CARENINA VIDOTTE PLAZA Investigação fitoquímica e avaliação da atividade antioxidante das folhas e frutos de Eugenia jambolana Lam. (Myrtaceae) Dissertação apresentada ao Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Química. Orientadora: Profª. Drª. Dulce Helena Siqueira Silva. ARARAQUARA 2007 1 FICHA CATALOGRÁFICA Plaza, Carenina Vidotte P721i Investigação fitoquímica e avaliação da atividade antioxidante das folhas e frutos de Eugenia jambolana Lam. (Myrtaceae) / Carenina Vidotte Plaza. – Araraquara : [s.n], 2007 108 f. : il. Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual Paulista, Instituto de Química Orientador: Dulce Helena Siqueira Silva 1. Química orgânica. 2. Flavonóides. 3. Antioxidantes. 4. Antocianinas. I. Título. Elaboração: Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação do Instituto de Química de Araraquara Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação 2 Dedico este trabalho Aos meus pais Beto e Marilei, Aos meus irmãos Roberta, Conrado e Catarina, E, à minha orientadora. 3 AGRADECIMENTOS Ao meu pai Beto e minha mãe Marilei pelo exemplo de vida, carinho e atenção em todos os momentos em que liguei chorando!! Minhas tias Cris Cláu e Dri, aos meus tios Nemêncio e Sérgio pelo fã-clube, incentivo, enorme apoio e incontáveis dicas que contribuíram para meu crescimento. À minha avó Anésia pelo colo oferecido quando mais precisei e também minha avó Elvira. Aos meus “irmãozinhos” Roberta e Conrado e minhas “priminhas” Catarina e Dora, pelo grude, brigas e muitas risadas juntos. À minha grande amiga Gra que sempre me ouviu, deu bronca, carinho, força, sempre me empurrando para frente e me aturando nos momentos de “picos” de estresse!! À mulherada da República Sobradinho (moradoras e agregadas), onde sempre encontrei conforto e carinho; Maíra, Jejé e Inna, que mesmo longe pude sempre contar; Josi e Mayra, sempre dispostas a jogarem horas de conversa fora. Aos meus amigos de Monte Azul, Ribeirão e Araraquara. À Dulce pela orientação, paciência e carinho que teve comigo no decorrer desse trabalho, possibilitando não só a realização deste, como também minha evolução como pessoa. Aos amigos Geraldo, Ioanis, Renata e Maisa, que muito colaboraram para a realização deste trabalho; A todos os amigos que eu ganhei no NuBBE, e nos divertimos muito em congressos, viagens, churrascos, pizzadas, Bar Azul e até aulas de forró!!! Dessa turma tenho que destacar a Fêrrrr, Douglas, Amanda, Marcos, Luís, Fernando, Daniara e também Marina, Breno e Dani, que não são do Nubbe, mas estamos sempre juntos. 4 A toda a galera do laboratório NuBBE III, pós-graduandos e ICs, que transformam um ambiente fechado e saturado de solvente num lugar maravilhoso e de alto astral para se trabalhar, e até fazer faxina!!!! Aos amigos Nivaldo e Albertinho pela realização dos espectros e ao Marcelo e profª. Lourdes por dedicarem seus tempos em emprestar e me ensinar a utilizar o aparelho para análises em HSCCC. À todos os professores do Departamento de Química Orgânica pelos ensinamentos que colaboraram muito para minha formação profissional. À FAPESP pela bolsa concedida. E por último, a todos que torceram por mim para a conquista dessa nova etapa. AMO TODOS VOCÊS!! 5 “HÁ METAFÍSICA BASTANTE EM NÃO PENSAR EM NADA” (Alberto Caeiro) “Passa uma borboleta por diante de mim E pela primeira vez eu reparo Que as borboletas não têm cor nem movimento, Assim como as flores não têm perfume nem cor. A cor é que tem cor nas asas da borboleta, No movimento da borboleta o movimento é que se move, O perfume é que tem perfume no perfume da flor. A borboleta é apenas borboleta E a flor é apenas flor.” (Alberto Caeiro) 6 RESUMO A família Myrtaceae apresenta ampla distribuição, ocorrendo, preferencialmente, nas zonas tropicais e subtropicais, e é considerada uma das mais importantes famílias da flora brasileira em função da larga ocorrência de espécies comestíveis e/ou usadas na medicina tradicional. Eugenia jambolana Lam. é conhecida no Brasil como jambolão, e é de grande interesse pelas aplicações medicinais, especialmente de suas folhas e frutos, no tratamento da diabetes. O trabalho tem como objetivo a investigação fitoquímica das folhas e frutos de E. jambolana monitorado por testes para detecção de atividade potencialmente antioxidante, através dos métodos de descoramento do β-caroteno e seqüestro do radical DPPH. Folhas e frutos da planta em estudo foram coletados na Faculdade de Ciências e Letras – UNESP/CAr. Foi obtido o extrato etanólico das folhas que foi particionado com solventes de diferentes polaridades. Para a obtenção do extrato bruto dos frutos (casca e polpa) foi utilizado MeOH (1% HCl). O estudo fitoquímico das folhas através de técnicas cromatográficas usuais (cromatografia em coluna, CLAE e cromatografia em contra corrente de alta velocidade) resultou no isolamento de dois flavonóides que apresentaram atividade antioxidante em ensaio com solução de β-caroteno. Os flavonóides isolados foram identificados como 4’-O- ramnopiranosídeo-3’,5,5’,7-tetraidroxi-flavona (1) e miricetrina (2). Análises em CLAE-DAD das frações provenientes do extrato bruto das frutas evidenciaram a presença de três antocianinas majoritárias e uma minoritária, que foram detectadas por análises de CLAE-DAD e CLAE-MS, e em comparação com dados da literatura, proporcionou a identificação das mesmas como cianidina-3-xilosídeo, cianidina-3- glucosídeo, cianidina-3-rutinosídeo e cianidina-3-(6’’-acetoil)-glicosídeo. As frações FrX-4, FrX-442, FrX-452 e FrX-5 foram foram avaliadas frente ao radical livre DPPH apresentaram forte atividade seqüestradora de radicais livres, os valores de IC50 foram 0,065, 0,45, 0,038 e 0,044 mg.mL-1 respectivamente. O resultado obtido mostrou que as frações analisadas têm atividade antioxidante bem maior que o padrão rutina, sugerindo que, possivelmente os extratos de E. jambolana poderão ser usados como agente quimiopreventivo. Palavras chaves: jambolão, Eugenia jambolana, antioxidante, flavonóides, antocianinas. 7 ABSTRACT The Myrtaceae family is widely distributed and occurs, mostly, in tropical and subtropical areas. It is one of the most important families of the Brazilian flora owing to the wide occurrence of edible species and/or species used in the traditional medicine. Eugenia jambolana Lam. is known in Brazil as jambolão and is of great interest for its folk medicinal applications, especially of their leaves and fruits, in the treatment of diabetes. Leaves and fruits of this species have been collected at UNESP (University Campus). The ethanol extract of the leaves was partioned with organic solvents and the crude extract of the fruits (skin and pulp) was obtained with acidified methanol (1% HCl). The phytochemical study of the leaves extract using chromatographic techniques (column chromatography, TLC, HPLC and HSCCC) resulted in the isolation of two flavonoids which presented strong antioxidant activity in the TLC assay using β-carotene solution as revealing agent. The isolated flavonoids have been identified as 4’-O- ramnopyranoside-3',5',5,7-tetrahydroxy-flavone (1) and myricetrin (2). Their strong antioxidant activity could be related with the presence of hydroxy groups in ring B which provides increased stability to the radical formed after donation of a hydrogen radical, and also the presence of the α,β-unsaturated carbonyl moiety on C ring.. HPLC-DAD analyses of the fractions obtained from the crude extract of the fruits evidenced the presence of three major anthocyanins and a minor one, which been identified by analyses of HPLC-DAD and HPLC-MS data, and comparison with literature. They were identified as cyanidin-3-xyloside, cyanidin-3-glucoside, cyanidin-3-rutinoside and cyanidin-3- (6''-acetoyl)-glucoside. Anthocyanin-rich fractions were evaluated for their free radical scavenging activity towards the stable free radical DPPH and evidenced stronger activity when compared to standard compound rutin. These results suggest a possible use of the E. jambolana extracts or semipurified fractions as chemopreventive agents. Keywords: jambolão, Eugenia jambolana, antioxidant, flavonoids, anthocyanins. 8 LISTA DE FIGURAS FIGURA 1: PRINCIPAIS VIAS DO METABOLISMO SECUNDÁRIO E SUAS INTERLIGAÇÕES (SIMÕES ET AL, 1999; PERES, 2007). ..............................................................................................18 FIGURA 2: ROTA BIOSSINTÉTICA GERAL PARA FLAVONÓIDES E SEUS PRINCIPAIS GRUPOS. (ANDERSEN & MARKHAM, 2006; SIMÕES ET AL, 1999). ..........................................21 FIGURA 3: POSSÍVEIS MUDANÇAS ESTRUTURAIS DAS ANTOCIANINAS EM MEIO AQUOSO EM FUNÇÃO DO PH (TERCI & ROSSI, 2002). ........................................................................22 FIGURA 4: MECANISMO DE AÇÃO ANTIOXIDANTE POR SEQÜESTRO DE RADICAIS LIVRES DOS FLAVONÓIDES (ARORA, 1998).........................................................................................23 FIGURA 5: FONTES DE ESPÉCIES REATIVAS E MECANISMO DE DEFESA (GUARATINI ET AL, 2007).................................................................................................................................25 FIGURA 6: DIFERENTES FONTES DE AGENTES TERAPÊUTICOS DE 1981 A 2006 (NEWMAN & CRAGG, 2007). ................................................................................................................30 FIGURA 7: FRUTOS E FOLHAS DE E. jambolana (FOTO: HTTP://WWW.MOTHERHERBS.COM/PCAT- GIFS/PRODUCTS-SMALL/SYZYGIUM-CUMINI1.JPG). ............................................................33 FIGURA 8: EXEMPLAR ADULTO DE E. jambolana.. ....................................................................34 FIGURA 9: FLORES DE E. jambolana (FOTO DE A. MURRAY, COPYRIGHT 2000, UNIV. FLÓRIDA). ..........................................................................................................................................34 FIGURA 10: EXEMPLOS DE FLAVONÓIDES ISOLADOS DE E. jambolana (MAHMOUD ET AL, 2001).................................................................................................................................35 FIGURA 11: CCDC DAS FRAÇÕES EBF-1-1 À EBF-1-21, ELUÍDAS NO SISTEMA ACOET:ÁCIDO ACÉTICO:MEOH:H2O (10:1:1:3) E REVELADAS COM A) ANISALDEÍDO E B) β-CAROTENO. ..........................................................................................................................................60 FIGURA 12: CROMATOGRAMA DA FRAÇÃO EBF-1-14, C-18, H2O:MECN (9:1), 254NM. .........60 FIGURA 13: ESTRUTURAS PARCIAIS PARA A SUBSTÂNCIA 1, ATRIBUÍDAS RESPECTIVAMENTE AOS ANÉIS A, B E C DE UMA FLAVONA. ....................................................................................61 FIGURA 14: ESTRUTURA DA SUBSTÂNCIA 1. .............................................................................61 FIGURA 15: ALGUMAS CORRELAÇÕES OBSERVADAS EM EXPERIMENTO GHMBC E COSY DA SUBSTÂNCIA 1. ..................................................................................................................62 FIGURA 16: CROMATOGRAMA DA FRAÇÃO EAF-167, H2O:MECN (85:15), 254NM. ................63 FIGURA 7: ESTRUTURAS PARCIAIS PARA A SUBSTÂNCIA 2, ATRIBUÍDAS RESPECTIVAMENTE AOS ANÉIS A, B E C DE UM FLAVONOL......................................................................................64 9 FIGURA 18: ESTRUTURA DA SUBSTÂNCIA 2. .............................................................................65 FIGURA 19: ALGUMAS CORRELAÇÕES OBSERVADAS EM EXPERIMENTO GHMBC E COSY DA SUBSTÂNCIA 2. ..................................................................................................................66 FIGURA 20: CROMATOGRAMA DE CC-7, C-18, GRADIENTE H2O/MEOH (INICIANDO COM 5%MEOH), C-18, 350NM..................................................................................................67 FIGURA 21: CROMATOGRAMAS DE CC-2 E CC-3, C-18, GRADIENTE H2O/MEOH (INICIANDO COM 