UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS CÂMPUS DE ARARAQUARA LUCIANA ARANTES SOARES ESTUDO DA ATIVIDADE ANTIDERMATOFITICA DE PROTOCATECUATOS CONTRA T. rubrum E T. interdigitale ARARAQUARA-SP 2011 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS CÂMPUS DE ARARAQUARA LUCIANA ARANTES SOARES ESTUDO DA ATIVIDADE ANTIDERMATOFITICA DE PROTOCATECUATOS CONTRA T. rubrum E T. interdigitale ORIENTADORA: Profa. Dra. Ana Marisa Fusco Almeida ARARAQUARA-SP 2011 Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Biocências e Biotecnologia aplicadas à Farmácia, da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara, Universidade Estadual Paulista – UNESP, como requesito para obtenção do título de Mestre em Biociências e Biotecnologia Aplicadas á Farmácia. Área de Concentração: Micologia. Ficha Catalográfica Elaborada Pelo Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação Faculdade de Ciências Farmacêuticas UNESP – Campus de Araraquara CAPES: 40300005 Soares, Luciana Arantes S676p Estudo da atividade antidermatofítica de Protocatecuatos contra T. rubrum e T. interdigitale. / Luciana Arantes Soares – Araraquara, 2011. 85 f. Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual Paulista. “Júlio de Mesquita Filho”. Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Programa de Pós Graduação em Biociências e Biotecnologia aplicadas à Farmácia Orientadora: Ana Marisa Fusco Almeida 1. Antifúngicos. 2. Ácido protocatecuico. 3. Trichophyton. 4. Sinergismo. 5. Proteômica. 6. Eletroforese bidimensional. I. Almeida, Ana Marisa Fusco, orient. II. Título. Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Micologia Clínica da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara/SP-UNESP. Recebeu apoio financeiro da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de nível Superior (CAPES). “O que também aprendestes, e recebestes, e ouvistes, e vistes em mim, isso praticai; e o Deus de paz será convosco. Ora, muito me regozijo no Senhor por terdes finalmente renovado o vosso cuidado para comigo; do qual na verdade andáveis lembrados, mas vos faltava oportunidade. Não digo isto por causa de necessidade, porque já aprendi a contentar-me com as circunstâncias em que me encontre. Sei passar falta, e sei também ter abundância; em toda maneira e em todas as coisas estou experimentado, tanto em ter fartura, como em passar fome; tanto em ter abundância, como em padecer necessidade. Posso todas as coisas naquele que me fortalece.” (Filipenses 4:9-13) Dê sempre o melhor e o melhor virá... Às vezes as pessoas são egocêntricas, ilógicas e insensatas... Perdoe-as assim mesmo. Se você é gentil, as pessoas podem acusá-lo de egoísta e interesseiro... Seja assim mesmo. Se você é um vencedor, terá alguns falsos amigos e alguns inimigos verdadeiros... Vença assim mesmo. O que você levou anos para construir, alguém pode destruir de uma hora para outra... Construa assim mesmo. Se você tem paz e é feliz, as pessoas podem sentir inveja... Seja feliz assim mesmo. O bem que você faz hoje, pode ser esquecido amanhã... Faça o bem assim mesmo. Dê ao mundo o melhor de você. Mas isso pode nunca ser o bastante... Dê o melhor de você assim mesmo E veja você que, no final das contas... É entre você e Deus... Nunca foi entre você e eles! (MADRE TEREZA DE CALCUTÁ) Dedico este trabalho Aos meus pais, Sebastião e Adélia, às minhas irmãs Fernanda e Maria, minha eterna gratidão e reconhecimento de que os méritos desta conquista a muito da presença de vocês. Agradecimentos Costumo dizer que minha formação acadêmica é construída com tudo que venho colocando na minha bagagem durante a vida. Entre vários professores que tive na graduação, uma parte importante do conteúdo desta bagagem vem do Professor Hindermburg Cruvinel que tive o prazer de conhecer, estudar e admirar durante a graduação. Obrigado pela força, pelo querer bem e por ter me incentivado a ingressar na pós-graduação. Ao Professor Dr. Pizzolito agradeço pelo incentivo, desde o momento que esta etapa era apenas uma vontade. Obrigado por ter me apresentado a professora Dra. Maria José que é um exemplo de pessoa a ser seguido. Agradeço a Professora Dra. Maria José por ter aberto as portas do seu laboratório e, sem me conhecer, ter ¨apostado¨ em mim e ter permitido a minha integração no seu grupo. Obrigado pelos seus ensinamentos transmitidos de sua experiência em pesquisa e ensino. À Professora Dra. Ana Marisa Fusco, por me aceitar como sua orientanda, pelos seus ensinamentos, pela sua correta orientação e por sua disponibilidade irrestrita. Por seus ensinamentos inspiradores, expresso a minha gratidão ao Professor Dr. Luís Octávio, por ter partilhado conhecimentos e sugestões na banca de qualificação, produção do artigo científico e por ter aceitado o convite para compor a banca de defesa. Meus agradecimentos dirigem-se ainda a Professora Dra. Ana Fachin da Unaerp, pelas sugestões na banca de qualificação e por ter disponibilizado linhagem de fungo utilizada neste trabalho. Ao Instituto de Química-UNESP e aos professores integrantes do Projeto Temático Biota/Bioprospecta- Fapesp, pela contribuição para o desenvolvimento desse estudo. Ao Professor Dr. Anderson da UFTM, por toda sua atenção, e por ter aceitado o convite para compor a bancada de avaliação deste trabalho. Aos queridos companheiros de bancada do Laboratório de Micologia (sem qualquer ordem) Liliana, Fernanda Sangalli, Fernanda Gullo, Janaína, Haroldo, Suélen, Caroline (Panta), Caroline (Tatto), Tatiane, Jaqueline, Danielle, Natália, Aline, Kayla, Claudete, Nayla, Julhiany, Thais, Warley, Patrícia (Laranja), Carol (de BH), Sr. Torres e Valter, por dividimos esforços na conquista de mais uma etapa de vida. À Rosângela técnica do Laboratório de Micologia, pela colaboração e organização do laboratório durante a realização da dissertação. Ao Marcelo Teruyuki, por ser uma pessoa que admiro muito. À Elaine técnica do Laboratório de Microbiologia, pelo carinho, pela enorme simpatia com que sempre me tratou. Aos colegas dos laboratórios de Imunologia, Citologia e Bioquímica, obrigada pela convivência e aprendizado diário. Ao pessoal da Pós-Graduação: Cláudia, Sônia, Laura, Ângela, Márcia e Joyce pelo apoio técnico para a realização deste trabalho. Ainda agradeço pessoas da segurança, compras, gestão, limpeza, biblioteca e manutenção informática pelo apoio e serviços prestados. A todos os professores do Programa de Biociências e biotecnologia, que de alguma forma contribuíram para o meu crescimento profissional. À FCF- UNESP e Capes pelo apoio financeiro e institucional para a realização deste trabalho. Às minhas amigas de república, segunda família (sem qualquer ordem) Larissa, Dayene, Tatiane, Jéssica e Renata obrigada pela companhia, por terem me fornecido apoio e encorajamento nos momentos bons e nos mais difíceis, por estarem sempre presentes com sua amizade. Agradeço à minha família em especial, aos meus pais, que sempre me orientaram e empurraram no melhor sentido. Todas as palavras do mundo são poucas para expressar o meu reconhecimento e gratidão por isso, digo simplesmente OBRIGADA... Obrigada por terem feito de mim o que sou. Expresso a minha profunda gratidão às minhas irmãs Fernanda e Maria. Agradeço o apoio demonstrado, os incentivos constantes e as críticas construtivas que me dirigiram (e continuaram a dirigir) ao longo da vida. À minha querida Tia Ana Palmira e ao meu querido Tio Augusto César, exemplos de força e fé... obrigada pelo apoio e pelo incentivo, e ainda por fazerem parte da minha vida compartilhando momentos importantes. Ao meu namorado Emerson e minha sogra Andreia, pelo apoio e carinho, agradeço a Deus por ter-me dado a graça de tê-los ao meu lado nesta jornada. A Deus, cuja força sempre senti ao meu lado. Todos os valores nos quais acredito, aprendi durante o convívio com muitas pessoas. Algumas delas apenas passaram pela minha vida e logo se foram, algumas outras foram tão importantes que sempre terão um espaço reservado em minhas boas lembranças, algumas outras seguem e seguirão comigo, mas todas serão únicas. Ninguém é capaz de realizar seus sonhos por si só... Ninguém é capaz de viver sozinho! Que Deus abençoe a todos! Acabo fazendo minhas as palavras as de pensador Sêneca: “Quem acolhe um benefício com gratidão, paga a primeira prestação da sua dívida” Obrigada a todos! ORAÇÃO DA SERENIDADE “CONCEDEI-ME SENHOR A SERENIDADE NECESSÁRIA PARA ACEITAR AS COISAS QUE NÃO POSSO MODIFICAR. CORAGEM PARA MODIFICAR AQUELAS QUE POSSO E SABEDORIA PARA DISTINGUIR UMAS DAS OUTRAS” (Reinhold Niebuhr) Sumário 1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................. 20 1.1. Produtos naturais e síntese de novas compostos ........................................................ 20 1.2. Atividades de Ésteres do Ácido Protocatecuico ........................................................ 21 1.3. Dermatofitoses ........................................................................................................... 22 1.3.1. Epidemiologia ........................................................................................................ 24 1.3.2. Tratamento ............................................................................................................. 26 1.3.3. Resistência .............................................................................................................. 27 1.4. Ensaios de sensibilidade ............................................................................................ 28 1.5. Sinergismo ................................................................................................................. 29 1.6. Proteômica ................................................................................................................. 30 2. JUSTIFICATIVA .......................................................................................................... 32 3. OBJETIVOS .................................................................................................................. 33 3.1. Objetivos gerais ......................................................................................................... 33 3.2. Objetivos Específicos ................................................................................................ 33 4. MATERIAIS E MÉTODOS .......................................................................................... 34 4.1. Obtenção dos compostos (1-16) ................................................................................ 34 4.1.1. Síntese dos protocatecuatos (2-15) ......................................................................... 34 4.1.2. Síntese do ácido 3,4 – diacetoxibenzóico (16) ....................................................... 34 4.1.3. Diluição dos compostos ......................................................................................... 35 4.2. Cultivo dos dermatófitos ............................................................................................ 35 4.3. Preparo do inóculo ..................................................................................................... 36 4.4. Avaliação da suscetibilidade de dermatófitos aos antifúngicos pela técnica de microdiluição ........................................................................................................................ 36 4.5. Concentração Fungicida Mínima (CFM) ................................................................... 