JONATHAN WESLEY FERREIRA RIBEIRO ASPECTOS DO NICHO DE REGENERAÇÃO EM DUAS ESPÉCIES DE Gochnatia (ASTERACEAE) EM COMUNIDADE DE CERRADO ASSIS 2014 JONATHAN WESLEY FERREIRA RIBEIRO ASPECTOS DO NICHO DE REGENERAÇÃO EM DUAS ESPÉCIES DE Gochnatia (ASTERACEAE) EM COMUNIDADE DE CERRADO Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências e Letras de Assis – UNESP – Universidade Estadual Paulista para a obtenção do título de Mestre em Biociências (Área de Conhecimento: Caracterização e Aplicação da Diversidade Biológica). Orientadora: Dra. Rosana Marta Kolb ASSIS 2014 Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) Biblioteca do Instituto Educacional de Assis – I E D A Ribeiro, Jonathan Wesley Ferreira R484a Aspectos do nicho de regeneração em duas espécies de Gochnatia (Asteraceae) em comunidade de cerrado / Jonathan Wesley Ferreira Ribeiro. Assis, 2014 92 f. il. Dissertação de Mestrado – Faculdade de Ciências e Letras de Assis – Universidade Estadual Paulista. Orientadora: Dra. Rosana Marta Kolb 1. Gochnatia barrosii. 2. Gochnatia polymorpha. 3. Germinação. 4. Plasticidade fenotípica. 5. Anatomia foliar. I. Título. CDD 634.6 Aos meus pais, Jonas e Edna, dedico. AGRADECIMENTOS A Deus, pela vida e por permitir a concretização desta etapa. Aos meus pais, Jonas e Edna, e a minha irmã (Grazi) e cunhado (Thiago), por todo amor, carinho e apoio incondicional nesta caminhada. A Dra. Rosana Kolb, pela excelente orientação, paciência e amizade. A Raquel e aos queridos amigos de laboratório, Carina, Graciele, Luiz Felipe, Milena, Suellen e Thais, por toda ajuda e colaboração no projeto, e pela amizade. Aos estagiários, Alison, Diego, Edivaldo, Guilherme e Henrique, pela ajuda em diversas etapas do projeto. Aos colegas e amigos da Pós-Graduação, em especial, Érika, Flávia, Milena, Priscila, Vanessa e Yara, pelo auxílio nos experimentos e principalmente pela amizade. Aos amigos distantes, pela amizade verdadeira, incentivo e apoio neste processo, especialmente ao Pedro, por toda ajuda. Aos doutores (as) Darío Palmieri, Mônica Bertão, Regildo da Silva e Ciro Branco por cederem seus laboratórios e/ou equipamentos para a realização de partes deste estudo. A Dra. Giselda Durigan pela leitura crítica e preciosas contribuições no texto durante a banca de qualificação. Ao Dr. Massanori Takaki por realizar as medidas de V/VE, leitura crítica do texto e sugestões durante a banca. Ao Dr. Luiz Fernando de Almeida pelo auxílio nas medidas de fluorescência, leitura crítica do texto e sugestões durante a banca. Ao doutorando Danilo M. Franco pelo auxílio nas medidas de fluorescência. Aos funcionários Gilberto e Allan pelo auxílio na parte experimental. A FAPESP (processo 2013/03748-6) e a PROPG da UNESP pelas bolsas de mestrado concedidas. Ao Instituto Florestal do Estado de São Paulo (COTEC) pela permissão para realização das coletas do material vegetal e medidas ambientais na Estação Ecológica de Assis. Muito obrigado! SUMÁRIO INTRODUÇÃO GERAL...................................................................................11 REFERÊNCIAS...............................................................................................20 CAPÍTULO 1 – Nicho de germinação em duas espécies de Gochnatia (Asteraceae) ocorrentes no Cerrado...........................................................26 Resumo...........................................................................................................27 Introdução........................................................................................................28 Material e métodos..........................................................................................30 Resultados.......................................................................................................34 Discussão........................................................................................................41 Agradecimentos...............................................................................................45 Referências.....................................................................................................45 CAPÍTULO 2 – Plasticidade mofofisiológica à luz em duas espécies de Gochnatia (Asteraceae) ocorrentes no Cerrado.........................................50 Resumo...........................................................................................................51 Introdução........................................................................................................52 Material e métodos..........................................................................................55 Resultados.......................................................................................................61 Discussão........................................................................................................72 Agradecimentos...............................................................................................77 Referências.....................................................................................................77 CONCLUSÕES GERAIS.................................................................................84 APÊNDICE......................................................................................................85 LISTA DE TABELAS Capítulo 1 Tabela 1. Temperatura (ºC) na superfície do solo em diferentes micro-habitats na Estação Ecológica de Assis, SP, nos meses de outubro de 2012 e janeiro de 2013 em dois períodos do dia (8 e 12h)..............................................................................35 Tabela 2. Porcentagem de sombreamento natural ao nível do solo em diferentes ambientes de cerrado sensu stricto, cerradão e em pleno sol, durante o período da manhã (8h) e tarde (12h) na Estação Ecológica de Assis, SP...................................36 Tabela 3 – Resumo da Anova fatorial (axb) para o efeito de temperaturas constantes e luz sobre a germinação (G) e tempo médio de germinação (TMG) de cipselas de espécies de Gochnatia...............................................................................................36 Tabela 4 – Porcentagem de germinação (G) e tempo médio de germinação (TMG) de cipselas de espécies de Gochnatia em diferentes temperaturas constantes de incubação na luz e no escuro.....................................................................................37 Tabela 5 – Resumo da Anova fatorial (axb) para o efeito de temperaturas alternadas e luz sobre a germinação (G) e tempo médio de germinação (TMG) de cipselas de espécies de Gochnatia...............................................................................................38 Tabela 6 – Porcentagem de germinação (G) e tempo médio de germinação (TMG) de cipselas de espécies de Gochnatia em diferentes temperaturas alternadas de incubação na luz e no escuro.....................................................................................39 Capítulo 2 Tabela 1 – Comprimento do caule (cm), diâmetro do colo (mm) e índice de estiolamento (cm.mm-1) em plantas de Gochnatia barrosii e G. polymorpha submetidas a diferentes níveis de sombreamento (0, 50, 70 e 98%)........................62 Tabela 2 – Concentração (µg.cm²) de pigmentos fotossintéticos em folhas de plantas de Gochnatia barrosii e G. polymorpha submetidas a diferentes níveis de sombreamento (0, 50, 70 e 98%)...............................................................................66 Tabela 3 – Atributos morfo-anatômicos foliares de plantas de Gochnatia barrosii e G. polymorpha submetidas a diferentes níveis de sombreamento (0, 50, 70 e 98%)...........................................................................................................................68 Tabela 4 – Índice de plasticidade fenotípica (IPF) em relação à luz de atributos de crescimento, fisiológicos e morfo-anatômicos para Gochnatia barrosii e G. polymorpha.................................................................................................................72 LISTA DE FIGURAS Introdução Geral Figura 1 – Indivíduo adulto (A), inflorescência (B) e cipselas (C) de Gochnatia barrosii; e indivíduo adulto (D), tronco (E) e inflorescência (F) de G. polymorpha.................................................................................................................18 Capítulo 1 Figura 1 – Temperaturas e precipitação mensal durante o ano de 2012 no município de Assis, SP...............................................................................................................34 Figura 2 – Figura 2. Porcentagem de germinação e tempo médio de germinação (TMG) de cipselas de Gochnatia barrosii (A e B) e G. polymorpha (C e D) respectivamente, sob luz com diferentes razões de vermelho e vermelho extremo (V/VE 0,1; 0,5; 7,2).....................................................................................................40 Figura 3 – Porcentagem de germinação e tempo médio de germinação (TMG) de cipselas de Gochnatia barrosii (A e B) e G. polymorpha (C e D) respectivamente, em diferentes potenciais osmóticos (MPa).......................................................................41 Capítulo 2 Figura 1 – Biomassa seca das folhas (A; D), caule (B; E) e raízes (C; F) em plantas de Gochnatia barrosii (■) e G. polymorpha (▲) submetidas a diferentes níveis de sombreamento (0, 50, 70 e 98%)...............................................................................61 Figura 2 – Condutância estomática (gs) (A; B) e rendimento quântico potencial do PSII (Fv/Fm) (C; D) em folhas de plantas de Gochnatia barrosii (■) e G. polymorpha (▲) submetidas a diferentes níveis de sombreamento (0, 50, 70 e 98%).................63 Figura 3 – Curvas de saturação de luz em plantas de Gochnatia barrosii (A e C) e G. polymorpha (B e D) crescidas em diferentes níveis de sombreamento (0, 50, 70 e 98%). Taxa aparente de transporte de elétrons (ETR) (A e B), e quenching não fotoquímico (NPQ) (C e D).........................................................................................65 Figura 4 – Seções transversais de folha de Gochnatia barrosii (A-D) e G. polymorpha (E-H), submetidas a diferentes níveis de sombreamento. A e E – 0%, B e F – 50%, C e G – 70%, e D e H – 98% de sombreamento...........................................................70 Figura 5 – Posição dos indivíduos de G. barrosii (B) e G. polymorpha (P) submetidos a diferentes níveis de sombreamento (0 - plena luz; 50 - 50% sombreamento; 70 - 70% de sombreamento e 98 - 98% de sombreamento) nos dois primeiros componentes principais..............................................................................................71 RIBEIRO, Jonathan Wesley Ferreira. Aspectos do nicho de regeneração em duas espécies de Gochnatia (Asteraceae) em comunidade de Cerrado. 