5%MEOH), C-18, 254NM..........................................................................................67 FIGURA 22: CROMATOGRAMAS DE CC-10, CC-13 E CC-14, C-18, GRADIENTE H2O/MEOH (INICIANDO COM 5%MEOH), C-18, 290NM.......................................................................68 FIGURA 23: CROMATOGRAMAS DE ALGUMAS FRAÇÕES ORIGINÁRIAS DO FRACIONAMENTO COM HSCCC E DA FRAÇÃO ACOET-M, GRADIENTE H2O/MEOH (INICIANDO COM 5%MEOH), C-18, 290NM. ....................................................................................................................69 FIGURA 24: CROMATOGRAMA DE FRX-4, C-18, GRADIENTE H2O/MEOH (INICIANDO COM 5%MEOH), 254NM. ..........................................................................................................70 FIGURA 25: CROMATOGRAMA DE FRX-5, C-18, C-18, GRADIENTE H2O/MEOH (INICIANDO COM 5%MEOH), 254NM. ..........................................................................................................71 FIGURA 26: CROMATOGRAMA DE FRX-442, C-18, GRADIENTE H2O/MEOH (INICIANDO COM 5%MEOH). .......................................................................................................................71 FIGURA 27: CROMATOGRAMA DE FRX-442 0 A 15MIN 35% B, 16 A 18MIN 35-40% B, 19 A 35MIN 40% B, 35 A 40 MIN 40-100% B, EM COLUNA DE FASE REVERSA (FENIL-HEXILA), ONDE A É ÁGUA (0,5% H3PO4) E B É MEOH A 254NM. .....................................................72 FIGURA 28: MECANISMO DE REAÇÃO DO RADICAL DPPH COMO ANTIOXIDANTE (DOADOR DE H.). ....................................................................................................................................73 FIGURA 29: ATIVIDADE SEQÜESTRADORA DE RADICAIS LIVRES DE FRX-4, FRX-442, FRX-452 E FRX-5 FRENTE AO DPPH. .................................................................................................73 FIGURA 30: PROPOSTA DE FRAGMENTAÇÃO PARA FRX-4-2......................................................75 FIGURA 31: ESQUEMA DE FORMAÇÃO DE M/Z 244 PARA FRX-2................................................75 FIGURA 32: PROPOSTA DE FRAGMENTAÇÃO PARA FRX-4-3......................................................76 FIGURA 33: REARRANJO PROPOSTO PARA JUSTIFICAR O ÍON M/Z 149. .......................................76 FIGURA 34: PROPOSTA DE FRAGMENTAÇÃO PARA FRX-5. ........................................................76 FIGURA 35: CROMATOGRAMA DE FRX-4 (C18, GRAD H2O/MEOH, 520NM) ANALISADO EM ESPECTROMETRIA DE MASSAS E OS REFERENTES ESPECTROS DE UV..................................77 10 FIGURA 36: ESPECTRO DE MASSAS DE FRX-4-1. .......................................................................77 FIGURA 37: ESPECTRO DE MASSAS DE FRX-4-2. .......................................................................77 FIGURA 38: ESPECTRO DE MASSAS DE FRX-4-3. .......................................................................77 FIGURA 39: ESPECTRO DE MASSAS DE FRX-4-4. .......................................................................78 FIGURA 40 ESPECTRO DE RMN 1H DE EBF-1-14-E EM DMSO-D6 A 500MHZ.........................87 FIGURA 41: AMPLIAÇÕES DO ESPECTRO DE RMN 1H DE EBF-1-14-E EM DMSO-D6 A 500MHZ ..........................................................................................................................................88 FIGURA 42: GHMQC DE EBF-1-14-E EM DMSO-D6 A 500MHZ. ............................................89 FIGURA 43: GHMBC DE EBF-1-14-E EM DMSO-D6 A 500MHZ..............................................90 FIGURA 44: GCOSY DE EBF-1-14-E EM DMSO-D6 A 500MHZ ...............................................91 FIGURA 45: ESPECTRO DE RMN 1H DE EAF-167R EM DMSO-D6 A 500MHZ..........................92 FIGURA 46: AMPLIAÇÕES DO ESPECTRO DE RMN 1H DE EAF-167R EM DMSO-D6 A 500MHZ93 FIGURA 47: ESPECTRO DE RMN 13C DE EAF-167R EM DMSO-D6 A 500MHZ.........................94 FIGURA 48: ESPECTRO DE DEPT DE EAF-167R EM DMSO-D6 A 500MHZ. .............................95 FIGURA 49: ESPECTRO GCOSY DE EAF-167R EM DMSO-D6 A 500MHZ. ...............................96 FIGURA 50: ESPECTRO GHMQC DE EAF-167R EM DMSO-D6 A 500MHZ...............................97 FIGURA 51: ESPECTRO GHMBC DE EAF-167R EM DMSO-D6 A 500MHZ...............................98 FIGURA 52: ESPECTRO DE RMN 1H DE FRX-4 EM DMSO-D6 A 500MHZ ................................99 FIGURA 53: ESPECTRO DE RMN 1H DE FRX-5 EM DMSO-D6 A 500MHZ .............................100 FIGURA 54: ESPECTRO DE RMN 1H DE CC-3 EM DMSO-D6 A 200MHZ ...............................101 11 LISTA DE FLUXOGRAMAS FLUXOGRAMA 1: PREPARAÇÃO DO EXTRATO BRUTO DAS FOLHAS DE E. jambolana. ...............42 FLUXOGRAMA 2: PARTIÇÃO DO EXTRATO BRUTO DAS FOLHAS DE E. jambolana. ....................43 FLUXOGRAMA 3: FRACIONAMENTO DO EXTRATO N-BUTANÓLICO DAS FOLHAS DE E. jambolana. ..........................................................................................................................................44 FLUXOGRAMA 4: FRACIONAMENTO DO EXTRATO HIDROALCOÓLICO DAS FOLHAS DE E. jambolana. ........................................................................................................................47 FLUXOGRAMA 5: PARTIÇÃO DO EXTRATO ACETATO DAS FOLHAS (EACF) DE E. jambolana. ...50 FLUXOGRAMA 6: PREPARAÇÃO DO EXTRATO BRUTO DOS FRUTOS DE E. jambolana. ...............52 FLUXOGRAMA 7: PARTIÇÃO DO EXTRATO BRUTO DOS FRUTOS DE E. jambolana. ....................54 12 LISTA DE TABELAS TABELA 1: PRINCIPAIS COMPOSTOS FUNCIONAIS INVESTIGADOS PELA CIÊNCIA DE ACORDO COM A SBAF (WWW.SBAF.ORG.BR/SBAF)................................................................................27 TABELA 2: FRACIONAMENTO DO EXTRATO N-BUTANÓLICO (EBF) DAS FOLHAS DE E. jambolana POR CC EM FASE REVERSA (C-18). ....................................................................................45 TABELA 3: FRACIONAMENTO DO EXTRATO HIDROALCOÓLICO (EAF) DAS FOLHAS DE E. jambolana POR CC EM FASE REVERSA (C-18). ..................................................................47 TABELA 4: FRACIONAMENTO DE EAF-1-6 POR CC EM FASE REVERSA (C-18). .........................48 TABELA 5: FRACIONAMENTO DE ACOET-M POR HSCCC. .......................................................51 TABELA 6: FRACIONAMENTO DO EXTRATO BRUTO DOS FRUTOS (FRX) DE E. jambolana POR CC EM XAD-4.........................................................................................................................54 TABELA 6: FRACIONAMENTO DAS FRAÇÕES FRX-43, FRX-44, FRX-45, FRX-46, FRX-47 POR CC EM XAD-4. .................................................................................................................55 TABELA 8: DADOS DE RMN 1H E RMN-2D (500 MHZ, DMSO-D6) DA SUBSTÂNCIA 1. ...........62 TABELA 9: DADOS DE RMN 1H E RMN-2D (500 MHZ, DMSO-D6) DA SUBSTÂNCIA 2. ...........65 TABELA 10: IDENTIFICAÇÃO DAS ANTOCIANINAS DE E. jambolana. .........................................74 13 LISTA DE ABREVIATURAS AcOEt Acetato de Etila aq. Aquosa C18 Sílica Gel de Fase Reversa (octadecilsilano) CC Cromatografia em Coluna CCDC Cromatografia em Camada Delgada Comparativa CDCl3 Clorofórmio deuterado CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência COSY Correlated spectroscopy d Dubleto DAD Detector em Arranjo de Diodos DCM Diclorometano dd Duplo dubleto DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DMSO-d6 Dimetilsulfóxido deuterado DPPH Difenil-picril-hidrazila EAcF Extrato acetato das folhas EAF Extrato hidroalcoólico das folhas EBF Extrato n-butanólico das folhas EHF Extrato hexânico das folhas EtOH Ácool etílico FrX Extrato dos frutos gCOSY Gradient correlated spectroscopy gHMBC Gradient heteronuclear multiple bond coherence gHMQC Gradient heteron. Multiple quantum coherence grad. Gradiente HCl Ácido clorídrico HSCCC High speed counter curent chromatography IC50 Concentração inibitória de 50% J Constante de acoplamento m Multipleto m/z Relação massa/carga 14 MeCN Acetonitrila MeOH Metanol MHz/Hz Megahertz/Hertz min. Minuto NuBBE Núcleo de Bioensaio, Biossíntese e Eco-Fisiologia de Produtos Naturais pg. Página pH Potencial Hidrogeniônico prep. Preparativo(a) Rf Fator de Retenção RMN 13C Ressonância Magnética Nuclear de Carbono 13 RMN 1H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio RMN - 2D Ressonância Magnética Nuclear Bidimensional s Singleto sl Singleto largo t Tripleto TMS Tetrametilsilano tr Tempo de Retenção UV-Vis Ultra Violeta - Visível δ Deslocamento químico 15 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO 17 1.1 METABOLISMO 18 1.2 COMPOSTOS FENÓLICOS 19 1.2.1 FLAVONÓIDES 20 1.2.2 ANTOCIANINAS 22 1.3 ANTIOXIDANTES 23 1.4 RADICAIS LIVRES 24 1.5 ALIMENTO FUNCIONAL 26 1.6 PLANTAS MEDICINAIS 28 1.7 ESPÉCIE EM ESTUDO 32 1.7.1 MYRTACEAE 32 1.7.2 Eugenia jambolana LAM. 33 2 MATERIAIS E MÉTODOS 37 2.1 SOLVENTES E REAGENTES 37 2.2 CONCENTRAÇÃO 37 2.3 CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD) 37 2.4 CROMATOGRAFIA EM COLUNA 38 2.5 CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA 38 2.6 RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR 39 2.7 ESPECTROMETRIA DE MASSAS 39 2.8 ESPECTROFOTOMETRIA (LEITOR DE MICROPLACAS) 39 2.9 CROMATOGRAFIA EM CONTRA CORRENTE DE ALTA VELOCIDADE (HSCCC) 39 2.10 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE POR DESCORAMENTO DE SOLUÇÃO DE ββββ- CAROTENO 40 2.11 METODOLOGIA DE PREPARO DE AMOSTRAS PARA AS ANÁLISES 40 2.12 COLETA E CLASSIFICAÇÃO DO MATERIAL VEGETAL 41 2.13 PREPARAÇÃO DO EXTRATO BRUTO DAS FOLHAS 41 16 2.14 PARTIÇÃO DO EXTRATO BRUTO DAS FOLHAS 42 2.15 FRACIONAMENTO DO EXTRATO N-BUTANÓLICO DAS FOLHAS (EBF) 44 2.16 FRACIONAMENTO DO EXTRATO HIDROALCOÓLICO DAS FOLHAS (EAF) 46 2.17 FRACIONAMENTO DO EXTRATO ACETATO DAS FOLHAS (EACF). 49 2.18 PREPARAÇÃO DO EXTRATO BRUTO DOS FRUTOS 52 2.19 FRACIONAMENTO DO EXTRATO BRUTO DOS FRUTOS 53 2.20 FRACIONAMENTO DE FRX-4 55 2.21 FRACIONAMENTO DE FRX-442 56 2.22 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE SEQÜESTRADORA DE RADICAL LIVRE POR REDUÇÃO DO RADICAL 2,2-DIFENIL-1-PICRILHIDRAZILA (DPPH) EM TESTE ESPECTROFOTOMÉTRICO 57 2.23 ANÁLISE DA FRAÇÃO FRX-4 POR ESPECTROMETRIA DE MASSAS 58 3 RESULTADOS E DISCUSSÕES 59 3.1 PARTIÇÃO DO EXTRATO BRUTO DAS FOLHAS DE E. jambolana 59 3.2 FRACIONAMENTO DO EXTRATO BRUTO DOS FRUTOS DE E. jambolana. 70 4 CONCLUSÕES 79 5 REFERÊNCIAS 81 5.1 SITES CONSULTADOS 85 ANEXO A 86 ANEXO B 102 17 1 INTRODUÇÃO O estudo químico de organismos vivos, como plantas e organismos marinhos, vem crescendo a cada dia, visto a importância das substâncias encontradas na descoberta de novos agentes terapêuticos para o homem. Há muito tempo os produtos naturais são utilizados na cura de doenças do corpo. Cerca de 400 anos antes de Cristo, Aristóteles, o pai da medicina, já dizia “deixe o alimento ser sua medicina e a medicina ser seu alimento”. Os alquimistas, benzedores, curandeiros e xamãs são conhecedores do poder curador das plantas encontradas na natureza, essa sabedoria foi conquistada através da herança do conhecimento e da observação do comportamento de animais e, claro, sempre preservando o caráter mágico, mítico e ritualístico. Os alquimistas tinham três objetivos principais: transformar qualquer metal em ouro, obter o elixir da longa vida e criar o homúnculo (vida humana artificial). O elixir da longa vida seria um remédio universal, que curaria todos os males, além de proporcionar a longevidade a quem o tomasse. A veracidade das propriedades terapêuticas dos vegetais pode ser comprovada através de estudos realizados em laboratórios, com técnicas que envolvem o isolamento de substâncias e testes para a avaliação do potencial ativo dos extratos ou substâncias. 