RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta tese será disponibilizado somente a partir de 25/11/2024. Campus de Botucatu CICLO CIRCADIANO E AUXINA NA MODULAÇÃO DA SÍNTESE DE ALCALOIDES EM Annona emarginata H. RAINER Bruna Cavinatti Martin Defesa apresentada ao Instituto de Biociências, Câmpus de Botucatu, UNESP, para obtenção do título de Doutora no Programa de Pós-Graduação em Biologia Vegetal, Interunidades entre o Instituto de Biociências do campus de Botucatu e Instituto de Biociências campus Rio Claro. BOTUCATU – SP 2022 Campus de Botucatu UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “Julio de Mesquita Filho” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU CICLO CIRCADIANO E AUXINA NA MODULAÇÃO DA SÍNTESE DE ALCALOIDES EM Annona emarginata H. RAINER Doutoranda: Bruna Cavinatti Martin Orientadora: Profª Drª Gisela Ferreira Defesa apresentada ao Instituto de Biociências, Câmpus de Botucatu, UNESP, para obtenção do título de Doutora no Programa de Pós-Graduação em Biologia Vegetal, Interunidades entre o Instituto de Biociências do campus de Botucatu e Instituto de Biociências campus Rio Claro. BOTUCATU – SP 2022 4 AGRADECIMENTOS À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superiror - Brasil CAPES pela concessão de bolsa de doutorado - Código de Financiamento 001. Ao Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas (Botânica) e aos funcionários da Seção de Pós-graduação, pelo auxílio no decorrer do curso. À Prof.ª Dr.ª Gisela Ferreira pela orientação na execução desse trabalho, por toda troca e aprendizado durante esse arduo caminho. Aos colegas de laboratório Drª Ana Beatriz Marques Honório, Ms. Gustavo Cabral da Silva, Dr. Felipe Girotto Campos e Dr. Fabrício Custódio de Moura Gonçalves, por todo auxílio possível na execução das analises do trabalho. Aos amigos que fiz em Botucatu que tornaram minha caminhada um pouco mais leve. Ao meu psiquiatra Dr Lucas Valente Giustra, sem o qual, jamais teria chegado ao final dessa jornada. Ao meu marido Caio Pagliarini Colombo por todo cuidado, toda parceria e todos os puxões de orelha para me fazer entender que eu precisava cumprir sim com o trabalho que me propus a fazer, mas que ao mesmo tempo, a vida vai muito além disso. Aos meus filhos caninos, Weed e Raul, que foram minha razão de viver e minha companhia durante o doutorado em meio a uma pandemia. Aos meus amados pais, Tania Cavinatti Martin e Antonio Martin Filho, por sempre serem meu chão e meu ar em todos os desafios da vida, inclusive nesse. Obrigada por não me deixaram desistir. À Deus, por ter me mantido em pé e colocado pessoas em meu caminho que me auxiliaram para a conclusão desse trabalho. 5 SUMÁRIO Resumo 7 Abstract 9 1. INTRODUÇÃO GERAL 10 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 12 2.1 Metabolismo especializado em Annonaceae 12 2.1.1 Alcaloides em Annonaceae 13 2.1.2 Fatores ambientais que afetam a produção de alcaloides 14 2.2 Auxinas e o metabolismo primário e especializado 16 2.2.1 Auxinas e o metabolismo primário 18 2.2.2 Auxinas e o metabolismo especializado 19 REFERÊNCIAS 21 3. CAPÍTULO 1: Impacto do ciclo circadiano na produção de alcaloides em mudas de Annona emarginata ‘Terra-Fria’ 28 Resumo 28 Abstract 29 3.1 Introdução 30 3.2 Material e Método 31 3.2.1 Obtenção de material vegetal e delineamento experimental 31 3.2.2 Alcaloides 31 3.2.3 Nitrato redutase 32 3.2.4 Trocas gasosas e fluorescência da clorofila a 32 3.2.5 Extração e quantificação de açúcares 33 3.2.6 Atividade antioxidante 33 3.2.7 Análise dos dados 34 3.3 Resultados e Discussão 34 3.4 Conclusão 43 REFERÊNCIAS 43 4. CAPÍTULO 2: Modulação da síntese de alcaloides pela ação de ácido indolilacético em mudas de Annona emarginata (Schltdl) H. Rainer 49 Resumo 49 Abstract 51 4.1 INTRODUÇÃO 52 6 4.2 MATERIAL E MÉTODOS 55 4.2.1 Obtenção de material vegetal e delineamento experimental 55 4.2.2 Aplicação do ácido indolilacético e seu inibidor de transporte TIBA 56 4.2.3 Alcaloides 56 4.2.4 