RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta tese será disponibilizado somente a partir de 27/07/2023. Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia EFEITOS DAS DIFERENTES SOLUÇÕES DE CONGELAÇÃO SOBRE A CRIOPRESERVAÇÃO DE CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS CANINAS BRUNA APARECIDA DOS SANTOS Botucatu, SP Julho – 2022 Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia EFEITOS DAS DIFERENTES SOLUÇÕES DE CONGELAÇÃO SOBRE A CRIOPRESERVAÇÃO DE CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS CANINAS Tese apresentada junto ao Programa de Pós-graduação em Biotecnologia Animal para obtenção do título de DOUTORA Bruna Aparecida dos Santos Orientadora: Profa. Dra. Fernanda da Cruz Landim Botucatu, SP Julho – 2022 Nome do autor (a): Bruna Aparecida dos Santos Título: EFEITOS DAS DIFERENTES SOLUÇÕES DE CONGELAÇÃO SOBRE A CRIOPRESERVAÇÃO DE CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS CANINAS BANCA EXAMINADORA Profa. Dra. Fernanda da Cruz Landim Presidente e Orientadora Departamento de Cirurgia Veterinária e Reprodução Animal, FMVZ - UNESP - Botucatu/SP Profa. Dra. Laura Leandro da Rocha Membro Departamento de Zootecnia, UFRPE - Recife/PE Profa. Dra. Fabiana Ferreira de Souza Membro Departamento de Cirurgia Veterinária e Reprodução Animal, FMVZ - UNESP - Botucatu/SP Prof. Dra. Flávia Karina Delella Membro Departamento de Biologia Estrutural e Funcional do Instituto de Biociências do Botucatu Prof. Dr. Mateus José Sudano Membro Departamento de Genética e Evolução /UFSCAR - São Carlos/SP Data da defesa: 27 de Julho de 2022. AGRADECIMENTOS Agradeço a Deus, pelo dom da vida, por todas as graças que todos os dias me presenteia, por me manter de pé e com saúde. A ti Senhor, toda honra e toda glória. Gratidão a minha família, meus pais Genivaldo e Maria, e minhas irmãs, Vanessa e Juliana, por todo amor, apoio, força, por sempre estarem ao meu lado apesar da distância, pelo incentivo e por confiarem que eu seria capaz. Sem vocês eu não teria chegado até aqui, o amor que sinto é imensurável. Ao meu namorado Carlos Eduardo, pelo amor, carinho, paciência, incentivo, companheirismo, por todos os momentos felizes e de cumplicidade, por todas as lágrimas que você não deixou cair, e por todas que você enxugou. Obrigada por segurar a minha mão e me fazer acreditar que ainda existem pessoas maravilhosas. Eu te amo! A todas minhas amizades, dentro e fora do meio acadêmico. Em especial a Nadja e Ana Beatriz. Quero agradecer por todo carinho, força, por me ouvirem, estarem ao meu lado, pelos momentos de descontração, por se fazerem família quando mais precisei, e aquecer meu coração para aguentar a saudade de casa. Agradeço a minha orientadora Fernanda Landim, por ter me acolhido no seu grupo de estudos, e dado a oportunidade de desenvolver esta pesquisa. Em seu nome, agradeço também a Omics Biotecnologia pelo apoio financeiro. A todos os funcionários da FMVZ (Andréia, Cibele, Felipe, Cabeça, Evandro, Camila) e todos os outros que fizeram parte dessa história. Aos colegas de laboratório, e todos que contribuíram para realização deste trabalho, em especial a Thaisy, Fernando e Wellington pelas contribuições, minha eterna gratidão, vocês foram essenciais. A Clínica Veterinária Toca dos Bichos, em especial ao Médico Veterinário Rodrigo e toda equipe, pela parceria na concessão do material biológico para uso nessa pesquisa, e por serem tão prestativos e receptivos. Quero deixar meu profundo agradecimento aos proprietários que consentiram a coleta, e a suas lindas cadelinhas. O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001. DEDICATÓRIA “À minha família, meus pais Genivaldo e Maria, e minhas irmãs Vanessa e Juliana. Vocês são o motivo de tudo, foi por vocês que eu cheguei até aqui. Com todo meu amor e gratidão, dedico. ” ““Conheça todas as teorias, domine todas as técnicas, mas ao tocar uma alma humana, seja apenas outra alma humana...” Carl Jung RESUMO SANTOS, B.A. EFEITOS DAS DIFERENTES SOLUÇÕES DE CONGELAÇÃO SOBRE A CRIOPRESERVAÇÃO DE CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS CANINAS. Botucatu – SP. 2022. 88p. Defesa de Doutorado – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus Botucatu, Universidade Estadual Paulista. Para utilizar as células-tronco mesenquimais caninas (CTMs) em terapias é imprescindível que sejam formados criobancos de armazenamento celular, sendo assim, a metodologia da criopreservação de CTMs necessita de estudos, uma vez que o efeito da congelação e dos agentes crioprotetores sobre as células obtidas de tecido adiposo canino ainda é pouco conhecido. Desta forma, o objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos de diferentes tipos de soluções na criopreservação das CTMs, sobre a estrutura, viabilidade, proliferação celular, ultraestrutura e expressão gênica, bem como no seu desenvolvimento pós-descongelação. Para isto, foram isoladas células-tronco de 12 cadelas. As amostras foram divididas em 5 tratamentos: não criopreservado (controle) = NCRIO; 90% SFB (Soro fetal Bovino) com 10% DMSO = SFB; Meio de cultivo DMEM/F12 alta glicose acrescido com 20% SFB e 10% DMSO = DMEM/F12; DMEM/F12 alta glicose, acrescido com 5%PVA, 5% de ITS, 5% de BSA e 10% DMSO = PVA/ITS/BSA e BambankerTM = BAM. Sendo que em todos foram utilizados o Dimetilsufóxido (DMSO) como agente crioprotetor principal. As células foram avaliadas antes da criopreservação, pós-descongelação imediata e após o recultivo. Foi realizada uma análise de custo das diferentes soluções. A viabilidade e apoptose celular foram avaliadas pelo teste de exclusão com o corante Trypan blue e anexina V; a proliferação celular, pela curva de crescimento; a ultraestrutura em microscópio eletrônico de transmissão, a expressão gênica por RT- qPCR e a análise de custo através de pesquisa de mercado. Todos os dados foram submetidos a análise estatística pelo software SAS versão 9.4. Os resultados mostraram que as CTMs criopreservadas com o meio comercial foi superior aos demais quanto ao número de células e a proliferação celular, mas foi similar aos grupos NCRIO e PVA/ITS/BSA quanto a viabilidade celular. Embora não tenham sido observadas alterações morfológicas significativas entre os tratamentos de criopreservação, a ultraestrutura celular variou de acordo com os componentes do meio, no qual a morfologia mais próxima da encontrada nas células frescas foi observada nos grupos PVA/ITS/BSA e BAM. A expressão gênica demonstrou que as células apresentaram diferenças quanto aos tratamentos para os transcritos CD44, TGFB1, CXCL12 e IDO. Neste estudo foi observado que embora o tratamento com a marca comercial tenha sido superior aos demais crioprotetores, as outras combinações de substâncias crioprotetoras testadas foram eficientes na criopreservação das CTMs caninas, sendo alternativas que podem ser utilizadas. Todos os tratamentos possibilitaram a retomada das funções celulares normais após a descongelação e recultivo. E as soluções autoformuladas são economicamente mais viáveis que a marca comercial. Esses resultados são importantes para o estabelecimento de protocolos de criopreservação de CTMs nessa espécie, pois aumentam as possibilidades de escolha da solução crioprotetora e também permite o uso de soluções com custos mais acessíveis e sem componentes contaminantes como o SFB. Palavras-chave: Criobancos; crioprotetores; viabilidade; tecido adiposo ABSTRACT SANTOS, B.A. EFFECTS OF DIFFERENT FREEZING SOLUTIONS ON CRYOPRESERVATION OF CANINE MESENCHYMAL STEM CELLS. Botucatu – SP. 2022. 