RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta tese/dissertação será disponibilizado somente a partir de 30/11/2025 At the author's request, the full text of this thesis/dissertation will not be available online until November 30, 2025 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA CÂMPUS DE BOTUCATU EFEITO DE DOSE LETAL E SUBLETAL DO IMIDACLOPRIDE NO TRANSCRIPTOMA DE ABELHAS Apis mellifera AFRICANIZADAS ISABELLA CRISTINA DE CASTRO LIPPI Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Zootecnia como parte das exigências para obtenção do título de Doutora em Zootecnia BOTUCATU – SP Julho 2024 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA CAMPUS DE BOTUCATU EFEITO DE DOSE LETAL E SUBLETAL DO IMIDACLOPRIDE NO TRANSCRIPTOMA DE ABELHAS Apis mellifera AFRICANIZADAS ISABELLA CRISTINA DE CASTRO LIPPI Orientador: Prof. Dr. Orientador Ricardo de Oliveira Orsi Coorientador: Dr. Samir Moura Kadri Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Zootecnia como parte das exigências para obtenção do título de Doutora em Zootecnia BOTUCATU – SP Julho - 2024 I II III Biografia da autora Isabella Cristina de Castro Lippi, nascida em São Paulo – SP no dia 15 de março de 1993, ingressou no curso de Medicina Veterinária no ano de 2013 na UNESP de Jaboticabal- FCAV e concluindo o curso no ano de 2017. Em 2018 iniciou o mestrado em Zootecnia na UFGD e conquistou o título de mestre em Zootecnia em fevereiro de 2020, no mesmo ano que iniciou o curso de doutorado no programa de pós-graduação em Zootecnia da UNESP de Botucatu – FMVZ, atuando nas áreas de apicultura, genética e produção animal. IV Agradecimentos O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001. Agradeço à minha família, em especial meus filhos que me motivam a sempre seguir em frente. Agradeço meu companheiro Henrique que nos acompanha com muito carinho e dedicação, sem essa parceria não seria possível conquistar meus objetivos e sonhos, passamos por muitas dificuldades, mas passamos juntos e isso faz toda a diferença. Agradeço à minha mãe e meu pai que sempre me apoiaram e me encorajaram, acreditaram em mim e viabilizaram a minha chegada até aqui. Agradeço ao meu professor orientador por toda compreensão, acolhimento, ensinamentos, paciência e tudo que foi feito por mim para que eu conseguisse finalizar essa etapa tão importante na minha vida. Com certeza foi essencial a humanidade do senhor, então agradeço imensamente. Agradeço aos meus queridos amigos de setor, Yanzinho, Jaine (Janaína) e Iloran, vocês fizeram meus dias felizes, animados, alimentados com bolinhos e café, fizeram com que as dificuldades fossem regadas de risadas (as vezes de desespero), me animaram, me acolheram, me ajudaram quando eu precisei, me apoiaram, e eu sou muita grata pelo presente que foi ter vocês na minha vida. Espero que os nossos caminhos ainda se cruzem por muitas e muitas vezes, torço pelo sucesso de todos vocês. Agradeço a todos os integrantes e estagiários do grupo Néctar que contribuíram para a realização de trabalhos, projetos, confraternizações e construção de momentos tão especiais que carrego com muito carinho. Ju, Aline, Gui, Suelen, Torres, Elisa, Júlia, Giovanna, muito obrigada. Agradeço também aos queridos funcionários Maurício e Dinho que fazem tanto para que o setor continue funcionando de forma adequada, vocês são essenciais para o funcionamento da universidade e das nossas pesquisas. Agradeço imensamente a Cláudia por sempre ajudar em absolutamente tudo que precisamos, e ser uma grande mãezona para os alunos da pós-graduação. Muito obrigada, Claudinha. Agradeço também o Dinho e o Maurício por todo trabalho e ajuda. Agradeço pela CAPES pela bolsa cedida que foi essencial para a permanência na pós-graduação. V Resumo A introdução de subespécies europeias e africanas no Brasil levou ao surgimento das abelhas africanizadas, que combinam alta produtividade com comportamento defensivo. As abelhas desempenham um papel crucial na polinização, essencial para a fertilização e reprodução de plantas, contribuindo para 35% da produção agrícola global. A polinização aumenta a qualidade e quantidade das culturas, movendo um setor econômico significativo. A polinização, além de sua importância econômica, é vital para a biodiversidade e a produção sustentável de alimentos. A perda de polinizadores pode trazer consequências negativas para a produção agrícola e a saúde humana, evidenciando a necessidade de práticas agrícolas sustentáveis e de proteção às abelhas. A atividade apícola é vital para a agricultura familiar, oferecendo produtos como mel, própolis, cera, e geleia real, com o Brasil se destacando como um grande produtor de mel orgânico. As abelhas enfrentam ameaças significativas de agrotóxicos, que têm efeitos letais e subletais. Esses produtos químicos, como os neonicotinoides, afetam o comportamento, desenvolvimento e saúde das abelhas, comprometendo a sobrevivência das colônias. Os neonicotinoides agem como