UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA Fábio Joly Campos COMPARAÇÃO ENTRE VENTILAÇÃO MECÂNICA CONVENCIONAL PROTETORA E VENTILAÇÃO OSCILATÓRIA DE ALTA FREQUENCIA, ASSOCIADAS AO NOi, QUANTO AOS EFEITOS SOBRE OXIGENAÇÃO, LESÃO HISTOLÓGICA E DANO OXIDATIVO PULMONAR EM MODELO DE LESÃO PULMONAR AGUDA INDUZIDA EM COELHOS Tese apresentada à Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de Botucatu, para obtenção do título de Doutor em Fisiopatologia em Clínica Médica. Orientador: Prof. Titular José Roberto Fioretto Botucatu 2015 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA Fábio Joly Campos COMPARAÇÃO ENTRE VENTILAÇÃO MECÂNICA CONVENCIONAL PROTETORA E VENTILAÇÃO OSCILATÓRIA DE ALTA FREQUENCIA, ASSOCIADAS AO NOi, QUANTO AOS EFEITOS SOBRE OXIGENAÇÃO, LESÃO HISTOLÓGICA E DANO OXIDATIVO PULMONAR EM MODELO DE LESÃO PULMONAR AGUDA INDUZIDA EM COELHOS Tese apresentada à Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de Botucatu, para obtenção do título de Doutor em Fisiopatologia em Clínica Médica. Orientador: Prof. Titular José Roberto Fioretto Botucatu 2015 Dedicatória Dedicatória Dedicatória A Claudia, minha esposa, por estar sempre ao meu lado e por toda a sua compreensão , mesmo nos momentos difíceis que passamos sempre me apoiou e fez de tudo para me ajudar a realizar todos os meus sonhos, sem ela nada disso seria possível! Aos meus pais Gregório e Madalena que foram os precursores de tudo, me ensinaram quais caminhos seguir e sempre estiveram a meu lado Aos meus irmãos Fernando e Beatriz por todos os conselhos e ajuda Ao meu orientador e amigo José Roberto Fioretto, por sua eterna disposição em ajudar. Pelos seus incentivos e por sua compreensão pelas dificuldades encontradas e apoio para enfrentá-las Agradecimentos Agradecimentos Agradecimentos Um agradecimento especial ao Dr. Fernando Ronchi e a Dra Cilmery por ajudar em todas as etapas deste trabalho. Suas orientações e ajudas foram muito preciosas À todos os amigos da UTI pediátrica de Botucatu, em especial Mário, Rossano e Marcos que ajudaram na realização deste trabalho e tanta diferença fizeram na minha formação profissional Aos funcionários do laboratório da Pediatria que sempre me apoiaram, sem sua ajuda não teria conseguido Ao professor Carlos Alberto Padovani pela orientação na análise estatística As amigas Fernanda, Lia, Atsuko e Rafaela, médicas da UTI pediátrica da Faculdade de Medicina de Marília por entenderem minhas ausências nesse período e pelo seu apoio durante todos estes anos Índice Índice Índice I- Fundamentação e Justificativa da Tese.................................................. 11 1- Síndrome do desconforto respiratório agudo........................................ 13 1.1 Fisiopatologia e Critérios Diagnósticos................................................... 14 1.2 Fases Evolutivas....................................................................................... 15 1.3 Etiologia................................................................................................... 17 1.4 Tratamento Ventilatório da LPA/SDRA.................................................. 17 1.4.1 Ventilação Mecânica Protetora............................................................. 17 1.4.2 Ventilação Oscilatória de Alta Frequência............................................ 19 1.5 Óxido Nítrico Inalatório (NOi)................................................................. 22 2 – Referências Bibliográficas..................................................................... 27 II- Artigo Original ....................................................................................... 38 III- A Tese (artigo publicado)...................................................................... 45 Resumo ......................................................................................................... 47 1. Introdução................................................................................................. 48 2. Métodos..................................................................................................... 49 2.1 Desenho, animais e instrumentação......................................................... 50 2.2 Indução da lesão pulmonar ...................................................................... 51 2.3 Grupos experimentais.......................................................................................... 51 2.4 Administração de óxido nítrico inalatório ............................................... 52 2.5 Coleta do tecidos ..................................................................................... 53 2.6 Lavado broncoalveolar ........................................................................... . ....... ............ 53 2.7 Análise antioxidante total ........................................................................ 53 2.8 Análise do dano ao DNA no tecido pulmonar ........................................ 54 2.9 Determinação dos produtos do óxido nítrico no plasma ......................... 54 2.10 Análise estatística................................................................................... 54 3. Resultados................................................................................................. 56 3.1 Hemodinâmica, mecânica pulmonar e troca gasosa................................. 56 3.2 Lesão oxidativa......................................................................................... 59 Índice 3.2 Lesão oxidativa ........................................................................................ 49 3.2.1 Capacidade antioxidante e total ............................................................ 59 3.2.2 Análise do dano ao DNA em tecio pulmonar ....................................... 59 3.3 Contagem de células polimorfonucleares................................................. 59 3.4 Quantificação dos produtos do óxido nítrico no plasma ......................... 59 4. Discussão................................................................................................... 61 Conclusões..................................................................................................... 65 Referências Bibliográficas........................................................................... 67 IV- Desdobramentos da tese........................................................................ 79 V- Considerações Finais............................................................................... 74 Fundamentação e Justificativa da Tese 11 I – Fundamentação e Justificativa da Tese Fundamentação e Justificativa da Tese 12 Este estudo teve como foco de análise a síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA), sua fisiopatologia e principais terapêuticas ventilatórias e adjuvantes não ventilatórias. Apesar do progresso no entendimento da fisiopatologia da SDRA e o avanço em estratégias terapêuticas de pacientes com a síndrome, a mortalidade permanece elevada, variando de 40% a 60%1-5. Embora os mecanismos da SDRA não sejam completamente elucidados6, várias evidências sugerem que pacientes portadores da síndrome estão expostos a elevado grau de estresse oxidativo (EO) induzido por uma variedade de eventos7-10. O EO é resultante do desequilíbrio entre o sistema de defesa antioxidante e a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) ou de nitrogênio (RNS) com acúmulo de lesão oxidativa em biomoléculas 11. Alguns estudos demonstraram que existe redução de antioxidantes em pacientes com SDRA12, 13, entretanto, não há evidência clínica para a suplementação destes agentes para reduzir mortalidade ou morbidade. Por outro lado, a ventilação pulmonar mecânica (VM) constitui um dos principais pilares do tratamento da SDRA4, sendo capaz de modificar a evolução da doença e reduzir a mortalidade14. Existem dois métodos ventilatórios de proteção pulmonar utilizados na SDRA. Um é baseado na VM convencional (VMC)15 e outro na ventilação oscilatória de alta frequência16-18. A complexidade fisiopatológica e a gravidade de alguns casos de SDRA exigem a utilização de outras estratégias de tratamento além da VM. Assim é que o tratamento clínico da síndrome inclui controle da infecção subjacente, controle hidroeletrolítico e do estado hemodinâmico, suporte nutricional e otimização da VM protetora. Quando a hipoxemia persiste ou se agrava, terapias adjuvantes, como o óxido nítrico inalatório (NOi) podem ser utilizadas19. Em trabalho anterior, nosso grupo estudou coelhos submetidos a lesão pulmonar aguda por meio de lavagem traqueal com salina aquecida e submetidos Fundamentação e Justificativa da Tese 13 a VMC protetora com o objetivo de avaliar os efeitos de baixas doses de NOi sobre o estresse oxidativo e lesão histopatológica e inflamatória dos pulmões. Concluímos que a utilização precoce de baixas doses do gás atenuou o estresse oxidativo e a lesão pulmonar histopatológica e inflamatória20 . Apresentaremos a seguir breve revisão dos principais elementos que motivaram a realização desta tese e que foram levados em consideração para a elaboração da hipótese de trabalho. 