88p. Defesa de Doutorado – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus Botucatu, Universidade Estadual Paulista. In order to use canine mesenchymal stem cells (MSCs) in therapies, it is essential that cryobanks of cell storage are formed, therefore, the methodology of cryopreservation of MSCs needs studies, since the effect of freezing and cryoprotective agents on the cells obtained from canine adipose tissue is still poorly understood. Thus, the aim of this study was to evaluate the effects of different types of solutions in the cryopreservation of MSCs, on the structure, viability, cell proliferation, ultrastructure and gene expression, as well as on their post-thawing development. For this, stem cells from 12 female dog were isolated. The samples were divided into 5 treatments: not cryopreserved (control) = NCRIO; 90% FBS (Fetal Bovine Serum) with 10% DMSO = FBS; High glucose DMEM/F12 culture medium plus 20% FBS and 10% DMSO = DMEM/F12; DMEM/F12 high glucose plus 5%PVA, 5% ITS, 5% BSA and 10% DMSO = PVA/ITS/BSA and BambankerTM = BAM. In all, Dimethylsuffoxide (DMSO) was used as the main cryoprotective agent. Cells were evaluated before cryopreservation, immediate post-thawing and after reculture. A cost analysis of the different solutions was carried out. Cell viability and apoptosis were evaluated by the Trypan blue dye and annexin V exclusion test; cell proliferation, by the growth curve; ultrastructure in transmission electron microscope, gene expression by RT-qPCR and cost analysis through market research. All data were submitted to statistical analysis using the SAS software version 9.4. The results showed that the MSCs cryopreserved with the commercial medium was superior to the others in terms of cell number and cell proliferation, but was similar to the NCRIO and PVA/ITS/BSA groups in terms of cell viability. Although no significant morphological changes were observed between the cryopreservation treatments, the cellular ultrastructure varied according to the components of the medium, in which the morphology closest to that found in fresh cells was observed in the PVA/ITS/BSA and BAM groups. The gene expression showed that the cells showed differences regarding the treatments for the CD44, TGFB1, CXCL12 and IDO transcripts. In this study, it was observed that although the ii treatment with the commercial brand was superior to other cryoprotectants, the other combinations of cryoprotective substances tested were efficient in the cryopreservation of canine MSCs, being alternatives that can be used. All treatments allowed the resumption of normal cell functions after thawing and reculture. And self-formulated solutions are more economically viable than branded. These results are important for the establishment of cryopreservation protocols for MSCs in this species, as they increase the possibilities of choosing the cryoprotectant solution and also allow the use of more affordable solutions without contaminating components such as FBS. Keywords: cryobanks; cryoprotectants; viability; adipose tissue iii LISTA DE FIGURAS Figura 1. Esquema das doadoras utilizadas no estudo.............................36 Figura 2. Demonstração das análises e desenho experimental................36 Figura 3. Células-tronco caninas, aderentes ao plástico e com morfologia fibroblastóide.............................................................................................37 Figura 4. Curva de viabilidade das CTMs caninas após a descongelação nas horas observadas (4, 12, 24, 48 e 96 horas).......................................44 Figura 5. Curva de crescimento das CTMs caninas após 144 horas.........45 Figura 6. CTMs caninas não submetidas a congelação NCRIO...............46 Figura 7. CTMs após a descongelação, tratamento SFB..........................47 Figura 8. CTMs após a descongelação, tratamento DMEM/F12...............48 Figura 9. CTMs após a descongelação, tratamento PVA/ITS/BSA...................49 Figura 10. CTMs após a descongelação, tratamento BAM.......................50 Figura 11. CTMs recultivadas, tratamento SFB .......................................51 Figura 12. CTMs recultivadas, tratamento DMEM/F12.............................52 Figura 13. CTMs recultivadas, tratamento PVA/ITS/BSA.........................53 Figura 14. CTMs recultivadas, tratamento BAM.......................................54 Figura 15. Expressão gênica das CTMs caninas......................................55 iv LISTA DE TABELAS Tabela 1. Imunofenotipagem para os marcadores de membrana de CTMs caninas........................................................................................................37 Tabela 2. Sequência de primers dos genes que foram utilizados na RT- qPCR..........................................................................................................40 Tabela 3. Comparação de médias para o efeito de tratamento..................43 Tabela 4. Comparação de médias para o efeito de criopreservação.........43 Tabela 5. Comparação de médias da viabilidade sobre os tratamentos.....44 Tabela 6. Proliferação das CTMs caninas após 144 horas.................................45 Tabela 7. Custo das soluções crioprotetoras..............................................57 v SUMÁRIO CAPÍTULO 1 ...................................................................................................... 1 1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA ................................................................ 2 2. REVISÃO DE LITERATURA ......................................................................... 4 2.1. Células-tronco mesenquimais (CTMs): importância e utilização..............4 2.2. A criopreservação celular........................................................................ 7 2.3. Crioprotetores ....................................................................................... 