2014. 92f. Dissertação (Mestrado em Biociências). – Faculdade de Ciências e Letras, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Assis, 2014. RESUMO Entender quais fatores determinam a distribuição ecológica das plantas é de suma importância para a conservação das suas espécies. As espécies Gochnatia barrosii e G. polymorpha apresentam padrões de distribuição distintos nas fitofisionomias do Cerrado, com G. polymorpha ocupando um maior número de micro-habitats em relação a G. barrosii. Diante disto, o objetivo deste estudo foi avaliar se os habitats preferenciais das espécies G. barrosii e G. polymorpha são distintos por restrições de água, temperatura ou de luz durante as fases iniciais de desenvolvimento, e também se o nicho de regeneração está relacionado com a distribuição ecológica das espécies em diferentes fitofisionomias do Cerrado. Foi avaliado o potencial germinativo das cipselas dessas espécies submetidas a diferentes fatores ambientais (temperaturas, qualidade de luz e disponibilidade de água) sob condições controladas. Além disso, avaliaram-se as respostas de crescimento, de atributos fisiológicos e morfo-anatômicos foliares em plantas submetidas a diferentes níveis de sombreamento em casa de vegetação. A espécie G. polymorpha apresentou maior amplitude térmica com porcentagens de germinação elevadas; mostrou ainda melhor desempenho nas respostas germinativas frente a diferentes situações, com menor sensibilidade à luz e maior tolerância ao estresse hídrico do que G. barrosii. Ambas as espécies apresentaram plasticidade fenotípica, sendo capazes de alterar suas características de crescimento, sua morfo-anatomia e fisiologia foliar em resposta aos diferentes níveis de sombreamento. Porém, a espécie G. polymorpha apresentou maior plasticidade fenotípica em relação a G. barrosii. Sendo assim, conclui-se que os fatores água, luz e temperatura são limitantes para a germinação das cipselas, sendo a luz um importante filtro ambiental também para o desenvolvimento inicial das plantas, e consequentemente, para a distribuição espacial destas espécies no Cerrado. As características de germinação e desenvolvimento das plantas em resposta aos diferentes fatores ambientais testados foram similares entre as espécies, não sendo possível afirmar, portanto, que os nichos de regeneração são distintos. No entanto, o nicho de regeneração nas espécies estudadas está relacionado com a distribuição ecológica em diferentes micro-habitats, explicando em parte o padrão de distribuição distinto dessas espécies no Cerrado. Palavras-chave: Germinação. Temperaturas. Luz. Estresse hídrico. Plasticidade fenotípica. Sombreamento. Anatomia foliar. RIBEIRO, Jonathan Wesley Ferreira. Regeneration niche aspects of two Gochnatia species (Asteraceae) in Cerrado community. 2014. 92p. Dissertation (Master’s degree in Biosciences). – Faculty of Sciences and Languages of Assis, São Paulo State University, Assis, 2014. ABSTRACT Understanding which factors determine the ecological distribution of plants is very important for the conservation of their species. The Gochnatia barrosii and G. polymorpha species exhibit distinct patterns of distribution in the Cerrado phytophysiognomies, with the species G. polymorpha occupying a larger number of micro-habitats in relation to G. barrosii. Given these facts, it was aimed to evaluate if the preferential habitats for G. barrosii and G. polymorpha species are distinct for water, temperature or light during the initial growth stages, and also if the regeneration niche is related to ecological distribution of species in different vegetation types from Cerrado. We evaluated the germinative potential of the cypselae of both species submitted to different environmental factors (temperature, light quality, water availability) under controlled conditions. Moreover, we evaluated the response of growth, physiological attributes and morphoanatomical leaf attributes from plants submitted to different shading levels under greenhouse conditions. The species G. polymorpha presented higher thermal amplitude, with high germination rates; it even showed better responses facing different situations, with lesser light sensibility and higher hydric stress tolerance than G. barrosii. Both species presented phenotypic plasticity, being able to change their growth, morphoanatomical and physiological leaf characteristics in response to different levels of shading. However, the G. polymorpha species showed greater phenotypic plasticity compared to G. barrosii. Therefore, it was concluded that the water, light and temperature are limiting for germination cypselae, being light an important environmental filter also for the initial development, and thus, for the spatial distribution of these species in the Cerrado vegetations. The germination characteristics and development of plants in response to different environmental factors were similar between species; therefore, it is not possible to say that the regeneration niches are distinct. Moreover, the regeneration niche of the studied species is related to the ecological distribution in different micro-habitats, explaining at least in part the different distribution pattern of these species in Cerrado phytophysiognomies. Keywords: Germination. Temperature. Light. Hydric stress. Phenotypical plasticity. Shading. Foliar anatomy. 11 INTRODUÇÃO GERAL Um dos maiores desafios na pesquisa em ecologia de comunidades vegetais é entender quais os processos que determinam a distribuição das espécies, principalmente em florestas tropicais, onde a riqueza de espécies arbóreas, por exemplo, pode alcançar aproximadamente 300 espécies por hectare coexistindo de maneira estável (THOMAS et al., 1998; SILVERTOWN, 2004). A coexistência implica na sobreposição espaço-temporal na distribuição de algumas espécies, sendo que as populações são limitadas por fatores comuns e por interações antagônicas (GIACOMINI, 2007). Uma das explicações da teoria ecológica clássica para este fenômeno é o “princípio da exclusão competitiva”, que afirma que a convivência estável entre diferentes espécies só é possível quando elas ocupam nichos ecológicos diferentes (GAUSE, 1934; CHESSON, 1991; SILVERTOWN, 2004). O princípio da exclusão competitiva geralmente é bem aplicado para explicar a coexistência e/ou partilhamento de recursos em espécies animais, onde o nicho trófico, por exemplo, é observado facilmente; no caso das plantas, entender a coexistência não é tão simples, pois todos os vegetais consomem exatamente os mesmos recursos, como CO2, luz, água e nutrientes minerais (GRUBB, 1977; SILVERTOWN, 2004). Em plantas, a coexistência é facilitada por variações na competição entre as espécies ao longo de gradientes ambientais. Com isso, a riqueza de espécies é largamente dependente da heterogeneidade ambiental, em conjunto com adaptações às condições físicas (MURRAY; GARCIA, 2002). Assim, as diferenças nas habilidades competitivas das espécies devem ser contrabalanceadas por 12 diferenças de nicho para que se tenha uma coexistência estável entre as espécies (KOBE, 1999; GIACOMINI, 2007). Hutchinson (1957) definiu o nicho de uma espécie como um conjunto de n- dimensões, cada qual representando um fator ou recurso importante para a espécie em um espaço n-dimensional (nicho multidimensional). Dessa forma, podem-se descrever os limites ou intervalos de atividade de cada espécie de uma comunidade ao longo de cada uma das dimensões de seu ambiente. Essas dimensões incluem fatores físicos, químicos e biológicos (RICKLEFS, 2010). O nicho ecológico em plantas é composto por quatro componentes básicos: o nicho de hábitat, que são os limites físicos e químicos tolerados, o nicho de forma de vida, que é a expressão do tamanho e produtividade anual, o nicho fenológico, que é o padrão de desenvolvimento sazonal, e o nicho de regeneração, que expressa os limites de condições abióticas e bióticas toleradas e/ou requeridas durante o processo de regeneração de uma espécie (GRUBB, 1977). Neste último caso, as diferenças de nicho entre espécies coexistentes podem já se manifestar durante os primeiros estágios de desenvolvimento, como por exemplo, nas fases de germinação de sementes e desenvolvimento de plântulas (GRUBB, 1977; RANIERI et al., 2012). Nas espécies simpátricas Lavoisiera cordata Cogn. e L. francavillana Cogn., foram observadas diferenças no comportamento germinativo das sementes quando submetidas a diferentes temperaturas constantes (15, 20, 25 e 30ºC), indicando diferenças adaptativas na germinação, contribuindo para a diferenciação de nicho e ocupação de diferentes ambientes (RANIERI et al., 2003). Da mesma forma, Ranieri et al. (2012) encontraram diferenças no nicho de germinação para as espécies 13 simpátricas Sinningia rupicola (Mart.) Wiehler e S. allagophylla (Mart.) Wiehler em relação à temperatura ótima de germinação. Já na fase de plântula, as espécies Mimosa claussenii Benth., M. decorticans Barneby, M. heringeri Barneby e M. setosissima Taub. apresentaram diferenciação de nicho possivelmente por adaptações distintas às condições edáficas (SIMON; HAY, 2003). A germinação e o desenvolvimento das plântulas são fases críticas do ciclo de vida dos vegetais superiores (VILLALOBOS; PELÁEZ, 2001), sendo a sobrevivência das plantas a estes eventos crucial para o crescimento e manutenção das populações (MELO et al., 2004). Muitos fatores interferem nesses eventos, sendo a água, a temperatura e a luz os fatores principais na influência