18 1.1 Metabolismo Num organismo vivo ocorre um conjunto de reações químicas no interior das células denominado metabolismo, que, nos vegetais, pode se dividir entre primário e secundário, dependendo da função a ele designada. Metabolismo primário é o conjunto de processos que desempenham as funções essenciais, como a fotossíntese, a respiração e o transporte de solutos. Já no metabolismo secundário são sintetizadas substâncias que a princípio, não possuem função essencial. Porém, são essas substâncias as responsáveis pela proteção do vegetal de diversos fatores. Com isso, o metabolismo secundário acaba exercendo um papel importante na interação das plantas com o meio ambiente, ou seja, representa uma interface química entre as plantas e o ambiente circundante, por tanto, sua síntese é frequentemente afetada por condições ambientais. (PERES, 2007; DI STASI, 1996; GOBBO-NETO & LOPES, 2007). Dentre os fatores ambientais que influenciam o conteúdo dos metabólitos secundários pode-se citar a sazonalidade, ritmo circadiano, desenvolvimento da planta, temperatura, disponibilidade hídrica, radiação ultravioleta, nutrientes (macro e micronutrientes), altitude, poluição atmosférica e indução por estímulos mecânicos ou ataque de patógenos. Assim sendo, a constância de concentrações de metabólitos secundários praticamente não existe. Em plantas medicinais, outros fatores como condições de coleta, estabilização e estocagem também podem ter grande influência (GOBBO-NETO & LOPES, 2007). Existem três grandes grupos de metabólitos secundários: terpenos, compostos fenólicos e alcalóides, suas vias biossintéticas são mostradas na figura 1. Figura 1: Principais vias do metabolismo secundário e suas interligações (SIMÕES et al, 1999; PERES, 2007). acetil-CoA ácido chiquímico via do mevalonato aminoácidos aromáticos ciclo do ác. cítrico 19 1.2 Compostos Fenólicos Os compostos fenólicos são derivados do ácido chiquímico. São responsáveis pelo sabor, odor e coloração de diversos vegetais. Essa classe de substâncias é responsável pela proteção das plantas contra os raios ultravioletas, insetos, fungos, vírus e bactérias. A proteção contra a fotodestruição proporcionada por esses compostos é devida às suas propriedades de absorver ou dissipar a energia solar, principalmente devido à sua extensão de conjugação. Quimicamente dizendo, são substâncias que possuem pelo menos um anel aromático no qual ao menos um hidrogênio é substituído por um grupamento hidroxila (PERES, 2007; GOBBO- NETO & LOPES, 2007). Para a formação biossintética dos compostos fenólicos ocorre a combinação de uma unidade de ácido chiquímico e uma ou mais unidades de acetato ou derivados deste. O ácido chiquímico é formado pela condensação aldólica de dois metabólitos da glicose (SIMÕES et al, 1999). Há vários relatos na literatura apontando os compostos fenólicos como substâncias potencialmente ativas frente a testes químicos e biológicos indicando que essa classe de substâncias é totalmente promissora na descoberta de novos fármacos. Eles são geralmente encontrados e ingeridos pelo homem através de alimentos originários de plantas. Em sua composição, o vinho tinto possui misturas de polifenóis, principalmente antocianinas e flavan-3-óis, além de outros fenólicos como o resveratrol e o ácido gálico. A espécie encontrada em maior quantidade é o flavan-3-ol, em suas formas oligoméricas e poliméricas (procianidinas) que representam 25-50% do total de fenólicos constituintes (CORDER et al, 2006). Corder e colaboradores (2006), em seu trabalho, identificaram as procianidinas, que são taninos condensados, como sendo o principal polifenol vasoativo presente nos vinhos tintos, através da avaliação da dilatação dos vasos sanguíneos e a conseqüente supressão da síntese da endotelina-1, um peptídeo capaz de constringir os vasos sanguíneos. Flavonóides, taninos, antocianinas e outros constituintes fenólicos possuem potencial antioxidante, impedindo o efeito danoso dos radicais livres. Visando a melhoria e sustentação da saúde, é de vital importância o consumo dessas fontes naturais de substâncias para nosso organismo, pois os fenólicos contribuem para a manutenção do equilíbrio pró e antioxidante de sistemas biológicos, desempenhando função essencial na prevenção de várias doenças. 20 1.2.1 Flavonóides Os flavonóides foram descobertos em 1930 pelo prêmio Nobel Szent-György, que extraiu a citrina da casca do limão. Esta classe de compostos participa na fase dependente de luz da fotossíntese, durante a qual catalisam o transporte de elétrons. Estes desempenham um papel fundamental no organismo humano atuando na proteção contra agentes oxidantes como, por exemplo, os raios ultravioleta, a poluição ambiental, substâncias químicas presentes nos alimentos, entre outros, e atuam também como agentes terapêuticos num elevado número de patologias (SILVA, M. B. S., 2007). Possuem uma unidade básica de 15 carbonos, que inclui dois anéis aromáticos hidroxilados, ligados entre si por um fragmento de três carbonos, sua rota biossintética pode ser observada na figura 2 (pg. 21). Dependendo da substituição e do nível de oxidação do anel C, os flavonóides podem ser divididos em 14 classes, sendo os que se incluem na dieta humana divididos essencialmente em seis grupos, flavanóis, flavonóis, flavonas, antocianidinas, isoflavonóides e flavanonas, dentro da mesma classe, diferem-se na substituição dos anéis A e B (DI STASI, 1996; SILVA, M. B. S., 2007). 21 Figura 2: Rota biossintética geral para flavonóides e seus principais grupos. (ANDERSEN & MARKHAM, 2006; SIMÕES et al, 1999). 22 1.2.2 Antocianinas As antocianinas são compostos flavonoídicos, responsáveis pela cor evidenciada em algumas frutas, vegetais, cereais e flores, tal como o vermelho, roxo e azul. É de grande interesse para a indústria, pois são bons corantes para os alimentos, em plantas estão presentes, em grande maioria, na forma de compostos glicosilados (HOU et al, 2004). Possuem uma carga positiva no anel central da estrutura, a pH<3, o que lhes confere, junto com o número e posição de grupos hidroxilas presentes, a coloração (figura 3, pg. 22). Possuem forte atividade antioxidante e efeitos inibitórios no desenvolvimento de algumas linhagens de células cancerígenas. Estudos de atividade-estrutura mostram que a atividade é potencializada devida à presença dos grupos hidroxila no anel B (HOU et al, 2004). Figura 3: Possíveis mudanças estruturais das antocianinas em meio aquoso em função do pH (TERCI & ROSSI, 2002). 23 1.3 Antioxidantes Substâncias antioxidantes são necessárias para proteger o organismo contra o excesso de radicais livres, ou seja, contra o estresse oxidativo. Existem as enzimas (antioxidantes enzimáticos) que combatem esses radicais, mas também há compostos (antioxidantes não enzimáticos), geralmente ingeridos através dos alimentos, que também combatem esses radicais numa reação de óxido-redução, na qual o composto doa um hidrogênio para o radical e passa a ser a substância radicalar, porém, de maior estabilidade. •• •• −+→−+ −+→−+ OFlOHOHFlHOb OFlROOHOHFlROOa 2) ) Figura 4: Mecanismo de ação antioxidante por seqüestro de radicais livres dos flavonóides (ARORA, 1998). a) Espécie reativa de oxigênio (ERO); b) Radical hidroxila. 24 1.4 Radicais Livres Radicais livres são espécies que contém elétrons desemparelhados. Podem-se citar como exemplo as espécies reativas de oxigênio (EROs) e de nitrogênio (ERNs). Esses são seqüestrados e destruídos por enzimas específicas, como superóxido dismutase, catalase e glutationa peroxidase, protegendo os sistemas biológicos do estresse oxidativo. A superprodução de radicais livres, junto com avitaminoses A, C e E e um nível reduzido das enzimas citadas, contribui com o estresse oxidativo, pois esses radicais podem induzir dano oxidativo em biomoléculas como carboidratos, proteínas, lipídios e DNA, acelerando assim o envelhecimento cutâneo e de membranas lipídicas, e contribuindo para a indução de câncer, doenças cardiovasculares, neurodegenerativas e inflamações (BANERJEE; DASGUPTA; DE, 2005; CERQUEIRA; MEDEIROS; AUGUSTO, 2007). As EROs e ERNs participam da iniciação e progressão das reações em cadeia envolvendo a formação de espécies radicalares. A reatividade destes compostos com biomoléculas é variável, sendo alguns estáveis e pouco reativos, como por exemplo, o radical superóxido, O2 •-, e outros altamente reativos, apresentando velocidade de reação próxima à constante de colisão com moléculas-alvo, sendo o radical hidroxila, HO•, o principal exemplo (CERQUEIRA; MEDEIROS; AUGUSTO, 2007). Alimentos ricos em substâncias antioxidantes exercem uma função essencial na prevenção de doenças cardiovasculares, câncer e doenças neurodegenerativas, incluindo mal de Parkinson e Alzheimer, assim como inflamações e problemas causados por envelhecimento cutâneo, pois as substâncias antioxidantes combatem os radicais livres (BANERJEE; DASGUPTA; DE, 2005). Uma quantidade substancial de evidências tem indicado o papel chave dos radicais livres e outros oxidantes como grandes responsáveis pelo envelhecimento e pelas doenças degenerativas associadas ao envelhecimento (SOUSA et al, 2007). 25 Figura 5: Fontes de espécies reativas e mecanismo de defesa (GUARATINI et al, 2007). Fontes endógenas Fontes exógenas Enzimas Processos Patógenos Células Poluentes Gases Atmosféricos Radiação FORMAÇÃO DE ESPÉCIES REATIVAS Mecanismos de Defesa: ANTIOXIDANTES ENZIMÁTICOS E NÃO ENZIMÁTICOS 26 1.5 Alimento Funcional É muito importante estreitar a relação entre alimentação e saúde. Há muito tempo acredita-se que o consumo de frutas e hortaliças auxilia na prevenção de diversas doenças, por isso, recomenda-se uma “alimentação ideal”, que deve conter doses balanceadas de proteínas, carboidratos, gorduras, fibras, vitaminas, minerais e água; é sabido também que a urbanização, a industrialização e a globalização exercem uma grande influência sobre o estilo de vida, a dieta e, consequentemente, o estado nutricional da população (CARVALHO et al, 2006). O interesse nos alimentos específicos que podem prevenir, ou curar algum tipo de doença resultou no uso do termo “alimentos funcionais”. Este termo foi introduzido no Japão na década de 80 e até hoje não existe uma definição universalmente aceita, mas pode ser entendido como um alimento ou um componente do alimento que proporciona um benefício à saúde além da nutrição básica. Em outras palavras, são os alimentos extras à nutrição básica, que beneficiam uma ou mais funções orgânicas, contribuindo para melhorar o estado de saúde e bem-estar e/ou reduzir o risco de doenças, ou seja, fornece benefícios fisiológicos adicionais ao consumidor. Vale lembrar que nenhum alimento isolado deve ser ingerido em detrimento de outros para prevenir qualquer doença específica. O alimento funcional não deve ser utilizado para o tratamento de doenças nem cuidados paliativos (CARVALHO et al, 2006; JONES, 2002; www.ift.org/cms). Segundo a Sociedade Brasileira de Alimentos Funcionais (SBAF), o mercado de alimentos funcionais tem crescido muito nos últimos anos e em 2000, no mundo todo, apresentava um potencial de vendas de cerca de US$ 70 bilhões/ano. No Japão, o primeiro país que formulou um processo de regulação específico para os alimentos funcionais, conhecidos como Alimentos para Uso Específico em Saúde (FOSHU) já existem cerca de 200 tipos diferentes de alimentos funcionais. Além do mercado Japonês, o de países europeus e o norte americano a cada dia apresentam novidades nesse segmento. No Brasil, embora o mercado esteja em crescimento, ainda é tímido, ocupando uma posição defasada em relação a países como Japão, EUA e Europeus. A SBAF classifica as seguintes substâncias como sendo os principais compostos funcionais investigados pela ciência (tabela 1). 