10 2.4. Métodos de avaliação de células criopreservadas................................16 3. HIPÓTESE E OBJETIVOS .......................................................................... 18 3.1. Hipótese ................................................................................................ 18 3.2. Objetivo geral ........................................................................................ 18 3.3. Objetivos específicos ............................................................................ 18 4. REFERÊNCIAS ........................................................................................... 18 CAPÍTULO 2 .................................................................................................... 29 ARTIGO CIENTÍFICO ...................................................................................... 30 Highlights........................................................................................................ 30 Abstract .......................................................................................................... 31 1. Introdução ................................................................................................... 32 2. Material e métodos ..................................................................................... 34 2.1. Reagentes, meios e protocolos..............................................................34 2.2. Aspectos éticos ..................................................................................... 34 2.3. Coleta,isolamento e cultivo das CTMs caninas ..................................... 34 2.4. Criopreservação das amostras e delineamento experimental................35 2.5. Caracterização das CTMs......................................................................37 2.6. Teste de viabilidade celular com Trypan blue….....................................37 2.7. Teste de viabilidade com anexina V…………...…………………………..38 2.8. Protocolo de transporte.......……………………………………..…….…...38 2.9. Teste de proliferação celular..................................................................38 2.9. Análise de ultraestrutura…………………………………………………….39 2.10. PCR quantitativa em tempo real (RT-qPCR)……………………………39 2.11. Análise de custo das soluções crioprotetoras.......................................41 2.12. Análise estatística.................................................................................41 vi 3. RESULTADOS...………………………………………………………………….42 3.1. Viabilidade celular…………………………………………………………...42 3.2. Protocolo de transporte……………………………………………………..44 3.3. Proliferação celular.................................................................................44 3.4. Ultraestrutura……………………………………………………...………….45 3.5. PCR quantitativa em tempo real (RT-qPCR)..........................................54 3.6. Análise de custo das soluções crioprotetoras........................................56 4. DISCUSSÃO………………………………………………………………………57 5. CONCLUSÃO……………………………………………………………………..65 6.AGRADECIMENTOS.....................................................................................65 7. REFERÊNCIAS.............................................................................................66 CAPÍTULO 1 2 1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA O Brasil ocupa o segundo lugar do ranking de países que mais possuem animais de estimação, e de acordo com dados levantados pelo IBGE e atualizados pelo Instituto Pet Brasil, em 2018 foram contabilizados no país 54,2 milhões de cães. O mercado pet e o número de adoções de cães (Canis lupus familiaris) estão crescendo consideravelmente, principalmente durante a pandemia do Coronavírus. O crescimento elevado deve-se à solidão que as pessoas sentem nesse período de isolamento social, e também ao fato delas permanecerem por mais tempo em casa (PET BRASIL, 2022). Em 2019, o setor faturou R$ 35,4 bilhões de reais, obtendo um crescimento de 3% em relação ao ano anterior. Esse faturamento está relacionado a indústria Pet Food, Pet Care, serviços veterinários e venda de animais. Vale salientar que a Cadeia Pet é um dos setores que mais gera emprego, sendo que, em 2018, aproximadamente 2 milhões de postos de trabalho foram gerados diretamente pelo setor (PET BRASIL,2022). Além dos fatos já mencionados, os cães de estimação possuem importância sentimental para seus tutores, sendo muitas vezes considerados como membro da família, estabelecendo uma interação homem-animal, e uma troca de cuidados e afetos (ALMEIDA; PAZ; OLIVEIRA, 2020). A preocupação do tutor com o bem-estar e a saúde dos animais tem crescido, e em casos de doenças ou de problemas de saúde provenientes da velhice, são priorizados tratamentos/terapias que forneçam uma maior qualidade e expectativa de vida, além da plena recuperação. Atualmente a terapia celular tem sido uma alternativa cada vez mais indicada pelos médicos veterinários para o tratamento de algumas doenças caninas, pelos resultados obtidos (ARMSTRONG et al., 2012). As células-tronco estromais mesenquimais (CTMs), são encontradas na maioria dos tecidos adultos, podendo ser isoladas da medula óssea, tecido adiposo e placentário. As CTMs possuem a habilidade de se diferenciar in vitro para adipócitos, mioblastos, osteoblastos e condrócitos. Além disso, conferem suporte a hematopoiese, tolerância imunológica, reconstituição funcional de determinados tecidos, bem como resistência à fibrose, a apoptose ou a hipertrofia (MORONI; FORNASARI, 2013). Adicionalmente, tem uma atividade imunossupressora, que evita efeitos adversos relacionados a rejeição entre o 3 material transferido e o hospedeiro (ZHOU H. et al, 2008). As CTMs secretam citocinas e fatores de crescimento que possuem atividade parácrina e autócrina, sendo este o principal mecanismo de ação que confere efeitos terapêuticos das células (GNECCHI; ZHANG; NI; DZAU, 2008). Apesar dos inúmeros benefícios, a produção de células e a criopreservação ainda possui entraves, uma vez que o efeito da congelação sobre as células obtidas de tecido adiposo canino ainda é pouco estudado. A criopreservação celular visa a manutenção das células vivas por um longo tempo sem a necessidade de múltiplas passagens, evitando a perda de características fenotípicas e alterações genéticas, previne contaminações, e mantém suas funções biológicas inativadas de forma controlada, evitando o comprometimento de suas funções após a descongelação (GINANI; SOARES; BARBOZA, 2012). Além disso, podem ser transportadas para utilização na terapia celular. O método mais utilizado para criopreservar células é o da congelação lenta, na qual uma queda gradativa da temperatura leva a formação de gelo extracelular promovendo uma desidratação progressiva da célula com aumento da concentração de soluto intracelular até um estado passível de