agonistas da acetilcolina nas abelhas, causando hiperexcitabilidade e, em doses subletais, problemas comportamentais e fisiológicos. As ferramentas moleculares são fundamentais para estudar esses efeitos servir como guia para o desenvolvimento de estratégias de mitigação. O presente estudo expos as abelhas a doses letais (Ingestão:0,081 μg/abelha; Contato:0,063 μg/abelha) ou subletais (Ingestão:0.00081 μg/abelha; Contato: 0.00063 μg/abelha) de imidaclopride por ingestão ou contato e analisaram seus transcriptomas após 1 e 4 horas de exposição. Os resultados mostraram uma expressão diferencial significativa de genes associados a processos biológicos fundamentais, como o sistema imunológico, metabolismo nutricional, detoxificação, ritmo circadiano e comportamento de forrageamento. Após 1 hora de ingestão de imidaclopride, 1.516 genes (73 da dose letal; 1.509 da dose subletal) apresentaram expressão diferencial em comparação com o controle, enquanto após 4 horas, 758 genes (733 da dose letal; 25 da dose subletal) exibiram expressão diferencial em comparação com o controle. Após uma hora de contato com o inseticida, 49 genes apresentaram expressão diferencial em comparação com o controle, sendo 20 exclusivos de cada dose e 9 genes foram comuns entre os tratamentos. Considerando o período de 4 horas de contato com o inseticida, 48 genes apresentaram expressão diferencial em comparação com o controle, sendo 42 genes diferencialmente expressos na dose letal e 18 na dose subletal. A exposição ao imidaclopride pode afetar a função olfativa das abelhas, essencial para a polinização. Além disso, foram observadas alterações metabólicas que podem impactar o desempenho das abelhas, bem como perturbações nos ritmos circadianos, essenciais para a sobrevivência das colônias. Houve também evidências de uma resposta adaptativa ao estresse oxidativo. Esses estudos ressaltam a importância de considerar os efeitos VI subletais dos pesticidas e suas consequências a longo prazo para as populações de abelhas e o funcionamento dos ecossistemas. Eles fornecem insights valiosos para o desenvolvimento de políticas públicas visando o manejo sustentável de pesticidas e a preservação das abelhas, essenciais para a segurança alimentar global. Palavras-chave: Apicultura; Inseticida; Transcriptoma VII Abstract The introduction of European and African subspecies in Brazil led to the emergence of Africanized bees, which combine high productivity with defensive behavior. Bees play a crucial role in pollination, essential for the fertilization and reproduction of plants, contributing to 35% of global agricultural production. Pollination increases the quality and quantity of crops, driving a significant economic sector. In addition to its economic importance, pollination is vital for biodiversity and the sustainable production of food. The loss of pollinators can have negative consequences for agricultural production and human health, highlighting the need for sustainable agricultural practices and the protection of bees. Beekeeping is vital for family farming, offering products such as honey, propolis, wax, and royal jelly, with Brazil standing out as a major producer of organic honey. Bees face significant threats from pesticides, which have lethal and sublethal effects. These chemicals, such as neonicotinoids, affect the behavior, development, and health of bees, compromising the survival of colonies. Neonicotinoids act as acetylcholine agonists in bees, causing hyperexcitability and, in sublethal doses, behavioral and physiological problems. Molecular tools are essential for studying these effects and guiding the development of mitigation strategies. This study exposed bees to lethal (Ingestion: 0.081 μg/bee; Contact: 0.063 μg/bee) or sublethal (Ingestion: 0.00081 μg/bee; Contact: 0.00063 μg/bee) doses of imidacloprid through ingestion or contact and analyzed their transcriptomes after 1 and 4 hours of exposure. The results showed significant differential gene expression associated with fundamental biological processes, such as the immune system, nutritional metabolism, detoxification, circadian rhythm, and foraging behavior. After 1 hour of imidacloprid ingestion, 1,516 genes (73 from the lethal dose; 1,509 from the sublethal dose) showed differential expression compared to the control, while after 4 hours, 758 genes (733 from the lethal dose; 25 from the sublethal dose) exhibited differential expression compared to the control. After one hour of contact with the insecticide, 49 genes were differentially expressed compared to the control, with 20 unique to each dose and 9 genes common between the treatments. Considering the 4-hour contact period with the insecticide, 48 genes were differentially expressed compared to the control, with 42 genes differentially expressed at the lethal dose and 18 at the sublethal dose. Imidacloprid exposure can affect the olfactory function of bees, essential for pollination. Additionally, metabolic