1. Síndrome do desconforto respiratório agudo Ashbaugh et al.1, em 1967, utilizaram o termo “síndrome da angústia respiratória do adulto” para descrever um quadro agudo de insuficiência respiratória grave que evoluía com elevada taxa de mortalidade. A síndrome foi descrita em 11 adultos e uma criança e foi caracterizada por edema pulmonar não cardiogênico que cursava com taquidispnéia, cianose refratária à administração de oxigênio, presença de infiltrados alveolares bilaterais ao exame radiológico do tórax e diminuição da complacência pulmonar. Posteriormente, com a Conferência de Consenso Americana-Europeia de 1994, julgou-se mais apropriado o termo Síndrome do Desconforto Respiratório Agudo para designar tais casos, dado o caráter agudo da doença e o fato de serem acometidos, indistintamente, adultos e crianças. Além disso, levando-se em conta que os quadros de insuficiência respiratória aguda podem ser a base fisiopatológica em uma grande variedade de agravos e que pequena porcentagem de pacientes com insuficiência respiratória desenvolve as alterações clássicas da SDRA, foi elaborado um conceito mais amplo, que engloba todos os casos de falência respiratória. A denominação genérica adotada foi Lesão Pulmonar Aguda (LPA)21. Fundamentação e Justificativa da Tese 14 1.1 Fisiopatologia e Critérios Diagnósticos A SDRA caracteriza-se por processo inflamatório extenso que leva à quebra da barreira alvéolo-capilar com desenvolvimento de edema intersticial e alveolar, diminuição da complacência pulmonar, desequilíbrio da relação ventilação/perfusão (relação V/Q) e hipoxemia refratária à administração de oxigênio22. A lesão de pneumócitos do tipo II, produtores de surfactante, e a inativação do surfactante pelo processo inflamatório também contribuem para o colabamento expiratório de unidades alveolares, com consequente redução da capacidade residual funcional. Além disso, existe aumento da resistência vascular pulmonar produzido por combinação complexa de lesão pulmonar primária, em consequência de resposta inflamatória à agressão pulmonar, e de complicações do tratamento, principalmente a lesão pulmonar induzida pela ventilação mecânica. A hipertensão pulmonar impõe carga adicional ao ventrículo direito, limitando o débito cardíaco23. Os critérios diagnósticos da síndrome foram estabelecidos pela Conferência de Consenso Americana-Européia 21, realizada em 1994, sendo eles: 1) presença de evento agudo desencadeante de lesão pulmonar; 2) evidência de hipoxemia refratária à administração de oxigênio demonstrada por relação PaO2/FiO2  200 mmHg para SDRA e  300 para LPA, a despeito da pressão expiratória positiva utilizada; 3) presença de infiltrado bilateral na radiografia de tórax em posição frontal e 4) pressão capilar pulmonar  18 mmHg, quando medida, ou ausência de evidência clínica de hipertensão atrial esquerda. Mais recentemente, a definição e os critérios diagnósticos da síndrome passaram por nova revisão, no que se denominou de Definição de Berlim24. Nos novos critérios diagnósticos foi especificado o tempo de uma semana de um evento clínico para caracterizar o quadro agudo, foram criados exemplos de radiografias de tórax e os critérios radiológicos aclarados, para determinação da origem do edema pulmonar foi introduzida a avaliação ecocardiográfica para excluir edema hidrostático, fatores de risco foram incluídos e quanto a Fundamentação e Justificativa da Tese 15 oxigenação a síndrome foi classificada, de acordo com a relação PaO2/FiO2 e com a pressão final expiratória final positiva (PEEP) utilizada em: a) Leve: 200 mmHg < PaO2/FiO2 ≤ 300 mmHg com PEEP ou CPAP ≥ 5 cmH2O; b) Moderada: 100 mmHg < PaO2/FiO2 ≤ 200 mmHg com PEEP ≥ 5 cmH2O;. Grave: PaO2/FiO2 ≤ 100 mmHg com PEEP ≥ 5 cmH2O. Deixa de ser utilizado o termo LPA. Apesar da Definição de Berlim representar avanço no estudo da SDRA, ainda apresentava algumas limitações, como o fato de não terem sido incluídas crianças nos estudos. Assim, após nova revisão, foi publicada em junho de 2015 por Khemani et al. Novos critérios para diagnóstico da SDRA em crianças. A principal mudança foi a adoção do índice de oxigenação (IO) e o índice de saturação de oxigênio e não apenas a relação PaO2/FiO2 para estratificação da SDRA em leve, moderada e grave25. Apesar do melhor entendimento da fisiopatologia da doença e do avanço tecnológico observado na monitoração e no tratamento de pacientes gravemente doentes, a mortalidade por SDRA permanece elevada, variando de 31% a 60% em adultos15 e de 43% a 62% em crianças 21,26. 1.2 Fases Evolutivas Do ponto de vista anatomopatológico, a evolução da SDRA pode ser dividida em três fases inter-relacionadas que correspondem à evolução clínica da doença: fase exsudativa, de edema e hemorragia; fase proliferativa, de organização e reparação e fase fibrótica terminal27. A fase exsudativa corresponde à primeira semana após o início da insuficiência respiratória aguda. Macroscopicamente os pulmões apresentam-se rígidos, de coloração avermelhada escura e estão extremamente pesados. A superfície parenquimatosa é hemorrágica, de consistência firme e não aerada. Fundamentação e Justificativa da Tese 16 Microscopicamente observa-se congestão capilar, edema intersticial e alveolar e hemorragia interalveolar. Nesta fase, é característica a presença de membranas hialinas eosinofílicas, usualmente vistas após as primeiras 48 horas. Essas membranas são compostas de proteínas plasmáticas condensadas, mais evidentes ao longo do ducto alveolar, obstruindo as saídas dos alvéolos adjacentes27. Há evidências de alterações ultraestruturais do endotélio, como edema celular, alargamento das junções intercelulares e aumento da quantidade de vesículas pinocitárias. O epitélio alveolar apresenta necrose extensa dos pneumócitos tipo I, maissusceptíveis à lesão. Esta perda da barreira alvéolo-capilar permite extravasamento do líquido intersticial para o espaço alveolar. A fase proliferativa, entre a primeira e a terceira semanas de evolução da doença, representa o estágio de organização dos exsudatos intra-alveolares e intersticiais produzidos na fase aguda. Os pulmões apresentam-se duros, com coloração cinza claro e com textura lisa atribuível à presença de tecido conjuntivo recém formado. O epitélio torna-se cubóide, com proliferação de pneumócitos tipo II ao longo dos septos alveolares. A regeneração das células epiteliais marca o início desta fase, podendo haver atipia nuclear. No interior da parede alveolar existe proliferação de fibroblastos e miofibroblastos, que posteriormente migram para o exsudato intra-alveolar fibrinoso. Os fibroblastos transformam o exsudato em tecido de granulação e posteriormente, pela deposição de colágeno, em tecido fibroso. A fase fibrótica inicia-se após a primeira semana de evolução da síndrome. Depois de três a quatro semanas, o pulmão é totalmente remodelado por tecido colágeno. Macroscopicamente a superfície pleural apresenta aspecto grosseiro e o parênquima pulmonar é pálido e esponjoso, apresentando áreas de espaços aéreos microcísticos com diâmetro de um a dois milímetros e zonas de retração (padrão em favos de mel). Os brônquios periféricos são dilatados e anormalmente próximos da superfície da pleura visceral. As artérias parecem serpentinas e, histologicamente, apresentam espessamento fibroso de suas Fundamentação e Justificativa da Tese 17 paredes. Microscopicamente os septos alveolares e as paredes dos espaços aéreos são compostos de tecido colágeno com células esparsas. Os espaços aéreos apresentam dilatação irregular27,28. 1.3 Etiologia A SDRA pode ser causada por agressão pulmonar direta (primária), como ocorre na aspiração, infecção pulmonar, afogamento e contusão pulmonar, ou pode ser provocada por agressão indireta (secundária), como na sepse, politraumatismo, em transfusões maciças de hemoderivados, entre outras 29. 