RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta tese será disponibilizado somente a partir de 30/03/2018. PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS (MICROBIOLOGIA APLICADA) Otimização da produção de D(-) ácido lático por Sporolactobacillus nakayamae e Lactobacillus delbrueckii utilizando subprodutos agro-industriais SUSAN MICHELZ BEITEL SUSAN MICHELZ BEITEL Tese apresentada ao Instituto de Biociências do Campus de Rio Claro, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Ciências Biológicas (Microbiologia aplicada). Rio Claro 2016 Otimização da produção de D(-) ácido lático por Sporolactobacillus nakayamae e Lactobacillus delbrueckii utilizando subprodutos agro-industriais Orientador: Prof. Dr. Jonas Contiero Rio Claro 2016 Tese apresentada ao Instituto de Biociências do Campus de Rio Claro, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Ciências Biológicas (Microbiologia aplicada). i Dedicatória Ao meu querido pai Jaime Beitel, dedico. ii ―Faça o que você pode, com o que você tem, no lugar onde você está‖ Theodore Roosevelt iii Agradecimentos Ao meu orientador Dr. Jonas Contiero, pela oportunidade do desenvolvimento desta pesquisa em seu laboratório, pela orientação e solicitude, pelos conhecimentos repassados e valores transmitidos, sugestões, incentivo e amizade. Às colegas do grupo de pesquisa do ―Ácido lático‖, e, sobretudo amigas Luciana e Daiane, pelas colaborações em várias etapas deste trabalho, pelos conhecimentos compartilhados, pelo carinho e amizade. Ao meu pai Jaime pela formação pessoal e educação, por ter me mostrado como o trabalho e dedicação edificam, pelo carinho e incentivo. Aos meus avós e irmã, pelo carinho e apoio. Á minha avó Eunice ―In Memorian‖ pelo carinho e atenção. Ao Instituto de Biociências da UNESP por fornecer infraestrutura necessária para este trabalho. À Braskem pela bolsa de doutorado concedida. À Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo pelo auxílio financeiro (Processo n°: 10/52416-8). A todos que colaboraram direta ou indiretamente durante esses anos de desenvolvimento do doutorado, meu reconhecimento. iv RESUMO O ácido lático tem sido alvo de ampla investigação devido a sua ampla possibilidade de aplicações, despertando interesse em vários setores biotecnológicos e industriais. Pode ser obtido através de via química ou fermentativa; a vantagem da produção por fermentação é a obtenção de isômeros opticamente puros. Um dos principais interesses é reduzir os custos de produção, assim como desenvolver processos que não gerem resíduos. Os substratos utilizados na fermentação e a etapa de purificação do ácido lático são os principais responsáveis pelo custo do processo. Para tanto, o objetivo do atual estudo foi selecionar substratos disponibilizados por baixo custo, assim como estudar as melhores condições de fermentação que propiciem uma eficiente produção de D(-) ácido lático por cepas selvagens de Sporolactobacillus nakayamae e Lactobacillus delbrueckii. Os componentes dos meios de cultivo, assim como suas respectivas concentrações foram selecionados a partir de planejamentos experimentais. Por sua vez, foi avaliada a influência de diferentes agentes neutralizadores de pH na fermentação. Também foram estudados os parâmetros fermentativos como pH, temperatura, agitações e proporções de inóculo. A fim de elevar os níveis de produção e produtividade, foram estudadas diferentes estratégias de bateladas alimentadas. Foi desenvolvido um processo de purificação utilizando recursos de baixo custo. A partir do meio de cultivo composto de açúcar cristal, farinha de amendoim e Tween 80, S. nakayamae foi capaz de produzir 112,93 g/L de D(-) ácido lático. A purificação e recuperação do ácido lático foram realizadas por filtração do meio fermentado em carvão e celite, em seguida passado por resina de troca catiônica. Essa técnica revelou-se eficiente na remoção de açúcares e proteínas assim como na recuperação do ácido lático. Ainda utilizando S. nakayamae outro meio de cultivo foi estudado, a partir da mesma fonte de carbono, porém usando extrato de levedura (subproduto da produção de etanol) como fonte de nitrogênio e adicionado de alguns sais. Após estudar as melhores condições de cultivo em biorreator (pH 6.0, 35 ºC, 20% de volume de inóculo e 125 rpm), alcançou-se uma produção de 122,41 g/L de ácido lático e produtividade de 3,65 g/L.h por fermentação em batelada alimentada multi pulsos, em 54 horas. O agente controlador de pH selecionado foi NaOH, que colabora evitando a geração de resíduos durante a purificação. A produção de D(-) ácido lático foi estudada por um segundo micro-organismo (L. delbrueckii), desenvolvendo-se um processo fermentativo eficiente, de baixo custo, a partir do qual os mais altos níveis de produção (162 g/L) foram alcançados. O meio de fermentação foi composto de melaço de cana-de açúcar, água de maceração de milho e alguns sais, tais resíduos foram utilizados sem necessidade de v hidrólise. A fermentação foi conduzida por 48 horas em batelada alimentada multi pulsos a 39 ºC, 150 rpm, 25% de inóculo, pH 5.5, controlado por Ca(OH)2 