27 Tabela 1: Principais compostos funcionais investigados pela ciência de acordo com a SBAF (www.sbaf.org.br/SBAF). COMPONENTES ATIVOS PROPRIEDADES BENÉFICAS EXEMPLOS DE ALIMENTOS FUNCIONAIS QUE CONTÉM O COMPONENTE Isoflavonas Ação estrogênica (reduz sintomas menopausa) e anti-câncer Soja e derivados Proteínas de soja Redução dos níveis de colesterol Soja e derivados Ácidos graxos ômega-3 (EPA e DHA) Redução do LDL-colesterol; ação antiinflamatória. Indispensável para o desenvolvimento do cérebro e retina de recém nascidos Peixes marinhos como sardinha, salmão, atum, anchova, arenque, etc Acido α-linolênico Estimula o sistema imunológico e tem ação antiinflamatória Óleos de linhaça, colza, soja; nozes e amêndoas Catequinas Reduzem a incidência de certos tipos de câncer, reduzem o colesterol e estimulam o sistema imunológico. Chá verde, cerejas, amoras, framboesas, mirtilo, uva roxa, vinho tinto Licopeno Antioxidante, reduz níveis de colesterol e o risco de certos tipos de câncer como de próstata Tomate e derivados, goiaba vermelha, pimentão vermelho, melancia Luteína e Zeaxantina Antioxidantes; protegem contra degeneração macular Folhas verdes (luteína)Pequi e milho (zeaxantina) Indóis e Isotiocianatos Indutores de enzimas protetoras contra o câncer, principalmente de mama Couve flor, repolho, brócolis, couve de bruxelas, rabanete, mostarda Flavonóides Atividade anti-câncer, vasodilatadora, antiinflamatória e antioxidante Soja, frutas cítricas, tomate, pimentão, alcachofra, cereja, salsa, etc Fibras solúveis e insolúveis Reduz risco de câncer de cólon, melhora funcionamento intestinal. As solúveis podem ajudar no controle da glicemia e no tratamento da obesidade, pois dão maior saciedade. Cereais integrais como aveia, centeio, cevada, farelo de trigo, etc, leguminosas como soja, feijão, ervilha, etc, hortaliças com talos e frutas com casca Prebióticos - frutooligossacarídeos, inulina Ativam a microflora intestinal, favorecendo o bom funcionamento do intestino Extraídos de vegetais como raiz de chicória e batata yacon Sulfetos alílicos (alil sulfetos) Reduzem colesterol, pressão sanguínea, melhoram o sistema imunológico e reduzem risco de câncer gástrico Alho e cebola Lignanas Inibição de tumores hormônio-dependentes Linhaça, noz moscada Tanino Antioxidante, anti-séptico, vaso-constritor Maçã, sorgo, manjericão, manjerona, sálvia, uva, caju, soja, etc Estanóis e esteróis vegetais Reduzem risco de doenças cardiovasculares Extraídos de óleos vegetais como soja e de madeiras Probióticos - Bífidobacterias e Lactobacilos Favorecem as funções gastrointestinais, reduzindo o risco de constipação e câncer de cólon Leites fermentados, Iogurtes e outros produtos lácteos fermentados Há a discussão a respeito dos alimentos funcionais, pois nestes existe a presença de produtos naturais com atividade farmacológica. A eficácia e segurança desses alimentos deve ser assegurada por estudos científicos. Os alimentos funcionais não curam doenças, ao contrário dos remédios. Eles apresentam componentes ativos capazes de reduzir o risco de certas doenças. 28 1.6 Plantas Medicinais Vegetais que possuem atividade farmacológica são chamados de plantas medicinais. A definição da Organização Mundial de Saúde (OMS) para plantas medicinais diz que “são aquelas que têm uma história de uso tradicional como agente terapêutico”. A OMS reconhece que 80% da população dos países em desenvolvimento utilizam-se de práticas tradicionais nos cuidados básicos de saúde. Deste universo, 85% utilizam plantas ou preparados. Nesse sentido, a OMS recomenda a difusão mundial dos conhecimentos necessários ao uso racional das plantas medicinais e medicamentos fitoterápicos (www.portal.saude.gov.br). Em sua estratégia global sobre a medicina tradicional e a medicina complementar e alternativa para os anos de 2002 a 2005, a OMS reforçou o compromisso de estimular o desenvolvimento de políticas públicas com o objetivo de inseri-las no sistema oficial de saúde dos seus 191 estados-membros. E o Brasil, com sua diversidade genética vegetal estimada em 55 mil espécies catalogadas, possui ampla tradição de uso das plantas medicinais vinculado ao conhecimento popular e transmitido por gerações, além de tecnologia e, principalmente recursos humanos especializados para validar cientificamente este conhecimento (dados obtidos do site do Ministério da Saúde). Estimativas do governo brasileiro dizem que 60% da população não têm acesso a qualquer tipo de medicamento convencional, utilizando apenas recursos terapêuticos naturais. Pensando nesse fato, a Assembléia Legislativa do Estado de São Paulo criou o Programa Estadual de Fitoterápicos, Plantas Medicinais e Aromáticas, que tem como objetivo propor, elaborar e promover a implantação de políticas e diretrizes para a área de fitoterápicos, plantas medicinais e aromáticas no âmbito das instituições do Governo Estadual. Em outros estados, como Rio de Janeiro, Amapá e Mato Grosso já existe o Programa Estadual de Fitoterápicos regulamentados pelo poder executivo e em plena atividade. O Brasil apresenta a mais rica biodiversidade do planeta, com mais de 20% do número total de espécies (considerando fauna e flora), tornando-se o principal país dentre os chamados países megadiversos. Possui várias zonas climáticas que incluem o trópico úmido no norte, o semi-árido no nordeste e áreas temperadas no sul. As diferenças climáticas contribuem para as diferenças ecológicas formando zonas biogeográficas distintas, com cinco principais biomas: a maior floresta tropical úmida (Floresta Amazônica), com mais de 30 mil espécies vegetais, e a maior planície inundável (o Pantanal) do mundo, além do Cerrado 29 (savanas e bosques), da Caatinga (florestas semi-áridas) e da Mata Atlântica (floresta tropical pluvial). O Brasil possui uma costa marinha de 3,5 milhões km² com uma variedade de ecossistemas que incluem recifes de corais, dunas, manguezais, lagoas, estuários e pântanos. Com isso, os brasileiros poderiam se beneficiar mais desta situação. Porém, sabemos muito pouco sobre ela, uma vez que para seu conhecimento é importante a integração dos estudos de morfologia e composição química das espécies e, sobre esta última, temos ainda muito a desvendar (www.mme.gov.br; GIORGETTI et al, 2007). Além dessa rica biodiversidade, o Brasil conta com uma grande herança cultural, com a presença de várias etnias que conhecem bem o poder “curador” das plantas, como os índios e negros, sem contar, é claro, os europeus, colonizadores das Américas. Atualmente, grande parte da comercialização de plantas medicinais é feita em farmácias e lojas de produtos naturais, que em sua grande maioria não possuem certificado de qualidade, com pouca ou nenhuma comprovação de suas propriedades farmacológicas. Mais atenção deveria ser dada a este fato, pois a toxicidade de plantas medicinais é um problema sério de saúde pública, além de muitos cuidados relevantes, como identificação errônea da planta, possibilidades de adulteração, interações entre plantas medicinais e medicamentos alopáticos, efeitos de superdosagens, reações alérgicas ou tóxicas (VEIGA JUNIOR & PINTO, 2005). A diferença entre planta medicinal e fitoterápico está na elaboração da planta para uma formulação específica, o que caracteriza um fitoterápico (VEIGA JUNIOR & PINTO, 2005). Segundo a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) “fitoterápicos são medicamentos obtidos a partir de plantas medicinais. Eles são obtidos empregando-se exclusivamente derivados de droga vegetal (extrato, tintura, óleo, cera, exsudato, suco, e outros). Os fitoterápicos, assim como todos os medicamentos, devem oferecer garantia de qualidade, ter efeitos terapêuticos comprovados, composição padronizada e segurança de uso para a população. A eficácia e a segurança devem ser validadas através de levantamentos etnofarmacológicos, documentações tecnocientíficas em bibliografia e/ou publicações indexadas e/ou estudos farmacológicos e toxicológicos pré-clínicos e clínicos”. O estudo de plantas medicinais envolve o isolamento de substâncias ativas, e tem proporcionado inúmeras descobertas importantes para a humanidade e seu desenvolvimento conta com um número cada vez maior de profissionais, estabelecendo um caráter multi e interdisciplinar para as pesquisas que visam referendar seu uso. Técnicas de descoberta de fármacos tem sido aplicadas para a padronização da medicina natural, principalmente para a elucidação analítica dos compostos. (BALUNAS & KINGHORN, 2005; SILVA, 2000). 30 As plantas são fontes de substâncias para o desenvolvimento de medicamentos. O número de novas substâncias ativas, também conhecidas com Novas Entidades Químicas (NCEs), considerando as substâncias biológicas e as vacinas, no ano de 2005, chega a um valor de 54, dos quais, 24% são de origem natural ou derivados de produtos naturais e 37% são biológicas ou vacinas. O campo de produtos naturais está produzindo ou envolvido em aproximadamente 50% de todas as NCEs entre os anos de 2000-2006 (NEWMAN & CRAGG, 2007). Produtos naturais proporcionam um ponto de início para novas substâncias sintéticas, com diversas estruturas e com vários estereocentros que podem ser trocados sinteticamente. Fármacos derivados de plantas medicinais podem servir não somente como novas drogas por si só, mas também como modelo para novas drogas otimizadas pela química medicinal e sintética (BALUNAS & KINGHORN, 2005). 30% 24% 18% 28% Sintéticos Sintéticos modelados de produtos naturais Vacinas e biológicas Produtos naturais e derivados Figura 6: Diferentes fontes de agentes terapêuticos de 1981 a 2006 (NEWMAN & CRAGG, 2007). Segundo Newman & Cragg, (2007), as maiores áreas que têm sido investigadas pela indústria farmacêutica são as relacionadas com as doenças infecciosas, o câncer, antihipertensivos e antiinflamatórios. Na área antibacteriana, a grande maioria das NCEs são de origem naturais (10,2%), derivadas de produtos naturais (65,3%) e sintéticas porém modeladas a partir de produtos naturais (1%), ou seja, 76,5% do total de fármacos. Com as drogas anticancer, entre as não-biológicas, estão divididas entre produtos naturais (11,1%), derivados de produtos naturais (30,9%), sintéticas (22,2%) e modeladas a partir de produtos naturais (35,8%), ou seja, apenas 22,2% do total são totalmente sintéticas. O avanço tecnológico propiciou rapidamente o surgimento de novos medicamentos. Entre os anos de 2000 e 2003 houve uma constante introdução de novos produtos naturais e medicamentos derivados destes nos EUA, Europa e Japão. Um total de 15 novos fármacos foi 31 lançado, os quais incluem os antiinflamatórios arteether, a caspofungina (derivado de ecnocandina), a droga galantamina (inibidor de acetilcolinesterase), o antibacteriano daptomicina, entre outros (BUTLER, 2004). O processo de estudo de plantas medicinais começa, tipicamente, com um botânico, etnobotânico, etnofarmacologista ou ecólogo, que coleta e identifica a planta de interesse. A partir daí, o fitoquímico prepara extratos dos materiais da planta e começa o processo de isolamento e caracterização das substâncias ativas, caracterizando uma área de estudo multidisciplinar. A farmacognosia engloba todos esses campos dentro de uma distinta ciência interdisciplinar envolvendo um amplo estudo dos produtos naturais de várias fontes, incluindo plantas, bactérias, fungos e organismos marinhos. Farmacognosia pode ser definida como parte da farmacologia que trata das drogas ou substâncias medicinais antes de serem submetidas a qualquer manipulação (BALUNAS & KINGHORN, 2005; SIMÕES et al, 1999; WIKIPÉDIA). Visto a importância dos produtos naturais e suas ações farmacológicas para o desenvolvimento de novos fármacos, o estudo de plantas medicinais se torna totalmente necessário no âmbito nacional. Com isso, devem-se selecionar espécies tanto de origem selvagem quanto de origem cultivada. 