1.4 Tratamento Ventilatório da SDRA 1.4.1 Ventilação Mecânica Protetora A VM é fundamental para o tratamento na medida em que melhora a oxigenação por recrutamento alveolar, com restabelecimento da relação V/Q30. No entanto, embora as manobras ventilatórias possam melhorar a oxigenação arterial, elas não reduzem a hipertensão pulmonar. Além disso, com a progressão da insuficiência respiratória pode ser necessário o emprego de volume corrente (VC) e de pressões inspiratórias elevadas (pressão inspiratória de pico e de platô). Em três trabalhos do grupo de Gattinoni31-33 foi observado, por meio de estudo tomográfico dos pulmões, que o comprometimento do parênquima pulmonar não é homogêneo na síndrome, existindo áreas de pulmão normal juntamente com áreas extremamente condensadas e outras mediamente lesadas. Paralelamente, diversas publicações34-37 alertaram para a ocorrência de lesão pulmonar induzida pela ventilação mecânica (LPIVM) ao se utilizar elevados Fundamentação e Justificativa da Tese 18 valores de volume corrente (10-15 mL/Kg) e de pico de pressão inspiratória (> 40 cmH20), até então empregados rotineiramente. A ideia que predomina atualmente é a de que o emprego de altos volumes correntes, que geram altas pressões inspiratórias na VM de pacientes com SDRA, determina lesão estrutural em áreas de pulmão até então sadias (volutrauma e barotrauma), reproduzindo as lesões anatomopatológicas da SDRA nestas áreas, agravando a hipoxemia e piorando a evolução dos pacientes38. Também, ciclos sucessivos de abertura e fechamento dos alvéolos sadios podem determinar colapso ou “afrouxamento” destas unidades de troca gasosa, o que se convencionou chamar de atelectrauma. Além disso, em decorrência do volutrauma e do atelectrauma, a VM mais agressiva pode propiciar a passagem de mediadores inflamatórios liberados nos alvéolos para a circulação pulmonar e daí para a circulação sistêmica, podendo ocasionar disfunções orgânicas extra-pulmonares (biotrauma)39. Estes conhecimentos determinaram modificação substancial na maneira de utilizar a VM nestes pacientes, sendo introduzido o conceito de VM protetora. Assim, a recomendação atual para VM protetora em SDRA é a de que se utilize volume corrente de 5 a 7 mL/Kg, limitando a pressão de platô em 30 cmH20, permitindo que a saturação arterial de oxigênio (SaO2) fique entre 88%-90% (hipoxemia permissiva) e que a PaCO2 atinja valores de até 100 mmHg (hipercapnia permissiva)15. Além disso, a PEEP deve ser ajustada para manter aberta a maioria das unidades alveolares e prevenir seu colapso no final da expiração40 e, com isso, reduzir o shunt intrapulmonar e melhorar a hipoxemia. A otimização da PEEP, na medida em que impede a abertura e o fechamento cíclicos dos alvéolos, reduz a LPIVM. O ponto de inflexão inferior do ramo inspiratório da curva pressão/volume (P/V) tem sido proposto como um ponto de referência para se encontrar a PEEP ideal. Na prática clínica, o nível da PEEP ideal tem sido obtido à beira do leito, aumentando-se essa pressão de 2 a 3 cmH2O, gradualmente, e Fundamentação e Justificativa da Tese 19 acompanhando seu efeito sobre a SaO2. Na UTIP da Faculdade de Medicina de Botucatu – UNESP, temos utilizado PEEP mínima de 10 cmH2O, na fase inicial do tratamento de lactentes e crianças com SDRA, aumentando gradualmente seu nível de 2 a 3 cmH2O de acordo com a resposta da SaO2, fixando o valor que se correlaciona com a melhor SaO2, e que permita reduzir a FiO2 para menos de 60% sem causar sinais de hiperinsuflação pulmonar no exame radiológico de tórax41. Recentemente, Amato et al., publicaram artigo no qual foram avaliados dados de ensaios clínicos realizados entre 1998 e 2008. Os autores observaram que o único parâmetro ventilatório que tem valor preditivo na evolução de paciente com SDRA é a chamada pressão de distensão (PD), calculada pela diferença entre a pressão de platô e a PEEP. Foi observado que o grupo com PD entre 8 e 15 cmH2O apresentou menor mortalidade. Apesar da importância deste trabalho, é necessário destacar que nos estudos avaliados os pacientes recebiam bloqueio neuromuscular, portanto, mais estudos deverão ser realizados para definir o real papel da PD no tratamento da SDRA42. 1.4.2 Ventilação Oscilatória de Alta Frequência (VAF) Embora a VMC seja efetiva para a maioria das crianças, há um número significante de pacientes com insuficiência respiratória grave nos quais a VMC pode não garantir a oxigenação e a ventilação. Nestes casos, a VAF passa ser uma alternativa atraente por suas características únicas43. A VAF é um modo ventilatório que utiliza volume corrente menor do que o volume do espaço morto anatômico (1–3 mL/Kg) com frequência bem acima da fisiológica (3–15 Hertz, ou seja, 180–900 ciclos/minuto). Esta forma de ventilação vem sendo utilizada com sucesso para o tratamento de pacientes com insuficiência respiratória grave quando a VMC falha. Além disso, há relatos de Fundamentação e Justificativa da Tese 20 que, quando a VAF é utilizada precocemente, ocorre redução na lesão pulmonar aguda e crônica em pacientes com SDRA44. Trata-se de um aparelho de ventilação pulmonar mecânica com fluxo contínuo de gás que é capaz de eliminar o CO2 e manter constante a pressão da via aérea. O ventilador é dotado de um pistão eletromagnético capaz de gerar oscilação de alta frequência sobre o fluxo aéreo, determinando a amplitude de oscilação da pressão. Em contraste com a VMC, na VAF o volume corrente é inversamente relacionado à frequência e tanto a inspiração como a expiração são ativas. A pressão de amplitude é maior no circuito do ventilador e na porção proximal da traqueia, diminuindo progressivamente ao longo da via aérea, resultando em baixa pressão de amplitude nos alvéolos45. A combinação de pequena variação de volume e pressão e manutenção de pressão média de vias aéreas (MAP) tornam o uso da VAF atrativo na SDRA. Além disso, a manutenção do volume pulmonar, que evita superdistensão pulmonar e o aparecimento de atelectasia em pacientes com SDRA, e seu padrão de fluxo, podem melhorar a relação V/Q45. Foi demonstrado em crianças com SDRA melhora significante na oxigenação, redução na frequência de barotrauma e melhora dos resultados clínicos com o uso da VAF45. Em adultos com SDRA foi descrita melhora imediata e sustentada da relação PaO2/FiO2 quando os pacientes foram submetidos à VAF combinada com manobras de recrutamento alveolar46. Como efeito benéfico adicional, foi demonstrado redução dos níveis de mediadores inflamatórios em amostras de lavado broncoalveolar de pacientes sob VAF quando comparado com a VMC47. Atualmente, muita atenção tem sido dada a utilização precoce da VAF48. Assim é que quando a SaO2 for menor do que 90%, em FiO2 ≥ 0,6 com pressão inspiratória (Pip) de 30-32 cmH2O e PEEP ≥10 cmH2O recomenda-se a transferência da criança da ventilação convencional para a VAF49. Fundamentação e Justificativa da Tese 21 Em 2010, foi publicada revisão sistemática seguida de metanálise a respeito da utilização da VAF em SDRA50. Os autores concluíram que a análise dos estudos favoreceu a utilização da VAF quanto a mortalidade em 30 dias. Da mesma forma, estudo realizado em recém-nascidos de muito baixo peso concluiu que a VAF, comparada com a ventilação mandatória intermitente sincronizada, permitiu extubação mais precoce e reduziu a incidência de displasia bronco pulmonar 51. Apesar das características atraentes da VAF para ser utilizada na SDRA, dois estudos randomizados recentes, realizados em pacientes adultos, não demonstraram efeitos benéficos dessa estratégia ventilatória quanto a mortalidade. O chamado OSCAR Trial 52 avaliou 785 pacientes de 29 hospitais do Reino Unido e comparou VAF com um grupo de pacientes submetidos a ventilação convencional e não observou diferença de mortalidade. Ocorre que os pacientes que foram submetidos a VAF utilizaram um ventilador nunca utilizado em outros estudos e diferente daquele da prática clínica. Além disso, muitos centros relataram que não tinham experiência com a VAF. Paralelamente, foi publicado o OSCILLATE Trial 53. Também um estudo multicêntrico randomizado que foi interrompido depois da inclusão de 548 pacientes por aumento de mortalidade no grupo submetido a VAF. Novamente, o estudo mostrou problemas metodológicos, pois o grupo VAF incluiu pacientes mais graves, com maior instabilidade hemodinâmica e que fizeram uso de vasopressores e bloqueadores neuromusculares em frequência significantemente maior. Para completar a análise de estudos clínicos, a última metanálise sobre o tema concluiu que a VAF não reduz a mortalidade em adultos com SDRA, mas não aumenta