilizados como desdobramento dos estudos de ligação uma vez que, a partir da investigação de marcadores em regiões candidatas, é possível o refinamento do dado desvendando os genes e marcadores responsáveis pelo desfecho alvo do estudo. Quanto à distribuição dos marcadores a serem investigados, duas estratégias são amplamente empregadas: a investigação de marcadores em genes candidatos, que são aqueles presentes em regiões previamente ligadas à doença ou aqueles funcionalmente relevantes para o desfecho; a distribuição sem nenhuma premissa, onde se faz uso de grande quantidade de marcadores distribuídos por todo o genoma. Este segundo modelo de estudo é conhecido como genomewide (GW) e considerado uma estratégia geradora de hipóteses(2). Nas últimas décadas as ferramentas moleculares e de bioinformática foram aprimoradas, de modo a se tornarem importantes aliadas em pesquisas que envolvam variabilidade genética. Entre os marcadores moleculares de variabilidade mais utilizados, encontram-se os polimorfismos de base única (SNPs – single nucleotide polymorphism) (15). Estas variantes caracterizam-se pela substituição de apenas uma base nucleotídica que ocorrem na população em frequência maior do que 1%. O efeito que decorre desta alteração está diretamente relacionado com a sua localização no genoma. Ocorrendo dentro de um exon, pode ser classificado como SNP não sinônimo, onde se observa a substituição de aminoácidos na tradução do RNAm. As substituições de aminoácidos podem ainda ser conservativas, quando não se observa alteração funcional da proteína sintetizada, ou não conservativas, onde a proteína alterada representa mudança de desempenho. Os SNPs podem ocorrer ainda em regiões regulatórias, como regiões 12 promotoras e 3’UTR, afetando a ligação de fatores de transcrição ou a estabilidade do transcrito, gerando alterações quantitativas na expressão da proteína.Quando presente no intron o SNP também podem ter efeito funcional, interferindo no splicing do RNA que pode afetar a estrutura da proteína (42), ou na codificação de microRNAs que tem importante papel regulatório, ou podem apenas refletir o efeito associado à outro polimorfismo que se encontre em desequilíbrio de ligação (LD) com o mesmo, mantendo assim a sua utilidade como marcador na elucidação de associações de genes com as características alvo da pesquisa, além de (43). Assim, os SNPs são marcadores altamente úteis para estudos de epidemiologia genética, mesmo porque são os maiores responsáveis pela variação genética interindividual (44). 1.5 GENÉTICA EM HANSENÍASE Análises de segregação complexa demonstraram que a hanseníase sofre a interferência de fatores genéticos e segue o modelo de herança major gene, ou seja, embora um determinado gene possua um papel de destaque em determinado processo, ele atua em conjunto com outros genes (45). Estudos de ligação com varredura do genoma, isto é, genomewide, apontaram picos de ligação nas regiões cromossômicas 10p13 (46),(47), 6p21 (47), (48), 6q25-26 (47) e 17q22 (48)para a hanseníase. Assim, estas regiões devem abrigar possíveis genes candidatos envolvidos no desenvolvimento da doença. Em estudo subsequente ao publicado em 2003, que descreveu o pico de ligação da região 6q25-26, Mira et al. (2004) investigaram a associação de marcadores em 43 genes desta região e encontraram resultados positivos para o gene PARK2, até então envolvido apenas com a doença de Parkinson, evidenciando assim a importância desta estratégia de busca de marcadores genéticos para a doença (49). Localizado na região 6p21 encontram-se os genes do complexo HLA, que controlam os perfis de resposta imunológica Th1 e Th2, diretamente envolvidos nas formas clínicas da hanseníase (50) (51). Dentre eles, os genes TNF e LTA, HLA de classe III, possuem marcadores inequivocamente associados à hanseníase em diferentes populações (52), (48), (53), (54), (55), (56), (57), (58). Localizado na região promotora do TNF encontra-se o polimorfismo mais bem estudado deste gene, o -308A>G que, apesar da associação confirmada com a hanseníase e suas formas clínicas em diversos estudos, tem a questão susceptibilidade/resistência 13 ainda controversa, uma vez que na população brasileira o alelo -308A está associado à resistência, e em outras populações com susceptibilidade (52), (55). Quanto ao LTA, o polimorfismo LTA+80 foi associado com a hanseníase, mas de forma dependente da idade de manifestação da doença, nas populações vietnamita, indiana e brasileira (54). Os genes do HLA de classe II,DR e DQ,também apresentam forte associação com suscetibilidade à hanseníase e suas formas clínicas, que foi confirmada em estudos de estratégia GW em populações distintas (59), (60). Um estudo do tipo genomewide de associação (GWAS), realizado em 2009 com uma grande população da China, encontrou