37 4.6. Avaliações das Associações ....................................................................................... 38 4.6.1. Método do tabuleiro de xadrez ............................................................................... 38 4.6.2. Associação equimolar ............................................................................................ 40 4.7. Tratamento das células fúngicas e extração de proteínas .......................................... 40 4.7.1. Doseamento protéico .............................................................................................. 41 4.7.2. Análise do perfil protéico por eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) .............................................................................................. 41 4.7.3. Eletroforese Bidimensional .................................................................................... 41 4.7.3.1. Focalização Isoelétrica (Primeira dimensão) ...................................................... 41 4.7.3.2. Preparo da amostra ............................................................................................. 42 4.7.3.3. SDS-PAGE (Segunda dimensão) ....................................................................... 42 4.7.4. Revelação do gel pelo azul de Comassie ............................................................... 43 4.8. Teste de citotoxidade - MTT ..................................................................................... 43 5. RESULTADOS ............................................................................................................. 44 5.1. Avaliação da atividade antifúngica dos compostos sintéticos esterificados .............. 44 5.1.1. Avaliação da atividade antifúngica dos compostos sintéticos esterificados .......... 45 5.2. Avaliação da atividade combinatória de fluconazol e protocatecuatos ..................... 49 5.3. Avaliação da atividade combinatória de griseofulvina e protocatecuato de nonila ... 51 5.4. Avaliação da atividade antifúngica da combinação equimolar de miconazol e protocatecuatos ..................................................................................................................... 52 5.4.1. Avaliação da atividade antifúngica da combinação equimolar de miconazol e protocatecuatos ..................................................................................................................... 53 5.5. Avaliação da atividade antifúngica da combinação equimolar de nistatina e protocatecuatos ..................................................................................................................... 54 5.6. Resultados do ensaio de citotoxicidade dos protocatecuatos de pentila, hexila, heptila, octila e nonila ........................................................................................................... 56 5.7. Resultados da avaliação do proteoma total e diferencial de T. rubrum nas situações de contato com as substâncias antifúngicas .......................................................................... 57 5.7.1. Análise do perfil protéico por eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) dos extratos proteicos totais de T. rubrum .......................... 57 5.8. Análise do proteoma total de T. rubrum (Tm1) por eletroforese bidimensional dos géis controle (Tm1 sem contato com substância antifúngica) e Tm1 tratado com terbinafina 58 5.9. Análise do perfil diferencial do controle (Tm1 sem contato com substância antifúngica) e Tm1 tratado com terbinafina ......................................................................... 62 5.10. Análise protéica por eletroforese bidimensional controle (Tm1 sem contato com substância antifúngica) e Tm1 tratado com protocatecuato de nonila.................................. 64 5.11. Análise do perfil diferencial do gel controle e gel tratado com nonila .................. 68 6. DISCUSSÃO ................................................................................................................. 69 7. CONCLUSÕES ............................................................................................................. 74 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................... 75 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Tabela representativa contendo o cálculo do coeficiente de partição, a CIM e CFM dos protocatecuatos frente aos seis isolados 45 Tabela 2. Concentração inibitória mínina In vitro (CIM%) e concentração fungicida mínima (% CFM) do ácido protocatecuico e seus ésteres para Tr1, Tr2 e Tr3 46 Tabela 3. Concentração inibitória mínima In vitro (CIM%) e concentração fungicida mínima (CFM%) do ácido protocatecuico e seus ésteres para Tm1, Tm2 e Tm3. 46 Tabela 4. Atividade de fluconazol combinado com os protocatecuatos de pentila (7), hexila (8), heptila (9), octila (10) e nonila (11) contra cepas de dermatófitos (μg/mL) 50 Tabela 5. Valores de CIM da griseofulvina e do derivado nonila testados por uso simples e combinados contra os isolados de dermatófitos. O índice combinado fracionado (ICIF) das duas substâncias também está representado na tabela 51 Tabela 6 - Atividade in vitro da combinação de miconazol com protocatecuatos de pentila (PEN), hexila (HEX), heptila (HEP), nonila (NON), dodecila (DOD), tetradecila (TET), hexadecila (HEX) e octadecila (OCT) contra três linhagens de dermatófitos (μg/ml) 53 Tabela 7. Atividade in vitro de nistatina com protocatecuato de pentila (PENT), Hexila (HEX), heptila (HEP), nonila (NON), dodecila (DOD), tetradecila (TET), hexadecila (HEX) e octadecila (OCT) contra três linhagens de dermatófitos (μg/mL) 55 Tabela 8. Avaliação da atividade citotóxica em macrófagos alveolares e índice de seletividade a partir da relação entre o CI50 e CFM 56 Tabela 9. Proteínas demonstradas na figura 7 com seus respectivos pontos isoelétricos (pI), massas moleculares (MM) e alterações observadas com o tratamento com terbinafina 62 Tabela 10. Proteínas demonstradas na figura 10 com seus respectivos pontos isoelétricos (pI), massas moleculares (MM) e alterações observadas com o tratamento com nonila 68 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Estruturas químicas do ácido protocatecuico (1) e seus ésteres (2-16) 22 Figura 2. Exemplo de esquema de combinação de compostos na placa de microdiluição de 96 poços. Teste combinatório com griseofulvina (em negrito) e protocatecuato de nonila (em itálico). C-: Controle Negativo; C+: Controle Positivo. * CIM e CIM concentração inibitória mínima de griseofulvina e do protocatecuato de nonila, respectivamente 39 Figura 3. Valores de CIM e CFM dos protocatecuatos contra duas espécies de Trichophyton 48 Figura 4. Componentes totais de Tr1 (1), Tm3 (2), Tr1 sem tratamento (3) e Tr1 tratado com nonila 10x (4) 57 Figura 5. Eletroforese bidimensional dos componentes protéicos totais de T. rubrum na faixa de pH de 3 a 10 sem tratamento. Gel corado pelo azul de Comassie 59 Figura 6. Eletroforese bidimensional dos componentes protéicos totais de T. rubrum tratado com terbinafina 50 x acima da CIM. Gel corado pelo azul de Coomassie 60 Figura 7. Eletroforese bidimensional do extrato protéico total de T. rubrum isolado clínico na faixa de pH de 3 a 10, comparada com T. rubrum tratado com terbinafina 50 x . Em A, B, C, D, E e F tem-se visão ampliada das proteínas. 61 Figura 8. Eletroforese bidimensional dos componentes protéicos totais de T. rubrum na faixa de pH de 3 a 10 sem tratamento. Gel corado pelo azul de Coomasie. 65 Figura 9. Eletroforese bidimensional dos componentes protéicos totais de T. rubrum tratado com nonila 10 x acima da CIM. Gel corado pelo azul de Coomassie 66 Figura 10. Eletroforese bidimensional do extrato protéico total de T. rubrum isolado clínico na faixa de pH de 3 a 10, comparada com T. rubrum tratado com protocatecuato de nonila 10 x . Em A, B, C e D têm-se visão ampliada das proteínas 67 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS °C - Graus Celsius ABC – Transportador que codifica para um gene de resistência em fungos. ASD - Ágar Sabouraud Dextrose ATCC - American Type Culture Collection CFM - Concentração fungicida mínima CI50 - Concentração Inibitória para 50% de células CIF - Concentração inibitória fracionada CIM - Concentração inibitória mínima CLSI - Clinical and Laboratory Standards Institute DCC - N, N'- dicyclohexylcarbodiimide DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium DMSO - Dimetilsufoxido DTT - dittiotreitol ELISA - Enzyme Linked Immunosorbent Assay Fase log - Fase logarítimica FLU - fluconazol ICIF - Índice de concentração inibitória fracionada IS – Índice de Seletividade KDa – Kilodalton log P - logaritmo do coeficiente de partição em um sistema bifásico M - molar MCZ - miconazol MeOH – metanol mg - miligrama mL - mililitro MM - massa molecular mM - milimolar MOPS - Ácido 3- (N-morfino) propanosulfônico MTT - 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5- brometo de difeniltetrazólio NCBI – Centro Nacional de Informações Biotecnológicas NIS - nistatina nm - nanômetro OMS - Organização Mundial da Saúde p/v - peso/volume PAF - Proteina antifúngica de Penicillium chrysogenum PBS - Solução Salina Tamponada com Fosfato pH - potencial hidrogeniônico PI - Ponto isoelétrico rpm - rotações por minuto SDS – PAGE – Eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS SFB - Soro Fetal Bovino TCA - ácido tricloroacético TEMED - Tetra metil etileno diamino Tm1 - Trichophyton interdigitale isolado clínico 1 Tm2 - Trichophyton interdigitale isolado clínico 2 Tm3 - Trichophyton interdigitale ATCC 40131 Tr1 - Trichophyton rubrum isolado clínico 1 Tr2 - Trichophyton rubrum isolado clínico 2 Tr3 - Trichophyton rubrum MYA 3108 Tris - 2-amino-2-hidroximetilpropano TruMDR1- Gene de resistência que codifica um transportador ABC, em T. rubrum. TruMDR2- Gene de resistência que codifica um transportador ABC, em T. rubrum. UFC - Unidades formadoras de colônia V – Volts YEPD - Yeast Extract Peptone Dextrose μg - micrograma μL - microlitro μM - micromolar 18 Resumo São evidentes a necessidade de novas substâncias antifúngicas e a grande importância dos produtos naturais no desenvolvimento de novas ferramentas terapêuticas. Assim, neste estudo avaliou-se a atividade antifúngica dos derivados sintéticos esterificados do ácido protocatecuico. Todos os isolados apresentaram bons resultados ao teste de suscetibilidade aos derivados sintéticos do ácido protocatecuico demonstrando que 62,5% foram ativos em relação para dois isolados de T. rubrum (Tr1 e Tr2), T. rubrum MYA 3108 (Tr3) e isolado clínico T. interdigitale (Tm1) e 68,7%, para isolado clínico T. interdigitale (Tm2) e T. interdigitale ATCC 40131 (Tm3) dos 16 compostos testados. Como referência para avaliação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) foram considerados todos os resultados com valores ≤ 62,5 ug\mL. A combinação fluconazol mais protocatecuatos de pentila, hexila, heptila, octila e nonila foi aditivo para isolados clínicos Tr1, Tm1 e Tm3, exceto a combinação com fluconazol mais protocatecuato de heptila, que revelou um efeito sinérgico contra Tm3. A griseofulvina em combinação com protocatecuato de nonila mostrou atividade sinérgica em duas linhagens de dermatófitos, atividade aditiva para quatro linhagens. Oito derivados do ácido protocatecuico foram associados quimicamente com o miconazol sendo encontradas interações sinérgicas e aditivas. Foi testada a associação entre protocatecuatos e o antifúngico nistatina, resultando interações antagônicas, demonstrando assim que o polieno não possue ação antifúngica quando combinada aos ésteres. Resultados dos testes de citotoxicidade pelo MTT realizados em células de macrófagos alveolares de camundongos (AMJ2-C11) indicaram que se trata de compostos de baixa toxicidade. Foi analisado o proteoma total do isolado clínico de T. rubrum antes e após o contato com terbinafina e os resultados revelaram modificações na expressão de 26 proteínas. A eletroforese bidimensional também foi realizada com os componentes protéicos de T. rubrum tratados com o protocatecuato de nonila, revelando alterações na expressão de oito proteínas. De acordo com informações técnicas levantadas, os ésteres do ácido protocatecuico, bem como suas associações com fármacos podem constituir uma fonte promissora de protótipos para a busca de novos agentes terapêuticos. Palavras-chave: antifúngicos, ácido protocatecuico, protocatecuatos, Trichophyton, sinergismo, proteômica, eletroforese bidimensional. 