o risco de barotrauma ou determina maior chance de hipotensão e, de fato, reduz o risco de falência de oxigenação54. Em 2011, nosso grupo publicou estudo experimental em coelhos submetidos à lesão pulmonar aguda por meio de lavagem traqueal com salina aquecida com o objetivo de comparar VAF com VMC protetora quanto a Fundamentação e Justificativa da Tese 22 performance antioxidante, oxigenação e lesão histopatológica e inflamatória dos pulmões55. Nesse trabalho, de forma inédita, foi empregado o método da capacidade antioxidante total (TAP). A TAP determina de uma maneira global a capacidade de defesa antioxidante e o estresse oxidativo, e pode detectar os antioxidantes biológicos presentes no compartimento hidrofílico e lipofílico celular e suas interações contra o estresse oxidativo56. Este método foi validado para utilização no plasma por Beretta et al.57 e posteriormente aplicado em tecidos biológicos por Ferreira et al.58. É baseado na oxidação de análogo lipofílico (probe) denominado BODIPY [ác.4,4-difluoro-5-(4-fenil-1,3- butadienil)-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno-3-ndecanóico] por meio de um gerador de radical lipoperoxil (LOO•) do compartimento lipofílico denominado MeO-AMVN [2,2¢-azobis(4-methoxi-2,4-dimetil-valero-nitrilo)]. A oxidação do BODIPY origina um produto de fluorescência verde que pode ser detectado em contador de emissão de luz fluorescente57. Concluímos que a VAF desempenhou importante papel protetor na lesão pulmonar aguda, levando a melhora da oxigenação, processo inflamatório e redução do dano histopatológico, além de atenuar a lesão pulmonar oxidativa comparado à VMC protetora. 1.5 Óxido Nítrico Inalatório (NOi) A complexidade fisiopatológica e a elevada taxa de mortalidade observada na SDRA exigem a implementação de outras estratégias de tratamento diferentes da ventilação pulmonar mecânica. Levando-se em conta a fisiopatologia da doença, entende-se que a administração de medicações vasodilatadoras seria útil na terapêutica da síndrome por possibilitar reequilíbrio da relação V/Q. No entanto, os vasodilatadores intravenosos disponíveis no mercado não apresentam especificidade para o leito vascular pulmonar e podem reduzir a pressão arterial Fundamentação e Justificativa da Tese 23 sistêmica, agravando ainda mais o shunt intrapulmonar por vasodilatação não seletiva de artérias que perfundem áreas pulmonares mal ventiladas, com piora da relação V/Q nestas áreas e diminuição da PaO2 59. O NOi é um vasodilatador pulmonar seletivo que exerce seus efeitos somente em áreas pulmonares ventiladas. Atua no controle do tônus vascular por meio da ativação da guanil-ciclase e aumento da produção do GMP-cíclico, levando a relaxamento da musculatura lisa vascular. Desta forma, há aumento do fluxo sanguíneo para essas áreas e desvio do sangue de regiões mal ventiladas, com otimização da relação V/Q60. Esta ação determina melhora da oxigenação, redução da resistência vascular pulmonar e, portanto, diminuição da pós-carga ventricular direita, com aumento do débito cardíaco61. Os efeitos descritos poderiam ser úteis na SDRA, pois permitiriam a redução de parâmetros ventilatórios, com diminuição do risco de aparecimento de LPIVM e redução da morbidade e da mortalidade62. Destaca-se que, devido à alta afinidade pela hemoglobina, o NO, quando administrado por via inalatória, é inativado rápida e especificamente no sangue, não promovendo vasodilatação da circulação sistêmica63. O primeiro trabalho que avaliou os efeitos biológicos do NOi foi publicado em 1993 por Rossaint et al64. Os autores estudaram 10 pacientes adultos com SDRA e observaram diminuição do shunt intrapulmonar e melhora da oxigenação arterial. Posteriormente, em 1994, Abman et al.65 descreveram efeitos benéficos do NOi sobre a oxigenação, hipertensão pulmonar e índice cardíaco em crianças com SDRA, sem influência na mortalidade. Procurando demonstrar se a administração de NOi melhora a oxigenação por tempo prolongado, vários estudos realizados em adultos66-68 e em crianças69,70 evidenciaram apenas resposta imediata ao gás. Em pediatria, Dobyns et al.71, estudando 108 pacientes com insuficiência respiratória aguda (índice de oxigenação: IO > 15 cmH2O/mmHg), observaram resposta prolongada ao NOi quando comparado com placebo, ao longo de 72 horas, em dois subgrupos de Fundamentação e Justificativa da Tese 24 pacientes, aqueles com IO ≥ 25 cmH2O/mmHg no início do estudo e nos pacientes imunodeprimidos. Os autores consideraram que a terapia com NOi não sustentou a melhora na oxigenação em todos os pacientes porque os mesmos foram incluídos no estudo em estágios tardios da doença (três a cinco dias depois do diagnóstico). Seguindo a ideia dos efeitos benéficos da administração precoce, publicamos, em 2001, protocolo de administração precoce de NOi em crianças com SDRA. Demonstramos melhora imediata e sustentada da oxigenação utilizando o gás tão precocemente quanto 12 horas depois do diagnóstico da doença, suportando a hipótese de que o tratamento iniciado logo depois do diagnóstico pode ser mais efetivo72. Em 2003, The Cochrane Library publicou revisão sistemática sobre os efeitos do NOi em insuficiência respiratória hipoxêmica aguda de adultos e crianças, com atualização em 200673. Cinco estudos randomizados e controlados foram analisados, avaliando 535 pacientes. A revisão concluiu que o NOi é útil apenas como terapia de salvamento, nas primeiras 24 horas de doença. Vale ressaltar que dos cinco estudos analisados, apenas o de Dobyns et al.71 foi realizado em crianças e que a conclusão final indicou que o potencial efeito da terapia com NOi em pacientes com SDRA está para ser definido, principalmente em crianças. Em 2004, analisamos os efeitos da administração precoce de NOi na SDRA comparando um grupo composto de crianças seguidas prospectivamente e que recebeu NOi associado à terapia convencional (GNOi) com um grupo histórico de pacientes que utilizou apenas terapia convencional (GTC). Nosso objetivo central foi determinar o efeito imediato e sustentado do NOi sobre alguns índices de oxigenação e parâmetros ventilatórios. A terapia com NOi foi introduzida tão cedo quanto 1,5 hora depois do diagnóstico de SDRA, em pacientes otimamente ventilados com níveis apropriados de Peep (≥10cmH2O). Demonstramos melhora imediata da relação PaO2/FiO2 e do índice de Fundamentação e Justificativa da Tese 25 oxigenação. Da mesma forma, o tratamento prolongado associou-se com melhora da oxigenação, tanto que a FiO2 e a Pip puderam ser rápida e significantemente reduzidas. A taxa de mortalidade para o GNOi foi significantemente mais baixa (GTC: 10/21- 47,6%; GNOi: 3/18 – 16,6%, p<0,001). A mediana do tempo de tratamento com o gás foi de 2 dias (1 – 6) e a dose média utilizada de 4,03±1,59ppm. Concluímos que o tratamento precoce com NOi causa melhora imediata e sustentada da oxigenação, com redução mais precoce de parâmetros ventilatórios associados com alto risco de lesão pulmonar induzida pela ventilação mecânica e toxicidade pelo oxigênio, o que pode contribuir para redução da taxa de mortalidade. Especulamos que o emprego do NOi tenha permitido redução da agressividade da VM, com diminuição da mortalidade74 . Estes resultados podem ser explicados, em parte, pois o NOi e os produtos de sua oxidação apresentam efeitos antiinflamatórios (diminuição da ativação de linfócitos e da adesão leucocitária) e interferem com o metabolismo oxidativo75. Sustentando a hipótese de que a administração precoce de NOi pode ser benéfica na SDRA, Razavi et al.76 publicaram estudo sobre os efeitos do NOi em lesão pulmonar induzida por sepse, em modelo experimental de ratos. Os autores concluíram que a exposição precoce ao NOi no curso da lesão pulmonar aguda induzida por sepse associa-se à redução da infiltração leucocitária e menor lesão oxidativa, sendo que o NO pode ser de grande benefício se administrado mais precocemente na história natural da lesão pulmonar aguda. Atestando a atualidade e a importância do assunto, em maio de 2007 foi publicada nova revisão sistemática seguida de metanálise a respeito dos efeitos do NOi sobre a oxigenação e mortalidade na lesão pulmonar aguda em adultos e crianças77. Foram computados 12 estudos envolvendo 1.237 pacientes. Os autores concluíram que o NO se associa à limitada melhora da oxigenação em pacientes com SDRA e não confere benefício quanto à mortalidade. Ocorre que dos 12 estudos avaliados apenas dois foram conduzidos em crianças, sendo um Fundamentação e Justificativa da