ou controle desses processos (BASKIN; BASKIN, 1998; BENECH-ARNOLD; SÁNCHEZ, 1995; BEWLEY; BLACK, 1994). A disponibilidade de água consiste num fator crucial para a germinação, pois este processo tem início apenas após a embebição da semente, que leva à reidratação dos tecidos e ativação do metabolismo, culminando na emergência da raiz primária (LARCHER, 2006). A temperatura também atua como fator limitante principalmente para a germinação de sementes, pois afeta individualmente todos os processos germinativos, agindo principalmente na velocidade de embebição de água pela semente e em todas as reações metabólicas do processo, afetando assim a germinação total e a velocidade de germinação (CARVALHO; NAKAGAWA, 2000; MARCOS-FILHO, 2005). A luz, por sua vez, consiste em um importante recurso para as plantas, provendo energia para a síntese de todas as moléculas orgânicas na fotossíntese e 14 ainda sendo responsável pela modulação da morfogênese de tecidos e órgãos em todas as fases de desenvolvimento (CARVALHO; TAKAKI; AZEVEDO, 2011). A percepção do ambiente luminoso é mediada através de fotorreceptores, que são caracterizados pelo comprimento de onda que podem perceber (SULLIVAN; DENG, 2003). As clorofilas apresentam pico de absorção na luz azul (430nm) e na vermelha (660nm); os fotorreceptores da família dos fitocromos apresentam pico de absorbância nas luzes vermelho e vermelho-extremo (600-750nm); criptocromos e fototropinas nas regiões UVA e azul (320-500nm) e os carotenoides com pico de absorbância também na região do azul (BRIGGS; HUALA, 1999; CARVALHO et al., 2011; CASAL et al., 2003). Os fitocromos constituem uma família de cromoproteínas com duas formas estáveis nos tecidos vegetais, sendo os responsáveis pela sensibilidade das sementes à luz (SMITH, 2000). Estão presentes nas células sob duas formas fotoconversíveis (MANCINELLI, 1994), simbolizadas como Fv e Fve; a primeira é a forma inativa, absorve luz vermelha (V: 600-700nm) e por fotoconversão altera sua estrutura para a forma Fve, forma ativa responsável pela promoção de diversos processos, incluindo a germinação, absorvendo luz vermelho-extremo (VE: 700- 750nm) e voltando à forma inativa Fv (BEWLEY; BLACK, 1994; SMITH, 2000). Sementes podem apresentar diferentes respostas à luz de acordo com as formas de fitocromo que controlam a germinação. Tais respostas podem se apresentar basicamente como sementes que germinam apenas na presença de luz (induzidas pela luz V e inibidas pela luz VE), sementes que germinam na ausência de luz e aquelas insensíveis à luz, que germinam em ambas as condições (TAKAKI, 2001). Já o fluxo de fótons entre 400 e 700nm do espectro solar, denominado de radiação fotossinteticamente ativa (RFA), é responsável pela excitação das 15 moléculas de clorofi la, iniciando o fluxo de energia necessário para a fotossíntese (MONTEITH, 1972). O nível de irradiância (µmol.m-2.s-1) da RFA é um fator determinante que interfere no crescimento e desenvolvimento das plântulas (KUREPIN et al., 2011). Assim, características do ambiente como o sombreamento causado pela presença de dossel, a deposição de serapilheira e presença de estrato herbáceo- arbustivo podem alterar a composição espectral da luz, bem como diminuir a amplitude térmica (FENNER; THOMPSON, 2005) na superfície do solo e reduzir a irradiância da RFA (FRANCO, 2002), influenciando a germinação e o desenvolvimento das plantas, respectivamente. Em condições de sombreamento, onde os níveis de irradiância são menores, plântulas podem ampliar a eficiência da captura de luz através do aumento da razão clorofila b/a, do aumento de área foliar e da redução da razão raiz/parte aérea (MELO et al., 2004). Em níveis distintos de luz, cada espécie pode mostrar crescimento relativo maior do que outra para sobreviver. Este particionamento do ambiente de luz fornece uma explicação para a dinâmica sucessional e sugere que a coexistência e a diversidade de espécies arbóreas tropicais são parcialmente mantidas através da diferenciação de nicho (KOBE, 1999). Neste contexto, estudos que visam o conhecimento da ecologia de regeneração são importantes, pois permitem saber o grau de vulnerabilidade das espécies frente a mudanças climáticas e ambientais (HOFFMANN, 2000), além de fornecer conhecimento para o desenvolvimento de técnicas em ecologia da restauração. Coopera-se, dessa forma, para a conservação da biodiversidade, principalmente quando se trata de ecossistemas tropicais, localizados, em sua 16 maioria, em regiões do mundo que apresentam rápida expansão das populações e aumento na demanda por alimentos, colocando assim, ecossistemas megadiversos e complexos em risco (KLINK; MACHADO, 2005). O Brasil é reconhecido por abrigar a maior biodiversidade do mundo, e o bioma do Cerrado figura entre as regiões biodiversas do planeta de maior necessidade para conservação (MYERS et al., 2000). O Cerrado é o segundo maior bioma brasileiro, ocupando cerca de 21% do território do país (KLINK; MACHADO, 2005), compondo cerca de 1/3 da biota brasileira e cerca de 5% da diversidade de fauna e flora mundiais (BATALHA; MANTOVANI, 2001). Atualmente registra-se 11,627 espécies vegetais vasculares, sendo 44% endêmicas (MENDONÇA et al., 2008; WALTER, 2006). Nesse sentido, o Cerrado é a savana tropical mais diversificada do mundo (KLINK; MACHADO, 2005). O estado de São Paulo apresenta um dos quadros mais intensos de devastação do Cerrado. Com a evolução tecnológica da agricultura, sua vegetação passou por rápida supressão nas últimas décadas (DURIGAN et al., 1999). Atualmente, estima-se que reste menos de 12% da cobertura original do bioma no estado (SÃO PAULO, 2005). Menos de 10% da área total de remanescentes encontra-se protegida em Unidades de Conservação Estaduais (SÃO PAULO, 1997). Uma das poucas áreas remanescentes corresponde à Estação Ecológica de Assis, localizada no município de Assis, que abriga um dos maiores fragmentos de Cerrado no estado (SÃO PAULO, 1997). Sua vegetação é classificada como cerrado sensu lato, com o predomínio da fisionomia de cerradão, ocorrendo também fisionomias de cerrado sensu stricto e florestas paludículas (ROSSATTO; TONIATO; DURIGAN, 2008). 17 No estado de São Paulo duas espécies simpátricas do gênero Gochnatia são particularmente comuns e dominantes em áreas de borda do cerradão (ROSSATO; KOLB, 2012). Gochnatia barrosii Cabrera (cambará-veludo) é um arbusto que pode alcançar 2 m de altura (Figura 1- A, B e C). Além do estado de São Paulo, a espécie é encontrada no sul de Minas Gerais, Goiás, Mato Grosso, Mato Grosso do Sul e Paraná, ocupando áreas de cerrado sensu stricto e campos cerrados (DURIGAN et al., 2004; CRIA, 2013). Já Gochnatia polymorpha (Less.) Cabrera (candeia ou cambará) é uma árvore (Figura 1- D, E e F) que pode alcançar de 6-15 m de altura, ocorrendo nos estados da Bahia, Espírito Santo, Goiás, Minas Gerais, Mato Grosso do Sul, São Paulo, Rio de Janeiro, Paraná, Santa Catarina e Rio Grande do Sul (LORENZI, 2000). A espécie é generalista, ocorrendo frequentemente em estádios iniciais da sucessão florestal. É encontrada comumente no Cerrado, porém também está presente em outras formações florestais, como floresta ombrófila densa, floresta ombrófila mista, floresta ombrófila densa altomontana, floresta estacional semidecidual, mata ciliar e mata paludosa (SÃO PAULO, 2003). 18 Figura 1. Indivíduo adulto (A), inflorescência (B) e cipselas (C) de Gochnatia barrosii; e indivíduo adulto (D), tronco (E) e inflorescência (F) de G. polymorpha. Na Estação Ecológica de Assis, a espécie G. barrosii é encontrada em ambientes de cerrado sensu stricto e em bordas de cerradão. Desta forma, está restrita a ambientes mais abertos, enquanto a espécie G. polymorpha pode ser encontrada em matas ciliares, cerradão e cerrado sensu stricto, desde o interior até 19 as bordas desses ambientes (ROSSATTO; KOLB, 2012). Segundo Rossato e Kolb (2012), os indivíduos adultos de G. barrosii e G. polymorpha apresentam diferenças estruturais e funcionais em suas folhas, indicando que estas espécies possuem adaptações distintas e exploram o ambiente de forma diferente. Diante do exposto, o objetivo deste estudo foi avaliar se os habitats preferenciais dessas espécies são distintos por restrições de água, temperatura ou de luz durante as fases iniciais de desenvolvimento. E ainda, avaliar a relação entre o nicho de regeneração e a distribuição ecológica em escala de micro-habitats no Cerrado. Para tanto, foi avaliado o potencial germinativo das cipselas (sementes) dessas espécies submetidas a diferentes temperaturas constantes e alternadas e em qualidades luminosas diferentes, e estresse hídrico simulado. Além disso, avaliou-se a plasticidade fenotípica à luz durante o desenvolvimento inicial das plantas em diferentes níveis de sombreamento. Dessa forma, este estudo pretendeu responder às seguintes questões: (i) As duas espécies de Gochnatia ocupam nichos de regeneração diferentes? (ii) O nicho de regeneração pode explicar a distribuição das espécies de Gochnatia em escala local de micro-habitats em diferentes fitofisionomias do Cerrado? (iii) Diferenças no nicho de regeneração podem contribuir para a diferenciação de nicho nos indivíduos adultos? Espera-se encontrar maior amplitude de nicho de regeneração para a espécie G. polymorpha, uma vez que a espécie ocorre em vários tipos de formações vegetacionais, ocupando maior número de micro-habitats quando comparada à G. barrosii. Portanto, é esperado também que esta espécie apresente maior habilidade competitiva na germinação de cipselas em diferentes condições de disponibilidade 20 de água, temperatura e luz; bem como maior plasticidade à luz durante o desenvolvimento inicial de plantas sob diferentes níveis de sombreamento. Esta dissertação está organizada na forma de artigos, que por sua vez, foram considerados como capítulos. Os artigos estão formatados de acordo com as instruções para preparação de manuscritos da revista Plant Species Biology, porém nem todas as recomendações foram atendidas devido ao fato desde documento também seguir a instrução normativa para formatação de dissertação do programa de pós-graduação em Biociências. No primeiro capítulo são apresentados os resultados referentes à germinação de cipselas das espécies de Gochnatia estudadas, onde especificamente é investigada a relação entre o nicho de germinação e a distribuição ecológica em escala local de micro-habitats dessas espécies no Cerrado. No segundo capítulo são apresentados os resultados referentes à plasticidade morfofisiológica das plantas de Gochnatia em resposta a um gradiente de luz. REFERÊNCIAS BASKIN, C.C.; BASKIN, J.M. Seeds: Ecology, biogeography, and evolution of dormancy and germination. San Diego: Academic Pres,1998. 