que, além de ser economicamente viável, apresenta a vantagem de não aumentar drasticamente a pressão osmótica do meio de cultivo. A produção de D(-) ácido lático de elevada pureza óptica a partir dos resíduos agro-industriais utilizados, é uma alternativa econômica para o processo em escala industrial. Palavras-chave: D(-) ácido lático. Delineamento experimental. Fermentação. Batelada alimentada. Sporolactobacillus nakayamae. Lactobacillus delbrueckii. vi ABSTRACT Lactic acid has been extensive studied due its wide range of applications, receiving more attention in several industrial and biotechnological fields. This molecule can be obtained by chemical or fermentative pathways; only by fermentation the optically pure isomers could be achieved. Reduce the fermentation cost as well residues generate is a real need. The substrates used in fermentation and the purification step are the mainly responsible for the costs of the process. Therefore, the aims of this study were selected affordable substrates and study the fermentation conditions to improve D(-) lactic acid production by wild strains of Lactobacillus delbrueckii and Sporolactobacillus nakayamae. In order to evaluate the components media and its ideal concentration, experimental designs were applied. The influence of temperature, pH, inoculum percentage, agitation conditions and pH controlling agents were also verified. Moreover fed-batch feeding strategies were studied in order to increase production and productivity levels of D(-) lactic acid. A purification technic based in low-cost material was developed. D(-) lactic acid concentration of 112.93 g/L was obtained using commercial sucrose, peanut flour, and Tween 80 by S. nakayamae. The purification and recovery of D(-) lactic acid from this fermentation medium were performed using filtration on activated carbon, followed by celite and cation resin exchange. This approach showed a high efficiency in protein and sugar removal as well in D(-) lactic acid recovery from the fermentation medium. Other culture media was developed using S. nakayamae, achieving 122.41 g/L of D(-) lactic acid and 3.65 g/L.h of productivity by multi-pulse fed-batch fermentation at 54 h, using initial media containing yeast extract (byproduct of alcohol production), crystallized sugar and salts. The best parameters fermentation setting to this process were pH 6.0, 35 °C, 20% inoculum and 125 rpm. The pH agent controller selected was NaOH, which is interesting to avoid future waste generation on purification step. The production from other microorganism (L.delbrueckii) was studied, describing an efficient and very low cost process, using molasses and corn step liquor as substrate. A maximum D(-) lactic acid concentration of 162 g/liter was achieved at 48 hours of fermentation, the productivity at this point is 3.37 g/L.h. It was found that the optimal conditions to run this process were 39 ºC, 150 rpm, 25% size of inoculum (v/v) and pH 5.5 controlled by addition of Ca(OH)2, which provides economy to process and prevent cell stress that could be caused by high osmotic pressure of the culture media. The production of D (-) lactic acid of high vii optical purity from agro-industrial wastes is an economical alternative process at industrial scale. Keywords: D(-) lactic acid. Experimental design. Fermentation. Fed-batch fermentation. Sporolactobacillus nakayamae. Lactobacillus delbrueckii. viii Lista de figuras Figura 1. Estruturas químicas de Fischer dos enantiômeros de ácido lático ............................ 18 Figura 2. Vias catabólicas das bactérias ácido láticas: a) Homofermentativa B) Heterofermentativa.. ................................................................................................................. 19 Figura 3. Métodos de produção de ácido lático a) Síntese química e b) Fermentação microbiana.. .............................................................................................................................. 21 Figura 4. . Número de publicações relacionadas com a produção de ácido lático via fermentativa.. ............................................................................................................................ 21 Figura 5. Previsão de Rendimento Global do mercado de Ácido lático, 2014-2022 (USD Milhões). ................................................................................................................................... 22 Figura 6. Vias de síntese de PLA. ............................................................................................ 23 Figura 7. Aplicações biotecnológicas do ácido lático .............................................................. 24 Figura 8. Demanda global de produção de biopolímero. ......................................................... 25 Figura 9. Capacidade de produção de Bioplástico. .................................................................. 26 Capítulo I Figure 1. Pareto graph for D(-) lactic acid production. a) PBED; b) FFD ............................... 