Tese 26 deles o de Dobyns et al.71, comentando anteriormente, e o outro de Day et al.69. Assim como no trabalho de Dobyns et al.71, Day et al.69 administraram NO tardiamente, depois de 3,8 ± 1,8 dias de ventilação mecânica. Outro fator que interfere com a resposta ao NOi, além do tempo de introdução do gás, é o grau de abertura dos alvéolos, sendo sua ação clínica tanto maior quanto maior for o grau de recrutamento de unidades alveolares78, principalmente aquele induzido pela VAF79. Esse fator não foi considerado nos estudos citados. Considerando que a manutenção da abertura dos alvéolos é mais facilmente obtida com a utilização da VAF e que o gás necessita de alvéolo aberto para atravessá-lo e determinar vasodilatação, ganha interesse o estudo da associação de VAF e NOi. Assim, em 2011, nosso grupo testou a hipótese de que a associação de NOi (introduzido precocemente) com VAF melhora a oxigenação de forma mais consistente e duradoura que a associação óxido nítrico e VMC80. Foi realizado estudo prospectivo, randomizado e cruzado em crianças insuficiência respiratória hipoxêmica que concluiu que tanto a VAF como VMC, associadas com administração precoce de NOi, melhoram a oxigenação. A VAF possibilita redução da FiO2 e aumento da relação PaO2/FiO2 mais precoces quando comparado com VMC em 8h. Foi assim que nasceu a ideia da tese ora apresentada, ou seja, aprofundar os conhecimentos das interações entre duas diferentes estratégias ventilatórias associadas ao NOi do ponto de vista experimental para avaliar os efeitos sobre oxigenação, lesão oxidativa, histopatológica e inflamatória dos pulmões. Referências Bibliográficas 27 2 – Referências Bibliográficas 1. Ashbaugh DG, Bigelow DB, Petty TL, Levine BE. Acute respiratory distress in adults. Lancet 1967; 2:319-23 2. Dernaika TA, Keddissi JI, Kinasewitz GT. Update on ARDS: beyond the low tidal volume. Am J Med Sci 2009; 337:360-7 3. Wheeler AP, Bernard GR. Acute lung injury and the acute respiratory distress syndrome: a clinical review. Lancet 2007; 369:1553-64 4. Dahlem P, van Aalderen WM, Bos AP. Pediatric acute lung injury. Paediatr Respir Rev 2007; 8:348-62 5. de Hemptinne Q, Remmelink M, Brimioulle S, Salmon I, Vincent JL. ARDS: a clinicopathological confrontation. Chest 2009; 135:944-49 6. 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Artigo - Original 38 II - Artigo Original Interactive effects of mechanical ventilation, inhaled nitric oxide and oxidative stress in acute lung injury Artigo - Original 39 Artigo - Original 40 Artigo - Original 41 Artigo - Original 42 Artigo - Original 43 Artigo - Original 44 Artigo 45 III - Artigo publicado Interação entre efeitos da ventilação mecânica, óxido nítrico inalatório e estresse oxidativo em lesão pulmonar aguda Artigo 46 Interação entre efeitos da ventilação mecânica , óxido nítrico inalatório e estresse oxidativo em lesão pulmonar aguda Carlos Fernando Ronchi1a, 2 *; Ana Lucia dos Anjos Ferreira1a; Fabio Joly Campos1b; Cilmery Suemi Kurokawa1b; Mario Ferreira Carpi1b; Aurélio Marcos de Moraes1b; Rossano Cesar Bonatto1b; Kyung-Jin Yeum2; Jose Roberto Fioretto1b. Respiratory Physiology and Neurobiology 190 (2014) 118-123 1Universidade Estadual Paulista (UNESP), Faculdade de Medicina de Botucatu; 1aDepartamento de Medicina Interna; 1bDepartamento de pediatria; 2Jean Mayer USDA Human Nutrition Research Center on Aging, Tufts University. Artigo - Resumo 47 RESUMO Comparar ventilação mecânica convencional (VMC) e ventilação oscilatória de alta frequência (VOAF), com e sem óxido nítrico inalatório (NOi), quanto a oxigenação, inflamação, estresse oxidativo e dano no DNA em modelo de lesão pulmonar aguda (LPA). A lesão pulmonar foi induzida por meio de infusão traqueal de solução salina aquecida. Os coelhos foram ventilados com FiO2 1.0 e randomizados em cinco grupos. O estresse oxidativo foi medido pela capacidade antioxidante total e o dano no DNA, pelo teste do cometa. Parâmetros ventilatórios e hemodinâmicos foram registradas a cada 30 minutos por quatro horas. Os grupos com LPA mostraram pior oxigenação que o grupo controle. Após 4 horas de ventilação mecânica, o grupo VOAF apresentou significante melhora na oxigenação. Os grupos VOAF, com e sem NOi, e o grupo VMC com NOi mostraram aumento significativo da capacidade antioxidante e redução no dano no DNA quando comparado ao grupo VMC sem NOi. O óxido nítrico inalatório não beneficiou adicionalmente o grupo VOAF em relação ao estresse oxidativo e ao dano ao DNA. De forma geral, a lesão pulmonar foi reduzida quer seja utilizando VMC ou VOAF com NOi. Artigo - Introdução 48 1. INTRODUÇÃO A síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA) é caracterizada por processo inflamatório que causa ruptura da barreira alvéolo-capilar levando a edema alveolar e intersticial. Há aumento da resistência vascular pulmonar de instalação rápida e que persiste mesmo após a correção da hipóxia (Phua & Govert, 2008). De acordo com a Definição de Berlim, hipoxemia leve é caracterizada por 200 mmHg < PaO2/FiO2 < 300 mmHg, moderada 100 mmHg < PaO2/FiO2 < 200 mmHg e grave PaO2/FiO2 < 100mmHg (SDRA: Definição de Berlim, 2012). Apesar da ventilação mecânica (VM) ser importante medida de suporte nos pacientes com SDRA, ela pode levar a dano pulmonar adicional (Dahlem e tal.,2007) devido a utilização de volume corrente inspirado alto (Vt) ou de pressões de inspiratórias elevadas (Ware and Matthay,2000). A VM protetora mostrou diminuição na taxa de mortalidade em estudos clínicos (ARDS Network,2000). A ventilação oscilatória de alta frequência (VOAF) é considerada um modo ventilatório não convencional protetor atraente (Allerdet- Servent et al.,2008;Girard and Bernard,2007). Ela utiliza baixo volume corrente (1-3 mL/kg) com frequência respiratória muito acima da fisiológica (5-10Hz), evitando, assim, altas oscilações de pressões e de volume alveolares, típicas da ventilação mecânica convencional (VMC). Recentemente, demonstramos que a VOAF melhora oxigenação e reduz o processo inflamatório e a lesão histopatológica e atenua a lesão pulmonar oxidativa quando comparada a VMC em modelo experimental de lesão pulmonar (Ronchi et al.,2011, 2012). A utilização de óxido nítrico inalatório (NOi), um potente vasodilatador endógeno (Kohelet, 2003) apresenta benefício potencial (Heussel et al., 2003) sem causar vasodilatação sistêmica e hipotensão (Ichinose et al., 2004). Entretanto, seu efeito na resposta inflamatória pulmonar permanece controverso, mostrando tanto aumento (Sittipunt et al., 2001) quanto diminuição (Bloomfield Artigo - Introdução 49 et al., 1997) na liberação de mediadores inflamatórios. O óxido nítrico é uma molécula reativa produzida pela enzima óxido nítrico sintase (NOS) em uma variedade de células . É um radical livre que pode reagir com outras moléculas para formar compostos químicos tóxicos no pulmão, incluindo peroxinitrito, que lesa o DNA, induz peroxidação lipídica e reage com proteínas, levando a apoptose celular (Crow and Beckman, 1995). O óxido nítrico inibe a expressão das moléculas de adesão, citocinas e quimocinas, como a IL-8, MCP-1, entre outras (Guzik et al., 2003). Além disso pode reagir com alvos biológicos direta ou indiretamente via produtos reativos intermediários. Em condições aeróbicas, o gás reage com oxigênio e radicais superóxidos para formar dióxido de nitrogênio e peroxinitrito, respectivamente. Estas espécies reativas de nitrogênio são capazes de causar danos nas macromoléculas por oxidação dos complexos redox – ativos ou por nitração de aminas aromáticas (Sittipunt et al., 2001). Estes efeitos são relacionados a dose de NOi, potencial local de oxidação/redução, outros mediadores inflamatórios e radicais livres derivados do oxigênio (Laroux et al.,2001). Nosso grupo recentemente mostrou que o uso de baixa dose de NOi atenua estresse oxidativo e lesão pulmonar histológica e inflamatória (Fioretto et al.,2012). Até o momento nenhum estudo comparou os efeitos da VOAF e VMC com o NOi sobre o estresse oxidativo pulmonar e quanto ao dano ao DNA utilizando a capacidade antioxidante total e o teste do cometa, respectivamente. Baseado em nossos estudos prévios nossa hipótese é que a VOAF associada ao NOi atenua o estresse oxidativo em lesão pulmonar aguda. Este estudo tem como objetivo comparar a VOAF e a VMC, com e sem NOi, quanto a oxigenação, inflamação, histopatologia, defesa antioxidante e dano ao DNA em um modelo de lesão pulmonar aguda. Artigo - Métodos 50 2.MÉTODOS 2.1 Desenho, animais e instrumentação Foi conduzido estudo