32 1.7 Espécie em estudo 1.7.1 Myrtaceae A família Myrtaceae apresenta ampla distribuição, ocorrendo, preferencialmente, nas zonas tropicais e subtropicais, com número de espécies estimado entre 3.500 e 5.800, pertencentes à cerca de 100 gêneros. É considerada uma das mais importantes famílias da flora brasileira, com 23 gêneros e cerca de 820 espécies nativas ou subespontâneas. Os gêneros de maior riqueza são: Eugenia (108 spp.), Myrcia (57 spp.), Marlierea (27 spp.) e Gomidesia (25 spp.) (LIMA & GUEDES-BRUNI, 2004). As mirtáceas têm sido organizadas tradicionalmente em duas subfamílias, Leptospermoideae e Myrtoideae, esta última incluindo todas as mirtáceas americanas, exceto o gênero monotípico Tepualia. Atualmente, a nova classificação infra-família reconhece duas subfamílias, Myrtoideae e Psiloxyloideae, e 17 tribos. Todas as mirtáceas brasileiras estão incluídas na Tribo Myrteae (GRESSLER et al, 2006). A grande diversidade de espécies de Myrtaceae também se reflete nas restingas brasileiras sendo a família mais representativa nas restingas do Estado do Rio de Janeiro e Eugenia, o gênero com maior número de espécies. Na restinga de Grumari (Zona Oeste do Rio de Janeiro), Myrtaceae é representada por dois gêneros, na qual Eugenia é o mais representativo, com sete espécies (SILVA, A. L. G., 2007). As mirtáceas brasileiras geralmente não produzem madeiras valiosas, restringindo-se ao fornecimento de lenha, à utilização em pequenas peças ou objetos e outras formas de uso local. Por outro lado, há numerosas espécies frutíferas, algumas exploradas comercialmente (e.g. a goiabeira, Psidium guajava L., a jabuticabeira, Myrciaria cauliflora Berg, e a pitangueira, Eugenia uniflora L.). Essas espécies representam apenas uma pequena fração do grande potencial econômico da família, tendo em vista o grande número de frutos comestíveis produzidos por espécies não comerciais (GRESSLER et al, 2006). 33 1.7.2 Eugenia jambolana Lam. O gênero Eugenia é usado como antiinflamatório, analgésico, antipirético, antifúngico e no tratamento de úlceras pépticas, além de muitas espécies estarem relatadas como plantas ricas em polifenóis gálicos e derivados de ácidos elágicos, taninos e flavonóides glicosídeos. (MAHMOUD et al, 2001). Eugenia jambolana Lam. (syns. Syzygium cumini Skeels S. jambolanum DC., E. cumini Druce, E. djouat Perr., Myrtus cumini L., Calyptranthes jambolana Willd.) é de grande interesse pelas aplicações medicinais de seu fruto (figura 7, pg. 33). No Brasil é conhecida como jambolão, jamelão, jalão ou jambol (MORTON, 1987) e, por seu fruto ser semelhante ao formato, cor e tamanho da azeitona, também pode assim ser chamado. (www.bibvirt.futuro.usp.br) Figura 7: Frutos e folhas de E. jambolana (foto: http://www.motherherbs.com/pcat-gifs/products- small/syzygium-cumini1.jpg). É uma árvore originária da Índia, chegando a 10 m de altura, com copa ampla e muito ramificada (figura 8, pg. 34). Multiplica-se por sementes, desenvolve-se bem em qualquer tipo de solo, porém permeáveis e profundos. Prefere climas quentes e úmidos, principalmente de regiões litorâneas. Suas flores são de coloração creme ou brancas; com pétalas arredondadas caracteristicamente em forma de capuz, possuem bastante néctar, o qual atrai as abelhas para a produção de mel (figura 9, pg 34). Frutifica de janeiro a maio e seus frutos maduros são empregadas para fazer conservas, suco e geléias enquanto o suco das frutas verdes é usado para preparar um vinagre que é considerado um medicamento estomacal, carminativo e diurético. (BANERJEE; DASGUPTA; DE, 2005; www.bibvirt.futuro.usp.br/). 34 Figura 8: Exemplar adulto de E. jambolana. As folhas são utilizadas como alimento para gado e bicho da seda na Índia e a extração do óleo essencial é utilizado na fabricação de perfumes. A casca da árvore produz tintas marrons de várias tonalidades e bastante duráveis, elas são ricas em taninos e contém as enzimas esterase e galoil-carboxilase, as quais se presumem serem ativas na biossíntese de taninos (MORTON, 1987). Figura 9: Flores de E. jambolana (foto de A. Murray, Copyright 2000, Univ. Flórida). Folhas da E. jambolana são ricas em flavonóides glicosilados, como mostrado no trabalho de Mahmoud e colaboradores (2001) (figura 10, pg. 35), no qual foram isolados e identificados 17 polifenóis, incluindo flavonóides, taninos elágicos e ácidos fenólicos. 35 O O O R2 OR3 OH CH3 OH O OH R1 OH OH O O M1: R1 = Me, R2 = H, R3 = -COCH3 M2: R1 = H, R3 = -COCH3, R2 = M3: R1 = R2 = H, R3 = -COCH3 M4: R1 = Me, R2 = R3 = H M5: R1 = R2 = R3 = H OH OH OH O Figura 10: Exemplos de flavonóides isolados de E. jambolana (MAHMOUD et al, 2001). Os frutos contêm vitamina C, ácido gálico, taninos e antocianinas;; as frutas maduras. Extrato de semente que é tradicionalmente usado em diabete tem ação hipoglicêmica e propriedades antioxidantes em ratos diabéticos induzidos por aloxana, possivelmente devido à presença de taninos. (BANERJEE; DASGUPTA; DE, 2005) Em vários estudos das sementes e frutos desta espécie, com vários métodos para preparar o remédio e administrá-lo em animais normais e diabéticos, foram observados os seguintes efeitos: redução de glicemia e glicosuria, atividade antioxidante e restauração parcial de fígado alterado e glicogênio contido na estrutura muscular e nos níveis de glucoquinase, hexoquinase, glicose-6-fosfato e fosfofrutoquinase do fígado. (PEPATO et al, 2005). Administração do extrato etanólico das amêndoas das sementes E. jambolana na dosagem de 100 mg/kg.dia durante 30 dias resultou em uma diminuição nos níveis de glicose de sangue, uréia e açúcar da urina em ratos com diabete induzida por estreptozotocina. (RAVI et al, 2003) O extrato etanólico das cascas de E. jambolana foi analisado para atividade antiinflamatória em animais, não sendo evidenciado qualquer sinal de toxicidade até uma dose de 10,125 g/kg, p.o. em ratos, e apresentando uma ação antiinflamatória potente contra fases diferentes de inflamação, sem qualquer efeito colateral em mucosa gástrica (MURUGANANDAN et al, 2001). Visto toda a discussão da importância em trabalhar com plantas medicinais visando a descoberta de novos princípios bioativos, o presente trabalho tem como propósito o estudo 36 fitoquímico das folhas e frutos de E. jambolana Lam. a fim de isolar e determinar a estrutura química das substâncias presentes, através do fracionamento cromatográfico monitorado por testes para detecção de atividade potencialmente antioxidante. 37 2 MATERIAIS E MÉTODOS 2.1 Solventes e Reagentes Os solventes utilizados para CLAE foram de grau HPLC das marcas JT. Baker e Mallinckrodt. Para outros fins, foram utilizados solventes Merck e Synth de qualidade p.a., após prévio tratamento. Para experimentos de RMN, foram utilizados os solventes deuterados CDCl3 e DMSO-d6 produzidos por Merck, Aldrich ou Fluka. Para as revelações das placas cromatográficas foram utilizados reagentes das marcas Synth, Vetec e Sigma. Q 2.2 Concentração As concentrações das soluções foram efetuadas em rotaevaporador da marca Büchi (modelo R-114 e banho-maria B-480) sob pressão reduzida a temperatura de 40°C. 2.3 Cromatografia em camada delgada (CCD) Na análise por cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC), as placas foram empregadas dois tipos de placas cromatográficas: uma preparada no laboratório e outra adquirida. Na preparação das placas foi aplicado uma suspensão de sílica gel 60G (Merck) em água destilada, na proporção de 1:2 (p/v) sobre placas de vidro, obtendo-se 0,25 mm de espessura através da utilização de espalhador Quickfitt. Após a preparação das placas, estas foram deixadas em repouso por cerca de seis horas à temperatura ambiente e depois ativadas em estufa a 120ºC por cerca de 30 minutos. As placas adquiridas foram de silicagel 60 F254, expessura de camada de 0,2 mm (10x20 cm) da marca Riedel-de Häen AG. A visualização das manchas foi realizada através de métodos físicos ou químicos; como luz de ultravioleta 254-366 nm e reveladores específicos (p.e. solução de anisaldeído). 38 2.4 Cromatografia em coluna Foram utilizadas colunas de vidro de diferentes diâmetros internos e comprimentos, compatíveis com a massa das amostras. Como adsorvente foram utilizadas sílica derivatizada de fase reversa C-18 (25-40µm; Merck) e Amberlite XAD-4 (20-60 µm, poros de 40Å; Sigma). 2.5 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência Os cromatogramas foram obtidos por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) em aparelhos: • Varian Pro Star (Solvent Delivery Module 240 e Auto Sampler 410) acoplado ao detector Varian Pro Star Photodiode Array Ultra-violet (PDA-UV) 330 e registrados em microcomputador de 500 MHz com processador Pentium II, utilizando o software Varian Star Cromatography Workstation versão 5.52 – Modo analítico – gradiente exploratório. • Varian Pro Star (Solvent Delivery Module 230) acoplado ao detector Varian Pro Star UV/Vis Detector 310 e registrados em microcomputador de 350 MHz com processador Pentium II, utilizando o software Varian Star Cromatography Workstation versão 5.52 – Modo analítico – gradiente exploratório e isocrático. • Varian Pro Star (Solvent Delivery Systeme) acoplado ao detector Varian Pro Star UV/Vis Detector 320 e registrados em microcomputador de 350 MHz com processador Pentium II, utilizando o software Varian Star Cromatography Workstation versão 5.52 – Modo preparativo – isocrático. • Shimadzu (bomba Shimadzu LC-10 AD, auto injetor Shimadzu SIL 10 A) acoplado ao detector ultra-violeta em arranjo de diodos Shimadzu SPD MX AVP e registrados em microcomputador de 500 MHz com processador Pentium II, utilizando o software Shimadzu CLASS-LC10 versão 1.64A – Modo analítico- gradiente exploratório. Utilizou-se coluna analítica Phenomenex tipo LUNA (C-18 e Fenil-hexila, 250 x 4,6 mm, 5µm) e preparativas Phenomenex (C-18 e Fenil-hexila, 250 x 25 mm, 10µm). 39 2.6 Ressonância Magnética Nuclear Os espectros de Ressonância magnética nuclear de 1H e de 13C foram registrados em espectrômetro Bruker AC 200-F 4.7 T operando a 200 MHz para o núcleo de 1H e 50 MHz para o núcleo de 13C. Experimentos uni e bidimensionais foram realizados em espectrômetro Varian Inova 500 11.7 T operando a 500 MHz para o núcleo de 1H e em 125 MHz para o núcleo de 13C. Foi utilizado TMS como referência interna. 2.7 Espectrometria de massas Espectrômetro de massas de baixa resolução Fisons-Platform II, da Micromass; técnicas ionização por electrospray positivo (ESI +25V), utilizando como gás nebulisador o nitrogênio. Software MassLink. 2.8 Espectrofotometria (Leitor de microplacas) A leitura da absorbância para a avaliação da atividade seqüestradora de radical livre foi realizada no aparelho Synergy-HTS (λ 517nm). Os valores de IC50 foram calculados através da regressão linear das curvas, obtidas pelo programa Microcal TM Origin TM vrs 5,0 2.9 Cromatografia em contra corrente de alta velocidade (HSCCC) O instrumento utilizado foi um P.C. Inc., Potomac (Buffalo, NY, USA), equipado com uma coluna helicoidal multicamadas com duas bobinas de diâmetro interno de 1,68mm de politetrafluoroetileno (PTFE), de aproximadamente 80mL e 240mL conectados em série com uma capacidade total de 320mL. O valor de β variou de 0,5 na parte interna da coluna a 0,85 na parte externa da coluna e raio médio de revolução de 10cm (β=r/R, onde r é o raio da bobina e R o raio orbital de revolução). A velocidade foi ajustada com um controlador a 850rpm. O fluxo foi controladdo com a bomba de fluxo constante Waters 4000 (Milford, MA- 40 USA). A amostra foi injetada através do P.C. Inc. Injection Module (Buffalo, NY, USA) com um loop de 16mL. A coluna foi inicialmente preenchida com a fase estacionária, e posteriormente a fase móvel, no sentido cabeça a calda, com um fluxo de 1,0mLmin-1. Após as fases entrarem em equilíbrio hidrodinâmico na coluna, 16mL de solução (8mL de fase orgânica e 8mL de fase estacionária) contendo a amostra foi injetado, fluxo de 1,0mLmin-1. As frações foram recolhidas com um coletor automático (Pharmacia, Uppsala, Sweden), 5mL em cada tubo. Para a escolha do sistema de solvente a ser utilizado, testou-se inicialmente vários sistemas de solvente, tendo como base a literatura (ITO, 2005; CHEN et al, 2005; HOSTETTMANN; QUEIROZ; VIEIRA, 2003; SANTOS et al, 2005). Verificou-se a eficiência do sistema analisando separadamente as duas fases formadas por CCDC em proporções iguais, após desenvolvimento da placa comparam-se as proporções dos compostos em cada fase analisada. 