RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta dissertação será disponibilizado somente a partir de 30/09/2023. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “Júlio de Mesquita Filho” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU Efeitos parácrinos e metabólicos do meio enriquecido com cobalto em células endoteliais e osteoblastos Suelen Aparecida Teixeira Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências, Campus de Botucatu, UNESP, para obtenção do título de Mestre pelo Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Prof. Dr. Willian Fernando Zambuzzi BOTUCATU – SP 2022 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “Júlio de Mesquita Filho” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU Efeitos parácrinos e metabólicos do meio enriquecido com cobalto em células endoteliais e osteoblastos Suelen Aparecida Teixeira Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências, Campus de Botucatu, UNESP, para obtenção do título de Mestre pelo Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Prof. Dr. Willian Fernando Zambuzzi BOTUCATU – SP 2022 Palavras-chave: Cobalto; Hipóxia; Liga de cobalto cromo; Osteointegração. Teixeira, Suelen Aparecida. Efeitos parácrinos e metabólicos do meio enriquecido com cobalto em células endoteliais e osteoblastos / Suelen Aparecida Teixeira. - Botucatu, 2022 Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", Instituto de Biociências de Botucatu Orientador: Willian Fernando Zambuzzi Capes: 90300009 1. Cobalto. 2. Ligas de cromo. 3. Hipóxia. 4. Células endoteliais. 5. Osteointegração. 6. Osteoblastos. DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CÂMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE-CRB 8/5651 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. TRATAMENTO DA INFORM. AGRADECIMENTOS: Agradeço primeiramente ao meu pai, que sozinho me criou para lidar com o mundo; Agradeço a todos os meus professores que tive até aqui, que me deram base para conhecer e entender como tudo funciona; Agradeço a doutora Adele Caterino-de-Araújo, minha orientadora de iniciação científica, que foi quem me apresentou a pesquisa e o universo de possibilidades que ela pode conter; Agradeço ao meu atual orientador Willian Fernando Zambuzzi por ter me guiado por esse caminho do mestrado, em meio a uma pandemia e com tantas coisas para lidar; Agradeço ao Célio pelo grande apoio e execução das técnicas laboratoriais; Agradeço imensamente aos meus colegas de laboratório, não só pela contribuição pelo projeto, como por todas as vezes que me fizeram sorrir. Foram anos atípicos, mas com a presença de todos pude seguir e me redescobrir, como pessoa e como profissional; A FAPESP: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (2019/26854-2); A CAPES: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes); Ao CNPQ: Centro Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico. “Para cultivar a sabedoria, é preciso força interior. Sem crescimento interno, é difícil conquistar a autoconfiança e a coragem necessárias. Sem elas, nossa vida se complica. O impossível torna-se possível com a força de vontade”. (Dalai Lama) SUMÁRIO CAPITULO 1 INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 13 MICROAMBIENTE ÓSSEO ......................................................................................... 14 BIOMATERIAIS ........................................................................................................... 17 LIGA CoCr ..................................................................................................................... 20 ANGIOGÊNESE ............................................................................................................ 22 OBJETIVO ..................................................................................................................... 24 CAPITULO 2 Metabolic effects of CoCr-enriched medium on shear-stressed endothelial cell and osteoblasts: a possible mechanism involving a hypoxic condition on bone healing ...... 25 INTRODUCTION .......................................................................................................... 27 MATERIAL AND METHODS...................................................................................... 28 RESULTS ....................................................................................................................... 33 DISCUSSION ................................................................................................................. 42 REFERENCES ............................................................................................................... 45 DISCUSSÃO .................................................................................................................. 54 REFERÊNCIAS ............................................................................................................. 57 LISTA DE FIGURAS CAPITULO 1 Fig.1. Esquema do microambiente ósseo demonstrando estrutura e tipos celulares ...... 15 Fig.2. Evolução da funcionalidade e da capacidade regenerativa dos biomateriais ....... 18 Fig.3. Esquema do microambiente arterial demostrando a estrutura e o tipo celular utilizado .......................................................................................................................... 23 CAPITULO 2 Fig.1. Schematization of the experimental design performed in this study ................... 