prospectivo e sham controlado. Quarenta coelhos machos com peso entre 2,0 e 3,0 kg, brancos e da raça Norfolk foram anestesiados com cetamina (50mg/kg intramuscular) e xilazina (2mg/kg intramuscular) e instrumentados conforme descrito previamente (Fioretto et al., 2012; Ronchi et al., 2011, 2012). Brevemente, os coelhos foram pré oxigenados durante respiração espontânea com oxigênio a 100% por cateter nasal. Foi realizada traqueostomia com inserção de tubo traqueal (3,0-3,5 mm de diâmetro interno; Portex, Hythe, Reino Unido), sendo a posição assegurada com fita umbilical. A ventilação foi imediatamente iniciada com o ventilador Galileo Gold (Hamilton Medical AG, Suécia) na modalidade controlada a volume com pressão regulada com os seguintes parâmetros iniciais: FiO2 = 1.0; VC=6mL/kg; PEEP=5cmH2O; frequência respiratória=40-50 resp/min. Estes ajustes foram mantidos por 15 minutos para estabilização. Assim que a traqueostomia foi realizada, um cateter vascular foi introduzido na artéria carótida comum (22 Gauge jelco, IntrocanR SafetyTM- B Braun, Melsungen, Alemanha) e um cateter de duplo lúmen (5Fr – Arrow International Inc. Reading, Filadélfia, EUA) foi introduzido pela veia jugular até a veia cava superior. O cateter arterial foi usado para análise de gases no sangue e monitoração da pressão arterial com monitor convencional (Dixtal 2010,Manaus, Brasil). O cateter de duplo lúmen foi usado para administrar sedativos, fluidos de manutenção e drogas vasoativas. A anestesia foi mantida por infusão continua de cetamina (10mg/kg/h). Paralisia muscular foi induzida pela administração intravenosa de brometo de pancurônio (0,2mg/kg) e mantida com doses de 0,1 mg/kg. Se a pressão arterial média ficasse menor que 50 mmHg durante o experimento iniciava-se infusão de noradrenalina (0,5 - 1 mcg/kg/min). A necessidade de suporte inotrópico foi medida utilizando um escore para necessidade de drogas vasoativas (Gaies et Artigo - Métodos 51 al.,2010). A manutenção de fluidos foi realizada por infusão continua de salina a 0,9% contendo 5% de dextrose a 4 mL/kg/h. A temperatura corpórea foi medida por sonda esofagiana e mantida entre 38-39oC com manta térmica. Oximetria de pulso contínua foi realizada colocando sensor em uma porção tricotomizada da perna. Os coelhos foram mantidos minimizando o desconforto, sofrimento e dor de acordo com as orientações do Instituto Nacional de Saúde. Este estudo foi aprovado pelo comitê de ética em pesquisa experimental, Faculdade de Medicina de Botucatu, Universidade Estadual Paulista e do Jean Mayer USDA – Human Nutrition Research Center on Aging da Tufts University, Boston, EUA. 2.2 Indução da lesão pulmonar A lesão pulmonar foi induzida por meio de lavagem pulmonar com alíquotas de 30 mL/kg de salina 0,9% aquecida (38oC) conforme descrito previamente (Fioretto et al.,2012; Ronchi et al. , 2011,2012). Após a estabilização, obtinha-se amostra de sangue arterial para verificar se o animal estava hipoxêmico (dois valores de PaO2/FiO2 < 200 com intervalo de 15 minutos). Após período de estabilização, os animais recebiam uma insuflação sustentada com pressão média de via aérea de 30 cmH2O para promover recrutamento alveolar e equalizar o volume (McCulloch et al.,1998). 2.3 Grupos Experimentais Os animais (n=40) foram alocados para um de cinco grupos: a) grupo controle [GC, n=8: VC 6 mL/kg, PEEP 5 cmH2O]; b) LPA+VMC [GVM, n=8: VC 6mL/kg, PEEP 10 cmH2O, pressão de platô limitada em 30 cmH2O]; c) LPA+VMC+NOi [GVMNO, n = 8: VC 6 mL/kg, PEEP 10 cmH2O, NOi 5 ppm, pressão de platô limitada em 30 cmH2O, no aparelho Galileo Gold (Hamilton Medical AG, Suécia)]; d) LPA+VOAF [GVAF, n=8: Paw 12-14cmH2O, Artigo - Métodos 52 frequência respiratória (FR) 10Hz, tempo inspiratório de 33% , amplitude 20 cmH2O] e e) LPA+VOAF+NOi [GVAFNO, n=8: Paw 12-14cmH2O, FR 10Hz, tempo inspiratório de 33%, amplitude 20 cmH2O, NOi 5 ppm, no aparelho SensorMedic 3100A (Viasys Healthcare, Yorba Linda, EUA)]. Na VMC a frequência respiratória foi mantida entre 40-50 resp/min para manter a PaCO2 desejada (40-45 mmHg); na VOAF a pressão de amplitude foi modificada para manter o mesmo nível de PaCO2. A FiO2 foi mantida em 1.0 durante todo o experimento para todos os grupos. A coleta de sangue arterial foi obtida antes (linha de base) e depois da indução da lesão pulmonar e a cada 30 minutos pelas 4 horas de observação; A análise foi feita analisador de gás ABL-3 (Bayer,Rapid Lab, Khiron 865). 2.4 Administração de óxido nítrico inalatório A administração de NOi foi efetuada conforme descrição prévia (Fioretto et al.,2012,2004). Brevemente, a mistura de NO e nitrogênio foi obtida de tanques de 20L conectados à regulador de pressão (White Martins Gases industriais- Praxair, Rio de Janeiro, Brasil). A concentração do tanque foi certificada pelo fornecedor como 300ppm em nitrogênio. O NO foi administrado de forma contínua aos coelhos via fluxometro no ramo inspiratório do circuito do respirador, distante 30 cm do tubo traqueal do animal. As concentrações de óxido nítrico e de dióxido de nitrogênio (NO2) foram medidas usando um sensor eletroquímico (JP Moryia Ind & Com Ltda, São Paulo, Brasil) de amostras do gás obtido no circuito o mais próximo possível do tubo traqueal via um conector em Y. O sensor eletroquímico de NO/NO2 foi calibrado diariamente antes do uso. Os alarmes audiovisuais foram calibrados 1 ppm abaixo da dose administrada de NOi e a um máximo de NO2 de 3 ppm. O sistema de administração foi limpo antes do uso. Na ventilação oscilatória de alta frequência o NOi foi administrado e mensurado com o uso do Pulmonox Mini (Namu, Messer, Griesheim, Áustria). Artigo - Métodos 53 2.5 Coleta de tecidos O pulmão direito foi dissecado e estocado para análise do estresse oxidativo e o pulmão esquerdo dissecado para lavado broncoalveolar. Amostras de tecido para estudo do estresse oxidativo foram congeladas em nitrogênio líquido a 80 °C até a análise. 2.6 Lavado broncoalveolar O lavado broncoalveolar foi obtido a partir de duas lavagens do pulmão esquerdo utilizando-se 15 mL/kg de solução salina. O fluido do lavado broncoalveolar foi coletado e o número total de células contado em um hemocitômetro de câmara. A contagem diferencial foi feita por meio da analise morfológica com quite de coloração Panotic, sendo avaliada a porcentagem de polimorfonucleares. 2.7 Capacidade antioxidante total A capacidade antioxidante total (TAP) foi utilizada para avaliar o estado da defesa antioxidante/estresse oxidativo dos pulmões dos coelhos. A TAP foi quantificada comparando a área sob a curva relativa à cinética de oxidação da suspensão de controle lipossomal da fosfatidilcolina usada como referência da matriz biológica (Beretta et al., 2006). Lipossomas para controle foram preparados conforme validação e relatos prévios de outros autores no plasma (Beretta et al, 2006) e nos tecidos animais (Fioretto et al., 2012; Ronchi et al., 2011). Uma porção dorsal do pulmão foi pesado (0.4g), macerado e homogeneizado por 20 s em gelo com 2 mL de tampão salina de fosfato (PBS, 100 mM, pH 7.4) usando um IKA, homogeinizador Ultra-Turrax T8 (Wilmington, NC). Alíquotas do sobrenadante foram coletadas após centrifugação e foi realizada homogeneização do tecido pulmonar a 800/g por 15 minutos em uma centrífuga refrigerada Sorvall RT 6000 (Du pont Co., Newtown, Artigo - Métodos 54 CT) e usada para medida da TAP. A concentração de proteínas foi determinada usando o ensaio BCA descrito previamente (Beretta et al., 2006). 2.8 Análise do dano ao DNA no tecido pulmonar O dano do DNA endógeno foi medido em células do tecido pulmonar conforme descrito previamente por Ronchi et al. (2012). Brevemente, o tecido pulmonar (200 mg) foi macerado e homogeneizado em PSB frio usando um homogeinizador Potter (Wheaton instruments, New Jersey, EUA). A suspensão de células foi coletada e levada ao gelo por 10 min, depois centrifugada a 200/g por 5 minutos a 4°C em agarose para solidificar. As células foram removidas e as porções imersas em solução de lise por 24h. As porções foram então lavadas com PBS e imersas em um preparado tampão alcalino; após 40 minutos, realizou-se a separação do DNA por eletroforese. As porções foram lavadas em etanol absoluto e estocadas para secagem. As porções foram coradas com SYBRgreen, examinadas usando um microscópio fluorescente e a porcentagem de dano no DNA calculada por um escore computadorizado. A passagem de um passo a outro foi realizada sempre sob luz indireta. 