marcadores associados à hanseníase nos seguintes genes: CCDC122, LACC1, NOD2, TNFSF15, HLA-DR, RIPK2 e LRRK2 (59). A partir de então, a validação da associação do gene NOD2, envolvido na codificação de receptores que reconhecem componentes da parede micobacteriana, com a hanseníase, já foi feita por diversos estudos, como no trabalho realizado no Nepal que confirmou associação do gene NOD2 com a hanseníase per se e estados reacionais (55), e no Brasil onde tal associação foi replicada em cinco amostras populacionais distintas (40). Os genes CCDC122 e LACC1 tiveram associação replicada em estudos com populações da África, Índia (61) e do Brasil (40). Na população vietnamita, um estudo de associação confirmou os dados do GWAS para os genes CCDC122, LACC1, NOD2, HLA-DR e RIPK2 (62). A partir destes estudos foi possível observar o compartilhamento de fatores de risco genéticos entre a hanseníase e a doença de Chron localizados no cromossomo 13, corroborando com a hipótese de que micobactérias podem estar envolvidas na patogenia das doenças inflamatórias intestinais (62). Polimorfismos no gene TLR1 possuem efeito na produção de citocinas pró-inflamatórias em PBMCs (PeripheralBlood Mononuclear Cell) estimuladas com M. leprae (63). O SNP 602S (T1805G) foi associado com resistência a hanseníase em diferentes populações (64), (65), com dados replicados em um estudo do tipo genomewide (60). Este mesmo polimorfismo está associado com proteção a reação tipo 1 (66). Neste mesmo gene, outro marcador, o N248S, foi associado com a hanseníase per se e com estados reacionais da doença em uma população de Bangladesh (67). Estudos também apontaram associação de SNPs presentes na região promotora do gene IL10 com a hanseníase em população do Vietnã (47), do Brasil 14 (68), e da Índia (69), (56), sendo este gene codificante da citocina IL-10, com importante papel anti-inflamatório, cujas altas concentrações estão ligadas à progressão da hanseníase (70). Embora diversos estudos demonstrem a participação do componente genético do hospedeiro no desenvolvimento da hanseníase per se, poucos trabalhos têm focado na busca de marcadores associados às formas clínicas da doença, que em seus polos, possuem características muito distintas (71). Variações nos desenhos dos estudos, características intrínsecas de cada população alvo, bem como problemas de classificação podem gerar discordâncias entre os dados obtidos. Este aspecto está bem representado nos trabalhos de Siddiqui (2001) e Mira et al. (2003). No trabalho de Siddiqui et al. (2001), realizado com a população da Índia, foi demonstrada ligação da região cromossômica 10p13 com a hanseníase per se (46). Posteriormente Mira et al.(2003) encontraram associação desta mesma região com a forma PB da doença em população vietnamita, e ao reavaliar os dados de Siddiqui et al. (2001) demonstraram que, na verdade, os dados apontavam ligação da região 10p13 com a forma PB da doença, explicado pela grande quantidade de casos dessa forma na população estudada (47). Ainda nesta região, os genes CUBN (cubulina) e NEBL (nebulete) e MRC1 foram associados com a forma MB da doença, não explicando os dados reportados por Mira et. (2003) (47) (71) (73). Dentre os genes com marcadores associados às formas clínicas da hanseníase com dados replicados encontram-se o TNF, associado à forma MB em população indiana (52) e na população tailandesa (72), o MCR1, associado à forma MB em população do Brasil e Vietnã (73), o MBL2 associado à forma MB em população do Brasil (74) e do Nepal (55), e o TLR2 associado a forma PB da doença em população Malawi (75). O gene IL2RA, responsável pela síntese da cadeia alpha do receptor de IL2, também conhecido como CD25, está localizado na região cromossômica 10p15, e próximo da região 10p13 previamente ligada à forma PB da hanseníase (46), (47) apresentando-se como candidato posicional para estudos de associação com formas clínicas da hanseníase. Além disso, o papel imunológico que este receptor de IL-2 desempenha o torna também um candidato funcional para este estudo, já que a IL-2 polariza a resposta imune para o perfil Th1(23). No entanto, este receptor pode estar associado a um quadro de supressão dos macrófagos quando presentes nas Tregs, consumindo a IL-2 no sitio da resposta imune, dificultando a ativação e 15 proliferação dos linfócitos T efetores, o que por consequência impede a ativação dos macrófagos (76). Estudos demonstram que células que apresentam o CD25 aparecem em maior quantidade em pacientes do polo virchowiano, estando associadas a um quadro de proliferação do bacilo (77), (78), (36). Para o presente trabalho, escolhemos onze tags SNPs do banco de dados do Projeto Internacional HapMap do gene IL2RA, fazendo assim a sua cobertura genética total. Entre os marcadores escolhidos, encontra-se