19 Abstract There is a clear need for new antifungal compounds, and the importance of natural products in the development of novel therapeutic tools. In this study, it was evaluated the antifungal activity of protocatechuic acid esters. All of the fungus isolated showed good results when testing susceptibility to synthetic derivatives of protocatechuic acid, showing that 62.5% were active against two strains of T. rubrum (Tr1 e Tr2), T. rubrum MYA 3108 (Tr3) and clinical isolate T.interdigitale (Tm1) and 68.7% for clinical isolate of T. interdigitale (Tm2) and T. interdigitale ATCC 40131 (Tm3) of the 16 compounds tested. Reference values of Minimum Inhibitory Concentration (MIC) were considered ≤ 62.5 ug/ mL. The combination of fluconazole plus pentyl, hexyl, heptyl, octyl and nonyl protocatechuates was additive to clinical isolates Tr1, Tm1 and Tm3, except the combination fluconazole plus heptyl protocatechuate, which showed a synergistic effect on Tm3. Griseofulvin in combination with nonyl protocatechuate exhibited synergistic activity two towards dermatophyte strains, additive interaction for four strains. When eight protocatechuic acid derivatives were chemically associated with miconazole, were observed synergistic and additive effects. We tested the association between protocatechuates and nystatin, resulting in antagonistic interactions. Thus it demonstrated that have not a polyene antifungal best when combined with protocatechuic acid esters. Results of cytotoxicity tests by MTT assay using alveolar macrophages (AMJ2-C11) cells indicated that esters showed low toxicity. It was analyzed the proteome of the total clinical isolate of T. rubrum before and after contact with the terbinafine and the results indicated changes in the expression of 26 proteins. The two-dimensional electrophoresis was also performed with the protein components of T. rubrum treated with nonyl protocatechuate, suggesting changes in the expression of 8 proteins. According to data found trhougout laboratoty tests, protocatechuic acid esters, as well as their associations with drugs constitute a promising source of prototypes for the search for novel therapeutic agents. Keywords: antifungal, protocatechuic acid, protocatechuate, Trichophyton, synergism, proteomics, two- dimensional electrophoresis. 20 1. INTRODUÇÃO 1.1. Produtos naturais e síntese de novas compostos Produtos naturais têm sido a fonte mais produtiva de novos fármacos. Várias razões foram apresentadas para explicar essa pesquisa; entre elas está sua diversidade química (Harvey, 2007). Em relação à busca de novos fármacos, um antifúngico ideal deveria ter atividade fungicida de amplo espectro e não causar toxicidade ao hospedeiro (Carrillo-Muñoz et al., 2006). As plantas têm sido usadas na medicina por longa data, sendo extensivamente empregadas na medicina popular por representarem uma alternativa econômica de fácil obtenção e aplicabilidade para diversas patologias (Rojas et al., 2006). São uma fonte importante de produtos naturais biologicamente ativos, muitos dos quais se apresentam como modelos para a síntese de um grande número de fármacos (Simões et al., 2001). Atenção especial tem sido direcionada para derivados naturais com base no conhecimento da produção de compostos antifúngicos pela natureza (Wojtaszek, 1997; Gurgel et al., 2005). Os extratos obtidos de plantas tais como Euphorbia prostata, Salvia texana, Colubrina greggii, Clematis drummondii, dentre outras, têm demonstrado resultados promissores que estimulam a busca de novas fontes vegetais com potencial antifúngico (Alanís-Garza et al., 2007; Matasyoh; Mayo; Ngure, 2008). É evidente a grande importância dos produtos naturais no desenvolvimento de novas ferramentas terapêuticas. Nesse quesito, as plantas medicinais e seus metabólitos derivados são importantes para pesquisa farmacológica e o desenvolvimento de fármacos. Isto tanto porque podem ser utilizadas diretamente como agentes terapêuticos, como também de fonte de matéria-prima para síntese ou ainda podem servir de protótipos para novos modelos farmacologicamente ativos (Brasil, Ministério da Saúde, 2006). Englobando todas as novas entidades químicas aprovadas como fármacos chega-se a um total aproximado de 1.184 das substâncias pesquisadas entre 1981-2006; 5% correspondem a produtos naturais, 47% correspondem a derivados semi-sintéticos de produtos naturais, mímicos de produtos naturais e sintetizados com grupos farmacofóricos baseados em produtos naturais, 18% são biológicos e vacinas e 30% são totalmente sintéticos 21 (Newman; Cragg, 2007). A originalidade de muitas estruturas de produtos naturais atrai a atenção para seu uso como ponto de partida para semi-síntese e síntese total (Butler, 2005). Modificações de produtos naturais por meio da semi-síntese levaram a produtos obtidos por combinações de diversos tipos de modificações. O antibacteriano meticilina é obtido através de modificações semi-síntéticas da penicilina G, gerando uma estrutura com maior estabilidade química. A telitromicina é um antibacteriano com modificações semi- sintéticas da eritromicina (Nussbaum et al., 2006). Derivados semi-sintéticos da vancomicina e teicoplanina contendo substituintes hidrofóbicos na subunidade do carboidrato mostraram-se ativos contra linhagens bacterianas resistentes à vancomicina. O desenvolvimento de quimioterápicos de origem sintética e o descobrimento de novos antibióticos potentes isolados de fontes naturais representam contribuições inestimáveis na luta contra resistência bacteriana (Nussbaum et al., 2006). A maioria dos fármacos antifúngicos tem origem nos produtos naturais. As equinocandinas atuam inibindo a biossíntese de componentes da parede celular dos fungos. Os antifúngicos caspofungina, micafungina e anidalafungina têm sido bastante úteis no tratamento de infecções fúngicas apresentando menores efeitos adversos que a anfotericina. Caspofungina e micafungina são derivados semi-sintéticos disponíveis no mercado internacional (Harvey, 2008), porém, ainda não totalmente disponíveis no mercado brasileiro. 1.2. Atividades de Ésteres do Ácido Protocatecuico O ácido protocatecuico (ácido 3,4- dihidroxibenzóico, figura 1), é um derivado do ácido benzóico encontrado em frutas, nozes e vegetais, tais como azeitonas e arroz (Soares, 2002). A presença dos compostos fenólicos tem sido muito estudada por estes apresentarem atividades farmacológicas e também por inibirem a oxidação lipídica e a proliferação de fungos. Os ácidos fenólicos são algumas das substâncias que constituem o grupo dos compostos fenólicos. Caracterizam-se por terem um anel benzênico, um grupamento carboxílico e um ou mais grupamentos de hidroxila e/ou metoxila na estrutura (Soares, 2002). Estudos de laboratório com animais demonstraram que o ácido protocatecuico é um eficaz anticarginogênico com propriedades antioxidantes, protege contra o estresse oxidativo, exerce 22 efeitos preventivos nas doenças cardiovasculares que estão associados aos radicais livres (Reis, 2010). O O HO HO R 1 Ácido protocatecuico R = H 2 Protocatecuato de metila R = CH3 3 Protocatecuato de etila R = CH2CH3 4 Protocatecuato de propila R = (CH2)2CH3 5 Protoctecuato de butila R = (CH2)3CH3 6 Protocatecuato de pentila R = (CH2)4CH3 7 Protocatecuato de hexila R = (CH2)5CH3 8 Protocatecuato de heptila R = (CH2)6CH3 9 Protocatecuato de octila R = (CH2)7CH3 10 Protocatecuto de nonila R = (CH2)8CH3 11 Protocatecuato de decila R = (CH2)9CH3 12 Protocatecuato de dodecila R = (CH2)11CH3 13 Protocatecuato de tetradecila R = (CH2)13CH3 14 Protocatecuato de hexadecila R = (CH2)15CH3 15 Protocatecuato de octadecila R = (CH2)17CH3 OH O O O O O 16 Ácido 3,4 - diacetoxibenzóico ― Figura 1. Estruturas químicas do ácido protocatecuico (1) e seus ésteres (2-16). 1.3. Dermatofitoses Milhões de seres humanos e animais sofrem de infecções superficiais causadas por um grupo de fungos filamentosos altamente especializados, os dermatófitos, que infectam exclusivamente estruturas queratinizadas (Burmester et al., 2011). Os dermatófitos são um grupo de fungos que, em vida parasitária, vivem à custa de queratina da pele, unhas e pêlos. Enquadram-se os gêneros Trichophyton, Microsporum e Epidermophyton que se caracterizam 23 de acordo com a formação e morfologia dos seus conídios (Cabañes, 2000; White et al., 2008; Peres et al., 2010). Embora as infecções dos dermatófitos sejam restritas as superfícies da epiderme, estes podem ser invasivos e provocar infecções graves e disseminadas em pacientes imunodeprimidos, com desenvolvimento de granulomas (Peres et al., 2010). Nesses casos, a doença deixa de ser superficial e atinge camadas mais profundas da derme causando lesões granulomatosas. Em geral, os dermatófitos vivem confinados no extrato córneo da epiderme e apêndices cutâneos, principalmente nas áreas úmidas do corpo a exemplo das regiões entre os dedos do pé, virilhas e abaixo do seios (Chuang et al., 2007). Esses fungos produzem queratinases que são enzimas proteolíticas capazes de hidrolisar queratina, principal proteína constituinte do cabelo, unhas e pele. A infecção pode ter sintomas leves a graves dependendo da resposta imunológica do hospedeiro (Akcaglar et al., 2011; Weeks J. et al., 2003). A queratina, o colágeno e a elastina constituem 25% da massa dos mamíferos. A enzima necessária para hidrolisá-los é a queratinase produzida pelos dermatófitos em tecidos infectados e, por isso, está inerente à virulência dos dermatófitos (Simpanya, 2000). As queratinazes e outras enzimas são liberados no processo da patogênese e os queratinócitos são ativados, desencadeando uma resposta inflamatória mediada por citocinas e receptores, compreendendo a imunidade inata, bem como adquirida, incluindo neutrófilos, macrófagos, anticorpos e células T (Brasch, 2009). A colonização por um dermatófito e a sua capacidade em causar uma infecção no hospedeiro dependem de vários fatores. Dentre os quais se destacam o fato de não serem responsivos aos mecanismos de proteção do hospedeiro que incluem a secura, o pH ligeiramente ácido e a contínua regeneração da pele, o efeito fungicida dos ácidos graxos, o estado da camada queratinizada e de outros fatores como a competição com a microbiota normal da epiderme (Erbagci, 2004). A instalação da infecção inicia-se pela inoculação do artrósporo depositado sobre a pele, favorecido por lesão cutânea ou escoriação pré – existente (Sidrim & Rocha, 2004) e notável habilidade enzimática para degradar a queratina (Abdel-Rahman, 2000; Simpanya, 2000; Macedo et al., 2005). Além disso, também pode infectar várias espécies animais, determinando de modo geral, lesões secas, arredondadas e comumente não pruriginosas que se distribuem focalmente na superfície cutânea sem causar transtornos gerais aos animais afetados (Pereira & Meireles, 2001). Os animais servem como reservatórios de dermatófitos e suas infecções têm considerável importância zoonótica (Cabañes, 2000). 