2.9 Determinação dos produtos do óxido nítrico no plasma A combinação de nitrato e nitrito (NOx) foi medida para determinar a concentração de óxido nítrico no plasma dos coelhos como descrito previamente (Miles et al., 1996) utilizando um quite de ensaio fluorimétrico para Nitrato/Nitrito (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI). 2.10 Análise estatística Os dados foram analisados no SigmaPlot 11 (SPSS, Chicago, IL). Dados que apresentaram distribuição normal tiveram as diferenças comparadas pela Artigo - Métodos 55 analise de variância de uma via e por comparação entre os pares (teste de Student-Newman-Keuls) e expressos como média ± SD. Dados com distribuição não normal foram comparados por Kruskal-Wallis e a comparação entre os pares pelo teste de Dunn, sendo os dados expressos como mediana (variação). A comparação dos grupos em diferentes momentos foi feita pela medida de analises repetidas de Friedman e a comparação entre os pares pelo método de Dunnett. Tabelas categóricas de contingência foram comparadas pelo teste exato de Fisher. Significância estatística foi definida como p < 0,05. Artigo - Resultados 56 3. RESULTADOS Não houve diferença estatística entre os grupos quanto ao peso (GC:2,83±0,29=GVM:2,62±0,23=GVMNO:2,74±0,32=GVAF:2,50±0,18=GVA FNO: 2,55±0,21 kg; p>0, 05), número de lavagens pulmonar para induzir lesão pulmonar ( GVM:7,8±2,66= GVMNO:7,4±1,87= GVAF:7,6±2,53= GVAFNO:8,2±2,04; p>0,05) e porcentagem de fluido recuperado após lavagem pulmonar (GVM:86%=GVMNO: 81% =GVAF: 87% =GVAFNO: 82%; p>0,05). 3.1 Hemodinâmica, mecânica pulmonar e troca gasosa Os animais dos grupos LPA necessitaram de noradrenalina para manter a pressão arterial média acima de 50 mmHg. Todos os grupos com lesão apresentaram escore inotrópico/vasoativo maior que o GC [GC: 0 (0-30)< GVM: 50 (0-75)=GVMNO: 50 (0-65)=GVAF: 50 (0-60)=GVAFNO: 50 (25-75); p<0,05]. A figura 1 mostra que houve aumento significante da pressão de vias aéreas após a indução da lesão pulmonar em todos os grupos LPA comparado ao GC (p<0,05) assim permanecendo até o fim do experimento. Artigo - Resultados 57 Figura 1. Pressão média da via aérea em relação ao tempo para os grupos. Dados são mostrados com média±DP. *p<0,05: comparação do grupo controle com os grupos com lesão pulmonar. #p<0,05: lesão pulmonar comparada com basal. Grupo GC, grupo controle; GVM ventilação mecânica convencional sem NOi; GVMNO ventilação mecânica convencional com NOi; GVAF ventilação oscilatória de alta frequência sem NOi; GVAFNO ventilação oscilatória de alta frequência com NOi. Grupos com lesão pulmonar aguda mostraram hipoxemia significante após a lesão pulmonar quando comparado à linha de base e ao GC. Após 4h de ventilação mecânica, os grupos GVAF mostraram aumento significante da oxigenação comparado aos grupos GVM, apresentando índice de oxigenação similar ao da linha de base e ao GC. Os valores do Índice de oxigenação ( IO, pressão média de vias aéreas × FiO2 × 100/PaO2; cmH2O/mmHg) e da PaO2 e são mostrados nas figuras 2A e 2B, respectivamente. Artigo - Resultados 58 Figura 2. (A) Índice de oxigenação (pressão média de vias aéreas x FiO2 x100 / PaO2 ) pelo tempo nos grupos. Dados são mostrados com média±DP. *p<0,05 comparando ao grupo controle e #p<0,05 comparando com basal. (B) PaO2 sobre tempo nos grupos. Dados são mostrados com média±DP. *p<0,05 comparando ao grupo controle e #p<0.05 comparando com basal. Grupo GC, grupo controle; GVM ventilação mecânica convencional sem NOi; GVMNO ventilação mecânica convencional com NOi; GVAF ventilação oscilatória de alta frequência sem NOi; GVAFNO ventilação oscilatória de alta frequência com NOi. Artigo - Resultados 59 3.2 Lesão oxidativa 3.2.1 Capacidade antioxidante total Os grupos submetidos a ventilação oscilatória de alta frequência exibiram TAP no tecido pulmonar comparável ao GC e, significantemente, maior que os grupos GVM indicando maior proteção contra o estresse oxidativo nos grupos VOAF. Embora sem significância estatística, o GVM associado ao NOi mostrou TAP maior que o GVM sem o gás. 3.2.2 Análise do dano ao DNA em tecido pulmonar O dano ao DNA endógeno foi significativamente mais elevado nos animais submetidos a VMC sem NOi que nos grupos GC, GVAF e GVMC sem oxido nítrico (tabela 1). 3.3 Contagem de células polimorfonucleares A porcentagem de células PMN recuperadas do lavado broncoalveolar foi significantemente mais elevada no GVMC que nos GVAF e no GVMNO, as quais forma similares ao GC (tabela 1). 3.4 Quantificação dos produtos do óxido nítrico no plasma Não houve diferença entre os grupos para concentração de NO× (tabela 1). Artigo - Resultados 60 Tabela 1. Avaliação da capacidade antioxidante total (TAP), Dano ao DNA no tecido pulmonar, número de células polimorfonucleares (PMN) e concentração nitrito/nitrato no plasma. GC GVM GVMNO GVAF GVAFNO Performance antioxidante (%proteção g/proteína) 58,9±4,31 46,9±3,09 55,9±2,4 69,2±5,02* 68,7±4,14* Dano do DNA (%DNA na calda) 10,6±2,04* 29,9±3,91 8,75±3,06* 8,65±2,42* 7,10±2,18* Número de células PNM × 106 (lavado broncoalveolar) 0,21±0,17* 4,56±1,82 0,91±0,42 0,41±0,18* 0,29±0,18* Concentração no plasma nitrito/nitrato 3,54±0,51 4,44±0,96 8,71±1,96 6,14±1,30 6,17±1,22 Dados são mostrados com média±DP. *p<0,05 comparando grupos com o grupo de ventilação mecânica convencional (VMC). One Way análise de variância (teste de Student-Newman-Keus). Grupo GC, grupo controle; GVM ventilação mecânica convencional sem NOi; GVMNO ventilação mecânica convencional com NOi; GVAF ventilação oscilatória de alta frequência sem NOi; GVAFNO ventilação oscilatória de alta frequência com NOi. Artigo - Discussão 61 4. DISCUSSÃO Este estudo corrobora achados prévios de que a VOAF, per se, aumenta a oxigenação e apresenta efeito protetor contra o estresse oxidativo e a lesão inflamatória pulmonar. Além disso, os efeitos da VOAF não aumentam quando o NOi foi associado e a ventilação mecânica convencional associou-se a melhora da oxigenação e redução do dano ao DNA quando utilizada juntamente com o NOi. Até onde pudemos constatar, este é o primeiro estudo que associou VOAF ao NOi e comparou o dano no DNA em tecido pulmonar pelo teste do cometa. Demonstramos previamente, por meio da avaliação da TAP, que a VOAF tem importante função de proteção contra a lesão pulmonar oxidativa em modelo experimental de LPA (Ronchi et al., 2011). De fato, a VOAF tem mostrado, consistentemente, benefícios em SDRA em estudos clínicos e experimentais (Imai et al.,2001; Mehta et al., 2004; Rotta et al., 2001). Em acordo com estudos prévios nosso estudo confirmou que a VOAF melhora oxigenação e reduz lesão inflamatória (Mehta et al., 2004; Rotta et al., 2001). O óxido nítrico inalatório melhora a oxigenação arterial em pacientes com SDRA por diminuir o shunt intrapulmonar e a pressão arterial pulmonar (Rossaint et al., 1993). Administrado em baixas doses e sob monitoração contínua, o gás é opção terapêutica segura para tratar hipertensão pulmonar (Rossaint et al., 1994). Fioretto et al. (2004) observaram melhora aguda no índice de oxigenação quando o NOi foi administrado precocemente e associado a VMC, 1,5 horas após o diagnóstico de SDRA em crianças, quando comparado a VMC sem o gás. O tratamento prolongado também levou a aumento da oxigenação, além disso a FiO2 e a pressão inspiratória de pico puderam ser diminuídas de forma rápida e significativa. Artigo - Discussão 62 Outros investigadores tem sugerido que o NOi pode diminuir o processo inflamatório. Razavi et al. (2002) avaliaram o efeito do NOi sobre a inflamação pulmonar em modelo em ratos com lesão pulmonar induzida por sepse, demonstrando que a exposição precoce ao gás relacionava-se a diminuição da infiltração por leucócitos e a menos lesão oxidativa, avaliada pela medida da 8- isoprostana. Weigand et al. (2000) analisaram a peroxidação lipídica pelo malondialdeido, hexanal e pentanal em pacientes com SDRA. Eles demonstraram que malondialdeido, hexanal e pentanal estavam significativamente elevados, dado que indicava peroxidação lipídica pulmonar. Não obstante, a concentração sanguínea destes produtos da peroxidação lipídica não foram afetados pela administração de NOi por 24h. Parece que a resposta ao NOi é melhor em pacientes com insuficiência respiratória mais grave (Dobyns et al., 1999) e quando administrado logo após o diagnóstico de SDRA (Fioretto et al., 2004). Estes resultados apontam para o início de uma dose baixa de NOi para atenuar a inflamação pulmonar. Em acordo, Chollet-Martin et al. (1996) que mostraram que a redução da inflamação pulmonar na SDRA induzida