changes were observed that could impact bee performance, as well as disruptions in circadian rhythms, essential for colony survival. There was also evidence of an adaptive response to oxidative stress. These studies highlight the importance of considering the sublethal effects of pesticides and their long-term consequences for bee populations and ecosystem functioning. They provide valuable insights for the development of public policies aimed at sustainable VIII pesticide management and the preservation of bees, essential for global food security. Keywords: Apiculture; Insecticide; Transcriptome IX LISTA DE ILUSTRAÇÕES CAPÍTULO 1 Figura 1. Abelha operária, Rainha e Zangão........................................................ 17 Quadro 1 : Funções executadas pelas operárias de acordo com a idade........... 19 Quadro 2 Período de desenvolvimento (dias) de crias de abelhas Apis mellifera africanizada........................................................................................................... 20 Figura 2. Passos básicos de um experimento típico de RNA-seq........................ 28 CAPÍTULO 2 Figura 1. Diagrama de Venn representando o número de genes diferencialmente expressos (GDEs) entre os grupos experimentais expostos ao imidaclopride após uma hora (A) e quatro horas (B) na dose letal (IG50) e na dose subletal (IGSUB) em comparação ao grupo controle. 43 Figura 2. Histograma representando o número de genes diferencialmente expressos (DEGs) regulados negativamente e positivamente para os grupos experimentais expostos à imidaclopride após um período de uma hora (A) e quatro horas (B), usando dose letal (IG50) e dose subletal (IGSUB) em comparação ao grupo controle 44 Figura 3 Análise de ontologia genética (GO) dos grupos experimentais após uma hora de exposição a uma dose letal de imidaclopride (IG50). Processos biológicos (BP) são indicados em vermelho. 44 Figura 4. Análise de ontologia genética (GO) dos grupos experimentais após uma hora de exposição a uma dose subletal de imidaclopride (IGSUB). Processos biológicos (BP) são indicados em vermelho, componentes celulares (CC) são indicados em verde e funções moleculares (MF) são indicadas em azul 45 Figura 5. Análise de ontologia genética (GO) da intersecção dos grupos experimentais após uma hora de exposição a doses letais e subletais de imidaclopride. Processos biológicos (BP) são indicados em vermelho. 46 X Figura 6. Análise de ontologia genética (GO) dos grupos experimentais após quatro horas de exposição a uma dose letal de imidaclopride (IG50). Processos biológicos (BP) são indicados por vermelho, componentes celulares (CC) indicados por verde e funções moleculares (MF) indicadas por azul. 47 Figura 7. Análise de ontologia genética (GO) dos grupos experimentais após quatro horas de exposição a uma dose subletal de imidaclopride (IGSUB). Funções moleculares (MF) são indicadas em vermelho. 48 Figura 8. Análise de ontologia genética (GO) da intersecção dos grupos experimentais após quatro horas de exposição a doses letais e subletais de imidaclopride. Funções moleculares (MF) são indicadas em vermelho. 48 Figura 9. Análise de cluster dos genes diferencialmente expressos após 1 e 4 horas de exposição às doses utilizadas (letal: IG50 e IGSUB: IGSUB) e grupo controle. * Log fold change (logFC) 49 CAPÍTULO 3 Figura 1. Diagrama de Venn representando o número de genes diferencialmente expressos (GDEs) entre os grupos experimentais expostos ao imidaclopride após uma hora (A) e quatro horas (B) na dose letal (LD50) e na dose subletal (LD50/100) em comparação ao grupo controle. 76 Figura 2. Histograma representando o número de genes diferencialmente expressos (DEGs) regulados negativamente e positivamente para os grupos experimentais expostos à imidaclopride após um período de uma hora (A) e quatro horas (B), usando dose letal (LD50) e dose subletal (LD50/100) em comparação ao grupo controle 76 Figura 3 Análise de ontologia genética (GO) dos grupos experimentais após uma hora de exposição a uma dose letal de imidaclopride (LD50). Componentes celulares (CC) são indicados em vermelho. 77 Figura 4. Análise de ontologia genética (GO) da intersecção dos grupos experimentais após uma hora de exposição a doses letais e subletais de 77 XI imidaclopride. Processos biológicos (BP) são indicados em vermelho e funções moleculares (MF) são indicadas em azul Figura 5. Análise de ontologia genética (GO) dos grupos experimentais após quatro horas de exposição a uma dose letal de imidaclopride (LD50). Vermelho indica processos biológicos (PB) e azul indica componentes celulares (CC). 78 Figura 6. Análise da Ontologia Gênica (GO) dos grupos experimentais foi realizada após quatro horas de exposição à dose subletal de imidaclopride (IG50). Vermelho indica processos biológicos (PB), verde indica componentes celulares (CC) e azul indica funções moleculares (FM). 