58 Figure 2. Response surface for lactic acid production by S. nakayamae showing the interaction between peanut flour and commercial sucrose ....................................................... 59 Figure 3. Response surface for lactic acid production by S. nakayamae showing the interaction between Tween 80 and commercial sucrose .......................................................... 60 Figure 4. Response surface for lactic acid production by S. nakayamae showing the interaction between Tween 80 and peanut flour ....................................................................... 61 Capítulo II Figure 1. Response surface for lactic acid production by S. nakayamae. The interactions between (a) Yeast extract and Crystallized sugar, (b) Salts and Crystallized sugar and (c) Yeast extract and Salts. ............................................................................................................. 91 Figure 2. Time course of lactic acid and residual sucrose concentration under the conditions of using different neutralizing agents ........................................................................................... 92 Figure 3. Effect of (a) temperature and (b) pH on D(-) lactic acid production and sucrose consumption by S. nakayamae. ................................................................................................ 93 Figure 4. Effect of (a) agitation and (b) inoculum size on D(-) lactic acid production and sucrose consumption by S. nakayamae. ................................................................................... 94 ix Figure 5. Time courses of sucrose consumption, D(-) lactic acid production and cell growth in batch fermentation (a), pulse fed-batch (b) and multi-pulse fed-batch fermentation (c and d) by S. nakayamae. ...................................................................................................................... 95 Figur 6. Time courses of sucrose consumption, D(-) lactic acid production and cell growth in constant feed rate (a) and exponential fed-batch fermentation (b) by S. nakayamae ............... 96 Capítulo III Figure 1. The interaction of media elements on lactic acid production using RSM. a) Corn step liquor and Salts solution; b) Corn step liquor and sugar molasses and c) Salts solution and sugar molasses. ....................................................................................................................... 115 Figure 2. Effect of neutralizing agents on D(-) Lactic acid production and residual sugar content by fermentation process with molasses sugar (150 g/L), corn step liquor (65 mL/L) and salts solution (5 mL/L). .................................................................................................... 116 Figure 3. The effects of temperature (a) and pH (b) on lactic acid fermentation. .................. 117 Figure 4. The effects of agitation (a) and inoculum size (b) on lactic acid fermentation....... 118 Figure 5. Fed-batch fermentations of D(-) lactic acid by the L. delbrueckii. a and c) pulse; b) multi-pulse; d) continuous feed rate. ...................................................................................... 119 x Lista de tabelas Tabela 1. Micro-organismos do gênero Sporolactobacillus envolvidos na produção de D(-) ácido lático ................................................................................................................................ 34 Tabela 2. Micro-organismos do gênero Lactobacillus envolvidos na produção de ácido lático .................................................................................................................................................. 35 Capítulo I Table 1. Variables and their levels in lactic acid production under a PBED ........................... 62 Table 2. Design matrix for the fractional 25-1 factorial experiments, used to study the influence of 5 factors on S. nakayamae D(-) lactic acid production ........................................ 63 Table 3. Variables and their levels of lactic acid production under an RSM ........................... 64 Table 4. Influence of carbon sources on S. nakayamae lactic acid production, productivity and yield .......................................................................................................................................... 65 Table 5. Influence of nitrogen sources on S. nakayamae lactic acid production, productivity and yield ................................................................................................................................... 66 Table 6. PBED with coded values and experimental results for lactic acid production, productivity, yield and residual sugar concentration ................................................................ 67 Table 7. Fractional factorial design with coded and experimental results for lactic acid production, productivity, yield and residual sugar concentration ............................................ 68 Table 8. RSM design with coded values and experimental results for lactic acid production, productivity, yield and residual sugar concentration ................................................................ 