pelo gás é refletida por ativação de PMN e liberação de IL-8 / IL-6. Além disso, outro estudo do nosso grupo comparando VMC com e sem NOi, mostrou que a administração precoce de baixa dose de NOi atenuou o estresse oxidativo e as lesões histológicas e inflamatórias (Fioretto et al., 2012). É interessante notar que o NOi não teve impacto quando associado a VOAF em nosso modelo. Porém, quando administrado junto a VMC, imediatamente após a lesão pulmonar, observamos que o dano ao DNA foi significativamente menor na VMC com NOi do que sem o gás. Apesar de não significante a avaliação da TAP evidenciou aumento da capacidade antioxidante no tecido pulmonar do GVMNO. Entretanto, como pacientes com SDRA são submetidos a ventilação mecânica por longos períodos em unidades de terapia intensiva, mais estudos são necessários para avaliar os mecanismos de dano Artigo - Discussão 63 pulmonar por lesão oxidativa em plasma de pacientes usando a TAP e diferentes estratégias de ventilação. Este conhecimento fornecerá melhor entendimento da proteção antioxidante contra o estresse oxidativo na SDRA. O fato do NOi não ter efeito quando associado a VOAF pode ser devido ao fato de que esse modo ventilatório, per se, já evita grandes variações de pressões e volumes alveolares, reduzindo a lesão pulmonar. Entretanto, quando associado a ventilação mecânica convencional os efeitos do NOi podem ser mais claramente identificados. Estes achados podem ser também ser explicados pelas diferenças nos modelos animais de lesão pulmonar. Idealmente, o modelo animal de LPA deve reproduzir os mecanismos e as consequências da LPA humana, inclusive mudanças fisiológicas e patológicas. Porém, nenhum modelo animal sozinho reproduz todas as características da SDRA nos humanos. Os coelhos, por exemplo, tem 57% de similaridade com a região variável TLR4 e estão associados a moderada produção de oxido nítrico. Diferentemente, ratos e camundongos têm alta produção de óxido nítrico, a qual é discreta em humanos e primatas (Matute-Bello et al., 2008). Atualmente, um dos modelos de indução de lesão pulmonar mais utilizados é a lavagem alveolar com salina aquecida. É, primariamente, um modelo de depleção de surfactante que causa lesão pulmonar muito semelhante a SDRA humana nos efeitos sobre oxigenação, complacência pulmonar, atelectasia e edema perivascular e peribrônquico. Porém, induz menos infiltração por macrófagos e linfócitos, a menos que outra agressão, como a ventilação mecânica, seja adicionada (Matute-Bello et al., 2008). Com relação a dose de NOi, é recomendado que o paciente seja mantido com a dose mais baixa associada a resposta positiva na oxigenação, ou seja, acréscimo maior ou igual a 10 mmHg na relação PaO2 /FiO2 (Cuthbertson et al., 1997; Fioretto et al., 2003). Previamente, em estudo clínico de nosso grupo, dose mais baixa de NOi (5 ppm) foi administrada pelo período mais curto de tempo para diminuir os potenciais efeitos tóxicos como formação de metahemoglobina Artigo - Discussão 64 e acúmulo de dióxido de nitrogênio. O mesmo princípio e dose foram utilizados no presente estudo. Além disso, procuramos usar a mesma dose que usamos em estudos prévios para torná-los comparáveis (Fioretto et al., 2011, 2004). Implicações Futuras Primeiramente, em função da complexidade da fisiopatologia da SDRA, encontrar um único tratamento para a síndrome será difícil. Mais estudos sobre estes mecanismos deverão se realizados para se obter o melhor desfecho. A avaliação da TAP e o teste do cometa devem continuar em uso para avaliar a capacidade antioxidante e o estresse oxidativo dos pacientes. Como demonstramos, esses testes podem identificar o estresse oxidativo em modelos experimentais (Ronchi et al., 2012). Em segundo lugar, o uso de suplementos antioxidantes poderão ser importante recurso de tratamento destes pacientes minimizando a lesão causada pelo estresse oxidativo. Também demonstramos correlação entre os valores de biomarcadores de estresse oxidativo no sangue periférico e nos órgãos alvos, sugerindo que a avaliação dos sangue periférico poderá ser utilizada em grandes estudos epidemiológicos conduzidos por intensivistas quando a avaliação do órgão envolvido não for possível. Artigo - Conclusão 65 CONCLUSÃO O óxido nítrico inalatório não traz efeitos benéficos quando associado a VOAF no que diz respeito ao estresse oxidativo e dano no DNA do pulmão. De maneira geral, a lesão pulmonar pode ser atenuada utilizando a VOAF ou a VMC protetora associadas ao NOi. Artigo 66 Conflito de Interesses Os autores declaram não haver conflito de interesses AGRADECIMENTOS Financiado em parte pela FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo), São Paulo, SP, número do processo: 2008/08199-2 e por U.S. Department of Agriculture, Agri-cultural Research Service under Cooperative Agreement, USDA:58-1950-7-07. Qualquer opinião, achado, conclusão ou recomendação expressa nesta publicação são do autor e não refletem, necessariamente, a opinião da UNESP ou do Departamento de Agricultura dos EUA. Nós agradecemos a todos os funcionários do laboratório clinico e experimental do Departamento de Pediatria – UNESP e do laboratório Experimental da Tufts University por sua assistência e a Colin E. Knaggs pela revisão do texto. Artigo - Referências 67 Acute Respiratory Distress Syndrome Network, 2000. 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Care Med. 28, 3429–3435. Desdobramento da Tese 72 IV – Desdobramentos da Tese Desdobramento da Tese 73 Em decorrência de nossa atuação no Centro de Pesquisa Clínica e Experimental do Departamento de Pediatria – Faculdade de Medicina de Botucatu – UNESP, desde a implantação do modelo experimental de lesão pulmonar aguda em 2006, foi possível a realização do mestrado, da atual tese de doutoramento e a participação em outros projetos do grupo. Cabe destacar o trabalho publicado na revista Experimental Biology and Medicine 2011; 236: 1188–1196. DOI: 10.1258/ebm.2011.011085 por Ronchi CR, Ferreira ALA, Campos FJ et al. Esse estudo comparou a ventilação mecânica convencional proterora (VMC) e a ventilação oscilatória de alta frequência (VOAF) quanto a oxigenação, estresse oxidativo pulmonar, inflamação e lesão pulmonar histopatológica em modelo de lesão pulmonar aguda (LPA) em coelhos, utilizando, pela primeira vez na literatura, método de avaliação global da oxidação do tecido pulmonar (Total Antioxidant Performanece). Demonstramos que o tratamento com VAF melhora a oxigenação, o processo inflamatório, reduz o dano histopatológico e atenua o estresse oxidativo pulmonar comparado à ventilação mecânica convencional. Mais recentemente, em 2015, novo projeto aprovado pela FAPESP sob o número 2014/15683-9 (Efeito da suplementação com licopeno sobre o estresse oxidativo pulmonar induzido por lesão pulmonar aguda experimental) estudará o papel do licopeno no estresse oxidativo pulmonar de animais submetidos a diferentes estratégias ventilatórias protetoras, garantindo a continuação dos estudos na área e nossa ligação com o grupo de pesquisa. Considerações Finais 74 V – Comentários finais Considerações Finais 75 A SDRA é doença respiratória grave e que motiva a internação ou complica a evolução de crianças e adultos gravemente enfermos. A evolução muitas vezes dramática destes pacientes exige busca incessante de novas formas de tratamento e melhor entendimento da fisiopatologia. Sabidamente, a SDRA apresenta fisiopatologia complexa, com lesão pulmonar extensa e consequente diminuição da relação V/Q e da oxigenação. Desta forma, além da estabilização hemodinâmica e hidreletrolítica dos pacientes, a ventilação mecânica é parte fundamental do tratamento. Apesar da utilização da VM protetora, nem sempre os pacientes respondem satisfatoriamente, necessitando de outras modalidades ventilatórias e tratamentos adjuvantes. Existem poucos estudos avaliando o papel do estresse oxidativo no desenvolvimento e progressão da SDRA e correlacionando-o com outras modalidades terapêuticas empregadas no condução dos pacientes com a síndrome. Assim como são conflitantes os resultados de estudos que avaliaram a suplementação com antioxidantes na SDRA. Sabemos que a melhor fonte de antioxidantes, que têm um papel fundamental no combate ao estresse oxidativo, é a alimentação. Existe grande variedade de alimentos ricos em antioxidantes, o que justifica estudos clínicos mais aprofundados para avaliar se ocorrem mudanças no metabolismo oxidativo em pacientes gravemente enfermos submetidos à suplementação dietéticas destes elementos.