24 Os dermatófitos não fazem parte da flora normal dos humanos nem são microrganismos oportunistas, mas verdadeiros patógenos que infectam os tecidos queratinizados, unhas ou cabelo de indivíduos saudáveis (Baeza et al., 2007; Monod, 2008). Os dermatófitos em seu estado saprofítico digerem a queratina in vitro, utilizando assim como substrato. Possuem a capacidade de invadir tecidos vivos e provocar determinadas lesões, cuja severidade se relaciona, em parte, à reação do hospedeiro ao organismo invasor, e aos fatores tais como: virulência da espécie ou da estirpe infectante; reação do hospedeiro aos produtos metabólicos produzidos pelo fungo; local anatômico da infecção e fatores locais ambientais (Simpanya, 2000). Espécies de dermatófitos são caracterizadas com base em seu nicho ecológico: geofílicos, zoofílicos e antropofílicos. As espécies geofílicas são encontradas no solo e raramente produzem infecções em seres humanos. As espécies zoofílicas colonizam animais e podem ser transmitidas ao ser humano, sendo responsáveis por cerca de 30% das dermatofitoses humanas e geralmente provocam inflamação aguda. Já as espécies antropofílicas representam cerca de 70% das infecções nesses hospedeiros causando infecções crônicas de progressão lenta, sugerindo que o fungo tenha se adaptado ao hospedeiro humano (White et al., 2008; Peres et al., 2010). O aspecto clínico varia de acordo com o local da lesão e com o agente etiológico envolvido. Frequentemente produzem lesões circinadas descamativas, eritematosas, às vezes vesiculosas, pustulosas, podendo ou não apresentar hiperqueratose. Nas unhas, o acometimento pode ser subungueal invasivo ou localizado. No couro cabeludo são observadas as formas tonsurantes, com alopécia que regride após a cura e a fávica, crostosa e pustulosa, que acomete o folículo piloso causando alopécia definitiva (Weitzman & Summerbell, 1995). 1.3.1. Epidemiologia A distribuição dos dermatófitos varia em diferentes países e depende de vários fatores como estilo de vida, tipo da população, condições sócio – econômicas, migração de pessoas, idade, presença de animais domésticos e condições climáticas (Dolenc-Voljc, 2005). Elas podem alcançar altos níveis endêmicos e necessitar de intervenções públicas específicas 25 (Seebacher; Bouchara; Mignon, 2008). A Academia Americana de Dermatologia estima que uma parcela de 10-20 % da população é afetada por dermatófitos (Pfaller; Sutton, 2006). Epidemiologicamente, as espécies T. rubrum e T. interdigitale se destacam como os principais agentes etiológicos de dermatofitoses em humanos. No Brasil trabalhos de inúmeros pesquisadores, apontam registros do predomínio dessas espécies como um dos principais agentes causadores de dermatofitoses em humanos, nas mais diversas manifestações clínicas (Rezende et al., 2008). Em um trabalho desenvolvido por Simonnet e colaboradores, na Guiana Francesa, com 726 pacientes, foi verificado que (28,2 %) apresentaram diagnóstico presuntivo de onicomicoses (infecções das unhas), (27,8 %) Tinea capitis, (22,0 %) micoses superficiais cutâneas dos pés, e de outras áreas do corpo (21,9 %). Trichophyton rubrum foi o dermatófito mais comum recuperado de casos de onicomicose (67,4 %), Tinea pedis (70,6 %) e Tinea corporis (52,4 %). A prevalência do T. rubrum e ocorrência de onicomicoses e micoses dos pés, na Guiana Francesa são similares aos resultados reportados da Europa, enquanto que a frequência de tinea do couro cabeludo e da importância de T. tonsurans em tais infecções são semelhantes aos da situação nas Américas ( Simonnet et al., 2011). No Brasil, o Sul e Sudeste revelaram uma alta incidência de infecções causadas por dermatófito T. rubrum, seguido por M. canis e T. interdigitale, enquanto no Nordeste, T. tonsurans, T. rubrum e M. canis apresentam maior predominância (Purim; Freitas & Leite, 2009). Em um estudo na região norte do Rio Grande do Sul, constituído por 100 indivíduos, verificou-se que entre os atletas, a frequência das onicomicoses e tinea pedis foi de 32% e, para o grupo de não atletas, foi de 20%. Os patógenos identificados foram dermatófitos (84,8 %), leveduras (15,2 %) e o organismo mais comumente identificado foi T. rubrum, seguido pelo T. interdigitale (Sabadin et al., 2011). Existe uma predominância de T. rubrum como principal agente etiológico em várias regiões geográficas do mundo como Japão, Estados Unidos, México e em regiões do Brasil (Welsh et al., 2006). No entanto, alguns estudos mostram o aparecimento de outros dermatófitos como principais agentes causadores de infecção; entre eles o T. interdigitale e M. canis (Dolenc-Voljc, 2005). O T. rubrum pode produzir praticamente todos os quadros clínicos de dermatofitose e tem como características principais a tendência para cronicidade e a resistência aos tratamentos convencionais (Siqueira et al., 2006). A frequência desse agente aumenta com o processo de urbanização levando à sua predominância como causador da dermatofitose em 26 grandes centros urbanos (Ruiz & Zaitz, 2001). O reconhecimento dos dermatófitos ao nível de espécie e as informações sobre a sua ecologia têm um papel importante nos estudos epidemiológicos e na saúde pública; especialmente para espécies que produzem surtos familiares ou institucionais (Sugita et al., 2006). 1.3.2. Tratamento Para tratamento de infecções fúngicas de pele, os medicamentos tópicos são apropriados apenas para infecções iniciais ou leves, especialmente causadas por T. rubrum, principal causador da tinea pedis. Os principais fármacos administrados topicamente são ciclopirox e amorolfina. Ciclopirox atua na inibição da absorção de potássio, fosfato e aminoácidos enquanto a amorolfina atua na inibição do ergosterol da membrana celular do fungo (Shirwaikar et al., 2008). Nas onicomicoses e infecções causadas por dermatófitos zoofílicos, que levam ao desenvolvimento principalmente de tinea capitis e corporis, a terapia usual é sistêmica (Tosti et al., 1998; White et al., 2008). Os principais fármacos utilizados no tratamento da onicomicose são terbinafina, itraconazol e griseofulvina (Garmendia et al., 2008). A terbinafina é um antifúngico pertencente à classe das alilaminas, que age sobre a enzima esqualeno-epoxidase bloqueando a biossíntese do ergosterol da membrana celular dos fungos. É o fármaco mais utilizado para o tratamento das onicomicoses, pois apresenta alta eficácia e atividade fungicida. A terapia combinada (oral e tópica) melhora os resultados do tratamento (Garmendia et al., 2008) A griseofulvina inibe o crescimento dos dermatófitos de todos os gêneros. É utilizada exclusivamente para controlar o desenvolvimento da infecção dos tecidos queratinizados apresentando, apenas, ação fungistática nas doses usuais. O mecanismo de ação deste fármaco está associado à interferência na polimerização dos microtúbulos causando anomalias na divisão celular por interferir na formação do fuso acromático. Atua também no crescimento anormal, provavelmente pela alteração do transporte intracelular associado aos microtúbulos (Odds, 2003). Na terapia antifúngica há dois grupos de azóis que são utilizados na clínica: os imidazóis (cetoconazol, miconazol, clotrimazol e econazol) e os triazóis (fluconazol, itraconazol, voriconazol e posaconazol). O uso dos imidazóis é restrito ao tratamento de 27 micoses superficiais. Na medicina dermatológica, para o tratamento de infecções crônicas ou severas, os fármacos como terbinafina, itraconazol e fluconazol são mais utilizados (Fernández-Torres et al., 2001, Fernández-Torres et al., 2003a). 1.3.3. Resistência Os relatos de recidivas estão geralmente associados à interrupção da terapia antifúngica e à resistência clínica à droga terbinafina que já vem sendo descrita na literatura. Mukherjee e colaboradores descreveram um caso de resistência clínica a terbinafina (Mukherjee et al., 2003). O isolado foi retirado de um paciente com onicomicose cujo tratamento oral com terbinafina não foi eficaz. O quadro exibiu, ainda, resistência cruzada a vários outros fármacos, incluindo naftina, butenafina, tonoftato e tolciclato, sugerindo mecanismo de resistência alvo-específica. O relato quanto à resistência à terbinafina já foi discutido e este se refere à mutação no gene esqualeno epoxidase levando à substituição do aminoácido L393F (Osborne et al., 2005). A resistência à terbinafina em espécies mutantes de Aspergillus spp, também foi referida, e neste indicou que houve mutação no gene que codifica a enzina esqualeno epoxidase (ErgA), resultando em alta resistência a esse antifúngico (Rocha et al., 2006; Espinel-Ingroff., 2008). Em estudos referentes aos mecanismos de resistência á terbinafina com o fungo T. rubrum, dois transportadores do tipo ABC, TruMDR1 e TruMDR2, mostraram-se importantes no processo de resistência, na secreção de enzimas e na patogenicidade desse dermatófito (Fachin et al ., 2006; Martinez-Rossi, 2008; Maranhão et al., 2009). A resistência clínica à griseofulvina ou recidivas pós-terapias são comuns nas dermatofitoses. A resistência in vitro dos dermatófitos à griseofulvina é pouco relatada. Para T. rubrum, em estudo realizado por Zomorodian e colaboradores, foi verificado uma diminuição da expressão do gene que codifica a beta-tubulina, sob condições de pressão desta droga e a diminuição foi dependente da concentração. Esta informação contribuiu para um melhor conhecimento do mecanismo de ação e, consequentemente, pode auxiliar na utilização mais racional deste fármaco (Zomorodian et al., 2007). 28 1.4. Ensaios de sensibilidade O teste de sensibilidade às drogas antifúngicas tem importante valor, principalmente do ponto de vista clínico, pois se pode prever êxito na terapêutica utilizada (Galgiani et al., 1992). Os testes antifúngicos devem identificar resistência in vitro entre uma população de fungos suscetíveis ou deve detectar o desenvolvimento de resistência durante a terapia (Favel et al.,1995). Os protocolos desenvolvidos pela Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI; antigamente o National Comittee for Clinical Laboratory Standards [NCCLS]) preconizam métodos de ensaio reprodutíveis da atividade de antifúngicos contra leveduras (M27-A3, M27-S3, M44-P e M44-A-S2 documentos) e fungos filamentosos (M38-A2) (Canton et al., 2009). As metodologias para tais avaliações são variáveis, sendo realizadas a difusão em ágar e a diluição em ágar e caldo (Stoppa et al., 2009). Esses métodos têm por princípio vários parâmetros como tamanho do inóculo, concentrações definidas de agentes antifúngicos e diferentes condições que permitam o crescimento do microrganismo sem que haja interferência da atuação da droga (Colombo et al.,1995). Muitos estudos no Brasil e no mundo têm sido publicados com objetivo de validar as metodologias atualmente empregadas para determinação de sensibilidade às drogas antifúngicas. Os trabalhos têm auxiliado o sucesso da terapêutica medicamentosa, pois estabelece uma relação entre a concentração inbitória mínima e à susceptibilidade do fungo à droga (Pappalardo & Melhem, 2003). 