69 Table 9. Purification parameters of the fermentation media .................................................... 70 Capítulo II Table 1. Variables and their levels for D (-) lactic acid production under a RSM ................... 87 Table 2. RSM design with real values and experimental results for lactic acid production, productivity, yield and residual sugar concentration ................................................................ 88 Table 3. ANOVA with estimated regression coefficients for D(-) lactic acid production ....... 89 Table 4. Comparison of D-lactic acid fermentation by S. nakayamae using different neutralization agents. ................................................................................................................ 90 Capítulo III Table 1. Culture conditions on study of the parameters effect on lactic acid production ...... 101 Table 2. Influence of carbon and nitrogen sources on D(-) lactic acid production, productivity and Yield by L. delbrueckii .................................................................................................... 103 xi Table 3. RSM design matrix with real/coded values and experimental results for lactic acid production, productivity, yield, and residual sugar concentration ......................................... 104 Table 4. ANOVA for the regression model with estimated regression coefficients for D(-) lactic acid production.............................................................................................................. 105 Table 5. Fed-batch fermentation strategies on D(-) lactic acid production ............................ 108 Anexo Table 10. ANOVA with estimated regression coefficients for D(-) lactic acid production ... 145 xii Lista de abreviaturas e siglas % Por cento ANOVA Análise de variância ATP Adenosina Trifosfato D(-) Levógiro D-LDH D-lactato Desidrogenase FFD Fractional Factorial Designs g Grama GYP Glucose, Yeast and Peptone h hora HPLC High Performance Liquid Chromatography L Litro L(+) Dextrógiro LDH Lactato Desidrogenase L-LDH L-lactato Desidrogenase LR Lactato Racemase mg miligrama mL Mililitros ºC Graus Celsius PBED Plackett-Burman Experimental Design PDLA Poli D- ácido lático PDLLA Poli DL- ácido lático pH Potencial hidrogeniônico PLA Polímero de Ácido Lático PLLA Poli L-ácido lático rpm rotação por minuto RSM Response Surface Methodology V volume Yp/s Rendimento produto substrato xiii Sumário 1 Introdução.......................................................................................................................... 15 2 OBJETIVOS...................................................................................................................... 17 2.1 Objetivo geral: ........................................................................................................... 17 2.2 Objetivos específicos: ................................................................................................ 17 3 Revisão da Literatura ........................................................................................................ 18 3.1 O ácido lático ............................................................................................................. 18 3.2 Polimerização do ácido lático .................................................................................... 22 3.3 Aplicações biotecnológicas do ácido lático e seu polímero (PLA) ........................... 24 3.4 Fatores que influenciam na produção de ácido lático ................................................ 27 3.5 Meio de cultivo para fermentação lática: Fontes alternativas de carbono e nitrogênio 28 3.6 Produção do ácido lático por fermentação ................................................................. 30 3.7 Neutralizadores de pH ............................................................................................... 31 3.8 Micro-organismos envolvidos na produção de ácido lático ...................................... 33 3.8.1 O gênero Sporolactobacillus ............................................................................... 33 3.8.2 O gênero Lactobacillus ....................................................................................... 34 3.9 Planejamento experimental como ferramenta na otimização de processos ............... 35 3.10 Extração e purificação do ácido lático ....................................................................... 36 4 Metodologia e Resultados ................................................................................................. 39 Capítulo I .............................................................................................................................. 40 High D(-) lactic acid levels production by Sporolactobacillus nakayamae and an efficient purification ........................................................................................................................ 40 Capítulo II ............................................................................................................................. 