o polimorfismo rs2386841, já associado ao câncer de intestino (79) ao câncer de mama (80), bem como com doenças intestinais inflamatórias associadas à helmintos e protozoários (81). Embora este polimorfismo já possua dados de associação com outras doenças, não existem trabalhos que apontem associação deste SNP com a hanseníase e suas formas clínicas. Outro gene candidato alvo do presente trabalho é o TGFB1, um candidato funcional que possui polimorfismos associados a diferentes tipos de doenças, como câncer de pulmão e mama, infarto do miocárdio, doenças vasculares e doenças inflamatórias (82), (43). A citocina TGF-β1 possui dados funcionais associados à forma clínica da hanseníase, estando significativamente aumentada em pacientes do polo virchowiano (35), (36). Um estudo avaliando cultura de macrófagos estimulados com M. leprae demonstrou que pacientes VV produzem maior quantidade de TGF- β1 quando comparados ao grupo TT, evidenciando a importância desta citocina nas diferentes formas clínicas (53). Em trabalho similar, Venturini et al.(2011) não encontraram diferença na produção de TGF-β1 in vitro, porém a analise in situ das lesões dos pacientes, demonstrou uma maior expressão de TGF-β1 em pacientes DV (35). Estudos demonstram também um importante papel do TGF-β1 no desenvolvimento de doenças inflamatórias intestinais, como a doença de Crohn (83). Entre os polimorfismos funcionais do TGFβ1, encontra-se o rs1800470, associado com maior produção de TGF-β1 e com diversos tipos de câncer, doenças cardíacas e coronárias, doenças pulmonares, complicações em transplantes (“doença do enxerto contra o hospedeiro”), miopia e doenças inflamatórias (82). Como citado, é conhecido que o TGFB1 encontra-se mais expresso em pacientes MB (36) e que o rs1800470 tem papel sobre a secreção desta citocina (82), entretanto, ainda não existem trabalhos abordando a associação deste polimorfismo com a hanseníase, fundamentando a escolha deste SNP como alvo do presente trabalho. 16 Gaschignard et al.(2016) consideram que do ponto de vista genético, poucos são os trabalhos que focam a pesquisa de marcadores associados às formas clínicas da hanseníase, uma vez que na literatura existem 39 associações de marcadores em 28 genes para o desfecho forma clínica, enquanto que estudos sobre a hanseníase per se apresentam 82 associações em 50 genes (84). Os autores usam o termo “polarização” para definir o processo de progressão da doença no indivíduo infectado, tendo como desfecho as formas PB e MB, considerando que estas duas formas, independente da classificação clínica considerada, abrangem todos os subtipos de manifestação da doença (84). Desta forma, o presente trabalho, segue o modelo de estudo proposto por Gaschignard et al, 2016, tendo por objetivo realizar um estudo de associação genética onde será investigado a associação de marcadores em genes candidatos com as formas clínicas da hanseníase (84). 2.OBJETIVO GERAL Investigar a associação de marcadores nos genes IL2RA e TGFB1 com as formas clínicas da hanseníase por meio de estudo de associação baseado em populações de casos de hanseníase provenientes de Rondonópolis-MT e do Estado de São Paulo. 2.1.OBJETIVOS ESPECIFICOS Investigar a associação dos seguintes marcadores com as formas clínicas da hanseníase:  rs7910961, rs11256497, rs12722561, rs2245675, rs2386841, rs3134883, rs4749926, rs6602392, rs706778, rs942201 e rs9663421 do gene IL2RA;  rs1800470 do gene TGFB1. 17 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Eidt LM. Breve história da hanseníase: sua expansão do mundo para as Américas, o Brasil e o Rio Grande do Sul e sua trajetória na saúde pública brasileira. 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Phone: 55-14-31035896. E-mail: anacarlap@gmail.com Financial support: FAPESP (2009/16873-8). The authors declare no financial or commercial conflicts of interest. 28 ABSTRACT Leprosy is an infectious chronic disease compromising skin and peripheral nerves. There is a spectrum encompassing the clinical forms of leprosy, directed by host immune response. Leprosy has been classified as multibacillary (MB) and paucibacillary (PB), in accord to number of lesions and bacillary burden. Here we have conducted a genetic association study to clinical forms of leprosy based on two case-control samples from Brazil. We have investigated the association of the IL2RA and TGFB1 genes with clinical forms of leprosy. These genes codify important molecules to immunosuppressive activity of the Treg cells, and present differential expressions in accord to the clinical forms of leprosy. A total of 885 leprosy cases were included in the study: 406 cases from Rondonópolis municipality as start population, and 479 cases from the State of São Paulo as a replication population. The AA genotype of the