29 1.5. Sinergismo Um arsenal de medicamentos fitoterápicos resulta de combinações de extratos, que podem assumir diferentes efeitos, incluindo aditivos, sinérgicos e antagônicos (Adams et al., 2006). Como alternativa ao tratamento de doenças fúngicas, a exemplo do que ocorre nas micoses invasivas, uma opção que vem sendo reportada é a terapia combinada. Informações sobre a eficácia das combinações são esparsas e consistem basicamente de resultados de estudos in vitro e em modelos animais experimentais. Entretanto essa terapia pode ser uma alternativa à monoterapia para pacientes com infecções invasivas que são difíceis de tratar. Podem ser exemplos as originadas por espécies multi – resistentes e aquelas que não respondem ao tratamento convencional (Cuenca-Estrella, 2004). A combinação sinérgica de fármacos antifúngicos com substâncias de origem vegetal para aperfeiçoar seu desempenho biológico tem sido estudada com o intuito de viabilizar o uso de fármacos que apresentam considerável toxicidade (Han, 2007). Duas drogas que produzem efeitos semelhantes podem produzir efeitos exagerados ou diminuídos quando usados simultaneamente. A avaliação quantitativa é necessária para equacionar casos de simples ação aditiva. Esta distinção é baseada na definição clássica de aditividade farmacológica significando que cada componente contribui para o efeito de acordo com sua própria potência. Assim, as relações de potência dos agentes, não necessariamente constantes em todos os efeitos níveis, permitem um cálculo utilizando pares para determinar a dose equivalente a um ou outro agente e os efeitos usando o equivalente na relação dose-resposta do composto de referência (Tallarida, 2001). Desta forma, a atividade de extratos antifúngicos vegetais pode ser melhorada por meio da combinação entre diferentes substâncias de diversas plantas. Através dos estudos de sinergismo é possível validar e confirmar presença de interações demonstradas entre extratos de diferentes plantas e também entre componentes de um mesmo extrato (Biavatti, 2009). Em uma investigação realizada por Yamada e colaboradores verificou-se que a monoterapia com voriconazol ou anfotericina B lipossomal, ambos indicados para o tratamento de aspergilose invasiva, apresentava baixa resposta durante o tratamento da doença (Yamada et al.,2010). Quando estas foram associadas à micafungina, ambas tiveram um efeito potencializado contra a infecção. A associação de drogas também foi estudada em isolados de casos de infecções disseminadas causadas por T. asahii, sendo avaliada a atividade 30 antifúngica de voriconazol, caspofungina e anfotericina B isoladamente e em combinação. Melhores resultados foram obtidos com a associação de caspofungina e anfotericina B, sugerindo que o tratamento com fármacos combinadas pode ser uma alternativa terapeuticamente útil (Li et al., 2010). 1.6. Proteômica Os mecanismos de ação de muitos compostos com atividade antifúngica de fontes vegetais ainda não foram elucidados. Uma estratégia seria a utilização de sistemas proteômicos para prospecção de novos alvos moleculares (Sleno & Emili, 2008). O termo proteoma foi introduzido no início dos anos 90 por Wilkins para indicar a proteína total e complementar expressa pelo genoma de uma célula, tecido ou organismo (Wilkins & Pasquali et al., 1996; Wilkins & Sanchez et al., 1996). O proteoma celular é muito complexo, formado por um grande número de proteínas que variam conforme o contexto, momento ou evento metabólico ao qual está submetido o organismo (Wilkins, et al, 1995). As análises proteômicas tornaram-se muito importantes no campo funcional do genoma, principalmente devido ao conhecimento adquirido dos vários genomas sequenciados. Entretanto estas informações não foram suficientes para explicar os eventos biológicos e encontrar alvos para novos fármacos (Anderson & Seilhamer, 1997). As análises proteômicas requerem uma grande variedade de técnicas analíticas incluindo separações eletroforéticas e espectrofotometria de massas para identificação. Sua aplicação pode ser na identificação de biomarcadores na pesquisa clínica, análise da interação entre as proteínas, modificações pós- traducionais, além da identificação de alvos terapêuticos potenciais (Westermeier et al, 2005). A Bioinformática e a Bioestatística são essenciais para tais avaliações, bem como para o delineamento dos dados gerados (Smith et al., 2009). A proteômica tornou-se uma tecnologia relevante para o estudo de microrganismos, tecidos, organelas celulares ou células. Várias abordagens têm sido usadas para estudar, por exemplo, o desenvolvimento do tumor, descoberta de biomarcadores (Acero et al., 2011) para orientar a terapia alvo molecular e monitorar a atividade e resposta terapêutica a um grande número doenças (Rifai et al., 2006). A proteômica possui diversas aplicações e finalidades na área microbiológica. Um exemplo é a análise de componentes de superfície do Aspergillus fumigatus na identificação 31 de candidatos protéicos para a produção de vacinas e novas macromoléculas alergênicas (Asif et. al., 2006). Outros proteomas além de fungos têm sido estudados. Os pesquisadores Caldelari e seus colaboradores analisaram o proteoma de Streptococcus gordonni, por eletroforese bidimensional e verificaram que o microrganismo resistente apresentou duas proteínas com intensidade aumentada, as quais mostraram relação com resistência à penicilina (Caldelari et al., 2000). Assim, no presente trabalho se buscou novas substâncias com atividade contra as espécies de fungos dermatofíticos mais prevalentes a partir de ésteres do ácido protocatecuico. Além disso, também se pretendeu verificar o efeito de combinações destes com fármacos antifúngicos utilizado no tratamento destas infecções. Também foi utilizada a abordagem proteômica a fim de realizar a detecção de novos alvos terapêuticos potenciais e elucidar os mecanismos de ação de moléculas por meio da verificação das proteínas diferencialmente expressas após contato com esses compostos. 32 2. JUSTIFICATIVA É sabido ser o Brasil um país rico em biodiversidade com enorme potencial de desenvolvimento biotecnológio nas mais diferenciadas linhas de produtos, principalmente os farmacológicos. Produtos naturais bioativos são o ponto de partida para o desenvolvimento de novos fármacos, síntese dessas substâncias e de derivados planejados, permitindo que se identifique o farmacóforo e possibilitando o planejamento de fármacos sintéticos. De acordo com a revisão bibliográfica elaborada para essa pesquisa, os estudos com extratos e substâncias derivadas de produtos naturais descrevem apenas sua potência, não aprofundando os estudos no sentido de reconhecer e validar alvos para elucidação do mecanismo funcional dos princípios ativos. Assim, no presente projeto foi realizada a bioprospecção de ésteres do ácido protocatecuico. Foi avaliado também o sinergismo entre esses derivados sintéticos na busca de novos fármacos combinados com atividade que mimetizem concentração anteriormente tóxica. Verificou o perfil de proteínas do isolado clínico de T. rubrum antes e após o contato com terbinafina e protocatecuato de nonila a fim de elucidar as prováveis proteínas- alvo. A importância dessa análise pode gerar a identificação de novos alvos interessantes neste grupo de fungos e na pesquisa de novos protótipos fungitóxicos. 33 3. OBJETIVOS 3.1. Objetivos gerais Avaliar atividade anti-dermatofítica e sinérgica do ácido protocatecuico e seus ésteres, caracterizar as propriedades biológicas destes e verificar perfil protéico das células fúngicas antes e após o contato com substâncias que apresentaram maior potência. 3.2. Objetivos Específicos Realizar a bioprospecção de derivados sintéticos do ácido protocatecuico, avaliando atividade antifúngica; Avaliar a interação entre protocatecuatos e fármacos antifúngicos; Realizar testes de citotoxicidade dos protocatecuatos selecionados; Realizar a avaliação do perfil protéico total e diferencial para futura caracterização e identificação das proteínas que tiverem sua expressão modificada quando em contato com composto sintético do ácido protocatecuico e droga de referência utilizada no tratamento das dermatofitoses; 34 4. MATERIAIS E MÉTODOS 4.1. Obtenção dos compostos (1-16) Os compostos foram cedidos por meio do projeto Biota-FAPESP e Bioprospecta- Fapesp, em associação com grupo de pesquisa da Dra. Dulce H. S. Silva e Dr. Luis O. Regasini, do Instituto de Química da UNESP-Araraquara. 4.1.1. Síntese dos protocatecuatos (2-15) Uma alíquota de 3,0 mL de uma solução de N, N – dicicloexilcarbodiimida (DCC, 1,0 mmol) em dioxano anidro foi adicionada, na temperatura de 5°C, a uma solução de 0,2 mmol de ácido protocatecuico (1) e 20 mmol dos respectivos alcoóis n- alquílicos em 6,0 mL de dioxano anidro. O meio reacional foi mantido sob agitação durante 48 horas, sendo o solvente evaporado sob pressão reduzida. O resíduo foi lavado com acetato de etila (3x) e filtrado. O filtrado foi submetido à extração líquido – líquido com uma solução saturada de ácido cítrico (3 x) e, posteriormente, com solução saturada de bicarbonato de sódio (3x). A fase orgânica foi seca em sulfato de magnésio anidro e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica eluída com diferentes misturas de hexano e acetato de etlila, fornecendo os ésteres alquílicos planejados (2-15) (Ximenes et al., 2010). 4.1.2. Síntese do ácido 3,4 – diacetoxibenzóico (16) Para a síntese do derivado acilado (16), o ácido protocatecuico (1) foi dissolvido em 10,0 mL de piridina anidra e anidrido acético (1:1) sob atmosfera inerte de gás hidrogênio. O meio reacional foi mantido sob agitação por 48 horas à temperatura ambiente, sendo seco sob pressão reduduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna eluída com 35 clorofórmio: metanol (85:15), redendo o ácido protocatecuico acilado (16) (Morais et al., 2010). 4.1.3. Diluição dos compostos Para diluição dos compostos sintéticos foram utilizados microtubos tipo Eppendorf e como diluente utilizou-se DMSO, solubilizados com o auxilio do vórtex. Foram realizados cálculos para determinação da quantidade de cada substância testada para que a concentração inicial na placa de microdiluição fosse 250 μg/mL. Para os experimentos realizados neste trabalho foram preparadas soluções de antifúngicos, que foram diluídos conforme preconizado o documento M38-A proposto pelo CLSI (2002) com algumas modificações. O fluconazol foi diluído em água estéril para preparo da solução-estoque, a griseofulvina e terbinafina foram dissolvidos em DMSO. Após as diluições conforme recomendações do protocolo M38-A foram obtidas para fluconazol soluções com concentrações finais de 64; 32; 16; 8; 4; 2; 1; 0,5; 0,25 e 0,125 μg/mL em RPMI. Para a griseofulvina e terbinafina, foi obtido concentrações finais de 8; 4; 2; 1; 0,5; 0,25; 0,125; 0,0625, 0,0313 e 0,0156 ug/mL em RPMI. 4.2. Cultivo dos dermatófitos Neste estudo foram selecionados dois isolados clínicos de T. rubrum, denominados Tr1 e Tr2, uma cepa ATCC T. rubrum ATCC MYA 3108 (Tr3), dois isolados clínicos de T. interdigitale (Tm1 e Tm2), T. interdigitale ATCC 40131 (Tm3). A manutenção de todas as cepas foi realizada por repiques periódicos. Os dermatófitos foram cultivados em Ágar Sabouraud Dextrose (Difco TM) por 7 dias, a temperatura ambiente. As características dos dermatófitos estão descritas a seguir. Tr1 e Tr2: Cepas pertencentes à micoteca do Laboratório de Micologia do Departamento de Análises Clínicas, Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade Estadual Paulista (UNESP), previamente isoladas a partir dos exames de rotina encaminhados ao mesmo laboratório. 