solidificação. O grau de dano imposto à célula durante a congelação depende diretamente do tipo de crioprotetor utilizado e da curva de resfriamento empregada durante o procedimento (BENSON et al., 2008). Nestas condições, os índices de sobrevivência de células mamíferas só são aceitáveis na presença de substâncias crioprotetoras (HUBEL, 1997). Na produção de células-tronco em larga escala com a finalidade de utilizar nas terapias, é necessário que sejam feitos criobancos de CTMs, e que se desenvolvam protocolos de criopreservação eficientes, para viabilizar o armazenamento por longos períodos, sem comprometer a sua funcionalidade. Desta forma a escolha da solução ideal de substâncias com ação crioprotetora é uma etapa importante para o sucesso da técnica (HUNT, 2019). Existem poucos crioprotetores para a preservação de células somáticas, e apesar do glicerol, sacarose e trealose, não apresentarem toxicidade nas CTMs, ainda precisam ser mais investigados quanto ao uso (JANZ et al., 2012). Diante do que foi explanado, o objetivo do estudo foi avaliar os efeitos de diferentes soluções crioprotetoras, sobre a estrutura, viabilidade, proliferação e 4 expressão gênica. Propiciando a utilização de soluções autoformuladas sem a presença de agentes contaminantes como o SFB e que sejam mais viáveis economicamente. 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1. Células-tronco mesenquimais (CTMs): importância e utilização O termo célula-tronco mesenquimal (CTMs) surgiu a partir de observações in vitro que este tipo celular tem a capacidade de se diferenciar nas várias linhagens de tecidos mesodermais. Foram definidas como células-tronco adultas, multipotentes, e tem uma capacidade de renovação limitada, podendo se diferenciar em tipos celulares como osso, cartilagem, gordura e músculo (CAPLAN, 1991). Pela sua facilidade de divisão e proliferação as CTMs são responsáveis pela manutenção e renovação dos tecidos adultos, podem ser expandidas in vitro em meio de cultura (CAPLAN, 2005). Elas foram isoladas inicialmente da medula óssea, tecido adiposo e tecido placentário. As céulas-tronco derivadas do tecido adiposo possuem um potencial de diferenciação semelhante ao das derivadas da medula óssea, sendo a sua principal vantagem o fato de que podem ser coletadas com métodos minimamente invasivos, e são facilmente isoladas e cultivadas (STERODIMAS et al., 2010). As CTMs têm habilidades funcionais de diferenciação in vitro para adipócitos, mioblastos, osteoblastos e condrócitos, suporte de hematopoiese, tolerância imunológica, reconstituição funcional de determinados tecidos, resistência à fibrose, apoptose ou hipertrofia (MORONI; FORNASARI, 2013). Com uma atividade imunossupressora, que evita efeitos adversos relacionados a rejeição entre o material depositado e o hospedeiro (ZHOU H. et al, 2008). Estão presentes ou são atraídas para locais de lesão ou doença, e secretam fatores bioativos que são imunomoduladores e tróficos. Isto significa que a principal função das CTMs tanto endógenas, como transplantadas, é a produção de substâncias com efeito terapêutico, promovendo a reparação e regeneração tecidual e não a diferenciação em células do tecido lesado. Por este motivo, novamente Caplan sugeriu a modificação do nome para células 5 sinalizadoras medicinais, do inglês “medicinal signaling cells” – MSCs (CAPLAN,2017). A ação imunomoduladora das CTMs depende da imunorreatividade do ambiente no qual elas estão inseridas pois elas têm a capacidade de promover ou restringir a inflamação quando o sistema está imunossuprimido ou superativado. Essa modulação é realizada por ação tanto parácrina como autócrina através da produção de fatores de crescimento, citocinas, quimiocinas e vesículas extracelulares, que trabalham de forma associada com mecanismos que dependem do contato celular (GOMZIKOVA et al., 2019; GNECCHI, ZHANG; NI; DZAU, 2008). Com o avanço dos estudos em Medicina Veterinária, voltados para o desenvolvimento de terapias regenerativas, a terapia celular com o uso das CTMs, vem se mostrando eficaz e confiável para o tratamento de algumas doenças que acometem a espécie canina. Assim, sua utilização tem sido cada vez mais frequente e indicada pelos Médicos Veterinários. As novas intervenções terapêuticas com as células, se sobressaem as terapias tradicionais com moléculas farmacêuticas, pois possuem ação diferente por meio de mecanismos endógenos. Não acarretando em efeitos colaterais. (MOUNT et al.,2015). Há relatos na literatura de casos bem-sucedidos com a utilização das CTMs, que obtiveram resultados satisfatórios para o tratamento de algumas doenças. Foi feito um estudo para avaliar o uso das células do tecido adiposo para o tratamento da Osteoartrite (articulação do quadril) em cães, e os autores relataram que houve melhora significativa dos pacientes (VILAR et al., 2014). Outro estudo avaliou os cães acometidos por displasia coxofemoral, que receberam as CTMs derivadas da fração vascular estromal (FVS) autólogo, e do tecido adiposo (alogênico) da gordura iguinal. Os animais foram avaliados por um período de 3 meses e tiveram melhora nos escores clínicos em todos os pacientes, porém os cachorros que receberam a FVS, obtiveram melhores resultados do que as do tecido adiposo alogênicas (MARX et al., 2014). A Degeneração crônica do disco intervertebral (DDIV), também foi investigada, os cães foram tratados com CTMs da medula óssea da crista ilíaca, e foram feitos exames neurológicos e ressonância magnética. Os resultados 6 alcançados foram melhorias na sensação de dor, reflexos e ataxia, mas nenhuma alteração nas características da ressonância magnética foi observada (PENHA et al.,2014). Os cães com fístulas perianais (furunculose) refratárias à ciclosporina, receberam CTMs derivadas de linhagem de células-tronco embrionárias humanas MA09, xenogênicas. Foi feito um acompanhamento no período de 1 ano, mas com 3 meses já foi observado o fechamento completo das fístulas em todos os cães, porém em 2 animais ela foi recidiva após 6 meses. Apesar disso conseguiram ter uma redução de 50% no uso de ciclosporina em 5/6 cães aos 3 meses e 4/6 cães aos 6 meses (FERRER et al.,2016). Foi relatado que as CTMs derivadas da medula óssea podem melhorar o resultado funcional de equinos acometidos por tendinite e desmite, e comprovaram que a terapia é segura e tem um excelente resultado, pois os animais que receberam o tratamento retornaram ao seu nível anterior de atividade esportiva (RENZI et al., 2013). A revisão de literatura sobre a terapia com células-tronco para o tratamento da função renal de animais com lesão de isquemia-reperfusão renal (RIRI) mostrou que as CTMs de diversas fontes podem melhorar a função renal de animais RIRI, mas as células derivadas do tecido adiposo e do músculo foram as mais pesquisadas e possivelmente tem o maior potencial terapêutico (SHANG et al., 2021). A avaliação do efeito das CTMs caninas carregadas com paclitaxel (agente quimioterápico) no crescimento de linhas celulares de glioma canino e glioblastoma humano, mostraram que as células da medula óssea e do tecido adiposo foram capazes de captar e liberar paclitaxel, e que conseguiram inibir a proliferação da linha celular de glioma canino J3T e das linhas celulares de glioblastoma humano T98G e U87MG (BONOMI et al., 2017). Alguns estudos foram conduzidos para avaliar a aplicação das CTMs para o tratamento de doenças que acometem os gatos, como a gengivoestomatite crônica felina (ARZI et al., 2016), a asma (TRZIL; MASSEAU; WEBB, 2016), e a osteoartrite e cardiomiopatia felina (TAGHAVI; SHARP; DURAN, 2015). Todas as pesquisas supracitadas relataram que os felinos obtiveram uma melhora após a administração da terapia celular para estas doenças. 