rs2386841 polymorphism in the IL2RA gene was associated to PB form in the start population (OR: 4.29; p-value = 0.0043), but this was not confirmed for the replication population. The C allele of the rs1800470 marker at the TGFB1 gene was associated to MB form in the start population (OR: 2.36; p-value = 0.0238). This association was replicated for the replication population (OR: 2.10; p-value = 0.0300). In a combined analysis joining both populations the association of the rs1800470 was confirmed (OR: 1.81; p-value = 0.0475). We have demonstrated, for the first time, an association data for the candidate region at chromosome 10 associated to PB form. In addition, we reported the association of TGFB1 gene with the MB form. Our results place these genes as candidates for validation and replication studies and confirm the regulatory activity of Tregs as important to clinical outcome in leprosy. Keywords: leprosy; genetic epidemiology; TGFB1; IL2RA; Tregs. 29 1. Introduction Leprosy is a chronic infectious disease caused by the Mycobacterium leprae, an intracellular pathogen with predilection for skin macrophages and Schwan cells, causing skin lesions and compromising peripheral nerves. It represents a public health problem, with approximately 210,000 new cases per year in the world, while Brazil ranks second in the number of patients in the world (WHO, 2016). The disease presents a broad clinical spectrum, where there are two poles, tuberculoid (TT) and lepromatous (LL) with predominance of the Th1 and Th2 immune response respectively. The TT pole represents the localized form of the disease with the highest bacillus containment, and the LL pole represents the disseminated form with the highest bacillary spread. There are also three intermediate forms, borderline tuberculoid (BT), borderline borderline (BB), and borderline lepromatous (BL). This classification, proposed by Ridley and Jopling (1966), is widely used in research centers and covers clinical, immunological, microbiological and histopathological aspects (Ridley and Jopling, 1966). For treatment purposes, since 1982 WHO has divided patients into paucibacillary (PB) and multibacillary (MB), considering Ridley and Jopling classification, microbiological indexes and, more recent, the number of lesions (WHO, 1998). The genomic sequence of M. leprae presents low variability, so it is believed that host genetics plays an important role in the development of the disease per se and its clinical forms (Cole et al., 2001). However, the polarization phenotype is neglected by studies on genetic epidemiology of leprosy. The number of genes already associated to leprosy subtypes or its polarization (39 associations in 28 genes) is shorter than for leprosy per se (82 associations in 50 genes) (Gaschignard et al., 2016). Genome-wide linkage studies unveiled peaks at the chromosomal regions 10p13 (Mira et al., 2003; Siddiqui et al., 2001), 6p21(Miller et al., 2004; Mira et al., 2003), 6q25-26 (Mira et al., 2003) and 17q22 (Jamieson et al., 2004) for leprosy. Genes well-associated with leprosy per se are PARK2 (Mira et al., 2004), TNF, LTA (Roy et al., 1997; Shaw et al., 2001; Fitness et al., 2004; Alcais et al., 2007; Sapkota et al., 2010; Wong et al., 2010; Cardoso et al., 2011; Ali et al., 2012), HLA-DR, RIPK2, (Zhang et al., 2009), CCDC122, LACC1(Wong et al., 2010; Zhang et al., 2009) LRRK2, TNFSF15 (Zhang et al., 2009; Grant et al., 2012) NOD2( Zhang et al., 2009; Berrington et al., 2010; Sales-Marques et al., 2014) TLR1 (Bochud et al., 2008; De Sales Marques et al., 2013; Johnson et al., 2007; Misch et al., 2008; Schuring et al., 2009; S H Wong et al., 2010), IL10 (Santos et al., 2002; Pereira et al., 2009; Franceschi et al., 2009). 30 Although several studies have demonstrated the participation of the host genetic component in the development of leprosy per se, few studies have focused on the search for markers associated with the clinical forms of the disease (Gaschinard et al., 2016). Besides, a two-stage model has been proposed do leprosy genetic susceptibility, with a set of genes to risk of leprosy per se and another set for leprosy clinical forms (Alter et al., 2011). Some genes with markers associated to clinical forms of leprosy with replicate data are TNF, associated with MB form in Indian (Roy et al., 1997) and Thai populations (Vejbaesya et al., 2007), MCR1 (Alter et al., 2010) and MBL2 associated to the MB form in Brazil (Messias- Reason et al., 2007) and Nepal (Sapkota et al., 2006), TLR2 associated with the PB form of the disease in Ethiopia (Bochud et al., 2008) and Malawi (Fitness et al., 2004). The IL2RA gene is located at the chromosomal region 10p15, near from the linkage peak for leprosy (Mira et al., 2003; Siddiqui et al., 2001). It codes the alpha subunit of the IL- 