31 Fig.S1. Differences in Co concentration in the culture medium .................................... 32 Fig.2. CoCr-enriched medium modulates the expression of genes involved with angiogenesis ................................................................................................................... 33 Fig.3. Protein carbonylation of endothelial cells subjected to Co-Cr-enriched medium ........................................................................................................................................ 34 Fig.4. Pivotal marker genes in osteogenic differentiation were evaluated ..................... 35 Fig.5. ECM remodeling-related genes ........................................................................... 37 Fig.6. Gelatinolytic activities were measured by zymography ...................................... 38 LISTA DE TABELAS CAPITULO 2 Tabela 1. Primers sequences and quantitative polymerase chain reaction cycle conditions ........................................................................................................................................ 33 LISTA DE ABREVIAÇÕES AKT - serine/threonine protein kinase ALP – Fosfatase alcalina ANOVA – Análise de variância ARMD – Adverse reaction to metal debris BMU’s – Basic Multicelular Units BSP - Bone sialoprotein CaCl2 – Cloreto de cálcio CAPES – Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de nível Superior cDNA – fita complementar de ácido desoxiribonucleico CNPq – Concelho nacional de desenvolvimento ciêntifico e técnológico Co - Cobalto CoCr – Liga Cobalto-Cromo Col1a1 – Cadeia alpha 1 de colágeno tipo 1 Col3a1 – Cadeia alpha 3 de colágeno tipo 1 Cr - Cromo Ctrl - Control DAE - Dual Acid-Etched DNA – Ácido desoxiribonucleico DNPH - 2,4-Dinitrophenylhydrazine ECM - Extracellular matrix eNOS - Endothelial nitric oxide synthase FAPESP – Fundação de amparo à pesquisa do estado de São Paulo FBS – Fetal Serum Bovine GAPDH – Gliceraldeido 3-fosfato desidrogenase GFAAS - Graphite furnace atomic absorption spectrometry HIF – Fator induzivel por hipoxia HIF1α - Fator induzivel por hypoxia 1 alfa HIF2α - Fator induzivel por hypoxia 2 alfa HUVEC – Human umbilical vein endotheial cells MC3T3-E1 – Pre-osteoblasts cell MMP2 – metalloproteinase 2 MMP9 – metalloproteinase 9 MMPs - metalloproteinases MOM – Metal-on-metal mRNA - Messenger ribonucleic acid nNOS - neural nitric oxide synthase OM –Osteogenic Medium Osterix - transcription factor for osteoblast differentiation qPCR – quantitative real time Polymerase Chain Reaction ROS – Reative oxygen stress RUNX2 - Runt-related transcription factor 2 SUS – Sistema único de saúde Ti - Titanium TIMP1 - metallopeptidase inhibitor 1 TIMP2 - metallopeptidase inhibitor 2 VEGF - Vascular endothelial growth factor W – with Wo – without RESUMO As ligas à base de cobalto-cromo (CoCr) surgiram como um biomaterial interessante acerca do campo biomédico, principalmente considerando sua biocompatibilidade, resistência à corrosão e ausência de magnetismo; entretanto, seu efeito no metabolismo celular é pouco conhecido e isso nos levou a avaliar melhor se o meio enriquecido com CoCr afeta o metabolismo tanto de osteoblastos quanto de células endoteliais, e também se há um acoplamento entre elas. Também foi considerado aqui o efeito já conhecido do Cobalto (Co) como um elemento hipóxico, estabelecendo um modelo in vitro importante. Discos de CoCr foram incubados em meio de cultura livre de Soro Fetal Bovino (FBS) por 24 horas. Este meio enriquecido com CoCr foi utilizado para tratar culturas de células endoteliais sob tensão de cisalhamento por 72 horas. Depois disso, o meio condicionado contendo metabólitos de células endoteliais foi ainda utilizado para submeter as culturas de osteoblastos, quando as amostras foram adequadamente colhidas para permitir a análise moleculares. Nossos dados mostram que o meio enriquecido com CoCr contém 1,5-2,0ng/mL de Co, que foi capturado pelas células endoteliais e osteoblastos em cerca de 30% em quantidade e parece modular suas vias metabólicas: as células endoteliais expressaram maior perfil dos genes HIF1α, VEGF e nNOS, enquanto seu perfil global de carbonilação proteica foi inferior ao das culturas de controle, sugerindo menor comprometimento com o estresse oxidativo. Além disso, os osteoblastos respondendo aos metabólitos das células endoteliais com CoCr apresentam expressão dinâmica dos genes marcadores na diferenciação osteogênica, como genes da fosfatase alcalina (ALP), osteocalcina e sialoproteína óssea (BSP), estando significativamente aumentados. Além disso, as forças de tensão de cisalhamento diminuem o estímulo à expressão do ColA1 gene nos osteoblastos respondendo aos metabólitos das células endoteliais, bem como modulação importante de genes relacionados à remodelação da matriz extracelular. Por fim, analisando as atividades das metaloproteinases de matriz (MMPs), os dados mostram que os metabólitos das células endoteliais com tensão de cisalhamento aumentam as atividades tanto do MMP9 quanto do MMP2 nos osteoblastos. Ao todo, nossos dados mostram pela primeira vez que os metabólitos de células endoteliais respondendo aos discos CoCr contribuem para o fenótipo osteogênico in vitro, e isto prediz uma interação ativo entre a angiogênese e a osteogênese durante a osseointegração da liga CoCr, podendo ser relacionada em mecanismos de regeneração do osso, guiado pela condição de hipóxia experimental provocado pelo cobalto. ABSTRACT