7 Estas pesquisas indicaram que as CTMs têm sido usadas com sucesso na clínica para regeneração de ossos, cartilagens, medula espinhal, cardíaca, rim e da bexiga. É notável que as células podem ser usadas para melhorar os cuidados de saúde dos animais que são acometidos por algumas doenças, aumentando o potencial regenerativo do próprio corpo ou desenvolvendo novas terapias (BAJADA et al., 2008). No entanto, para produzir as células-tronco em larga escala com a finalidade de utilizar nas terapias, é necessário que sejam feitos criobancos de CTMs, e que desenvolvam protocolos de criopreservação eficientes para espécie trabalhada em questão, que viabilizem o armazenamento por longos períodos sem comprometer a sua funcionalidade (HUNT, 2019). 2.2. A criopreservação celular Por definição a criopreservação é a conservação das células, tecidos ou qualquer outro material biológico, expostos a temperaturas negativas, fazendo- se o uso de substâncias químicas denominadas de crioprotetores, com o intuito de manter a amostra viável e em condições de utilização em situações posteriores (HUBEL, 1997). Essa técnica é bastante empregada em cultivo celular, para formação de bancos. As primeiras tentativas de criopreservação celular foram com hemácias, o sangue era congelado com hidroxietilamido ou pentamido e logo após eram conservados em Nitrogênio. No entanto, depois da descongelação as taxas de viabilidade eram muito baixas, então devido ao fracasso dessa técnica ela parou de ser utilizada (VALERI & RAGNO, 2005). O cultivo celular por períodos prolongados pode ocasionar uma perda de características fenotípicas e alterações genéticas. Então uma das finalidades da criopreservação é a manutenção das células congeladas em bancos, diminuindo seu metabolismo, devido a diminuição da temperatura, retardando e prevenindo essas alterações, otimizando o uso desse material em momentos posteriores. (MORAES; AUGUSTO; CASTILHO, 2007). Outro fator importante da criopreservação é impedir a senescência durante longos períodos de cultivo. A célula atinge a senescência quando há um encurtamento dos telômeros e o bloqueio do ciclo celular. Quando crescem de 8 forma acelerada in vitro, o encurtamento dos telômeros pode aumentar até chegar em um platô, causando uma instabilidade cromossômica generalizada o que promove uma apoptose em massa, ou seja, as células morrem (LLOYD, 2002). É necessário observar as diferenças entre os tipos celulares, já que as células de uma determinada espécie e ou tecido podem responder de forma diferente a um protocolo de criopreservação, por que possuem disparidade quanto a sua composição física e biológica, como por exemplo, a permeabilidade da membrana e razão superfície/volume, e isso acaba acarretando problemas com a viabilidade e as funções metabólicas das células. Diante disso, observa- se a necessidade de ajustar o protocolo de criopreservação de acordo com os tipos celulares de interesse (HUNT, 2019). O aperfeiçoamento da técnica de criopreservação é tão importante quanto a melhora do processo de cultivo celular, para que se obtenha um produto final que seja consistente e de máxima qualidade. Quando a criopreservação não é feita de maneira adequada pode haver uma variação de linhagem para linhagem das células, ter uma queda significativa no rendimento celular, redução das funções celulares, e de forma não intencional, produzir uma subpopulação de células que tenham diferenças genéticas e epigenéticas das CTMs de origem (HUNT, 2019). Os cuidados para realizar a criopreservação vão além de se obter um produto final com boa viabilidade e que consiga ser expandido após o congelamento. Existem consequências que precisam ser levadas em consideração, principalmente para o uso em terapias. Foi verificado que a presença de células apoptóticas e necróticas no produto final aplicado no paciente pode provocar uma resposta inflamatória ou induzir uma reação imunológica anormal (HOTCHKISS et al., 2009). Intervenções são necessárias durante a criopreservação das CTMs, para enfraquecer a ativação da via de coagulação. Onde, podem ser desenvolvidos novos protocolos com crioprotetores diferentes, e que incluam a administração de anticoagulantes genéricos, ou inibidores genéticos para fator tecidual, com o objetivo de reduzir a probabilidade de tromboembolismo associado a terapia com CTMs (TATSUMI et al., 2013). É uma estratégia eficaz para melhorar a qualidade 9 das CTMs descongeladas, tanto no que se diz respeito a produção, quanto ao desenvolvimento e aplicação dessas células nas terapias. Outra questão levantada, é a temperatura de criopreservação e o período de tempo de conservação após a congelação. Quanto a temperatura, geralmente as células são congeladas em nitrogênio líquido há -196ºC, ou armazenadas em ultrafreezers há -80ºC. Foi feita uma pesquisa com células da polpa dentária criopreservadas por 6 meses nas duas temperaturas (-196ºC e -80ºC) e constataram que o resultado é semelhante, e que a capacidade de diferenciação celular foi idêntica nos dois grupos (WOODS et al., 2009). Em relação ao tempo ideal de criopreservação, PAPACCIO et al. (2006) estudaram a criopreservação de células derivadas da polpa dentária, que foram mantidas criopreservadas pelo período de 2 anos, após a reconstituição apresentaram capacidade de diferenciação em osteoblastos e integridade celular sem alterações, mostrando que as características celulares foram mantidas após um longo período de congelação. Um estudo com células de tecido adiposo canino, avaliou os efeitos da criopreservação após o período de 1 ano, e concluíram que as CTMs conservaram sua morfologia semelhante a fibroblastos, com positividade de fosfatase alcalina e expressão de marcadores (MARTINELLO et al., 2011). Também foi