2 receptor, and is also named CD25. It plays a role in leprosy since IL-2 polarizes the immune response to the Th1 profile acting on the macrophages activation. However, this molecule is also associated to an immunosuppressive profile, being present at regulatory T cells (Tregs). Tregs use this receptor to consume IL-2 at the site of the immune response, hindering the activation and proliferation of the effector T lymphocytes, and preventing the activation of macrophages (Chinen et al., 2016). Studies have shown that CD25+ cells are in a greater number of patients in the lepromatous pole and are associated with a proliferation of bacillus (Tarique et al., 2017; Bobosha et al., 2014). Another candidate gene for association studies in leprosy polarization is TGFB1. It is a pleiotropic cytokine with important function in the immunoregulatory activity of Tregs (Massagué, 2012). TGF-β has an important role in diseases caused by intracellular microorganisms such as Leishmania, Trypanosomacruzi, Toxoplasma gondii, Lacazialoboi, and mycobacteria, since it suppresses the activation of macrophages (de Souza Aarão et al., 2014). In vitro and in situ studies confirm higher TGF-β production in lepromatous patients, which participates in the anti-inflammatory milieu and bacillary persistence observed at this pole (de Souza Aarão et al., 2014; Petito et al., 2013; Saini et al., 2014; Venturini et al., 2011). Herein, we investigated the association of markers at the IL2RA and TGFB1 genes with leprosy polarization, using a stepwise strategy enrolling two population samples from Brazil. 2. Methods 2.1. Subjects and study design 31 We adopted a step-wise design to investigate markers in the IL2RA and TGFB1 genes. Our start population is from Rondonópolis county, located at Mato Grosso State, an hyperendemic region of Brazil for leprosy. In order to test the replication of the data, we investigated a second case-control sample from State of São Paulo (replication population), where the epidemiological indexes of leprosy are more controlled (Brazil Ministry of Health, 2015). In order to classify patients in PB and MB, we adopted the WHO classification criterion of 1982. Taking into account the Ridley and Jopling (1966) spectrum, TT and BT patients with bacilloscopy index ≤1+ were classified as PB, while MB patients had bacilloscopy index ≥ 2+ (WHO, 1982). Patients from Rondonópolis encompassed 406 individuals, of which 90 were PB and 310 MB. Leprosy diagnosis were confirmed by clinical-laboratory tests in the out patient service of the local family health clinics. The sample of patients from São Paulo State were composed by 479 cases, diagnosed at the Lauro de Souza Lima Institute (Bauru-SP), and 99 were PB and 380 MB. The description of the general characteristics of these groups are detailed in the Table1. Table 1. Characteristics of MB and PB groups in the start and replication populations. Variable Category Start Population (n=406) Replication Population (n=479) Clinical form (WHO, 1982) Paucibacillary Multibacillary 96 (24%) 310 (76%) 99 (21%) 380 (79%) Clinical form (Ridley & Jopling, 1966) LL BL BB BT TT IL 21 (5,1%) 63 (15,3%) 79 (19,2%) 156 (38,7%) 60 (14,6%) 27 (6,6%) 102 (21,2%) 131 (27,3%) 132 (27,5%) 49 (10,2%) 62 (12,9%) 3 (0,6%) Age (mean±SD) MB Age (mean±SD) PB 42,9 ±16,1 39,1 ±16,1 37,9 ± 18,01 40,2 ± 18,01 Ethnicity MB Ethnicity PB Caucasian Black Mestizo Without classification Caucasian Black Mestizo Without classification 116 (37%) 10 (3%) 184 (60%) - 29 (30%) 6 (6%) 61 (64%) - 299 (78%) 17 (5%) 49 (13%) 15 (4%) 82 (83%) 7 (7%) 9 (9%) 1 (1%) 32 Gender MB Gender PB Male Female Male Female 201 (65%) 109 (35%) 45 (47%) 51 (53%) 271 (71%) 109(29%) 63 (64%) 36 (36%) MB – multibacillary leprosy; PB – paucibacillary leprosy; SD – standard deviation; LL – Polar lepromatous leprosy; BL – Borderline lepromatous leprosy; BB – Bordeline bordeline leprosy; BT – Borderline tuberculoid leprosy; TT – Polar tuberculoid leprosy; IL – Indeterminate leprosy. 2.2. DNA extraction and SNP genotyping Genomic DNA was extracted from peripheral blood leukocytes samples by salting-out method. Genotyping were performed by allelic discrimination method based on TaqMan® technology (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), and were conducted on Step One Plus real-time PCR equipment (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). 2.3. Markers selection The rs1800470 polymorphism of TGFB1 was selected from literature data reporting functional effects of this variant (Shin et al., 2005; Wei et al., 2007; Li et al., 2004; Fan et al., 2014; Zhang et al., 2015; Langdahl et al., 2008; Sandhya et al., 2011; Jonth et al., 2007; Martelossi Cebinelli et al., 2016). This is a missense polymorphism that promotes the substitution of proline by leucine. For IL2RA gene we picked eleven tag SNPs from International HapMap Project database considering a minimum minor allele frequency of 0.1 and a r2cutoff of 0.8 in Yoruba population. Following SNPs were selected: rs7910961, rs11256497, rs12722561, rs2245675, rs2386841, rs3134883, rs4749926, rs6602392, rs706778, rs942201 and rs9663421. 