79 Figura 7. Análise da Ontologia Gênica (GO) da intersecção dos grupos experimentais foi realizada após quatro horas de exposição às doses letais e subletais de imidaclopride. Vermelho indica processos biológicos (PB), verde indica componentes celulares (CC) e azul indica funções moleculares (FM). 80 Figura 8. Análise de cluster dos genes diferencialmente expressos após 1 e 4 horas de exposição às doses utilizadas (letal: LD50 e Subletal: LD50/100) e grupo controle. 80 XII LISTA DE TABELAS CAPÍTULO 4 Tabela 1. O impacto da polinização por abelhas Apis mellifera na qualidade e produtividade das colheitas em vários países. 103 Tabela 2. Genes diferencialmente expressos que podem ter impactos na atividade de polinização. 104 XIII Lista de abreviaturas e siglas A.Mellifera Apis mellifera DL50 Dose letal DL50/100 Dose subletal EROs Espécies reativas de oxigênio RNA Ácido ribonucleico mRNA Ácido ribonucleico mensageiro DNA Ácido desoxirribonucleico cDNA Ácido desoxirribonucleico complementar RNA-seq Sequenciamento de ácido ribonucleico SNP Polimorfismos de nucleotídeo único PCR Reação em cadeia da polimerase (Polymerase chain reaction) ORF Fase de leitura aberta NGS Sequenciamento de Nova Geração DEGs Genes diferencialmente expressos GO Ontologia genética BP Processos biológicos MF Funções moleculares CC Componentes celulares IG50 Dose letal por ingestão IGSUB Dose subletal por ingestão CONT50 Dose letal por contato CONTSUB Dose subletal por contato ACh Acetilcolina AChR Receptor de acetilcolina AChE Aceticolinesterase AChE2 Aceticolinesterase-2 OBPs Proteínas de ligação de odor CSPs Proteínas quimissensoriais MRJPs Proteínas da geleia real AMPs Peptídeos ligados à atividade antimicrobiana APDs Apiderminas CPs Proteínas cuticulares CAT Catalase SOD Superoxide dismutase XIV Sumário Capítulo I .................................................................................................................................... 15 Introdução .............................................................................................................................. 15 1. As abelhas Apis mellifera: histórico e aspectos gerais da biologia .................. 15 2. A importância das abelhas ...................................................................................... 20 3. Impacto dos agrotóxicos na sobrevivência das abelhas .................................... 22 4. Ferramentas para estudos genéticos em abelhas .............................................. 25 Objetivos ................................................................................................................................ 29 Referências ........................................................................................................................... 29 Capítulo II................................................................................................................................... 40 Capitulo III .................................................................................................................................. 54 Transcriptomic Analysis of the Head Reveals Molecular Mechanisms Underlying Topical Imidacloprid Effects on Apis mellifera Forager Bees ............................................ 55 Abstract................................................................................................................................. 56 Introduction ......................................................................................................................... 57 Materials and Methods ...................................................................................................... 58 Results .................................................................................................................................. 61 Discussion ........................................................................................................................... 63 Capitulo IV ................................................................................................................................. 81 Lethal and sublethal doses of imidacloprid can undermine agricultural pollination services carried out by Apis mellifera bees .......................................................................... 82 Abstract................................................................................................................................. 82 Introduction ......................................................................................................................... 83 Materials and methods...................................................................................................... 84 Conclusion ........................................................................................................................... 91 Acknowledgements ........................................................................................................... 92 Availability of data and materials ................................................................................... 