Quantificação de ácido indolilacético 57 4.2.5 Nitrato Redutase 57 4.2.6 Trocas gasosas e fluorescência da clorofila a 57 4.2.7 Açúcares e amido 58 4.2.8 Atividade antioxidante e espécies reativas de oxigênio 58 4.2.9 Análise dos dados 58 4.3 RESULTADOS 59 4.4 DISCUSSÃO 74 4.5 CONCLUSÃO 79 REFERÊNCIAS 79 7 Resumo As plantas da família Annonaceae são conhecidas por produzirem diversos metabolitos especializados, dentre eles os alcaloides destacam-se por sua variedade e funções biológicas de interesse farmacológico e agronômico. A espécie Annona emarginata é nativa e muito utilizada como porta enxerto de espécies comerciais de Annona como a atemóia, além de ser utilizada na recuperação de áreas biodegradas e possuir ampla variedade de alcaloides. É sabido que os alcaloides podem sofrer alterações em sua concentração ou composição de acordo com o ambiente, e que além disso, tais substâncias compartilham parte da sua rota de síntese com o ácido indolilacético (IAA). Assim, o objetivo desse trabalho foi verificar as possíveis alterações da síntese de alcaloides em Annona emarginata dentro de um ciclo circadiano, bem como se a aplicação de IAA modifica a síntese de alcaloides. Além disso, buscamos avaliar possíveis alterações no metabolismo primário das mudas, que pudessem estar relacionadas com as mudanças nos alcaloides. Visando avaliar variações no conteúdo de alcaloides no ciclo circadiano um primeiro experimento foi instalado e com relação à aplicação de IAA e a síntese de alcaloides um segundo experimento foi realizado. Em ambos os experimentos analisamos alcaloides totais e liriodenina, presença e ausência de alcaloides específicos, atividade da nitrato redutase, trocas gasosas, fluorescência da clorofila a, açúcares e amido, enzimas antioxidantes, peróxido de hidrogênio e lipoperoxidação. Nossos resultados mostraram que em Annona emarginata existe uma relação entre metabolismo primário e especializado, causando alterações na concentração de alcaloides totais, liriodenina e na presença e ausência de alcaloides específicos em folhas e raízes. Concluímos com o primeiro experimento que o melhor horário de coleta visando extrair maior concentração desses compostos é às 02h00 nas raízes. Quanto ao segundo experimento, verificamos que a aplicação de IAA também causou alterações pontuais no metabolismo primário que resultaram em redução da síntese de alcaloides, além de causar alterações na presença e ausência de alcaloides em raízes de mudas de Annona emarginata, o que foi possível detectar com a inibição do transporte de auxina. 8 Palavras-chave: Metabolismo especializado; Metabolismo primário; Hormônios vegetais; Fotossíntese 9 Abstract Plants of the Annonaceae family are known to produce several specialized metabolites, among which the alkaloids stand out for their variety and biological functions of pharmacological and agronomic interest. The species Annona emarginata is native and widely used as a rootstock for commercial species of Annona such as atemoya, in addition to being used in the recovery of biodegradable areas and having a wide variety of alkaloids. It is known that alkaloids can change their concentration or composition according to the environment, and that, in addition, such substances share part of their synthesis route with indolylacetic acid (IAA). Thus, the objective of this work was to verify the possible alterations in the synthesis of alkaloids in Annona emarginata within a circadian cycle, as well as whether the application of IAA modifies the synthesis of alkaloids. In addition, we sought to evaluate possible changes in the primary metabolism of seedlings, which could be related to changes in alkaloids. Aiming to evaluate variations in the alkaloid content in the circadian cycle, a first experiment was installed and in relation to the application of IAA and the synthesis of alkaloids, a second experiment was carried out. In both experiments we analyzed total alkaloids and liriodenine, presence