666p. BATALHA, M.A.; MANTOVANI, W. Floristic composition of the cerrado in the Pé-do- Gigante reserve (Santa Rita do Passa Quatro, Southeastern Brazi l). Acta Botanica Brasilica, v. 15, p. 289-304, 2001. BENECH-ARNOLD, R.; SÁNCHEZ, R.A. 1995. Modeling weed seed germination. In: KIGEL, J.; GALILI, G. (Eds.). Seed development and germination. New York: Academic Press. 1995. p. 545-566. 21 BEWLEY, J.D.; BLACK, M. 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Programa de Pós-Graduação em Biociências, Departamento de Ciências Biológicas, Faculdade de Ciências e Letras de Assis, Univ Estadual Paulista – UNESP. Av. Dom Antônio, 2100, 19806-900, Assis, São Paulo, Brasil. 27 Nicho de germinação em duas espécies de Gochnatia (Asteraceae) ocorrentes no Cerrado Resumo Diversos estudos investigaram a relação entre amplitude de nicho de germinação e distribuição ecológica e geográfica em espécies vegetais e resultados contraditórios têm sido encontrados. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi avaliar se os requerimentos de germinação das sementes estão relacionados com a distribuição ecológica de duas espécies simpátricas de Gochnatia em escala local de micro-habitats de duas fitofisionomias do Cerrado (cerrado sensu stricto e cerradão), com G. polymorpha ocupando o maior número deles. Experimentos de germinação em laboratório foram desenvolvidos para determinar a amplitude térmica de germinação, a influência da luz e de diferentes potenciais osmóticos sobre as respostas germinativas das cipselas. Os resultados mostraram que a amplitude térmica de germinação das duas espécies estudadas está relacionada com as temperaturas nos diferentes micro-habitats de ocorrência. Os dados obtidos mostram ainda, que a espécie G. polymorpha, em comparação com a espécie congenérica G. barrosii, apresenta maior amplitude de nicho de germinação, pois apresenta maior amplitude térmica com porcentagens de germinação elevadas, menor sensibilidade à luz e maior tolerância ao estresse hídrico, favorecendo a germinação e estabelecimento da espécie em um maior número de micro- habitats no Cerrado, o que é coerente com seu caráter generalista. Palavras-chave: Nicho de regeneração, cipselas, tolerância ambiental, cerrado sensu stricto, cerradão. 28 Introdução A amplitude de condições nas quais uma semente pode germinar é reconhecida como o nicho de germinação, que consiste em um dos aspectos chave do nicho de regeneração em plantas (Grubb 1977), podendo determinar a distribuição ecológica e geográfica em espécies vegetais (Brändle et al. 2003; Donohue et al. 2010). Diversos estudos investigaram a relação entre amplitude de nicho de germinação e distribuição ecológica e geográfica em espécies vegetais e resultados contraditórios têm sido encontrados (Thompson et al. 1998; Thompson et al. 1999; Brändle et al. 2003; Thompson & Ceriani 2003; Kissmann et al. 2012; Ranieri et al. 2012; Silveira et al. 2012; Kissmann & Habermann 2013). Portanto, as evidências da associação dos requerimentos de germinação com a distribuição ecológica e/ou geográfica nas espécies vegetais ainda são inconsistentes (Donohue et al. 2010). De maneira geral, sementes apresentam adaptações para os habitats nos quais a espécie se reproduz, aumentando as chances de germinação na época ideal. Entender estas relações torna-se essencial para ações de conservação da flora (Baskin & Baskin 1998; Mota & Garcia 2013; Garcia et al. 2014). Entre os diversos fatores que compõem o nicho de germinação, a temperatura, a luz e a disponibilidade de água têm sido descritos como os mais importantes, atuando no controle da germinabilidade, do tempo de germinação e da dormência de sementes de várias espécies tropicais e subtropicais (Baskin & Baskin 1998; Probert 2000; Smith 2000; Fernández- Pascual et al. 2013; Mota & Garcia 2013; Silveira et al. 2013). Em habitats heterogêneos, tais fatores tendem a apresentar grande variação no espaço e no tempo, principalmente entre diferentes fisionomias vegetais (Kissmann et al. 2012; Salazar et al. 2012). Características dos ecossistemas como o sombreamento causado pela presença de dossel, deposição de serapilheira e presença de estrato herbáceo-arbustivo podem 29 alterar a composição espectral da luz, bem como atenuar a intensidade luminosa e diminuir a amplitude térmica na superfície do solo, influenciando dessa forma na germinação de sementes. Já a disponibilidade de água consiste num fator limitante principalmente em ecossistemas com precipitações sazonais (Vasquez-Yanes et al. 1990; Fenner & Thompson 2005). Espécies que apresentam distribuição em diversos micro-habitats geralmente mostram maior tolerância às variações dos diferentes fatores ambientais (Rossato & Kolb 2010), podendo conferir dessa forma, uma maior amplitude de nicho de germinação (Thompson et al. 1999; Donohue et al. 2010; Ranieri et al. 2012). Em se tratando de habitats heterogêneos, o Cerrado brasileiro é caracterizado por precipitações sazonais e marcante heterogeneidade fisionômica, possuindo um gradiente ecológico bastante contrastante em relação às características abióticas, como luz, temperatura e umidade na superfície do solo (Kissmann et al. 2012; Salazar et al. 2012). O Cerrado é considerado um hotspot para a conservação da biodiversidade mundial (Myers et al. 2000); estima-se que a diversidade de plantas esteja em torno de 12 mil espécies, sendo 44% endêmicas (Mendonça et al. 2008; Walter 2006), muitas das quais encontram-se ameaçadas pela fragmentação e perda de habitats decorrentes de intensas atividades humanas. A vegetação do Cerrado apresenta fisionomias florestais, savânicas e campestres, que divergem estruturalmente e funcionalmente entre si. Entre as fitofisionomias florestais, o cerradão é uma vegetação com predominância de árvores, com cobertura arbórea de cerca de 90%. Entre as fitofisionomias savânicas, o cerrado sensu stricto ou cerrado típico caracteriza- se pela presença de árvores baixas, com dossel descontínuo (Ribeiro & Walter 2008). Considerando a importância da compreensão dos fatores que determinam a distribuição das espécies vegetais nos ecossistemas, o objetivo deste estudo foi avaliar se os requerimentos de germinação das sementes estão relacionados com a distribuição ecológica 30 de duas espécies simpátricas de Gochnatia em escala local de micro-habitas de duas fitofisionomias do Cerrado (cerrado sensu stricto e cerradão), que constituem um gradiente ecológico com diferentes condições para a germinação de sementes (Sales et al. 2013). Experimentos em laboratório foram desenvolvidos para determinar a amplitude térmica de germinação, a influência da luz e de diferentes potenciais osmóticos sobre as respostas germinativas das sementes. A espécie arbórea G. polymorpha apresenta maior distribuição nos diferentes micro- habitats do Cerrado em relação à espécie arbustiva G. barrosii, portanto, espera-se que: i) sementes de G. polymorpha apresentem maior tolerância a diferentes condições ambientais de temperatura, luz e disponibilidade de água, e assim, maior amplitude de nicho de germinação, favorecendo o estabelecimento da espécie em um número maior de micro-habitats no Cerrado em relação à espécie G. barrosii; ii) os requerimentos de germinação estejam relacionados com as condições de temperatura, luz e disponibilidade de água dos micro-habitats nos quais as espécies ocorrem. Material e métodos Espécies estudadas Em áreas de Cerrado no estado de São Paulo, duas espécies simpátricas do gênero Gochnatia (Asteraceae) são particularmente comuns e dominantes em áreas de borda do cerradão (Rossato & Kolb 2012). Gochnatia barrosii Cabrera (cambará-veludo) é um arbusto que pode alcançar 2 m de altura, é encontrada predominantemente em fitofisionomias savânicas no Cerrado, principalmente no cerrado sensu stricto, porém também é encontrada em bordas de cerradão, de forma que está restrita a ambientes mais abertos. Por outro lado, Gochnatia polymorpha (Less.) Cabrera (candeia ou cambará) é uma árvore que pode alcançar 31 de 6-15 m de altura, ocorrendo em matas ciliares, cerradão e cerrado sensu stricto, desde o interior até as bordas desses ambientes (Rossatto & Kolb 2012). Coleta de sementes e área de estudo As sementes (cipselas) foram coletadas de 12 indivíduos por espécie em outubro de 2012 (G. barrosii) e em janeiro de 2013 (G. polymorpha) na Estação Ecológica de Assis (EEA; 22º33’65’’- 22º36’68’’S; 50º22’29’’-50º23’00’’W), uma unidade de proteção integral dos recursos naturais localizada no oeste do estado de São Paulo, Brasil. O clima na EEA de acordo com a classificação de Köppen é de transição entre Cwa e Cfa, sendo caracterizado como subtropical, com chuvas concentradas entre os meses de outubro a maio, e estação seca de junho a setembro. As médias anuais de precipitação e temperatura são de 1400 mm e 21,8ºC, respectivamente. O relevo regional é suave-ondulado, com altitudes que variam entre 520 a 590 m (Secretaria do Meio Ambiente 1997), sendo os solos do tipo Latossolo Vermelho Distrófico, Argissolo Vermelho-Amarelo Eutrófico e Argissolo Vermelho-Amarelo Distrófico (Bognola et al. 1996). A vegetação na EEA é classificada como cerrado lato sensu (Oliveira- Filho & Ratter 2002), com predomínio da fisionomia de cerradão (Pinheiro & Durigan 2009), que é uma formação florestal com características escleromórficas e altura média do estrato arbóreo variando de 8 a 15 m, apresenta dossel contínuo e cobertura arbórea que pode chegar a 90%. Também ocorre a fisionomia de cerrado sensu stricto, caracterizada por estrato arbóreo e arbustivo-herbáceo definidos, com árvores distribuídas aleatoriamente sobre o terreno em diferentes densidades e dossel descontínuo (Ribeiro & Walter 2008), sendo que a cobertura arbórea média na área de estudo é de 46,3% (Pinheiro & Durigan 2009). 