2.7. Statistical analyses The comparisons of alleles, genotypes and carriers frequencies were performed using a univariate logistic regression model, with and without adjustment for the covariates gender and ethnicity, using statistical software R for Windows, version 2.5.1, and the packages "genetics", "desing", "hmisc" and "haplo.states". P-value <0.05 was adopted as cutoff for statistical significance. In order to avoid the multiple comparisons effect, Bonferroni correction was adopted before testing the replication of data for IL2RA markers. To confirm the independent signals of the markers at IL2RA we measured the linkage disequilibrium (LD) through r2 statistics using the Haploview software, version 4.2. 33 3. Results 3.1 IL2RA Among the eleven markers tested in the IL2RA gene (Supplementary Table 1), three showed a significant association with clinical forms of leprosy for the start population (rs2386841, rs7910961and rs6602392), as described in Table 2. However, after Bonferroni correction only the association of AA genotype of the rs2386841 with the PB form remained significant (OR=4.29; p-value= 0.0043) and was tested in the replication population, according to the step-wise strategy. However, this association was not replicated for the replication population, as described in Table 2. The linkage disequilibrium analysis including the eleven markers showed that rs2386841 has an independent signal (Fig. 1). Table 2: Frequency data in PB and MB groups and association data for markers rs2386841, rs7910961 and rs6602392 at the IL2RA gene. Population /Marker Alelles or Genotypes PB MB OR (95%CI) p-value OR (95%CI) p-valuea A 0,23 0,16 1,57 (0,89-2,75) 0,1150 1,71 (0.96-3,05) 0,0682 C 0,76 0,82 * * Start Population CC 59 (0,62) 214 (0,70) * * rs2386841 AC 27 (0,28) 83 (0,27) 1,17 (1,37 -9,54) 0,5338 1,27 (0,74-2,18) 0,3752 AA 9 (0,09) 9 (0,03) 3,62 (1,37-9,54) 0,0091 4,29 (1,57-11,6) 0,0043 Carrier A 1,42 (0,88-2,29) 0,1505 1,56 (0,95-2,56) 0,0769 n= 95 n= 306 Start Population rs7910961 A G GG AG AA CarrierA 0,44 0,56 32(0,34) 43(0,45) 20(0,21) 0,35 0,65 134(0,44) 127(0,42) 45(0,15) 1,41(0,88-2,25)0,1487 * * 1,41(0,84-2,38)0,1865 1,86(0,96-3,75)0,0622 1,53(0,94-2,48)0,0818 1,50(0,93-2,43)0,0940 * * 1,51(0,88-2,56)0,1266 2,09(1,07-4,09)0,0308 1,66(1,01-271)0,0443 n=95 n=306 Start Population rs6602392 C A CC AC AA Carrier A 0,89 0,11 74(0,78) 21(0,22) 0 0,82 018 209(68) 86(28) 11(0,04) * 0,57(0,28-1,17)0,13 * 0,68 (0,39-1,19)0,1821 - 0,61(0,35-1,05)0,0748 * 0,50(0,24-1,03)0,0628 * 0,59(0,34-1,05)0,0743 - 0,52(0,30-0,91)0,0230 n=95 n=306 A 0,24 0,26 1,09 (0,60-1,97) 0,7683 1,08 (0,59-1,97) 0,7894 C 0,76 0,74 * * Replicatio n population rs2386841 CC 44 (0,59) 175 (0,58) * * AC 24 (0,32) 97 (0,32) 1,01 (0,58-1,77) 0,9548 1,00 (0,56-1,76) 0,9924 AA 6 (0,08) 30 (0,10) 1,25 (0,49-3,20) 0,6321 1,24 (0,48-3,20) 0,6446 Carrier A 1,06 (0,63-1,78) 0,8131 1,05 (0,62-1,78) 0,8479 n= 74 n= 302 Bold values denote statistically significant results. Abbreviation: OR — odds ratio; CI — confidence interval of 95%. *Indicates the baseline for comparison. a OR e p-value adjusted for covariates sex and ethnicity. 34 Fig.1. Linkage disequilibrium (LD) map fort tag SNPs at the IL2RAgene.The number within boxes represents r2 values calculated by Haploview software (4.2). 3.2TGFB1 When we tested the rs1800470 marker in the TGFB1 gene for the start population we found an association of the AA genotype with the MB form of the disease, and this data was replicated for the replication population. Besides, the AG genotype and carriers of A allele also showed association with the MB form for the replication population, as described in Table 3. Then, we conducted a combined analysis joining both populations and adjusting the association data for gender, ethnicity and origin covariates, in order to evaluate a possible interference of the different populations on the data. From this analysis, the AA genotype association remained associated to MB form (OR=2.23; p-value=0.0016). In addition, the AG genotype, A allele and carriers of A were also associated to MB form, as described in Table 3. 