2.10 Avaliação da atividade antioxidante por descoramento de solução de ββββ- caroteno A amostra a ser avaliada é aplicada e desenvolvida em placas cromatográficas, que são então nebulizadas com solução metanólica de β-caroteno na concentração de 0,02%. Após a secagem da placa, ela é posta sob iluminação natural até o descoramento do fundo. As substâncias com propriedade antioxidante são evidenciadas em manchas amarelas (PRATT & MILLER, 1984). 2.11 Metodologia de preparo de amostras para as análises ANÁLISES VIA CCDC: As amostras são aplicadas nas cromatoplacas na forma de soluções, em solventes bastante voláteis (AcOEt, Hex, MeOH), que possam ser facilmente eliminados após a aplicação e desenvolvidas em cubas cromatográficas saturadas com a fase móvel escolhida. ANÁLISES VIA CLAE: Para eliminação de interferentes apolares (material graxo) a amostra foi submetida a pré-tratamento por Extração em Fase Sólida (EFS) em cartucho 41 preenchido com sílica de Fase Reversa (C18), utilizando-se MeOH/H2O 95:5 (v/v) como eluente. Inicialmente o adsorvente foi ativado com MeOH puro (2-3 Vm) e posteriormente equilibrado com o eluente escolhido (2-3 Vm). A amostra foi solubilizada em 1mL de MeOH/H2O 95:5 (v/v), aplicado no cartucho e eluído com 2 mL da fase móvel. A solução recolhida foi filtrada em disco de membrana polimérica e armazenada em vial para análise por CLAE. A limpeza do cartucho foi feita com MeOH puro e depois, quando necessário, com DCM. Por se tratar de estudo químico qualitativo, não foram feitos cálculos de concentração das amostras analisadas. ANÁLISES VIA RMN: As amostras foram diluídas em 0,6 mL de solvente deuterado (CDCl3 ou DMSO-d6) e em seguida, as soluções foram filtradas em esfera de algodão e armazenadas em tubo de vidro próprio para RMN. ANÁLISES VIA HSCCC: A amostra foi diluída em 16mL da mistura do sistema de solventes. 2.12 Coleta e classificação do material vegetal Folhas da planta em estudo, E. jambolana, foram coletadas na Faculdade de Ciências e Letras – UNESP no dia 25 de março de 2005 e os frutos, no dia 17 de fevereiro de 2006, ambos na cidade de Araraquara, estado de São Paulo. A amostra foi identificada pela Drª. Maria Cláudia M. Young e a exsicata foi depositada no herbário do Instituto Botânico – SMA – São Paulo (nº) 2.13 Preparação do extrato bruto das folhas Separaram-se as folhas dos galhos, que foram secas em estufa a 40ºC e, posteriormente trituradas em moinho de faca elétrico. As folhas moídas (aproximadamente 800 g) foram submetidas à extração exaustiva com etanol por maceração, e, após concentração do solvente a pressão reduzida, forneceu o extrato bruto etanólico das folhas (79,95g), apresentando um rendimento de aproximadamente 8,8% (fluxograma 1, pg. 42). 42 2.14 Partição do extrato bruto das folhas Parte do extrato etanólico bruto (45,00g) foi submetida à partição líquido-líquido solubilizando em MeOH:H2O (7:3 v/v) e extraído inicialmente com hexano, solvente de baixa polaridade, após a separação das fazes, foi adicionado H2O à fase hidroalcoólica até que atingisse a proporção MeOH:H2O 1:1 (v/v) e então extraída com AcOEt, solvente de média polaridade, e por fim, à fase hidroalcoólica foi adicionado mais H2O, atingindo a proporção de 3:7 (v/v) de MeOH:H2O e extraído com n-BuOH, fornecendo as fases correspondentes que, após serem concentrados em rotaevaporador, forneceram os extratos hexânico (3,86g), acetato de etila (8,35g), n-butanólico (8,05g) e hidroalcoólico (23,92g) conforme mostra o fluxograma 2 (pg. 43). Os extratos foram monitorados através de CCDC e nebulizadas com solução metanólica de β-caroteno. Esta solução indica a propriedade antioxidante, pois após deixar as placas algumas horas sob luz natural ou após o descoramento do fundo. Para os extratos hexano e acetato de etila, a CCDC foi desenvolvida em AcOEt 100%, enquanto que para os extratos n-butanólico e hidroalcoólico, o sistema utilizado para o desenvolvimento foi AcOEt/MeOH 4:1 (v/v). Fluxograma 1: Preparação do extrato bruto das folhas de E. jambolana. Folhas secas e moídas (~800g) Resíduo Extrato Etanólico Extrato Bruto (79,95g) 1- Maceração com EtOH 2- Filtragem Concentração 43 Fluxograma 2: Partição do extrato bruto das folhas de E. jambolana. Extrato Bruto solubilizado n-Hexano 3 x 200mL Fase Hidroalcoólica Fase Hexânica Extrato Hexânico (EHF) (3,86g) Fase Hidroalcoólica Fase n-Butanólica Fase Hidroalcoólica 1- MeOH:H2O (1:1 v/v) 2- AcOEt 3 x 200mL Concentração Extrato n-Butanólico (EBF) (8,05g) Solubilização em MeOH:H2O (7:3 v/v) Concentração Fase Acetato Extrato Acetato (EAcF) (8,35g) Concentração 1- MeOH:H2O (3:7 v/v) 2- n-BuOH 3 x 200mL Concentração Extrato Hidroalcoólico (EAF) (23,92g) Extrato Bruto (45,00g) 44 2.15 Fracionamento do extrato n-Butanólico das folhas (EBF) O extrato n-butanólico (2,93g) foi fracionado através de uma coluna cromatográfica (19,5cm de altura e 3,0cm de diâmetro) de sílica derivatizada com unidades octadecil (fase reversa, C-18) em função da alta polaridade do extrato, com gradiente H2O:MeOH, em ordem crescente de polaridade, resultando em 21 frações, conforme mostra o fluxograma 3 (pg. 44) e a tabela 2 (pg. 45). A fração EBF-1-14 (54,8mg) apresentou forte atividade antioxidante, observada através do método do β-caroteno e características de flavonóides, como espectro de UV dos picos obtidos em análise por CLAE/DAD apresentando duas absorções características, uma em 252nm e outra em 360nm. Uma condição isocrática (H2O:MeCN 9:1) foi otimizada para EBF-1-14 em CLAE analítico (fluxo de 1,0mLmin-1, detecção a 254nm) seguida de fracionamento em CLAE semi-preparativo (fluxo de 10,0mLmin-1, detecção a 254nm, cromatograma da figura 12, página 60), utilizando uma coluna cromatográfica de sílica derivatizada de fase reversa C-18, resultando no isolamento da substância 1. Fluxograma 3: Fracionamento do extrato n-butanólico das folhas de E. jambolana. Extrato n-Butanólico (2,93g) EBF-1-1 a 13 EBF-1-14 (54,8mg) EBF-1-16 a 21 21 Frações CC – C18 (gradiente H2O:MeOH) 1 (2,0mg) CLAEprep. (C18, H2O:MeCN - 90:10) 45 Tabela 2: Fracionamento do extrato n-butanólico (EBF) das folhas de E. jambolana por CC em fase reversa (C- 18). Frações Eluente Massa (mg) EBF-1-1 H2O 53,2 EBF-1-2 H2O/MeOH (19:1) 92,0 EBF-1-3 H2O/MeOH (9:1) 97,2 EBF-1-4 H2O/MeOH (17:3) 163,0 EBF-1-5 H2O/MeOH (4:1) 20,4 EBF-1-6 H2O/MeOH (4:1) 24,0 EBF-1-7 H2O/MeOH (4:1) 37,6 EBF-1-8 H2O/MeOH (7:3) 95,7 EBF-1-9 H2O/MeOH (3:2) 63,1 EBF-1-10 H2O/MeOH (3:2) 114,3 EBF-1-11 H2O/MeOH (3:2) 112,1 EBF-1-12 H2O/MeOH (1:1) 37,7 EBF-1-13 H2O/MeOH (1:1) 61,9 EBF-1-14 H2O/MeOH (1:1) 54,8 EBF-1-15 H2O/MeOH (2:3) 75,1 EBF-1-16 H2O/MeOH (1:4) 21,7 EBF-1-17 MeOH 11,1 EBF-1-18 MeOH/Acetona (1:1) 14,2 EBF-1-19 Acetona 9,2 EBF-1-20 AcOEt 29,3 EBF-1-21 AcOEt 7,8 46 2.16 Fracionamento do extrato Hidroalcoólico das folhas (EAF) O extrato hidroalcoólico (9,57g) foi fracionado através de uma coluna cromatográfica aberta (19,5cm de altura e 3,0cm de diâmetro) com sílica derivatizada para fase reversa (C- 18), eluída com gradiente H2O/MeOH, em ordem crescente de polaridade, obtendo-se 15 frações (fluxograma 4, pg. 47, tabela 3, pg. 47), esse método foi escolhido em função da alta polaridade do extrato. A fração EAF-1-6 foi escolhida para fracionamento por apresentar forte atividade antioxidante, observada no teste com solução metanólica de β-caroteno e características de flavonóides, parte da fração (509,1 mg) foi submetida à coluna cromatográfica (13 cm de altura e 3,0cm de diâmetro) de fase reversa (C-18) com gradiente H2O:MeOH, de 5 a 100% de MeOH, resultando em 11 frações (fluxograma 4, pg. 47, tabela 4, pg. 48). Uma condição isocrática (H2O:MeCN 17:3) foi otimizada para a fração EAF-167 (209,3mg) em CLAE analítico (fluxo de 1,0mLmin-1, detecção a 254nm) seguida de fracionamento em CLAE semi-preparativo, utilizando uma coluna cromatográfica de fase reversa C-18 (fluxo de 10,0mLmin-1, detecção a 254nm, cromatograma figura 16, página 63), resultando na substância 2. 47 Fluxograma 4: Fracionamento do extrato hidroalcoólico das folhas de E. jambolana. Tabela 3: Fracionamento do extrato hidroalcoólico (EAF) das folhas de E. jambolana por CC em fase reversa (C-18). Frações Eluente Massa (mg) EAF-1-1 H2O/MeOH (19:1) 600,2 EAF-1-2 H2O/MeOH (9:1) 526,8 EAF-1-3 H2O/MeOH (17:3) 267,4 EAF-1-4 H2O/MeOH (4:1) 397,6 EAF-1-5 H2O/MeOH (7:3) 257 EAF-1-6 H2O/MeOH (1:1) 718,9 EAF-1-7 H2O/MeOH (2:3) 591,6 EAF-1-8 H2O/MeOH (1:4) 359,1 EAF-1-9 MeOH 728,1 EAF-1-10 MeOH 65,9 EAF-1-11 AcOEt 248,7 Extrato Hidroalcoólico (9,57 g) EAF-1-1 a 5 EAF-1-6 (509,1mg) EAF-1-7 a 15 15 Frações CC – C18 (gradiente H2O:MeOH) 11 Frações CLAEprep. (C18, H2O:MeCN - 85:15) CC – C18 (gradiente H2O:MeOH) EAF-161 a 166 EAF-167 (209,3mg) EAF-168 a 1611 2 (4,1mg) 48 Tabela 4: Fracionamento de EAF-1-6 por CC em fase reversa (C-18). Frações Eluente Massa (mg) EAF-161 H2O/MeOH (19:1) 13,6 EAF-162 H2O/MeOH (9:1) 26,3 EAF-163 H2O/MeOH (17:3) 21,1 EAF-164 H2O/MeOH (4:1) 13,3 EAF-165 H2O/MeOH (7:3) 13,6 EAF-166 H2O/MeOH (11:9) 29,2 EAF-167 H2O/MeOH (11:9) 224,9 EAF-168 H2O/MeOH (11:9) 20,3 EAF-169 H2O/MeOH (2:3) 36,1 EAF-1610 H2O/MeOH (1:4) 7,3 EAF-1611 MeOH 100,3 49 2.17 Fracionamento do extrato Acetato das folhas (EAcF). O extrato acetato, composto por uma mistura de substâncias de polaridades baixas e altas, evidenciado em análise por CCDC, foi submetido a uma partição líquido-líquido, para separar as substâncias contidas por diferença de polaridade e afinidade em função dos solventes utilizados. Para essa partição foram utilizados hexano, CHCl3, MeOH/H2O, que após a evaporação do solvente, resultaram nas frações AcOEt-H (fase hexânica, 0,698g), AcOEt-C (fase clorofórmica, 1,999g) e AcOEt-M (fase hidroalcoólica, 2,070g); observou a formação de um precipitado entre as fases AcOEt-C e AcOEt-M, que foi recolhido separadamente, atribuído o código AcOEt-ppt (0,543g) (fluxograma 5, pg. 50). Essas frações foram analisadas por CCDC e, AcOEt-M mostrou-se mais interessante para iniciar o trabalho de fracionamento, por provavelmente ser a fração enriquecida em flavonóides. Para investigar a fração AcOEt-M foi utilizado o HSCCC, que proporciona baixo consumo de solvente e perda de amostra praticamente nula, além de ampliar o conhecimento em técnicas de separação. 