and absence of specific alkaloids, nitrate reductase activity, gas exchange, fluorescence chlorophyll, sugars and starch, antioxidant enzymes, hydrogen peroxide and lipid peroxidation. Our results showed that in Annona emarginata there is a relationship between primary and specialized metabolism, causing changes in the concentration of total alkaloids, liriodenine and in the presence and absence of specific alkaloids in leaves and roots. We concluded with the first experiment that the best time of collection to extract the highest concentration of these compounds is at 2:00 am in the roots. As for the second experiment, we found that the application of IAA also caused specific changes in the primary metabolism that resulted in a reduction in the synthesis of alkaloids, in addition to causing changes in the presence and absence of alkaloids in the roots of Annona emarginata seedlings, which was possible to detect by inhibiting auxin transport. Keywords: Specialized metabolism; Primary metabolism; plant hormones; Photosynthesis 10 1. INTRODUÇÃO GERAL O metabolismo das plantas é dividido em primário e especializado. O metabolismo primário consiste em uma série de processos fundamentais, como a fotossíntese e a respiração, a fim de assegurar o crescimento e desenvolvimento da planta, sendo encontrado em todo reino vegetal (VERPOORTE, 2000). O metabolismo especializado, se utiliza dos produtos do metabolismo primário como precursores de seus compostos, que vão garantir a sobrevivência do vegetal, atuando especialmente na interação entre a planta e o ambiente (KUTCHAN et al., 2015; PICHERSKY; LEWINSOHN, 2011; VERPOORTE, 2000). Os metabólitos especializados são restritos a determinadas espécies e/ou órgãos e são divididos em três grandes grupos: terpenos, compostos fenólicos e compostos nitrogenados (STEVENSON; NICOLSON; WRIGHT, 2017). Os alcaloides, alvo desta pesquisa, fazem parte da classe dos compostos nitrogenados, sendo metabólitos de grande importância quando se trata de adaptação e sobrevivência das plantas a fatores bióticos e abióticos estressantes (ataques de patógenos e radiação UV, por exemplo), além de serem reserva de nitrogênio (JANSEN et al., 1998; SIMÕES et al., 1998; SIMÕES et al., 2007; SIMÕES et al., 2016). Na família Annonaceae estão documentados mais de 900 alcaloides, sendo que os mais abundantes são os benzilisoquinolínicos (ABI) derivados da tirosina e fenilalanina (LÚCIO et al., 2015). Em A. diversifolia, os ABIs são produzidos desde etapas iniciais da germinação, onde a liriodenina atua como sistema de defesa ao inibir o crescimento de Rhizopus stolonifer e Aspergillus glaucus, fungos que degradam desde sementes (DE LA CRUZ CHACÓN et al., 2011; DE LA CRUZ CHACÓN; GONZÁLEZ- ESQUINCA, 2012) até plantas adultas (GONZÁLEZ-ESQUINCA et al., 2014). Desta forma, a liriodenina é um alcaloide benzilisoquinolínico bastante encontrado em espécies dessa família sendo considerado marcador quimiotaxonômico. Além disso, a liriodenina possui importantes atividades biológicas como ação antifúngica, antibactericida, antiprotozoaria, capaz de inibir o crescimento de varios fitopatógenos (DE LA CRUZ CHACÓN et al., 2011). A produção de alcaloides varia em função de estádio de desenvolvimento do vegetal (HOFT et al., 1996; WILLIAMS; ELLIS, 1989), de condições ambientais (HOFT et al., 1996; BRISKE; CAMP, 1982; ELGORASHI et al., 2002; ROCCA- PEREZ et al., 2004) e de reguladores vegetais, como as auxinas (PALEG et al., 1959; SOUSA et al., 2019; SILVA et al., 2021). 