avaliado o período de criopreservação de células do tecido adiposo por 6 meses, e os autores relataram que as células não tiveram perda de potencial proliferativo ou de diferenciação (GONDA et al., 2008). Outros autores estudaram o período de criopreservação por 30 dias (GINANI; SOARES; BARBOZA, 2012; TEMMERMAN et al., 2010; VASCONCELOS et al., 2011) e não constataram diferenças significativas na proliferação e na capacidade de diferenciação celular. OLIVEIRA et al. (2020) ao avaliar as células provenientes de catetos (Pecari tajacu) criopreservadas por 2 semanas, obtiveram os mesmos resultados que os autores supracitados. O que leva a concluir que o tempo de criopreservação tanto curto quanto longo, não afeta as características biológicas das células-tronco. O método de criopreservação mais utilizado para células de mamíferos é o da refrigeração lenta (BOMHARD et al., 2016; FUJIKAWA et al., 2017). Na qual ocorre uma queda gradativa da temperatura, levando a formação de gelo extracelular, promovendo uma desidratação progressiva da célula com aumento 10 da concentração de soluto intracelular até um estado passível de solidificação. O grau de dano imposto à célula durante o congelamento vai depender diretamente do tipo de crioprotetor utilizado, e da curva de resfriamento empregada durante o procedimento (BENSON et al., 2008). Se o processo da congelação for muito lento, pode ocorrer algumas implicações nas mitocôndrias e no retículo endoplasmático, por causa da desidratação irreversível causada na célula. Entretanto, se o congelamento for muito rápido, as células não passarão pela desidratação de forma adequada, e a água intracelular residual poderá formar cristais de gelo, que pode ocasionar um comprometimento das organelas. Uma taxa ótima de resfriamento foi preconizada para as células de mamíferos que é de -1 ºC/min (GURRUCHAGA et al., 2019). Para atingir essa velocidade de temperatura ideal, foi desenvolvido o sistema Mr. Frosty (Mr. Frosty™ Freezing Container) um suporte para colocar os tubos criogênicos, que contém álcool isopropílico, no qual o mesmo fica localizado em baixo do recipiente, e é responsável por permitir que a velocidade de arrefecimento ideal seja alcançada, chegando a uma taxa de resfriamento de 1°C/min (LEÓN- QUINTO et al., 2014). Nestas condições, os índices de sobrevivência de células mamíferas só são aceitáveis na presença de substâncias crioprotetoras (HUBEL, 1997). 2.3. Crioprotetores Os agentes crioprotetores são essenciais para a criopreservação de células e tecidos, pois sem a sua utilização, o congelamento seria uma prática inviável. Agem diminuindo os danos causados no processo de criopreservação lenta. Essas substâncias químicas tem uma ação coligativa com as moléculas de água, essa função é de extrema importância para evitar que se formem cristais de gelo intracelular, e para que reduza os danos causados pelas altas concentrações dos solutos presentes na suspensão das células, evitando assim, a desidratação das proteínas e lesões na membrana plasmática (SILVA; RODRIGUES; SILVA, 2017). Alguns aspectos devem ser levados em consideração para escolha do crioprotetor ideal, pois a proteção oferecida pelo mesmo vai depender de alguns 11 fatores, como a concentração, temperatura de exposição, duração da exposição, a concentração usada na adição e remoção do crioprotetor, o tampão osmótico usado durante sua remoção e a taxa de resfriamento e aquecimento, devem ser considerados durante a otimização do processo de criopreservação (ELLIOTT; WANG; FULLER, 2017). Existem dois tipos de crioprotetores: os permeáveis ou intracelulares, e os não permeáveis ou extracelulares. Os permeáveis são aqueles que podem passar pelas membranas celulares, pois são substâncias químicas que possuem uma massa molecular baixa. São ausentes de carga residual, e possuem alta solubilidade em meio aquoso, o que facilita sua entrada na célula. Fazem ligações de hidrogênio com as moléculas da água, além de prevenir a exposição das células a elevadas concentrações de eletrólitos (LEÓN-QUINTO et al., 2011). Nesse grupo temos: o glicerol, etilenoglicol (EG), 1,2-propanodiol e dimetilsulfóxido (Me2SO ou DMSO) (HUNT et al., 2011). A eficácia desses crioprotetores dependerá da temperatura, da permeabilidade e do tipo de célula, além de sua toxicidade química (HUNT, 2019). Os não permeáveis ou extracelulares, agem de uma forma diferente, provocando o aumento da osmolaridade do meio extracelular, removendo a água do interior das células para o meio extracelular, impedindo a formação de cristais de gelo em seu interior durante a congelação. Eles são macromoléculas, e não penetram nas células por causa do seu alto peso molecular. Entre eles estão: o hidroxietilamido, polivinilpirrolidona, soro fetal bovino, trealose, frutose, sacarose e glicose. Geralmente são utilizados por causa da sua baixa toxicidade (HUNT et al., 2011; RODRIGUES et al., 2008). Durante a criopreservação as células são submetidas a condições extremas como choque frio, estresse osmótico, toxicidade do crioprotetor, formação de gelo intracelular e estresse oxidativo (PEGG, 2015). O soro fetal bovino (SFB) vem sendo utilizado como crioprotetor extracelular para sanar essas limitações e melhorar a eficiência do congelamento (SANG et al., 2021). O SFB funciona como um tampão, tem ação antioxidante, que é dada através das ligações das moléculas, fazendo com que as membranas se estabilizem e consequentemente diminua a formação de gelo extracelular, a desidratação da célula e também minimiza a concentração de solutos durante o congelamento 12 (LEÓN-QUINTO et al., 2011). Na composição do SFB podem ser encontradas: enzimas, hormônios, proteínas de transporte, de adesão, fatores de crescimento, citocinas, ácidos graxos, lipídios, vitaminas, carboidratos e nitrogênio de origem não proteica e albumina (BRUNNER et al., 2010). Por causa da sua constituição, ele é muito utilizado na proliferação das células como meio de cultivo após o descongelamento, pois os seus componentes estimulam o crescimento celular e ajudam na recuperação de suas funções (LEE et al., 2012). Outro fator importante do SFB é a presença da albumina, uma macromolécula, que é um dos principais componentes do soro, tem uma importante participação no controle da pressão osmótica e nutrição, protegendo o dano celular, pois impede a formação dos cristais de gelo durante a criopreservação (SMAGUR et al., 2013). Entretanto, o uso do soro tem alguns entraves que preocupam e trazem riscos, por causa da sua composição indefinida, variações entre lotes e pelo seu potencial de contaminação. Essas variações entre lotes podem levar a resultados inconsistentes e aumentar o tempo e o custo envolvidos na triagem de adequação do lote para cultura