36 Tr3: Linhagem isolada de paciente com dermatofitose, (ATCC MYA-3108) cedida gentilmente pela Profa. Dra. Ana Lucia Fachin da Unidade de Biotecnologia (UNAERP), antes da ruptura do gene TruMDR2. Tm1 e Tm2: Cepas pertencentes à micoteca do Laboratório de Micologia do Departamento de Análises Clínicas, Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade Estadual Paulista (UNESP), previamente isoladas a partir dos exames de rotina, foram encaminhadas ao mesmo laboratório. Tm3: Cepa de T. interdigitale ATCC 40131, pertencente à micoteca do Laboratório de Micologia do Departamento de Análises Clínicas, Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade Estadual Paulista (UNESP). 4.3. Preparo do inóculo Após o crescimento de 7-10 dias em temperatura ambiente, em tubos contendo Ágar Sabouraud Dextrose (ASD), as colônias fúngicas foram cobertas com 5 mL de salina estéril (NaCl 0,85%). Os esporos foram suavemente suspendidos com o auxílio de uma alça em anel descartável e depois transferidos para um tubo estéril onde permaneceram por 30 minuntos, com o objetivo de se obter a separação dos microconídeos. A partir desta suspensão, foi realizada a contagem dos esporos em Câmara de Newbauer, com o objetivo de se obter um inóculo final com 5 x103 UFC/\mL. 4.4. Avaliação da suscetibilidade de dermatófitos aos antifúngicos pela técnica de microdiluição Para posterior determinação da concentração inibitória mínima (CIM) foi utilizada adaptação da metodologia segundo o CSLI M38-A (2002), com modificações. Para tanto, nesta técnica foram utilizadas microplacas de 96 poços. O meio de cultura utilizado foi o RPMI com 2% de glicose tamponado com MOPS pH 7,2. A coluna 1 foi utilizada para controle negativo do teste, contendo assim apenas meio de cultura (200 μL). A partir da coluna 2 até 11, nas fileiras A a H, foram colocadas diluições decrescentes dos compostos em estudo. Na coluna 2, colocou-se o RPMI suplementado com 2% de glicose em quantidade calculada previamente de acordo com a concentração do composto diluído em DMSO. 37 Colocou-se então a substância na coluna 2, sendo que o volume final nesse poço foi de 200 μL. Posteriormente na coluna 2 foram retirados 100 μL e repassados à coluna 3 e assim sucessivamente até a coluna 11 para a qual foram retirados 100 μL e descartados, obtendo-se então a diluição do composto sintético. Por fim, foram colocados 100 μL da suspensão de células na concentração de 5,0 x 103 UFC/mL em cada poço, nas colunas 2-12. Foi feito também o controle com os fármacos, colocando 100 μL da suspensão de células em cada poço na coluna 2 a 11. Posteriormente, foram adicionados 100 μL do antifúngico em suas respectivas diluições conforme determinado na portaria M 38- A do CSLI. As placas foram incubadas a 35ºC e a leitura foi feita depois de 168 horas. Foi realizada leitura visual e espectrofotométrica a 490 nm. Utilizou-se o indicador de viabilidade celular (AlamarBlue®) para confirmação da CIM. Para os derivados azólicos a CIM foi definida como a concentração que apresentou uma inibição de 50% e para a terbinafina e griseofulvina, uma inibição de 80% do crescimento fúngico, comparadas ao controle do inóculo. CIM50 e CIM80 foram definidas como as CIMs capazes de inibir 50% e 80% dos isolados, respectivamente. 4.5. Concentração Fungicida Mínima (CFM) A determinação da Concentração Fungicida Mínima foi realizada em placa de Petri contendo ágar Sabouraud. A placa de Petri foi previamente demarcada de acordo com as posições das diluições dos compostos e controles positivos na placa de microdiluição. Uma alíquota do conteúdo dos poços da placa de microdiluição foi transferida com auxílio de um palito estéril para o respectivo local na placa de Petri. Após 96 horas de incubação a 35°C, foi verificado o crescimento de colônias e as respectivas concentrações. Foi determinada como CFM, ou seja, a menor concentração do composto em estudo ou fármaco antifúngico em situação tal que não tenha ocorrido o desenvolvimento dos microrganismos. 38 4.6. Avaliações das Associações As associações entre os protocatecuatos e fármacos antifúngicos foram estudados empregando os métodos do tabuleiro de xadrez e associação equimolar. O método do tabuleiro do xadrez foi empregado para o estudo com os fármacos fluconazol e griseofulvina, enquanto a associação química foi utilizada para os estudos com miconazol e nistatina. 4.6.1. Método do tabuleiro de xadrez O método do “tabuleiro de xadrez” foi baseado no procedimento estabelecido pelo CLSI. A técnica de microdiluição em caldo para o teste de sensibilidade antifúngica foi executada (CLSI, 2002). O meio de cultura utilizado foi o RPMI-1640 com L-glutamina sem bicarbonato de sódio e acrescido de 2% de glicose, tamponado com MOPS 0,165M, pH 7,2. Em cada orifício da microplaca, foram adicionados 50 μL de cada composto em dosagem 4 vezes a concentração final, nas fileiras de A a G e colunas de 2 a 11. A análise combinatória foi realizada envolvendo as associações entre protocatecuatos e fármacos antifúngicos. Por exemplo, as concentrações finais do agente antifúngico griseofulvina variaram de 0,0625 μg/mL à 0,0007 μg/mL e para o protocatecuato de nonila variaram de 15,6 μg/mL à 0,03 μg/mL. Em cada poço foram adicionados 100 μL de suspensão fúngica (5,0 x 103 UFC/mL); como controle negativo foram utilizados 200 μL de RPMI (coluna 1 orifício A até D) e, para controle positivo, 100 μL de RPMI com 100 μL de inóculo (coluna 1 orifício E até H ). Na coluna 12 foi colocado o fluconazol, utilizado como controle de droga e, na linha H orifício 2 até 11, foi colocado somente o protocatecuato de nonila, e adicionaram-se 100 μL de inóculo em todos os orifícios; assim se obteve a CIM individual de cada substância. As concentrações finais em μg/mL das duas substâncias associadas podem ser visualizadas na figura 2. As placas foram incubadas a 35ºC e a leitura foi feita após 168 horas. Foram realizadas leituras visuais e espectrofotométricas a 490 nm. 39 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A C- 0,0625 15,6 0,0625 7,8 0,0625 3,9 0,0625 1,95 0,0625 0,97 0,0625 0,48 0,0625 0,24 0,0625 0,12 0,0625 0,06 0,0625 0,03 0,25 B C- 0,031 15,6 0,031 7,8 0,031 3,9 0,031 1,95 0,031 0,97 0,031 0,48 0,031 0,24 0,031 0,12 0,031 0,06 0,031 0,03 125 C C- 0,015 15,6 0,015 7,8 0,015 3,9 0,015 1,95 0,015 0,97 0,015 0,48 0,015 0,24 0,015 0,12 0,015 0,06 0,015 0,03 0,0625 CIM D C- 0,007 15,6 0,007 7,8 0,007 3,9 0,007 1,95 0,007 0,97 0,007 0,48 0,007 0,24 0,007 0,12 0,007 0,06 0,007 0,03 0,0312 E C+ 0,003 15,6 0,003 7,8 0,003 3,9 0,003 1,95 0,003 0,97 0,003 0,48 0,003 0,24 0,003 0,12 0,003 0,06 0,003 0,03 0,015 F C+ 0,0015 15,6 0,0015 7,8 0,0015 3,9 0,0015 1,95 0,0015 0,97 0,0015 0,48 0,0015 0,24 0,0015 0,12 0,0015 0,06 0,0015 0,03 0,007 G C+ 0,0007 15,6 0,0007 7,8 0,0007 3,9 0,0007 1,95 0,0007 0,97 0,0007 0,48 0,0007 0,24 0,0007 0,12 0,0007 0,06 0,0007 0,03 0,003 H C+ 62,5 31,2 15,6 7,8 CIM 3,9 1,95 0,97 0,48 0,24 0,12 0,001 Figura 2. Exemplo de esquema de combinação de compostos na placa de microdiluição de 96 poços. Teste combinatório com griseofulvina (em negrito) e protocatecuato de nonila (em itálico). C-: Controle Negativo; C+: Controle Positivo. * CIM e CIM Concentração Inibitória Mínima de griseofulvina e do protocatecuato de nonila, respectivamente. Para verificar o efeito combinatório da griseofulvina e protocatecuato de nonila, adotou- se o índice de concentração inibitória fracionada (ICIF), o qual pode ser sinérgico, aditivo, indiferente ou antagônico (Johnson et al., 2004). Para o cálculo do IFIC seguiu-se a fórmula: ICIF = a/b + a/c, onde; a = CIM (protocatecuato + fármaco antifúngico), b = CIM (protocatecuato) e c = CIM (fármaco antifúngico). CIM da combinação CIM da nonila CIM da griseofulvina 40 4.6.2. Associação equimolar A associação equimolar foi realizada por meio da mistura simples dos pós, segundo as respectivas massas molares, miconazol (MM =416 g/mol) e nistatina (MM= 926 g/mol). Exemplo geral; para a associação equimolar de miconazol (MM = 416 g/mol) + protocatecuato de dodecila (MM=322 g/mol), foram misturados 4,2 mg de miconazol e 3,2 mg de protocatecuato de dodecila. Dessa forma, a mistura final apresentou em 7,4 mg (4,2 mg + 3,2 mg), quantidades similares do protocatecuato em estudo e o fármaco antifúngico, ambos em μmol. A associação entre os protocatecuatos, miconazol e nistatina foi classificada segundo os valores de índice de concentração inibitória fracionada (IFIC) de modo semelhante àquele empregado para a análise de associação entre protocatecuatos, fluconazol e griseofulvina (método do tabuleiro de xadrez). A classificação da associação equimolar foi definida como antagônica, indiferente, aditiva e sinérgica. Foi realizada segundo os valores de ICIF de modo idêntico àquele utilizado para os estudos utilizando o método do tabuleiro de xadrez. Para avaliação das combinações pelo método de tabuleiro de xadrez e associação equimolar utilizou-se as seguintes classificações: sinérgica quando o ICIF é menor ou igual a 0,5; aditiva quando ICIF é maior que 0,50 e menor/igual a 1,0; indiferente quando ICIF é maior que 1 e menor/igual 4; e antagônica quando ICIF é maior 4,0 (Johnson et al., 2004). 4.7. Tratamento das células fúngicas e extração de proteínas Os fungos filamentosos foram cultivados em meio YEPD na concentração de 5 x 103 UFC/mL e incubado em temperatura ambiente durante 7 dias até atingirem a fase log da curva de crescimento. Então foi adicionada terbinafina em uma concentração 50 vezes superior a CIM previamente determinada ficando em contato por mais 7 dias. O mesmo procedimento foi realizado para o protocatecauto nonila na concentração 10 vezes acima da CIM. O cultivo foi lavado com água destilada para a retirada do meio de cultura e do extrato. Ao “pellet” foram acrescidos 5 mL da solução 10 mM Tris-HCI e triturado em nitrogênio líquido. O “pellet” foi colocado em contato com solução desnaturante composta por uréia 4 M, SDS 2%, 41 -mercaptoetanol 2% segundo Pendrak, et al., (2000). Como controle foram usados os fungos filamentosos cultivados em meio YEPD e não entraram em contato com os demais compostos. 4.7.1. Doseamento protéico A dosagem das proteínas após a extração foi realizada pelo método de Bradford (Bradford, 1976). Alíquotas de 100 μL de amostra foram adicionadas em 5 mL do reagente diluído (1:4) em tubos e incubadas por 5 minutos em temperatura ambiente. Na sequência foi feita a leitura em espectrofotômetro a 595 nm. As concentrações das proteínas foram calculadas por meio da comparação com uma curva-padrão e realizados os cálculos para obtenção de 600 μg de proteína por mL. 4.7.2. Análise do perfil protéico por eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) Os perfis protéicos foram analisados quanto à sua alteração após a exposição à terbinafina e ao protocatecuato de nonila por eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio, SDS-PAGE, sob condições redutoras, utilizando sistema de tampão descontínuo de Laemmli, (1970) e Studier, (1973). 4.7.3. Eletroforese Bidimensional 4.7.3.1. Focalização Isoelétrica (Primeira dimensão) As proteínas foram separadas de acordo com o seu ponto isoelétrico (pI), sendo submetidas à focalização isoelétrica, utilizando-se o sistema Ettan IPGphor 3 (GE 42 Healthcare). As fitas utilizadas para a caracterização das proteínas presentes na amostra foram de 13 cm de comprimento, não lineares, com gradiente de pH variando de 3-10. 