11 Com relação ao ambiente, estudos demonstram alterações no conteúdo de alcaloides de acordo com a sazonalidade, variações nas condições de luminosidade, temperatura e disponibilidade de água (VERMA e SKULA et al., 2015; YANG et al., 2018). O cultivo de Trachyspermum ammi em região de escassez hídrica aumenta o teor de clorofila e fenólicos totais e reduz a altura das plantas, massa fresca e seca da erva, o que influencia seu sistema de defesa (AZHAR et al., 2011). Castro-Moreno et al. (2013) verificaram que em Annona lutescens houve redução na concentração de liriodenina nas raízes na estação seca. As elevadas temperaturas também afetam a produção de metabólitos especializados fazendo com que o fotossistema II apresente diminuição da eficiência fotoquímica causando aumento do estresse nas plantas (JOCHUM et al., 2007). No entanto até o momento não foi observado como o ciclo circadiano impacta a produção de alcaloides em Annona sp. Metabólitos especializados e hormônios compartilham parte de rotas metabólicas, o que sugere que hormônios poderão desempenhar papel na biossíntese de alcaloides. A rota do ácido chiquímico dá origem a produtos especializados nitrogenados como os alcaloides e compostos fenólicos, além do grupo hormonal das auxinas (LJUNG, 2013; MAEDA; DUDAREVA, 2012). Além disso, sabe-se que os hormônios possuem efeitos no crescimento das plantas, morfogênese e metabolismo primário reconhecidos há mais de um século (ALAM; NAEEM; IDREES, 2012). O fato de os hormônios estarem relacionados ao metabolismo primário e especializado das plantas sugere estudos que ao investigarem o papel de hormônios na síntese de metabólitos especializados, considere suas relações também com o metabolismo primário (OLIVOTO et al., 2017), o que ainda é pouco elucidado em Annonaceae. A espécie Annona emarginata (Schltdl.) H. Rainer escolhida para este estudo é nativa do continente sul-americano, encontrada na Argentina, Bolívia, Brasil, Paraguai, Peru e Uruguai (MAAS et al., 2001). No Brasil possui importância na recuperação de áreas degradadas e é utilizada como porta-enxerto para espécies comerciais como a atemoia (Annona x atemoya Mabb.) e a fruta-do-conde (A. squamosa L.) (BETTIOL NETO et al., 2006; KAVATI, 2013) devido à sua rusticidade, tolerância a patógenos causadores da broca-do-colmo (KAVATI, 2013), podridão de raízes e colo (TOKUNAGA, 2005) e tolerância ao déficit hídrico severo (MANTOAN et al., 2016). Nesta espécie há relatos da presença de liriodenina, anonaina, reticulina e asimilobina em raízes e caules de plantas adultas (LÚCIO et al., 2015). 79 reduções na transpiração e nos açúcares e amido nos momentos de maior síntese de alcaloides (156h e 324h). 4.5 Conclusão A aplicação do ácido indolilacético provoca alterações no metabolismo primário que resultam em decréscimo na concentração de alcaloides totais e liriodenina em raízes de mudas de Annona emarginata, o que foi possível confirmar com a inibição do transporte de auxina. Com a inibição do transporte de auxina, nos momentos em que verificamos maior concentração de alcaloides totais tanto em raízes como em folhas, houve redução na transpiração e no teor de carboidratos. A auxina IAA altera as relações entre presença e ausência de alcaloides. Nas folhas após aplicação de IAA foi possível detectar lanuginosina, liriodenina e xilopina, e quando seu transporte é inibido, desaparece a xilopina e surge a N-metil laurotetanina. Nas raízes a IAA promove o aparecimento de discretina e xilopina, enquanto a oxoglaucina não é detectada, e quando o transporte da auxina é inibido, não se observa assimilobina e oxoglaucina, mas sim a xilopina. Referências ALEXIEVA V, SERGIEV I, MAPELLI S, KARANOV E. The effect of drought and ultraviolet radiation on growth and stress markers in pea and wheat. Plant, Cell & Environment. 24(12): 1337-1344, 2001. BARON, D.; AMARO, A. C. E.; CAMPOS, F. G.; FERREIRA, G. Leaf gas exchanges responses of atemoya scion grafted onto Annona rootstocks. Theoretical and Experimental Plant Physiology, v. 30, n. 3, p. 203–213, 2018. Disponível em: . BEAUCHAMP C, FRIDOVICH I. Superoxide dismutase: improved assays and an assay applicable to acrylamide gels. Analytical biochemistry. 44(1):276-287, 1971. BRADFORD, M.M. 1976. Um método rápido e sensível para a quantificação de quantidades de microgramas de proteína utilizando o princípio da ligação proteína- corante. 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