71 Environmentally friendly production of D (-) lactic acid by Sporolactobacillus nakayamae: Investigation of fermentation parameters and fed-batch strategies .............. 71 Capítulo III- Artigo submetido à revsita (a definir) ................................................................. 97 xiv Efficient conversion of agro-industrial wastes into D(-) lactic acid by fed-batch fermentation using Lactobacillus delbrueckii ................................................................... 97 5 Considerações finais ........................................................................................................ 120 Referências bibliográficas ...................................................................................................... 122 Anexo ..................................................................................................................................... 135 Artigo publicado (referente ao capítulo I) .......................................................................... 135 Material suplementar referente ao artigo I ―High D(−) lactic acid levels production by Sporolactobacillus nakayamae and an efficient purification‖ ............................................ 145 15 1 Introdução O ácido lático é uma das moléculas mais investigadas nos últimos tempos apresentando diversas aplicações na área médica, alimentícia, farmacêutica, ortodôntica, têxtil, entre outras (WEE et al., 2004). Grande atenção tem sido voltada para a produção do biopolímero de ácido lático (PLA). Diferentes polímeros podem ser construídos, apresentando características distintas direcionadas para determinadas aplicações. Isso é possível pelo fato de existirem dois isômeros da molécula de ácido lático, D(-) e L(+) (GHAFFAR et al., 2014). A proporção de cada isômero na constituição dos polímeros é responsável pela característica que o mesmo apresentará, polímeros resistentes ou maleáveis, duráveis ou biodegradáveis podem ser elaborados. O ácido lático pode ser obtido através de via química ou fermentativa, a vantagem da fermentação por micro-organismos é a obtenção de um produto opticamente puro, alcançado pela seleção de cepas homofermentativas, ou seja, que produzem apenas um tipo de isômero (L ou D), enquanto a rota química produz uma mistura racêmica de ácido. Além do mais, podem-se reduzir os custos de produção quando utilizados substratos de baixo custo no meio fermentativo, como resíduos agro-industriais; a seleção de resíduos que dispensam a etapa de hidrólise adiciona economia ao processo. Nesse sentido, esforços têm sido dirigidos no intuito de descobrir novas linhagens microbianas, que sejam eficientes em produzir níveis elevados de apenas um isômero de ácido lático, empregando-se substratos alternativos e de baixo custo. O Brasil é um país que domina a produção de muitas culturas, com acentuado crescimento no setor de agronegócios, e geralmente o processamento industrial dessas matérias primas geram diferentes tipos de resíduos agro-industriais, que podem ser utilizados como fonte de carbono e nitrogênio nos processos fermentativos. A produção de ácido lático tem sido reportada por diversos micro-organismos, incluindo bactérias, fungos filamentosos e leveduras (ILMÉN et al., 2013; SUN e ZHU, 2012, DING e TAN 2006). As bactérias láticas são as mais utilizadas, e diferentes processos fermentativos têm sido reportados. Cada linhagem de micro-organismo apresenta atividade metabólica em faixas específicas ótimas de pH e temperatura, que influenciam em fatores como atividade enzimática e permeabilidade da membrana microbiana, qual facilita a passagem dos nutrientes do meio e a saída de produtos, por exemplo. Outros parâmetros do processo fermentativo podem influenciar no desempenho dos micro-organismos; a agitação está intimamente relacionada com a homogeneidade do meio de cultivo, promovendo um 16 maior contato das células com os componentes do meio; por outro lado determinadas velocidades de agitação podem causar cisalhamento, assim como interferir no oxigênio disponível no sistema. A concentração de substrato também tem grande influência no processo. Elevadas concentrações de fonte de carbono podem causar repressão catabólica, inibindo a produção, enquanto baixas concentrações de substrato obviamente levam à conversão de pequenas quantidades de produto formado. As técnicas de bateladas alimentadas vêm solucionar esse impasse, uma vez que pode se manter uma baixa concentração de substrato no interior do reator, adicionando-se estrategicamente o substrato conforme a necessidade. Existem várias estratégias de alimentação, desde as mais simples como pulsos que podem ser aplicados manualmente, como as mais elaboradas a partir de softwares, onde são inseridos dados referentes à cinética fermentativa do micro-organismo utilizado, e o programa estima a quantidade necessária de suprimento de substrato necessário para o crescimento microbiano e a conversão em produto. Durante a fermentação, o ácido lático formado é responsável por baixar o pH do meio, o que pode interferir no metabolismo do micro-organismo, por isso se faz necessário o controle do pH por algum agente