35 Table3: Frequency data in PB and MB groups and association data for markers rs1800470 at the TGFB1 gene. Population Alelles or Genotypes PB MB OR (95%CI) p-value OR (95%CI) p-valuea A 0,45 0,55 1,50 (1,86-3,60) 0,0944 1,47 (0.90-2,40) 0,1201 G 0,55 0,45 * * Start population GG 24 (0,27) 54 (0,19) * * AG 50 (0,56) 146 (0,52) 1,29 (0,72 -2,31) 0,3770 1,27 (0,70-2,30) 0,4201 AA 15 (0,17) 83 (0,29) 2,45 (1,18-5,10) 0,0158 2,36 (1,12-4,98) 0,0238 Carrier A 1,56 (0,89-2,72) 0,1127 1,52 (0,86-2,69) 0,1452 n= 89 n= 283 A 0,47 0,55 1,40 (0,87-2,26) 0,1650 1,40 (0,89-2,36) 0,1313 G 0,53 0,45 * * replication population GG 25 (0,30) 68 (0,20) * * AG 39 (0,46) 174 (0,50) 1,64 (0,92-2,91) 0,0917 1,81 (1,00-3,25) 0,0475 AA 20 (0,24) 106 (0,30) 1,94 (1,00-3,77) 0,0483 2,10 (1,07-4,11) 0,0300 Carrier A 1,74 (1,01-2,98) 0,0424 1,91 (1,10-3,30) 0,0205 n= 84 n= 348 Combined population s A G GG AG AA Carrier A 0,46 0,54 49 (0,28) 89 (0,51) 53 (0,20) 0,55 0,45 122 (0,19) 320 (0,51) 189 (0,30) 1,45 (1.03-2,04) 0,0294 * * 1,44 (0,96-2,16) 0,0763 2,16 (1,32-3,53) 0,0020 1,64 (1,12-2,42) 0,0110 1,47 (1,04-2,07) 0,0270 * * 1,52 (1,00-2,31) 0,0448 2,23 (1,35-3,66) 0,0016 1,72 (1,16-2,55) 0,0063 n=191 n=631 Bold values denote statistically significant results. Abbreviation: OR — odds ratio; CI — confidence interval of 95%. *Indicates the baseline for comparison. a OR e p-value were adjusted for covariates sex, ethnicity and origin. 4. Discussion In this study we intentioned to apply the strategy proposed by Gaschignardet al. (2016), focusing on the phenotype of "leprosy polarization", referring to the process involved in the differentiation of the clinical forms of leprosy. From the genetic perspective, the leprosy polarization phenotype can be considered as neglected, given the lack of studies for this purpose. In most cases, the studies that deal with the clinical forms of the disease do this as secondary analysis of studies about leprosy per se, comparing clinical forms groups with healthy controls. For Gaschignard et al., (2016) this is not valid, since these designs consider PB and MB forms of leprosy as "distinct diseases", and the mechanisms involved in the disease per se, will not necessarily be involved in the clinical form determination (Gaschignard et al., 2016). They also described the benefits of using the correct method for study clinical forms outcome. Here we conducted an association study focusing on the leprosy polarization phenotype respecting those criterions pointed by Gaschinard et al. (2016), for two genes associated to the regulatory process of the immune response, IL2RA and TGFB1. 36 After test eleven polymorphisms covering the IL2RA gene, we found an association signal for AA genotype of the rs2386841 with the PB form of leprosy in the start population from Rondonópolis. This association cannot be confirmed in the replication population, probably reflecting genetic background differences between these populations, which are from two distant regions in Brazil. However, this is the first loci at 10p13 region associated to PB form, in accord to described by Mira et al. (2003), since other associations data for this region, at MRC1, NEBL and CUBN genes, are related to MB form (Grant et al., 2014; Alter et al., 2010). Thus, our data evidences IL2RA gene as a candidate for validation and replication studies on leprosy polarization. As expected, the linkage disequilibrium analysis showed that rs2386841 has an independent effect, being an interesting marker for association studies of this gene. When testing TGFB1 gene we found association of the AA genotype of the polymorphism rs1800470 to the risk of MB form of leprosy in both populations. The combined analysis reinforced these association data. These findings conflict with functional data pointing the G allele associated with higher production of TGF-β1 (Martelossi Cebinelli et al., 2016), since MB patients has a greater amount of this cytokine (Saini et al., 2014; Venturini et al., 2011). This variant, also known as +29C>T, is located at the hydrophobic core of the signal peptide sequence, however both alleles encode apolar amino acids (Martelossi Cebinelli et al., 2016). Thus, in spite of missense, this marker cannot be the causative of the functional effect and it can reflect the effect of other variants. Besides, a specific effect for M. leprae stimulus should be investigated. Treg cells CD4+ CD25+ FoxP3+ are important regulator of the Th1 and Th2 immune responses, which contribute to clinical presentation of leprosy. FoxP3 is the key transcription factor of this cell population and TGF-β1 and IL-10 are the main effector cytokines involved in Treg cell activities. These cells participate in the induction and maintenance of the immunosuppressive profile seen in lepromatous leprosy contributing to the high bacillary burden (Sadhu et al., 2016). The nature of the FOXP3 activity, if suppressor or activator, seems to be different when comparing the leprosy poles (Kumar et al., 2013). Besides, the miR155 is involved in the higher proliferation and longevity of Tregs in BL/LL patients (Kumar et al., 2013). Considering these aspects, we decided to explore for the first time the genetic association of CD25 and TGF-β1 with the leprosy polarization. It is important to mention that we have already investigated this association for IL10, which is only associated to leprosy per se in our population (Pereira et al., 2009). 