in vitro. E quanto a contaminação, o soro pode se tornar um contaminante biológico se tiver príons ou vírus, que podem causar reações imunes, zoonoses ou contaminação cruzada entre espécies (MANNELLO; TONTI, 2007). Por isso é importante que sejam avaliados outros tipos de crioprotetores para substituição do SFB. Foi feita uma pesquisa com objetivo de substituir o SFB pela albumina sérica humana, na criopreservação de células-tronco de espermatogônias murinas, e concluíram que a utilização de 5% de albumina sérica humana é um potencial substituto do SFB para a criopreservação, com propriedades comparáveis (SANG et al., 2021). O dimetilsulfóxido (DMSO) é o crioprotetor mais utilizado em criopreservação de células e tecidos, geralmente é usado sozinho ou em combinação com outros crioprotetores. Ele é um solvente utilizado na indústria, composto por um grupo sulfóxido hidrofílico e dois grupos metila hidrofóbicos, e possui uma grande capacidade de absorção de umidade, consegue se misturar com os ácidos nucléicos, carboidratos, lipídeos e proteínas sem alterar de forma 13 irreversível a configuração das moléculas. Apresenta uma ligação covalente entre o enxofre e o oxigênio, (CASTRO et al., 2011). O DMSO atravessa a membrana celular formando pontes de hidrogênio com as moléculas de água presente no citosol, o que leva a diminuição do ponto de congelamento da água. Por tanto, a formação de cristais de gelo dentro da célula diminui e a integridade das membranas é conservada (CETINKAYA et al., 2014). Para a maioria das células somáticas de mamíferos, sua utilização é recomendada na concentração de 10%, pois garante uma alta viabilidade na pós-descongelação. Vários estudos que utilizaram essa concentração comprovam essa eficiência (LIU et al., 2008; BAHARI et al., 2018; PEREIRA et al., 2019; LI et al., 2009). Mas apesar de seus benefícios como crioprotetor, o DMSO apresenta uma toxicidade que traz uma preocupação com a sua utilização. MOTTA et al. (2010) relataram que o seu uso pode desencadear náuseas nos pacientes, dor de cabeça, hipotensão, e foi visto também que promove uma alteração química nas células como a produção de radicais livres que levam a lesão celular e a sua inviabilidade. Também transporta fatores indutores de apoptose e induz a formação de poros na membrana plasmática (NOTMAN et al., 2006). Por estes motivos é sugerido que o DMSO seja usado em combinação com outros crioprotetores extracelulares, ou com antioxidantes para minimizar esses efeitos tóxicos, pois a associação acelera o processo de desidratação celular e equilibra a citotoxidade e os possíveis danos causados na célula (SOLOCINSKI et al., 2017). Essa problemática tem feito alguns pesquisadores buscarem soluções para substituir o DMSO completamente, ou para diminuir seu uso. Um estudo com criopreservação de fibroblastos bovinos e de células do cumulus, testou a eficácia da Poli - L -lisina carboxilada (CPLL) como crioprotetor alternativo, para ser usado como possível substituto do DMSO. Os resultados mostraram que a CPLL pode substituir o DMSO como material crioprotetor convencional, pois obteve melhor proliferação, entre outros resultados significativos (FUJIKAWA, 2017). Na literatura encontram-se outras pesquisas envolvendo o uso de crioprotetores para células tronco de algumas espécies de animais e também em 14 humanos. DUAN; LOPEZ (2016) estudaram o efeito da criopreservação em CTMs caninas do tecido adiposo subcutâneo e infrapatelar, utilizando como crioprotetor (10% DMEM/F-12, 10% DMSO e 80% FBS). Observaram que não houve diferença na expansão e na multipotencialidade das células nos dois tecidos. Uma pesquisa feita com células do tecido adiposo de camundongos, criopreservadas com SFB e com 10% de DMSO por 30 dias, mostrou um padrão de crescimento celular ascendente em ambos os grupos (criopreservados e não criopreservados). Adicionalmente não teve diferença significativa, em relação a viabilidade celular e danos nucleares entre os grupos estudados (GINANI; SOARES; BARBOZA, 2012). Foi avaliado o efeito da criopreservação (10% de DMSO) na morfologia, viabilidade, expressão gênica e proporção relativa de marcadores de superfície de CTMs em células derivadas de tecido adiposo, medula óssea e polpa dentária de rato, e viram que a criopreservação reduziu significativamente o número de células viáveis na medula óssea e populações de células da polpa dentária, mas não teve efeito sobre as células do tecido adiposo (DAVIES et al., 2014) Avaliaram e otimizaram um meio de congelamento para criopreservação de células somáticas de cateto, onde um grupo foi criopreservado em 10% de DMSO com 10% de SFB, e o outro com 10% de DMSO e 50% de SFB, em ambos os grupos foi adicionado 0,2 M de sacarose. Não houve diferenças significativas quanto as variáveis avaliadas, porém a atividade proliferativa foi menor no tratamento com (10% de DMSO, 10% de SFB e 0,2 M Sacarose), mostrando que o crioprotetor com 50% de SFB foi mais eficiente para as células da espécie estudada (OLIVEIRA et al., 2020). Ao estudarem a congelação lenta de células fetais e adultas de Lince Ibérico (Lynx pardinus), observaram que a solução crioprotetora composta de DMEM, SFB, 10% DMSO e 0,2 M de sacarose mostrou resultados positivos, com taxas de viabilidade acima de 80% após a criopreservação, evidenciando a eficiência da utilização de um dissacarídeo (sacarose), e da combinação de crioprotetores extra e intracelulares (LEÓN-QUINTO et al., 2014). Em um estudo de Criopreservação de células e tecidos de cartilagem, foi investigado o efeito da vitrificação e do congelamento lento na viabilidade celular e tecidual. As células foram vitrificadas e congeladas em uma solução composta 15 de etilenoglicol, ficoll e sacarose. Os resultados não revelaram diferença significativa entre as taxas de viabilidade e da atividade proliferativa das células da cartilagem criopreservadas usando os dois métodos. (CETINKAYA; ARAT, 2011). Pesquisadores avaliaram o efeito de alguns crioprotetores na viabilidade de células endoteliais da córnea humana, que foram: Cellbanker 2, BambankerTM, KM Banker, Stem-Cellbanker, Bambanker hRM, ReproCryo DMSO Free RM, Opti-MEM + 10% DMSO + 10% SFB. O tratamento com o Bambanker hRM se destacou uma vez que as células cresceram de maneira semelhante ao controle não criopreservado (OKAMURA et al.,2019). A descongelação e a retirada dos agentes crioprotetores da célula, é um fator que deve ser levado em consideração, uma vez que o método utilizado para o aquecimento pode ter um impacto significativo na recuperação celular, e se for feito de maneira inadequada pode danificar as células (HUNT, 2019). Então o reaquecimento deve ser feito rapidamente, para diminuir o tempo de exposição a concentrações de solutos prejudiciais à medida que o gelo derrete durante o reaquecimento, e para evitar os possíveis danos causados pela recristalização do gelo intracelular (LEWIS et al., 2016). O método mais utilizado para a descongelação das CTMs tem sido o aquecimento rápido através do banho termostático a 37°C, pois é eficaz e de simples execução. Logo após as células são lavadas com uma solução salina para a eluição dos crioprotetores e podem ser avaliadas de acordo com a finalidade desejada (LECCHI et al., 2016). 