neutralizante (HONGO et al. 1986).. Vários controladores de pH podem ser utilizados, e a escolha deste no processo é muito importante, uma vez que o controlador associa-se ao ácido lático transformando-o em lactato, o tipo de lactato formado direcionará os processos subsequentes de purificação do ácido lático. O agente controlador de pH também esta intimamente relacionado com os custos do processo. O processo de downstream é uma etapa muito importante por apresentar expressiva contribuição referente aos custos finais de obtenção do produto, assim como a geração de resíduos. Diferentes técnicas de separação e purificação do ácido lático têm sido reportadas dependendo da constituição do meio fermentado final (GONZALEZ et al., 2006; TIMBUNTAM et al., 2008). GONZALEZ et al., 2006; TIMBUNTAM et al., 2008;. Diante da expressiva aplicabilidade industrial do D(-) ácido lático e da necessidade de se desenvolver processos de produção economicamente competitivos e ambientalmente amigáveis, este estudo tem como objetivo estabelecer as melhores condições para a produção de D(-) ácido lático pelos micro-organismos Sporolactobacillus nakayamae e Lactobacillus delbrueckii através de modificações no meio de cultivo e condições de fermentação. 120 4 Considerações finais Os micro-organismos S. nakayamae e L. delbrueckii foram capazes de produzir elevados níveis de D(-) ácido lático por fermentação. Quanto aos planejamentos experimentais, o Plackett-Burman e o fatorial fracionado foram úteis na seleção dos componentes significativos do meio de cultivo, porém observa-se que, esta técnica deve ser aliada ao bom senso do pesquisador, levando em consideração particularidades do processo e do metabolismo microbiano, a fim de interpretar corretamente os resultados. A metodologia de superfície de resposta apresentou-se muito eficiente na seleção das concentrações adequadas dos componentes do meio de fermentação. Foram apresentados dois perfis de produção distintos, um para cada micro-organismo. A metodologia de produção de ácido lático pelo S. nakayamae é baseada em um meio de cultivo mais puro, considerando o açúcar cristal e extrato de levedura utilizados como fonte de carbono e nitrogênio, respectivamente, apesar dessas fontes serem disponibilizadas por um custo acessível, ainda são mais dispendiosas que os resíduos agro-industriais. NaOH foi o controlador de pH utilizado neste processo, não é um dos controladores economicamente mais acessíveis porém oferece muita facilidade no processo por ser bastante solúvel, pode ser utilizado em altas concentrações, sem apresentar obstruções nas mangueiras que o conduzem até o interior do fermentador, assim como não aumentam demasiado o volume de trabalho do processo. Além disso, se for considerado um futuro processo de separação por eletrodiálise, o NaOH poderia ser reutilizado na fermentação. As condições de temperatura, pH e agitação estão de acordo com relatos da literatura para esta espécie e a estratégia de alimentação utilizada por um pulso oferece facilidade do processo. A técnica de purificação utilizada foi eficiente na separação dos resíduos do processo e recuperação do ácido lático, além de ser conduzida de forma simplificada utilizando materiais não onerosos. Portanto, trata-se de um processo que apresenta um custo moderado, porém compensado pela facilidade de condução como também no processo de downstream, por não apresentar muitas impurezas no meio fermentado final, facilita a purificação, assim como minimiza a geração de resíduos. Ainda para este micro-organismo, o meio de cultivo utilizando farinha de amendoim como fonte de nitrogênio é uma alternativa econômica, porém para este modelo de reator 121 foram apresentadas dificuldades na condução do processo uma vez que o meio de cultivo se torna bastante consistente, obstruindo mangueiras na coleta de amostras. Um segundo perfil de produção de ácido lático utilizando o L. delbrueckii como agente conversor apresenta uma produção mais econômica, baseada em resíduos agro- industriais, utilizando um neutralizador de pH Ca(OH)2 muito acessível economicamente. Este micro-organismo apresenta a uma maior velocidade de crescimento e produção e foi capaz de produzir níveis superiores de ácido lático em relação ao S. nakayamae. Contudo, a purificação deste meio fermentado pode ser mais complexa, por conter impurezas oriundas dos resíduos agro-industriais utilizados, e se considerar o método de purificação usualmente utilizado nas indústrias para separação do Cálcio, a geração de resíduos deve ser considerada. Conclui-se que, os dois perfis são interessantes e oferecem diferentes possibilidades, que podem ser aproveitadas de acordo com determinados interesses e estruturas específicas operacionais para uma produção em maior escala. 122 Referências bibliográficas ABDEL-RAHMAN, M. A.; XIAO, Y. T.; TASHIRO, Y.; WANG, Y.; ZENDO, T.; SAKAI, K.; SONOMOTO, K. Fed-batch fermentation for enhanced lactic acid production from glucose/xylose mixture without carbon catabolite repression. J. Biosci Bioeng. v.119, p.153- 158, 2015. 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