37 Classical covariates determining clinical forms of leprosy include sex, age, endemicity, geography, BCG vaccination (Gaschinard et al., 2016). To assemble a case- control sample to genetic association studies is indispensable consider these covariates. Here we adopted selection criteria and analysis parameters to control the effect of these covariates in order to avoid biases. Data from the literature indicate a higher incidence of the MB form in men than in women, with a ratio of 1.5-2 times (reviewed by Gaschignard et al., 2016). The number of MB individuals is also increased in Brazilian men than women (WHO, 2017). Our population samples follow this observation since the male:female ratios are 1.84 for the start population and 2.48 for replication population, respectively. In spite of ethnicity not to be a classical risk factor influencing leprosy clinical forms, we considered this in our analysis since Brazilian people suffers of an intense admixture of races. When adjusting the analysis using sex and ethnicity as covariates, we observed differences to IL2RA results, since rs7910961 and rs6602392 markers presented positive association after the adjustment. However, for the rs2386841 and rs1800470 there were no interferences of these covariates. A higher mean of age among MB than in PB patients has been also reported, probably due to the long incubation time of the bacillus (de Vries and Perry, 1985; Guerra-Silveira and Abad-Franch, 2013; WHO 2017). Although the influence of age is higher in men than in women, the effect of these covariates (age and sex) are independent on the polarization of leprosy (Guerra-Silveira and Abad-Franch, 2013). In our study the mean age of illness for both populations is in agreement with the observed for the Brazilian population with a predominance of cases in adults (WHO, 2017). The geography and endemicity covariates are highly influenced by human genetic factors. Thus, populations with different genetic background present intense epidemiological differences interfering with the outcomes of genetic studies. For example, in a meta-analysis the A allele of -308A>G at the TNF gene was associated with leprosy resistance only in Brazilian population, in spite of to be associated with susceptibility in other populations (Cardoso et al., 2011). According to WHO data, Brazil has a predominance of MB cases in its population, with 72% of MB, while in India the proportion of MB among the new cases in 2016 was 49% (WHO, 2017). The proportions of MB form in our population samples reflect what is observed in Brazil (76% for start population and 76,1% for replication population). Finally, we could not find reliable data on BCG vaccination for these populations. Leprosy is a complex trait and factors related to host, environment and pathogen act in the development of the disease per se and its clinical forms (Alter et al., 2011). However, 38 there is no evidence that different strains of M. leprae interfere in the outcome, and studies point to a low genetic variability of the bacillus as well (Monot et al., 2009). Thus, considering the broad clinical aspect of leprosy, the human genetic component seems to play a more relevant role in the outcome of the disease (Alter et al., 2011). From the epidemiological perspective, the elucidation of the mechanisms involved in the leprosy polarization may help to predict clinical forms with higher potential in transmitting the disease, helping to interrupt the transmission chain (Job et al., 2008). Thus, our data helps to construct the genetic architecture of leprosy clinical forms. Also in vitro functional studies using different ratios M. leprae cells (MOI) may be an interesting strategy for the validation of genetic epidemiology data on leprosy polarization. 39 References Alcaïs, A., Alter, A., Antoni, G., Orlova, M., Nguyen, V.T., Singh, M., Vanderborght, P.R., Katoch, K., Mira, M.T., Vu, H.T., Ngyuen, T.H., Nguyen, N.B., Moraes, M., Mehra, N., Schurr, E., Abel, L., 2007. Stepwise replication identifies a low-producing lymphotoxin-alpha allele as a major risk factor for early-onset leprosy. Nat. Genet. 39, 517–22. https://doi.org/10.1038/ng2000 Ali, S., Chopra, R., Aggarwal, S., Srivastava, A.K., Kalaiarasan, P., Malhotra, D., Gochhait, S., Garg, V.K., Bhattacharya, S.N., Bamezai, R.N.K., 2012. Association of variants in BAT1-LTA-TNF- BTNL2 genes within 6p21.3 region show graded risk to leprosy in unrelated cohorts of Indian population. Hum. 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