50 Fluxograma 5: Partição do extrato acetato das folhas (EAcF) de E. jambolana. A escolha do sistema de solvente (descrito no item 2.9, pg. 39) é fundamental para que a separação dos constituintes seja eficiente; foi escolhido um sistema ternário, a fim de diminuir a diferença de polaridade entre as fases e aumentar a solubilidade da amostra em ambas, de maneira aproximadamente proporcional, ou seja, obtendo um coeficiente de partição igual ou aproximadamente igual a um; dessa maneira pode-se garantir a eficiência e capacidade de separar os componentes da fração analisada segundo diferenças de polaridade. O sistema que resultou numa melhor resolução foi AcOEt:n-PrOH:H2O, na proporção 6:1:7 (v/v/v). Foi preparado 840mL do sistema, deixado de um dia para outro num funil de separação a temperatura ambiente para que atingisse um equilíbrio e as fases fossem totalmente separadas. No equipamento, inicialmente foi introduzida a fase estacionária e posteriormente a fase móvel, já com a coluna em movimento para evitar perdas da fase EAcF (7,08g) EAcF solubilizado n-Hexano 3 x 100mL Fase Aquosa AcOEt-H (0,6980g) 1- MeOH:H2O (1:1) 2- CHCl3 3 x 100mL PRECIPITADO Concentração AcOEt-ppt (0,5430g) Solubilização em MeOH:H2O (7:3 v/v) AcOEt-C (1,999g) FASE ORGÂNICA Concentração FASE AQUOSA Concentração AcOEt-M (2,0702g) FASE ORGÂNICA Concentração 17 Frações (CC-1 até CC-17) HSCCC (AcOEt:n-PrOH:H2O 6:1:7 v/v/v) 2 (CC-7) (23,3mg) 51 estacionária e garantir que não fosse formada bolhas no interior da coluna; após o equilíbrio estabelecido, na coluna havia 85% de fase estacionária; em seguida foram injetados 418,0mg de amostra. Foram obtidas 157 frações que após análise por CCDC foram reunidas em 17 frações (tabela 5, pg. 51). Algumas frações foram analisadas por CLAE-DAD e RMN de 1H, resultando em frações semi-puras, contendo poucos picos, observados na análise por CLAE (cromatogramas das figuras 20, 21, 22 e 23, pg. 67, 67, 68 e 69 respectivamente) e no re- isolamento da substância 2 (fração CC-7, 23,3mg), com um rendimento bem maior quando comparado com o obtido no isolamento através de CLAEprep., isso por que, o HSCCC não usa suporte sólido, minimizando a perda de massa. Tabela 5: Fracionamento de AcOEt-M por HSCCC. Frações Massa (mg) CC-1 6,2 CC-2 40,8 CC-3 47,9 CC-4 30,8 CC-5 25,6 CC-6 5,8 CC-7 23,3 CC-8 20,6 CC-9 15,4 CC-10 25,6 CC-11 6,0 CC-12 4,6 CC-13 10,2 CC-14 25,2 CC-15 67,1 CC-16 53,2 CC-17 0,8 52 2.18 Preparação do extrato bruto dos frutos Foram utilizados aproximadamente 6,5Kg de frutos maduros, que tiveram as sementes separadas e armazenadas. A polpa e casca rendeu 5,2Kg e é parte de interesse por provavelmente conter o grupo de substâncias conhecido como antocianinas. Num liquidificador, as cascas e polpas foram trituradas com 200 mL de solução MeOH (1% HCl) por três minutos, a escolha do ácido a ser utilizado foi feita comparando dados da literatura (LIU at al, 2004; SEERAM at al, 2002; LEE 2002; CHANDRA; NAIR; IEZZONI, 1992; WANG et al, 1997; EINBOND et al, 2004; LONGO & VASAPOLLO, 2005). Para separar a parte solúvel das partículas insolúveis, a mistura foi centrifugada a 10000 rpm por 10min a uma temperatura de 4°C, resultando em 5L de sobrenadante, já que a fruta contém muita água. O extrato bruto dos frutos (462,66g) foi obtido após a concentração do sobrenadante (5L) à pressão reduzida. Na preparação do extrato bruto dos frutos foi muito importante conseguir que a integridade das antocianinas fosse mantida, por isso a adição de HCl (fluxograma 6, pg. 52). O interesse em obter esta classe de substâncias surgiu por apresentarem alto poder de combate a radicais livres e atividade antioxidante. Fluxograma 6: Preparação do extrato bruto dos frutos de E. jambolana. Frutos (6,5kg) Caroço (1,3kg) Polpa + Casca (5,2kg) 1- MeOH (1% HCl) 2- Liquidificador (3 min) 3- Centrifugar (10 min- 4°C, 10000 rpm) 4- Concentrar (sob pressão, 30°C) Extrato Bruto Frutos (FrX) (462,66g) 53 2.19 Fracionamento do extrato bruto dos frutos Os frutos do jambolão possuem muito açúcar, então, foi necessário utilizar um método para enriquecer as frações em antocianinas, excluindo os açúcares livres, para minimizar as interferências nas análises cromatográficas. O aumento de polaridade da amostra decorrente da presença de açúcares, aumenta também sua solubilidade em água, e dificulta sua secagem, o que compromete etapas seqüenciais de fracionamento. Na primeira etapa de fracionamento do extrato bruto dos frutos, foi utilizada uma coluna cromatográfica com a resina Amberlite XAD-4 (32cm de altura e 7cm de diâmetro) para remoção dos açúcares livres (fluxograma 7, pg. 53 e tabela 6, pg. 54); a série eluotrópica (SAKAKIBARA et al, 1991) foi: • H2O • H2O/MeOH 1:1 • MeOH • Hexano • Acetona • Acetato de Etila • EtOH Os açúcares não são adsorvidos e foram eluídos nas primeiras frações (H2O). Posteriormente as outras substâncias foram eluídas, visto que este polímero (XAD-4) adsorve minimamente substâncias polifenólicas. 54 Fluxograma 7: Partição do extrato bruto dos frutos de E. jambolana. a. Eluição com H2O, H2O/MeOH 1:1, MeOH, Hexano, Acetona, Acetato de Etila, EtOH b. Gradiente H2O � MeOH Tabela 6: Fracionamento do extrato bruto dos frutos (FrX) de E. jambolana por CC em XAD-4. Frações Eluente Massa (mg) FrX-1 H2O 3210,0 FrX-2 H2O 3450,0 FrX-3 H2O 62480,0 FrX-4 H2O/MeOH (1:1) 2573,8 FrX-5 MeOH 386,0 FrX-6 Hexano 372,8 FrX-7 Acetona 272,0 FrX-8 AcOEt 59,5 FrX-9 EtOH 22,1 CC (XAD-4)a 1- FrX-2 FrX-3 FrX-4 FrX-5 FrX-6 FrX-7 FrX-8 FrX-9 FrX-1 Extrato Bruto Frutos (FrX) (75,42g) FrX-41 FrX-42 FrX-43 FrX-44 FrX-45 FrX-46 FrX-47 FrX-48 CC (C-18)b 1- 55 2.20 Fracionamento de FrX-4 Para o fracionamento da FrX-4 (1,95g) foi utilizada uma CC de fase estacionária com sílica derivatizada C-18 (15,5cm de altura e 3cm de diâmetro), eluída com gradiente H2O (4%H3PO4)/MeOH, iniciando com 100% de H2O e finalizando com 100% de MeOH. Foram obtidas oito frações (FrX-41 até FrX-48). As frações de FrX-43 à FrX-47 foram submetidas à partição com XAD-4 (12cm de altura e 7cm de diâmetro), utilizando como série eluotrópica H2O, MeOH, EtOH e acetona, resultando assim em quatro frações cada (FrX-431 até FrX- 434; FrX-441 à FrX-442 e assim por diante). Tabela 7: Fracionamento das frações FrX-43, FrX-44, FrX-45, FrX-46, FrX-47 por CC em XAD-4. Frações Eluente Massa (mg) FrX-431 H2O --* FrX-432 MeOH 213,2 FrX-433 EtOH 13,5 FrX-434 Acetona 10,2 FrX-441 H2O --* FrX-442 MeOH 247,6 FrX-443 EtOH 2,9 FrX-444 Acetona 10,6 FrX-451 H2O --* FrX-452 MeOH 197,9 FrX-453 EtOH 10,0 FrX-454 Acetona 12,6 FrX-461 H2O --* FrX-462 MeOH 195,2 FrX-463 EtOH 10,8 FrX-464 Acetona 11,3 FrX-471 H2O --* FrX-472 MeOH 93,6 FrX-473 EtOH 10,1 FrX-474 Acetona 4,9 * Secagem incompleta. 56 2.21 Fracionamento de FrX-442 Para o fracionamento da FrX-442 (99,7mg) foi utilizada uma coluna cromatográfica de fase reversa C-18 (10cm de altura e 2cm de diâmetro), eluída com gradiente H2O (4% H3PO4)/MeOH, iniciando com 95% de H2O e finalizando com 100% de MeOH. Uma nova tentativa de fracionamento foi feita para esta fração, utilizou-se CLAE analítico, e a condição otimizada foi 0 a 15 min 35% B, 16 a 18 min 35-40% B, 19 a 35 min 40% B, 35 a 40 min 40-100% B, em coluna de fase reversa (fenil-hexila), onde A é água (0,5% H3PO4) e B é MeOH. Reduziu-se a concentração do ácido fosfórico da fase móvel para evitar possíveis danos ao aparelho e coluna, o que foi possível visto que o resultado obtido foi o mesmo para as duas concentrações. 57 2.22 Avaliação da atividade seqüestradora de radical livre por redução do radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazila (DPPH) em teste espectrofotométrico 200 µL de uma solução 0,004% de DPPH foi misturada com soluções das frações FrX- 4, FrX-442, FrX-452 e FrX-5 em diversas concentrações, aguardou-se 30 minutos ao abrigo da luz e então a leitura foi feita no leitor de microplacas Synergy-HTS (λ 517nm). Como solução padrão foi utilizada rutina, nas mesmas concentrações. A porcentagem de seqüestro do radical livre foi obtida utilizando a seguinte equação: 100*% controle amostracontrole A AA ∆ ∆−∆ = Os valores de IC50 foram calculados através da regressão linear das curvas, obtidas pelo programa Microcal TM Origin TM vrs 5,0. 58 2.23 Análise da fração FrX-4 por espectrometria de massas A técnica de análise por espectrometria de massas foi utilizada como ferramenta adicional para obter valiosas informações sobre as estruturas das antocianinas presentes nos frutos e suprir assim a obstância no processo de isolamento através do CLAE preparativo. A amostra foi injetada em CLAE analítico em gradiente H2O (0,5% H3PO4)/MeOH, de 5% a 100% de MeOH. Os picos foram coletados e analisados por espectrômetro de massas para a identificação dos constituintes químicos presentes na fração analisada. 59 3 RESULTADOS E DISCUSSÕES 3.1 Partição do extrato bruto das folhas de E. jambolana A partição do extrato bruto das folhas com solventes de diferentes polaridades resultou na separação de classes de substâncias de acordo com sua afinidade com o solvente extrator; assim, substâncias de baixa e média polaridade foram solúveis nos extratos hexânico e acetato de etila, enquanto nos extratos n-butanólico e hidroalcoólico estão as substâncias de maior polaridade. As placas de CCDCs dos extratos foram nebulizadas com solução de β-caroteno para a escolha do ponto de partida do trabalho, ou seja, o extrato a ser fracionado inicialmente, todos, exceto o hexânico (EHF), apresentaram resultado positivo para o teste antioxidante, mas pelo fato dos extratos n-butanólico (EBF) e hidroalcoólico (EAF) estarem livres de substâncias de baixa polaridade, como clorofila e ácidos graxos, esses foram fracionados primeiro. As CCDCs dos mesmos também foram reveladas com solução de Dragendorff, indicando a ausência de substâncias nitrogenadas, pois não foi observado manchas de coloração alaranjadas e, também, com solução ácida de anisaldeído, revelador universal. O EBF foi fracionado através de uma coluna cromatográfica de fase reversa (C-18) para que as substâncias nele contidas fossem divididas em grupos de polaridade. Com a análise das 21 frações originárias dessa coluna em CCDC, reveladas com anisaldeído e β- caroteno (figura 11, pg. 60), foi possível selecionar algumas para a análise em CLAE-DAD. Após essa nova análise, pôde-se escolher a fração EBF-1-14 para novo fracionamento, já que ela apresentou forte atividade antioxidante e características de flavonóides, como espectro de UV dos picos apresentando duas absorções, uma em 252nm e outra em 360nm. De EBF-1-14 obtiveram-se nove sub-frações, originárias do fracionamento feito através de CLAE preparativo, utilizando coluna C-18, dais quais apenas uma (EBF-1-14-E, 2,0mg, figura 14, pg. 61) aparentou estar pura e com massa suficiente para a obtenção de espectros RMN. 60 Figura 11: CCDC das frações EBF-1-1 à EBF-1-21, eluídas no sistema AcOEt:Ácido Acético:MeOH:H2O (10:1:1:3) e reveladas com A) anisaldeído e B) β-caroteno. Figura 12: Cromatograma da fração EBF-1-14, C-18, H2O:MeCN (9:1), 254nm. A fração EBF-1-14-E foi submetida à análise por RMN permitindo sua identificação (substância 1). O espectro de RMN de 1H mostrou perfil característico de flavonóides glicosilados, com sinais distribuídos ao longo da região aromática e um sinal em 12,7 atribuído a uma hidroxila quelada a uma carbonila, além de sinais em δ 3-4, indicativos de presença de açúcar; um singleto em 5,20 δH e um dubleto em 0,85 δH (6 Hz 3H) associados a uma unidade de ramnose como substituinte de aglicona. No espectro de RMN1H foram observados sinais em 6,20 δ (d, 2,0 Hz, 1H) e 6,37 (d, 2,0 Hz, 1H) acoplando entre si, indicando um sistema meta substituído, atribuídos a H6 e H8 respectivamente, além de sinais em 6,89 δ (s, 1H) e 7,26 (s, 2H), atribuídos a H3 e H2’/H6’. O espectro de RMN de 13C mostrou sinais em δC 16,8 e δ 70,5, confirmando uma unidade de ramnose como substituinte de aglicona. A B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 A B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Substância 1 61 O O O O Figura 13: Estruturas parciais para a substância 1, atribuídas respectivamente aos anéis A, B e C de uma flavona. A posição da ramnose foi definida de acordo com o deslocamento químico de H6, H8 e H2’/H6’ por comparação com dados da tricetina (aglicona não glicosilada), que junto com dados da literatura (HARBORNE, 1994) permitiu atribuir para a substância em questão a estrutura do flavonóide 1 (figura 14). Os sinais em δ 113,0, δ 107,0, δ 145,4 e δ 136,0 foram atribuídos aos carbonos do anel B, caracterizando um anel 3’,4’,5’-trioxigenado. A atribuição de todos os hidrogênios aos respectivos átomos de carbono, foi realizada após análise cuidadosa dos mapas de contorno no experimento gHMQC. As correlações observadas nos experimentos de gHMBC e COSY (tabela 8) foram fundamentais para a elucidação da estrutura da substância 1 e permitiu sua identificação como 5,7,3’,5’-tetraidroxi-4’-ramnosil-flavona. Os espectros podem ser observados no Anexo A (pg. 85). O OOH O OH OH OH O CH3 OH OH OH 1 2 34 5 6 7 8 9 10 1' 2' 3' 4' 5' 6' 1'' 2'' 3'' 4'' 5'' 6'' Figura 14: Estrutura da substância 1. 