32 Condições ambientais na área de estudo A temperatura superficial do solo foi medida a uma profundidade de 1 cm, utilizando termômetro digital. A irradiância da luz (µmol.m-2.s-1) foi medida próximo à superfície do solo com sensor esférico acoplado a um fotômetro Li-cor (Li-250A, Biosciences, Lincoln, USA). As medidas foram realizadas por volta das 08:00 e das 12:00 horas, nos meses de outubro de 2012 e janeiro de 2013, em diferentes micro-habitats: pleno sol, borda de cerrado sensu stricto, interior de cerrado sensu stricto, borda de cerradão e interior de cerradão. Os dados de precipitação e temperatura ambiente foram obtidos a partir da base de dados online do Centro Integrado de Informações Agrometeorológicas (CIIAGRO), do Governo do Estado de São Paulo. Testes de germinação Para avaliar o efeito da temperatura sobre a germinação, as cipselas foram submetidas às temperaturas constantes de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 e 40ºC, e alternadas de 15-30, 20-30, 25-30 e 25-35ºC, sob fotoperíodo de 12 horas de luz branca (lâmpadas fluorescentes 20W, aprox. 60 µmol.m-2.s-1) e sob escuro contínuo. Foram utilizadas quatro repetições de 25 cipselas por tratamento, acondicionadas em caixas gerbox® forradas com papel filtro umedecido com água destilada. Na condição de escuro o gerbox foi envolvido em papel laminado. Foi avaliado o efeito da alteração da composição espectral da luz sobre a germinação através da exposição das cipselas à luz de sombreamento (baixa razão V/VE), com razões de V/VE de 0,1 e 0,5, comparada com grupo controle com razão V/VE de 7,2, simulando luz de clareira (alta razão V/VE). O experimento com luz de sombreamento foi conduzido em sala com temperatura alternada controlada de 25-30ºC, sob quatro lâmpadas incandescentes (duas de 25W e duas de 60W, fornecendo irradiância de aproximadamente 60 µmol.m-2.s-1) e 33 fotoperíodo de 12 horas. No grupo controle, as cipselas foram expostas a luz branca (lâmpadas fluorescentes) em câmara de germinação com alternância de temperaturas de 25- 30ºC e 12 horas de fotoperíodo. Para os tratamentos de luz de sombreamento, as caixas gerbox foram envolvidas em papel laminado e fita adesiva (Silver Tape®) e as tampas encapadas com película plástica tipo insulfim® com diferentes níveis de filtragem da luz, produzindo razões V/VE de 0,1 e 0,5 ao nível das cipselas, simulando a luz filtrada por dossel (Simão et al. 2008). Para todos os tratamentos foram utilizadas quatro repetições de 25 cipselas em caixas gerbox forradas com papel filtro umedecido com água destilada. As razões de V/VE foram obtidas com o auxílio de um espectroradiômetro LI-1800 (LI-COR U.S.A). O efeito do estresse hídrico sobre a germinação foi simulado através de soluções de polietileno glicol (PEG 6000) nos potenciais osmóticos de -0,2, -0,4, -0,6, -0,8, -1,0 MPa (Villela et al. 1991), e comparados com um grupo controle (0 MPa) contendo apenas água destilada. Para cada potencial osmótico foram utilizadas cinco repetições de 20 cipselas, dispostas em placas de petri (9 cm de diâmetro) contendo quatro folhas de papel de filtro e 12 mL da solução a ser testada. As placas de petri foram vedadas com filme de PVC transparente e mantidas em câmara de germinação (Eletrolab®) sob temperatura constante de 25ºC sob fotoperíodo de 12 horas de luz branca (lâmpadas fluorescentes 20W, aprox. 60 µmol.m-2.s-1). A semente da cipsela foi considerada como germinada quando apresentou protrusão da raiz primária de no mínimo 1 mm de comprimento. A leitura dos testes foi realizada a cada 24 horas e concluída após 30 dias para todos os experimentos realizados. A avaliação da germinação dos testes nas condições de escuro e vermelho-extremo foi realizada em sala escura sob luz verde de segurança (Amaral-Baroli & Takaki 2001). Constatou-se através de um teste prévio (dados não apresentados) que a luz verde não interfere na germinação das cipselas nas espécies estudadas. Os parâmetros avaliados foram porcentagem de germinação e tempo médio de germinação de acordo com Labouriau (1983). 34 Análise estatística Os dados em porcentagem foram transformados em arco seno (x/1000,5); todos os dados foram testados quanto à normalidade (teste de Shapiro-Wilk, α=0,05) e homogeneidade das variâncias (teste de Cochran ou Levene, α=0,05) e submetidos à Anova simples ou fatorial (axb) seguida pelo teste de Tukey (p<0,05). Resultados Durante o período do estudo foi observado que o pico de dispersão das cipselas ocorreu no mês de outubro para G. barrosii e janeiro para G. polymorpha. Esta observação está de acordo com o relatado por outros autores, que indicam como época de dispersão os meses de outubro a dezembro para G. barrosii e de dezembro a fevereiro para G. polymorpha (Durigan et al. 1999). Dessa forma, as duas espécies dispersam seus diásporos no período das chuvas, quando as temperaturas médias (outubro a janeiro) variam de 16-20ºC (mínimas), 23- 25ºC (médias) e 27-31ºC (máximas), e a quantidade de chuva durante o período pode chegar a 800 mm (Figura 1). Figura 1. Temperaturas e precipitação mensal durante o ano de 2012 no município de Assis, SP. 35 Na área do estudo, a temperatura na superfície do solo foi sempre superior em ambientes de cerrado sensu stricto do que em ambientes de cerradão, independente do período do dia ou do mês. Entretanto, as temperaturas nesses ambientes foram sempre mais amenas do que aquelas em ambiente sem cobertura vegetal (pleno sol) (Tabela 1). Tabela 1. Temperatura (ºC) na superfície do solo em diferentes micro-habitats na Estação Ecológica de Assis, SP, nos meses de outubro de 2012 e janeiro de 2013 em dois períodos do dia (8 e 12h). cerrado sensu stricto cerradão pleno sol interior borda interior borda Outubro Manhã 26,0 ± 0 27,2 ± 1,3 24,0 ± 0 24,0 ± 0 28,2 ± 0,8 Tarde 29,2 ± 1,6 28,7 ± 0,6 26,2 ± 0,3 28,3 ± 0,6 36,7 ± 2,0 Janeiro Manhã 25,3 ± 1,5 26,7 ± 0,6 23,0 ± 0 24,0 ± 0 31,7 ± 0,6 Tarde 32,7 ± 3,1 32,8 ± 4,2 27,0 ± 0,6 28,4 ± 1,1 49,6 ± 0,5 *Os valores indicam média ± desvio padrão. Em relação à intensidade da luz nos diferentes micro-habitats, o cerradão apresentou níveis de sombreamento superior ao cerrado sensu stricto, nos dois meses em que as medidas foram tomadas. No mês de outubro, a porcentagem de sombreamento da vegetação no cerrado sensu stricto variou de 67 a 75% entre interior e borda; para o cerradão o sombreamento foi de 79 a 98%. Em janeiro o sombreamento natural foi de 64 a 79% no cerrado sensu stricto e de 84 a 98% no cerradão (Tabela 2). 36 Tabela 2. Porcentagem de sombreamento natural ao nível do solo em diferentes ambientes de cerrado sensu stricto, cerradão e em pleno sol, durante o período da manhã (8h) e tarde (12h) na Estação Ecológica de Assis, SP. cerrado sensu stricto cerradão Pleno sol interior borda interior borda Outubro Manhã 75 75 98 90 0 Tarde 75 67 97 79 0 Janeiro Manhã 76 68 98 95 0 Tarde 79 64 98 84 0 As diferentes temperaturas constantes e a presença ou ausência da luz influenciaram significativamente a porcentagem e o tempo médio de germinação em ambas as espécies, e a interação entre temperatura e luz também foi significativa (Tabela 3). Ambas as espécies germinaram na faixa de temperatura entre 10 – 35ºC na luz e 10 – 30ºC no escuro, sendo que as maiores taxas de germinação foram alcançadas nas temperaturas de 15, 20 e 25ºC sob luz branca e 15, 20 e 25ºC no escuro em G. barrosii, e em 15, 20, 25ºC na luz e 10, 15, 20 e 25ºC no escuro para G. polymorpha (Tabela 4). No entanto, a espécie G. polymorpha apresentou germinação mais eficiente – acima de 60% – em uma maior faixa de amplitude térmica (10 – 30ºC na luz e 10 – 25ºC no escuro) enquanto que em G. barrosii esta amplitude foi de 15 – 30ºC na luz e 15ºC e 20ºC no escuro (Tabela 4). Tabela 3. Resumo da Anova fatorial (axb) para o efeito de temperaturas constantes e luz sobre a germinação (G) e tempo médio de germinação (TMG) de cipselas de espécies de Gochnatia. Gochnatia barrosii Gochnatia polymorpha G TMG G TMG Temperaturas (F; p) 189,0 <0,001 10,3 <0,001 347,6 <0,001 758,1 <0,001 Luz (F; p) 83,1 <0,001 21,8 <0,001 5,4 =0,020 5,9 =0,020 Interação (F; p) 11,9 <0,001 3,2 =0,039 11,9 <0,001 12,2 <0,001 F – valor teste F; p – probabilidades. 37 Tabela 4. Porcentagem de germinação (G) e tempo médio de germinação (TMG) de cipselas de espécies de Gochnatia em diferentes temperaturas constantes de incubação na luz e no escuro. Temperaturas ºC Gochnatia barrosii Gochnatia polymorpha Luz Escuro Luz Escuro G (%) 5 0 d 0 d 0 d 0 d 10 5,0 ± 5,0 d 1,0 ± 2,0 d 73,0 ± 3,8 c 95,0 ± 6,0 ab 15 84,0 ± 7,3 ab 61,0 ± 18,9 bc 97,0 ± 3,8 ab 96,0 ± 3,3 ab 20 90,0 ± 5,2 a 71,0 ± 6,0 abc 99,0 ± 2,0 a 98,0 ± 2,3 ab 25 88,0 ± 7,3 a 54,0 ± 9,5 c 97,0 ± 3,8 ab 94,0 ± 2,3 ab 30 65,0 ± 15,0 bc 4,0 ± 3,3 d 87,0 ± 8,9 bc 39,0 ± 13,2 c 35 3,0 ± 3,8 d 0 d 2,0 ± 2,3 d 0 d 40 0 d 0 d 0 d 0 d TMG(dias) 5 - - - - 10 - - 21,8 ± 0,9 d 19,1 ± 0,7 e 15 19,9 ± 1,3bc 20,6 ± 1,4c 9,8 ± 0,1 bc 9,6 ± 0,1 cd 20 13,6 ± 1,7a 19,5 ± 1,3bc 5,7 ± 0,1 a 5,6 ± 0,1 a 25 15,3 ± 0,7ab 21,4 ± 1,3c 5,6 ± 0,2 a 7,1 ± 0,3 b 30 21,5 ± 2,4c 23,6 ± 5,7c 9,0 ± 0,3 b 11 ± 1,4 d 35 - - - - 40 - - - - Média ± desvio padrão seguida pela mesma letra não difere estatisticamente pelo teste de Tukey (p<0,05); as letras comparam colunas e linhas para cada espécie; (-) não calculado. Para as cipselas de G. barrosii a germinação foi sempre maior na luz, independentemente da temperatura. No entanto, diferenças significativas entre luz e escuro ocorreram apenas nas temperaturas de 25 e 30ºC. Em G. polymorpha, diferenças significativas na germinação das cipselas entre luz e escuro ocorreram apenas na temperatura de 10ºC. Sendo que nesta temperatura houve maior germinação no escuro. Nas demais temperaturas, as médias de germinação foram elevadas (>96%) e similares (Tabela 4). As cipselas germinaram em menor tempo nas temperaturas de 20 e 25ºC na luz em relação ao escuro em G. barrosii (13,6 e 15,3 dias, respectivamente) e