92 References ........................................................................................................................... 92 Capítulo V ................................................................................................................................ 105 Implicações ........................................................................................................................ 106 XV Capítulo I 15 Introdução 1. As abelhas Apis mellifera: histórico e aspectos gerais da biologia Sugere-se que o gênero Apis originou-se na Ásia após a separação dos continentes. Antes que os colonizadores europeus trouxessem abelhas melíferas para o continente americano, a distribuição da abelha Apis ocorreu no restante do continente africano, Europeu, Oriente Médio e partes da Ásia. Estudos genéticos e com base em características morfológicas e nidificação, sugeriram dez espécies de abelhas que pertencem ao gênero Apis: as abelhas anãs (Apis florea e Apis andreniformis) e as abelhas gigantes (Apis dorsata, Apis laboriosa, Apis binghami e Apis nigrocincta) que constroem ninhos em locais abertos, compostos por um único ou poucos favos; e as abelhas medianas, que constroem ninhos formados por diversos favos dentro de cavidades (Apis mellifera, Apis cerana, Apis koschevnikovi e Apis nuluensis) (Garnery et al., 1992; Radloff et al., 2011; Wallberg et al., 2014; Gupta, 2014). A maioria das espécies de abelhas é solitária, ou vivem em grupos constituídos por fêmeas adultas que se envolvem independentemente na construção do ninho, defesa e cuidados com a prole, mas sem divisão reprodutiva do trabalho (Wcislo & Tierney, 2009). Um menor número de táxons, grupos familiares (um organismo feminino e sua prole feminina) evoluíram para sociedades eussociais, nas quais um grupo de fêmeas funcionalmente estéreis permanecem no ninho para ajudar sua rainha progenitora a criar a prole. As abelhas comunais e seus tipos sociais semelhantes provavelmente não representam um estágio de transição para a eussocialidade, mas são uma estratégia social diferente e ecologicamente relevante (Wcislo et al., 2017). A Apis mellifera é uma espécie eussocial, que vive em colônias com comportamento social bem desenvolvido, caracterizado pelo compartilhamento do ninho, cuidado cooperado das crias (indivíduos adultos cuidam das larvas em 16 desenvolvimento), hierarquia da reprodução e sobreposição de gerações (Danforth, 2007). Os humanos começaram a usufruir da cera e mel de colônias de abelhas há milhares de anos. Pinturas rupestres na África e Espanha, datadas de aproximadamente 6.000 a.C., representam a extração de mel realizada em colônias selvagens, de maneira extrativista, alocados em fendas de rochas (Crane, 1999; Wallberg et al., 2014). A atividade humana foi responsável por fomentar o transporte de colônias de abelhas ao redor do mundo, por realizar a seleção artificial para características desejáveis e o fluxo gênico, incluindo a expansão de linhagens híbridas de abelhas (Schneider et al., 2004). A alta capacidade de adaptação das abelhas permitiu sua sobrevivência em ambientes extremos, como na tundra, desertos e florestas tropicais (Seeley, 2009), apresentando notável capacidade morfológica e iniciou oficialmente em 1839, quando o padre Antonio Carneiro importou de Portugal 100 colônias de abelhas Apis mellifera Entre 1845 e 1880, imigrantes alemães e italianos trouxeram outras subespécies de Apis mellifera: a abelha negra da Alemanha, Apis mellifera mellifera e a italiana Apis mellifera lingustica, para regiões do Sul e Sudeste do país (Crane, 1999). Em 1956, o professor Warwick Estevan Kerr viajou para a África para selecionar rainhas. O projeto tinha objetivo de comparar as abelhas africanas com as europeias, visando estratégias para melhorar a produção e rusticidade, determinando então qual espécie seria mais apropriada para as condições brasileiras (Scott Schneider et al., 2004; Spivak et al., 2019). Apesar da maior produtividade, as abelhas africanas apresentavam pronunciado comportamento defensivo, característica indesejável para a apicultura comercial (Gonçalves, 2001). Sendo assim, o objetivo da estratégia de introdução das abelhas africanas no Brasil era realizar seleções genéticas para obtenção de abelhas que apresentassem a mansidão das abelhas europeias com a alta produtividade das abelhas africanas (Stort & Gonçalves, 1994). Após uma falha no manejo, enxames 26 colmeias escaparam para o ambiente e ocorreu então o cruzamento das abelhas africanas com as linhagens 92 Acknowledgements This work was supported by The São Paulo Research Foundation (FAPESP) (grant number 2020/10524-0) and Coordination of Superior Level Staff Improvement (CAPES) (grant number 88887.502119/2020-00). Availability of data and materials Data are available at NCBI with the following BioProject number: PRJNA1017469. 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