Cobalt-chromium (CoCr)-based alloys have emerged as an interesting biomaterial within biomedical field, mainly considering their biocompatibility, resistance to corrosion and absence of magnetism; however, its effect on cell metabolism is barely known and this prompted us better evaluating whether CoCr-enriched medium affects the metabolism of both osteoblast and endothelial cells, and also if there is a coupling between them. This is also considered here the already-known effect of Cobalt (Co) as a hypoxic element. Firstly, discs of CoCr [subjecting (W) or not (Wo) to dual acid-etched (DAE)] were incubated into FBS-free cell culture medium up to 24 hours (37oC). This CoCr-enriched medium was further used to treat shear-stressed endothelial cells cultures up to 72 hours. Thereafter, the conditioned medium containing metabolites of shear-stressed endothelial cells in response to CoCr-enriched medium was further used to subject osteoblast’s cultures, when the samples were properly harvested to allow the analysis of the molecular issues. Our data shows that CoCr-enriched medium contains 1.5-2.0ng/mL of Co, which was captured by endothelial cells and osteoblasts in about 30% in amount and it seems modulate their metabolic pathways: shear-stressed endothelial cells expressed higher profile of HIF1α, VEGF and nNOS genes, while their global profile of protein carbonylation was lower than the control cultures, suggesting lower oxidative stress commitment. Additionally, osteoblasts responding to metabolites of CoCr-challenged endothelial cells show dynamic expression of marker genes in osteogenic differentiation, with alkaline phosphatase (ALP), osteocalcin, and bone sialoprotein (BSP) genes being significantly increased. Additionally, tensional shear-stress forces decrease the stimulus for ColA1gene expression in osteoblasts responding to endothelial cells metabolites, as well as modifying the extracellular matrix remodeling related genes. Analyzing the activities of matrix metalloproteinases (MMPs), the data shows that shear-stressed endothelial cells metabolites increase the activities of both MMP9 and MMP2 in osteoblasts. Altogether, our data shows for the first time that shear-stressed endothelial metabolites responding to CoCr discs contribute to osteogenic phenotype in vitro, and this predicts an active crosstalk between angiogenesis and osteogenesis during osseointegration of CoCr alloy and bone healing, maybe guided by the Co-induced hypoxic condition. 13 CAPITULO 1 INTRODUÇÃO Visando uma melhor compreensão do microambiente peri-implante, é importante ressaltar o processo de osteointegração, o qual leva em conta mecanismos celulares e moleculares ao redor do implante. Parte dos mecanismos deste processo remetem a osteogênese original, e é responsável por conectar à superfície do implante ao tecido ósseo. Para que isso ocorra de maneira eficiente, a superfície do implante deve possuir características que estimulem respostas biológicas adequadas, e que favoreçam o processo de ancoragem das células ósseas em sua superfície, permitindo a síntese e mineralização correta da matriz, garantindo assim a homeostase do tecido. Contudo, para que se chegue no estágio final de cicatrização, ocorrem vários eventos a partir da colocação cirúrgica do implante. Neste processo, ocorre a ruptura de vasos locais e o contato direto do sangue do paciente com o implante. A superfície implantar é recoberta por proteínas séricas, que permitem ativação de plaquetas e fibrinas, criando um coágulo sanguíneo. Vale ressaltar que um ambiente rico em plaquetas disponibiliza uma alta concentração de fatores de crescimento, sendo favorável ao desenvolvimento ósseo (BRESSAN; UNIVERSIDADE, 2019; OLIVEIRA, 2010; SILVA et al., 2016). Posteriormente, ocorrerá o recrutamento de células inflamatórias e células tronco mesenquimais, que liberam enzimas para quebra dirigida do coágulo. Neste contexto, há liberação de diversos fatores presentes no coágulo o qual torna o microambiente biocompatível, permitindo assim a adesão das células tronco mesenquimais e, por meio da interação de uma infinidade de vias de sinalização, ocorre a diferenciação celular com desfecho osteogênico. Uma vez diferenciada, estas células assumem fenótipo de osteoblastos, ocorrendo a deposição de fosfato de cálcio na matriz extracelular pre-sintetizada, realizando-se então o processo de mineralização. Acoplado a isso, o mecanismo da angiogênese se desenrola formando novos vasos para o transporte de nutrientes até o tecido em desenvolvimento. Da visão histológica, células endoteliais tem um forte papel na regulação de osteoblastos e consequentemente no crescimento e remodelamento ósseo. Assim, cabe destacar que o microambiente periimplantar requer a interação de células endoteliais e células ósseas, envolvendo mecanismos celulares e moleculares integrados e que favorece e dirige a osseointegração (BRESSAN; UNIVERSIDADE, 2019; OLIVEIRA, 2010; SILVA et al., 2016). 57 REFERÊNCIAS ABE, J.; BERK, B. C. Novel mechanisms of endothelial mechanotransduction. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology, v. 34, n. 11, p. 2378–86, nov. 2014. ACCORSI-MENDONCA, T. et al. Expression of matrix metalloproteinases-2 and -9 and RECK during alveolar bone regeneration in rat. Journal of molecular histology, v. 39, n. 2, p. 201–208, abr. 2008. AFONSO, S. Biomateriais E. 1998. 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