em G. polymorpha o menor tempo 38 de germinação ocorreu nas temperaturas de 20 e 25ºC na luz e 20ºC no escuro (5,7, 5,6 e 5,6 dias, respectivamente) (Tabela 4). Em relação à germinação em temperaturas alternadas, houve efeito significativo das temperaturas sobre a porcentagem e tempo médio de germinação em ambas as espécies. Por outro lado, a presença ou não da luz influenciou apenas a porcentagem de germinação. A interação entre temperatura e presença ou não de luz foi significativa apenas em G. barrosii (Tabela 5). Para G. barrosii as temperaturas alternadas de 25-30ºC na luz proporcionaram maior porcentagem e menor tempo médio de germinação, e em G. polymorpha as temperaturas alternadas de 25-30ºC na luz e 20-30ºC no escuro proporcionaram as maiores porcentagens de germinação em menor tempo (Tabela 6). As cipselas de G. polymorpha apresentaram germinação acima de 70% em um maior número de regimes de temperaturas alternadas (15-30, 20-30 e 25-30ºC na luz) em relação a G. barrosii, que apresentou o mesmo desempenho apenas nos regimes térmicos de 20-30 e 25-30ºC (Tabela 6). Tabela 5. Resumo da Anova fatorial (axb) para o efeito de temperaturas alternadas e luz sobre a germinação (G) e tempo médio de germinação (TMG) de cipselas de espécies de Gochnatia. Gochnatia barrosii Gochnatia polymorpha G TMG G TMG Temperaturas (F; p) 81,5 <0,001 21,8 <0,001 121,2 <0,001 80,0 <0,001 Luz (F; p) 78,5 <0,001 2,1 =0,162 24,0<0,001 0,03 =0,851 Interação (F; p) 11,9 <0,001 8,3 =0,002 1,9 =0,144 2,2 =0,131 F – valor teste F; p – probabilidades Para G. barrosii a diminuição da razão de vermelho e vermelho extremo (V/VE) da luz afetou os parâmetros de germinação avaliados. A partir da razão 0,5 a porcentagem de germinação foi reduzida (F=98,3; p<0,01) e o tempo médio de germinação aumentou em relação ao grupo controle (F=20,8; p=0,00) (Figura 2). 39 Tabela 6. Porcentagem de germinação (G) e tempo médio de germinação (TMG) de cipselas de espécies de Gochnatia em diferentes temperaturas alternadas de incubação na luz e no escuro. Temperaturas ºC Gochnatia barrosii Gochnatia polymorpha Luz Escuro Luz Escuro G (%) 15-30 36,0 ± 5,6 bc 18,0 ± 7,6 cd 71,0 ± 8,8 abc 57,0 ± 8,8 b 20-30 75,0 ± 11,0 a 43,0 ± 11,0 b 85,0 ± 8,2 a 80,0 ± 9,7 ac 25-30 84,0 ± 11,7 a 31,0 ± 10,0 bc 89,0 ± 6,0 a 63,0 ± 12,8 bc 25-35 4,0 ± 3,2 d 0 d 16,0 ± 8,6 d 1,0 ± 2,0 d TMG(dias) 15-30 24,7 ± 1,9 c 24,4 ± 1,6 bc 18,7 ± 1,6 c 20,7 ± 2,5 c 20-30 22,5 ± 0,5 bc 20,9 ± 0,8 b 13,6 ± 0,4 b 12,5 ± 1,6 ab 25-30 16,9 ± 0,8 a 22,5 ± 2,7 bc 10,6 ± 0,4 ab 10,1 ± 1,0 a 25-35 - - 23,5 ± 4,1* - Média ± desvio padrão seguida pela mesma letra não difere estatisticamente pelo teste de Tukey (p<0,05); as letras comparam colunas e linhas para cada espécie; (-) não calculado; *não foi incluso na Anova fatorial. As cipselas de G. polymorpha apresentaram menor sensibilidade à alteração da razão V/VE em comparação com G. barrosii, com a germinação afetada apenas pela razão 0,1, sendo que na razão 0,5 não houve diferença significativa em relação ao grupo controle (7,2) para os dois parâmetros avaliados (Germinação: F=275, p<0,01; TMG: F=3,93, p=0,09) (Figura 2). O estresse hídrico simulado com PEG 6000 interferiu na germinação de ambas as espécies. No entanto, o limite de tolerância ao estresse divergiu entre as espécies (Figura 3). A porcentagem de germinação de cipselas de G. barrosii foi afetada a partir do potencial osmótico de -0,4 MPa, a partir do qual a germinação foi drasticamente reduzida, sendo que o limite de tolerância ao estresse osmótico foi até -0,8 MPa, quando apenas 2% das cipselas germinaram (F=102,2; p<0,01) (Figura 3). 40 0,1 0,5 7,2 0 20 40 60 80 100 (C) (D) (A) a a a a b b a G er m in aç ão (% ) c b a (B) 0,5 7,2 10 15 20 25 T M G d ia s-1 0,1 0,5 7,2 0 20 40 60 80 100 G er m in aç ão ( % ) Razão V/VE 0,5 7,2 10 15 20 25 Gochnatia polymorpha T M G d ia s-1 Razão V/VE Gochnatia barrosii Figura 2. Porcentagem de germinação e tempo médio de germinação (TMG) de cipselas de Gochnatia barrosii (A e B) e G. polymorpha (C e D) respectivamente, sob luz com diferentes razões de vermelho e vermelho extremo (V/VE 0,1; 0,5; 7,2). Os gráficos representam média ± desvio padrão. Letras diferentes indicam diferença significativa entre diferentes qualidades de luz (p<0,05). O tempo médio de germinação foi afetado a partir de -0,2 MPa, quando houve um aumento progressivo do tempo médio de germinação conforme se reduziu o potencial osmótico (F=93,6; p<0,01) (Figura 3). As cipselas de G. polymorpha apresentaram alta porcentagem de germinação (>80%) até o potencial osmótico de -0,4 MPa. No potencial de - 0,6 MPa a porcentagem decresceu, porém ainda sem apresentar diferença significativa dos tratamentos anteriores (Figura 3). As cipselas desta espécie germinaram ainda nos potenciais osmóticos de -0,8 e -1,0 MPa. Porém, a germinabilidade foi muito baixa nestas condições (F=88,5; p<0,01). O estresse hídrico simulado interferiu também no tempo médio de germinação, que aumentou progressivamente a partir do potencial de -0,4 MPa (F=33,2; p<0,01) (Figura 3). 41 0 -0,2 -0,4 -0,6 -0,8 -1,0 0 20 40 60 80 100 0 -0,2 -0,4 -0,6 -0,8 -1,0 5 10 15 20 25 0 -0,2 -0,4 -0,6 -0,8 -1,0 0 20 40 60 80 100 0 -0,2 -0,4 -0,6 -0,8 -1,0 5 10 15 20 25 (D)(C) (A) c bc b a a a a ccc b ab G er m in aç ão ( % ) G er m in aç ão (% ) a (B) * ** c c b Gochnatia polymorpha T M G d ia s-1 Gochnatia barrosii bb aaa Potencial osmótico (MPa) T M G d ia s-1 Potencial osmótico (MPa) Figura 3. Porcentagem de germinação e tempo médio de germinação (TMG) de cipselas de Gochnatia barrosii (A e B) e G. polymorpha (C e D) respectivamente, em diferentes potenciais osmóticos (MPa). Os gráficos representam média ± desvio padrão. Letras diferentes indicam diferença significativa entre os diferentes potenciais osmóticos (p<0,05). (*) não calculado. Discussão A amplitude de temperaturas dentro da qual a germinação ocorre pode estar relacionada com a variação térmica a que as plantas estão expostas naturalmente (Baskin & Baskin 1998). Os resultados apresentados mostram que, para as duas espécies de Gochnatia, a variação da temperatura ambiente (Figura 1) e da superfície do solo (Tabela 1) nos diferentes micro-habitats de cerradão e cerrado sensu stricto está dentro da amplitude térmica de germinação nas duas espécies (10 – 35ºC na luz; 10 – 30ºC no escuro), e também próxima das temperaturas ótimas (20 e 25ºC constante na luz em G. barrosii; e 20 e 25ºC constante na luz 42 ou 20ºC no escuro em G. polymorpha; ou 25-30ºC alternadas sob luz para as duas espécies e 20-30ºC alternadas em G. polymorpha) (Tabelas 4 e 6). A percepção da luz ambiente é essencial para as diferentes fases de desenvolvimento dos vegetais, podendo indicar à planta sua localização no espaço e no tempo. Para algumas espécies, a percepção da luz durante a fase inicial do ciclo de vida pode ser determinante para indicar o momento ideal para germinação das sementes ou para o desenvolvimento da plântula (Smith 2000). Neste estudo, a resposta à luz foi dependente da temperatura de incubação nas duas espécies. Porém, este efeito foi mais evidente em cipselas de G. barrosii, espécie que apresentou tendência ou mesmo menores taxas de germinação significativas sob escuro contínuo em todas as temperaturas. Por outro lado, as cipselas de G. polymorpha apresentaram sensibilidade à luz apenas na temperatura de 10ºC (Tabela 4) no caso das temperaturas constantes, e sob temperaturas alternadas apresentou menor inibição da germinação no escuro quando comparada a G. barrosii (Tabela 6). O sombreamento do dossel da floresta pode diminuir a razão V/VE da luz incidente sobre o solo, já que as copas das árvores atuam como um filtro da luz, podendo inibir a germinação de certas espécies (Vasquez-Yanes et al. 1990; Casal & Sánchez 1998; Smith 2000). Os resultados indicam que as espécies germinam preferencialmente em ambientes abertos (V/VE 7,2), com maior disponibilidade de luz como, por exemplo, nos micro-habitats de interior e borda do cerrado sensu stricto e eventualmente na borda do cerradão (Tabela 2). Ambas as espécie foram capazes de germinar na razão V/VE de 0,5, indicando que podem germinar no sub-bosque sob dossel (interior do cerradão; Tabela 2). Entretanto, a espécie G. barrosii foi mais sensível à alteração da qualidade de luz, tendo sua germinação diminuída nesta condição (V/VE 0,5), o que pode explicar ao menos em parte a ausência desta espécie no interior do cerradão e sua ocorrência em áreas alteradas e borda deste ambiente. A 43 germinação das espécies de Gochnatia estudadas é completamente inibida sob dossel muito fechado (V/VE 0,1). A respeito das diferenças na sensibilidade à luz observada entre as duas espécies, estas provavelmente se devem a diferentes proporções na quantidade de fitocromo inativo (Fv) e ativo (Fve) preexistentes nas sementes dessas espécies (Casal & Sánchez 1998). A resposta à alteração da qualidade da luz é bastante variável entre espécies tropicais. Por exemplo, sob condições de laboratório, as espécies Cecropia obtusifolia Bertol. e Piper umbellatum L. tiveram a germinação drasticamente reduzida em razões V/VE abaixo de 0,8 (<20%) (Vasquez-Yanez et al. 1990). Por outro lado, algumas espécies não apresentam inibição da germinação quando expostas a baixas razões de V/VE, como em Acacia polyphylla DC. (Araújo-Neto et al. 2003) e Hylocereus setaceus (Sal-Dick ex DC.) (Simão et al. 2007). A inibição da germinação em baixas razões de V/VE pode ser um importante mecanismo para evitar a germinação de sementes de espécies heliófitas em áreas sombreadas (Vazquez-Yanes & Orozco-Segovia 1993). Este fenômeno pode ser atribuído a maior necessidade de luz para germinação em cipselas de G. barrosii, uma vez que esta espécie tem sua distribuição associada a habitats com maior disponibilidade de luz no Cerrado. Além da temperatura e da luz, outro fator que pode limitar a distribuição das espécies no ambiente é a disponibilidade de água. O processo de absorção de água pela semente durante a germinação pode ser dividido em três fases; na fase I a quantidade de água aumenta substancialmente através da diferença de potencial hídrico entre a semente e o meio. Durante a fase II, o conteúdo de água é mantido relativamente constante e os processos metabólicos requeridos para o crescimento do embrião são ativados, sendo que nesta fase ainda há tolerância à desidratação. A fase III é marcada por aumento no conteúdo de água da semente, que acontece devido à absorção associada ao início do crescimento do embrião e, uma vez iniciada, perde-se rapidamente a tolerância à desidratação (Ferreira & Borghetti 2004). 