2.4. Métodos de avaliação de células criopreservadas Alguns métodos são utilizados para avaliar o efeito que a criopreservação causa nas células, um dos mais usuais é o teste de exclusão do corante Trypan Blue. Ele determina o número de células viáveis presentes em uma suspensão de células, o que proporciona a determinação da viabilidade celular. Parte-se do princípio de que as células vivas possuem membranas celulares intactas que excluem o corante, ou seja, ele não consegue penetrar na célula, enquanto nas células mortas o corante consegue entrar e a mesma fica azul, identificando que 16 ela está morta. Neste teste, uma suspensão de células é simplesmente misturada com corante e então examinada visualmente através do microscópio para determinar se as células o absorvem ou excluem (STROBER, 2015). O teste usado para detecção de células apoptóticas é o da anexina V e iodeto de propídio, por meio da citometria de fluxo, que possibilita avaliar a viabilidade celular. A análise da anexina possibilita a detecção das fases iniciais de apoptose antes da perda da integridade da membrana celular e permite medir a cinética da morte apoptótica em relação ao ciclo celular (VERMES et al., 1995). Nos estágios iniciais da apoptose ocorrem mudanças na superfície celular, uma dessas alterações da membrana plasmática é a translocação da fosfatidilserina do lado interno da membrana plasmática para a camada externa, pela qual fica exposta na superfície externa da célula. A anexina V é uma proteína cálcio dependente de ligação a fosfolipídios com alta afinidade para fosfatidilserina (VERMES et al., 1995). A anexina é usada como uma sonda sensível para exposição de fosfatidilserina sobre a membrana celular. Em células normais a fosfatidilserina está localizada na região interna da membrana plasmática. No início do processo de apoptose é translocada para a região externa da membrana, ficando exposta a marcadores celulares como a anexina V, e a sua translocação para a superfície externa da célula não é exclusiva da apoptose, mas ocorre também durante a necrose celular (VERMES et al., 1995). A diferença entre essas duas formas de morte celular programada é que durante os estágios iniciais da apoptose a membrana celular permanece intacta, enquanto no exato momento em que ocorre a necrose a membrana celular perde sua integridade e torna-se permeável. Portanto, a medição da ligação da anexina V à superfície celular como indicativo de apoptose deve ser realizada em conjunto com um teste de exclusão de corante para estabelecer a integridade da membrana celular, onde é utilizado o Iodeto de propídio, que tinge as células necrosadas, permitindo a diferenciação entre os dois processos. O teste discrimina células intactas, células apoptóticas e células necróticas. Em comparação com os testes tradicionais existentes, o ensaio da anexina V é sensível e fácil de realizar (VERMES et al., 1995). Outra análise importante é a de ultraestrutura, ao qual denomina-se como o estudo das estruturas celulares que são muito pequenas e consequentemente 17 não podem ser observadas com o microscópio óptico, e mostra a estrutura detalhada de uma célula, tecido, ou órgão, que pode ser observada por microscopia eletrônica de transmissão, varredura e de super resolução (BRIEGER, 1963). Por tanto, o desenvolvimento de técnicas de seccionamento ultrafino possibilitou um estudo sistemático da organização ultraestrutural das células (SJÖSTRAND, 1956). O microscópio eletrônico de transmissão é bastante utilizado para análise de materiais biológicos por que mostra com alta definição as imagens intracelulares, permitindo a observação da morfologia celular, aspectos gerais das organelas, a organização molecular de vírus ou constituintes subcelulares, oferecendo informações sobre as alterações celulares (GALLETI, 2003). O microscópio eletrônico funciona utilizando um feixe de elétrons em alta tensão. São utilizadas lentes eletromagnéticas que focalizam o feixe de elétrons na amostra. Os átomos que constituem o feixe de elétrons passam através da amostra e produzem diferentes tipos de radiação. O seu componente mais importante é a coluna, pois o feixe de elétrons é gerado e dirigido para atravessar a amostra, onde a imagem será ampliada para a realização da análise e registro digital (KESTENBACH, BOTTA FILHO, 1989). Os constituintes principais que controlam a passagem dos elétrons pela coluna são filamento, anodo, sistema de alinhamento, lente condensadora, correção de astigmatismo e campo escuro, lente objetiva, lente projetora e tela. Tem uma resolução que atinge valores na faixa de 0,2nm (KESTENBACH, BOTTA FILHO, 1989). Uma das etapas cruciais e que requer muitos cuidados é a preparação das amostras que serão lidas no microscópio de transmissão, pois essa etapa determina o sucesso da técnica. Inicialmente, o material precisa ser cortado em uma série de secções ultrafinas, e para obtenção desses cortes a amostra precisa passar por alguns procedimentos que garantem a preservação de suas propriedades originais, que são fixação, desidratação, inclusão, ultramicrotomia e contrastação. Esses passos irão variar de acordo com a amostra e o objetivo do estudo (GRIMSTONE, 1980). 18 3. HIPÓTESE E OBJETIVOS 3.1. Hipótese Modificações na metodologia de criopreservação e a utilização de diferentes soluções autoformuladas com o uso combinado de crioprotetores intra e extracelulares, podem minimizar o impacto deletério causado nas células durante a criopreservação e reduzir o custo de produção. 3.2. Objetivo geral Os objetivos deste estudo foram testar diferentes soluções para criopreservação de CTMs caninas derivadas do tecido adiposo, avaliando os efeitos sobre a membrana plasmática, viabilidade, proliferação celular, ultraestrutura e expressão gênica, bem como no seu desenvolvimento pós- descongelação. 3.3. Objetivos específicos - Estabelecer um protocolo que mantenha a integridade celular durante a criopreservação e pós-descongelação com custos acessíveis; - Comparar os resultados obtidos das diferentes combinações de crioprotetores na criopreservação; - Estabelecer um protocolo de transporte. 4. REFERÊNCIAS* ALMEIDA, J. R; PAZ, C. E. D. O.; OLIVEIRA, M. R. 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