62 Tabela 8: Dados de RMN 1H e RMN-2D (500 MHz, DMSO-d6) da substância 1. H δδδδ (ppm), multiplic., J (Hz) δδδδC gHMBC (δδδδ) gCOSY (δδδδ) 1 --- --- --- --- 2 --- 157,4 --- --- 3 7,26 (s, 1H) 107,0 113,4 --- 4 --- --- --- --- 5 --- --- --- 6 6,20 (d, 2,0Hz, 1H) 98,0 104,2 / 92,9 6,36 7 --- --- --- --- 8 6,36 (d, 2,0Hz, 1H 92,9 98,0 6,20 9 --- --- --- --- 10 --- 104,2 --- --- 1’ --- 113,0 --- --- 2’ e 6’ 6,89 (s, 2H) 107,3 107,8 / 157,4/ 145,4 / 136,2 --- 3’ e 5’ --- 145,4 --- --- 4’ --- 136,0 --- --- 1’’ 5,20 (s, 1H) 101,4 69,8 --- 2’’ 3,98 (m, 1H) 69,5 --- 3,55 3’’ 3,55 69,8 --- 3,17 / 3,98 4’’ 3,17 (s, 1H) 70,5 --- 3,55 5’’ 3,40 70,0 --- 0,85 6’’ 0,85 (d, 6,0Hz, 3H) 16,8 70,5 3,40 Figura 15: Algumas correlações observadas em experimento gHMBC e COSY da substância 1. 63 O EAF apresentava características parecidas com o EBF, por isso seu fracionamento foi similar, iniciando com seu fracionamento em coluna C-18. A análise da fração EAF-1-6 indicou a presença de flavonóides, pois apresentou espectro de RMN 1H com sinais na região aromática, e com atividade antioxidante, observada através do teste com solução de β- caroteno. EAF-1-6 foi fracionada através de coluna cromatográfica com C-18, obtendo-se 11 sub-frações, que também foram analisadas. Destas, selecionou-se a sub-fração EAF-167, em função da atividade antioxidante observada em teste com solução de β-caroteno, para fracionamento em CLAE preparativo, resultando em apenas uma sub-fração (EAF-167-R, 4,1mg, figura 18, pg. 65) com alto grau de pureza que foi submetida à análise por espectros de RMN para a elucidação estrutural (substância 2). Figura 16: Cromatograma da fração EAF-167, H2O:ACN (85:15), 254nm. O espectro de RMN de 1H apresentou semelhanças com o da substância 1, indicando tratar-se de um flavonóide glicosilado, com algumas diferenças nos sinais da região aromática, como a ausência do sinal em δ 7,26, atribuído ao H3 do anel C, indicando haver um substituinte nesta posição. Mostrou também sinais em δ 3-4, indicativos de presença de açúcar, caracterizado como a ramnose, por mostrar um dubleto em 5,19 δH (2Hz, 1H, H1’’) e um dubleto em 0,84 δH (6,5Hz, 3H, H6’’) (HARBORNE, 1994). Substância 2 64 Ainda no espectro de RMN1H foram observados sinais em 6,19 δ (d, 2,0 Hz, 1H) e 6,35 δ (d, 2,0 Hz, 1H) acoplando entre si, indicando um sistema meta substituído para o anel A, além de sinal em 6,87 δ (s, 2H), atribuído aos hidrogênios do anel B 3,4,5-trioxigenado. O O Figura 17: Estruturas parciais para a substância 2, atribuídas respectivamente aos anéis A, B e C de um flavonol. A atribuição de todos os hidrogênios aos respectivos átomos de carbono, foi realizada após análise cuidadosa dos mapas de contorno no experimento gHMQC de 2. O espectro de RMN de 13C mostrou sinais para C aromáticos (δ 92-150) que foram atribuídos a uma unidade de flavonol, e sinais em δ 17,4 e na região de δ 69-72, sugerindo uma unidade de ramnose como substituinte da aglicona. Os sinais em δ 119,6, δ 107,9, δ 145,7 e δ 136,4 foram atribuídos aos carbonos do anel B, 1’, 2’/6’, 3’/5’ e 4’ respectivamente, caracterizando um anel 3’,4’,5’-triidroxilado. A presença do sinal em 5,2 δH (101,9 δC) correlacionando a longa distância (3 J) pelo gHMBC com o carbono em δ 134,3 atribuído ao C-3, indica que a substância 2 é um flavonol na qual a ramnose encontra-se na posição 3. Outras correlações observadas no gHMBC e COSY estão relatadas na tabela 9 e figura 19. A análise dos dados obtidos e comparação com a literatura (MAHMOUD et al, 2001) permitiram atribuir à substância em questão a estrutura da miricetrina. 65 O O O O OH OH OH OH OH OH OH OH CH3 Figura 18: Estrutura da substância 2. Tabela 9: Dados de RMN 1H e RMN-2D (500 MHz, DMSO-d6) da substância 2. H δδδδ (ppm), multiplic., J (Hz) δδδδ C gHMBC (δδδδ) gCOSY (δδδδ) 1 --- --- --- --- 2 --- 157,4 --- --- 3 --- 134,3 --- --- 4 --- 177,7 --- --- 5 --- 161,3 --- --- 6 6,19 (d, 2,0Hz, 1H) 98,6 103,9 / 93,5 6,35 7 --- 164,1 --- --- 8 6,35 (d, 2,0Hz, 1H) 93,5 164,1 / 98,6 / 156,4 / 103,9 6,19 9 --- 156,4 --- --- 10 --- 103,9 --- --- 1’ --- 119,6 --- --- 2’ e 6’ 6,87 (s, 2H) 107,9 157,4 / 145,7 / 136,4 --- 3’ e 5’ --- 145,7 --- --- 4’ --- 136,4 --- --- 1’’ 5,19 (d, 1H) 101,9 70,5 / 134,3 --- 2’’ 3,97 (dd, 1,5;3,5Hz; 1H) 70,0 --- 3,54 3’’ 3,54 (dd, 3,0;9,0Hz, 1H) 70,3 --- 3,97 / 3,15 4’’ 3,15 (1H) 71,3 70,5 3,54 5’’ 3,33 (1H) 70,5 --- 0,84 6’’ 0,85 (d, 6,5Hz, 3H) 17,4 70,5 3,33 66 Figura 19: Algumas correlações observadas em experimento gHMBC e COSY da substância 2. Para o fracionamento de AcOEt-M utilizou-se a cromatorafia em contra corrente de alta velocidade em escala preparativa, já que muitas classes de substâncias podem ser separadas através desta técnica. O mecanismo de separação do HSCCC é baseado principalmente na diferença de solubilidade dos componentes entre as duas fases, então as substâncias separam-se de acordo com seus coeficientes de partição. Além das vantagens já citadas na parte de materiais e métodos, podemos ainda ressaltar que é uma técnica onde a fração ou o próprio extrato pode ser injetado diretamente, podendo assim, utilizar grande quantidade de amostra e assim, poupar etapas de purificação. O sistema de solvente escolhido foi a mistura AcOEt:n-PrOH:H2O (6:1:7, v/v/v), que distribuiu as substâncias presentes em AcOEt-M de maneira proporcional nas duas fases, ou seja, resultou num coeficiente de partição aproximadamente igual a um. A fase orgânica (superior) foi escolhida como sendo a fase móvel, e, portanto, a fase aquosa (inferior) para ser a fase estacionária. O processo resultou na coleta de 17 frações (CC-1 à CC-17). A análise do cromatograma de CC-7 mostra a presença de um flavonóide majoritário, identificado como o flavonol miricetrina (substância 2), através de RMN 1H em comparação com o já isolado anteriormente, e dois minoritários (cromatograma na figura 20, pg.67). 67 Figura 20: Cromatograma de CC-7, gradiente H2O/MeOH (iniciando com 5%MeOH), C-18, 350nm. Os cromatogramas de CC-2 e CC-3, figura 21, com perfis bem parecidos, mostraram a presença de dois flavonóides majoritários. O espectro de RMN de 1H da fração CC-3 (figura 49, pg. 98) mostrou se tratar de uma mistura de flavonol e flavona, já que foi observado um sinal em δH 7,42 característico do hidrogênio na posição 3 de uma flavona. Pelo espectro de ultravioleta pôde-se distinguir o flavonol e a flavona, já que os flavonóis possuem valores para a banda I entre 352-385, enquanto que as flavonas possuem valores entre 304-350 (ANDERSEN & MARKHAM, 2006), provavelmente devido à presença de um substituinte na posição 3 (anel C). O flavonol foi atribuído primeiro pico, pois possui λmáx em 354,58 (banda I), e a flavona ao segundo pico, pois seu valore de λmáx para a banda I é de 334,34. Nos cromatogramas pôde-se observar que CC-3 está enriquecida com o flavonol e CC-2 contém aproximadamente a mesma quantidade das duas substâncias. Figura 21: Cromatogramas de CC-2 e CC-3, gradiente H2O/MeOH (iniciando com 5%MeOH), C-18, 254nm. CC-2 CC-3 68 A análise dos cromatogramas das frações CC-10, CC-13 e CC-14 (figura 22) indica a presença de vários picos com grupos cromóforos semelhantes, com bandas no espectro de UV entre 215 e 240nm. CC-10 CC-13 CC-14 CC-10 CC-13 CC-14 Figura 22: Cromatogramas de CC-10, CC-13 e CC-14, gradiente H2O/MeOH (iniciando com 5%MeOH), C-18, 290nm. A comparação das frações obtidas através da técnica de cromatografia em contra corrente com a matriz de partida (figura 23, pg. 69), mostra que se trata de uma ótima ferramenta para um fracionamento inicial, visto que as sub-frações obtidas contêm poucos constituintes, facilitando sua separação, podendo até resultar em alguma substância com alto grau de pureza, como foi o caso de CC-7, contendo o flavonol miricetrina. 69 AcOEt-M CC-3 CC-5 CC-7 CC-10 CC-13 CC-14 AcOEt-M CC-3 CC-5 CC-7 CC-10 CC-13 CC-14 Figura 23: Cromatogramas de algumas frações originárias do fracionamento com HSCCC e da fração AcOEt- M, gradiente H2O/MeOH (iniciando com 5%MeOH), C-18, 290nm. 70 3.2 Fracionamento do extrato bruto dos frutos de E. jambolana. Após vários estudos para a preparação do extrato bruto dos frutos enriquecidos em antocianinas, a condição escolhida foi a solução de MeOH acidificada (1%HCl), que se mostrou muito eficiente, pois permitiu a extração e manteve a integridade das antocianinas, como pode ser visto nos cromatogramas das frações FrX-4 e FrX-5 (figuras 24 e 25). O fracionamento do extrato bruto dos frutos em CC com XAD (tabela 2), resultou em nove frações. Na eluição com água, foram obtidas três frações, e uma fração para cada eluente adicional. Espectros de RMN 1H indicaram que, apesar da forte coloração vermelha (indicativo de antocianinas), as frações FrX-1, FrX-2 e FrX-3 contêm majoritariamente açúcares. O espectro de RMN 1H das frações FrX-4 e FrX-5 mostraram que contém substâncias aromáticas e grande quantidade de açúcares. As análises em CLAE-DAD das frações FrX-4 e FrX-5 indicaram a presença de três antocianinas majoritárias e uma minoritária (figuras 24 e 25), observadas pelo espectro UV, com duas bandas características, uma em cerca de 274nm e outra ao redor de 524nm. Os demais picos apresentaram bandas com λ máx próximos a 250nm no espectro de UV, sugerindo uma provável presença de outros substituintes fenólicos. Figura 24: Cromatograma de FrX-4, gradiente H2O/MeOH (iniciando com 5%MeOH), 254nm. 71 Figura 25: Cromatograma de FrX-5, gradiente H2O/MeOH (iniciando com 5%MeOH), 254nm. Após a análise em CLAE das frações resultantes do procedimento para o fracionamento de FrX-4 (tabela 7), verificou-se que as antocianinas estavam presentes nas sub-frações FrX-432, FrX-442 e FrX-452, como mostrado no cromatograma de FrX-442 em 254 e 510nm (figura 26), mas com tempos de retenção diferente aos das figuras 24 e 25, provavelmente devido às alterações causadas pelo uso de diferentes colunas. Figura 26: Cromatograma de FrX-442, C-18, gradiente H2O/MeOH (iniciando com 5%MeOH). 510nm 254nm 72 O fracionamento de FrX-442 através da coluna cromatográfica de fase reversa C-18 não foi eficiente. Mesmo observando as “faixas” eluindo, as sub-frações apresentavam o mesmo perfil, observados através de CCDC e CLAE. Após várias pesquisas na literatura e adaptações pode-se chegar a uma condição de análise para que a FrX-442 fosse fracionada em CLAE preparativo, porém a maioria da massa ficou retida na coluna, como podemos observar no cromatograma da figura 27, no qual os picos selecionados representam as antocianinas, já que foram observados a λ 520nm. Figura 27: Cromatograma de FrX-442 0 a 15min 35% B, 16 a 18min 35-40% B, 19 a 35min 40% B, 35 a 40 min 40-100% B, em coluna de fase reversa (fenil-hexila), onde A é água (0,5% H3PO4) e B é MeOH a 254nm. A avaliação da atividade anti-radicalar das rações semi-purificadas de E. jambolana foi realizado pelo ensaio que determina a porcentagem de seqüestro de radicais livres da molécula de DPPH. Os radicais livres são formados no citoplasma, nas mitocôndrias ou na membrana celular através de reações de óxido-redução, isto é, as moléculas cedem ou recebem um elétron para a formação radicalar. Compostos polifenólicos, como as antocianinas, são antioxidantes não-enzimáticos, e agem inibindo o processo de peroxidação lipídica (BIANCHI & ANTUNES, 1999) doando um átomo de hidrogênio para o radical, evitando assim as reações em cadeias. 73 Figura 28: Mecanismo de reação do radical DPPH como antioxidante (doador de H.). Todas as frações testadas frente ao radical livre DPPH apresentaram forte atividade quando comparada à rutina. O valor de IC50 é a concentração efetiva na qual 50% dos radicais DPPH são seqüestrados, e esses valores das frações FrX-4, FrX-442, FrX-452 e FrX-5 foram 0,065, 0,45, 0,038 e 0,044 mg.mL-1 respectivamente. O valor para a rutina foi de 21µmolmL-1 (12,81mgmL-1), evidenciando um potencial antiradicalar marcadamente superior ao observado para a rutina, usada como controle positivo. 0,00 0,02 0,04 0,0