44 A embebição em potenciais hídricos reduzidos diminui o conteúdo de água das sementes e aumenta a duração da fase II, que atrasa a protrusão da radícula na fase III (Perez et al. 2001). Este fenômeno pode ser observado nas duas espécies de Gochnatia, que apresentaram atraso na emissão da radícula a partir do potencial osmótico de -0,2 MPa, sendo que a terceira fase da embebição não se completou em cipselas de G. barrosii que foram mantidas no potencial de -1,0 MPa (Figura 3). As cipselas de G. barrosii apresentaram menor tolerância ao estresse hídrico simulado com PEG 6000. Porém, a disponibilidade de água para a germinação das cipselas no Cerrado talvez não seja um fator limitante para ambas as espécies, já que dispersam seus diásporos durante a estação chuvosa e apresentam altas porcentagens de germinação dentro do período de 30 dias. Os resultados obtidos neste estudo suportam a hipótese de que a espécie G. polymorpha apresenta maior amplitude de nicho de germinação, pois apresenta maior tolerância a diferentes fatores ambientais em comparação com G. barrosii. As cipselas de G. polymorpha apresentaram maior amplitude térmica com porcentagens de germinação elevadas, menor sensibilidade à luz e maior tolerância ao estresse hídrico. Tais características podem favorecer a germinação da espécie desde fisionomias mais abertas (cerrado sensu stricto) até as mais fechadas (cerradão), ou mesmo através da ocupação mais eficiente de clareiras no cerradão, podendo explicar ao menos em parte a distribuição dos indivíduos adultos desta espécie desde o interior até as bordas nas duas formações fisionômicas de Cerrado estudadas e, também, em formações florestais secundárias. Agradecimentos Os autores agradecem ao Dr. Massanori Takaki por realizar as medidas das razões V/VE das películas plásticas, ao Dr. Ciro C.Z. Branco por emprestar o sensor de luz e ao 45 Instituto Florestal do Estado de São Paulo por permitir a realização do estudo na EEA. Este estudo foi realizado com apoio financeiro da FAPESP (Proc. nº 2013/03748-6). Referências Amaral-Baroli A. & Takaki M. (2001) Phytochrome controls achene germination in Bidenspilosa L. (Asteraceae) by very low fluence response. 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Tese de doutorado, Universidade de Brasília, Brasília. 50 CAPÍTULO 2 Plasticidade morfofisiológica à luz em duas espécies de Gochnatia (Asteraceae) ocorrentes no Cerrado Jonathan Wesley Ferreira Ribeiro1; Davi Rodrigo Rossatto2; Rosana Marta Kolb1 1. Departamento de Ciências Biológicas, Faculdade de Ciências e Letras de Assis, Univ Estadual Paulista – UNESP. Av. Dom Antonio, 2100, 19806-900, Assis, São Paulo, Brasil. 2. Departamento de Biologia Aplicada à Agropecuária, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Univ Estadual Paulista – UNESP. Via de Acesso Prof. Paulo Donato Castellane, s/nº, zona rural, 14884-000, Jaboticabal, São Paulo, Brasil. 51 Plasticidade morfofisiológica à luz em duas espécies de Gochnatia (Asteraceae) ocorrentes no Cerrado Resumo A luz consiste num dos fatores mais importantes para o estabelecimento e desenvolvimento de plantas, e em habitats heterogêneos, a alta plasticidade à luz pode conferir vantagens adaptativas para a obtenção de recursos em condições luminosas contrastantes. As espécies simpátricas Gochnatia barrosii e G. polymorpha apresentam padrões distintos de distribuição nas fitofisionomias de Cerrado, com G. polymorpha ocupando um maior número de micro- habitats em relação a G. barrosii. Assim, o objeto deste estudo foi analisar a plasticidade fenotípica em resposta à luz em duas espécies de Gochnatia, bem como se o grau de plasticidade entre estas espécies pode indicar a capacidade de ocupação de diferentes micro- habitats no Cerrado. Foram avaliadas as respostas de crescimento, de atributos fisiológicos e morfo-anatômicos foliares em plantas de Gochnatia barrosii e G. polymorpha submetidas a diferentes níveis de sombreamento (0, 50, 70 e 98%) em casa de vegetação. A plasticidade fenotípica foi estimada através do índice de plasticidade fenotípica (IPF) considerando todas as variáveis analisadas. Os resultados obtidos revelaram que ambas as espécies estudadas apresentam plasticidade fenotípica à luz para as características avaliadas. No entanto, a espécie G. polymorpha apresentou maior plasticidade em relação a G. barrosii, o que está de acordo com o caráter generalista desta espécie, sendo encontrada em uma ampla variedade de habitats no Cerrado. Palavras chave: Plasticidade fenotípica, fluorescência da clorofila, pigmentos fotossintetizantes, anatomia foliar, ecofisiologia. 52 Introdução Entre os diferentes fatores ambientais que interferem no estabelecimento e crescimento de plântulas, a luz é um dos mais importantes, pois influe diretamente na capacidade de aquisição de carbono, nas taxas de crescimento e consequentemente nos padrões de mortalidade (Gómez-Aparicio et al. 2006; Montgomery 2006; Valladares 2003). A disponibilidade de luz é extremamente variável de acordo com a estruturação de formações vegetais e pode ser um dos fatores que determinam a distribuição das plantas em escala local (Hoffmann et al. 2004). No Cerrado brasileiro há uma ampla variedade de fitofisionomias, que variam desde formações campestres, passando por formações savânicas, até florestais (Oliveira & Ratter 2002; Ribeiro & Walter 2008), que são determinadas em virtude de variações em propriedades físico-químicas do solo, regimes de fogo, profundidade do lençol freático, micro-clima e topografia (Oliveira & Ratter 2002; Assis et al. 2011; Rossatto et al. 2012). Tais fitofisionomias possuem divergências estruturais e funcionais entre si, apresentando uma marcante diferença em relação à cobertura de dossel e densidade de árvores (Oliveira & Ratter 2002). Tais diferenças estruturais levam a variações no microclima da superfície do solo e afetam drasticamente a quantidade de radiação solar que adentra as diferentes fisionomias (Kissmann et al. 2012; Salazar et al. 2012). Essa heterogeneidade ambiental consiste num importante fator limitante ao estabelecimento de plantas a partir de sementes, interferindo nos processos de germinação de sementes, emergência e estabelecimento de plântulas entre os diferentes tipos fitofisionômicos (Hoffmann et al. 2004; Salazar et al. 2011; Kissmann et al. 2012; Salazar et al. 2012; Ribeiro & Borguetti 2013). No Cerrado é comum a ocorrência de regiões ecotonais entre formações savânicas e florestais, apresentando diferenças na densidade arbórea e na cobertura do dossel (Hoffmann et al. 2005). Entre as fitofisionomias florestais, o cerradão é uma vegetação com 53 predominância de árvores formando um dossel contínuo com uma cobertura arbórea de cerca de 90%. E entre as fitofisionomias savânicas, o cerrado sensu stricto ou cerrado típico caracteriza-se pela presença de árvores baixas, com dossel descontínuo e cobertura arbórea de cerca de 50% (Pinheiro & Durigan 2009; Ribeiro & Walter 2008). Espécies que ocorrem em habitats heterogêneos geralmente apresentam uma considerável plasticidade fenotípica em resposta à luz (Lee et al. 2000; Souza et al. 2010). A Plasticidade fenotípica é a habilidade de um organismo de alterar sua morfologia e/ou fisiologia em resposta a mudanças nas condições ambientais, sendo particularmente importante para plantas devido ao modo de vida séssil (Schlichting 1986). Pode ocorrer em diferentes níveis, podendo ser morfológica, anatômica e/ou fisiológica. Além disso, o grau de plasticidade fenotípica pode apresentar variações interespecíficas, intraespecíficas e mesmo entre diferentes atributos funcionais (Boeger et al. 2008; Cardoso & Lomônaco 2003; Portes et al. 2010; Sachéz-Goméz et al. 2006; Souza et al. 2010; Valladares et al. 2000). A plasticidade é especialmente importante para plantas que ocorrem em habitats heterogêneos, uma vez que a alta plasticidade pode conferir vantagens adaptativas para a obtenção de recursos em condições ambientais contrastantes, permitindo assim, a exploração de nichos distintos e ampliando as possibilidades de distribuição da espécie ao longo de gradientes ambientais (Boeger et al. 2008; Sultan 2003). A folha é um dos órgãos vegetais mais plásticos, e também o mais exposto às variáveis ambientais (Fahn 1986) e, por essa razão, modificações de suas características em vários níveis podem ser observadas (Boeger et al. 2008; Rossatto & Kolb 2010; Rossatto et al. 2010). Folhas sujeitas a diferentes condições de radiação solar podem apresentar alterações na concentração dos pigmentos fotossintetizantes (Gonçalves et al. 2001). Além disso, modificações da anatomia foliar podem permitir a manutenção e proteção do aparato fotossintético, mantendo-o em funcionamento mesmo em condições adversas (Silva et al. 2010). 54 Considerando a importância da disponibilidade de luz para o estabelecimento e desenvolvimento inicial de espécies vegetais, e que os diferentes tipos fitofisionômicos do Cerrado possuem regimes de luz distintos, neste estudo, avaliamos o crescimento e respostas fisiológicas e morfo-anatômicas foliares de duas espécies simpátricas de Gochnatia (Asteraceae) sob diferentes níveis de sombreamento, para verificar se estas espécies apresentam plasticidade fenotípica em resposta à luz, e se o grau de plasticidade pode indicar a capacidade de ocupação de diferentes micro-habitats no Cerrado. As espécies de Gochnatia apresentam diferenças no padrão de distribuição entre as fitofisionomias do Cerrado. A espécie Gochnatia barrosii Cabrera (cambará-veludo) é um arbusto que pode alcançar 2 m de altura, é encontrada predominantemente em fitofisionomias savânicas no Cerrado, principalmente no cerrado sensu stricto, porém também é encontrada em bordas de cerradão, desta forma está restrita a ambientes mais abertos (Durigan et al. 2004). Já a espécie Gochnatia polymorpha (Less.) Cabrera (candeia ou cambará) é uma árvore que pode alcançar de 6-15 m de altura, ocorrendo em matas ciliares, cerradão e cerrado sensu stricto, desde o interior até as bordas desses ambientes (Durigan et al. 1999; Rossatto & Kolb 2012). Devido ao fato de ambas as espécies ocorrerem naturalmente em habitats heterogêneos, espera-se que ambas apresentem plasticidade em resposta à luz (Lee et al. 2000), entretanto, espera-se encontrar maior plasticidade para plantas de G. polymorpha, já que esta espécie apresenta uma distribuição mais ampla, em diferentes micro-habitats no Cerrado quando comparada à G. barrosii. 