4.7.3.2. Preparo da amostra De acordo com os cálculos realizados durante a dosagem pelo método de Bradford, pipetou-se o volume adequado de amostra e adicionou-se TCA 10% em acetona, para realização da precipitação, a qual foi feita a 4 °C durante 12 horas. Em seguida, foi centrifugada a amostra a 10.000 RPM por 15 minuntos, três vezes com acetona 90%. Depois de lavar três vezes descartou-se a acetona e adicionou-se De-Streak, IPG Buffer e solução de reidratação, até total dissolução. As fitas foram reidratadas com 250 μL de amostra, a qual contém 600 μg de proteína, durante 10-20 horas, em temperatura ambiente, no aparato adequado para reidratação (Immobiline Dry Strip Reswelling Tray – GE Healthcare). As fitas foram cobertas com Cover Fluid (GE Heathcare) evitando-se a evaporação durante a reidratação. Em seguida, realizou-se a focalização de acordo com as seguintes condições: 500V por 1 hora, 1000V por 1 hora, 8000V por 2 horas e 30 minutos, 8000V por 30 minutos. Após a focalização, as fitas foram retiradas do aparelho e armazenadas à temperatura de –80ºC. 4.7.3.3. SDS-PAGE (Segunda dimensão) Após a focalização isoelétrica, as fitas foram mantidas por 20 minutos em solução de equilíbrio com 100 mg DTT e, em seguida, por mais 20 minutos em outra solução de equilíbrio com 250 mg de iodacetamida, soluções de redução e alquilação, respectivamente. A segunda dimensão, que foi realizada para a separação das proteínas de acordo com a massa molecular, foi em gel de poliacrilamida 12,5 % de acordo com Laemmli, 1970. As fitas foram inseridas sobre o gel de acrilamida e fixadas com uma solução de agarose 0,5 % (m/v). A separação eletroforética foi realizada a 10 ºC, sendo que no primeiro estágio foi utilizada uma corrente de 15 V por 15 minutos e, no segundo estágio, uma corrente de 30 V por gel durante, aproximadamente, 4 horas. 43 4.7.4. Revelação do gel pelo azul de Comassie Após a eletroforese, os géis controle e com perfil protéico da terbinafina e nonila, foram corados com Coomassie Azul Brilhante G-250 segundo Neuhoff et al., (1988). 4.8. Teste de citotoxidade - MTT A citotoxicidade do ácido protocatecuico e seus ésteres foi avaliada por MTT [-3-(4,5- dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazólio]. Foram utilizados macrófagos alveolares de camundongos (AMJ2-C11) (Banco de Células do Rio de Janeiro). Estas foram cultivadas em garrafas de plástico em DMEM (Sigma®), suplementadas com soro fetal bovino (SFB) 10% e antibióticos sob a temperatura de 36,5 °C. A concentração de 10 x 105 células/mL foi utilizada para formação de células em monocamada. Os protocatecuatos foram mantidos em contato com as células por 24 horas. Após o período de incubação, as células foram tratadas com o reagente MTT (Sigma-Aldrich®) e incubadas novamente por mais 4 h. Após a formação de “cristais de formanza” adicionadou-se 100 μL de isopropanol para solubilizar o precipitado e permitir a leitura do resultado, alterando a média de cor (Mosmann, 1983). A absorbância de “formazana” foi mensurada pelo leitor de ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) em 560 nm. Como um teste controle positivo foi usado cisplatina. 44 5. RESULTADOS 5.1. Avaliação da atividade antifúngica dos compostos sintéticos esterificados Na tabela 1 estão resumidos os resultados do coeficiente de partição através do log P (logaritmo do coeficiente de partição em um sistema bifásico) (Leal et al., 2009), atividade in vitro do ácido protocatecuico e seus ésteres frente às espécies de dermatófitos. Para cada protocatecuato foi calculado aos diferentes valores de CIM e CFM, estabelecendo a relação entre lipofilicidade e atividade antifúngica. Este estudo foi realizado a fim de indicar características químicas responsáveis pela atividade biológica, incluindo a importância de grupos hidroxila livres e o comprimento da cadeia lateral. O ácido protocatecuico mostrou atividade fraca contra Trichophyton spp. (CIMs entre 125 e 250 ug/mL) e o seu derivado acilado diacetato benzóico mostrou-se totalmente inativo (CIM ≥ 250 ug/mL). No entanto, a presença dos grupos hidroxila mostrou-se ser necessária, mas não suficiente para um efeito antifúngico potente. Os ésteres mais potentes possuiam uma largura de seis a nove carbonos na cadeia alquilica lateral, como observado entre os protocatecuatos de hexila, heptila, octila e nonila. A potência aumentou com o número de carbonos na cadeia lateral até atingir um ponto máximo. Neste caso depois de nove carbonos os compostos perderam significantemente a atividade, fenômeno conhecido como efeito de corte ou “cutoff effect” (Kubo et al, 2002). Todos os resultados indicaram uma correlação clara e positiva entre os valores de CIM, comprimento da cadeia alquílica e sua contribuição para lipofilicidade. Trichophyton mentagophytes (Tm2), teve o menor valor de CIM (0,97 ug/mL). Para as cepas T. rubrum, o protocatecuato de heptila demonstrou um valor de MIC igual a 1,95 ug/mL. O protocatecuato de octila mostrou alta potência contra T. rubrum MYA 3108 (Tr3), exibindo um valor de CIM de 0,97 ug/mL. Para as cepas Tr1 e Tr2, esse composto apresentou CIM de 1,95 e 7,8 ug/mL, respectivamente. Para o protocatecuato de nonila o melhor resultado foi mostrado para as cepas Tr1 e Tr3, com a CIM de 1,95 ug/mL. 45 5.1.1. Avaliação da atividade antifúngica dos compostos sintéticos esterificados Tabela 1. Tabela representativa contendo o cálculo do coeficiente de partição, a CIM e CFM dos protoctecuatos frentes aos seis isolados. Cálculo do coeficiente de partição ( Log P) dos protoctecuatos; Concentração Inibitória Mínima (CIM); Concentração Fungicida Mínima (CFM), isolados clínicos de T. rubrum (Tr1 e Tr2); T. rubrum ATCC MYA 3108 (Tr3), isolados clínicos de T. interdigitale (Tm1 e Tm2) e T. interdigitale ATCC 40131 (Tm3). Os números entre parênteses são as numerações de cada composto. O teste foi realizado em quintuplicata, em experimento independente. Dermatófitos Protocatecuatos log P R Tr1 Tr2 Tr3 Tm1 Tm2 Tm3 CIM CFM CIM CFM CIM CFM CIM CFM CIM CFM CIM CFM Àcido protocatecuico (1) 0,81 H 250 250 250 250 250 250 250 >250 >250 >250 125 125 Àcido 3,4-diacetoxibenzóico (2) 0,76 - 250 250 >250 >250 >250 >250 250 250 >250 >250 250 250 Protocatecuato de metila (3) 1,08 CH3 62,5 62,5 31,2 31,2 31,2 31,2 62,5 250 62,5 62,5 31,25 62,5 Protocatecuato de etlia (4) 1,41 CH2CH3 31,2 31,2 31,2 31,2 31,2 31,2 31,2 62,5 31,2 31,2 31,25 125 Protocatecuato de propila (5) 1,90 (CH2)2CH3 15,6 15,6 31,2 31,2 31,2 31,2 15,6 62,5 62,5 62,5 15,6 31,2 Protocatecuato de butila (6) 2,32 (CH2)3CH3 15,6 15,6 7,80 7,80 7,80 7,80 7,80 62,5 15,6 15,6 15,6 15,6 Protacatecuato de pentila (7) 2,73 (CH2)4CH3 7,80 7,80 7,80 7,80 7,80 7,80 3,90 15,6 7,80 7,80 7,80 15,6 Protocatecuato de hexila (8) 3,15 (CH2)5CH3 3,90 3,90 1,95 3,90 3,90 3,90 1,95 3,90 3,90 3,90 3,90 7,80 Protocatecuato de heptila (9) 3,57 (CH2)6CH3 1,95 1,95 1,95 1,95 1,95 1,95 1,95 3,90 0,97 0,97 3,90 3,90 Protocuato de octila (10) 3,99 (CH2)7CH3 1,95 1,95 7,80 7,80 0,97 0,97 1,95 3,90 1,95 1,95 3,90 3,90 Protocuato de nonila (11) 4,40 (CH2)8CH3 1,95 1,95 3,90 3,90 1,95 1,95 3,90 3,90 3,90 3,90 3,90 3,90 Protocatecuto de decila (10) 4,82 (CH2)9CH3 3,90 3,90 3,90 3,90 3,90 3,90 7,80 7,80 3,90 3,90 3,90 3,90 Protocatecuto de dodecila (13) 5,65 (CH2)11CH3 >250 >250 125 125 >250 >250 250 250 62.5 62,5 31,25 62,5 Protocatecuato de tetradecila (14) 6,49 (CH2)13CH3 >250 >250 125 125 >250 >250 >250 >250 125 250 >250 >250 Protocatecuato de hexadecila (15) 7,32 (CH2)15CH3 >250 >250 >250 >250 >250 >250 >250 >250 >250 >250 >250 >250 Protocatecuato de octadecila (16) 8,16 (CH2)17CH3 >250 >250 >250 >250 >250 >250 >250 >250 >250 >250 >250 >250 Griseofulvina - 0,0312 0,0625 0,0625 0,0625 0,125 0,125 46 Os resultados revelaram que dos 16 compostos testados, 10 (62,5%) tiveram atividade potente contra dois isolados clínicos de T. rubrum (Tr1 e Tr2), T. rubrum MYA 3108 (Tr3) e Tm1 (tabelas 2 e 3) e 11 (68,7%) contra o isolado clínico T. interdigitale ATCC 40131 (Tm3) (tabela 3). Os valores de referência de Concentração Inibitória Mínima (CIM) foram considerados como inferiores 62,5 ug/mL. Com relação à griseofulvina, os valores encontrados foram MIC 0,0312 μg/ml para Tr1; 0,0625 μg/mL para Tr2, Tr3 e Tm1; 0,125 μg/mL para Tm2 e Tm3. Tabela 2. Concentração inibitória mínina In vitro (CIM%) e concentração fungicida mínima (% CFM) do ácido protocatecuico e seus ésteres para Tr1, Tr2 e Tr3. Dermatófitos Tr1 Tr2 Tr3 Concentrações (ug /mL) CIM % CFM % CFM % CFM % CFM % CFM % 0,97- 62,5 10 (62,5 %) 10 (62,6%) 10 (62,5 %) 10 (62,5%) 10 (62,5 %) 10 (62,5%) 125- 250 2 (12,5%) 2 (12,5%) 3 (18,7% ) 3 (18,7%) 1 (6,25 %) 1 (6,25%) >250 4 (25% ) 4 (25%) 3 (18,7% ) 3 (18,7%) 5 (31,2 %) 5 (31,2%) Total 16 (100%) 16 (100%) 16 (100%) 16 (100%) 16 (100%) 16 (100%) Tabela 3. Concentração inibitória mínima In vitro (CIM%) e concentração fungicida mínima (CFM%) do ácido protocatecuico e seus ésteres para Tm1, Tm2 e Tm3. Dermatófitos Tm1 Tm2 Tm3 Concentrações (ug /mL) CIM% CFM % CIM % CFM % CIM % CFM % 0,97- 62,5 10 (62, 5 %) 9 (56, 2%) 11 (68,7 %) 11 (68,7%) 11 (68,7 %) 11 (68,7%) 125- 250 3 (18,7% ) 3 (18,7%) 1 (6,25 %) 1 (6,25%) 2 (12,5% ) 2 (12,5%) >250 3 (18,7% ) 4(25,0%) 4 (25,0% ) 3 (25,0%) 3 (18,7% ) 3 (18,7%) Total 16 (100%) 16 (100%) 16 (100%) 16 (100%) 16 (100%) 16 (100%) O espectro da atividade antifúngica de todos os compostos sintéticos dos protocatecuatos testados contra as seis linhagens de dermatófitos está demonstrada na figura 3, onde observou-se a atividade específica para cada linhagem de dermatófitos. Nota-se que 47 os valores de CIM correspondem à CFM em geral e que há uma tendência a serem mais ativos contra a espécie T. rubrum na concentração de 0,97-1,95 μg/mL, porém, a maioria dos compostos apresenta atividade antifúngica forte contra ambas as espécies. 48 Figura 3. Valores de CIM e CFM dos protocatecuatos contra duas espécies de Trichophyton spp. 49 5.2. Avaliação da atividade combinatória de fluconazol e protocatecuatos Os valores de CIF (concentração inibitória fracionada) de fluconazol e dos protocatecuatos de pentila (7), hexila (8), heptila (9), octila (10) e nonila (11) estão representados na tabela 4. As combinações de fluconazol e protocatecuatos de pentila, hexila, heptila, octila e nonila foram testadas frente a três linhagens de dermatófitos, por meio da técnica de checkerboard. Quando as combinações foram analisadas individualmente (tabela 4), quase todas (FLU+7; FLU+8; FLU+9; FLU+ 10; FLU+ 11) foram aditivas. A combinação FLU+8 demonstrou-se indiferente para Tr1. Para Tm2 todas as combinações foram aditivas. O protocatecuato de heptila associado ao fluconazol (FLU+ 9) demonstrou atividade sinérgica para Tm3 e aditividade para as demais associações (FLU+7; FLU+8; FLU+10 e FLU+11). 