55 Material e métodos Coleta de sementes e área de estudo As sementes (cipselas) foram coletadas de 12 indivíduos por espécie em outubro de 2012 (G. barrosii) e em janeiro de 2013 (G. polymorpha) na Estação Ecológica de Assis (EEA; 22º33’65’’- 22º36’68’’S; 50º22’29’’-50º23’00’’W), uma unidade de proteção integral dos recursos naturais localizada no oeste do estado de São Paulo, Brasil. O clima na EEA de acordo com a classificação de Köppen é Cwa e Cfa, caracterizado como subtropical, com chuvas concentradas entre os meses de outubro a maio, e estação seca de junho a setembro. As médias anuais de precipitação e temperatura são de 1400 mm e 21,8ºC respectivamente. O relevo regional é suave-ondulado, em altitudes que variam entre 520 a 590 m (Secretaria do Meio Ambiente 1997), sendo os solos do tipo Latossolo Vermelho Distrófico, Argissolo Vermelho-Amarelo Eutrófico e Argissolo Vermelho-Amarelo Distrófico (Bognola et al. 1996). A vegetação na EEA é classificada como cerrado lato sensu (Oliveira-Filho & Ratter 2002) com predomínio da fisionomia de cerradão (Pinheiro & Durigan 2009), que é uma formação florestal com características escleromórficas e altura média do estrato arbóreo variando de 8 a 15 m, apresenta dossel contínuo e cobertura arbórea que pode chegar a 90%. Também ocorre a fisionomia de cerrado sensu stricto, caracterizada por estrato arbóreo e arbustivo-herbáceo definidos, com árvores distribuídas aleatoriamente sobre o terreno em diferentes densidades e dossel descontínuo (Ribeiro & Walter 2008), sendo que a cobertura arbórea média na área de estudo é de 46,3% (Pinheiro & Durigan 2009). Condições experimentais Cipselas previamente germinadas foram semeadas (uma unidade) em copos plásticos (50 ml) contendo solo de Cerrado e mantidos em laboratório. Noventa dias após a emergência, as plântulas foram transplantadas para sacos de polietileno (13,5 cm diâmetro x 56 30 cm altura) contendo solo de Cerrado e levadas para casa de vegetação. Nesta ocasião, as plântulas possuíam de 0,78 a 1,14 cm de altura, 0,78 a 1,13 cm de comprimento de raiz, 0,65 a 0,68 mm de diâmetro do colo e tinham de 3,1 a 3,4 folhas. Foram utilizados quatro níveis de sombreamento: 98% (aprox. 29 µmol.m-2.s-1), 70% (aprox. 424 µmol.m-2.s-1), 50% (aprox. 679 µmol.m-2.s-1), obtidos com telas tipo sombrite de cor preta, e 0% (aprox. 1395 µmol.m-2.s-1). As medidas de irradiância (sob os sombrites e na ausência deles) foram realizadas próximo ao meio-dia com um sensor esférico acoplado a um fotômetro Li-cor (Li-250A, Biosciences, Lincoln, USA). Os níveis de sombreamento foram definidos a partir de medidas de irradiância obtidas em campo, em áreas de ocorrência natural das espécies estudadas. O tratamento de 50% de sombreamento simula condições de clareiras no cerradão, o tratamento de 70%, bordas e interior do cerrado sensu stricto, e o tratamento de 98% o sub-bosque sob dossel fechado do cerradão. Análise de crescimento As seguintes medidas foram tomadas para cada tratamento: comprimento do caule e da raiz (cm), massa seca do caule, da raiz e das folhas (g), área foliar total (cm²), diâmetro do colo (mm) e número de folhas. Foi determinado o índice de estiolamento (comprimento do caule/diâmetro do colo) como uma medida alométrica relacionada à estratégia de evitar a sombra (Sánchez-Gómez et al. 2006). As medidas foram realizadas 240 dias após o transplante (que ocorreu 90 dias após a emergência). Para a realização das medidas, cada planta foi considerada como uma repetição, sendo o número amostral de 10 plantas por tratamento, com exceção do tratamento de 98%, onde a mortalidade reduziu o n amostral para 4. Para a medida do caule foi considerada a distância entre o colo até a gema apical, e o diâmetro do colo foi medido com paquímetro digital, de precisão de 0,05 mm. Para a retirada 57 das raízes, os sacos plásticos foram cortados verticalmente e o solo removido com jatos finos de água. Para determinação da massa seca, o material foi coletado, acondicionado em sacos de papel e mantido em estufa a 80ºC durante 48 horas. Após secagem, foram pesados separadamente em balança analítica. A determinação da área foliar total foi feita através da digitalização das folhas de cada indivíduo com scanner e as medidas realizadas com o software imageJ® de domínio público. Atributos fisiológicos Medidas foram realizadas no terço inferior de folhas (uma por planta) completamente expandidas do segundo ou terceiro nó de cinco plantas de cada tratamento. As medidas foram tomadas entre as 09:00 e 11:00 horas de um dia ensolarado no mês de março de 2014 em casa de vegetação, onde a temperatura e umidade relativa do ar ambiente eram em média de 32,9 ± 0,4 ºC e 64,8 ± 2,2 % respectivamente. A condutância estomática (gs) foi medida com um porômetro (modelo sc-1, Decagon Devices, USA). Foram tomados dados de fluorescência da clorofila utilizando uma curva de saturação luminosa utilizando um fluorômetro portátil, modelo Junior PAM (Gademann Instruments GmbH, Wurzburg, Germany), com um fibra óptica de 1,5 mm de diâmetro e uma fonte de luz de diodo azul (485±40 nm). Foi realizada uma curva “rápida” de fluorescência utilizando-se procedimentos padrões (White & Critchley 1999), o tempo total para realização da curva foi de 88 s, com 10 s de intervalo entre os flashes actínicos de luz (duração de 0,8s cada flash). Os flashes foram realizados em uma ordem de intensidade crescente. Os parâmetros de fluorescência da eficiência quântica efetiva, rETR (taxa relativa de transporte de elétrons) e NPQ (quenching não fotoquímico) foram calculados utilizando o software WINCONTROL (2.133/03.00) utilizando procedimentos usuais através de curvas rápidas de luz (Genty et al. 1989), utilizando-se um fator de absorbância de 0,84 e um valor de 0,5 para 58 absorção de luz para o PSI e PSII. Todas as medidas de fluorescência da clorofila foram realizadas em folhas previamente aclimatadas ao escuro por 30 minutos. Para determinação de pigmentos fotossintéticos dois discos foliares (0,6 cm² cada) foram coletados do terço inferior das mesmas folhas onde foram realizadas as medidas de fluorescência. Os discos foliares foram pesados e em seguida macerados num almofariz com pistilo em 3,75 mL de acetona 80%, as amostras foram recolhidas em tubos de ensaio sendo centrifugadas a 3000 rpm durante 3 minutos. Após a centrifugação o sobrenadante foi coletado (2 mL) e transferido para uma cubeta de quartzo. Em seguida, as clorofilas (a, b e totais) e carotenoides totais foram quantificados através de espectrofotometria seguindo as equações propostas por Lichtenthaler (1987), sendo os resultados expressos em microgramas por centímetro quadrado (µg.cm²). Para evitar a fotodegradação dos pigmentos, a coleta do material vegetal foi realizada em laboratório na penumbra e a extração feita em sala escura climatizada (22,0±2,0ºC) sob luz verde. O peso exato dos discos foliares bem como o volume final após extração de cada amostra foi anotado para ajustar os cálculos finais. Atributos morfo-anatômicos Para análise dos tecidos foliares foram realizadas seções transversais de regiões medianas do limbo a partir das mesmas folhas utilizadas para medição das variáveis fisiológicas. Os segmentos foram fixados em FAA 70 por 48 horas (Johansen 1940), sendo após desidratados em série etílica e incluídos em parafina. As seções foram obtidas com espessura de 8-10 µm, sendo coradas com azul de astra e fucsina básica, tendo entellan como meio de montagem. As medidas para cada um dos caracteres foliares (espessura da cutícula da face adaxial, epiderme da face abaxial e adaxial, do parênquima paliçádico e lacunoso, e total) foram tomadas a partir de imagens capturadas em lentes objetivas de 20x, com um total de 10 medidas por indivíduo analisado, utilizando-se um microscópio óptico da Zeiss, modelo Axio 59 Scope A1, acoplado a uma câmera digital Zeiss, modelo AxioCam MRc. Todas as medidas foram tomadas, com uso da ferramenta “zoom” quando necessário, utilizando-se o programa Axiovision 4.7. A partir das medidas de espessura dos parênquimas paliçádico e lacunoso foi calculada a razão entre esses tecidos (parênquima paliçádico/lacunoso). As características estomáticas foram analisadas a partir de segmentos das mesmas folhas (uma amostra de ± 1 cm2 foi retirada entre a margem e a nervura principal da lâmina foliar, na porção mediana do semilimbo). A dissociação das epidermes foliares foi realizada com uma solução 1:1 de ácido acético glacial e peróxido de hidrogênio, a ± 70ºC, pelo tempo necessário para a total dissociação das epidermes (modificado de Franklin 1945). Quando não foi possível utilizar a técnica de dissociação das epidermes foi empregada a técnica de impressão da epiderme, utilizando cola universal para o processo, como descrito por Segatto et al. (2004). Após este processo, as epidermes foram lavadas com água destilada, colocadas sobre lâminas e coradas com safranina. A glicerina foi utilizada como meio de montagem. Foram analisados a densidade estomática, o comprimento e a largura das células-guarda (estômatos). As contagens dos estômatos foram feitas em três campos (definidos aleatoriamente) por indivíduo amostrado, na lente objetiva de 20x. O tamanho dos estômatos foi medido em no mínimo 3 campos diferentes, definidos aleatoriamente, totalizando 60 estômatos, com a lente objetiva de 20x. A ferramenta “zoom” foi util