50 Tabela 4. Atividade de fluconazol combinado com os protocatecuatos de pentila (7), hexila (8), heptila (9), octila (10) e nonila (11) contra cepas de dermatófitos (μg/ml). Efeito sinérgico (S), aditivo (A), indiferente (I). Tr1- T. rubrum, Tm2- T. interdigitale isolado clínico e Tm3- T. interdigitale ATCC 40131. Fungos CIM (μg/mL) FIC index (tipo de associação) Redução Composto sozinho Composto combinado FLU 7 8 9 10 11 FLU+7 FLU+8 FLU+9 FLU+10 FLU+11 FLU+7 FLU+8 FLU+9 FLU+10 FLU+11 FLU+7 FLU+8 FLU+9 FLU+10 FLU+11 Tr1 2,0 7,8 3,9 1,9 1,9 1,9 0,12−7,80 2,00−0,48 0,12−1,9 2,00−0,06 2,00−0,03 1,0 (A) 1,1 (I) 1,0 (A) 1,0 (A) 1,0 (A) 17x 0x 0x 8x 17x 0x 0x 32x 0x 64x Tm2 1,0 3,9 1,9 3,9 1,9 39 1,00−0,03 1,00−0,03 1,00−0,03 1,00−0,03 1,00−0,03 1,0 (A) 1,0 (A) 1,0 (A) 1,0 (A) 1,0 (A) 0x 129x 0x 129x 0x 129x 0x 129x 0x 129x Tm3 0,5 7,8 3,9 3,9 3,9 3,9 0,50−0,03 0,12−1,9 0,12−0,97 0,12−1,9 0,50−0,03 1,0 (A) 0,72 (A) 0,48 (S) 0,72 (A) 1,0 (A) 0x 258x 32x 2x 32x 4x 32x 2x 0x 129x 51 5.3. Avaliação da atividade combinatória de griseofulvina e protocatecuato de nonila As combinações de griseofulvina e nonila foram avaliadas contra seis linhagens de dermatófitos. O resultado da combinação de griseofulvina e protocatecuato de nonila demonstrou que houve atividade sinérgica frente a Tr1 e Tr2. Para as demais linhagens Tr3, Tm1, Tm2 e Tm3 a associação mostrou atividade aditiva. Tabela 5. Valores de CIM da griseofulvina e do derivado nonila testados por uso simples e combinados contra os isolados de dermatófitos (μg/mL). O índice combinado fracionado (ICIF) das duas substâncias também está representado na tabela. Efeito sinérgico (S), aditivo (A). CIM (μg/ml) Dermatófitos CIM (composto sozinho) CIM da combinação FICI (interp.) Redução Griseo 11 Griseo 11 Griseo + 11 Tr1 0,0312 3,90 0,0030 0,12 0,12 (S) 10x 32x Tr2 0,0625 3,90 0,0300 0,03 0,48 (S) 2x 129x Tr3 0,0625 1,95 0,0007 1,95 1,0 (A) 89 x 0x Tm1 0,0156 3,90 0,0007 3,90 1,0 (A) 22x 0x Tm2 0,0625 3,90 0,0007 3,90 1,0 (A) 89x 0x Tm3 0,125 3,90 0,0007 3,90 1,0 (A) 170x 0x 52 5.4. Avaliação da atividade antifúngica da combinação equimolar de miconazol e protocatecuatos Os resultados da combinação equimolar de miconazol e os protocatecuatos de pentila, hexila, heptila, nonila, dodecila, tetradecila, hexadecila e octadecila na proporção equimolar (1:1) estão representados na tabela 6. Quando se associou quimicamente os protocatecuatos com miconazol, foram encontradas atividade antifúngica sinérgica para Tm1. Para Tr1 foram encontradas duas interações aditivas (protocatecuato de hexadecila + miconazol e protocatecuato de octadecila + miconazol) e sinérgica para as demais associações. Para Tm3 houve cinco atividades indiferentes (protocatecuato de pentila + miconazol, protocatecuato de hexila + miconazol, protocatecuato de dodecila + miconazol, protocatecuato de tetradecila + miconazol, protocatecuato de hexadecila + miconazol), duas interações aditivas (heptila + miconazol, nonila + miconazol). Interação antagônica foi evidenciada na associação (octadecila + miconazol). 53 5.4.1. Avaliação da atividade antifúngica da combinação equimolar de miconazol e protocatecuatos Tabela 6 - Atividade in vitro da combinação de miconazol com protocatecuatos de pentila (PEN), hexila (HEX), heptila (HEP), nonila (NON), dodecila (DOD), tetradecila (TET), hexadecila (HEX) e octadecila (OCT) contra três linhagens de dermatófitos (μg/mL). a Para o cálculo do FIC para os compostos dodecila (somente para Tr1), tetradecila, hexadecila e octadecila foi arbitrariamente definido na concentração de 125 μg/mL. Efeito sinérgico (S), aditivo (A), indiferente (I), antagônico (AN). * Dados não calculados. Composto sozinho Composto combinado FIC índex Redução Tr1 Tm1 Tm3 Tr1 Tm1 Tm3 Tr1 Tm1 Tm3 Tr1 Tm1 Tm3 MCZ 0,25 0,25 0,25 PEN 7,8 3,9 7,8 0,03 (MCZ) 0,03 (PEN) 0,015 (MCZ) 0,015 (PEN) 0,97 (MCZ) 0,97 (PEN) 0,12 (S) 0,06 (S) 4,0 (I) 8x 260x 16x 260x * 8x HEX 3,9 1,95 3,9 0,003(MCZ) 0,003(HEX) 0,03 (MCZ) 0,03 (HEX) 0,97 (MCZ) 0,97 (HEX) 0,12 (S) 0,13 (S) 4,1 (I) 83x 1.300x 8x 65x * 4x HEP 1,95 1,95 3,9 0,0004 (MCZ) 0,0004(HEP) 0,03 (MCZ) 0,03 (HEP) 0,97 (MCZ) 0,97 (HEP) 0, 0018 (S) 0,13 (S) 4,1 (A) 625x 4.875x 8x 65x * 4x NON 1,95 3,9 3,9 0,03(MCZ) 0,03(NON) 0,06 (MCZ) 0,06 (NON) 0,97 (MCZ) 0,97 (NON) 0,13 (S) 0,25 (S) 4,1 (A) 8x 65x 4x 65x * 4x DOD >250 7,8 31,2 0,03(MCZ) 0,03(DOD) 0,03(MCZ) 0,03 (DOD) 0,48 (MCZ) 0,48 (DOD) 0,12 (S) a 0,12 (S) 1,9 (I) 8x * 8x 260x * 65x TET >250 >250 >250 0,015(MCZ) 0,015(TET) 0,03 (MCZ) 0,03 (TET) 0,48 (MCZ) 0,48 (TET) 0,12 (S) a 0,12 (S) a 1,92 (I) a 16x * 8x * * * HEX >250 >250 >250 0,007(MCZ) 0,007(HEX) 0,015 (MCZ) 0,015 (HEX) 0,48 (MCZ) 0,48 (HEX) 0 084 (A) a 0,18 (S) a 1,92 (I) a 35x * 16x * * * OCT >250 >250 >250 0,007(MCZ) 0,007(OCT) 0,03 (MCZ) 0,03 (OCT) 0,97 (MCZ) 0,97 (OCT) 0 084 (A) a 0,36 (S) a 11,6 (AN) a 35x * 8x * * * 54 5.5. Avaliação da atividade antifúngica da combinação equimolar de nistatina e protocatecuatos Os resultados da combinação equimolar de nistatina e os protocatecuatos de pentila, hexila, heptila, nonila, dodecila, tetradecila, hexadecila e octadecila estão representados na tabela 7. Quando se associou quimicamente os protocatecuatos de pentila, hexila, heptila, nonila, dodecila, tetradecila, hexadecila e octadecila, foi encontrada apenas uma interação aditiva entre dodecila e nistatina contra Tm1, para as demais associações foram evidenciadas interações antagônicas e indiferentes contra Tr1, Tm1 e Tm3. Os resultados demonstraram que este polieno não possui uma melhor ação antifúngica quando associada a oito protocatecuatos diferentes. 55 Tabela 7. Atividade in vitro de nistatina com protocatecuato de pentila (PEN), hexila (HEX), heptila (HEP), nonila (NON), dodecila (DOD), tetradecila (TET), hexadecila (HEX) e octadecila (OCT) contra três linhagens de dermatófitos (μg/mL). a Para o cálculo do FIC para o protocatecuato de dodecila (somente para Tr1), tetradecila, hexadecila e octadecila foi arbitrariamente definido na concentração de 125 μg/mL. Efeito sinérgico (S), aditivo (A), indiferente (I), antagônico (AN). Composto sozinho Composto combinado FIC index B Tr1 Tm1 Tm3 Tr1 Tm1 Tm3 Tr1 Tm1 Tm3 NIS 2,0 2,0 0,5 PEN 7,8 3,9 7,8 1,95 (NIS) 1,95 (PEN) 3,90 (NIS) 3,90 (PEN) 3,90 (NIS) 3,90 (PEN) 1,2 (I) 2,9 (I) 8,3 (AN) HEX 3,9 1,95 3,9 1,95 (NIS) 1,95 (HEX) 3,90 (NIS) 3,90 (HEX) 3,90 (NIS) 3,90 (HEX) 1,4(I) 3,9(I) 8,8 (AN) HEP 1,95 1,95 3,9 1,95 (NIS) 1,95 (HEP) 3,90 (NIS) 3,90 (HEP) 3,90 (NIS) 3,90 (HEP) 1,9(I) 3,9(I) 8,8 (AN) NON 1,95 3,9 3,9 1,95 (NIS) 1,95 (NON) 1,95 (NIS) 1,95 (NON) 3,90 (NIS) 3,90 (NON) 1,9 (I) 1,4(I) 8,8 (AN) DOD >250 7,8 31,2 0,97 (NIS) 0,97 (DOD) 1,95 (NIS) 1,95 (DOD) 1,95 (NIS) 1,95 (DOD) 8,2 (AN) a 1,0(A) 4,0 (I) TET >250 >250 >250 0,97 (NIS) 0,97 (TET) 3,90 (NIS) 1,95 (TET) 1,95 (NIS) 1,95 (TET) 8,2 (AN) a 1,98 (I) a 19,5 (AN) a HEX >250 >250 >250 1,95 (NIS) 1,95 (HEX) 7,80 (NIS) 7,80 (HEX) 3,90 (NIS) 3,90 (HEX) 16,6 (AN) a 66,3 (AN) a 39 (AN) a OCT >250 >250 >250 1,95 (NIS) 1,95 (OCT) 7,80 (NIS) 3,90 (OCT) 3,90 (NIS) 3,90 (OCT) 16,6 (AN) a 66,3 (AN) a 39 (AN) a 56 5.6. Resultados do ensaio de citotoxicidade dos protocatecuatos de pentila, hexila, heptila, octila e nonila Os resultados dos ensaios para avaliação do potencial citotóxico dos protocatecuatos de pentila, hexila, heptila, octila e nonila pelo método de MTT estão representados na tabela 8. Para análise da atividade citotóxica foi determinado um valor de IC50 na concentração de 7,8 ug/mL. Como controle positivo de atividade citotóxica foi utilizada cisplatina. O valor de IC50 dos protocatecuatos de pentila, hexila, heptila, octila e nonila foram 40,1 ug/mL, 33,3 ug/mL, 8,04 ug/mL, 8,90 ug/mL, 8,10 ug/mL, respectivamente. Conforme observado na tabela 8 demonstra-se a quantidade necessária para inviabilizar 50% dos macrófagos e 100% das células fúngicas. De acordo com os resultados os protocatecuatos possuem baixa citotoxicidade. Tabela 8. Avaliação da atividade citotóxica em macrófagos alveolares e índice de seletividade a partir da relação entre o CI50 e CFM. IS: índice de seletividade obtido a partir da relação entre o IC50 (macrófagos alveolares) por CFM para cada linhagem de dermatófito. A concentração de 7,8 ug/mL analisada confere com valores de CFM dos fungos estudados Tr1,Tr2,Tr3,Tm1,Tm2 e Tm3 demonstrando assim que o efeito desses protocatecuatos podem ser promissores para o desenvolvimento de novas drogas antifúngicas. Compostos Citotoxicidade CI50 (μg/mL) IS Tr1 Tr2 Tr3 Tm1 Tm2 Tm3 Pentila 40,1 5,1 5,1 5,1 2,6 5,1 2,6 Hexila 33,3 8,5 8,5 8,5 8,5 8,5 4,2 Heptila 8,04 4,1 4,1 4,0 2,0 8,2 2,0 Octila 8,90 4,5 1,1 9,2 2,3 4,5 2,3 Nonila 8,10 4,1 2,1 4,1 2,1 2,1 2,1 cisplatina ― ― ― ― ― ― ― 57 5.7. Resultados da avaliação do proteoma total e diferencial de T. rubrum nas situações de contato com as substâncias antifúngicas 5.7.1. Análise do perfil protéico por eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) dos extratos proteicos totais de T. rubrum Os componentes totais do fungo tratado com nonila e sem tratamento foram analisados por eletroforese SDS-PAGE. O perfil eletroforético mostrou diferenças quanto à intensidade e número de bandas. Na figura 1 é possível verificar modificações no perfil das duas situações na faixa de ≥97 a ≤14 kDa. Figura 4. Componentes totais de Tr1 (1), Tm3 (2), Tr1 sem tratamento (3) e Tr1 tratado com nonila 10x (4). 1 2 3 4 MM 14 67 45 30 20 97 KDa 58 5.8. Análise do proteoma total de T. rubrum (Tm1) por eletroforese bidimensional dos géis controle (Tm1 sem contato com substância antifúngica) e Tm1 tratado com terbinafina A eletroforese bidimensional foi realizada com os componentes totais de T. rubrum sem tratamento e tratada com terbinafina. A concentração de terbinafina que produziu o efeito no proteoma deste fungo foi de 49 μg/mL. As figuras 5 e 6 mostraram as bandas selecionadas que apresentaram variações no perfil do proteôma nas diferentes situações e nas diferentes faixas de pH. Elegeu-se uma concentração 50 vezes maior que a CIM para terbinafina. Foram detectadas proteínas na eletroforese bidimensional com massas moleculares entre ≥ 80 e ≤ 9 kDa e PI entre 4 e 7. A análise diferencial da expressão em T. rubrum revelou em maioria diminuição na expressão das proteínas quando em contato com terbinafina. Esses dados estão descritos na tabela 9. 59 T. rubrum sem tratamento Figura 5. Eletroforese bidimensional dos componentes protéicos totais de T. rubrum na faixa de pH de 3 a 10 sem tratamento. Gel corado pelo azul de Comassie. 3-10 NL 60 T. rubrum tratado com terbinafina Figura 6. Eletroforese bidimensional dos componentes protéicos totais de T. rubrum tratado com terbinafina 50 x acima da CIM. Gel corado pelo azul de Coomassie. 3-10 NL 61 Figura 7. Eletroforese bidimensional do extrato protéico total de T. rubrum isolado clínico na faixa de pH de 3 a 10, comparada com T. rubrum tratado com terbinafina 50 x . Em A, B, C, D, E e F tem-se visão ampliada das proteínas. 62 5.9. Análise do perfil diferencial do controle (Tm1 sem contato com substância antifúngica) e Tm1 tratado com terbinafina Foi realizada a seleção dos spots para verificação de variações de intensidade de bandas de acordo com as diferentes situações. A análise foi realizada pelo software Image Master 2D Platinum. Tabela 9. Proteínas demonstradas na figura 7 com seus respectivos pontos isoelétricos (pI), massas moleculares (MM) e alterações observadas com o tratamento com terbinafina. Spot PI MM (kDa) Alteração de expressão 1 47045 76039 Diminuiu 1,81 vezes com terbinafina 2 49788 68389 Dimimuiu 1,65 vezes com terbinafina 3 57890 58465 Dimimuiu 2,63 vezes com terbinafina 4 56411 58465 Diminuiu 2,66 vezes com terbinafina 5 60057 57888 Diminuiu 1,63 vezes com terbinafina 6 58774 58465 Diminuiu 1,95 vezes com terbinafina 7 58869 51143 Diminuiu 1,71 vezes com terbinafina 8 55663 51143 Diminuiu 3,04 vezes com terbinafina 9 57781 43970 Aumentou 1,08 vezes com terbinafina 10 56512 43536 Diminuiu 1,2 vezes com terbinafina 11 55727 44408 Diminuiu 1,06 vezes com terbinafina 12 54025 19682 Diminuiu 1,95 vezes com terbinafina 13 46523 38259 Diminuiu 44,5 vezes c